FR2881756A1 - Procede d'etude du genotype des chiens de la race labrador visant a determiner les possibilites de coloration du pelage de leurs descendants - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé d'étude du génotype des chiens de la race labrador visant à déterminer les possibilités de coloration du pelage de leurs descendants, suivant lequel, à partir d'un prélèvement de matériel génétique du chien, on examine le gène TYRP1 pour y déceler la présence éventuelle d'une mutation du codon 331 du type Q331ter, et on en déduit la présence de caractères récessifs de coloration noire et/ou chocolat du pelage. On examine également, à partir du même prélèvement de matériel génétique, et de préférence de façon simultanée, le gène MC1R pour y déceler la présence éventuelle d'une mutation du codon 306 de type R306ter, et on en déduit la présence d'un caractère récessif de coloration jaune du pelage.

Description

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La présente invention concerne la conception et la mise au point d'un procédé d'étude du génotype des chiens visant à déterminer les possibilités de coloration du pelage de leurs descendants, par étude du gène TYRP1 et du gène MC1 R. II existe, chez les chiens en général, une grande variété de colorations du pelage. On trouve ainsi des chiens dont le pelage est qualifié de noir, de chocolat ou de brun, d'orange, jaune, rouge, or ou abricot, suivant la terminologie particulière utilisée par les éleveurs. Cette terminologie peut en outre varier d'un éleveur à l'autre. Les colorations noire et brune du pelage des chiens sont dues au pigment eumélanine, alors que la coloration jaune est due au pigment phéomélanine.

Il est d'une importance particulière pour les éleveurs canins de pouvoir optimiser leur stratégie de croisement, en matière de coloration du pelage. En effet, les croisements qui sont réalisés en fonction de la couleur du pelage apparente des parents (le phénotype) ne donnent pas toujours les résultats escomptés. Il est par exemple possible que le croisement d'un parent jaune et d'un parent brun résulte dans la naissance de chiots noirs, ou, au contraire, que le croisement de deux parents noirs donne des chiots de couleur sable. II en résulte pour les éleveurs une incertitude du résultat des croisements, qui entraîne pour eux une perte de temps et d'argent. La survenue de tels résultats inattendus est liée aux gènes de coloration récessifs portés par chaque chien. La connaissance de ces gènes permettrait de prévoir avec exactitude la coloration des chiots nés du croisement de parents déterminés, et de ce fait d'optimiser les croisements afin d'obtenir de façon fiable des chiots de la couleur souhaitée.

Différentes études ont été réalisées afin de déterminer une corrélation entre le génotype et le phénotype des chiens en terme de coloration du pelage. Chez les mammifères en général, on sait que les facteurs majeurs qui déterminent la synthèse d'eumélanine ou de phéomélanine sont des variations alléliques au niveau des loci Extension (E) et Agouti (B). Le locus Extension est situé sur le chromosome 5 du chien. Son produit est le récepteur de la 2881756 2 mélanocortine 1 (MC1 R). Le locus Agouti est situé sur le chromosome 11 du chien. Il code pour une protéine spécifique des mélanocytes, la protéine relative à la tyrosinase 1 (TYRP1).

La protéine TYRP1 et le récepteur MC1 R fonctionnent comme des signaux opposés, qui déterminent la synthèse, par les mélanocytes des follicules capillaires, qui sont les cellules produisant les pigments, de phéomélanine jaune ou d'eumélanine noire ou brune. Le récepteur MC1 R se situe sur la surface des mélanocytes. Il contrôle le niveau de tyrosinase produit par ces derniers. II s'agit du premier membre d'une famille de 5 récepteurs de la mélanocortine, qui appartient à la super-famille des récepteurs couplés aux protéines G. Son activation provoque la synthèse d'eumélanine (couleur noire ou brune chez le chien) à la place de la phéomélanine (couleur sable chez le chien) par les mélanocytes. La protéine TYRP1 est quant à elle l'enzyme limitante impliquée dans la synthèse des mélanines. Elle affecte la pigmentation très tard, après la division entre la synthèse d'eumélamine ou de phéomélanine.

La présente invention concerne plus particulièrement les chiens de la race labrador. Chez le labrador, on trouve trois grands types de coloration du pelage: coloration noire, brune (également appelée chocolat) ou jaune (ou encore sable).

L'invention concerne ainsi un procédé d'étude du génotype des chiens de la race labrador visant à déterminer les possibilités de coloration du pelage de leurs descendants, suivant lequel, à partir d'un prélèvement de matériel génétique du chien, on examine le gène TYRP1 pour y déceler la présence éventuelle d'une mutation du codon 331 du type Q331ter, remplaçant un codon codant pour un résidu glutamine par un codon STOP. On déduit de cet examen la présence de caractères récessifs de coloration noire et/ou chocolat du pelage du labrador.

Suivant une caractéristique avantageuse de l'invention, à partir d'un prélèvement de matériel génétique du même chien, on examine également le gène MC1 R pour y déceler la présence éventuelle d'une mutation du codon 306 de type R306ter, remplaçant un codon codant pour une arginine par un codon STOP, et on en 2881756 3 déduit la présence d'un caractère récessif de coloration jaune du pelage.

L'efficacité du procédé selon l'invention pour la détermination des possibilités de coloration du pelage des descendants des chiens de la race labrador s'explique en considérant les résultats d'études antérieures publiées dans la littérature.

Il a été décrit dans la littérature que l'allèle Extension récessif (e) des chiens est dû à une unique mutation du gène MC1 R qui introduit un codon STOP prématuré dans sa séquence, au niveau du codon 306, et entraîne une perte de fonction (Newton et al., Mammalian Genome, 1 1, 24- 30, 2000). Il s'agit d'une mutation R306ter, remplaçant un codon codant pour un résidu arginine par un codon STOP (codon TGA remplaçant un codon CGA). Cette mutation est présente chez la grande majorité des chiens de coloration jaune examinés dans cette étude. De plus, tous les chiens examinés présentant une couleur de pelage noire ou brune ne possédaient pas ce codon STOP prématuré, ou bien ils étaient hétérozygotes pour ce codon.

Il a d'autre part été identifié, dans une autre étude, également chez le chien en général, trois mutations du gène TYRP1 qui affectent la production d'eumélanine et altèrent la pigmentation noire en une pigmentation brune. Il s'agit des mutations Q331 ter (qui introduit un codon STOP prématuré dans l'exon 5 du gène à la place d'un codon codant pour un résidu glutamine (codon TAG remplaçant CAG)), 345delP (qui supprime un résidu proline dans ce même exon 5), et S41 C (qui remplace une cystéine par une sérine dans l'exon 2) (Schmutz et al., Mammalian Genome, 13, 380-387, 2002). Les chiens à coloration brune du pelage sont homozygotes pour l'allèle Agouti récessif (b).

Dans cette dernière étude, la relation entre MC1 R et TYRP1 a également été étudiée. Suivant ses conclusions, la coloration jaune du pelage résulte de la présence d'un codon STOP prématuré en position 306 du gène MC1 R, qui entraîne un état homozygote récessif de ce gène (e). La coloration brune est quant à 2881756 4 elle le résultat d'un génotype récessif (b) au niveau du gène TYRP1, dépendant de trois mutations de sa séquence, et cela uniquement dans l'état hétérozygote ou homozygote dominant de MC1R. La coloration noire enfin est le résultat d'un génotype dominant (B), dans l'état hétérozygote ou homozygote dominant de MC1 R. Les résultats exposés ci-avant tendent à montrer que la détermination des caractères récessifs de coloration du pelage des chiens nécessite l'étude des mutations de la séquence de deux gènes: la mutation R306ter du gène MC1 R, et les mutations Q331 ter, 345delP et S41 C du gène TYRP1.

La présente invention provient de la découverte par les inventeurs du fait que, pour les chiens de la race labrador, seule la mutation Q331ter du gène TYRP1 influence la coloration en noir ou en brun du pelage, à l'exclusion des mutations 345delP et S41C, qui sont indifférentes de ce point de vue.

Suivant le procédé selon l'invention, l'étude de la mutation du type Q331 ter du gène TYRP1 permet de déduire la présence de caractères récessifs de coloration noire et/ou chocolat du pelage. Le phénotype potentiel de coloration noire est lié à la présence de l'allèle Agouti dominant (B), dans lequel le codon 331 n'est pas muté, alors que le phénotype potentiel de coloration brune est lié à la présence de l'allèle Agouti récessif (b), qui porte le codon muté. II est possible que le chien porte en même temps ces deux phénotypes potentiels, dans le cas où il est hétérozygote pour le gène TYRP1.

Dans tous les cas, ses descendants porteront obligatoirement l'un de ses deux allèles.

L'étude de la mutation R306ter du gène MC1 R permet quant à elle de déduire la présence d'un caractère récessif de coloration jaune du pelage. Le phénotype potentiel de coloration jaune ou sable est lié à la présence de l'allèle Extension récessif (e), associé à la mutation R306ter.

Ces analyses permettent d'accéder au génotype du labrador qui est déterminant du point de vue de la coloration du pelage. Ainsi, si on applique le procédé d'étude du génotype suivant 2881756 5 l'invention à chacun de deux parents potentiels, on peut déterminer, à partir d'un tableau de croisement des génotypes des deux parents liés aux codons 306 de MC1 R et 331 de TYRP1, ce tableau étant en lui-même classique, la répartition génotypique des chiots issus du croisement des deux parents en question, ainsi que les phénotypes de coloration du pelage respectifs associés. Ce procédé permet de déterminer les possibilités de coloration du pelage des chiots de la race labrador, à partir de l'étude du génotype de leurs parents déterminé par l'étude de la mutation du codon 306 du gène MC1 R et de la mutation du codon 331 du gène TYRP1, à l'exclusion de toute autre mutation, et notamment des mutations 345delP et 541C de TYRP1.

Suivant des modes de réalisation préférés dans la pratique industrielle, l'invention répond en outre aux caractéristiques suivantes, mises en oeuvre séparément ou en chacune de leurs combinaisons techniquement opérantes.

Dans des modes de mise en oeuvre préférés de l'invention, on examine la présence éventuelle de la mutation du codon 331 de TYRP1 et la présence éventuelle de la mutation du codon 306 de MC1 R de façon simultanée. On obtient de ce fait, tout-à-fait avantageusement, dans un même temps, le génotype du chien sur les deux loci Extension et Agouti.

Pour chaque chien, on trouve neuf possibilités de combinaisons génotypiques différentes, suivant que le chien est homozygote et/ou hétérozygote pour les allèles Extension et/ou Agouti. Suivant la combinaison, le chien pourra, en plus de sa coloration apparente, être porteur d'une ou plusieurs colorations potentiellement transmissibles à ses descendants.

Suivant des modes de mise en oeuvre particulièrement avantageux dans la pratique industrielle, à partir d'un prélèvement de matériel génétique du chien, on extrait l'ADN génomique et on amplifie un fragment du gène MC1 R incluant le codon 306 et un fragment du gène TYRP1 incluant le codon 331. On examine ensuite les fragments ainsi amplifiés pour y déceler les présences éventuelles respectives de la mutation R306ter du gène MC1 R, et de 2881756 6 la mutation Q331ter du gène TYRP1, par un test de détection des polymorphismes d'un seul nucléotide (pour l'anglais " Single Nucleotide Polymorphism ").

Le test de détection des polymorphismes d'un seul nucléotide est de préférence un test classique en lui-même, par exemple un test d'extension d'amorce, tel que décrit dans les documents US 5,888,819 et US 6,004,744, ou le test connu sous le nom de OLA (pour " Oligonucleotide ligation assay ", " Test de ligation d'oligonucléotides "), décrit par Landegren et al. (Science, 241, 1077-1080, 1988). Ce dernier test est préféré au premier, car il nécessite moins d'étapes pour sa mise en oeuvre.

Un tel test de détection des polymorphismes d'un seul nucléotide présente l'avantage d'être plus simple à effectuer que d'autres techniques également connues pour l'analyse des polymorphismes en général, telles par exemple que la technique des polymorphismes de la longueur des fragments de restriction de l'ADN génomique.

Les techniques de prélèvement, d'extraction et d'amplification des fragments d'ADN utilisées dans le cadre de 20 l'invention sont classiques en elle-mêmes.

Suivant une caractéristique avantageuse de l'invention, on examine les mutations de MC1R et de TYRP1 de façon simultanée, dans un même mélange réactionnel. Ceci permet, de façon tout-àfait avantageuse, d'accéder aux résultats concernant ces deux mutations avec un nombre minimal d'opérations et une quantité de produits réactionnels moindre que dans le cas d'une détection de chaque mutation séparément. Dans ce cas, le test de détection des polymorphismes d'un seul nucléotide est réalisé de façon à ce que les deux résultats concernant les deux mutations soient lisibles en même temps. Ceci est réalisé en utilisant des amorces nucléotidiques de longueurs différentes pour les deux mutations.

Dans des modes de réalisation préférés de l'invention, on amplifie l'exon 5 de TYRP1, qui contient le codon 331. Ce fragment de 121 paires de bases, qui contient le site de mutation à détecter, 2881756 7 présente avantageusement une taille optimale pour une amplification par la technique de réaction de polymérisation en chaîne.

On amplifie en outre de préférence un fragment de 123 paires de bases, notamment compris entre le codon 288 et le codon 329, de MC1R. Ce fragment contient le site de mutation à détecter. Sa taille est avantageusement optimale pour une amplification par la technique de réaction de polymérisation en chaîne.

Est également comprise dans l'invention l'étape intermédiaire du procédé d'étude du génotype des chiens de la race labrador, suivant laquelle on examine le gène TYRP1, en extrayant l'ADN génomique à partir d'un prélèvement de matériel génétique dudit chien, en amplifiant un fragment du gène TYRP1 incluant le codon 331, notamment l'exon 5 de TYRP1, et en appliquant sur le fragment amplifié un test de détection des polymorphismes d'un seul nucléotide pour y déceler la présence éventuelle d'une mutation du codon 331 du type Q331 ter L'invention sera maintenant plus avant précisée dans ses caractéristiques préférées et ses résultats, par la description détaillée de modes de mise en oeuvre particuliers qui font l'objet des

exemples ci-après.

Le procédé d'étude du génotype des chiens de la race des labradors suivant l'invention est mis en oeuvre de la façon suivante.

Exemple 1

Détection de la présence éventuelle des mutations Q331 ter 25 du gène TYRP 1 et R306ter du gène MC1R.

Un échantillon de sang, prélevé par exemple par la technique de la veinipuncture, ou un échantillon de poil, du chien de la race labrador est tout d'abord prélevé.

L'ADN génomique est extrait de cet échantillon par une méthode classique. Des fragments de MC1R et de TYRP1 sont ensuite amplifiés, par une méthode également classique, notamment par réaction de polymérisation en chaîne.

GE16-002BL.DOC EF/11F 19/04/05 Dans ces méthodes, comme dans toutes les méthodes classiques en elles-mêmes utilisées dans le cadre de l'invention, la mise au point des différents paramètres optimaux de réaction est effectuée de manière adaptée au problème particulier, suivant des calculs à la portée de l'homme du métier.

Un fragment de 123 paires de bases de séquence SEQ 1D NO: 1 de MC1 R, contenant le codon 306, est amplifié au moyen des amorces suivantes: MC1 R sens SEQ ID NO: 3 lo MC1 R anti-sens SEQ ID NO: 4 L'exon 5 de TYRP1, fragment de 121 paires de bases de séquence SEQ ID NO: 2, contenant le codon 331, est amplifié au moyen des amorces suivantes: TYRP1 sens SEQ ID NO: 5 TYRP1 anti-sens SEQ I D NO: 6 L'amplification par réaction de polymérisation en chaîne est réalisée de la façon suivante.

Pour MC1 R: Le volume réactionnel de 30 pl contient entre 3 et 7 nglpl d'ADN génomique, 1 mM de MgCl2, du tampon de réaction de polymérisation en chaîne 1X, 0,2 mM dNTP, 0,67 pmolelml de chaque amorce et 166 Unités d'ADN Polymérase Taq (commercialisée par New England BioLabs).

L'amplification est réalisée sur un PCR System 2700 de Applied BioSystems, avec une étape de chauffage de 4 minutes à 94 C, et 30 cycles de 50 secondes à 94 C, 50 secondes à 64 C et 50 secondes à 72 C, suivis d'une étape d'élongation de 4 minutes à 72 C.

Pour TYRP1: La réaction de polymérisation en chaîne est réalisée dans 2881756 9 un milieu réactionnel de 45 pl contenant entre 3 et 7 ng/pl d'ADN génomique, 2,5 mM de MgCl2, du tampon de réaction de polymérisation en chaîne 1X, 0,2 mM dNTP, 0,40 pmole/ml de chaque amorce et 166 Unités d'ADN Polymérase Taq (commercialisée par New England BioLabs).

L'amplification est réalisée sur un PCR System 2700 de Applied BioSystems. Le protocole de chauffage consiste en une étape de 4 minutes à 94 C, et 30 cycles de 50 secondes à 94 C, 50 secondes à 56 C et 50 secondes à 72 C, avec une étape finale d'élongation de 4 minutes à 72 C.

La taille des produits des réactions de polymérisation en chaîne est vérifiée par électrophorèse sur un gel à 2% d'agarose.

On examine ensuite l'ADN génomique ainsi amplifié aux fins d'y déceler la présence éventuelle des mutations des séquences 15 de MC1R et de TYRP1 qui sont recherchées.

Il s'agit, pour MC1 R, d'une mutation du premier nucléotide du codon 306 d'une Cytosine C en une Thymine T, remplaçant le codon CGA en TGA (codon STOP) en position 306. Comme on l'a expliqué plus haut; cette mutation, qui entraîne une perte de fonction de MC1 R, est portée par l'allèle récessif (e), et elle est associée à une coloration sable du pelage du labrador.

En ce qui concerne TYRP1, la mutation examinée est celle du premier nucléotide du codon 331, remplaçant également une Cytosine C par une Thymine T, soit modifiant le codon CAG en codon TAG (codon STOP). Cette mutation est portée par l'allèle récessif (b), et associée à une couleur brune du pelage du labrador.

La détection de ces deux mutations, qui sont toutes deux des polymorphismes d'un seul nucléotide, est de préférence réalisée de façon simultanée, dans une même succession d'opérations d'analyse. Suivant l'invention, elle peut être réalisée par deux techniques différentes. Tout autre procédé de détection des polymorphismes est cependant également utilisable dans le cadre de l'invention.

OE16-1.D2B1 DOC EF/RF 18/04/05 Test d'extension d'amorce Le principe est basé sur l'extension de l'extrémité 3' d'une amorce par un di-désoxyribonucléotide marqué. L'extension a lieu uniquement lorsque le nucléotide marqué est complémentaire du s nucléotide de l'ADN cible adjacent à l'extrémité 3' de l'amorce. L'amorce est choisie de telle sorte qu'elle s'hybride sur la séquence d'ADN immédiatement en amont du nucléotide causant le polymorphisme.

Pour la mise en oeuvre de ce test, les produits de la réaction de polymérisation en chaîne sont tout d'abord purifiés. On réunit 25 pl du milieu réactionnel d'amplification du fragment MC1R et 35 pl du milieu réactionnel de la réaction d'amplification de TYRP1 et on purifie l'ensemble par filtration sous vide. Une solution de produit de réaction de polymérisation en chaîne contenant à la fois les fragments MC1R et les fragments TYRP1 est ainsi obtenue.

Les amorces choisies pour ce test sont les suivantes: Pour MC1R, l'amorce est conçue de telle sorte qu'elle permet l'identification du nucléotide en première position du codon 306 (C ou T suivant que la mutation R306ter est ou non présente).

Sa séquence est la suivante: SEQ ID NO: 7 Pour TYRP1, l'amorce est conçue pour détecter la qualité du site polymorphique situé au niveau du premier nucléotide du codon 331 (C ou T suivant la présence ou non de la mutation Q331ter). Une queue poly-A a été ajoutée à son extrémité 5' pour permettre une migration différentielle des amorces allongées pour MC1R et TYRP1. Sa séquence est la suivante: SEQ ID NO: 8 Les longueurs de ces deux amorces ont été déterminées de façon à ce que, afin de minimiser le temps et les coûts d'analyse, le test de la mutation de MC1R et le test de la mutation de TYRP1 puissent être réalisés en même temps dans un seul mélange réactionnel.

On utilise de préférence, pour la mise en oeuvre du test d'extension d'amorce, le test SnaPShot commercialisé par Applied BioSystems. Le mélange réactionnel de 10 pl contient 4 pl des produits de la réaction de polymérisation en chaîne purifiés, 1 pl d'un mélange d'amorces comprenant 20 pmoles/ml de l'amorce MC1R et 40 pmoles/ml de l'amorce TYRP1, et 5 pl du Mélange Réactionel Multiplex du kit SnaPShot.

Un protocole de chauffage est mis en oeuvre sur un PCR System 2700 d'Applied BioSystems. Ce protocole comprend 25 cycles de 10 secondes à 96 C, 5 secondes à 50 C et 30 secondes à 60 C.

Dans une dernière étape, afin d'éliminer les di-désoxyribonucléotides marqués qui n'ont pas été incorporés au cours de la réaction d'extension d'amorce, on utilise une Phosphatase Alcaline de crevette qui capture les di-désoxy-ribonucléotides en excès et permet d'éviter de ce fait la présence de pics contaminants sur les profils de lecture des résultats.

Les produits obtenus sont ensuite analysés au moyen d'un génotypeur Abi Prism 300 de Applied Biosystems. La lecture de la fluorescence portée par chaque produit, ainsi que celle de sa taille, permettent de détecter les présences éventuelles d'une mutation du codon 306 sur les allèles MCR1 et d'une mutation du codon 331 sur les allèles TYRP1.

Test de ligation d'oligonucléotides (OLA) Le principe de ce test de détection des polymorphismes d'un seul nucléotide est le suivant.

Deux amorces sont hybridées sur des séquences complémentaires d'ADN au niveau du site du polymorphisme. Ces amorces sont conçues de telle sorte que l'extrémité 3' de la première amorce est localisée de façon immédiatement adjacente à l'extrémité 5' de la deuxième amorce qui joue le rôle de rapporteur.

Si l'extrémité 3' de la première amorce s'apparie parfaitement avec GE16. 002111DGC EF/RF 18/04/05 2881756 12 l'ADN cible, les deux amorces peuvent être liguées par des ligases d'ADN. Aucune ligation ne sera obtenue s'il y a un mésappariement au niveau de l'extrémité 3' de la première amorce. Afin de permettre la détection du polymorphisme, dans une étape subséquente de la procédure, la première amorce est marquée à son extrémité 5', notamment par un groupement fluorescent. La différenciation de la taille des fragments obtenus et de la fluorescence est ensuite réalisable par électrophorèse.

Le protocole de ce test est basé sur la méthode mise au lo point par Landegren et al (Science, 241, 1077-1080, 1988) en l'adaptant aux conditions spécifiques des mutations R306ter de MC1R et Q331ter de TYRP1.

Les amorces utilisées pour détecter les deux sites polymorphiques sont les suivantes.

ls Pour MC1R: L'amorce MC1R sauvage détecte l'allèle sauvage CGA (codant pour une arginine) à la position 306, et elle est marquée par le groupement fluorescent 5'-Fluorescéine phosphoramidite (6-FAM), alors que l'amorce MC1R mutée détecte l'allèle muté qui est responsable de la protéine non fonctionnelle, portant un codon TGA (codon STOP) à la même position, et qu'elle est marquée par le groupement fluorescent 5'hexachloro-fluorescéine phosphoramidite (5HEX). Leurs séquences sont données dans le tableau 1 ci-après. La séquence des amorces rapporteur associées sont également données dans le tableau 1.

La séquence de l'amorce MC1R inverse, qui va être liée aux amorces allèles spécifiques est la suivante: SEQ ID NO: 9 Pour TYRP1: L'amorce TYRP1 sauvage est conçue pour identifier le site polymorphique CAG (codant pour une glutamine) au niveau du codon 331. Elle est marquée par le groupement fluorescent 5'-Fluorescéine cE16-002BI.DOC EF/RF 19/04/05 phosphoramidite (6-FAM). L'amorce TYRP1 mutée permet de détecter le codon muté TAG (codon STOP) sur le même site 331. Elle est marquée par le groupement fluorescent 5'-hexachlorofluorescéine phosphoramidite (5HEX). Les séquences de ces amorces sont également données dans le tableau 1 ci- après, avec la séquence des amorces rapporteur associées.

La séquence de l'amorce TYRP1 inverse choisie pour la mise en oeuvre de ce test est la suivante: SEQ ID NO: 10 Les tailles relatives de ces amorces les unes par rapport aux autres ont été avantageusement choisies de manière à permettre une détection simultanée, dans une même opération d'analyse, des mutations de MC1R et TYRP1.

Tableau 1

Gène Codon Acide Cible Nom de l'amorce Amorce de ligation Aminé Amorce marquée Rapporteur MC1R 306 Arg (R) CGA MC1R_Sauvage [6-FAM]-SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 STOP TGA MCIR_Muté [5HEX]-SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 TYRP1 331 Gln (Q) CAG TYRPI_Sauvage [6-FAM]-SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16 STOP TAG TYRP1_ Muté [5HEX]-SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18 Séquence des amorces utilisées pour la mise en oeuvre du test OLA.

La réaction d'hybridation et de ligation des amorces ne nécessite pas d'étape de purification des mélanges issus de la réaction de polymérisation en chaîne. Les produits de la réaction de polymérisation en chaîne sont simplement dilués 10 fois dans de l'eau distillée stérile.

La réaction d'hybridation et de ligation est réalisée dans un volume réactionnel de 20 pl contenant 5 pl de chaque produit de réaction de polymérisation en chaîne dilué, 0,012 pmole/dal de MC1R sauvage, 0,050 pmole/pl de MC1R muté, 0,012 pmolelpl de 2881756 14 MC1R sauvage, 0,050 pmole/pl de MC1R muté, 0,012 pmole/pl de MC1R inverse, et 0,080 pmole/pl de TYRP1 sauvage, 0,320 pmole/pl de TYRP1 muté, 0,080 pmole/pl de TYRP1 inverse, du tampon Ligase 1X et 400 Unités de ligase d'ADN Taq DNA ligase (commercialisée par New England BioLabs).

Le protocole de chauffage est réalisé sur un PCR System 2700 d'Applied Biosystems avec une étape de chauffage de 2 minutes à 97 C, 10 cycles de 30 secondes à 97 C et 2 minutes à 60 C, et une étape finale de 10 minutes à 99 C.

Les fragments amplifiés sont ensuite analysés au moyen d'un génotypeur Abi Prism 300 de Applied Biosystems.

Sur la base de la lecture de la couleur des fluorophores associés à chaque fragment ainsi obtenu, et de la longueur des fragments en comparaison avec la taille standard, on peut assigner la séquence des codons 306 de MC1R et 331 de TYRP1.

A l'aide des résultats obtenus par l'une ou l'autre de ces deux méthodes, on peut attribuer pour chaque chien les génotypes de MC1R et de TYRP1 en termes d'allèles Extension et Agouti, et déduire la possibilité de colorations récessives du pelage jaune, noire et/ou chocolat.

Exemple 2

Détermination de la coloration du pelage Suivant son génotype, chaque chien présentera une coloration de pelage déterminée (son phénotype, déterminé par les allèles dominants), et il sera éventuellement porteur d'une ou plusieurs colorations potentiellement transmissibles à ses descendants (colorations liées à ses allèles récessifs). Ces colorations du pelage peuvent être déterminées en fonction du tableau 2 suivant: 2881756 15

Tableau 2

Génotype GénotypeT Phénotype de coloration du MC1R YRP1 pelage associé EE BB Noir EE Bb Noir porteur chocolat EE bb Chocolat Ee BB Noir porteur jaune Ee Bb Noir porteur jaune et chocolat Ee bb Chocolat porteur jaune ee BB Jaune porteur noir ee Bb Jaune porteur noir et chocolat ee bb Jaune porteur chocolat Corrélation entre le génotype et le phénotype du labrador en terme de coloration du pelage. 5 En fonction du génotype ainsi déterminé pour chacun des deux parents, on peut, à partir d'un tableau de croisement du génotype de deux parents (suivant une procédure qui est en elle-même classique), déterminer les probabilités de coloration du pelage des chiots issus de ce croisement.

Ce procédé permet avantageusement de guider les éleveurs dans le choix des parents qui devront être croisés en vue d'obtenir des descendants àcaractéristiques de coloration du pelage bien déterminées.

Il a été effectué un test de vérification des résultats obtenus par le procédé d'étude du génotype suivant l'invention.

Pour chaque exemple de croisement ci-après, on a déterminé, par le procédé suivant l'invention, le génotype de chacun 2881756 16 des deux parents associé au caractère de coloration du pelage, et le phénotype correspondant, par analyse exclusive des mutations du codon 306 du gène MC1 R et du codon 331 du gène TYRP1. On a prévu de façon théorique à partir de ces résultats les possibilités de coloration attendues chez les chiots issus du croisement.

Après que le croisement ait été effectivement réalisé entre les deux parents labradors concernés, on a observé la coloration du pelage des chiots et on a comparé ces résultats expérimentaux avec les prévisions théoriques effectuées suivant l'invention.

Exemple de croisement 1 Mâle Femelle Phénotype noir porteur chocolat Phénotype noir porteur chocolat Génotype Bb EE Génotype Bb EE Prévisions théoriques de coloration du pelage des chiots: 25% noir pur (BB EE) noir porteur chocolat (Bb EE) 50% chocolat pur (bb EE) 25% Résultats observés: Portée 1: 10 chiots 2 noir pur soit 20% 6 noir porteurs chocolat soit 60% 2 chocolat pur soit 20% Portée 2: 8 chiots 2 noir pur soit 25% 4 noir porteurs chocolat soit 50% 2 chocolat pur soit 25% Portée 3: 7 chiots 2 noir pur soit 28,6% 3 noir porteurs chocolat soit 42,9% 2 chocolat pur soit 28,6% Total: 25 chiots 6 noir pur 24% 13 noir porteurs chocolat 52% 6 chocolat pur 24% 35 2881756 17 Exemple de croisement 2 Mâle Femelle Phénotype noir porteur chocolat Phénotype noir porteur sable Génotype Bb EE Génotype BB Ee Prévisions théoriques de coloration du pelage des chiots: 25% noir pur (BB EE) noir porteur chocolat (Bb EE) 25% noir porteur sable (BB Ee) 25% chocolat pur (bb EE) 25% Résultats observés: Portée 1: 9 chiots 2 noir pur soit 22,2% 2 noir porteurs chocolat soit 22, 2% 3 noir porteur sable soit 33,3% 2 chocolat pur soit 22,2% Portée 2: 12 chiots 3 noir pur soit 25% 3 noir porteurs chocolat soit 25% 3 noir porteur sable soit 25% 3 chocolat pur soit 25% Portée 3: 8 chiots 2 noir pur soit 25% 2 noir porteurs chocolat soit 25% 2 noir porteur sable soit 25% 2 chocolat pur soit 25% Total: 29 chiots 7 noir pur (BB EE) 24,1% 7 noir porteurs chocolat 24,1% 8 noir porteur sable 27,6% 7 chocolat pur 24, 1% Exemple de croisement 3 Mâle Femelle Phénotype noir porteur chocolat Phénotype noir porteur sable et chocolat Génotype Bb EE Génotype Bb Ee 10 20 25 30 2881756 18 Prévisions théoriques de coloration du pelage des chiots: 12,5% noir pur (BB EE) noir porteur chocolat (Bb EE) 25% noir porteur sable (BB Ee) 12,5% noir porteur sable et chocolat 25% chocolat pur (bb EE) 12,5% chocolat porteur sable (bb Ee) 12,5% Résultats observés: Portée 1: 10 chiots 1 noir pur 3 noir porteur chocolat 1 noir porteur sable 3 noir porteur sable et chocolat 1 chocolat pur 1 chocolat porteur sable Portée 2: 13 chiots 2 noir pur 3 noir porteur chocolat 2 noir porteur sable 3 noir porteur sable et chocolat 1 chocolat pur 2 chocolat porteur sable Portée 3: 7 chiots 1 noir pur 1 noir porteur chocolat 1 noir porteur sable 2 noir porteur sable et chocolat 1 chocolat pur 1 chocolat porteur sable Total: 30 chiots 4 noir pur 13,3% 7 noir porteur chocolat 23,3% 4 noir porteur sable 13,3% 8 noir porteur sable et chocolat 26,7% 3 chocolat pur 10% 4 chocolat porteur sable 13,3% Exemple de croisement 4 Mâle Femelle Phénotype noir porteur sable et chocolat Phénotype sable pur Génotype Bb Ee Génotype BB ee soit 10% soit 20% soit 10% soit 30% soit 10% soit 10% soit 15,4% soit 23,1% soit 15,4% soit 23, 1% soit 7,7% soit 15,4% soit 14, 3% soit 14,3% soit 14,3% soit 28,6% soit 14,3% soit 14,3% 2881756 19 Prévisions théoriques de coloration du pelage des chiots: 25% noir porteur sable (BBEe) noir porteur sable et chocolat (BbEe) 25% sable pur (Bbee) 25% sable porteur chocolat (Bbee) 25% Résultats observés: Portée 1: 12 chiots 3 noir porteur sable soit 25% 3 noir porteur sable et chocolat soit 25% 3 sable pur soit 25% 3 sable porteur chocolat soit 25% Portée 2: 9 chiots 2 noir porteur sable soit 22, 2% 2 noir porteur sable et chocolat soit 22,2% 3 sable pur soit 33,3% 2 sable porteur chocolat soit 22,2% Portée 3: 6 chiots 1 noir porteur sable soit 16,7% 2 noir porteur sable et chocolat soit 33,3% 2 sable pur soit 33,3% 1 sable porteur chocolat soit 16,7% Portée 4: 8 chiots 3 noir porteur sable soit 37,5% 2 noir porteur sable et chocolat soit 25% 1 sable pur soit 12,5% 2 sable porteur chocolat soit 25% Total: 35 chiots 9 noir porteur sable 25, 7% 9 noir porteur sable et chocolat 25,7% 9 sable pur 25,7% 8 sable porteur chocolat 22,9% Dans tous les exemples précédents, on observe une correspondance remarquable entre les prévisions effectuées grâce au procédé selon l'invention et les résultats effectivement obtenus.

Le procédé suivant l'invention constitue de ce fait une méthode fiable et précise pour déterminer les possibilités de coloration du pelage des chiots de la race labrador à partir de l'étude du génotype de leurs parents, par analyse exclusive de la mutation R306ter du gène MC1R et de la mutation Q331ter du gène TYRP1, sans qu'il 2881756 20 soit nécessaire d'examiner la présence des mutations S41 C et 345delP du gène TYRP1.

La description qui précède explique clairement comment l'invention procède d'une manière que ne pouvait décrire l'homme du métier et comment elle permet d'atteindre les objectifs qu'elle s'est fixés. En particulier, elle fournit un procédé d'étude du génotype des chiens de la race labrador qui constitue un outil efficace pour déterminer les possibilités de coloration du pelage de leurs descendants. Ce procédé implique un nombre d'étapes d'analyse limité, par le seul examen de la mutation du codon 331 du gène TYRP1, qui permet de déduire la présence de caractères récessifs de coloration pour les colorations noire et/ou chocolat du pelage, de préférence complétée par la recherche de la mutation du codon 306 du gène MC1 R, d'où l'on peut déduire la présence éventuelle d'un caractère récessif de coloration jaune du pelage.

Il ressort néanmoins de ce qui précède que l'invention n'est pas limitée aux modes de mise en oeuvre qui ont été spécifiquement décrits dans le courant des exemples ci-dessus et qu'elle s'étend au contraire à toutes variantes passant par le biais de moyens équivalents.

Claims (2)

1. 21 REVENDICATIONS

   1. Procédé d'étude du génotype des chiens de la race labrador visant à déterminer les possibilités de coloration du pelage de leurs descendants, suivant lequel, à partir d'un prélèvement de matériel génétique du chien, on examine le gène TYRP1 pour y déceler la présence éventuelle d'une mutation du codon 331 du type Q331 ter, et on en déduit la présence de caractères récessifs de coloration noire et/ou chocolat du pelage.

   2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, à partir d'un prélèvement de matériel génétique dudit chien, on examine en outre le gène MC1R pour y déceler la présence éventuelle d'une mutation du codon 306 de type R306ter, et on en déduit la présence d'un caractère récessif de coloration jaune du pelage.

   3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on examine la présence éventuelle de ladite mutation du codon 306 de MC1 R et la présence éventuelle de ladite mutation du codon 331 de TYRP1 de façon simultanée.

   4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que, à partir d'un prélèvement de matériel génétique dudit chien: - on extrait l'ADN génomique, - on amplifie un fragment du gène MC1 R incluant le codon 306 et un fragment du gène TYRP1 incluant le codon 331, - et on examine les fragments ainsi amplifiés pour y déceler les présences éventuelles respectives de la mutation R306ter et de la mutation Q331 ter, par un test de détection des polymorphismes d'un seul nucléotide.
2. 2881756 22 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on examine les mutations R306ter de MC1R et Q331ter de TYRP1 de façon simultanée dans un même mélange réactionnel.

   6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce qu'on amplifie l'exon 5 de TYRP1.

   7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce qu'on amplifie un fragment d'environ 120 paires de base, notamment compris entre le codon 288 et le codon 329, de MC1R.

   8. Procédé de détermination des possibilités de coloration du pelage des chiots de la race labrador, caractérisé en ce que, pour chacun des deux parents, on applique le procédé d'étude du génotype des chiens selon l'une des revendications 2 à 7, puis on détermine, à partir d'un tableau de croisement des génotypes des deux parents, liés aux codons 306 de MC1R et 331 de TYRP1, la répartition génotypique desdits chiots et les phénotypes de coloration du pelage respectifs associés.

   9. Procédé d'étude du génotype des chiens de la race labrador, suivant lequel on examine le gène TYRP1, en extrayant l'ADN génomique à partir d'un prélèvement de matériel génétique du chien, en amplifiant un fragment du gène TYRP1 incluant le codon 331, notamment l'exon 5 de TYRP1, et en appliquant sur le fragment amplifié un test de détection des polymorphismes d'un seul nucléotide pour y déceler la présence éventuelle d'une mutation du codon 331 du type Q331ter.