FR2881436A1 - Procede de determination de la diversite des lymphocytes t dans un echantillon biologique - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne le domaine du diagnostic d'éventuels désordres du système immunitaire et l'analyse des réponses immunitaires. L'invention porte en particulier sur un procédé de détermination de la diversité des lymphocytes T dans un échantillon biologique, basé sur l'analyse, au niveau moléculaire, de la structure des jonctions résultant du réarrangement par recombinaison V(D)J de l'élément deltaRec-1 avec un gène AJ. Plus spécifiquement, la présente invention propose d'analyser la diversité combinatoire et/ou la diversité jonctionnelle des cercles d'excision (TREC) résultant du réarrangement de deltaRec-1, afin de déterminer l'hétérogénéité d'une population donnée de lymphocytes T.

Description

PROCEDE DE DETERMINATION DE LA DIVERSITE DES LYMPHOCYTES

T DANS UN ECHANTILLON BIOLOGIQUE

La présente invention concerne le domaine du diagnostic d'éventuels désordres du système immunitaire ou ayant des répercussions sur le système immunitaire. L'invention porte en particulier sur un procédé de détermination de la diversité des lymphocytes T dans un échantillon biologique.

Un lymphocyte T mature présente à sa surface un récepteur pour l'antigène (TCR) unique, formé par l'association de deux chaînes a et 13 ou y et â. Le TCR assure la fonction de reconnaissance antigénique des lymphocytes T, qui représente le point de départ de l'activation et de la prolifération de ces cellules. Le TCR est exprimé de manière clonale: chaque lymphocyte T porte à sa surface un TCR différent, spécifique d'un antigène donné. On appelle "répertoire" l'ensemble des lymphocytes T ayant des spécificités antigéniques différentes, et donc des TCR distincts. L'analyse de la diversité des TCR dans un échantillon donné permet donc de déterminer la diversité des lymphocytes T dans cet échantillon.

Les gènes codant pour le domaine V des chaînes TCR sont formés par la juxtaposition de gènes V et J, pour les chaînes TCRa et TCRy, et V, D et J pour les chaînes TCRf3 et TCRâ. Ils sont assemblés durant la différenciation des lymphocytes T par un mécanisme de recombinaison somatique dirigée, appelé "recombinaison V(D)J". Les gènes TCR sont regroupés en plusieurs loci. Le locus TCRB comporte les gènes BV, BD et BJ dont la recombinaison donnera les gènes codant pour la chaîne TCR(3. Le locus TCRAD est particulier: il comporte à la fois les gènes codant pour la chaîne TCRa et les gènes codant pour la chaîne TCRâ. Ce locus comporte plusieurs dizaines de gènes ADV/DV, dont une grande partie peut être utilisée soit pour une chaîne a soit pour une chaîne â. Cette région ADV/DV est suivie par les gènes DD et DJ, puis par les gènes AJ. Un réarrangement entre un gène ADV/DV, un gène DD et un gène DJ codera pour une chaîne TCRâ. Un réarrangement entre un gène ADV/DV et un gène AJ codera pour une chaîne TCRa.

La recômbinaison V(D)J permet de générer un répertoire de TCR extrêmement vaste. Les TCR diffèrent tout d'abord par la combinaison des segments V, D ou J réarrangés (diversité combinatoire). Pour les gènes TCRA, codant pour la chaîne TCRa, il existe par exemple chez la souris envi- ron 100 gènes V et 60 gènes J. Il y a donc potentiellement 6000 combinaisons possibles (voir figure 1). Pour les gènes TCRB (codant pour la chaîne TCRUU) il existe environ 450 combinaisons possibles (25 gènes V, 2 gènes D et 12 gènes J).

De plus, les mécanismes moléculaires de la recombinaison V(D)J introduisent une diversité jonctionnelle. Les gènes V, D et J sont bordés par de courtes séquences nucléotidiques conservées appelées séquences signal de recombinaison (recombination signal sequences, ou RSS). Ces RSS sont des motifs nucléotidiques composés d'un heptamère conservé et d'un nonamère semi-conservé, séparés par 12 ou 23 bases. La recombinaison est effectuée par un complexe qui comprend trois protéines exprimées spécifiquement dans les lymphocytes: les protéines RAG 1 et 2 (recombination activating genes), et la TdT (terminal nucleotidyl transferase). Les autres activités enzymatiques impliquées dans la recombinaison V(D)J sont fournies par des protéines ubiquitaires participant à la réparation de l'ADN par religature des extrémités ou recombinaison non homologue (non-homologous end joining, ou NHEJ).

La recombinaison V(D)J est initiée par l'introduction d'une coupure simple brin par les protéines RAG liées aux RSS. Cette coupure, située exactement à la jonction entre le gène et la RSS, génère une extrémité libre 3'-OH. Une attaque nucléophile de cette extrémité libre, sur le brin opposé, génère alors une cassure double brin; l'extrémité codante du gène est fermée en une structure en épingle à cheveux, tandis que l'extrémité des RSS est franche et phosphorylée. Pendant la phase suivante de la recombinaison V(D)J, les extrémités codantes subissent un apprêtement avant d'être ligaturées entre elles par les protéines participant à la NHEJ. Ceci implique notamment l'ouverture de la structure en épingle à cheveux, qui est imprécise et peut générer des répétitions inversées de quelques bases, appelées "nucléotides P". Des bases peuvent également être enlevées des extrémités libres de l'ADN codant. Enfin, la TdT peut ajouter à ces extrémités libres des bases supplémentaires, appelées "nucléotides N", indépendamment d'une matrice.

En conséquence, les jonctions codantes (JC) présentent une diversité très importante, tant du point de vue de la séquence de la jonction 35 que de sa longueur. Pratiquement chaque jonction réalisée dans un lympho- cyte T est unique et cette jonction constitue donc la signature moléculaire d'un lymphocyte T. Structurellement, au sein du domaine V des chaînes TCR, les acides aminés codés par la jonction V(D)J sont au centre d'un motif appelé "complementary determining region 3" (CDR3), bordé par des résidus codés par les gènes V et J. Chaque lymphocyte T exprime une combinaison unique de chaînes TCRa et TCR13 ou TCRy et TCR6, et les CDR3 de ces deux chaînes dictent la spécificité antigénique du TCR.

L'ADN compris entre les segments fusionnés lors de la recombinaison V(D)J est dans la plupart des cas excisé, et ses extrémités comportant les RSS sont ligaturées, formant ainsi un cercle d'excision (voir figure 2). Ces cercles ou TREC (T cell Receptor Excision Circles) ne se répliquent pas et sont dilués au cours de la division cellulaire. Chaque TREC est donc le marqueur d'un évènement de réarrangement, et contrairement au réarrangement codant pour les chaînes du TCR, sa quantité absolue ne varie pas en fonction de la prolifération cellulaire. Lors de la formation des TREC, les RSS sont ligaturées par les facteurs impliqués dans la réparation de l'ADN par religature des extrémités ou recombinaison non homologue (NHEJ). Les jonctions résultant de cette fusion des RSS des gènes réarrangés sont appelées "jonctions signal" (JS).

Dans quelques cas, lorsque les gènes réarrangés sont en orientation de transcription inverse, la recombinaison V(D)J n'entraîne pas la formation de TREC, mais conduit à l'inversion du fragment d'ADN séparant les gènes; dans ce cas uniquement, la jonction signal est retenue sur le chromosome et répliquée lors des divisions cellulaires.

Lors de la différenciation des lymphocytes T dans le thymus, les gènes codant pour la chaîne TCR(3 sont réarrangés et exprimés avant ceux codant pour la chaîne TCRa. Ces deux périodes de réarrangement sont séparées par une intense prolifération au cours de laquelle les lymphocytes ayant réussi à exprimer une chaîne TCR33 vont être très fortement amplifiés (jusqu'a 9 cycles de division). II peut donc y avoir jusqu'à 1000 cellules (29) portant le même réarrangement TCRB, qui peuvent potentiellement réarranger et exprimer des gènes TCRA différents. Les gènes ADV et AJ sont séparés sur le locus TCRAD par les gènes TCRD. Chez l'homme, il est générale-ment admis que lors de la maturation des lymphocytes T af3, les gènes TCRD sont excisés du locus avant que les gènes ADV et AJ se réarrangent. Cette excision résulte de la recombinaison d'une RSS particulière, ôRec-1, avec le gène AJ le plus proche, AJ61. Aucune séquence codante n'est associée à cette RSS. Le mécanisme de délétion des segments de gène codant pour la chaîne b des TCR, qui marque l'engagement des lymphocytes T dans la lignée a(3, a notamment été étudié par Shutter et al (Shutter, Cain et al. 1995), en utilisant des souris transgéniques dans lesquelles ont été intégrées les séquences humaines correspondant aux éléments de délétion b et à des gènes de la chaîne b des TCR. Les résultats décrits dans cette étude confirment que la délétion b intervient avant la recombinaison Va-Ja, et montrent que cette délétion implique la jonction de l'élément bRec avec différents segments AJ. Ces auteurs ont également montré, à partir d'ADN prove- nant d'un échantillon de thymus humain, que bRec-1 se recombine avec AJ 61, 60, 59, 58 et 57.

La diversité jonctionnelle résultant de l'apprêtement des extrémités codantes est une des caractéristiques essentielles du processus de recombinaison V(D)J, à l'origine de l'immense diversité des TCR. En revanche, il est généralement admis que les RSS sont ligaturées sans être apprêtées/modifiées, et donc que les jonctions signal (JS) portées par les TREC sont invariantes. Cette idée reste majoritairement répandue, malgré quelques publications décrivant une diversité au niveau de certaines JS. Ainsi, Candéias et al ont montré qu'une fraction significative (jusqu'à 24%) des jonctions signal résultant du réarrangement des gènes TCRB et TCRD chez la souris sont modifiées (Candéias, Muegge et al. 1996). Un article plus récent, étudiant également les jonctions signal résultant des recombinaisons V(3-D(3, montre que l'apparition de nucléotides N au niveau des jonctions signal dépend apparemment du locus V(3 utilisé pour la recombinaison, ce qui conduit les auteurs à suggérer que la configuration locale des chromosomes influe sur l'accessibilité à la recombinase (Kanari, Nakagawa et al. 1998). Ces articles restent toutefois limités au réarrangement de la chaîne 13 et, concernant l'article de Candéias et al, également au réarrangement de la chaîne â. Rien ne suggère que les mécanismes à l'origine de la diversité des JS au niveau des réarrangements des chaînes (i et b agissent également pour les gènes codant pour la chaîne TCRa.

Le dogme dominant, selon lequel les jonctions signal ne possèdent pas de diversité jonctionnelle dogme illustré notamment par la figure 5 de l'article de synthèse récent de Jung et al (Jung and Alt 2004) n'a jamais été remis en question concernant le réarrangement des gènes codant pour la chaîne TCRa. Au contraire, plusieurs auteurs ont récemment décrit des méthodes de quantification des TREC résultant de l'excision des gènes TORD, pour évaluer l'activité thymique chez des patients, basées sur l'amplification en temps réel de la jonction signal ôRecl/AJ61, en utilisant une sonde recouvrant cette jonction signal (Hochberg, Chillemi et al. 2001; Schônland, Zimmer et al. 2003), ou située juste en bordure (Hazenberg, Otto et al. 2000). Le choix d'une telle sonde indique que ces auteurs sont convaincus que cette jonction signal est invariante.

Dans certaines situations, il peut être intéressant de déterminer le niveau d'hétérogénéité des lymphocytes T circulants. Ceci peut être utile pour détecter des insuffisances du système immunitaire (moins ou pas de production de nouveaux lymphocytes) en raison de déficits immunitaires acquis ou congénitaux. Par exemple, la présence d'une population clonale ou pauci-clonale peut être le signe d'une réaction immunitaire en cours de développement, soit contre des cellules tumorales, soit en réponse à une infection.

Il est également utile de connaître le niveau d'hétérogénéité des lymphocytes T circulants pour suivre la reconstitution du système immunitaire après greffe de cellules hématopoiétiques (moelle osseuse ou cellules souches). En effet, cette reconstitution entraîne la production de novo de lymphocytes, avec éventuellement possibilité d'expansions clonales en raison de réactions du greffon contre l'hôte (GvH) ou de rejet de greffe. La présence d'une population clonale ou pauci-clonale serait alors la marque de l'expansion anormale d'un pool lymphocytaire particulier, ce qui peut être révélateur d'une GvH ou d'un rejet.

Plusieurs méthodes visant à déterminer la diversité d'une population de lymphocytes T ont déjà été décrites. La plupart d'entre elles sont passées en revue dans l'article de synthèse de Hodges et al (Hodges, Krishna et al. 2003).

Au niveau cellulaire, il est possible d'analyser la diversité d'une population lymphocytaire par cytométrie de flux (FACS), en utilisant une batterie d'anticorps monoclonaux dirigés contre les produits des différents gènes V[3 (région V3). Par comparaison avec des valeurs normales, ce test permet de déterminer si la distribution des lymphocytes est ou non altérée. Néanmoins, l'expression d'une région V13 ne représente qu'un des paramètres caractéristiques d'un lymphocyte donné car, comme exposé plus haut, les gènes codant pour la chaîne TCR(3 sont réarrangés et exprimés avant ceux codant pour la chaîne TCRa, ces deux périodes de réarrangement étant sépa- rées par une intense prolifération des lymphocytes exprimant une chaîne TCRI3. Il n'existe que peu d'anticorps dirigés contre les produits des gènes Va, rendant les analyses de ce paramètre par FACS impossibles. L'analyse par cytométrie de flux de la diversité des TCR est donc au mieux seulement indi- cative de l'homogénéité d'une population de lymphocytes T: elle ne concerne que l'expression des gènes V8, sans même prendre en compte la diversité jonctionnelle des CDR3 des chaînes TCR8. En outre, cette analyse nécessite une quantité importante de cellules (au minimum quelques millions de lymphocytes T).

Au niveau moléculaire, il est possible d'analyser la structure des gènes TCRA et TCRB exprimés par les lymphocytes T par différentes techniques basées sur la PCR, en amplifiant les gènes réarrangés soit à partir de transcrits, soit à partir d'ADN génomique. La séquence complète des loci TCRB et TCRA étant disponible, il est possible de choisir des amorces oligo- nucléotidiques spécifiques de chaque gène (ou famille de gènes) BV et ADV, des gènes BJ et AJ, et des gènes BC et AC codant pour les différents domaines des chaînes TCR3 et TCRa, respectivement. A partir de transcrits, on peut donc analyser les réarrangements des différentes familles ADV et BV par PCR quantitative en temps réel. La comparaison pour chaque famille (41 familles ADV et 30 familles BV, chez l'homme) avec le profil d'expression obtenu à partir d'échantillons contrôles permet de déterminer si un ou plusieurs gènes sont sur-représentés, indiquant une expansion lymphocytaire. Ce test permet de définir le niveau d'expression de chaque famille ADV ou BV dans un échantillon donné. Il ne donne cependant aucune information quant à la diversité des réarrangements de chaque gène ou famille de gènes ADV ou BV.

Toujours à partir de transcrits, un test de type "immunoscope" (élongation d'amorce marquée) permet de déterminer la distribution des tailles des CDR3 des gènes TCRA et TCRB réarrangés (Demande internationale WO 02/084567). Ce test nécessite la réalisation de deux réactions de PCR pour chaque famille: la première pour amplifier les transcrits utilisant un gène ADV ou BV donné et obtenir assez de matériel, la deuxième pour produire, par élongation d'une amorce marquée, de l'ADN simple brin marqué qui sera ensuite déposé sur un gel d'acrylamide. Ce test permet d'analyser l'hétéro- généité des CDR3 des chaînes TCRa et TCR8 exprimées dans la population analysée. En revanche, il ne permet pas de déterminer la distribution des différents gènes ADV et BV dans la population analysée.

Les tests décrits ci-dessus sont relativement lourds à mettre en oeuvre, car ils nécessitent la préparation d'ARN, puis la synthèse d'ADNc à partir de l'échantillon, ainsi que la réalisation d'un nombre important de réactions de PCR pour analyser toutes les familles ADV et BV. De plus, le travail à partir d'ARN nécessite la mise en place de précautions élaborées pour prévenir sa dégradation, et donc maintenir la représentativité de l'échantillon.

Les méthodes décrites à ce jour pour déterminer la diversité d'une population de lymphocytes reposent donc toutes sur l'analyse des réarrangements des gènes TCRB et, éventuellement, TCRA. Aucune de ces méthodes ne prend en compte le réarrangement qui conduit à l'inactivation du locus TCRD. A cet égard, il est connu que le réarrangement de bRec-1 inter-vient après le réarrangement des gènes TCRB, mais avant le réarrangement TCRA, durant la différenciation des lymphocytes T. La recombinaison au niveau de âRec-1 est considérée comme l'évènement initiateur de la recombinaison des gènes TCRA. Ce réarrangement excise du locus les gènes DD, DJ et DC codant pour une chaîne TCRâ et empêche ainsi la recombinaison et l'expression des gènes codant pour une chaîne TCRâ. Il engage ainsi définiti- vement les lymphocytes T dans la voie a(3. L'analyse de ce réarrangement permettrait donc de déterminer spécifiquement la diversité des lymphocytes T a8, en excluant les T y6.

Les inventeurs ont maintenant démontré que: - outre le réarrangement de bRecl avec un gène AJ, qui conduit à l'excision de l'intégralité du locus TCRD, il existe d'autres réarrangements conduisant à l'inactivation des gènes TCRD. Les inventeurs ont notamment observé, chez la souris, des réarrangements bRec-1/DJ2 et DD/AJ, qui conduisent à l'excision, respectivement, de tous les gènes DD, et du gène DC, rendant ainsi impossible l'expression d'une chaîne TCRâ.

- chez l'homme comme chez la souris, bRec-1 se réarrange non seulement avec AJ61, mais également avec (au moins) AJ58, AJ57 et AJ56. Chez l'homme, bRec-1 se réarrange également avec au moins AJ60 et AJ59.

- chez l'homme comme chez la souris, les jonctions signal résultant du réarrangement de Mec-1 avec un gène AJ ne sont pas invariantes. Une proportion significative (de 10 à 30%) des jonctions montre des signes d'apprêtement (ajout de nucléotides par la TdT et/ou délétion de quelques bases) des extrémités signal avant ligation. Il en résulte qu'il est possible de déterminer un profil caractéristique d'hétérogénéité de jonction signal pour chaque type de réarrangement âRec-1/AJ.

Ces nouveaux résultats impliquent qu'il existe une diversité combinatoire et jonctionnelle au niveau des jonctions signal présentes sur les TREC résultant de l'excision de gènes TCRD. Ces cercles d'excision constituent donc un nouveau critère pour analyser la diversité des lymphocytes T dans un échantillon. Ce critère, absent des méthodes actuelles d'analyse de la diversité des lymphocytes T, décrites plus haut, est particulièrement intéressant, car l'excision des gènes TCRD intervient après le réarrangement des gènes TCRB, mais avant le réarrangement TCRA, durant la différenciation des lymphocytes T. En particulier, les inventeurs ont démontré que la jonction signal produite lors de la recombinaison de ôRec1 constitue, au même titre que la jonction des gènes TCR, un élément de la signature moléculaire d'un lymphocyte T, et que le réarrangement de l'élément âRec-1 génère un répertoire de jonctions signal présentant à la fois une diversité combinatoire et une diversité jonctionnelle.

Un avantage particulier lié à l'analyse des jonctions signal résultant de l'excision de tout ou partie du locus TCRD est que ces jonctions sont portées par un cercle d'excision qui ne se réplique pas durant la prolifération cellulaire. Elles ne subissent donc aucune des variations dues aux évènements sélectifs qui façonnent le répertoire des lymphocytes T en fonction de la spécificité antigénique de leurs TCR. Ce réarrangement est donc un marqueur moléculaire caractéristique de l'émergence de nouveaux lymphocytes T dans le thymus, avant que le répertoire des TCR ne soit mis en place. Un tel marqueur, qui n'est ensuite modifié ni qualitativement, ni quantitativement, permet d'analyser, à partir de lymphocytes T périphériques, des événements qui se sont déroulés lors de l'émergence de nouveaux lympho- cytes T dans l'organisme (notamment dans le thymus).

La présente invention porte donc en premier lieu sur un procédé de détermination de la diversité des lymphocytes T dans un échantillon biologique d'un patient humain ou d'un animal, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'analyse de la diversité combinatoire et/ou de la diver- sité jonctionnelle des cercles d'excision (TREC) résultant de l'excision de tout ou partie du locus TCRD, lors de la recombinaison V(D) J. Ce procédé peut avantageusement être mis en oeuvre en analysant la diversité combinatoire et/ou la diversité jonctionnelle des cercles d'excision (TREC) résultant du réarrangement de bRec-1.

Les patients pour lesquels ce procédé sera particulièrement utile sont ceux pour lesquels un défaut du système immunitaire ou une maladie ayant des répercussions sur le système immunitaire est soit soupçonné, soit avéré, ainsi que les receveurs d'une greffe de cellules hématopoïétiques, pour lesquels on souhaite suivre la reconstitution du système immunitaire. Ce procédé peut être utilisé en complément du procédé d'analyse par cytométrie de flux décrit plus haut, mais il peut également être utilisé indépendamment. II permet d'analyser simplement un stade de réarrangement plus tardif que le réarrangement de TCRB, et beaucoup moins compliqué que le réarrangement de TCRA.

Le procédé de l'invention peut aussi être utilisé chez l'animal.

Un exemple de mise en oeuvre chez la souris est décrit ci-dessous, mais ce procédé est également transposable à d'autres animaux, en particulier aux mammifères tels que les bovins, le singe, le porc, le chat, le chien, le poulet... Le procédé de l'invention peut être utile à des fins expérimentales, pour étudier des modèles animaux de pathologies impliquant le système immuni- taire. A ce titre, on peut citer les infections par les virus d'immunodéficience simien (SIV) ou félin (FIV), qui constituent des modèles animaux de l'infection par HIV chez l'homme.

Des données de séquences ont été publiées pour certaines espèces de singes, et montrent des séquences de RSS ôRec-1 et AJ très proches de celles de l'homme et de la souris. Le procédé de l'invention est donc directement applicable au singe. Le singe est utilisé comme modèle animal pour étudier différentes pathologies humaines. Parmi ces pathologies, on peut citer les infections, notamment par le virus de l'hépatite C, ou par le virus d'immunodéficience (HIV chez l'homme, SIV chez le singe). Dans ce cadre, le procédé ci-dessus peut être utilisé pour étudier, à partir de biopsies, la diversité des lymphocytes T présents à différents stades de l'infection, correspondant par exemple au recrutement, puis à la prolifération des lymphocytes T. La biopsie sera choisie par l'homme du métier de façon à refléter l'évolution de la pathologie et/ou de la réponse immunitaire. Ainsi, pour étudier la réponse immunitaire au cours d'une infection par le virus de l'hépatite C, les biopsies seront avantageusement effectuées dans le foie.

Le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre à partir de n'importe quel échantillon biologique comportant des lymphocytes T. A titre d'exemples non limitatifs d'échantillons biologiques utilisables, on peut citer des échantillon de sang total, de cellules mononucléées totales, une biopsie contenant des lymphocytes T, ou encore une population de lymphocytes T triés par cytométrie de flux sur la base de l'expression de différents marqueurs membranaires, y compris leur TCR ou une région VR donnée.

Dans une mise en oeuvre préférée du procédé de l'invention, la diversité combinatoire des cercles d'excision résultant du réarrangement de bRec-1 est analysée en effectuant au moins trois réactions d'amplification d'un fragment des cercles d'excision, chaque réaction d'amplification étant spécifique d'une jonction signal résultant du réarrangement de bRec-1 avec une région AJ susceptible d'être ligaturée avec Mec-1. Les inventeurs ont montré que ces régions AJ sont essentiellement les régions AJ61 (aussi notée ipJa), AJ58, AJ57, et AJ56. Il peut également s'agir des régions AJ60 et AJ59. Bien entendu, dans cette mise en oeuvre de l'invention, les réactions d'amplification visent des réarrangements avec au moins 3, de préférence 4, et éventuellement 5 ou 6 régions AJ distinctes. Il est important de noter également que l'analyse de jonctions signal correspondant à d'autres réarrangements n'est pas exclue des procédés selon l'invention, dans une perspective d'étude plus exhaustive de la diversité d'une population de lymphocytes T. En effet, ôRec-1 peut se réarranger au moins jusqu'à AJ18 chez la souris (des jonctions signal résultant de ce réarrangement ont été mises en évidence), et au moins jusqu'à AJ2 chez l'homme (des jonctions codantes résultant de ce réarrangement ont été mises en évidence).

Dans le procédé ci-dessus, le terme "réaction d'amplification" fait référence à n'importe quelle méthode d'amplification d'acides nucléiques connue de l'homme du métier. On peut citer, à titre d'exemples et de façon non restrictive, l'Amplification en Chaîne par Polymérase (ACP), plus souvent désignée par l'homme du métier sous son acronyme anglophone, PCR (Polymerase Chain Reaction), la TMA (Transcription Mediated Amplification), la NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), la 3SR (Self Sustained Sequence Replication), l'amplification par déplacement de brin, ou SDA (Strand Displacement Amplification) et la LCR (Ligase Chain Reaction).

Selon une mise en oeuvre préférée du procédé de l'invention, les réactions d'amplification d'acide nucléique sont des réactions d'amplifica- tion en chaîne par polymérase (PCR), effectuées avec des couples d'amorces constitués chacun d'une amorce spécifique de ôRec-1 et d'une amorce spécifique d'une région AJ choisie parmi AJ61, AJ60, AJ59, AJ58, AJ57, et AJ56. Ces réactions sont effectuées de préférence dans des tubes séparés. Quelle que soit la technique utilisée pour réaliser les réactions d'amplification, l'ana-lyse des résultats consiste à examiner quelles réactions ont permis d'obtenir un produit d'amplification. Elles correspondent aux réarrangements présents dans la population de lymphocytes examinée, alors que l'absence d'amplification d'une jonction signal entre âRec-1 et une région AJ donnée indique que le réarrangement correspondant est absent de cette population. Bien entendu, des contrôles positifs sont de préférence utilisés lors de la mise en oeuvre du procédé de l'invention.

Le cas échéant, l'amplification peut être suivie en temps réel, par exemple en réalisant des PCR quantitatives. Ceci permet de quantifier les TREC présents dans l'échantillon biologique et, si ce dernier est approprié (par exemple, un échantillon de sang), d'évaluer la quantité de lymphocytes T récemment produits par le thymus. Des méthodes de quantification de la synthèse récente de lymphocytes T, basées sur la quantification des TREC dans un échantillon biologique, sont notamment décrites dans les articles de Schônland et al, Hazenberg et al, et Hochberg et al, cités plus haut. Toutefois, ces auteurs utilisent, pour quantifier les TREC présents dans un échantillon, une sonde située soit sur la jonction signal ôRec-1/AJ61, soit en bordure immédiate de cette jonction. Une telle sonde ne permet donc de détecter efficacement que les JS non modifiées (dans le cas de la sonde en bordure de la JS, elle permet également de détecter les JS modifiées uniquement de l'autre côté de la jonction). Ceci peut peut-être expliquer la dispersion des résultats observés par ces auteurs, même chez les sujets sains (voir notamment la Figure 1 de l'article de Hochberg et al). L'utilisation d'une sonde capable de s'hybrider avec les TREC portant des JS modifiées permettra de réduire cette dispersion, et donnera donc des résultats plus faciles à interpréter par le clinicien.

Il est donc proposé, selon un aspect de la présente invention, une méthodepour évaluer la production récente de lymphocytes T en quanti- fiant les TREC dans un échantillon biologique approprié, en utilisant une sonde distante d'au moins 5 à 10, et de préférence au moins 15 nucléotides de la jonction signal résultant du réarrangement parfait (sans modification) de 2881436 12 âRec-1 avec au moins une région AJ choisie dans le groupe constitué de AJ61, AJ60, AJ59, AJ58, AJ57, et AJ56. Cette méthode est avantageusement mise en oeuvre en quantifiant les TREC résultant du réarrangement de ôRec-1 avec au moins 2, 3, ou 4 régions AJ différentes. Cette quantification peut bien entendu être menée en complément de l'analyse, selon l'invention, de la diversité combinatoire et/ou jonctionnelle des cercles d'excision. Selon cet aspect de l'invention, la distance entre la sonde et la jonction signal est mesurée par rapport à la "jonction" proprement dite entre les deux RSS fusionnées, donc par rapport au centre du motif GTGCAC résultant du réarrangement parfait âRec-1/AJ, lorsque ce motif est créé.

Un autre aspect important de l'invention est l'analyse de la diversité jonctionnelle au niveau des jonctions signal présentes sur les cercles d'excision (TREC) résultant du réarrangement de bRec-1. En effet, les inventeurs ont mis en évidence qu'une proportion significative de ces jonctions signal, allant jusqu'à 40%, présente des "imperfections", et notamment des additions de nucléotides N. Cette propriété, insoupçonnée avant les travaux exposés ci-dessous, peut également être exploitée pour déterminer le degré d'hétérogénéité d'une population de lymphocytes T. Ainsi, l'invention porte également sur un procédé pour déterminer la diversité d'une population de lymphocytes T présents dans un échantillon, comprenant au moins une étape d'analyse de la diversité jonctionnelle d'au moins une jonction signal bRec-1/AJ. De préférence, la diversité jonctionnelle de la jonction signal la plus fréquente, c'est-à-dire la jonction bRec-1/AJ61, est examinée. De manière encore préférée, l'analyse de la diversité jonctionnelle des JS est effectuée en complément de l'analyse de la diversité combinatoire décrite ci-dessus.

Comme décrit ci-dessus, les jonctions signal correspondent à la fusion des RSS bordant les fragments réarrangés. Ces RSS sont constituées d'un heptamère conservé et d'un nonamère semi-conservé, séparés par 12 ou 23 bases. Les trois premières bases de l'heptamère présentent un degré de conservation très élevé, si bien que la grande majorité des RSS commencent par un triplet CAC. De ce fait, la ligature "parfaite" de deux RSS, par NHEJ, lors de la création d'une jonction signal, génère une séquence 5'-GTGCAC-3', qui correspond au site de restriction de l'enzyme ApaLl. Ceci permet de distinguer facilement les jonctions signal n'ayant subi aucune addition ni délétion, car elles sont sensibles à la restriction par ApaLl, contrairement aux jonctions signal modifiées.

Certaines RSS présentent toutefois des variations par rapport aux séquences conservées. Ceci est le cas, notamment des RSS de AJ60, chez l'homme et chez la souris, et de AJ59, chez la souris. L'analyse de la diversité jonctionnelle au niveau des jonctions signal impliquant ces RSS né- cessite donc d'utiliser d'autres techniques, par exemple de séquencer les jonctions en question.

Selon un mode de réalisation préféré des procédés de l'invention impliquant une analyse de la diversité jonctionnelle au niveau des JS, l'analyse de la diversité jonctionnelle comprend donc, pour chaque jonction signal bRec-1/AJ analysée, une étape d'amplification d'un fragment du cercle d'excision, comportant la jonction signal en question. Cette amplification est de préférence suivie, pour chaque jonction signal bRec-1/AJ analysée résultant du réarrangement de bRec-1 avec une région AJ choisie dans le groupe constitué de AJ61, AJ59, AJ58, AJ57, et AJ56 chez l'homme, ou AJ61, AJ58, AJ57, et AJ56 chez la souris, d'une étape d'analyse du profil de restriction par ApaLl du fragment amplifié. Différentes techniques pour analyser un profil de restriction d'un fragment d'ADN donné, par une enzyme déterminée, sont bien connues de l'homme du métier. Bien entendu, le fragment est incubé en présence de l'enzyme dans un tampon ad hoc. Le résultat de la digestion peut ensuite être analysé par migration sur gel d'agarose et visualisation par n'importe quelle technique disponible, par exemple par coloration au bromure d'éthydium (BET) ou au SybrGreen , ou encore par transfert sur membrane et hybridation avec une sonde marquée (radioactive, couplée à la peroxydase, au Texas Red ou autre).

Lorsque l'analyse de la diversité jonctionnelle intervient en complément de l'analyse de la diversité combinatoire des TREC, le même produit d'amplification d'un fragment du TREC peut être utilisé pour les deux aspects.

L'interprétation du résultat de la digestion du fragment par ApaLl est la suivante: si le fragment est complètement digéré, cela signifie que toutes les JS correspondant à la jonction ôRec-1/AJ analysée sont identiques et correspondent à la JS "canonique", non modifiée; si le fragment est complètement résistant à la restriction par ApaLl, toutes les JS correspondant à la jonction bRec-1/AJ analysée sont modifiées (ce qui ne signifie pas qu'elles sont identiques); le profil hybride (fragment partiellement sensible à ApaLl) est indicatif de la présence, dans l'échantillon étudié, d'au moins deux populations de lymphocytes comportant des TREC résultant du réarrangement de bRec-1 avec la région AJ analysée, l'une comportant une JS modifiée et l'autre non.

Dans le cas où une modification est mise en évidence par l'apparition d'un fragment résistant à ApaLl, ainsi que pour les JS qui ne présentent pas de site de restriction ApaLl, même en l'absence de modification (par exemple, les JS bRec-1/AJ60), il peut être intéressant d'effectuer une analyse qualitative des jonctions signal, notamment pour déterminer si la population des lymphocytes portant des TREC résistants à la restriction par ApaLl est homogène ou non. Par "analyse qualitative", on entend une analyse permettant de déterminer la nature (addition, délétion, substitution) des modifications apportées aux extrémités avant leur ligature pour former la jonction signal. Des procédés tels que décrits cidessus, comportant en outre une étape d'analyse qualitative des jonctions signal résistantes à la restriction par ApaLl, font donc également partie de la présente invention. Cette analyse qualitative peut être effectuée par différentes techniques connues de l'homme du métier, telles que le séquençage, ou l'extension d'amorce marquée. Elle est de préférence effectuée à partir des seuls fragments totalement ou partiellement résistants à ApaLl, mais le cas échéant, dans une perspective d'automatisation, elle peut être effectuée de façon systématique sur tous les fragments.

Un procédé particulier selon l'invention comprend les étapes suivantes: a. préparation de l'ADN à partir de l'échantillon biologique; b. réalisation d'au moins 3 ou 4 PCR, à l'aide de couples d'amorces dont chacun est constitué d'une amorce spécifique de bRec-1 et d'une amorce spécifique d'une région AJ choisie dans le groupe constitué de AJ61, AJ58, AJ57, et AJ56; c. restriction des produits des PCR avec l'enzyme de restric-30 fion ApaLl; d. analyse des profils de restriction obtenus à l'étape c.

e. le cas échéant, analyse qualitative des jonctions signal résistantes à la restriction par ApaLl, par extension d'amorce marquée.

A l'étape "a" de ce procédé, la préparation de l'ADN peut être 35 effectuée par n'importe quelle technique connue de l'homme du métier, telles que les techniques décrites au chapitre 6 du manuel de Sambrook et Russel (Molecular Cloning, Sème édition, CSHL press), ou en utilisant des trousses de préparation d'ADN disponibles dans le commerce.

Une étape intermédiaire peut, le cas échéant, être effectuée entre les étapes "b" et "c" de ce procédé, consistant à analyser les produits des amplifications réalisées à l'étape "b", par exemple par migration sur gel d'agarose et coloration. Cela permet de restreindre l'analyse des profils de restriction par ApaLl aux seules jonctions pour lesquelles un fragment a effectivement été amplifié.

Comme mentionné plus haut, la formation des jonctions signal est assurée par des protéines ubiquitaires participant à la réparation de l'ADN. II est donc probable que si l'une de ces protéines n'est pas complètement fonctionnelle, la proportion de jonctions signal modifiées augmentera. Les procédés décrits ci-dessus peuvent donc être utilisés pour détecter un éventuel désordre du mécanisme de réparation de l'ADN, qu'il s'agisse d'un défaut touchant une des enzymes impliquées dans la réparation par recombinaison non homologue (NHEJ), ou d'un facteur agissant en amont ou en aval de la recombinaison non homologue.

Un autre aspect de l'invention est une trousse de réactifs pour déterminer la diversité des lymphocytes T présents dans un échantillon biologique, par un procédé tel que ceux décrits ci-dessus. Une telle trousse comprend un ensemble d'au moins quatre amorces dont au moins une est spécifique de ôRec-1, et au moins trois sont spécifiques chacune d'une région AJ différente, sélectionnée dans le groupe constitué de AJ61, AJ60, AJ59, AJ58, AJ57, et AJ56. Ces amorces sont bien sûr choisies de façon à permettre l'amplification par PCR des jonctions signal résultant du réarrangement de bRec-1 avec les régions AJ sélectionnées. Parmi les réactifs additionnels éventuellement présents dans les trousses de l'invention, on peut citer les divers tampons et/ou enzymes nécessaires aux réactions d'amplification et/ou à la digestion par ApaLl, des échantillons pouvant servir de contrôles aux réactions d'extractions de l'ADN et/ou d'amplification et/ou de restriction, etc. A titre d'amorces et sondes utilisables dans les procédés et trousses de l'invention, on peut citer les oligonucléotides suivants: Tableau 1: Amorces et sondes pour amplifier des jonctions signal chez l'homme nom séquence SEQ ID NO: hôRec-1 RSS GAAAACACAGTGTGACATGGAGGGCTG 1 hôRec-1 RSSp AACTCGTGAGAACGGTGAATGAAG 2 hAJ61 RSS GGTGCCTCTGTCAACAAAGGTGATG 3 hAJ61 RSSp ATCCCTTTCAACCATGCTGACACC 4 hAJ6ORSS TCCCCCTTGCATCCCTAATCATGC 5 hAJ6ORSSp TGAGAGGAGGAAGTTACAGCACAGC 6 hAJ59RSS GCAATCAGAGGGCTGAAACACTTGG 7 hAJ59RSSp AAAAGGCTGTAAAGATCAAACCACC 8 hAJ58RSS TCATATCTCTGGACATATCTGTCAGG 9 hAJ58RSSp TAGTTCTTGGGAAGCTCTGCAAAGC 10 hAJ57RSS AGTAATCAGATTTGTTCTATAGGTCC 11 hAJ57RSSp GGGAATAGCTATACAATTGTATAA 12 hAJ56RSS GCTGGTTTTATCAGGGGGATTCTTGG 13 hAJ56RSSp TTAAGTAAATATCAAGGGGAGTTTGGG 14 Tableau 2: Amorces et sondes pour amplifier des jonctions signal chez la souris nom séquence SEQ ID NO: 5'JATA47 (AJ56) CAGTAGGGGATGGATGCTAACATGA 15 5'AJ47p (AJ56) AGTCCACAGATCCTACCACTGCTG 16 AJ57RSS-L TCCCTGGGAGACTCAC 17 AJ57RSSp TCTGGCTCCTATCGGCTAGCAGAAG 18 AJ58RSS-L GGATGGTATCGCTTATTCCT 19 AJ58RSSp TCGCACAGTGGAGGAAACTTCTAGTCCT 20 AJ59RSS CTCAGCAGACCTCAGTCCATCACC 21 AJ59RSSp ACAGGCACAATGAGTTGCCCTATCC 22 AJ6ORSS ATGACAGTCCAAGATGCTGCCTCC 23 AJ6ORSSp GACCTGGAGTGTGAGGGAAAAGTG 24 TREC_AJ61 TCTCTGAGGAACACGGAGTATC 25 TREC_AJ61p GCTGACAGGGCAGGTTTTTGTAAA 26 TREC_DR TGTGTCCTCAGCCTTGATCCAT 27 TREC_DRp ACTTATTGCAGCTCCTGAGCAT 28 Dans les Tableaux 1 et 2 ci-dessus, les oligonucléotides dont le nom se termine par un "p" peuvent être utilisés comme sondes lorsqu'ils sont marqués, mais peuvent également être utilisés comme amorces, notamment pour effectuer des PCR nichées ou semi-nichées (c'est-à-dire, à partir d'un produit amplifié par PCR, en utilisant deux ou une amorce(s), respecti- vement, internes au produit de la première amplification).

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels: Figures 1 et 2: Schémas explicatifs de la recombinaison V(D)J.

Figure 3: Analyse par Amplification et digestion par ApaLl des jonctions signal présentes dans une population de lymphocytes T isolée d'un patient.

Les jonctions signal ôRec-1/AJ61, bRec-1/AJ58 et ôRec-1/AJ57 ont été amplifiées à partir d'ADN extrait des lymphocytes péri- phériques CD4+ CD8+V1i1+ (triés par FACS) d'un patient et d'un échantillon de thymus humain (contrôle polyclonal). Les produits de PCR, non digérés (pistes 1, 3 et 5) et digérés (pistes 2, 4 et 6) par ApaLl ont été séparés sur gel d'agarose, puis transférés sur une membrane de Nylon et hybridés avec une sonde radioactive spécifique de ôRec-1.

Chez le patient, seules les amplifications ôRec-1/AJ61 et ôRec-1/AJ58 (pistes 1 et 3) donnent un produit, alors que chez le contrôle, les 3 réactions sont positives (pistes 1, 3 et 5). La diversité du répertoire des jonctions signal ôRec-1 est donc réduite chez le patient. De plus, les jonctions signal ôRec-1/AJ61 et ôRec-1/AJ58 amplifiées chez le patient sont entière- ment résistantes à la digestion par l'enzyme de restriction ApaLl (pistes 2 et 4), ce qui indique que les extrémités signal des gènes réarrangés ont été remaniées avant d'être ligaturées. En revanche, toutes les jonctions signal amplifiées à partir de l'ADN contrôle contiennent à la fois des produits sensibles et des produits résistants à la digestion (pistes 2, 4 et 6). Les jonctions amplifiées chez le patient sont donc moins diversifiées que dans l'échantillon contrôle, puisqu'elles ne comprennent pas de jonctions non modifiées. Les lymphocytes CD4+CD8+V(31+ isolés chez le patient possèdent donc un répertoire de réarrangements ôRec-1 réduit: il y a moins de réarrangements ôRec-1, et leur diversité jonctionnelle est restreinte, par rapport à un échantillon polyclonal contrôle.

Figure 4: Analyse de la diversité des jonctions ôRec-1/AJ58 Afin de déterminer si le produit de PCR ôRec-1/AJ58 (résistant à la digestion par ApaLl) amplifié à partir de la population CD4+CD8+V(31+ du patient contient une ou plusieurs espèces moléculaires, une analyse de diversité a été effectuée. Le produit de PCR ôRec-1/AJ58 a servi de matrice dans une réaction de PCR destinée à produire de l'ADN simple brin marqué à partir d'une amorce âRec-1 couplée au Texas Red . Cet ADN simple brin a ensuite été déposé sur un gel d'acrylamide, avec le produit correspondant amplifié à partir de l'échantillon contrôle. Cette méthode permet de séparer les différentes espèces moléculaires selon leurs longueurs, chaque taille donnant un pic de fluorescence. Dans l'échantillon contrôle (courbe en trait plein), on observe un pic majoritaire à la taille attendue pour une jonction non modifiée. Ces espèces moléculaires correspondent en grande partie aux jonctions sensibles à la digestion par ApaLl. On observe également plusieurs pics correspondant à des tailles supérieures, qui repré- sentent des espèces moléculaires comprenant des jonctions modifiées au moins par addition de nucléotides (encadrés). Ces pics correspondent aux jonctions modifiées présentes dans ce produit de PCR, résistantes à la digestion par ApaLl.

Dans le produit de PCR bRec-I/AJ58 amplifié à partir de la population CD4+ CD8+V[31+ du patient, on observe un seul pic. Ce produit ne contient donc qu'une seule espèce moléculaire. Il migre à la position correspondant à la taille attendue pour une jonction non modifiée, bien qu'il soit résistant à la digestion par ApaLl (voir figure 1). On peut donc en conclure que cette jonction a été modifiée par délétion puis ajout de nucléotide(s).

Figure 5: Mise en évidence des modifications N au niveau des JS ADV/AJ Les jonctions signal résultant des réarrangements de ADV2 et ADV8 avec AJ61, AJ58, AJ57 et AJ56 ont été amplifiées à partir d'ADN de thymocytes de souris C57BL/6 (wt) et déficientes en TdT (TdT). Les produits des PCR ont été digérés (+) ou non (-) par ApaLl avant migration sur gel et hybridation avec des sondes AJ internes.

Figure 6: Résultat du séquençage des jonctions signal ADV2/AJ à partir d'échantillons de souris sauvages et de souris TdToro * indique deux séquences présentant la même jonction mais utilisant des gènes ADV2 différents; ^ et ^^ indiquent deux séquences ayant la même jonction amplifiées à partir d'ADN de thymocytes de deux souris différentes.

Figure 7: Résultat du séquençage des jonctions signal murines DV102/DD2 et ADV2/DD2 Fiqure 8: Analyse de jonctions signal ôRec-1 /AJ humaines Des échantillons d'ADN de thymocytes de deux patients âgés de 10 jours (A) et 6 jours (B) ont été utilisés pour amplifier les JS résultant du réarrangement de ôRec-1 avec AJ61, AJ58, AJ57 et AJ56. Une fraction des produits PCR a été digérée par ApaLl; les produits digérés et non digérés ont ensuite été séparés sur gel d'agarose, transférés sur une membrane de nylon et hybridés avec une sonde ôRec-1 radiomarquée.

Fiqure 9: Résultat du séquençage des jonctions signal ôRec-1/AJ présentes dans un échantillon humain Fiqure 10: Amplification des JS résultant du réarrangement de ôRec-1 avec AJ61, AJ58, AJ57 et AJ56, à partir d'ADN de thymocytes murins.

Les produits PCR ont été séparés sur un gel d'agarose, puis transférés sur une membrane de nylon et hybridés avec une sonde ôRec-1 15 radiomarquée.

Figure 11: Résultat du séquençage des jonctions signal ôRec-1/AJ61 présentes dans un échantillon murin.

II doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne 20 constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLES

Exemple 1: détermination du degré d'hétérogénéité d'une population de lymphocytes T chez un patient I.A. Mode opératoire 1.A.1. Préparation de l'ADN Pour l'extraction de l'ADN le kit d'extraction nucleospin tissue de Machery Nagel a été utilisé, en suivant les instructions fournies.

É Les cellules sont culottées par 5 minutes de centrifugation à 1200 rpm (correspondant à 300 g). Le culot sec (jusqu'à 10 millions de cellules) est repris dans 185 pl de tampon de lyse Ti mélangé à 25pl de protéinase K fournie dans le kit.

É L'échantillon est vigoureusement vortexé et mis à digérer toute la nuit à 56 C.

É 200 pl de tampon B3 sont ensuite ajoutés, le lysat est 35 vortexé et mis à incuber à 70 C pendant 10 minutes É 210 pI d'éthanol absolu sont ajoutés et l'ensemble est déposé sur une colonne fournie dans le kit É La colonne est vortexée à 11000 g pendant une minute (fixation de l'ADN sur la silice) É La colonne est ensuite lavée avec 500 pl de BW puis 600 pI de B5 avec une centrifugation de 1 minute à 11000 g à chaque fois É La silice est séchée par centrifugation de 3 minutes à 11000 g É L'ADN est ensuite élué avec un volume de 50 à 200 pl de BE selon la quantité de cellules lysées au départ. Pour cela, le BE préchauffé à 70 C est déposé sur la colonne et l'ensemble est incubé 2 minutes à 70 C dans une étuve. L'ADN est récupéré par centrifugation de 1 minute à 11000 g 1. A.2. Amplification des Jonctions Signal Cette étape a pour but d'amplifier par PCR les jonctions signal d'intérêt, afin d'obtenir assez de matériel pour étudier leur structure.

à 200 ng d'ADN total sont utilisé pour chaque réaction de PCR. Selon l'échantillon, une deuxième PCR (PCR nichée, ou nested PCR) peut être nécessaire.

Les amplifications sont réalisées à l'aide de l'enzyme TaqGold (Applied Biosystem), dans le tampon "Master Mix" fourni. Des amorces spécifiques de ôRec-1 (SEQ ID No: 1) d'une part, et de AJ61 (SEQ ID No:3), AJ58 (SEQ ID No: 9), AJ57 (SEQ ID No: 11) et AJ56 (SEQ ID No: 13) d'autre part, ont été utilisées. Ces amorces sont choisies de manière à amplifier les Quatre réactions de PCR sont réalisées par ou 200 ng 12,5 pl 2 pI 2 pl qsp 25 pl 10' à 94 C cycles comportant la séquence suivante: 30" à 94 C, 30" à 64 C et 30" à 72 C, puis 10' à 72 C. 35

jonctions signal uniquement. échantillon.

Pour 25 pI de réaction: ADN: Master MIX 2X: Oligo sens à 5 pM: Oligo réverse à 5 pM: H2O: Conditions de PCR: Deuxième PCR avec un oligonucléotide spécifique de la région AJ plus interne (PCR nichée) : SEQ ID No: 4 pour AJ61, SEQ ID No: 10 pour AJ58, SEQ ID No: 12 pour AJ57, et SEQ ID No: 14 pour AJ 56 et, toujours, SEQ ID No: 1 pour ôRec-1.

Pour 25 pI de réaction: Produit de la 1ère PCR: 4p1 Master MIX 2X: 12,5 pl Oligo sens à 5 pM: 2 pl Oligo reverse à 5 pM: 2 pI H2O: qsp 25 pl Conditions de PCR: 10' à 94 C lx cycles comportant la séquence suivante: 30" à 94 C, 30" à 64 C et 30" à 72 C, puis 10' à 72 C.

Dépôt des produits de PCR sur gel d'agarose. Une première indication du degré d'hétérogénéité des lymphocytes contenus dans l'échantillon est obtenue à ce stade, selon que les 4 réactions sont positives ou non.

1.A.3. Détection de la diversité des jonctions signal par digestion avec l'enzyme ApaL 1: Cette étape a pour but de déterminer si les jonctions signal amplifiées à l'étape précédente sont diversifiées. Les RSS des gènes choisis (bRec-1, AJ61, AJ58, AJ57, AJ56) correspondent à la séquence RSS consensus et donc débutent par les 3 nucléotides GTG ou CAC. En conséquence, la ligature parfaite des deux RSS pour former une jonction signal crée un site (5'-GTGCAC-3') reconnu par l'enzyme de restriction ApaLl.

Une fraction importante (jusqu'à 30%) des jonctions signal résultant de la recombinaison V(D)J des gènes portés par le locus TCRAD ne sont pas formées par la ligature parfaite des RSS des gènes réarrangés, mais montrent des signes d'apprêtement par délétion et/ou addition de nucléotides aux extrémités RSS avant ligature. La diversité jonctionnelle qui en résulte empêche la formation du site de restriction ApaLl, et ces jonctions modifiées sont donc résistantes à la digestion par cette enzyme. La présence de deux espèces moléculaires après digestion des produits de PCR par ApaLl, une sensible et une résistante, est donc indicative de la diversité des jonctions amplifiées. Cette diversité révèle la présence de lymphocytes T ayant réalisé des évènements de recombinaison V(D)J différents.

Si au contraire seule une espèce moléculaire est détectée, alors la diversité de l'échantillon analysé est réduite par rapport à un échantillon contrôle.

La digestion est réalisée dans un volume final de 20 pl à 37 C 5 pendant 3h avec 5U d'enzyme ApaLl.

Produit de PCR: 10 pl Tampon de digestion 10X: 2 pl Enzyme 10U/pl: 0,5 pl H2O: 7,5 pl Un contrôle est réalisé dans les mêmes conditions, en omettant l'enzyme de restriction: Produit de PCR: 10 pl Tampon de digestion 10X: 2 pl H2O: 8 pl Séparation des produits digérés ou non par électrophorèse sur gel d'agarose à 2% en tampon TBE 1X en présence de BET.

L'ADN est ensuite transféré par capillarité sur membrane de Nylon Hybond N+ (Amersham), puis fixé sous UV (700 J).

La membrane est ensuite préhybridée avec du Rapid Hyb buffer (Amersham) 30 min à 42 C, puis hybridée à 42 C pendant 4 heures avec une sonde oligonucléotidique spécifique de ôRec-1 marquée au 32P par incubation avec la polynucléotide kinase du phage T4 et de l'ATPy32P, dans les conditions indiquées par le fournisseur.

La détection du signal radioactif se fait grâce à un 25 phosphorimager.

1.A.4. Analyse qualitative des jonctions signal humaines par extension d'amorce marquée Cette technique permet de déterminer la longueur des différentes jonctions signal bRec-1/AJ amplifiées à partir d'une population de lymphocytes T. II est ainsi possible de déterminer qualitativement les modifications introduites au niveau de la jonction signal. La distribution des fragments obtenus permet d'estimer la diversité de la population analysée. Cette méthode consiste à amplifier de l'ADN simple brin par PCR avec une amorce comportant un fluorochrome: le Texas-red. Ces fragments sont ensuite réso- lus sur un gel de polyacrylamide.

Volume final: 12,5 pl avec le kit master Mix amplitaq Gold de Applied biosytem Produit de PCR: 0,5 pl Master mix 2X: 6,25 pI Oligo 1 pM: 0,5 pl H2O: 5,25 pl Cycles de PCR: 6' à 94 C 12 cycles comportant la séquence suivante: 2' à 94 C, 1' à 64 C, et 7' à 72 C, puis 12' à 72 C.

9 pI de produit de PCR ont ensuite été mélangés avec 16 pl de formamide et 1 pl de marqueur fluorescent. Le mélange a été chauffé 5' a 96 C, puis injecté dans un séquenceur ABI Prism 310.

1.B. Résultats L'analyse par cytométrie de flux des lymphocytes T dans des prélèvements sanguins chez un patient a montré une distribution très altérée de l'utilisation des différents gènes V[3. Les lymphocytes T de ce patient utilisent de manière très majoritaire le gène V(31. De plus, on a détecté chez ce patient une population de lymphocytes T inhabituelle, qui exprime à la fois les molécules CD4 et CD8. Les lymphocytes T de cette population utilisent aussi de manière quasi-exclusive le gène V(31.

Ces lymphocytes T CD4+CD8+V(31+ ont été triés par cytométrie de flux et leur ADN préparé. Cet ADN a servi de matrice pour amplifier les jonctions signal bRec-1/AJ61, ôRec-1/AJ58, et ôRec-1/AJ57 (la quatrième combinaison, bRec-1/AJ56, n'a pas été réalisée dans cet exemple). Seules les amplifications ôRec-1/AJ61 et ôRec-1/AJ58 ont donné un produit, alors qu'un échantillon contrôle d'ADN extrait de thymocytes totaux (population normalement diversifiée) a donné un produit pour les 3 réactions (Fig 1, pistes 1, 3 et 5). Ce résultat indique que les lymphocytes T CD4+CD8+VI31+ purifiés à partir du sang du patient présentent un répertoire de réarrangements ôRec-1 restreint.

Les produits de PCR ont été soumis à une digestion par l'enzyme de restriction ApaLl et ceux provenant du patient ont été trouvés résistants (Fig 1, pistes 2, 4 et 6). Ce résultat indique que toutes les jonctions signal amplifiées sont modifiées chez le malade, alors que dans l'échantillon contrôle amplifié à partir de thymocytes, la majorité des jonctions signal sont non-modifiées, et on distingue donc des produits sensibles et des produits résistants à la digestion par ApaLl (Fig 1, pistes 2, 4 et 6). Ce résultat indique que la diversité jonctionnelle des jonctions signal amplifiées à partir des lymphocytes T CD4+CD8+Vt31+ du patient est limitée.

Pour déterminer si les jonctions signal amplifiées à partir de la population CD4+CD8+V(31+ sont poly ou mono-clonales, un test d'élongation d'amorce marquée de type "immunoscope" a été réalisé sur le produit de PCR ôRec-1/AJ58. Une seule espèce moléculaire a été trouvée dans ce produit de PCR (figure 2).

Ces expériences indiquent 1) que le répertoire des réarrangements bRec-1 est limité dans la population analysée (seuls 2 réarrangements sur 3 testés), et 2) que les jonctions qui sont retrouvées présentent un degré de diversité très restreint par rapport à un échantillon polyclonal contrôle.

Ces résultats suggèrent donc que la population de lymphocytes T CD4+CD8+ V(31+ résulte de la prolifération d'un faible nombre de lymphocytes initiaux.

Exemple 2: Modifications des jonctions signal lors de la recombinaison 20 V(D)J des gènes du locus TCRAD chez la souris 2.A. Matériels et méthodes 2.A.1. Souris Les souris C57BL/6 ont été élevées dans l'animalerie du Commissariat à l'Energie Atomique, à Grenoble. Les souris ont été sacrifiées par inhalation de CO2 et leur thymus a été prélevé à l'âge de 4-8 semaines.

2.A.2. Préparation de l'ADN L'ADN des thymocytes de souris C57BL/6 a été préparé à partir de 10' cellules en utilisant le kit d'extractionnucleospin tissue de Machery Nagel , en suivant les instructions du fabricant. L'ADN de thymocytes TdT '0 a été obtenu à partir de souris TdT "0 (Gilfillan, Dierich et al. 1993).

2.A.3. Amplification et digestion des jonctions signal L'ADN de thymocytes (100 ng) a été amplifié avec des amorces appropriées en utilisant le mélange AmpliTaqGold PCR comme suit: 10 minutes à 94 C, puis 35 cycles comportant la séquence suivante: 30 sec.

à 94 C, 30 sec. à 60 C et 30 sec. à 72 C, suivis de 10 min. à 72 C. Les réactions de PCR ont été réalisées sur un appareil "GenAmp PCR system 9600" de Perkin-Elmer, dans un volume final de 25 pl. Les séquences des amorces sont indiquées dans les Tableaux 1 et 2 ci-dessus.

Après amplification, 5 à 10 pl des produits de l'amplification PCR ont été digérés avec 5 unités d'enzyme de restriction ApaLl (Amersham Pharmacia Biotech) pendant 3 heures à 37 C dans le tampon fourni avec l'enzyme. Des contrôles ont été incubés de la même façon, mais sans ApaLl. Les produits digérés et non digérés ont été résolus côte à côte sur gel d'agarose 2%, transférés sur membrane N-Hybond+ (Amersham Biosciences) et hybridés avec un mélange de sondes oligonucléotidiques radiomarquées, spécifiques des régions AJ des jonctions signal amplifiées présentées dans les Tableaux 1 et 2 ci-dessus (sondes de SEQ ID Nos: 16, 18, 20 et 24). L'analyse des blots hybridés avec ces sondes a été réalisée sur un "Persona/ FX Imager' (Biorad), en utilisant le logiciel "Quantity One".

2.A.4. Clonage et séquençage des jonctions signal Les produits PCR ont été purifiés sur gel, clonés dans le vecteur pGEM-T Easy (Promega ) selon les instructions du fabricant, et transformés dans des bactéries compétentes. Après étalement, les colonies positives ont été identifiées par hybridation avec des sondes oligonucléo- tidiques spécifiques des régions AJ. Les plasmides ont été préparés à partir des colonies contenant les jonctions signal, soit avec le kit Wizard miniprep (Promega ), soit avec le système Montage Plasmid Miniprep 96 (Millipore Corporation ). Les plasmides contenant les JS ont ensuite été digérés individuellement par ApaLl. Le plasmide pGEM-T easy contient 2 sites pour cette enzyme. Si le plasmide recombinant contient une jonction signal non modifiée, formée par la fusion parfaite des RSS, un site ApaLl additionnel est introduit et la digestion donne 3 bandes après migration sur gel d'agarose. Si le plasmide recombinant contient une jonction signal modifiée, un tel site additionnel n'est pas introduit et la digestion donne seulement 2 bandes. Les plasmides présentant des profils inattendus, dans le nombre ou dans la taille des fragments d'ADN, ont été exclus des analyses ultérieures. Les plasmides contenant des jonctions signal modifiées ont été séquencés (Genome Express, Meylan, France), pour identifier la nature des modifications. Les jonctions signal identiques obtenues à partir d'un même échantillon ont été comptées une seule fois, car il est impossible de déterminer si ces occurrences multiples résultent d'événements indépendants ou d'une sur-amplification d'une jonction signal unique.

2.B. Résultats 2.8.1. Les jonctions signal ADV/AJ présentent une diversité fonctionnelle liée à l'action de la TdT Les JS résultant de la recombinaison des gènes ADV2 et ADV8 avec AJ61, AJ58, AJ57 et AJ56 ont été amplifiées à partir d'ADN de thymocytes de souris C57BL/6. Les produits PCR non digérés et digérés par ApaLl ont ensuite été analysés par migration sur gel d'agarose, suivie d'une révélation par transfert et hybridation avec des sondes radiomarquées spécifiques des régions AJ. Pour toutes les combinaisons ADV-AJ testées, une fraction significative des produits PCR était résistante à la restriction par ApaLl. Cette résistance indique que certaines jonctions signal sont modifiées et ne consistent pas en un simple raboutage des RSS.

L'implication potentielle de la TdT dans la génération des jonctions signal résistantes à la restriction par ApaLl (SJ ApaLl-R) a été analysée en effectuant les mêmes expériences à partir d'ADN de thymocytes déficients en TdT. Cela a révélé de façon nette qu'en l'absence d'expression de la TdT, les SJ ApaLl-R sont quasiment inexistantes, pour toutes les combinaisons testées (figure 5).

Des résultats similaires ont été obtenus en analysant les SJ produites après le réarrangement de ADV1, ADV20 et ADV6 avec les mêmes gènes AJ. La modification des SJ intervient donc lors du réarrangement d'au moins 5 des 21 familles de gènes ADV situées dans la région ADV/DV en 5' de ôRec- 1.

Ces résultats montrent que (i) les jonctions signal ADV-AJ présentent une diversité jonctionnelle, et (ii) cette diversité résulte presque totalement de l'addition de nucléotides N par la TdT.

2.8.2. Quantification et structure des jonctions signal modifiées Afin de déterminer précisément le pourcentage des jonctions signal modifiées, les jonctions signal ADV2/AJ ont été amplifiées à partir de d'ADN de thymocytes sauvages et clonés, de telle sorte que chaque JS puisse être analysée indépendamment par digestion par ApaLl du plasmide recombinant correspondant. Comme montré dans le Tableau 3 ci-dessous, la fréquence des SJ ApaLl-R varie de 9,7% pour ADV2/AJ58 à 39,1% pour ADV2/AJ61, avec une moyenne de 33,6%. Ainsi, une fraction significative des JS ADV2/AJ sont modifiées, même si la fréquence des modifications semble varier légèrement selon le gène AJ réarrangé.

Tableau 3: Analyse des jonctions signal produites durant le réarrangement des gènes TCRA chez la souris ApaLl-S ApaLl-R ApaLl-R Séquences Fréquence N/Séq. JS avec (S) séquencés uniques (R) R*/(R*+S) délétion ADV2-AJ61 14 11 9 9 39,1 % 3,1 1 ADV2-AJ58 28 4 4 3 9,7 % 1,7 0 ADV2-AJ57 25 6 6 6 19, 3 % 2,5 0 ADV2-AJ56 35 18 17 16 31,4 % 3,1 0 Total 67 39 36 34 33,6 2,6 1 La majorité de ces JS ApaLl-R ont été séquencées, pour identifier précisément la nature des modifications. Ces modifications consistaient essentiellement en addition de nucléotides N. Il a été trouvé que ces séquences contenaient entre 1 et 7 nucléotides sans support sur une matrice, avec une moyenne de 2,8 par séquence. Ces additions de nucléotides N correspondent principalement en des nucléotides G et C, qui représentent ensemble plus de 70% des bases ajoutées (Figure 6). Ceci constitue un biais typique de l'activité de la TdT. A deux exceptions près, les JS ADV2/AJ résistantes à ApaLl étaient uniques, ce qui indique que le répertoire des SJ modifiées présente une grande diversité.

II est important de noter qu'une JS ADV2/AJ57 dans laquelle 4 nucléotides N ont été insérés montre également une délétion de 3 bases de l'heptamère ADV2, ce qui suggère qu'une perte de nucléotides des extrémités RSS peut contribuer à la diversité des SJ. Cette observation a conduit les inventeurs à examiner la structure des SJ en l'absence d'expression de la TdT. Des SJ ADV2/AJ56 amplifiées à partir de souris déficientes en TdT ont été clonées, et les plasmides recombinants obtenus ont été analysés. La fréquence des plasmides ApaLl-R a été trouvée de 2, 7% (2 sur 74). Dans une de ces séquences, des nucléotides ont été délétés des deux signaux portés sur ADV2 et AJ56 (1 et 3 nucléotides, respectivement). Dans l'autre, 4 bases ont été délétées de l'heptamère de AJ56, tandis que le signal sur ADV2 est complet. Cette jonction contient également un nucléotide additionnel (Figure 6, dernières lignes).

II apparaît donc que la perte de bases des RSS est rare, et que la plupart des modifications observées dans les SJ du TCRA résultent d'additions de nucléotides N. 2.8.3. Les jonctions signal du TCRD sont modifiées par des additions de nucléotides N et par une activité exonucléolytique Une étude précédente de Candéias et al (supra) a montré que le réarrangement des gènes TCRD génère des jonctions signal modifiées tant par addition de nucléotides N que par perte de base(s). Ces données ont été obtenues après analyse du réarrangement de DV105 avec DD2. Cependant, DV105 se réarrange par inversion et la formation de SJ est donc cruciale pour maintenir l'intégrité chromosomique et assurer la survie cellulaire. Il est théoriquement possible que, lors de recombinaison par inversion, les RSS soient plus étroitement liées avec le complexe de recombinaison V(D)J, incluant l'activité exonucléolytique, afin d'assurer la formation de la SJ. Ceci pourrait expliquer la présence de délétions au niveau des extrémités RSS de DV105 et DD2. Par conséquent, afin de déterminer si la délétion de bases des éléments signaux (ES) est une caractéristique générale du réarrangement des gènes TCRD, ou si cela constitue au contraire une spécificité du réarrange- ment par inversion, les inventeurs ont analysé la structure des JS produites pendant le réarrangement qui se produit par délétion entre DV102 et DD2.

La digestion par ApaLl des plasmides recombinants obtenus après l'amplification des SJ DV102/DD2 et le clonage à partir d'ADN de thymocytes de souris C57BL/6 a révélé la présence de 34% de SJ ApaLl-R 3o (Tableau 4). De façon remarquable, l'analyse par séquençage a montré que 4 de ces jonctions signal modifiées (sur 17 jonctions différentes) ont perdu des nucléotides au niveau des extrémités terminales des RSS des DV102 et/ou DD2 (Figure 7). La perte de nucléotides des ES avant leur ligature n'est donc pas dépendante du fait que les gènes TCRD se réarrangent par délétion ou inversion.

La même analyse a ensuite été réalisée sur les JS ADV2/DD2 amplifiées à partir d'ADN de thymocytes de C57BL/6. La proportion des plasmides recombinants ApaLl-R a été trouvée de 44,7% (Tableau 4). L'analyse par séquençage a révélé 21 jonctions modifiées différentes. Dans 5 d'entre elles, les modifications ont consisté à la fois en l'addition de nucléotides N et en la délétion de bases des extrémités signal (Figure 7). Cette proportion est similaire à celle trouvée dans les SJ DV102/DD2. Cependant, elle est statistiquement différente (p=0,01 par le test de Mann-Whitney) de celle des délétions trouvées dans les JS ADV2/AJ résistantes à ApaLl (1 délétion sur 34 jonctions signal dans des thymocytes sauvages), ce qui indique que davantage de délétions sont introduites dans les JS produites pendant le réarrangement des gènes TCRD que lors du réarrangement des gènes TCRA, même lorsque la même famille de gènes ADV est utilisée dans les deux types de réarrangements.

Tableau 4: Analyse des jonctions signal produites durant le réarrangement des cènes TCRD chez la souris ApaLl-S ApaLl-R ApaLl-R Séquences Fréquence N/Séq JS avec (S) séquencé uniques (R*) R*/(R*+S) délétion(s) ADV2- 26 28 25 21 44,7 % 2,8 6 DD2 DV102- 33 25 25 17 34 % 3, 1 4 DD2 Total 59 53 50 38 39,2 2,9 10 Il apparaît donc que les mécanismes responsables de la diversité des jonctions signal diffèrent suivant que les JS en question résultent 20 du réarrangement des gènes TCRA ou TCRD.

2.8.4. Le réarrangement de l'élément 6Rec-1 présente une diversité combinatoire et fonctionnelle Les inventeurs ont ensuite analysé plus en détail la structure des jonctions signal produites par la recombinaison de l'élément ôRec-1 avec les gènes AJ. Les JS produites par la recombinaison de ôRec-1 avec AJ61, AJ58, AJ57 et AJ56 ont été amplifiées à partir d'ADN de thymocytes humains, et les produits de ces amplifications ont été digérés par ApaLl. La figure 8 montre qu'une fraction importante des produits PCR est résistante à la restric- tion par ApaLl, ce qui révèle l'existence, pour tous les réarrangements testés, de jonctions signal modifiées. Pour déterminer la nature des modifications, les produits résistants à ApaLl ont été purifiés sur gel et clonés; les plasmides présents dans des colonies sélectionnées au hasard ont été séquencés (figure 9). La présence de nucléotides N était évidente dans toutes les JS ApaLl-R analysées. En moyenne, 5,45 nucléotides ont été ajoutés par séquence, leur nombre variant de 1 à 11. Dans quatre cas (16%), des bases d'un des éléments signaux ont été perdues. Ces délétions varient de 1 à 13 bases. Cette fois encore, seulement une des séquences a été trouvée deux fois, ce qui montre la diversité du répertoire des SJ modifiées. Les jonctions signal bRec-1/AJ dans les thymocytes humains présentent donc une diversité jonctionnelle.

Les inventeurs ont ensuite cherché à déterminer si le réarrangement de l'élément âRec-1 murin est restreint au pseudogène AJ61 ou si, comme dans le thymus humain, d'autres gènes AJ peuvent également être utilisés. La même approche a été utilisée, et les JS résultant de la recombinaison de âRec-1 avec AJ61, AJ58, AJ57 et AJ56 ont été amplifiées à partir d'ADN de thymocytes murins. Ces JS étaient facilement détectables, comme montré à la figure 10. En outre, les inventeurs ont détecté des réarrangements de âRec-1 avec d'autres gènes AJ plus distants, jusqu'à AJ18. Ces résultats démontrent que les JS impliquant l'élément âRec-1 murin présentent, comme chez l'homme, une diversité combinatoire. Comme la RSS de l'élément âRec1 murin comporte un site ApaLl, la diversité jonctionnelle de ces JS ne peut pas être testée directement par restriction. Les JS bRec-1/AJ61 ont en conséquence été directement clonées et séquencées. Sur 34 JS analysées, 11 (31,42%) étaient modifiées (figure 11). Elles contiennent toutes des nucléotides N, de 2 à 12 par séquence, avec une moyenne de 4,4 par séquence. Dans une des JS, 3 bases ont en outre été délétées de âRec-1. Une fois de plus, l'absence de séquences redondantes illustre la diversité du répertoire murin des JS impliquant bRec-1.

Ces résultats montrent que la recombinaison de l'élément âRec-1 murin dans les thymocytes sauvages génère un répertoire de JS qui présente une diversité combinatoire et jonctionnelle.

REFERENCES

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Claims (16)

REVENDICATIONS

1. Procédé de détermination de la diversité des lymphocytes T dans un échantillon biologique d'un patient humain ou d'un animal, caractérisé en ce qu'il comporte une étape d'analyse de la diversité combinatoire et/ou de la diversité jonctionnelle des cercles d'excision (TREC) résultant de l'excision de tout ou partie du locus TCRD.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte une étape d'analyse de la diversité combinatoire et/ou de la diversité jonctionnelle des cercles d'excision (TREC) résultant du réarrangement de bRec-1.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la diversité combinatoire des cercles d'excision résultant du réarrangement de bRec-1 est analysée en effectuant au moins trois réactions d'amplification d'un fragment des cercles d'excision, chaque réaction d'amplification étant spécifique d'une jonction signal résultant du réarrangement de bRec-1 avec une région AJ choisie dans le groupe constitué de AJ61, AJ60, AJ59, AJ58, AJ57, et AJ56.

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les réactions d'amplification d'acide nucléique sont des réactions d'amplification en chaîne par polymérase (PCR), effectuées avec des couples d'amorces constitués chacun d'une amorce spécifique de bRec-1 et d'une amorce spécifique d'une région AJ choisie dans le groupe constitué de AJ61, AJ60, AJ59, AJ58, AJ57, et AJ56.

5. Procédé selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que trois ou quatre réactions d'amplification sont effectuées, chaque réaction d'amplification étant spécifique d'une jonction signal résultant du réarrange-ment de bRec-1 avec une région AJ choisie dans le groupe constitué de AJ61, AJ58, AJ57, et AJ56.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, comportant une étape d'analyse de la diversité des jonctions signal présentes sur les cercles d'excision résultant du réarrangement de bRec-1 avec au moins une région AJ choisie dans le groupe constitué de AJ61, AJ60, AJ59, AJ58, AJ57, et AJ56.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que, pour chaque jonction signal bRec-1/AJ analysée, l'analyse de la diversité jonctionnelle comporte une étape d'amplification d'un fragment du cercle d'excision, ledit fragment comportant ladite jonction signal.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que, pour chaque jonction signal bRec-1/AJ analysée et résultant du réarrange- ment de bRec-1 avec une région AJ choisie dans le groupe constitué de AJ61, AJ59, AJ58, AJ57, et AJ56 chez l'homme, ou AJ61, AJ58, AJ57, et AJ56 chez la souris, l'analyse de la diversité jonctionnelle comporte en outre une étape d'analyse du profil de restriction, par l'enzyme ApaLl, du fragment du cercle d'excision amplifié.

9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce qu'il comporte une étape d'analyse qualitative des jonctions signal présentes sur les cercles d'excision résultant du réarrangement de bRec-1 avec au moins une région AJ choisie dans le groupe constitué de AJ61, AJ60, AJ59, AJ58, AJ57, et AJ56.

10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, une étape d'analyse qualitative des jonctions signal partiellement ou totalement résistantes à la restriction par ApaLl.

11. Procédé selon la revendication 9 ou la revendication 10, caractérisé en ce que l'analyse qualitative des jonctions signal est effectuée par extension d'amorce marquée.

12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: a. préparation de l'ADN à partir de l'échantillon biologique; b. réalisation d'au moins 3 ou 4 PCR, à l'aide de couples d'amorces dont chacun est constitué d'une amorce spécifique de ôRec-1 et d'une amorce spécifique d'une région AJ choisie dans le groupe constitué de AJ61, AJ58, AJ57, et AJ56; c. restriction des produits des PCR avec l'enzyme de restriction ApaLl; d. analyse des profils de restriction obtenus à l'étape c; e. le cas échéant, analyse qualitative des jonctions signal résistantes à la restriction par ApaLl.

13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, comportant une étape de quantification des cercles d'excision résultant du réarrangement de âRec-1 avec au moins une région AJ choisie dans le groupe constitué de AJ61, AJ60, AJ59, AJ58, AJ57, et AJ56.

14. Utilisation d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, pour détecter un éventuel désordre du mécanisme de réparation de l'ADN.

15. Trousse de réactifs pour déterminer la diversité des lymphocytes T présents dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend un ensemble d'au moins quatre amorces dont au moins une est spécifique de âRec-1, et au moins trois sont spécifiques chacune d'une région AJ différente, sélectionnée dans le groupe constitué de AJ61, AJ60, AJ59, AJ58, AJ57, et AJ56, lesdites amorces étant choisies de façon à permettre l'amplification par PCR des jonctions signal résultant du réarrange-ment de bRec-1 avec les régions AJ sélectionnées.

16. Procédé selon la revendication 4 ou la revendication 12 ou trousse selon la revendication 15, caractérisés en ce que les amorces sont choisies parmi les amorces de séquences SEQ ID Nos 1 à 28.