JP2003503735A - 分子相互作用の測定および使用 - Google Patents
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Abstract
Description
わせて分類する方法に関する。とくに、本発明は、種々の結合相手間の、例えば
抗体−抗原相互作用における親和力の測定に関する。
原相互作用およびレセプターへの分子の結合の基礎となっている。分子の認知は
静電相互作用(水素結合)および疎水性相互作用のごとき非共有相互作用によっ
て達成される。結合定数および自由エネルギ、エンタルピーおよびエントロピー
変化の熱力学的測定は、とくにX線回析、かつ可能ならば、サイトに向けられた
突然変異生成からの情報と結合されるとき、分子認知の基礎に見通しを付与する
。
てなされた。AFMが結合破壊力を測定することができる一方、その技術は1つ
の測定のみが一度になされ得るという欠点を有している。今日まで、AFMは、
アビジン−ビオチン相互作用(フローリン他、サイエンス、1995;264:
415)、DNA交配(ボーランド他、PNAS、1995;92:5291)
、抗体−抗原相互作用(ダマー他、Biophys.J.,1996;70:2
437)および付着糖たんぱく質(ダマー他、サイエンス、1995;267:
1173)に使用された。
は十分に認められた技術である。例えば、親和力クロマトグラフィにおいて、分
離されるべき成分は特別なリガンドを収容しているコラムの下に通される。関心
の有る成分は優先的にかつ強力にコラムに結合し、かつ他の成分が除去されなが
らコラム上に保持される。結合された材料は後の段階においてコラムから溶出さ
れ得る。
択性を増加するのが望ましい。
4−10は、レーザ発生の表面音響パルスを使用して行われた表面洗浄および付
着の研究を開示している。パルスは低い反復率(20Hz)および一定のエネル
ギであった。手順は真空中で行われ、かつそれゆえ、商業的な開発には適さない
。光学的顕微鏡が粒子の除去を検出するのに使用され、そしてそれは種々の大き
さの粒子間で識別することができなかった。
ための圧電結晶センサの使用を開示している。クロサワ他、Chem.Phar
m.Bull,1990;38(5):1117−20は、抗体支持ラテックス
の粘着作用の検出のためにかかるセンサを使用することを報告している。WO−
A−98/40739は、また、媒体中の細胞の存在を指示するのに使用するた
めに、特別な結合物がそれに不動にされるようなプレートを含んでいる、かかる
センサを開示している。これらのセンサは一定の電圧において共振周波数の変化
を測定することによって使用される。
高感度であるので、細胞中での標本の培養によって検出される。臨床サンプル中
のウイルスDNAまたはRNAの直接検出は、PCRおよび関心のあるウイルス
に合わせられた特別なプライマを使用して達成され得る。PCRが増幅段階を伴
うので、相互汚染が主要な問題でありかつ信頼し得る定量的な方法を確立するの
は難しい。他の直接的な方法は電子顕微鏡、免疫電子顕微鏡、および酵素−結合
抗体による抗原検出を基礎にした方法を含んでいる。これらの方法はしばしば比
較的無感応であり、かつそれゆえ比較的大量のウイルス粒子を要求している。
増大している振幅において表面を機械的に振動することによって破壊されること
が可能で、表面から目標分子または粒子を分離させるという現実に基礎を置いて
いる。必要とされる加速、かつそれゆえ、力は、分子または粒子の質量、表面へ
の結合の性質および目標分子または粒子の幾何学的形状または大きさを含んでい
る、種々の要因に依存している。本発明は、それゆえ、種々の目標分子を分離し
、またはこれらを大きさにしたがって分類するのに、またはそれらの存在を検出
するのに使用され得る。
、 (i)前記組成物を表面上で不動にされる分析物用の結合相手と接触させる工
程と、 (ii)前記表面上から、前記分析物、または前記組成物の他の構成成分を選
択的に除去するように、増大する振幅で前記表面を振動させる工程と、を備えて
なっている。
定するための方法に使用されることが可能である。本発明の第2の態様によれば
、かかる方法は、 (i)一方が表面上で不動にされる前記結合相手を接触させる工程と、 (ii)増大する振幅で前記表面を振動させる工程と、 (iii)分離状態を検出する工程と、を備えてなっている。
ら共有結合への範囲にある、種々の物理的および化学的結合に適用されることが
可能である。
有している表面と、前記表面を増大している振幅で振動させるための手段と、分
離状態を検出するための手段と、を備えてなっている。
ンス(QCM)または表面音響波装置、または、例えば、交流電圧または磁界を
印加することによって振動するように作られ得る圧電材料を備えてなることがで
きる。これらはAFMに比べて安価な装置であり、かつマルチプレックスにされ
ることができる。かかる装置を使用することの他の利点は、結合の大部分が同時
に破壊され、特別な加速(ATDに印加された電圧)において検出可能な音響お
よび鋭い雑音ピークを生起するということである。他の利点は、ATDが、分離
状態が発生するとき、音響放出を検出するように、高感度マイクロホンとして使
用され得るということである。
化が、ATDが一定の電圧で駆動されるとき測定された。これに対して、本発明
は駆動電圧かつそれゆえATDの振動の振幅を増大することを伴っている。
している。これらの例は、空気中において、ストレプトアビジンと呼ばれる球体
がビオチニレートされた表面を有しかつ0.1V以上であるが6V以下の駆動電
圧を有するQCMを使用して通常のラテックス球体から分離され得ることを示し
ている。通常のラテックス球体は表面から除去されて、表面に付着されたストレ
プトアビジンと呼ばれる球体のみを残している(より強力なストレプトアビジン
−ビオチン結合によって)。これは、例えば、粒子の大きさによる分類および選
別、細胞選別、ファージの選別ならびに新たなバイオセンサの設計における用途
により、一定の時間長さに印加される可変の力に基づいて分離科学の新たな形態
を開いている。かかる分離方法は低コストであり、かつ容易にマルチプレックス
されかつ自動化され得る。例えば、同一のマイクロバランス上の種々の位置に種
々の目標を堆積しかつ多数の目標に対してリガンドのライブラリーを同時に選別
することができる。一定の大きさからなるウイルスの粒子の検出および分析は他
の応用範囲である。同様に重要なことは、本発明は、分子認知に伴われる力をプ
ローブするための、新たな、高感度のかつ潜在的に定量的な工具を提供するとい
うことである。
て、例えば、表面音響波装置、共振水晶結晶板装置、音響板モードおよび薄膜柔
軟プレート装置によって、振動するように作られ得る。
能である。本発明に使用され得るセンサの説明は、音響波センサ、バランタイン
他、(1997)アカデミック・プレスに収録されている。センサは、好ましく
は、表面音響波装置、または、より好ましくは、水晶結晶板マイクロバランス(
QCM)である。
結晶からなる円板である。交流電圧が電極に印加されるとき、逆の圧電効果によ
り、剪断振動を受ける。電圧を増加することはQCMの振動の振幅を増大するこ
とである。
放出を検出するのに使用され得る。1つの主要な共振周波数に対応し、かつ他の
モード近傍で音響放出を検出する周波数で振動を励起するのは技術的により容易
である。一例として、QCMはその共振周波数で駆動され、そして音響放出はそ
の第3高調波において検出される。
たは成分を説明するのに使用され得る。接触に続いて、分析物は分子の相互作用
によりセンサに結合され加速を受け、かつそれゆえ力が分析物に働かされる。振
動の振幅が増大するとき、かつ特定のしきい値力において、結合破壊が発生する
。先に結合された分析物粒子はかくして表面上で自由に転動する。
のであってもよい。分析物はたんぱく質、抗体、抗原、酵素、酵素抑制剤または
ポリヌクレオチドであってもよい。分析物は、また、バクテリア、細胞、ウイル
ス、プリオンまたはファージのごとき、大きな粒子であってもよい。本発明にお
ける使用にとくに適するさらに他の粒子の例は、あらゆる材料、例えば、シリカ
、金またはラテックス、またはプラスミドのごとき大きな高分子の微小球体を包
含している。表面固定の結合相手は同一の型のものであることができ、したがっ
て、適切な物理的または化学的結合に依存して選択され得る。
きな粒子は、また、光学的手段、例えば、顕微鏡によって検出され得る。
に目標分子を不動にすることによって実施される。表面は、次いで、センサの表
面上の分子を分離するように振動させられ得る。振動は振幅を安定して増大する
ことにより実施され、そして表面から目標分子を除去するか、または表面から組
成物の他の成分を除去するように選択されることができ、表面に結合された目標
分子を残している。好適な実施例において、センサ表面は圧電音響波装置、例え
ば、QCMを使用することによって振動させられる。同様の圧電装置が破壊状態
によって発生される音響雑音を検出するためのマイクロホンとして使用されるこ
とが可能である。
る。例えば、その技術は細胞表面に現れる特別なレセプター分子で細胞を選択す
るのに、または特別なリガンドに対する強い親和力で抗体のための選択に適用さ
れ得る。
により表面上の種々の位置において局部化され得る。その場合に、幾つかの異な
るリガンドを有する幾つかの強力に結合する相手用の混合物を同時にふるい分け
することができる。とくに、本発明は、その上に不動にされたレセプターのごと
き種々の材料を有するチップとともに使用され得る。より一般的には、チップは
、例えば、人間および動物臨床試験における種々の感染体、病原菌、プリオン、
食物アレルゲン、ウイルス、バクテリア等の、および食物および水の衛生状態の
試験を許容する材料を表示することができる。さらに、本発明はライブラリース
クリーニング、ファージ表示等に使用され得る。
ルを測定する方法である。好ましくは、一方の分子がセンサ表面に対して不動に
され、かつ他方の分子が粒子に、例えば、微小球体に対して不動にされる。粒子
は次いで関心のある分子の相互作用によりセンサに取着される。機能的なものに
された粒子は次いでセンサに電圧を印加することによって振動させられる。振動
の振幅が増大するので、力は結合破壊が生じる臨界値に達する。この時点におい
て、特徴的な雑音は高感度増幅器を使用することによって検出されることができ
、かつ粒子の動きは、例えば、光学的顕微鏡により観察されることができる。信
号の大きさはセンサ表面に結合された粒子の数に依存している。代表的には、Q
CMが、例1において、以下で説明されるように、物理的吸収の微小球体ととも
に使用されるならば、雑音は微小球体の大きさに依存して、0.1〜1Vで検出
され、発生は、微小球体が、顕微鏡により、摺動しかつ逃げ去るように観察され
るとき生じる。プロットは、破壊力スペクトルとして言及される、発生された雑
音対振幅(または印加された電圧)からなされ得る。結合破壊がプロットから明
らかとなる点が、そこで、雑音ピークとなる。それゆえ、結合破壊が生じる臨界
電圧が決定される。公知の結合密度および強度を有する粒子を使用する、適宜な
較正実験は、この方法を定量的にさせる。さらに、音響放出ピークの高さは結合
された粒子の数の尺度である。
、酵素/リガンド相互作用、抗体/抗原相互作用およびレセプター/リガンド相
互作用または大きな高分子とその天然の結合相手との間の相互作用の研究に適し
ている。本方法は、また、ポリヌクレオチド間の交配(ハイブリダイゼーション
)の状態の研究に応用され得る。かくして、本発明の第1の態様において、リガ
ンドは、例えば、たんぱく質、抗体または抗原、酵素、酵素抑制剤、ポリヌクレ
チオドまたは大きなプラスミドまたはウイルスのごとき大きな高分子であっても
よい。いずれかの材料が、本発明の第2の態様において、表面または粒子に結合
され得る。
するのに使用される。この作用は、単調に増大する振幅かつそれゆえ増大する加
速において、表面上の巨大粒子により、表面を振動させることに基礎を置いてい
る。これは圧電音響波装置、この場合には、水晶結晶板マイクロバランス(QC
M)により表面を駆動することによって達成される。振幅が増大すると、加速か
つそれゆえ粒子上に作用する力も増大する。表面に粒子を付着させるすべての結
合の破壊は音響雑音を結果として生じ、かつ同様の圧電装置が、破壊状態によっ
て発生される、この雑音を検出するための高感度マイクロホンとして使用される
。例1〜5に使用される装置の概略図が図1に示され、好適な装置のより一般的
な概略図が図8に示されている。
f発生器12、3f+Δfフィルタ13、ロックイン増幅器およびアナログ−デ
ジタル変換器14、および矢印によって示されるデータ入力および制御出力を有
しているコンピュータ15を備えている回路を示している。例1〜5において、
f=14.2MHz、およびΔf=82kHzである。粒子16は基板の表面上
に配置されている。
制御下で滑らかに上昇している出力振幅を供給することができる入力23および
出力24を備えた可変利得増幅器22を示している。回路は、また、帯域受信機
26(例えばSSB無線受信機と同様な)、およびリンク28によりデータを供
給する1または複数のアナログ−デジタル変換器27を備えている。さらに、回
路はコントローラ、記録およびデータ信号処理装置29(例えばコンピュータま
たは特殊化されたDSPプロセッサ)を備えている。破線30によって指示され
た接触はより最適な濾過および結合手段によって置き換えられることができ、例
えば、それは受動のL,C,Rネットワークであってもよい。
換器21を備えた増幅器22は、変換器が有効である周波数で好ましくは振動す
る、簡単な発振器ネットワークを提供し、QCMに関してそれは基本的な直列共
振周波数であってもよい。この発振周波数(F)は、例えば、14MHzである
。出力24において駆動電圧の振幅は制御リンク25によってコントローラ29
の制御下で滑らかに上昇する。点30において音響放出の出現信号は任意のフィ
ルタ/カプラによって純化され、かつ次いで帯域受信機26の入力に供給されて
もよい。作動している受信機の周波数帯は最大の信号対雑音規準、例えば、第3
高調波(3*F+ΔF)、例えば、42.082MHzの近傍に置かれた共振モ
ードによって選択され得る。
アナログ−デジタル変換器27によって変換される。データは、次いで、有用な
信号を引き出すために、29でさらにデジタル的に処理され、かつ次いで記録さ
れおよび/または観察者に示される。増幅器22は、加えて、信号対雑音比を改
善し、かつまた、発振器が変換器を横切る電流対電圧の正しい周波数および移相
下で作動することを保証する、受動的出力および/または入力フィルルタを備え
ることもできる。
このセンサは変換器電極33を駆動する増大している振幅を有する出力32でR
F電圧を発生するための手段31を備えている。電極33は圧電基板34におい
て高振幅SAWの発生のために最適化されている。電極構成37は音響放出の電
気信号への最良の変換のために最適化されている。パターンは複雑かもしれず、
1またはそれ以上の電極対を備えている。装置は、さらに、リンク36によって
発生器31を制御するための、かつ発生された信号を1またはそれ以上の入力3
8において受信しかつデータ信号処理、例えば、相関分析を実施するための制御
ユニット35を備えている。
効な変換周波数を供給するのに適するRF電圧を発生し、かつこれは圧電基板3
4(鎖線)上に置かれた発生している変換器電極33に供給される。RF電圧の
振幅は制御リンク36によってコントローラ35の制御下で時間とともに上昇す
る。受信電極37は能動領域から現れる音響放出を受信機/コントローラ35お
よび入力38に供給される電気信号へ変換する。アナログ−デジタル変換後に得
られたデータは次いで有用な信号を引き出すために信号処理を受ける。結果はそ
の場合に最終的に記録されおよび/またはオペレータに示される。
,図2B,図3A,図3B,図4A,図4B,図4C,図4D,図6B,図7お
よび図10は信号雑音(S;任意の単位)対振幅(A;ボルト)のプロットであ
る。図5A,図5B,図6Aおよび図6Cは信号雑音(S;任意の単位)対粒子
の数(N)のプロットである。
に付着された。使用された球体の被覆はQCMの表面積の1%であった。球体は
それらの直径において1%のみの変化を有した。
水晶結晶板を備えていた。クロム(厚さ20〜30nm)かつ次いで金(ゴール
ド)(厚さ100〜120nm)の層が堆積された。
それらは物理的結合(ラテックス−金)、ストレプトアビジン−ビオチン結合お
よび共有結合(アミド連鎖)である。物理的結合はセンサ表面上に直接ラテック
ス球体を配置し、そして窒素中で乾燥することによってなされた。ストレプトア
ビジン−ビオチン結合はビオチニレーテッドBSAを表面上に塗布し、そして窒
素中で乾燥することによってなされた。化学的結合はエタノール中に溶解された
アシド−終止のチオール(12−メルカプトドデカン酸)を使用してチオール分
子膜を形成することによってなされた。これは、次いで、EDC−NHSを使用
して活性化され、そしてアミン−終止の球体がアミノ結合を形成するように付加
された。
窓、および光学顕微鏡による散乱レーザ光の観察を許容するための光学窓を備え
たチャンバ内で実施された。QCMはチャンバ内に配置された。信号発生器、モ
デルDS345(スタンフォード・リサーチ・システムズ)がQCMを駆動する
のに使用された。粒子の運動および分離はCCDパナソニックWL−SL300
ビデオカメラを備えたオリンパスBH−2光学顕微鏡を使用して観察された。主
要な測定装置はロックイン増幅器、SR844(スタンフォード・リサーチ・シ
ステムズ)であった。基準信号は第1の発生器に同期された第2の発生器を使用
してロックインに供給された。すべての装置は実験の制御およびデータの収集の
ためにコンピュータにインターフェイスされた。
壊力スペクトルを示し、図2Bは物理的結合用のスペクトルである。
を実験的に測定することができる。これは分離に使用され得る。図2Aに示され
るように、幾つかが表面上にストレプトアビジンを有しかつ幾つかがそうでない
5μmの球体の混合物があるならば、0.1V以上であるが6V以下の、およそ
、1Vの電圧を表面上にビオチンを有するQCMに印加することにより、2つの
球体のセットを分離して表面上にストレプトアビジンと呼ばれる球体のみを設け
ることができる。この技術は、また、これらの球体が1Vで振動される場合に表
面上に結合するのみであるから、ストレプトアビジンと呼ばれる球体を検出する
のに使用され得る。
容している、実験データに基づいて、種々の電圧で計算された。この評価はQC
Mの電力消費およびそのQ因数(またはメリット因数−往復の相対的な共振帯域
幅=f/Δfresonance)を測定することによって行われた。振幅Aは、 A=〔QP/2π3f3M〕1/2 によって付与され、ここで、QはQまたはメリット因数、PはQCMによって消
費される電力、fは水晶結晶板の共振周波数およびMは運動に伴われるQCM水
晶結晶板の有効質量である。Q因数は6Vでおよそ15000であるように測定
され、それは60nmのQCMの振動振幅の評価を付与する。球体上の力はそれ
ゆえ9μNである。これは160pN2の単一のストレプトアビジン−ビオチン
結合を破壊するのに必要とされる力と比較されるべきであり、かつほぼ60,0
00結合が同時に破壊されることを示している。評価は、これが球体と表面との
間の最初のストレプトアビジン−ビオチン結合の50%またはそれ以上に対応し
ていることを示している。これは、球体を表面に付着する結合の大部分が同時に
破壊されることを意味している。これは破壊力スペクトルおよび結合破壊につい
ての検出可能な雑音に観察される鋭いピークを生じる。
QCMのQ因数は液体負荷により減少し、かくして空気と比較されるとき特定の
電圧において振動の振幅を減少する。微小球体に作用している粘着力がありそし
てその有効な質量は、球体上の力を増加する、関連の水の層により、増加する。
により表面に付着された5μmのラテックス球体に関する破壊力スペクトルを示
している。破壊はそれぞれ1Vおよび10Vにおいて発生する。
ン−ビオチン結合、および水中での化学的結合の破壊に関する臨界電圧の減少が
、後者の作用が特徴的であることを示している。したがって、この例は、結合破
壊、かつそれゆえ分離およびバイオ感知が水液体または他において可能であるこ
とを明瞭に示している。
であると仮定し、かつ同一の大きさの微小球体がこれらの実験において使用され
たので、破壊力の相対的なスケールが得られることができる。これは物理的:ス
トレプトアビジン−ビオチン:化学結合に関して1:60:600である。この
スケーリングは合理的であると思われ、かつこの方法のダイナミックレンジを示
している。公知の結合密度を用いて適宜な較正実験を行うことにより、これらの
測定を定量的にすることが可能である。
かつ容易に利用可能であるので、ウイルス、かつとくに、ファージpIIIコー
トたんぱく質に溶解されたマルトース結合たんぱく質を表示する遺伝子で変性さ
れたバクテリオファージの検出を示している。ファージは長さ1μmそして直径
6nmの柔軟なロッドからなる長く、細い線維状ウイルスである。遺伝子で変性
されたファージはファージpIIIコートたんぱく質への溶出としてウイルスの
一端において5マルトース−結合たんぱく質まで追加的に表示する;マクカファ
ーティ他、ネイチャー、1990,348:552参照。これらのファージはア
ミロース樹脂上でとくに純化され得る。
ス−結合たんぱく質融合が遺伝子III−記号化されたコートたんぱく質のアミ
ノ末端への融合としてfdファージの表面上に表示された。このために、fdフ
ァージベクトル、pJB113が構成された;それはMaIE(E.coli)
trpC(E.coli)と遺伝子IIIとの間の遺伝子融合を記号化した。こ
のファージベクトルはテトラサイクリン−抵抗マーカーを運んだ。変性されない
コンペティターファージはカナマイシン−抵抗マーカーを支持しているVCSM
113K07ヘルパーファージ(ストラトジェーン)であった。
トックを有するエシェニチア・コリ・菌株TG1の3mLのミッドログファーゼ
LB培養を感染させることにより得られた。37°Cで攪拌(250rpm)の
2時間後、培養の1mLが100mlLBに接種されかつ1時間、37°Cで、
350rpmにおいて攪拌された。テトラサイクリン(10μg/mL)または
カナマイシン(50μg/mL)が、30°C、250rpmで一晩中成長され
た、それぞれ、pJB113またはVCS培養に付加された。バクテリアは小球
形にされ(15分、4.1krpm)そしてファージはそれぞれ0.5Mおよび
4%(v/v)の最終濃度にNaClおよびPEG6000の添加により浮遊物
から沈殿した。氷上に1時間置いた後、ファージは遠心力(30分、4.1kr
pm)によって回収され、かつファージペレットが1mlH2O中に再び懸濁さ
れかつ4°Cで貯蔵された。
ml)中に溶解されかつ5分間攪拌された(部分的に溶融可能)。DMF(0.
5ml)中の11−メルカプトドデカン酸(11.5mg,0.05mmol,
5eq.)にDIC(7.8μl,6.3mg,0.05mmol,5eq.)
およびDMAP(cat.)が添加され、そしてこの溶液が澱粉溶液に添加され
た。反応は室温で一晩攪拌して置かれた。反応は、次いで、milliQ水(6
倍50mL)を有する溶液で濯ぎかつ濃縮によって、遮断された10000MW
薄膜を備えた攪拌されたセルをを使用して純化され、これに減圧凍結乾燥が追随
した。
プを含有している変性された澱粉を使用して設けられた。QCM(例1における
と同様に設けられた)は12時間メタノール(1μg/mL)中で澱粉の溶液中
に置かれた。サンプルは次いで水洗いされ、かつ窒素の蒸気下で乾燥された。ウ
イルスは溶液から表面上に堆積され、かつ空気中での実験のために室温で乾燥さ
れた。種々のウイルス濃度が希釈によって作られた。マルトース−結合たんぱく
質を遮断するマルトースにより実験を行うために、100nMマルトースがファ
ージの溶液に添加された。
、溶融可能なポテト澱粉(マルトースの分岐されたポリマを含有している)から
なる層で被覆された。実験は空気中および水中の両方において実施された。
.)の混合物に関して水中で得られた破壊力スペクトルを示しており、走査は5
00秒にわたって獲得された。金電極の表面上に各型のファージのおよそ500
ミリオンが存在している。変性されない、かつそれゆえとくに結合されないファ
ージに関して、破壊ピークは1.2Vで検出された。マルトース−結合ファージ
の対応する破壊ピークはほぼ9Vで、かつ結合破壊時に実施されるより大きなエ
ネルギによりとくに結合されないファージより強力である。空気中において、と
くに結合されたマルトース−結合ファージからのピークは10Vまで観察されな
かった;図4Bはとくに結合されないファージに関する空気中のデータを示して
いる。ピークは7.5Vで、水中で認められたピークにわたってほぼ6の増加を
発生する。第2の走査(...)はほとんどピークがなく、ファージが表面から
除去されたことを示している。このことは、追加の粘性摩擦力および粒子の有効
質量の増加が空気中より水中においてファージ粒子と表面との間の結合を破壊し
易くさせるということを立証している。
の観察に明らかに関連させられており;これは短い時間周期で発生している音響
雑音を結果として生じ、かつそれゆえ方法を非常に高感度にさせる。加えて、特
別な結合ファージからの信号は特別な結合がないファージからかつより高い振幅
において良好に分離され、それは特別でない吸着が特別な吸着の測定に影響を及
ぼさないことを意味している。非常に大きい力が、変性されないファージと表面
との間の特別でない相互作用を破壊するのに必要とされる力に比べて、ファージ
に表示されるマルトース−結合たんぱく質と澱粉被覆表面との間の特別な相互作
用を破壊するのに必要とされる。
中心(頂部のプロット)でまたは表面全体(底部のプロット)にわたってQCM
上に堆積されるとき、マルトース−結合ファージにより空気中で実施された制御
実験の結果を示しており;これは変性されないファージと同様な作動を示し、差
異がこれらの特別な相互作用によることを立証している。図4Dは表面上に10
00個のファージのみによる水中の破壊力スペクトルを示し、そして破壊の状態
が検出可能であることを示している。負荷の変化の結果として、QまたはQCM
の品質因数のより小さい変化によるピーク位置の小さな移動が存在する。
以上であるがマルトース−結合ファージに関する電圧以下である電圧においてQ
CMを駆動することによりマルトース−結合ファージから特別に結合されないフ
ァージを分離可能にすべきであることを示唆している。このことは、結合のため
にファージライブラリーをふるい分けするような代替の方法を示唆し、そのさい
表面上に残されたファージの結合親和力は、ファージが実用可能であるならば、
印加された電圧の大きさおよび印加される時間を制御することによって制御され
る。
ージにより、実施された。図5Aは、信号のパワーが少なくとも大きさの5個の
オーダーにわたってファージの数と直線であり、かつQCM上のほぼ200個の
ファージの存在が99%の確立で検出され得ることを示している(9Vに近い最
大強度の雑音ピークに関して)。図5Bは、99%の確立による100個のファ
ージの検出感度を示している、空気中での特別な結合のないファージについての
同様な曲線を示している。低い希釈において表面上のマルトース−結合ファージ
の数はAFMを使用する直接作像によって確認された。
れに対して、PCRを使用すると、ウイルスのDNAのコピーの数が溶液中に検
出される。強力なウイルス表面相互作用が存在するかまたは溶液が表面上にウイ
ルスを残して蒸発させられる場合に発生する、溶液サンプル中のすべてのウイル
ス粒子が表面に結合すると仮定されるならば、その場合に、感度の直接比較が可
能である。PCRの感度は、この例(最適化されていない)により、ファージの
検出感度に比較し得るウイルスDNA/mLの約100コピーである。エレクト
ロニクスは改善可能であり、かつ多分、少なくとも大きさのオーダーにより、感
度をさらに改善するような余地がある。例えば、これらの実験において、ファー
ジはQCMの表面上に均一に堆積された。しかしながら、QCMの振幅および感
度の両方が、支配的な信号がQCMの中心から到来することを意味している空間
的な依存を有している(図4Cに示されるように)。これは、より強力なピーク
がファージがQCMの中心にのみ堆積された場合に記録され得ることを意味し、
結果として感度の向上を生じる。
て人間のウイルスの検出に簡単に拡張され得る。これらの抗体はQCMの表面に
付着されたウイルス間の特別な相互作用を形成する。これらの抗体はウイルスと
特定の表面加速で破壊され得る表面との間の特別な相互作用を形成する。サンプ
ル中に存在する同様な大きさのまたはより大きい粒子による不特定の吸着は、今
示されたように、低い電圧においてピークを結果として生じ、そしてこれは表面
上の巨大分子による吸着がウイルスに結合するのに利用し得る抗体の数を減少す
るかもしれないけれども分析に影響を及ぼすものでない。多くの一般的なウイル
スは、表面との特別な相互作用の数および強度が異なるけれども、この例におい
て使用されたファージより大きい有効質量を有している。これは、必要とされる
電圧が同様な大きさまたはより小さいものであることを意味している。
つ低コストであるような潜在能力を有していることを示している。これは、臨床
環境における患者または農業における植物および動物を包含している多くの状況
においてウイルスの感染の迅速な診断を導くことができる。
クロバランスチップが35°の角度でATカットの、研磨された水晶結晶板(H
yQ,ケンブリッジ、英国)から作られ、そして30nmの厚さのクロムの付着
層、次いで較正された電気的コンダクタンスによって決定されるような200n
mの金層でエドワーズ蒸気堆積器中において覆われた。これらのチップは、次い
で、18時間分光等級のエタノール中でメルカプトドデカン酸の1mM溶液中に
浸漬され、エタノールでかつ次いで水で完全に濯がれ、かつ次いで窒素の蒸気に
より吹き付け乾燥された。これらのチップは、次いで、20分間NHS(100
mM)およびEDC(400mM)の混合物中に浸漬された。それらは水で完全
に濯がれ、次いでpH7.0で10mMPBSにおいてHSVIグリコプロテイ
ンDに対して上昇されたマウスの単クーロン性のIgG抗体の50μg/ml溶
液に1時間浸漬された。それらは次いで水で濯がれ、かつpH8.5でエタノー
ルアミンの1M溶液に10分間浸漬された。それらは次いで水で完全に濯がれ、
そしてPBSの1ml中に4°Cで貯蔵された。
子/mlの数がラテックス球体の内部標準により電子顕微鏡を使用して測定され
た。5×1010ウイルス粒子/mlの濃度においてHSVgD+ストック溶液の
シリアルの10倍希釈がBSA(0.1mg/ml)を含有しているPBS(1
0mMNa2HPO4/NaH2PO4,2.7mMKCl,120mMNaCl,
pH7.4)において行われ、かつ4°Cで貯蔵された。QCMチップは次いで
器具内に半田付けなしの接触により取り付けられ、そしてこれらの希釈の各々の
1μlまたは40μlがアンチ−gDlgG抗体で覆われたチップ表面上に配置
された。40分後、表面は水で全体的に洗浄され、次いで40μlのPBSで被
覆され、そしてQCMが0〜10Vで走査した。
ンプルに関する信号(7.5V近傍での雑音ピーク)対gD+ヘルペスシンプレ
ックスウイルス粒子の数のプロットである。図6BはgD+およびgD-ウイルス
に関する雑音対振幅のプロットである。表面上で抗体と特別な相互作用を持たな
いgD-ウイルスはピークを示しておらず;これに対してgD+ウイルスは7.5
V近傍で鋭いピークを示している。
られた。E.coliおよびS.aureus(実験室菌株)がブレインハート
/0.5%イースト抽出培養液中で培養されかつ37°Cで一晩培養された。各
培養の1mlサンプルが光学的密度によって測定されるような1010cfu/m
lの濃度に調整され、そして2分間12,000gで遠心分離され;ペレットが
無菌のPBSに再び懸濁された。10μlのバクテリア懸濁液が、アンチHSV
抗体に関して例4において記載された方法と同様な方法において、アンチE.c
oliIgG抗体で被覆されたれQCMチップ上に配置された。40分後、表面
は水で全体的に洗浄され、40μlのPBSで被覆され、そしてQCMが0〜1
0Vで走査した。
Vで鋭い信号を示し、そしてS.aureusに関しては何もない。
に、単一の器具中に増幅器1および受信機およびコントローラ5を結合している
、単一の器具(HP8512a、ヒューレット・パッカード)が使用された。器
具は連続波およびパワースイープモードに設定されている。SAW装置はRFモ
ノリティックス社から市場で入手可能なRF1171であった。直径1μmの、
約100,00個のラテックス球体がSAWの表面上に堆積された。結果として
生じているスペクトルは図10に示されている。多数のピークがクリーンな表面
上に存在しないことが観察される。これは、SAW装置が破壊の状態を検出する
のに使用され得ることを示している。種々のピークは、多分、種々の大きさの表
面上の球体のクラスタに対応し、かつそれゆえピークは種々の位置において観察
される。
Claims (20)
- 【請求項1】 結合相手間の親和力、または親和力に依存する前記結合相手
の一方の特性を測定するための方法において、 (i)一方が表面上で不動にされる前記結合相手を接触させる工程と、 (ii)増大する振幅で前記表面を振動させる工程と、 (iii)分離状態を検出する工程と、を備えてなることを特徴とする方法。 - 【請求項2】 組成物から目標分析物を分離するための方法において、 (i)前記組成物を表面上で不動にされる分析物用の結合相手と接触させる工
程と、 (ii)前記表面上から、前記分析物、または前記組成物の他の構成成分を選
択的に除去するように、増大する振幅で前記表面を振動させる工程と、を備えて
なることを特徴とする方法。 - 【請求項3】 前記結合相手間の結合強度を測定するための、請求項1に記
載の方法。 - 【請求項4】 前記他方の結合相手の存在を測定するための、請求項1に記
載の方法。 - 【請求項5】 前記他方の結合相手が粒子であるか、またはこの粒子上で不
動にされることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 【請求項6】 前記粒子の大きさまたは存在を測定するための、請求項5に
記載の方法。 - 【請求項7】 リガンドまたは前記または各結合相手がたんぱく質、抗体、
抗原、酵素、酵素抑制剤またはポリヌクレオチドであることを特徴とする先行す
る請求項のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項8】 前記リガンドまたは結合相手が細胞、バクテリア、ウイルス
、プリオンまたはファージであることを特徴とする請求項1ないし6に記載の方
法。 - 【請求項9】 異なる結合相手が前記表面上の異なる位置において不動にさ
れることを特徴とする先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項10】 前記分離状態が音響放出によって検出されることを特徴と
する先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項11】 前記表面が圧電変換器または音響変換器の一部分であるこ
とを特徴とする先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項12】 前記変換器が水晶結晶板マイクロバランスまたは表面音響
波装置であることを特徴とする請求項10に記載の方法。 - 【請求項13】 液体中で実施されることを特徴とする先行する請求項のい
ずれか1項に記載の方法。 - 【請求項14】 結合相手間の親和力を測定するための装置において、 その上で不動にされた一方の結合相手を有している表面と、 前記表面を増大している振幅で振動させるための手段と、 分離状態を検出するための手段と、を備えてなることを特徴とする装置。
- 【請求項15】 前記不動にされた結合相手がたんぱく質、抗体、抗原、酵
素、酵素抑制剤またはポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項14に記
載の装置。 - 【請求項16】 前記不動にされた結合相手が細胞、バクテリア、ウイルス
、プリオンまたはファージであることを特徴とする請求項14に記載の装置。 - 【請求項17】 種々の結合相手が前記表面上の種々の位置で不動にされる
ことを特徴とする請求項14ないし16のいずれか1項に記載の装置。 - 【請求項18】 前記検出手段が音響放出を検出することを特徴とする請求
項14ないし17のいずれか1項に記載の装置。 - 【請求項19】 前記振動手段および前記検出手段が圧電または音響変換器
を備えていることを特徴とする請求項18に記載の装置。 - 【請求項20】 前記変換器が水晶結晶板マイクロバランスまたは表面音響
波装置であることを特徴とする請求項19に記載の装置。
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