KR20020022648A - 분자 상호작용의 측정 및 이용방법 - Google Patents

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빅토르페트로비치 오스타닌
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아쿠바이오 리미티드
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Abstract

본 발명은 (ⅰ) 결합 파트너들을 접촉시키는 단계, 이들중 하나는 표면 위에 고정되어 있음; (ⅱ)증가된 진폭에서 표면을 진동시키는 단계; 및 (ⅲ)해리 발생을 검출하는 단계로 이루어진 결합 파트너들 사이의 친화력, 또는 결합 파트너들 중 하나의 친화력에 따르는 특성을 결정하는 방법에 관한 것이다. 결합 파트너들간의 친화력을 결정하는 장치는, 그 위에 고정된 하나의 결합 파트너를 갖는 표면(10), 증가된 진폭에서 표면을 진동시키는 수단; 및 해리 발생을 검출하기 위한 수단(14, 15)으로 이루어진다.

Description

분자 상호작용의 측정 및 이용방법{MEASUREMENT AND USE OF MOLECULAR INTERACTIONS}
명확한 분자 인식은 효소-리간드 상호작용, 항체-항원 상호작용 및 분자의 수용체와의 결합의 기초를 이루는 기초적인 과정이다. 분자 인식은 정전기적 상호작용(수소 결합)및 소수성 상호작용과 같은 비-공유 상호작용을 통해 이루어진다. 결합상수 및 자유에너지, 엔탈피와 엔트로피의 변화에 관한 열역학적 측정은, 특히 X-선 회절 및 가능하면, 위치에 따른 돌연변이 유발에 의한 정보와 결합될 때, 인식에 대한 분자적 기초에 통찰력을 제공한다.
상호작용력의 직접적인 측정은 표면력 장치 뿐만 아니라 원자력 현미경검사 (AFM)로 실시된다. AFM은 분자 파괴력을 측정할 수 있지만, 이 방법은 한번에 오직 하나만을 측정할 수 있는 단점이 있다. 현재, AFM은 애비딘-비오틴 상호작용 (Florinet al, Science, 1995; 264:415), DNA 잡종형성(Bolandet al, PNAS, 1995; 92:5291), 항체-항원 상호작용(Dammeret al, Biophys. J., 1996; 70:2437)) 및 점착 글리코프로테인(Dammer et al, Science, 1995; 267:1173)에 이용되고 있다.
생물학적 분자들을 리간드에 대한 그들의 상대 친화력을 기준으로 분리하는 것은 잘 알려져 있는 기술이다. 예를 들면, 친화성 크로마토그래피에서, 분리되어질 성분들은 특정한 리간드를 함유하는 칼럼을 통해 아래로 내려간다. 관심있는 성분은 칼럼에 우선적으로 및 강하게 흡착되며, 기타 성분들이 제거되는 동안 칼럼에 남는다. 흡착된 물질들은 나중 단계에서 칼럼으로부터 용리된다.
분리기술은 여러 연구 실험에서 중요한 부분이다. 이들 기술의 감도 또는 선택도의 증가가 바람직하다.
Kolomenskiiet al, J.Appl. Phys., 1998; 84(4):2404-10 은 레이저에 의해 생성된 표면 음향 펄스를 사용하여 실시한 표면 세정 및 점착 연구를 기재하고 있다. 펄스들은 낮은 반복률(20 Hz) 및 일정한 에너지를 가졌다. 방법은 진공하에서 실시되었고, 그러므로 상업적인 이용에는 적당하지 않다. 입자의 제거를 검출하기 위해 광학 현미경이 사용되어 왔으나, 다른 크기의 입자들을 구별할 수 없었다.
WO-A-98/45692는 포접 수화물(clathrate hydrates)의 형성/해리를 결정하기 위한 압전(piezoelectric) 크리스탈 센서의 사용을 기재하고 있다. Kurosawaet al, Chem. Pharm. Bull, 1990; 38(5);1117-20 은 항체-베어링 라텍스의 응집을 검출하기 위해 이와 같은 센서를 사용하는 것을 보고하고 있다. WO-A-98/40739는 매질 중의 세포의 존재를 나타내는데 사용하기 위한, 그 위에 특정 실재물이 고정되어 있는 판을 포함하는 센서를 기재한다. 이들 센서들은 일정 전압에서 공명 진동의 변화를 측정하는데 사용된다.
현재는, 대부분의 바이러스들은 세포 중에서 시편을 배양함에 의해 검출되는데, 이 방법이 비록 시간을 요하는 방법이지만 민감하기 때문이다. 임상 샘플중의 바이러스성 DNA 또는 RNA는 PCR 및 관심있는 바이러스에 대해 맞춤된 특정 프라이머를 사용함으로써 직접 검출될 수 있다. PCR에는 증폭 단계가 포함되므로, 교차-오염이 가장 큰 문제이며 확실한 정성적 방법을 확립하기가 어렵다. 기타의 직접적인 방법으로는 전자현미경법, 면역 전자현미경법, 및 효소-연결 항체를 사용한 항원 검출을 근거로 하는 방법이 포함된다. 이들 방법은 종종 비교적 둔감하므로 비교적 많은 양의 바이러스 입자들을 필요로 한다.
본 발명은 분자 상호작용을 측정하는 방법 및, 입자들을 분리, 분류 및 분립하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 여러가지 결합 파트너들간의 친화력, 예를 들면 항체-항원 상호작용의 측정에 관한 것이다.
도 1은 본 발명에서 사용되는 압전 변환기를 포함하는 장치의 개략도이다.
도 2a는 스트렙토비딘-비오틴 및 화학 결합에 대한 파괴력 스펙트럼이며, 도2b는 물리적 결합의 스펙트럼이다.
도 3은 스트렙타비딘-비오틴 및 화학결합으로 표면에 부착된 5 ㎛ 라텍스 구에 대한 파괴력 스펙트럼이다.
도 4a는 말토스-결합 파아지(-)와 비변형 파아지(...)의 등가 혼합물에 대한파괴력 스펙트럼이며, 도 4b는 비특이 결합 파아지만의 공기중 데이타이다.
도 5a는 물에서의 말토스-결합 파아지에 대한 곡선이며, 도 5b는 공기중의 비-특이 결합 파아지에 대한 곡선이다.
도 6a는 1 ㎕ 샘플(o)과 40 ㎕ 샘플(?)에 대해, gD+ 단순포진 바이러스 입자들의 수와 시그널의 플롯이며, 도 6b는 gD+및 gD-바이러스에 대한 진폭 대 잡음의 플롯이다.
도 7은E. coli및S. aureus에 대한 잡음/진폭 플롯이다.
도 8은 입력(23) 및 출력(24)을 갖는 게인 증폭기(22)에 대한 개략도이다.
도 9는 본 발명에 사용하기 위한 바람직한 SAW-기재 센서의 개략도이다.
도 10은 라텍스구가 놓인 SAW의 표면 위의 스펙트럼이다.
본 발명은 표적 분자 또는 입자들에 연결된 표적 분자와 표면 사이의 결합이, 증가된 진폭에서 표면이 기계적으로 진동함에 의해 파괴되어, 표적 분자 또는 입자를 표면으로부터 분리시킬 수 있다는 사실을 근거로 한다. 필요한 가속력, 및 따라서 힘은, 분자 또는 입자의 질량, 표면과의 결합 특성 및 표적 분자 또는 입자의 모양 또는 크기를 포함하여, 다양한 인자들에 의존할 것이다. 그러므로, 본 발명은 여러가지 표적 물질의 분리 또는 분립, 또는 그들의 존재를 확인하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 제 1면에 따르면, 조성물로부터 표적 분석체를 분리하는 방법은
(ⅰ)조성물을 분석체의 결합 파트너와 접촉시키는 단계, 여기서 결합 파트너는 표면 위에 고정되어 있음 ; 및
(ⅱ)분석체, 또는 조성물의 기타 성분을 표면으로부터 선택적으로 제거하기 위해, 증가된 진폭에서 표면을 진동시키는 단계로 이루어진다.
그 밖에, 본 발명은 입자의 존재 또는 크기, 또는 결합 파트너간의 친화력을 결정하기 위한 방법으로 사용될 수 있다. 본 발명의 제 2면에 따르면, 본 방법은
(ⅰ)결합 파트너들을 접촉시키는 단계, 이들 중 하나는 표면 위에 고정되어 있음;
(ⅱ)증가된 진폭에서 표면을 진동시키는 단계; 및
(ⅲ)해리 발생을 검출하는 단계로 이루어진다.
제 2면에 따르면, 본 발명은 수소결합과 같은 비교적 약한 상호작용에서부터 공유결합까지 다양한 범위의 물리적 및 화학적 결합에 적용될 수 있다.
본 발명에서 사용하기에 적당한 장치는, 그 위에 고정된 하나의 결합 파트너를 갖는 표면; 증가된 진폭에서 표면을 진동시키는 수단; 및 해리의 발생을 검출하는 수단으로 구성된다.
특히, 장치는 예를 들면 수정 미량천칭(QCM) 또는 표면 음파장치 등의 음향변환 장치(ATD), 또는 예를 들면, 교류전압 또는 자기장의 적용에 의해 진동을 일으킬 수 있는 어느 압전 재료로 이루어질 수 있다. 이들은 AFM과 비교하여 저렴한 장치이며 복합적일 수 있다. 이와 같은 장치를 사용하는 다른 장점은 대부분의 결합이 동시에 부러져서, 특정 가속(ATD에 적용된 전압)에서 검출할 수 있는 소리 및 예리한 잡음 피크를 일으킨다는 것이다. 또 다른 장점은 ATD를, 해리 발생시의 음향 방출을 검출하기 위한 민감한 마이크폰으로서 사용할 수 있다는 것이다.
ATD를 사용한 대부분의 선행기술에서는, ATD를 일정 전압에서 구동시킬 때 공명 주파수 또는 상의 변화를 측정한다. 반대로, 본 발명은 구동 전압과 그에 따른 ATD 진동의 진폭의 증가를 포함한다.
본 발명은 분리, 분류 및 분립에 널리 적용되고 있다. 본 발명의 실시예들은 스트렙타비딘-라벨된 구들을, 비오틴화된 표면과 0.1 V 이상이며 6 V 이하의 구동 전압을 갖는 QCM을 사용하여, 정상 라텍스구들로부터 분리시킬 수 있음을 나타낸다. 정상 라텍스 구들은 표면으로부터 제거되고, 표면에 연결된 스트렙타비딘-라벨 구들 만이(더 강한 스트렙타비딘-비오틴 결합에 의해) 남는다. 이것은 새로운 바이오센서의 고안 뿐만 아니라, 예를 들면 입자-분립 및 분류, 세포-분류, 파아지의 패닝(panning)에 적용되는 특정 시간 길이 동안 적용되는 가변력을 근거로 하는 분리 과학의 새로운 형태를 연다. 이와 같은 분리방법은 저렴하며 쉽게 복합화 및 자동화될 수 있다. 예를 들면, 여러가지 표적들을 동일 미량천칭의 여러 위치에 놓을 수 있고, 동시에 다수의 표적에 대한 리간드의 라이브러리를 스크린할 수 있다. 고정된 크기의 바이러스성 입자들을 검출 및 분석하는 것은 또 다른 적용영역이다. 똑같이 중요하게, 본 발명은 분자 인식에 포함되는 힘을 탐사하기 위한, 새롭고 민감하고 가능성 있는 정량적 도구를 제공한다.
본 발명은 진동을 일으킬 수 있는 센서 장치를 사용한다. 센서는 여러가지 방법, 예를 들면 표면 음파장치, 공명 수정 장치, 음향판 모드 및 얇은 막 쏠림판 장치의 사용으로 진동을 만들 수 있다.
본 발명에서 사용하기에 적당한, 많은 여러가지 센서들은 시판되는 것들 중에서 이용할 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 센서들에 대한 설명은 음파 센서들, Ballantineet al., (1997) Academic Press에 기재되어 있다. 센서는 바람직하게 표면 음파장치, 또는 더욱 바람직하게 수정 미량천칭(QCM)일 수 있다.
QCM은 전형적으로 최상부와 낮은 표면에 금 전극을 갖는 결정성 수정 원판이다. 전극에 교류 전압이 적용될 때, 반대의 압전 효과 때문에, 전단 진동을 겪는다. 전압이 증가함에 따라 QCM 진동의 진폭이 증가한다.
또한, 수정은 민감한 마이크로폰으로, 파괴 발생에 의한 음향방출을 검출하는데 사용될 수 있다. 하나의 중요한 공명 주파수에 대응하는 주파수에서 진동을 고조시키는 것, 및 또 다른 모드 부근의 음향 방출을 검출하는 것은 기술적으로 용이하다. 예를 들면, QCM은 그의 공명 주파수에서 구동되며, 음향 방출은 그의 세번째 고조파에서 검출된다.
설명에서, "분석체"라는 용어는 표면-고정 결합 파트너와 접촉하고 있는 결합 파트너 또는 성분을 설명하기 위해 사용될 것이다. 접촉 후에, 분석체는 분자 상호작용에 의해 센서와 결합하고 가속을 겪으며 따라서 그 힘이 분석체에 영향을 미친다. 진동의 진폭이 증가함에 따라, 및 특정 임계력에서, 결합 파괴가 발생한다. 이미 결합된 분석체 입자는 표면 위에서 자유롭게 회전한다.
분석체는 분자 상호작용을 통해 센서에 유지될 수 있는 어느 현미경적 존재일 수 있다. 분석체는 단백질, 항체, 항원, 효소, 효소 억제제 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 분석체는 박테리아, 세포, 바이러스, 프리온 또는 파아제와 같은 큰 입자일 수 있다. 그밖에, 본 발명에 사용하기에 특히 적당한 입자들의 예로는 실리카, 금 또는 라텍스와 같은 어느 재료의 중심체, 또는 플라즈미드와 같은 큰 고분자 등이 포함된다. 표면-고정된 결합 파트너는 동일한 타입일 수 있고, 그에 따라 및 적당한 물리적 또는 화학적 결합에 따라 선택될 수 있다.
더 작은 분석체의 해리는 바람직하게 음향 방출에 의해 검출된다. 더 큰 입자들은 광학적 수단, 예를 들면 현미경에 의해 검출될 수 있다.
본 발명의 제 1 면에서, 분리는 표적 분자를 결합 파트너와의 상호작용을 통해 센서 표면에 고정시킴으로써 일어난다. 그 다음, 센서 표면 위의 분자를 파괴시키기 위해 표면을 진동시킬 수 있다. 진동은 진폭, 따라서 가속을 점진적으로 증가 시킴에 의해 일어나며, 표면으로부터 표적 분자를 제거하거나, 또는 표면으로부터 조성물의 기타 성분을 제거하고 표면에 결합된 표적 분자가 남도록 선택될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 센서 표면은 압전 음향파 장치, 예를 들면 QCM을 사용하여 진동된다. 동일 압전장치를 파괴 발생으로 생성된 음향 잡음을 검출하기 위한 마이크로폰으로서 사용할 수 있다.
분리 기술은 특정 결합 파트너와 강하게 상호작용하는 분자를 선택하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 이 기술은 세포 표면에서 발현되는 특별한 수용체 분자들을 갖는 세포들을 선택하거나 또는 특별한 리간드에 강한 친화력을 갖는 항체를 선택하는데 사용될 수 있다.
여러가지 리간드들을, 예를 들면 접촉인쇄에 의해 또는 마스크 또는 무기광합성을 사용함에 의해 여러 위치에 배치시킬 수 있다. 그 다음, 몇몇 강하게 결합된 파트너들의 혼합물을 몇몇 상이한 리간드들과 동시에 스크린할 수 있다. 특히,본 발명은 그 위에 고정된 수용체와 같은 상이한 재료를 갖는 칩을 가지고 사용될 수 있다. 더욱 일반적으로, 칩들은 인간과 동물 임상 시험에서 여러가지 감염, 병원체들, 프리온, 음식 알레르겐, 바이러스, 박테리아등에 관해, 및 식품 및 물의 위생검사에 관한 시험을 허용하는 재료들을 보여줄 수 있다. 추가로, 본 발명은 라이브러리 스크린, 파아지 전시 등에 사용될 수 있다.
본 발명의 제 2면은 입자들의 존재 또는 크기, 또는 분자들간의 친화력 수준을 결정하는 방법이다. 바람직하게, 한 분자는 센서의 표면에 고정되어 있고 나머지 하나는 입자, 예를 들면 중심체에 고정된다. 그 다음, 입자는 흥미있는 분자 상호작용을 통해 센서에 부착된다. 그 다음, 기능화된 입자들은 센서에 전압을 적용함으로써 진동된다. 진동의 진폭이 증가함에 따라, 힘은 결합이 파괴되는 임계치에 도달한다. 이 점에서, 민감한 증폭기를 사용함으로써 특징적인 잡음을 검출할 수 있고 입자의 운동은 예를 들면 광학 현미경으로 관찰할 수 있다. 시그널의 크기는 센서 표면에 결합되어 있는 입자들의 수에 의존한다. 전형적으로, QCM이 하기 실시예 1과 같이 물리흡착 중심체에 대해 사용된다면, 잡음은 중심체의 크기에 따라, 0.1 ~ 1 V에서 검출되며, 중심체가 미끄러지고 누출되는 것이 현미경으로 관찰될 때 개시된다. 생성된 잡음 대 진폭(또는 적용 전압)을 플롯할 수 있으며, 이것은 파괴력 스펙트럼으로 불리울 수 있다. 결합이 파괴되는 점은 플롯에서 잡음 피크로서 나타날 것이다. 그러므로, 결합 파괴가 발생하는 임계 전압을 결정할 수 있다. 알려진 결합밀도 및 강도를 갖는 입자를 사용한 적당한 보정실험에 의해 이 방법을 정량화할 수 있다. 그밖에, 음향방출 피크의 높이로 결합 입자의 수를 측정할 수있다.
본 발명은 어느 분자 상호작용을 연구하기 위해 사용될 수 있으나, 특히 효소/리간드 상호작용, 항체/항원 상호작용 및 수용체/리간드 상호작용 또는 큰 고분자와 그의 천연 결합 파트너 사이의 상호작용을 연구하는데 적당하다. 본 방법은 또한 폴리뉴클레오티드들 사이의 혼성 발생 연구에 적용될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 제 1면에서, 리간드는 예를 들면 단백질, 항체 또는 항원, 효소, 효소 억제제, 폴리뉴클레오티드 또는 큰 플라즈미드 또는 바이러스와 같은 거대 고분자일 수 있다. 본 발명의 제 2 면에서 재료는 표면 또는 입자에 결합될 수 있다.
이하의 실시예들은 본 발명을 설명한다.
실시예에서, 파괴력 분광학은 표면과 작은 입자간의 점착력을 측정하기 위해 이 사용된다. 이 실시는 진폭이 단음조로 증가하고 및 따라서 가속이 증가함에 따라, 그 위에 미립자를 갖는 표면이 진동함을 근거로 한다. 이것은 압전 음파장치, 이 경우 수정 미량천칭(QCM)을 사용하여 표면을 구동시킴에 의해 얻어진다. 진폭이 증가함에 따라 가속되며 따라서 입자에 힘이 가해진다. 입자가 표면에 부착되어 있는 모든 결합의 파괴는 음향 잡음을 일으키며, 동일 압전 장치를 파괴 발생에 의해 생성되는 이와 같은 잡음을 검출하기 위한 민감한 마이크로폰으로 사용할 수 있다. 실시예 1 내지 5에 사용된 장치의 개략도를 도 1에 나타내었다. 도 8은 바람직한 장치의 더욱 일반적인 개략도이다.
더욱 특별하게, 도 1은 압전 변환기(10), 순수 사인곡선 f 발생기(11), 3f + Δf 생성기(12), 3f + Δf 필터, 록-인 증폭기 및 아날로그-디지탈 전환기(14), 및화살표로 표시된 자료 입력 및 대조 출력을 갖는 컴퓨터(15)로 이루어진 회로를 나타낸다. 실시예 1 내지 5에서, f=14.2 MHz, Δf= 82kHz이다. 입자(16)는 기질의 표면 위에 놓여진다.
도 8은 압전 변환기(21)(QCM, SAW 장치 등) 및, 시그널(25)의 조절하에 원활히 증가하는 출력 진폭을 전달할 수 있는 입력(23) 및 출력(24)을 갖는 가변 게인 증폭기(22)를 나타낸다. 또한, 회로는 (예를 들면, SSB 라디오 수신기와 유사한) 대역수신기(26), 및 링크(28)를 통해 자료를 공급하는 디지탈-아날로그 전환기 또는 전환기들(27)을 포함할 수 있다. 그 밖에, 회로는 제어기, 기록 및 자료 시그널 처리장치(29)(예를 들면, 컴퓨터 또는 전문화된 DAP 프로세서)를 포함할 수 있다. 파선(30)으로 표시된 접촉은 더욱 최적화된 여과 및 결합 수단으로 대치될 수 있으며, 예를 들면 수동 L,C,R 네트워크일 수 있다.
도 8에 나타난 회로의 사용에 있어서, 변환기(21)를 갖는 증폭기(22)는, 임의의 여과/결합 수단(30)과 함께 단순한 진동 네트워크를 제공하며, 변환기는 효과적인 주파수에서 바람직하게 진동한다: QCM에서, 이것은 기본 계열 공명주파수이다. 이 진동 주파수(F)는, 예를 들면 14 MHz이다. 출력(24)에서 구동 전압의 진폭은 제어링크(25)에 의해 제어기(29)의 조절하에 원활히 증가한다. 여과/결합 수단(30)에서 음향 방출의 출현 시그날은 광학 여과기/결합기에 의해 정화된 후, 대역 수신기(26)의 입력으로 공급된다. 작업 수신기 주파수 밴드는 최대 시그널 대 잡음을 기준으로 선택될 수 있고, 예를 들면 세번째 고조파 (3*F + ΔF) 근처에 위치한 공명 모드, 예를 들면 42.082MHz 일 수 있다.
단일 또는 정방형 출력 시그널을 고동력 범위의 아날로그-디지탈 전환기 또는 전환기들(27)로 전환시킨다. 그 다음, 자료를 추가로 제어기(29)에서 디지탈화하여 유용한 시그널을 얻은 다음, 기록하고 및/또는 관찰자에게 보인다. 증폭기 (22)에는, 시그널 대 잡음 비율을 향상시키고, 또한 진동자가 정확한 주파수 및 변환기를 가로질러 전압에 대한 전류의 상이동 하에서 작동함을 확인할 수 있도록, 추가로 수동 출력 및/또는 입력 필터(들)를 장치할 수 있다.
도 9는 본 발명에 사용하기 위한 바람직한 SAW-기재 센서를 나타낸다. 이 센서는 변환기 전극(33)을 구동시키는, 진폭의 증가에 따라 출력(32)에서 RF 전압을 생성하는 수단(31)을 포함한다. 전극 배열(33)은 압전-기질(34)에서 고진폭 SAW의 생성을 위해 최적화된다. 전극 배열(37)은 음향 방출이 전기적 시그널로 최선으로 변환되도록 활용된다. 패턴은 하나 이상의 전극 쌍으로 이루어진 복합적일 수 있다. 장치는 추가로 링크(36)에 의해 생성기(31)를 조절하며, 하나 이상의 입력(38)에서 생성된 시그널을 수용하고, 데이타 시그널 처리를 실행, 예를 들면 관련 분석을 위한 제어 유니트(35)를 포함할 수 있다.
SAW-기재 센서의 사용에 있어서, 생성기(31)는 출력(32)에서 유효한 전환 주파수를 제공하기에 알맞는 RF전압을 생성하고, 이것은 압전-기질(34)(점선)에 위치한 생성 변환기 전극(33)으로 공급된다. RF 전압의 진폭은 조절 링크(36)에 의해 제어기(35)를 조절함에 의해 시간을 통해 증가한다. 수용 전극(37)들은 활성영역으로부터 출현된 음향 방출을 수용체/제어기(35) 및 입력(38)로 공급되는 전기 시그널로 변환시킨다. 아날로그에서 디지탈로 전환된 후 얻어진 데이타는, 유효 시그널을 얻기 위해 시그널 처리된다. 그 다음 결과를 기록하고 연산자에게 전달한다.
실시예로부터 얻은 특정 결과를 도 2 내지 7 및 10에 나타내었다. 도 2a, 2b, 3a, 3b, 4a, 4b,4c, 4d, 6b, 7 및 10은 신호잡음(S:임의 단위) 대 진폭(A:전압)의 플롯이다. 도 5a, 5b, 6a 및 6c는 신호잡음(S:임의 단위) 대 입자의 수(N)를 플롯화한 것이다.
BSA : 보바인 혈청 알부민
LB : 루리아 액체배지(Luria broth)
DIC : 디메틸아미노이소프로필 클로라이드
DMAP : 디메틸아미노피리딘
EDC : 1,3-디메틸아미노프로필-3-에틸카르보디이미드
NHS : N-히드록시숙신이미드
PBS : 포스페이트-버퍼 살린
실시예 1
직경이 5 ㎛인 라텍스구를 흥미있는 다수의 결합을 통해 QCM 센서 표면에 부착시켰다. 사용된 구의 범위는 QCM 표면적의 1% 였다. 구는 그 직경에서 오직 1%의 편차만을 갖는다.
QCM 센서는 광택있는 수정판, 35°의 음향 횡단-컷(acoustic traverse-cut), 및 직경 8.25 mm로 이루어진다. 크롬층(20 ~ 30 nm 두께)과 그 위에 금층(100 ~ 120 nm 두께)을 도포하였다.
세가지 다른 결합들을 공기중 실험으로 연구하였다: 물리적 결합(라텍스금),스트렙타비딘-비오틴 결합 및 공유 결합(아미드 연결). 물리적 결합은 라텍스구를 센서 표면에 직접 놓고 질소 중에 건조시킴으로써 이루어졌다. 스트렙타비딘-비오틴 결합은 비오틴화된 BSA를 표면에 놓고 질소 중에 건조시킴으로써 이루어졌다. 화학결합은 에탄올에 용해된 산-말단 티올(12-메르캅토도데카노산)을 사용하여 티올 단일층을 형성시킴으로써 이루어졌으며; 그 후 이것은 EDC-NHS를 사용하여 활성화되었고, 아민-말단구를 첨가하여 아미드 결합을 형성하였다.
두개의 광학창을 갖는 챔버에서 실험을 실시하였다: 하나는 샘플에 레이저 조명을 제공하기 위한 것이며, 나머지 하나는 광학 현미경으로 분산된 레이저광을 관찰하기 위한 것이다. QCM을 챔버에 놓았다. 시그널 생성기, 모델 DS345(스텐포드 리서치 시스템스)를 사용하여 QCM을 구동하였다. CCD 파나소닉 WL-SL300 비디오 카메라가 장착된 올림푸스 BH-2 광학 현미경을 사용하여 입자의 운동과 분리를 관찰하였다. 주 측정 장비는 록-인 증폭기, SR844(스탠포드 리서치 시스템스)였다. 기준 시그널을 첫번째 생성기에 일치시킨 두번째 생성기를 사용하여 록-인 증폭기에 공급하였다. 실험 제어 및 데이타 수집을 위해 모든 장비를 컴퓨터에 연결시켰다.
도 2a는 스트렙토비딘-비오틴(1) 및 화학 결합(2)에 대한 파괴력 스펙트럼들을 나타내며, 도2b는 물리적 결합에 대한 스펙트럼을 나타낸다.
파괴력 스펙트럼을 기록함에 의해, 결합을 끊는데 필요한 힘 또는 전압을 실험적으로 결정할 수 있다. 이것은 분리를 위해 사용될 수 있다. 도 2a에서 볼 수 있듯이, 5 ㎛ 구들의 혼합물이 있다면, 이들 중 몇몇은 표면에 스트렙타비딘을 가지고, 몇몇은 갖지 않으며, 0.1 V 이상 및 6 V 이하의 전압, 즉 1 V를 표면 위의비오틴을 갖는 QCM에 적용함에 의해, 표면에 스트렙타비딘-라벨구만이 제공되도록 두 세트의 구들을 분리시킬 수 있다. 또한, 이 기술은 스트렙타비딘-라벨 구를 검출하기 위해 사용될 수 있는데, 이것은 오직 이들 구만이 1 V로 진동시킬 때 표면에 결합되어 있기 때문이다. 정량적인 측정을 위해, QCM 진동의 진폭을 다양한 전압에서 실험 데이타를 기초로 하여 산출하여 중심체 위의 힘을 평가하였다. 이 평가는 QCM의 동력소비 및 그의 Q 인자(또는 상응인자 - 상대적 공명 밴드 넓이의 역수=f/Δfresonance)를 측정함으로써 실시하였다. 주파수 A는 다음과 같이 주어진다.
A=[QP/2Π3f3M]1/2
여기서, Q는 Q 또는 상응인자, P는 QCM에 의해 소모된 전기력, f는 수정의 공명 주파수 및 M은 운동에 포함되는 QCM 수정판의 유효중량이다. Q 인자는 6V 에서 c.15000이 된다고 결정되었고, 이것은 60 nm의 QCM의 진동(vibration) 진폭의 견적을 제공한다. 따라서, 구 위의 힘은 9 μN이다. 이것은 단일의 스트렙토비딘-비오틴 결합을 끊는데 필요한 힘 160 pN2과 비교되어야 하며, 이것은 거의 60,000개의 결합이 동시에 끊어짐을 의미한다. 견적은 이것이 구와 표면 사이의 초기 스트렙타비딘-비오틴 결합의 50 % 이상에 해당됨을 나타낸다. 이것은 표면의 구에 붙어있는 결합의 대부분이 동시에 끊어어진다는 것을 의미한다. 이것은 파괴력 스펙트럼에서 뚜렷한 피크 및 결합 파괴에 대한 검출가능한 잡음을 발생시킨다.
실시예 2
이 실시예는 본 발명의 방법을 용액에서도 실시할 수 있음을 보여준다. QCM의 Q 인자는 액체 하중으로 인해 감소할 것이며, 따라서 공기중과 비교했을 때, 특정 전압에서 진동의 진폭이 감소한다. 중심체에 점성력이 작용할 것이며, 물의 해리층으로 인해 그의 유효 질량이 증가되고, 구에 대한 힘이 증가될 것이다.
도 3은 스트렙타비딘-비오틴(도 3a) 및 화학결합(도 3b)에 의해 표면에 연결된 5 ㎛ 라텍스 구에 대한 파괴력 스펙트럼을 나타낸다. 파괴는 각각 1 V 및 10 V 에서 일어났다.
스트렙타비딘-비오틴 결합에 대한 임계 전압이 공기중으로부터 물로 이동함에 의해 인자 6에 의해 6 V 에서 1V로 감소한 것 및 화학 결합의 파괴는, 후자의 효과가 우세함을 나타낸다. 그러므로, 이 실험은 수용액 또는 다른 것 중에서, 결합-파괴, 및 따라서 분리와 바이오센싱이 가능함을 분명히 설명한다.
이들 실험에서 동일한 크기의 고분자들이 사용되었기 때문에, 물리적, 스트렙토비딘-비오틴 및 화학적 결합에 대한 결합 밀도가 같다고 가정함으로써, 파괴력의 상대적 크기를 얻을 수 있다. 물리적 결합:스트렙토비딘-비오틴:화학 결합에 대한 파괴력의 상대적 크기는 1:60:600 이다. 이 크기는 합리적으로 보이며 이 방법의 기능적 범위를 설명한다. 알려진 결합 밀도를 사용한 알맞는 보정실험을 실시함으로써, 이들 측정을 정량화할 수 있다.
실시예 3
본 실시예는 바이러스들, 및 특히 파아지 pIII 외피단백질에 융해된 말토스-결합 단백질을 나타내는 유전적으로 변형된 박테리오파아지의 검출을 설명하는데, 파아지와 말토스-결합 상호작용 모두 특색을 잘 이루며 쉽게 이용가능하기 때문이다. 파아지는 1 ㎛의 유연한 로드와 6 ㎛의 직경으로 이루어진, 길고 얇은 필라멘트성 바이러스이다. 유전적으로 변형된 파아지는 파아지 pIII 외피단백질에 용해됨에 따라 바이러스의 한 말단에서 최대 5 개의 말토스-결합 단백질을 추가로 나타낸다: McCaffertyet al, Nature, 1990, 348:552. 이들 파아지는 아밀로스 수지에서 특별히 정제될 수 있다.
인돌 글리세롤 포스페이트 신타아제의 아미노 말단의 말토스-결합 단백질 융합은 유전자 III-암호화 외피단백질의 아미노 말단의 융합과 같이 fd 파아지의 표면에 나타난다. 이 목적을 위해, fd 파아지 벡터, pJB113을 구성하였다: 이것은MalE(E. coli), trpC(E.coli)및 유전자III 사이의 유전성 융합을 암호화 시켰다. 이 파아지 벡터는 테트라사이클린-내성 마커를 가진다. 비변형 경쟁 파아지는 카나마이신-내성 마커를 갖는 VCS M13 K07 헬퍼파아지(스트라타진)이었다.
박테리오파아지 농도 1 x 1012cfu/mL 를Escherichia coli균주 TG1의 중간 대수증식기 LB 배양 3 ml를 파아지 스톡 10 ㎕으로 감염시켜 얻었다. 37 ℃에서 2시간 흔들어(250 rpm)준 후, 배양 1ml를 LB 100 ml에 접종시키고, 350 rpm으로 37 ℃에서 1시간 동안 흔들었다. 테트라사이클린(10 ㎍/ml) 또는 카나마이신(50 ㎍/ml)을 pJB113 또는 VCS 배양에 각각 첨가하고, 이것을 30 ℃, 250 rpm에서 철야로 배양시켰다. 박테리아를 펠렛화하고(15 분, 4.1 krpm), NaCl과 PEG6000을 최종농도가 각각 0.5 M 및 4%(v/v)가 되도록 첨가함으로써 상징액으로부터 파아지를 침전시켰다. 얼음중에 1시간 동안 방치시킨 후, 파아지를 원심분리(30분, 4.1 krpm)시켜 회수한 후, 파아지 펠렛을 H2O 1 ml에 재현탁시키고 4 ℃에서 저장하였다.
가용성 전분(500 mg, 0.01 mmol, 1 eq.)을 DMF(10 ml)에 용해시키고 5분간 교반시켰다(부분적으로 녹는다). DMF중의 11-메르캅토도데카노산(11.5 mg, 0.05 mmol, 5 eq)에 DIC(7.8 ㎕, 6.3 mg, 0.05 mmol, 5 eq.)와 DMAP(cat.)를 첨가하고 이 용액을 전분 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 철야로 교반시켰다. 그 다음 반응물을 10000 MW 막 절단을 갖는 교반된 세포를 사용하여 정화하고, milliQ 물(50 ml 6번)로 헹구고, 농축시키고, 철야로 동결건조 시켰다.
표면에 화학적으로 결합되도록, 티올기를 함유하는 변형된 전분을 사용하여 표면을 제조하였다. (실시예 1과 같이 제조된) QCM을 12 시간동안 메탄올(1 ㎍/ml)중의 전분 용액에 놓았다. 그 다음 샘플을 세정하고 질소증기하에서 건조시켰다. 바이러스들을 용액으로부터 표면에 퇴적시키고 공기중 실험을 위해 실온에서 건조시켰다. 희석시켜 여러가지 농도의 바이러스를 제조하였다. 말토스-결합 단백질을 불로킹하는 말토스로 실험하기 위해, 말토스 100 nM을 파아지 용액에 첨가하였다.
이와 같이, QCM의 표면을 황-금(sulphur-gold) 결합에 의해 금 표면에 화학적으로 부착되는, (말토스의 분지된 폴리머들을 함유하는)가용성 감자 전분층으로 코팅시켰다. 공기중 및 물중 모두에서 실험을 실시하였다.
도 4a는 말토스-결합 파아지(-)와 비변형 파아지(...)의 등가 혼합물에 대해 500초에 걸쳐 스캔하여 얻은 파괴력 스펙트럼을 나타낸다. 금 전극 표면에 각 타입의 파아지 약 50 억개가 있다. 비변형, 따라서 비특이적 결합 파아지의 경우, 파괴피크는 1.2V에서 검출되었다. 말토스-결합 파아지의 경우, 대응하는 파괴 피크는 9 V 부근이었고, 결합 분리로 더 큰 에너지가 방출되기 때문에, 비특이 결합 파아지보다 더 강도가 높았다. 공기중 실험에서 특이적으로 결합된 말토스-결합 파아지로부터는 10 V 까지 아무런 피크도 관찰되지 않았다; 도 4b는 비특이 결합 파아지만의 공기중 데이타를 나타낸다. 피크는 7.5 V에서 나타났고, 물중의 피크보다 약 6배 이상 증가하였다. 두번째 스캔(...)은 거의 피크가 없었고, 이것은 파아지가 표면으로부터 제거되었음을 나타낸다. 이것은 추가의 바이러스성 마찰력과 입자의 유효중량의 증가가 공기중보다 물중에서 파아지 입자와 표면 사이의 결합을 더 쉽게 분리시킨다는 것을 확인시킨다.
파괴력 스펙트럼에서 피크들의 예리함은 외관상 결합 파괴가 임계 전압에서 발생하는 관찰과 연결되며; 이것은 단기간 발생하는 잡음을 일으키며, 따라서 본 방법을 매우 민감하게 만든다. 추가로, 특이 결합 파아지로부터의 시그널은 더 높은 진폭에서 비-특이 결합 파아지로부터 잘 분리되며, 이것은 비특이 흡수가 특이 흡수의 측정에 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다. 비변형 파아지와 표면 사이의 비-특이 상호작용 파괴시키는데 요구되는 것과 비교하여, 파아지 위에 노출된 말토스-결합 단백질들과 전분-코팅된 표면 사이의 특이 상호작용을 파괴시키는데 더 많은 힘이 요구된다.
도 4c는 그 결합 부위가 말토스로 블럭되고, 파아지가 QCM의 중심에(최상부 플롯) 또는 표면 전체에 걸쳐 놓였을 때, 말토스-결합 파아지를 사용하여 공기중 실시한 대조 실험의 결과를 나타내며; 이것은 비변형 파아지와 유사한 행동특성을보이고, 그 차이가 이들 특정 상호작용 때문이라는 것을 확인시켜준다. 도 4d는 표면에 오직 1000 파아지만을 갖는 물에서의 파괴력 스펙트럼을 나타내며, 여전히 파괴를 검출할 수 있음을 나타낸다. 하중 변화의 결과로서, Q 또는 QCM의 정량인자의 더 작은 변화 때문에 피크 위치가 조금 이동한다.
데이타는 또한 비-특이 결합 파아지를 파괴시키기 위한 전압 이상, 그러나 말토스-결합 파아지를 파괴시키기 위한 전압 이하의 전압에서 QCM을 구동함에 의해 말토스-결합 파아지로부터 비-특이 결합 파아지를 분리하는 것이 가능함을 제안한다. 이것은 결합을 위한 파아지 라이브러리를 스크린하는 선택적 방법을 제안하는데, 여기서 표면에 남은 파아지의 결합 친화력은 적용 전압의 크기와 전압이 적용되는 시간을 조절함에 의해 조절되며, 그렇지 않으면 파아지가 생존해 남는다.
방법의 감도를 결정하기 위해, 물에서 말토스-결합 파아지를 사용한 희석 실험을 실시하였다. 도 5a는 시그널 파워(가장 강한 잡음 피크는 9 V 근처)가 적어도 크기의 5승 이상으로 파아지의 수에 대해 선형이며, QCM 위의 약 200 파아지의 존재는 99%의 확률로 검출될 수 있음을 나타낸다. 도 5b는 공기중의 비-특이 결합 파아지에 대한 곡선을 나타내며, 99 %의 확률로 100 파아지의 검출감도를 나타낸다. 낮은 희석도에서는 표면위의 말토스-결합 파아지의 수를 AFM을 사용한 직접 영상을 통해 확인하였다.
이 실시예는 QCM 표면 위의 파아지의 수를 검출할 수 있음을 나타낸다. 반대로, PCR을 사용하여 바이러스성 DNA의 복사물의 수를 용액 중에서 검출한다. 용액 샘플 중의 모든 바이러스 입자들이 표면에 결합된다고 가정하면, 이것은 강한 바이러스-표면 상호작용이 존재하거나 또는 용액이 바이러스를 표면에 남기고 증발되는 것을 허용할 때 발생할 수 있으며, 그 다음 감도를 직접 비교할 수 있다. PCR의 감도는 이 실시예에 의해, ml 당 바이러스성 DNA의 약 100배이며 파아지의 검출 감도와 비교할 수 있다. 전자 작용이 향상될 수 있고, 감도는 적어도 크기의 지수적으로 추가로 향상될 수 있다. 예를 들면, 이들 실험에서 파아지는 QCM 표면에 걸쳐 고르게 놓인다. 그러나, QCM의 진폭과 감도 모두는 주 시그널이 QCM의 중심에서 발생됨을 의미하는 공간 의존성을 갖는다(도 4c). 이것은 파아지가 오직 QCM의 중심에만 침전되어 있다면 약간의 및 따라서 더 강한 피크가 기록될 수 있고, 따라서 감도가 향상될 수 있음을 의미한다.
이 방법은 QCM의 표면에 결합된 바이러스에 대한 특정 항체를 사용함으로써 인간 바이러스를 검출하는데 간단히 확장될 수 있다. 이들 항체들은 QCM의 표면에 결합된 바이러스와 특정 상호작용을 형성한다. 이들 항체들은 특정한 표면 가속에서 부서질 수 있는, 바이러스와 표면간의 특정 상호작용을 형성한다. 샘플에 존재하는 비슷한 크기 또는 큰 입자들에 의한 비-특이 흡착은 낮은 전압에서의 피크를 나타내며, 비록 표면 위에 고분자에 의한 흡착이 바이러스와의 결합에 이용할 수 있는 항체의 수를 감소시키더라도 분석에는 영향을 미치지 않는다. 가장 일반적인 바이러스는 비록 표면과의 특이 상호작용의 수와 강도는 다르더라도, 본 실시예에서 사용한 파아지보다 더 큰 유효중량을 갖는다. 이것은 요구 전압이 유사한 크기거나 또는 더 작다는 것을 의미한다.
이 실시예는 파괴력 스펙트럼이 증폭 단계를 필요로 하지 않으며, 정량적이고, 즉각적인 전위와 저비용을 갖는다는 것을 나타낸다. 이것은 임상 환자들 또는 농업식물 또는 동물을 포함한 여러가지 환경에서 바이러스 감염에 대한 빠른 진단을 제공한다.
실시예 4
본 실시예는 바이러스 결합 분석을 설명한다. 이 분석을 위해, 광택있는 수정판으로 수정 미량천칭 칩, 35°각의 AT 컷(HyQ, 캠브리지, 영국)을 제조하고 및 에드워드 증기 퇴적기에서 30 nm 두께의 크롬 점착층으로 코팅시킨 다음, 보정된 전극 콘덕턴스에 의해 정해진 바과 같이 200 nm의 금층으로 코팅시켰다. 그 후, 이들 칩을 18 시간 동안 스펙트럼 등급의 에탄올 중의 메트캅토도데카노산 용액 1mM 중에 침지시키고, 에탄올로 철저히 세척한 후 물로 세척하고, 그 다음 질소 증기하에서 송풍건조 시켰다. 그 다음, 이들 칩을 NHS(100 ml)와 EDC(400 mM)의 혼합물에 20분 동안 침지시켰다. 이들을 물로 완전히 세척하고, 그 다음 1시간 동안 pH 7.0에서 10 mM PBS 중의 HSV I 글리코프로테인 D에 대해 발생된 마우스 모노클로날 lgG 항체 용액 50 ㎍/ml에 침지시켰다. 그 다음 이들을 물로 헹구고 10분 동안 pH 8.5에서 1M 에탄올아민 용액에 침지시켰다. 그 다음 이들을 물로 완전히 헹구고 4 ℃에서 PBS 1ml 중에 저장하였다.
피콜(Ficoll)-정화 바이러스 원액 ml중의 바이러스 입자의 수를 라텍스 구의 내부 표준을 갖는 전자 현미경을 사용하여 결정하였다. 농도 5 x 1010바이러스 입자/ml의 HSV gD+원액의 10배 희석액을 BSA(0.1 mg/ml)를 함유하는 PBS(10 mMNa2HPO4/NaH2PO4, 2.7 mM KCl, 120 mM NaCl, pH 7.4)중에서 제조하고 4 ℃에서 저장였다. 그 다음 QCM 칩을 장비에 땜납없이 접촉시켜 장착하고, 각각의 이들 희석물 1 ㎕ 또는 40 ㎕를 항-gD lgG 항체로 코팅된 칩 표면 위에 놓았다. 40분 후, 표면을 물로 완전히 닦고 PBS 40 ㎕로 덮은 다음, 0 에서 10 V까지 QCM을 스캔하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6a는 샘플 1 ㎕(o)와 40 ㎕(?)의 gD+ 단순포진 바이러스 입자들의 수에 대한 시그널(7.5 V 근처에 잡음 피크)의 플롯이다: 라인순도는 양호하다. 도 6b는 gD+및 gD-바이러스에 대한 진폭 대 잡음의 플롯이다. 표면에서 항체와 특이한 상호작용을 갖지 않는 gD-바이러스는 피크를 보이지 않는다; 반대로 gD+바이러스는 7.5 V 부근에서 날카로운 피크를 나타낸다.
실시예 5
본 실시예의 박테리아 결합 분석을 위해, 실시예 4와 같이 QCM칩을 제조하였다.E. Coli및S. aureus(실험실 균주)를 브레인하트/0.5 % 이스트 추출액에서 배양하고 37 ℃에서 철야 보온시켰다. 각 배양액의 샘플 1 ml를 광학 밀도에 의한 결정에 따라 1010cfu/ml 농도로 맞추고, 2 분 동안 12,000 g에서 원심분리시키고; 펠렛을 무균 PBS에서 재현탁시켰다. 박테리아 현택액 10 ㎕를, 항-HSV 항체에 대해 실시예 4에 기재된 방법과 동일한 방법으로, 항 E.coli lgG 항체로 코팅된 QCM칩 위에 놓았다. 40분 후, 표면을 물로 완전히 수세하고 PBS 40 ㎕로 덮고, 그 다음 0 V 에서 10 V 까지 QCM을 스캔하였다.
그 결과를 도 7에 나타내었다. 잡음/진폭 플롯은E. coli에 대해 약 6 V에서 예리한 시그날을 나타냈고,S. aureus에 대해서는 시그날이 없었다.
실시예 6
본 실시예에서는 도 9에 나타낸 SAW 장치를 사용하였다. 이 경우, 증폭기(1)와 수용체 및 제어기(5)가 단일 장비에 결합된 단일 장비(HP8512a, 휴렛 팩커드)를 사용하였다. 이 장비를 연속파 및 동력 스위프 모드에 맞추었다. SAW 장치는 시판중인 RF Monolitics, Inc.의 RF1171 였다. SAW의 표면 위에 직경이 1 ㎛인 라텍스구 약 100,000 개를 놓았다. 결과의 스펙트럼을 도 10에 나타내었다. 다수의 피크들이 관찰되었는데, 이들은 깨끗한 표면에는 존재하지 않았다. 이것은 SAWS 장비가 파괴 발생을 검출하는데 사용될 수 있음을 나타낸다. 아마도 다양한 피크들은 표면 위의 다양한 크기의 클러스터 구에 해당할 것이며 따라서 피크들은 여러 위치에서 관찰된다.

Claims (20)

  1. (ⅰ)결합 파트너들을 접촉시키는 단계, 이들 중 하나는 표면 위에 고정되어 있음;
    (ⅱ)증가된 진폭에서 표면을 진동시키는 단계; 및
    (ⅲ)해리 발생을 검출하는 단계로 이루어지는, 결합 파트너들간의 친화력, 또는 친화력에 따른 결합 파트너들 중 하나의 특성을 결정하는 방법.
  2. (ⅰ)조성물을 분석체의 결합 파트너와 접촉시키는 단계, 결합 파트너는 표면 위에 고정되어 있음; 및
    (ⅱ)분석체, 또는 조성물의 기타 성분들을 표면으로부터 선택적으로 제거하기 위해 증가된 진폭에서 표면을 진동시키는 단계로 이루어지는, 조성물로부터 표적 분석체를 분리하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 결합 파트너들간의 결합 세기를 결정하기 위한 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 다른 결합 파트너의 존재를 결정하기 위한 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 다른 결합 파트너가 입자이거나 또는 입자 위에 고정되어 있는 것인 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 입자의 크기 또는 존재를 결정하기 위한 방법.
  7. 상기 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 리간드 또는 결합 파트너 또는 각 결합 파트너가 단백질, 항체, 항원, 효소, 효소 억제제 또는 폴리뉴클레오티드인 것인 방법.
  8. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 리간드 또는 결합 파트너가 세포, 박테리아, 바이러스, 프리온 또는 파아지인 것인 방법.
  9. 상기 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 다양한 결합 파트너들이 표면의 여러 위치에 고정되는 것인 방법.
  10. 상기 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 해리 발생이 음향 방출에 의해 검출되는 것인 방법.
  11. 상기 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표면이 압전 변환기 또는 음향 변환기의 일부인 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 변환기가 수정 미량천칭 또는 표면 음파장치인 방법.
  13. 상기 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 액체 중에서 실시되는 방법.
  14. 그 위에 고정된 하나의 결합 파트너를 갖는 표면, 증가된 진폭에서 표면을 진동시키는 수단, 및 해리 발생을 검출하는 수단으로 이루어진, 결합 파트너간의 친화력을 결정하기 위한 장치.
  15. 제 14항에 있어서, 고정된 결합 파트너가 단백질, 항체, 항원, 효소, 효소 억제제 또는 폴리뉴클레오티드인 장치.
  16. 제 14항에 있어서, 고정된 결합 파트너가 세포, 박테리아, 바이러스, 프리온 또는 파아지인 장치.
  17. 제 14항 내지 제 16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 다양한 결합 파트너들이 표면의 여러 위치에 고정되는 것인 장치.
  18. 제 14항 내지 제 17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 검출 수단이 음향 방출을 검출하는 것인 장치.
  19. 제 18항에 있어서, 진동 수단 및 검출 수단이 압전 또는 음향 변환기로 이루어지는 것인 장치.
  20. 제 19항에 있어서, 변환기가 수정 미량천칭 또는 표면 음파장치인 것인 장치.
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