FR2797272A1 - Nouvelles mutations du gene de la parkine, compositions, methodes et utilisations - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne des acides nucléiques codant pour de nouvelles formes de la parkine humaine mutées, tronquées ou comportant des multiplications d'exons, et les protéines et anticorps correspondants. Elle concerne aussi des méthodes et kits pour l'identification de mutations du gène de la parkine, ainsi que pour l'étude de composés à visée thérapeutique.

Description

La présente invention est relative au domaine de la génétique et, plus particulièrement, à l'identification de mutations du gène de la parkine. Elle concerne également des compositions et méthodes pour l'identification de ces mutations dans des échantillons, des formes de la parkine mutées, tronquées ou comportant des multiplicationss d'exons, et leurs utilisations à des fins de diagnostique, dépistage ou thérapeutique, par exemple. La maladie de Parkinson est une affection neurodégénérative fréquente dont la prévalence est proche de 2% après l'âge de 65 ans [de Rijk et al., 1997]. Les signes cardinaux de la maladie sont rigidité, bradykinésie, tremblement de repos et bonne réactivité, au moins initiale à la lévodopa. Les troubles sont dus à une perte massive des neurones dopaminergiques de la substantia nigra. Les causes de la maladie restent inconnues mais l'intervention de facteurs de susceptibilité génétique est fortement suspectée [Wood, 1997]. De nombreuses formes familiales avec une transmission dominante ont été rapportées. Des mutations du gène codant pour la synucléine alpha, localisé en 4q21-q23, ont été décrites dans un petit nombre de familles avec un début précoce et une aggravation rapide [Polymeropoulos et al., 1997; Krüger et al., 1998]. Un second locus est situé en 2p13 [Gasser et al., 1998]. Un syndrome parkinsonien de transmission autosomique récessive (AR-JP) a été décrit au Japon [Yamamura et al., 1973; lshikawa and Tsuji, 1996]. Il se manifeste avec les signes cardinaux de la maladie de Parkinson avec certaines particularités: i) début précoce, en règle avant lâge de 40 ans; ii) présence d'une dystonie, souvent aux membres inférieurs; iii) fluctuations au cours de la journée; et iv) évolution lentement progressive mais toujours associée à des dyskinésies sous lévodopa. L'examen neuropathologique révèle une perte massive des neurones de la substantia nigra pars compacta mais sans corps de Lewy, stigmate histopathologique de la maladie de Parkinson idiopathique [Yamamura et al.,<B>1973;</B> Takahashi et al., 1994]. Une liaison génétique entre la maladie dans des familles japonaises et des marqueurs en 6q25.2-27 a été démontrée qui définit le locus PARK2 [Matsumine et al., 1997]. Deux équipes ont ensuite décrit des familles PARK2 hors du Japon, en particulier aux Etats Unis, en Europe et au Moyen Orient [Jones et al., 1998; Tassin et al., 1998]. Très récemment, Kitada et al [Kitada et al., 1998] ont mis en evidence des délétions des exons (3-7) ou de l'exon 4 d'un nouveau gène, appelé parkine, dans 4 familles japonaises. La présente demande décrit maintenant la mise en évidence et la caractérisation, dans 77 familles et 102 cas isolés principalement européennes avec un syndrome parkinsonien de début précoce, de la présence de nouvelles altérations génétiques affectant le gène de la parkine. En outre, la présente demande montre que ces altérations génétiques sont présentent non seulement dans les syndromes parkinsoniens de début précoce, mais également dans les syndromes parkinsoniens plus tardifs. Ces nouvelles altérations offrent donc de nouveaux outils, à la fois pour le diagnostique et le traitement de la maladie de parkinson. Un objet plus particulier de l'invention concerne un acide nucléique codant pour la parkine humaine, caractérisé en ce qu'il comporte une ou plusieurs altérations génétiques choisies parmi: a) une délétion de un ou plusieurs exons, en combinaison ou non, b) une multiplication (p.ex. duplication,triplication) d'exons, c) une mutation ponctuelle, d) une délétion de 1 ou plusieurs paires de bases contigües entraînant un décalage du cadre de lecture. Le terme acide nucléique tel que défini dans la présente demande désigne les acides désoxyribonucléiques (ADN) et ribonucléiques (ARN). En outre, parmi les ADN, il peut s'agir d'ADN génomique (ADNg) ou complémentaire (ADNc). Les acides nucléiques de l'invention peuvent être d'origine naturelle ou synthétique. II sont généralement préparés par les techniques classiques de biologie moléculaire, incluant le criblage de banques, la synthèse artificielle, la ligature, la restriction, etc. Les positions données dans la présente demande sont calculées par rapport à la séquence de la parkine humaine représentée sur la Figure 1. Cette séquence représente la séquence de l'ADNc codant pour la parkine humaine. Par rapport à la séquence décrite par Kitada et al., elle comporte une modification au niveau du nucléotide 768 (C->T). Les altérations génétiques définies ci-dessus a) à d) sont principalement des altérations exoniques, c'est-à-dire affectent la région codante du gène de la parkine humaine. Toutefois, il a été également mis en évidence des altérations introniques, c'est-à-dire dans la partie non codante du gène comme par exemple une délétion de plusieurs paires de bases dans l'intron 8. Le gène de la parkine humaine comprend 12 exons, dont les positions nucléotidiques sont données ci-après

Exon <SEP> 1: <SEP> nucléotides <SEP> 1 <SEP> à <SEP> 108 <SEP> Exon <SEP> 2: <SEP> nucléotides <SEP> 109 <SEP> à <SEP> 272
<tb> Exon <SEP> 3: <SEP> nucléotides <SEP> 273 <SEP> à <SEP> 513 <SEP> Exon <SEP> 4: <SEP> nucléotides <SEP> 514 <SEP> à <SEP> 635
<tb> Exon <SEP> 5: <SEP> nucléotides <SEP> 636 <SEP> à <SEP> 719 <SEP> Exon <SEP> 6: <SEP> nucléotides <SEP> 720 <SEP> à <SEP> 835
<tb> Exon <SEP> 7: <SEP> nucléotides <SEP> 836 <SEP> à <SEP> 972 <SEP> Exon <SEP> 8: <SEP> nucléotides <SEP> 973 <SEP> à <SEP> 1034
<tb> Exon <SEP> 9: <SEP> nucléotides <SEP> 1035 <SEP> à <SEP> 1184 <SEP> Exon <SEP> 10: <SEP> nucléotides <SEP> 1185 <SEP> à <SEP> 1268
<tb> Exon <SEP> 11: <SEP> nucléotides <SEP> 1269 <SEP> à <SEP> 1386 <SEP> Exon <SEP> 12: <SEP> nucléotides <SEP> 1387 <SEP> à <SEP> 2960 Dans un premier mode de mise en oeuvre, l'invention concerne un acide nucléique codant pour la parkine, comportant des délétions de un ou plusieurs exons ainsi que des combinaisons de délétions d'exons. Plus particulièrement, ces délétions affectent les exons 2 à 9 séparémént ou en combinaison. Des exemples particuliers de ces délétions et combinaisons de délétions d'exons du gènes de la parkine sont illustrés dans le tableau<B>Il.</B> En outres, ces délétions peuvent être homozygotes c'est-à-dire- affecter les deux chromosomes simultanément ou hétérozygotes (incidence sur un chromosome seulement). La demanderesse a en particulier mis en évidence la délétion hétérozygote de l'exon 2 ainsi que des combinaisons de délétions de cet exon avec d'autres exons dont notamment l'exon 3 et l'exon 4. Au total, neuf délétions ou combinaison de délétions ont été pour la première fois mises en évidence et notamment les délétions suivantes exons2,2+3,2+3+4,3-6,3-9,6,6+7,7+8+9et8,cesdélétions ou combinaisons de délétions peuvent être combinées entre elles en cas d'hétérozygotes composites. La demanderesse a également mis en évidence un certain nombre de délétions homozygotes, seules ou combinées, telle que les délétions des exons 5 et 6. Les positions particulières des délétions décrites ci-dessus peuvent être définies en se rapportant à la numérotation des nucléotides sur la figure 1. Les conséquences de ces délétions ou combinaison de délétions restent souvent un décalage dans le cadre de lecture. Le tableau II résume les conséquences apparues en regard des délétions ou combinaisons de délétions relevées. Dans un autre mode de mise en oeuvre particulier, l'invention concerne un acide nucléique codant pour la parkine, comprenant une multiplication d'exons, c'est- à-dire la répétition d'un ou plusieurs exons dans le gène. Le présente demande montre pour la première fois: soit une duplication homozygote et heterozygote comme cela est illustré dans les exemples par la duplication de l'exon 3, soit une duplication de type hetérozygote comme illustré par la duplication de l'exon 6, 7 ou 11. La présente demande montre pour la première fois une triplication d'exons : soit une triplication homozygote, soit une triplication hetérozygote comme cela est illustré dans les exemples par la triplication de l'exon 2.

Dans un autre mode particulier, l'invention concerne un acide nucléique codant pour la parkine, comprenant une mutation ponctuelle, c'est-à-dire le remplacement d'une paire de bases par une autre. La présente demande montre en effet, l'existence de mutants ponctuels de la parkine et le caractère causal de certains d'entre eux dans l'apparition et le développement d'un syndrome parkinsonien. Plus particulièrement, la ou les mutations ponctuelles selon l'invention sont des mutations ponctuelles non-sens ou faux-sens ou bien entrainant un décalage du cadre de lecture. Une mutation non-sens est une mutation introduisant dans la séquence un codon stop. Une telle mutation conduit à l'arrêt prématuré de la traduction, et donc à la synthèse d'une protéine tronquée. Une telle mutation peut être également désignée par le terme "tronquante". Plus préférentiellement, la présente invention concerne un acide nucléique codant pour la parkine humaine, comprenant une mutation ponctuelle tronquante dans une région correspondant aux exons 2, 3, 7, 12. II s'agit encore plus préférentiellement d'une mutation dans l'exon 7 du gène de la parkine. A titre illustratif, on peut citer la mutation ponctuelle T->A sur le nucléotide 905, introduisant un codon stop à la place du résidu Cystéine 268. Un autre type de mutation ponctuelle selon l'invention est une mutation faux- sens. Une mutation faux-sens comprend le remplacement d'une paire de bases dans un codon, conduisant à un codon codant pour un acide aminé différent de l'acide aminé naturel, sans interruption de la séquence. Une telle mutation, isolée, conduit donc à une protéine ayant un nombre inchangé de résidus, mais dont l'un des résidus diffère de la protéine sauvage. La présente demande a maintenant montré que des mutants ponctuels faux-sens de la parkine existent chez des sujets atteints de syndromes parkinsoniens, et que ces mutants peuvent avoir un caractère causal. Plus préférentiellement, l'invention concerne un acide nucléique codant pour la parkine humaine, comprenant au moins une mutation ponctuelle faux-sens localisée notamment dans une région correspondant aux exons 6 à 12 et de manière préférée aux exons 6, 7, 9 et 12 . Un premier type de mutations ponctuelles faux-sens plus particulières au sens de l'invention comprend les mutations qui entrainent un changement non- conservatif d'acide aminé dans la protéine codée. De telles mutations sont en effet plus spécifiquement associées au phénotype de la maladie de parkinson. On entend par changement non-conservatif le remplacement d'un acide aminé par un autre acide aminé ayant des propriétés structurales, physicochimiques et/ou biologiques différentes du premier. Ainsi, le changement d'un acide aminé basique par un acide aminé non-basique est dit non-conservatif. Ce type de changements comprend plus particulièrement le changement des acides aminés de l'une ou l'autre des catégories suivantes : acide, basique, neutre polaire, neutre non polaire. Des exemples particuliers de mutants de ce type selon l'invention sont notamment les acides nucléiques comprenant l'altération génétique suivante, seule ou en combinaison - une mutation A->T sur le nucléotide 734 (Lys211 Asn) dans l'exon 6, - une mutation G->A sur le nucléotide 939 (Asp280Asn) dans l'exon 7, - une mutation G->A sur le nucléotide 1084 (Gly328G1u) dans l'exon 9, - une mutation C->T sur le nucléotide 1101 (Arg334Cys) dans l'exon 9, et/ou - une mutation G->A sur le nucléotide 1390 (Gly430Asp) dans l'exon 12. Un deuxième type de mutations ponctuelles faux-sens plus particulières au sens de l'invention comprend les mutations conservatrices. De telles mutations couvrent tout remplacement d'un codon codant un acide aminé par un codon codant un acide aminé du même groupe. Par groupe d'acides aminés on entend les acides aminés dont les propriétés structurales, physico-chimiques et/ou biologiques sont très proches et sont définis selon les catégories suivantes : acide, basique, neutre polaire, neutre non polaire. A titre d'exemple de mutation conservatrice, on peut cité de manière générale le remplacement du codon AAA (Lys) par le codon AGA (Arg), Lys et Arg faisant partie du même groupe d'acides aminés basiques. Un exemple particulier de ce type de mutation selon l'invention est notamment l' acide nucléique comprenant l'altération génétique suivante, seule ou en combinaison - une mutation T ->G sur le nucléotide 966 (Cys289G1y) dans l'exon 7, Par ailleurs, comme indiqué ci-avant, la présente invention concerne également tout acide nucléique comprenant une délétion de une ou plusieurs paires de bases contigües et entraînant un décalage du cadre de lecture (voir d). La présente demande démontre pour la première fois l'existence de mutants de délétion restreinte de la parkine, et leur implication dans l'apparition et le développement d'un syndrome parkinsonienPlus préférentiellement, les délétions restreintes selon l'invention conduisent, en raison du décalage du cadre de lecture, à la synthèse de protéines (i) tronquées et (ii) dont la séquence C-terminale est différente de la protéine sauvage. Dans le cas de délétions introniques, le décalage du cadre de lecture peut conduire soit à la non reconnaissance de l'intron si la mutation à lieu à la jonction exon-intron et la production d'une protéine abérrante, soit à un pliage incorrect de l'intron empêchant ainsi l'excision-épissage de celui-ci, lorsque la mutation a lieu à l'interieur de l'intron. Comme indiqué ci-avant, cette protéine (ou le domaine original) constitue un autre objet de la présente demande. Plus préférentiellement, l'invention concerne les acides nucléiques comprenant une délétion de 1 à 10 paires de bases contigües, de préférence de 1 à 5. Encore plus particulièrement, lesdélétions selon l'invention sont localisées dans une région de l'acide nucléique correspondant à l'intron 8 ou à l'exon 9. A titre d'exemple spécifique, on peut citer un acide nucléique comportant les altérations suivantes, seules ou en combinaison: - une délétion des cinq paires de bases TCTGC dans l'intron 8, en position 21 -17 par rapport à l'exon 9 et pouvant entrainer une non reconaissance du site d'épissage. - une délétion de deux paires de bases dans l'exon 9 en position 1142- 1143de1GA qui change l'Arg348 en Glu. Cette délétion a pour conséquence l'introduction d'un changement du cadre de lecture créant ainsi un codon stop en position 368 dans l'exon 10. Bien entendu, les altérations génétiques a) à d) décrites ci-dessus peuvent être isolées ou combinées entre elles, telles que notamment une mutation faux-sens et une délétion ou encore deux mutations faux-sens cumulées. A titre d'exemples illustrant ce type de combinaison, on peut cité particulièrement la combinaison de modifications suivantes - une mutation faux-sens C->T en position 1101 (Arg334Cys) dans l'exon 9 avec une délétion de 5 paires de bases en position -21 -17 par rapport à l'exon 9, dans l'intron 8 - une mutation faux-sens C->T en position 924 (Arg275Trp) dans l'exon 7 avec une mutation faux-sens G->A en position 1390 (Gly430Asp) dans l'exon 12. L'invention a également pour objet un acide nucléique codant pour la parkine humaine, caractérisé en ce qu'il comporte la séquence présentée sur la figure 1. Cette séquence comporte, par rapport à la séquence isolée par Kitada et al, une T en position 768, à la place d'une C, résultant, dans la protéine codée, en un acide aminé sérine en position 223, à la place d'une proline. Cet acide nucléique code pour la parkine sauvage rencontrée dans les populations européennes. L'invention concerne aussi tout vecteur comprenant un acide nucléique tel que défini ci-avant. Il peut s'agir d'un vecteur plasmidique, d'un cosmide, vecteur viral, episome, chromosome artificiel, etc. Dans un mode particulier, un tel vecteur 20 comprend aussi une région promotrice permettant l'expression dudit acide nucléique. De tels vecteurs peuvent être utilisés pour produire en quantités importantes les acides nucléiques de l'invention, ou pour produire les polypeptides correspondants, dans un hôte cellulaire approprié (cellule procaryote, eucaryote, animale ou végétale, par exemple). Des hôtes cellulaires préférés sont notamment des cellules de bactérie (E. coli par exemple) ou des cellules de levure, ou encore des cellules mammifères, animales ou humaines. A cet égard, l'invention concerne aussi toute cellule recombinante comprenant un acide nucléique ou un vecteur tels que définis ci-avant. L'invention concerne aussi toute cellule mammifère, notamment humaine, comprenant un acide nucléique ou un vecteur tels que définis ci-avant, en remplacement du gène sauvage de la parkine. Les cellules de l'invention peuvent être utilisées notamment pour l'étude des propriétés de la parkine, ainsi que comme modèles pour la recherche de composés susceptibles de compenser les altérations génétiques du gène de la parkine. L'invention concerne en outre tout mammifère non-humain comprenant un acide nucléique tel que défini ci-avant dans ses cellules. Avantageusement, ces mammifères sont obtenus par "knock-in" des altérations identifiées ci-avant, par recombinaison homologue, ou également par "knock-out" du gène sauvage, substitué par la version altérée de l'invention. De tels mammifères (rongeurs, canins, lapins, etc.) sont notamment utilisables pour l'étude des propriétés de la parkine et l'identification de composés à visée thérapeutique, par exemple. L'invention concerne également tout polypeptide codé par un acide nucléique tel que décrit ci-avant. Ces polypeptides sont donc la parkine humaine, ses variants polymorphes, et des variants mutés et/ou tronqués et/ou comportant une multiplicationd'exons, impliqués dans l'apparition et/ou le développement d'un syndrome parkinsonien. L'invention concerne en particulier les variants tronqués ou aberrants de la parkine tels que décrits ci-avant, ou une partie de ceux-ci correspondant à la séquence créée par le décalage de cadre de lecture. De tels polypeptides ou fragments, ou les acides nucléiques correspondants, sont utilisables pour identifier et/ou étudier des composés susceptibles de restaurer un phénotype normal à des cellules les exprimant. En particulier, les acides nucléiques décrits ci- dessus peuvent être transférés dans des cellules hôtes appropriées, de préférence des cellules eucaryotes (mammifère, levure par exemple), pour être utilisés dans un test de screening de composés capables de contrecarrer leur activité, qu'il s'agisse de composés chimiques, biochimiques ou génétiques. De tels polypeptides ou fragments sont également utilisables à titre d'antigènes, pour la préparation d'anticorps spécifiques, utilisables pour la détection des variants. En particulier, les régions polypeptidiques spécifiques des formes tronquées (en particulier les extrémités) peuvent être utilisées pour la préparation d'anticorps, selon les techniques classiques de l'immunologie, lesquels anticorps constituent alors des outils de détection de la présence de ces formes dans des échantillons biologiques issus de sujets. De tels anticorps peuvent être polyclonaux ou monoclonaux (préparés par exemple par fusion de cellules de rate d'animaux immunisés avec les antigènes, avec des cellules de myelome, puis sélection de clones producteurs d'anticorps monoclonaux). A cet égard, l'invention concerne également tout anticorps spécifique d'un polypeptide tel que décrit ci-avant, ou d'une région spécifique d'un tel polypeptide. Le terme "anticorps spécifique" désigne un anticorps ayant une affinité particulièrement supérieure pour l'antigène donné, par rapport à tout autre antigène. L'invention concerne en outre toute composition comprenant un polypeptide ou un anticorps ou encore un vecteur ou une cellule hôte tranformée par l'acide nucléique de l'invention, tels que décrits ci-avant. Ces compositions peuvent être conditionnées dans différents types de milieux (solutions salines, isotoniques, etc.) en présence de stabilisants ou de conservateurs, par exemple. Ces compositions peuvent être conservées au froid ou congelées, dans tout dispositif approprié (tube, boite, flacon, fiole, poche, etc.). L'une des applications de l'invention réside dans la détection de la présence de mutations dans le gène de la parkine, et leur corrélation avec la susceptibilité à la maladie de parkinson, par exemple. A cet égard, l'invention concerne également différents outils (sondes, amorces, anticorps, etc.), utiles à la mise en oeuvre de telles méthodes de détection. En particulier, l'invention concerne toute sonde ou oligonucléotide hybridant spécifiquement avec un acide nucléique tel que défini ci-avant. Les sondes ou oligonucléotides spécifiques de l'invention comprennent généralement moins de 500 pb, plus préférentiellement moins de 300 pb. Typiquement un oligonucléotide spécifique de l'invention comprend de 5 à 100 pb, avantageusement de 5 à 50 pb. La longueur de l'oligonucléotide peut bien entendu être ajustée par l'homme du métier. Les sondes ou oligonucléotides de l'invention sont par ailleurs généralement marqués, de manière à permettre leur détection. Différents types de marquages connus de l'homme du métier peuvent être utilisés (marquage radioactif, fluorescent, enzymatique, chimique, terminal ou interne, etc.). Enfin, les sondes ou oligonucléotides de l'invention ont la capacité d'hybrider spécifiquement avec les acides nucléiques tels que définis ci-avant, c'est-à-dire avec les différentes formes altérées du gène de la parkine. L'hybridation est dite spécifique lorsque la sonde ou l'oligonucléotide hybrident, dans des conditions de stringence élevée, avec l'acide nucléique portant l'altération recherchée, et pas ou peu avec le même acide nucléique ne portant pas ladite altération. L'hybridation est donc dite spécifique lorsque le différentiel signal spécifique/bruit de fond est suffisamment grand pour pouvoir être détecté. Les sondes ou oligonucléotides de l'invention sont donc généralement complémentaires d'une région au moins du gène de la parkine portant les altérations génétiques a) à d) décrites ci-avant. La complémentarité est généralement parfaite, de manière à assurer une meilleure sélectivité d'hybridation. Ces sondes ou oligonucléotides peuvent être synthétisés par toute technique connue de l'homme du métier, par exemple par clivage à partir des acides nucléiques décrits ci-avant, ou par synthèse artificielle, ou en combinant ces techniques. Ces sondes ou oligonucléotides sont utilisables pour l'identification, sur des échantillons biologiques, de la présence d'altérations génétiques du gène de la parkine. L'invention concerne aussi un couple d'amorce pour l'amplification de tout ou partie d'un acide nucléique tel que décrit ci-avant, caractérisé en ce qu'il comprend: - une première amorce complémentaire d'une région du gène de la parkine située en 5' d'une altération génétique, et 5 - une deuxième amorce complémentaire d'une région du gène de la parkine située en 3' de ladite altération génétique. Les amorces de l'invention sont généralement complémentaires d'une région du gène de la parkine, et comprennent avantageusement moins de 30 pb. L'invention concerne encore un procédé pour l'identification d'une altération génétique dans le gène de la parkine et en particulier la détection de délétion(s) et/ou multiplication (p.ex. duplication, triplication) d'exons à l'état homozygote et hétérozygote. Ce procédé selon l'invention comprend: i) la mise à disposition d'un échantillon comprenant le gène de la parkine, ii) l'amplification semi-quantitative d'une partie au moins dudit gène, ladite partie comprenant une altération génétique telle que définie ci-avant, et iii) la mise en évidence de la présence de l'altération génétique. Avantageusement, dans le procédé de l'invention, l'échantillon est un échantillon de sang, tissu, plasma ou une culture de cellules, provenant d'un sujet, notamment d'un mammifère, en particulier d'un humain. Dans un mode préféré de mise en oeuvre, l'échantillon est prétraité de manière à rendre le gène de la parkine, ou une partie de celui-ci, accessible pour l'amplification. Ce prétraitement peut comprendre la lyse des cellules, un traitement enzymatique, une dénaturation, etc. Avantageusement, l'amplification est réalisée au moyen d'un couple d'amorces tel que décrit plus haut ou celles décrites par Kitada et al. A titre d'exemple particulier de couple d'amorces selon l'invention, on peut cité les amorces servant à la détection d'altération dans l'exon 3 ou de mutations ponstuelles. 5 Ainsi, la paire d'amorce suivant à été utilisé dans le cadre de l'invention: For: 5'-(Hex)AATTGTGACCTGGATCAGC-3' et Rev : 5'-CTGGACTTCCAGCTGGTGGTGAG-3' Les amorces suivantes ont également été utilisées pour la mise en évidence des mutations ponctuelles suivantes:

Asp280Asn <SEP> : <SEP> 5'-GGCAGGGAGTAGCCAAGTTGAGGAT-3'
<tb> séquence <SEP> sauvage <SEP> G
<tb> Arg334Cys <SEP> : <SEP> 5'-AGCCCCGCTCCACAGCCAGCGC-3'
<tb> séquence <SEP> sauvage <SEP> G La mise en évidence d'une altération génétique telle que décrite ci-dessus peut être réalisée par différentes techniques, et notamment par PCR/multiplexe semi- quantitative, comme détaillé dans la partie expérimentale. Brièvement, cette méthode repose sur l'amplification par PCR semi-quantitative et en phase exponentielle d'ADN matrice. Suivant cette méthode la comparaison du taux relatif d'ADN matrice est suffisante pour mettre en évidence une perte de la quantité d'ADN (délétion d'exon(s)) ou au contraire une augmentation de la quantité d'ADN (multiplication d'exon(s)). L'invention concerne en outre un kit pour la mise en oeuvre des procédés de l'invention, comprenant une sonde ou un oligonucléotide ou un couple d'amorces tels que décrits ci-avant. Les kits de l'invention comprennent avantageusement les réactifs appropriés à une réaction d'amplification et/ou d'hybridation, et, éventuellement, un support pour de telles réactions (filtres, membranes, chips, etc.). La présente invention est particulièrement adaptée au diagnostique d'une susceptibilité à la maladie de parkinson, par la recherche d'une altération génétique telle que décrite plus haut dans le gène de la parkine. La présente invention est également relative à l'utilisation des outils décrits ci-avant (acides nucléiques, sondes, polypeptides, anticorps, cellules, animaux) pour l'identification de composés capables de contrecarrer, au moins en partie, les effets d'une altération génétique du gène de la parkine, notamment dans un but thérapeutique. Ainsi, de tels composés peuvent être mis en évidence par mise en contact d'une composition (ou d'un produit) test en présence d'une cellule ou d'un animal tel que décrit ci-avant, et détection d'un effet phénotypique ou génotypique. La méthode de l'invention peut notamment permettre l'identification de composés susceptibles d'être utilisés, seuls ou en combinaison avec d'autres produits ou traitements, pour le traitement (i.e., la diminution) de la maldie de Parkinson. De tels composés constituent un autre objet de la présente invention. D'autres avantages et applications de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. EXEMPLES <U>A - Légende des Figures</U> Figure 1: Séquence de l'ADNc codant pour la parkine humaine. Les jonctions entre les exons sont indiquée. Le codon initiateur (atg) et le codon stop (tag) sont en gras. Le changement C>T en position 768 est en gras et souligné. Figure 2: Résultats de la mise en évidence de délétions d'exons hétérozygotes dans une famille présentant le sydrome parkinsonnien de début précoce (FPD-GRE-WAG- 155) selon la méthode PCR/mutiplexe semi-quantitative de l'invention. Les carrés (homme) et ronds (femmes) noirs représentent les individus affectés. Les pics représentent les exons produits par PCR/mutiplexe semi-quantitative. Les chiffres entourés indiquent la hauteur des pics. La règle graduée au-dessus des éléctrophoregrammes indique la taille en paire de bases des produits de PCR. Tableau I : Récapitulatif des mutations mises en évidence. Les mutations soulignées sont l'objet de la présente invention. Les positions des nucléotides sont données selon la séquence de d'ADNc publiée dans la banque de données d'ADN japonnaise (DDBJ; numéro d'accès AB009973) et sont illustrées dans la figure 1. PAGE = electrophorèse sur gel de polyacrylamide; ASO = technique de détection des mutations mettant en oeuvre un oligonucléotide specifique d'un allèle; Tableau II : Fréquence et conséquences des délétions/multiplications d'exons del = délétion, het = hétérozygote; hom = homozygote Tableau III : Ratio des résultats obtenus dans la figure 2. La hauteur des pics est donnée pour chaque exon dans la partie gauche du tableau; les valeurs des doubles pics ayant été additionées. La partie droite du tableau fourni le calcul des ratios des valeurs des pics. Italique = valeur normale; souligné = valeur pathologique comparée au contrôle. Dans la deuxième ligne du tableau, pour chaque cas, le ratio du temoin est divisée par le ratio du cas. Les valeurs pathologiques sont ou #0,625 ou # 1,6 (=1/0,625) Des délétions d'exons ont été détectées pour les sujets FR 155 5 (exon 3), FR<B>155</B> 6 (exon 2), FR 155 8 et FR 155 9 (exons 2 + 3). Pour ces deux derniers sujets atteints, la valeur du ratio exon 3/2 est normale étant donné que les deux exons ont été délétés de manière hétérozygote.

<U>B - Matériel et méthodes</U> 1. Familles et patients 77 familles ont été sélectionnées selon les critères suivants (comme indiqué dans Lücking et al, 1998; Abbas et al, 1999): i) présence d'un syndrome parkinsonien avec une bonne réponse à la levodopa (# 30% d'amélioration) chez au moins deux membres d'une fratrie (ou un seul s'il y a notion de consanguinité); ii) absence de critères d'exclusion tels que signe de Babinski, ophtalmoplégie, démence ou dysautonomie survenant avant deux ans d'évolution; iii) début # 45 ans chez au moins un des atteints ; iv) hérédité compatible avec une transmission autosomique récessive (plusieurs patients dans une seule génération avec ou sans notion de consanguinité). Les familles étaient originaires de France (n=20), Italie (n=19), Grande-Bretagne (n=14), Pays-Bas (n=9), Allemagne (n=9), Liban (n=2), Algérie (n=1), Maroc (n=1), Portugal (n=1), Vietnam (n=1).

De plus, 102 cas isolés sans consanguinité connue ont été sélectionnés avec les même critères cliniques. Ils étaient originaires de France (n=31), Italie (n=23) et Grande-Bretagne (n=26), Allemagne (n=2 1)n Pays-Bas (n=1). Les résultats de la séquence de 12 exons du gène de la Parkine dans 38 familles ont été décrits précédemment (Lücking et al, 1998; Abbas et al, l999). 2. PCR multiplexe semi-quantitative pour la détection de délétions/multiplications d'exons à l'état homozygote et hétérozygote <I>a) Principes</I> La détection de délétions hétérogygotes ou des multiplications d'exons dans le gène de la Parkine ne peut pas être réalisée par PCR non quantitative. Ainsi, une PCR semi-quantitative qui compare le taux relatif d'ADN matrice est suffisante pour savoir s'il manque 50% de l'ADN matrice pour un ou plusieurs exons ou, au contraire dans le cas d'une multiplication hétérozygote ou homozygote, s'il y a p.ex. 50% (duplication hétérozygote), 100% (duplication homozygote ou triplication hétérozygote) ou 200% (triplication homozygoyte) d'ADN de trop pour un ou plusieurs exons. Pour réaliser cette comparaison, plusieurs exons d'un même individu sont amplifiés simultanément, dans une réaction de PCR (PCR multiplexe), les exons coamplifiés servant de standard interne de quantité. La PCR est réalisée avec des amorces fluorescentes, de telle sorte que la quantité de produit PCR peut être mesurée par la hauteur de pics sur un séquenceur automatique (ABI Prism 377), comme appliqué par exemple dans le LOH Assay (Loss of Heterozygosity) d'Applied Biosystems. La quantité de produit PCR (hauteur du pic) est directement liée à la quantité d'ADN matrice tant que la PCR est dans sa phase exponentielle qui signifie une absence de limitation par les substrats disponibles. Chaque PCR multiplexe, pour une combinaison donnée d'exons, produit une distribution typique de hauteur de pics pour un individu témoin et ainsi des ratios déterminés entre les différents pics.

Une délétion homozygote d'un exon sera démontré par l'absence du pic correspondant. Si un exon est délété à l'état hétérozygote, le pic correspondant aura la moitié de sa hauteur normale, ce qui changera le rapport entre les exons délétés et non délétés par un facteur 2 par rapport à un témoin (comparant la valeur haute à la valeur basse; figure 2 et tableau II relatif à la figure 2). Pour les duplications d'exons, les rapports changent d'un facteur 1,5 pour les hétérozygotes et d'un facteur 2 pour les homozygotes (toujours en comparant la valeur haute à la valeur basse). Ainsi, les facteurs pour une triplication hétérozygote ou homozygote sont 2 ou 3, respectivement (toujours en comparant la valeur haute à la valeur basse). De façon à pouvoir détecter également une délétion ou une multiplication de l'ensemble du gène de la Parkine, un produit de PCR de 328 paires de bases (C328) d'un gène situé à distance (gène de la Transthyrétine) est amplifié et sert de standard externe dans une des PCR multiplexes. Le fait que seulement les rapports des hauteurs entre les pics soient comparées rend, en première approximation, la méthode indépendante de la quantité et de la qualité de l'ADN. <I>b)</I> Etablissement <I>des conditions appropriées de</I> PCR multiplexe Au cours d'expériences préliminaires, il a été noté que les exons qui s'amplifient le mieux pouvaient influencer de façon négative l'amplification d'autres exons, pour lesquels l'efficacité était moins bonne. Ainsi, les exons dont l'efficacité d'amplification était comparable ont été regroupés. De plus, comme la taille du produit PCR peut influencer le rendement de l'amplification (les séquences courtes étant en règle mieux amplifiées que les longues), le regroupement des produits de PCR de taille comparable dans la réaction multiplexe a été effectué. Ainsi, trois combinaisons d'exons ont été choisies Comb 1: Ex 4o (261 bp) + 7o (239 bp) + 8 (206 bp) + I 1 (303 bp), Comb 2: Ex 5 (227 bp) + 6 (268 bp) + 8 (206 bp) + 10 (165 bp) and Comb 3: Ex 2 (308 bp) + 3i (243 bp) + 9 (278 bp) + 12 (255 bp) + C328 (contrôle externe de 328 paires de base). Les amorces utilisées sont celles décrites par Kitada et al (1998). Pour l'exon 3, une paire d'amorces exoniques a été utilisée For: 5'-(Hex)AATTGTGACCTGGATCAGC-3' et Rev :5'-CTGGACTTCCAGCTGGTGGTGAG-3'. Les amorces pour C328 étaient: TTRForHex : 5'-(Hex)ACGTTCCTGATAATGGGATC-3' et TTR328Rev : 5' -CCTCTCTCTACCAAGTGAGG-3'. De façon à obtenir des pics de hauteurs comparables dans chaque PCR multiplexe et pour se situer dans la phase exponentielle pour chaque exon, les conditions de PCR ont été ajustées de façon permanente (en suivant en partie les recommandations de Henegariu et al (Henegariu et al, 1997). En particulier, les températures d'hybridation et d'extension ont été diminuées et la concentration de MgC12 et la durée de l'extension ont été augmentées. De plus, les concentrations d'amorces ont été ajustées à partir d'une concentration standard de 0,8pM, selon l'efficacité d'amplification (les concentrations d'amorces étaient diminuées pour les exons qui s'amplifiaient bien, et augmentées pour les autres). Chaque combinaison d'exons a été testée pour vérifier que l'on situait dans la phase exponentielle et ce, dans deux PCR multiplexes en parallèle pour les 3 combinaisons d'amorces, sur un individu témoin avec 22, 23 et 24 cycles. Les hauteurs de pics ont été corrigées pour les variations de dépôts selon le marqueur de poids moléculaire interne (TAMRA 500 XL d'Applied Biosystems). Les hauteurs de pics corrigées étaient comparées au nombre de cycles, et représente, sur une échelle logarithmique, une droite ascendante qui démontre que l'on situe dans la phase exponentielle pour les conditions suivantes: 5 minutes à 95 C pour un cycle, 30 secondes à 95 C, 45 secondes à 53 C et 2,5 minutes à 68 C pendant 23 5 minutes à 68 C pendant un cycle. La réaction était réalisée avec 40 ng d'ADN dans un volume de 25p1 de solution de PCR, avec 3mM de MgC2, 0,2 mM dNTP et 1U Taq/25pl. La concentration de chaque primer était: Ex 2 (0,8 pM), Ex 3 (0,4 pM), Ex 4 (1.0 pM), Ex 5 (0,6 pM), Ex 6 (1,4 pM), Ex 7 (o,44 pM), Ex 8 (dans comb 1: 1,0 pM et dans comb 2: 0,8 pM), Ex 9 (0,4 pM), Ex 10 (1,04 pM), Ex 11 (0,8 pM), Ex 12 (1,2 pM) et C328 (1,92 pM). c) Applications de la PCR multiplexe, contrôles internes et électrophorése En règle générale, les PCR multiplexes ont été effectuées au moins dans deux réactions parallèles pour chaque individu. Pour chaque série de patient, au moins un contrôle positif (avec une délétion hétérozygote d'exons connus) et un contrôle négatif (individu témoin) ont été traités en parallèle pour obtenir les valeurs normales et pathologiques pour chaque premix de réaction, de façon à éviter les résultats erronés dus à des différences possibles dans le premix (variation de pipetage). Deux témoins additionnels ont été ajoutés, qui ne contenaient pas d'ADN matrice. 1.5 à 2,5p1 du produit de PCR ont été mélangés avec 4p1 de tampon de chargement (incluant 0.3p1 du marqueur de taille TAMRA 500 XL d'Applied Biosystems). 1,5 pl de ce mélange a été chargé sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 4%, contenant 96 puits sur un séquenceur automatique ABI 377. Les gels sont analysés par les logiciels GeneScan 3.1 et Genotyper 1.1.1 (Applied Biosystems). Les hauteurs de pics sont mesurées comme indiqué dans Genotyper. Pour les doubles pics avec une paire de bases de différence (causées par le fait que la polymérase Taq ajoute inconstamment un A à chaque extrémité), les deux hauteurs de pics sont additionnées. Les rapports de chaque combinaison de pics sont calculés pour chaque réaction, utilisant le logiciel Excel 5.0 (tableau III ) et les valeurs moyennes sont calculées pour deux réactions. <I>d) Interprétation</I> Pour les délétions, les résultats sont interprétés comme pathologiques si la différence de rapport était un facteur d'au moins 1,6 ou #0,625 (=1/1,6) dans tous les rapports respectifs entre le témoin et le cas (ratio du sujet/ ratio du control - tableau III relatif à la figure 2). Lorsque des différences de rapports entre les réactions parallèles sont discordantes (par exemple, à cause d'une amplification faible dans l'une des PCR), les rapports obtenus avec une amplification satisfaisante sont pris en compte à condition qu'ils soient normaux. Pour les duplications, un changement des rapports d'un facteur 1,30-l,65 ou >1,75 est interprété comme une duplication hétérozygote ou homozygote, respectivement (en comparant la valeur haute à la valeur basse). Pour une triplication, un changement des rapports d'un facteur 1,6-2,4 ou >2,6 est interprété comme une triplication hétérozygote ou homozygote, respectivement (en comparant la valeur haute à la valeur basse).

Cependant, comme les conditions ont été ajustées en permanence pendant le développement de la méthode, quelques-uns des résultats ont été obtenus dans des conditions légèrement différentes. Ces résultats sont pris en compte lorsqu'ils sont clairement normaux ou pathologiques et reproductibles. Dans les situations ambiguës, l'expérience était répétée dans des conditions adaptées.

<U>3. Analyse de séquence</U> La séquence des 12 exons codants a été réalisée comme précédemment rapporté (Abbas et al, 1999) pour 39 nouvelles familles et pour 35 cas sporadiques. 16 cas sporadiques supplémentaires etaient séquencés pour l'exon 1 à 10. <U>4. Analyse de la</U> cosé <U>é</U> ation et d'une<U>population</U> témoin <I>a) Mutations ponctuelles</I> Les variants de séquence de la Parkine ont été testées pour leur coségrégation dans les familles (selon la disponibilité d'autres échantillons) et pour leur présence dans une population de témoins sans syndrome parkinsonien (61à 73 individus). A cause du caractère certainement pathogène de la mutation 1142-1143delGA, des témoins n'étaient pas testés pour cette mutation. Les techniques utilisées sont PCR et digestion avec l'enzyme de restriction appropriée ou électrophorèse en gel de polyacrylamide (PAGE = polyacrylamide gel electrophoresis) (voir tableau 1). PCR/ restriction et PAGE ont été décrits précédemment (Abbas et al, 1999). Quand le variant ne provoquait pas de changement de site de restriction par lui-même, un site était artificiellement créé à l'aide d'une amorce avec un mismatch. Les amorces étaient conçues de façon à introduire le changement d'une base à proximité de la position du variant de séquence, de façon à créer un site de restriction qui inclut ce variant. Les amorces sont indiqués dans le tableau ci-dessous. Amorces modifiées (non complémentaires de la séquence sauvage pour une base) pour PCR

Mutation <SEP> Enzyme <SEP> de <SEP> Primer <SEP> F <SEP> Primer <SEP> R
<tb> restriction
<tb> Asp280Asn <SEP> Alw <SEP> 1 <SEP> Ex <SEP> 7o <SEP> For <SEP> 5'-GGCAGGGAGTAGCCAAGTTGAGGAT-3'
<tb> séquence <SEP> sauvage <SEP> G
<tb> Arg334Cys <SEP> BstU <SEP> 1 <SEP> Ex <SEP> 9 <SEP> For <SEP> 5'-AGCCCCGCTCCACAGCCAGÇGC-3'
<tb> séquence <SEP> sauvage <SEP> G Le changement de paire de bases introduit est souligné par comparaison à la séquence sauvage. b) Délétions ou multiplication d'exons homozygotes et hétérozygotes La coségrégation d'une délétion ou d'une multiplication d'exons dans les familles était analysée à l'aide des méthodes précédemment décrites. Une population contrôle n'a pas été testée en raison du caractère très probablement pathogène des mutations, qui entraînent une délétion interne de la protéine, avec ou sans décalage du cadre de lecture.

5. Analyse des liaisons génétiques Pour tester la liaison au locus PARK2, quatre marqueurs de type microsatellite, situés à proximité du locus, étaient testés (D6S1579, D6S411, D6S1550 et D6S305) comme décrits par Tassin et al (1998). <U>C - Résultats</U> 41 familles avec des mutations du gène de la Parkine ont pu être identifiées en plus des 12 déjà publiées (Lücking et al, 1998; Abbas et al, 1999). Parmi ces familles, 18 étaient des cas isolés sans consanguinité connue. <I>a) Détection de nouvelles mutations ponctuelles</I> Huit nouvelles mutations ponctuelles dans des exons ont été identifiées, dont six sont des mutations faux-sens, une tronquantes et une non-sens: 734A>T (Lys211Asn) dans l'exon 6, 905T>A (Cys268Stop), 939G>A (Asp280Asn) et 966T>G (Cys289G1y) dans l'exon 7, 1084G>A (Gly328G1u), 1142-1143de1GA et, 1lO1C>T (Arg334Cys) dans l'exon 9 et 1390G>A (Gly430Asp) d des mutations faux-sens conduisent à des changements d'acides aminés non conservatifs et une à un changement conservatif (Cys289G1y). De plus, une délétion de cinq paires de bases dans l'intron 8, localisée aux positions -21 à -17 par rapport à l'exon 9 a été mise en évidence. Tous ces variants de séquence n'ont pas été détectés chez 61 à 73 individus témoins (lamutation 1142-1143delGA n'étant pas testée) et ne représentent donc pas des polymorphismes. Les résultats sont détaillés dans le tableau I. b) Détection de nouvelles délétions homozygotes d'exons Des délétions homozygotes d'exons ont été détectées dans 3 familles en plus des délétions rapportées précédemment par Hattori et al (1998a) et Lücking et al (1998) pour l'exon 3 et par Hattori et al (1998a) pour les exons 3+4. Ces délétions concernent les exons 3 (FDP-ANG-GEO-141), 3+4 (IT-064) et 5+6 (SPD-LIB-HAG- 076). Les conséquences des délétions d'exons sur le cadre de lecture et leur fréquence relative dans l'échantillon sont indiquée dans le tableau II. c) Détection des duplications/triplication homozygotes et hétérozygotes Cinq nouveaux types de duplications d'exons ont été détectés: une duplication de l'exon 3 à l'état homozygote (SPD-NIC-AIT-091) et une duplication de l'exon 3 à l'état hétérozygote (SAL 399 213). En plus, des duplications hétérozygotes de l'exon 6 (FPD-LIL-CHA-171), de l'exon 7(DE 4001) et de l'exon 11 (SAL 399 213) ont été détéctées.Deux types de triplication ont été détéctés: une triplication de l'exon 2 à l'état homozygote (RM 347) et a l'état hétérozygote (RM 330). <I>d) Détection de nouvelles délétions</I> hétérozygotes Treize différentes combinaisons de délétions hétérozygotes d'exons ont été mises en évidence dans 21 familles. Les délétions suivantes ont été observées: exons 2, 2+3, 2+3+4, 3, 3+4, 3-6, 3-9, 4, 5, 6, 6+7, 7+8+9 et 8. Les délétions d'exons 2, 2+3, 2+3+4, 3-6, 3-9, 6, 6+7, 7+8+9 et 8 sont nouvelles.

Pour deux familles (Sal-Hab-436 et UK 124l6), il n'a pas pu être établi avec certitude si les mutations hétérozygotes des exons 2+3 ou 6-7, respectivement, étaient situées sur le même chromosome ou s'il s'agissait des cas hétérozygotes composites à cause de l'absence d'ADN pour d'autres membres de ces familles. Les conséquences des délétions et des multiplication d'exons décrites sur le cadre de lecture et leur fréquence relative dans notre échantillon sont indiquées dans le tableau II. <I>Mutations ponctuelles</I> récurrentes Cinq mutations ponctuelles ont été mises en évidence dans plus d'une famille. Ces mutations sont 202-203delAG (à l'état hétérozygote ou homozygote dans 5 familles), 255delA (à l'état homozygote ou hétérozygote dans 6 familles), Lys21 lAsn (à l'état hétérozygote dans 2 familles), et Arg275Trp (à l'état hétérozygote dans 5 familles). 5. Fréquences des différents types de mutations et des hétérozygotes composites Parmi les 53 familles avec des mutations de la Parkine, y compris les 12 précédemment publiées (Lücking et al, 1998; Abbas et al, l999), des délétions homozygotes d'exons ont été détectées dans 8 familles, des mutations ponctuelles à l'état homozygote dans 10 familles,une duplication d'exon homozygote dans une famille et une triplication d'exon dans une famille. Les patients de 21 familles étaient hétérozygotes composites pour deux mutations différentes (3 fois pour les mutations ponctuelles différentes, 6 fois pour une mutation ponctuelle et une délétion d'exon, deux fois pour une mutation ponctuelle et une duplication, une fois pour une triplication et une délétion d'exon, une fois pour deux duplications d'exon différentes et 6 fois pour deux délétions différentes d'exons; voir exemple figure 2). Dans deux cas, il n'était pas possible de déterminer s'il s'agissait d'hétérozygotes aux délétions de plusieurs exons adjacents composites, et dans 13 cas, seule une mutation à l'état hétérozygote (6mutations ponctuelles et 7 mutations d'exons) était détectée. <U>D) Discussion</U> La présente invention se rapporte à une nouvelle technique pour la détection de délétions d'exons hétérozygotes et de multiplications d'exons du gène de la Parkine, ainsi que l'identification de 41 nouvelles familles européennes avec une mutation dans ce gène. Il reste cinq familles pour lesquelles les liaisons au locus PARK2 a été exclue. 1. Méthode de détection des délétions d'exons et des multiplications d'exons Pour la première fois, la détection de délétions d'exons à l'état hétérozygote et de multiplications d'exons (p.ex. duplication, triplications) à l'état homozygote et hétérozygote dans le gène de la Parkine est décrite. Cet aspect est intéressant car les délétions d'exons sont relativement fréquentes (voir plus loin). Comme méthode de détection, un protocole de PCR multiplexe semi-quantitative a été choisi et mis au point. Cette méthode avait précédemment été validée pour le dosage génique, par exemple pour la détection de délétions du gène PMP22 (Poropat et Nicholson, 1998), à condition que l'amplification par PCR soit dans la phase exponentielle. Dans toutes ces expériences, le choix de témoins co-amplifiés qui servent de standard pour la quantification est crucial (Prior, 1998). Dans l'expérience, les exons non délétés servent de témoins internes dans l'amplification par PCR multiplexe chez le même individu. Les combinaisons de 4 ou 5 exons ont été choisies de façon à ne pas contenir plus de 2 exons adjacents, car de tels exons ne peuvent pas servir de contrôles dans le cas d'une délétion des deux. L'exon d'un gène différent (Transthyrétine) a été co-amplifié dans l'une des trois combinaisons pour identifier des délétions hétérozygotes de l'ensemble du gène Parkine. Ce contrôle externe était indirectement représenté dans les deux autres combinaisons, qui incluent des exons de par et autre de l'exon 9; ce dernier étant testé avec la Transthyrétine.

Les résultats obtenus par cette méthode étaient très reproductibles et les résultats anormaux montrent des différences dans les rapports d'un facteur, qui correspond à celui attendu en théorie. Ces résultats montrent qu'il s'agit d'une méthode simple et validée pour un criblage rapide. De plus, des petites délétions ou insertions dans le produit PCR, qui sont relativement fréquentes (voir ci-dessous) peuvent être détectées simultanément par cette méthode. 2. Délétions d'exons et multiplications d'exons Il a été possible d'identifierquatre duplications d'exons et une triplications d'exon jamais décrites dans le gène de la Parkine auparavant, mais dont la fréquence relative est faible. De plus, 10 combinaisons de délétions d'exons nouvelles ont été identifiées avec, pour la première fois, la démonstration des délétions qui emportent l'exon 2. Dans une précédente étude (Abbas et al, l999), la fréquence relative des mutations ponctuelles et des délétions d'exons avait été estimée à environ 50%. Ainsi, les délétions d'exons (hétérozygotes ou homozygotes) peuvent représenter jusqu'à 50% des mutations de la Parkine, soulignant l'intérêt de la technique décrite ici. De fait, cette technique a permis de détecter des mutations dans 26 des 53 familles. Ainsi, dans l'échantillon étudié les mutations ponctuelles et les délétions dans le gène de la Parkine ont la même fréquence, alors que les délétions d'exons sont majoritaires dans la population japonaise (Hattori et al, 1998). Les conséquences fonctionnelles des délétions ou des multiplications d'exons décrites (décalage du cadre de lecture ou délétion/multiplication en phase) ont été déduites des séquences d'ADNc publiées de la Parkine (Kitada et al, 1998) et sont spéculatives, car l'absence de produit de PCR n'indique pas qu'il y a forcément délétion de l'exon dans sa totalité (voir ci-dessus). Cependant, le rôle pathologique des modifications détectées est très probable, car elles se transmettent avec la maladie dans les familles qui ont pu être testées, elles sont associées à des mutation ponctuelles chez des hétérozygotes composites et les délétions sont identifiées avec une fréquence similaire à celle des mutations ponctuelles. De même, dans les cas isolés, la fréquence des délétions hétérozygotes et des mutations ponctuelles est similaire. Dans le cas de l'exon 3, des amorces exoniques ont été utilisées, qui démontrent l'altération de cet exon lorsqu'il n'y a pas de produit de PCR. En plus, dans une partie des cas, plusieurs exons juxtaposés étaient délétés simultanément, ce qui est un argument pour une grande délétion génomique. Des délétions ou des multiplicationhétérozygotes de l'ensemble du gène de la Parkine n'ont pas été observées. Il s'agit probablement d'un événement rare compte tenu de la très grande taille (environ 500 kb) de ce gène (Kitada et al, 1998). 3. Un point chaud de délétions d'exons ? Comme précédemment noté par le groupe du docteur Mizuno, les délétions d'exons touchent fréquemment les exons 3 à 5. Cette observation est confirmée dans les familles européennes. De plus, il est démontré que l'exon 2 seul ou associé à d'autres, est aussi fréquemment impliqué dans les familles européennes (tableau II).

4. Nouvelles mutations ponctuelles L'identification de 8 nouvelles mutations ponctuelles (6 de type faux-sens, 1 tronquantes et 1 de type non-sens) augmente la diversité des mutations ponctuelles du gène de la Parkine. Les mutations décrites sont pathogènes, comme a montré la ségrégation avec la maladie, et ne sont pas détectées chez 122 à 147 chromosomes de témoins (la mutation 1142-1143de1GA pas inclue). Même si le changement Cys289G1y est conservatif, ce changement d'acide aminé peut avoir des conséquences délétères importantes, si la cystéine en position 289 est impliquée dans un pont disulfure, important pour la fonction de la protéine.

De façon intéressante, 2 patients de la famille UK-040 présente 3 mutations différentes (voir tableau 4) : une mutation faux-sens Arg334Cys dans l'exon 9 à l'état homozygote, une délétion homozygote de 5 paires de bases en position -17 à -21 de l'intron 8, et une mutation faux-sens non conservative Asp280Asn à l'état hétérozygote. On peut suspecter que la mutation Arg334Cys à l'état homozygote est causale, mais la délétion de cinq paires de base à l'état homozygote, à proximité du site accepteur épissage de l'exon 9, pourrait aussi avoir des conséquences fonctionnelles. S. Des points chauds de mutations ponctuelles ? Cinq mutations ponctuelles sont présentes dans plusieurs familles analysées. Les trois plus fréquentes sont 255delA (détectée dans 6 familles) et 202-203delAG (trouvée dans 5 familles) et Arg275Trp (détectée dans 5 familles). Nous avions montré précédemment que deux des mutations 202-203delAG étaient probablement survenues de façon indépendante (Abbas et al, 1999). Un effet fondateur pourrait être suspecté pour la mutation 255delA qui touche 5 familles françaises. Cependant, cette hypothèse ne pourra être vérifiée que par l'analyse des haplotypes. 6. Génétique épidémiologique En tenant compte des 12 familles déjà publiées (Lücking et al, 1998 ; Abbas et al, 1999), 34 des 77 familles avec un syndrome parkinsonien de début précoce présentent des mutations du gène de la Parkine, qui souligne l'importance de ce gène dans les familles européennes. La détection de mutations dans 18 des 102 cas isolés et analysés est plus difficile à interpréter car l'effectif est plus petit et l'analyse de certains cas n'est pas complète# Cependant, il est frappant de constater que l'âge de début des 7 cas pour lequel il est connu est particulièrement précoce (13 à 22 ans) et qu'il y a très peu de cas à début très précoce sans mutation du gène de la Parkine (par exemple, IT-NA-JMP-3). Ce résultat suggère que la fréquence des mutations du gène de la Parkine dans des cas isolés croît lorsque leur âge décroît, spécialement avant l'âge de 25 ans. L'observation de mutations du gène de la Parkine dans des cas isolés n'est pas surprenante si l'on considère que dans des familles de petite taille, une maladie autosomique récessive a toutes les chances d'apparaître comme un cas isolé. L'analyse d'un échantillon plus large sera utile pour déterminer précisément la fréquence des mutations de la Parkine chez les cas isolés, selon l'âge de début. Des mutations ont été identifiées dans des familles d'origines très variées : France, Italie, Grande Bretagne, Allemagne, Pays Bas,Algérie, Portugal, . Ces résultats combinés à ceux de la littérature montrent que les mutations du gène de la Parkine sont mises en évidence dans toutes les populations testées jusqu'à présent. 7. Patients avec une anomalie du gène de la Parkine à l'état hétérozygote Bien que la technique de détection des délétions hétérozygotes d'exons ou des multiplications d'exons nous ait permis d'identifier des cas hétérozygotes composites, dans environ 1/4 des familles (13 sur 53) une seule mutation a été détectée. II s'agit de 6 cas avec une mutation ponctuelle à l'état hétérozygote et de 7 avec une délétion d'exon à l'état hétérozygote. Le rôle pathogène de ces mutations est très probable, car ils causent un changement d'acide aminé non conservatif ou une protéine tronquée. De plus, une de ces mutations de type faux-sens (Arg275Trp) est associée à une autre mutation ponctuelle hétérozygote (G1y430Asp) et à des délétions d'exon hétérozygotes (exon 3-6 ou exon 5+6), portée par l'autre allèle dans trois familles différentes. L'absence de détection d'une mutation sur l'autre allèle dans 13 familles suggère qu'une seconde mutation non détectée affecte une autre région du gène. Cette hypothèse est renforcée par le fait que dans 6 familles probablement liées au locus PARK2, car les patients sont haploidentiques pour 4 marqueurs de la région, aucune mutation n'a été détectée. Ainsi, d'autres régions du gène pourraient être affectées, telles que les régions promotrices, les régions 5' et 3' non traduites, ou des séquences introniques. <I>8. Hétérogénéité génétique des</I> syndromes <I>parkinsoniens</I> autosomiques <I>récessifs de début précoce</I> Dans 5 des 77 familles, une liaison génétique au locus Parkine a pu être exclue. De plus, aucune mutation n'a été identifiée dans 21 familles pour lesquelles ce locus n'a pas pu être formellement exclu. Ces résultats suggèrent qu'il pourrait exister au moins un autre locus pour des familles avec un syndrome parkinsonien autosomique récessif de début précoce en Europe. Cette hypothèse avait été proposée par Leroy et al (1998), qui rapporte une famille avec deux branches, dont l'une présente des délétions du gène de la Parkine, alors que l'autre ne présente ni ces délétions ni le même haplotype, ce qui exclu une liaison à ce locus. <I>V Conclusion</I> Une nouvelle méthode pour la détection de délétions hétérozygotes d'exons ou des multiplications d'exons est rapportée. En particulier, les duplications/triplications d'exons et des délétions de l'exon 2 et d'autres combinaisons d'exons sont nouvelles. En combinaison avec le séquençage d'exons, huitnouvelles mutations ponctuelles et une délétion intronique qui pourrait affecter un site d'épissage, ont pu être identifiées. Ainsi, 34 des 77 familles analysées ( environ 50%) présentent des mutations du gène de la Parkine. De plus, les mutations de ce gène ont été détectées dans 19 cas isolés. Dans la population européenne, la proportion de mutations ponctuelles et de délétions d'exons semble identique. Deux points chauds de mutations qui correspondent pour les délétions aux exons 3 à 5 et à prois mutations ponctuelles (202-203delAG, 255delA et Arg275Trp) ont, en outre, été mis en évidence. <U>Références</U> bibliographiques

Claims (34)

<U>REVENDICATIONS</U>

1. Acide nucléique codant pour la parkine humaine, caractérisé en ce qu'il comporte une ou plusieurs altérations génétiques choisies parmi: a) une délétion de un ou plusieurs exons, en combinaison ou non, b) une multiplication d'exons, c) une mutation ponctuelle, d) une délétion de 1 ou plusieurs paires de bases contigües

2. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce que la délétion d'exons a) affecte les exons 2 à 9, séparément ou en combinaison.

3. Acide nucléique selon la revendication 2, caractérisé en ce que la délétion est choisie parmi la délétion de l'exon 2, seule ou en combinaison, de préférence avec les délétions des exons 3 et/ou 4; la délétion de l'exon 6; la délétion de l'exon 8, seule ou en combinaison.

4. Acide nucléique selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend une combinaison de délétions choisie parmi les combinaisons suivantes : 2 + 3 + 4; 3 à6,5+6;6+7,7+8+9; 3à9.

5. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce que la multiplication d'exons b) est choisi parmi une duplication de l'exon 3; une duplication de l'exon 6, une duplication de l'exon 7, une duplication de l'exon 11 et une triplication de l'exon 2

6. Acide nucléique selon la revendication 1 caractérisé en ce que la mutation ponctuelle c) est une mutation non-sens.

7. Acide nucléique selon la revendication 6 caractérisé en ce que la mutation affecte des exons choisi parmi les exons 2; 3; 7; et 12, seuls ou en combinaison.

8. Acide nucléique selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'il comporte une mutation ponctuelle 905T->A, introduisant un codon stop à la place du résidu 5 Cys 268.

9. Acide nucléique selon la revendication 1 caractérisé en ce que la mutation ponctuelle c) est une mutation faux-sens.

10. Acide nucléique selon la revendication 9 caractérisé en ce que la mutation entraine un changement non-conservatif d'acide aminé dans la protéine 10 codée.

11. Acide nucléique selon la revendication 10 caractérisé en ce que la mutation affecte les exons 6 à 12, de préférence les exons choisis parmis les exons 6; 7; 9; ou 12 seuls ou en combinaison.

12. Acide nucléique selon la revendication 1 1 caractérisé en ce que la 15 mutation est choisie parmi les mutations Lys21 l Asn; Asp280Asn; Gly328G1u; Arg334Cys; ou Gly430Asp, seules ou en combinaison.

13. Acide nucléique selon la revendication 9 caractérisé en ce que la mutation est conservatrice.

14. Acide nucléique selon la revendication 13 caractérisé en ce que la 20 mutation est la mutation Cys289G1y; seule ou en combinaison.

15. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce que la délétion de paire(s) de bases d) entraîne un décalage du cadre de lecture.

16. Acide nucléique selon la revendication 15, caractérisé en ce que la délétion est de 1 à 10 paires de bases contigües.

17. Acide nucléique selon la revendication 15, caractérisé en ce que la délétion est la délétion de cinq paires de bases dans l'intron 8 en position -21 à -17 par rapport à l'exon 9, ou la délétion de deux paires de bases en position 1142-l 143de1GA dans l'exon 9.

18. Polypeptide codé par un acide nucléique tel que décrit selon l'une des revendications 1 à 17.

19. Anticorps spécifique d'un polypeptide tel que décrit selon la revendication 18.

20. Composition comprenant un polypeptide tel que décrit selon la revendication 18 ou un anticorps tel que décrit selon la revendication 19.

21. Sonde nucléotidique caractérisée en ce qu'elle hybride spécifiquement avec un acide nucléique tel que décrit selon l'une des revendications 1 à 17.

22. Couple d'amorces pour l'amplification de tout ou partie d'un acide nucléique tel que décrit selon l'une des revendications I à 17, caractérisé en ce qu'il comprend: - une première amorce complémentaire d'une région du gène de la parkine située en 5' d'une altération génétique, et - une deuxième amorce complémentaire d'une région du gène de la parkine située en 3' de ladite altération génétique.

23. Couple d'amorces selon la revendication 22, caractérisés en ce que les amorces sont choisies parmi les amorces suivantes 5'-GGCAGGGAGTAGCCAAGTTGAGGAT-3' 5'-AGCCCCGCTCCACAGCCAGCGC-3'

24. Procédé pour l'identification d'une altération génétique dans le gène de la parkine comprenant: i) la mise a disposition d'un échantillon test comprenant le gène de la parkine, ii) l'amplification d'une partie au moins dudit gène comprenant une altération génétique selon la revendication 1, et iii) la mise en évidence de la présence de l'altération génétique.

25. Procédé selon la revendication 24 caractérisé en ce que l'échantillon est un échantillon de sang, tissu, plasma ou une culture de cellules.

26. Procédé selon la revendication 25 caractérisé en ce que l'échantillon est prétraité de manière à rendre le gène de la parkine, ou une partie de celui-ci, accessible pour l'amplification.

27. Procédé selon la revendication 24 caractérisé en ce que l'amplification est réalisée au moyen d'un couple d'amorces tel que décrit selon la revendication 22.

28. Procédé selon la revendication 24 caractérisé en ce que la mise en évidence est réalisée par PCR/multiplexe semi-quantitative.

29. Procédé selon la revendication 28, caractérisé en ce qu'il met en évidence les délétions et/ou les multiplications d'exons.

30. Procédé de diagnostique d'une susceptibilité au syndrome parkinsonien comprenant la recherche d'une altération génétique dans le gène de la parkine selon la revendication 1.

31. Vecteur comprenant un acide nucléique tel que décrit selon l'une quelconque des revendications 1 à 17.

32. Cellule comprenant un vecteur tel que décrit selon la revendication 31.

33. Mammifère non-humain comprenant, dans ses cellules, un acide nucléique tel que décrit selon l'une des revendications 1 à 17.

34. Utilisation d'une cellule telle que décrite selon la revendication 32 ou d'un mammifère tel que décrit selon la revendication 33 pour l'identification de composés capables de contrecarrer les effets d'une altération génétique du gène de la parkine.