-
GEBIET DER
ERFINDUNG
-
Diese
Erfindung betrifft Verfahren zur Messung von zwischenmolekularen
Wechselwirkungen und zur Trennung, Sortierung und Klassierung von Teilchen.
Insbesondere betrifft diese Erfindung die Messung der Affinität zwischen
verschiedenen Bindungspartnern, z.B. bei einer Wechselwirkung zwischen
Antigen und Antikörper.
-
ALLGEMEINER
STAND DER TECHNIK
-
Als
Grundlage für
Enzym-Ligand-Wechselwirkungen, Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen und für die Bindung
von Molekülen
an Rezeptoren ist die spezifische Molekülerkennung ein grundlegender Vorgang.
Molekülerkennung
wird erreicht durch nichtkovalente Wechselwirkungen wie elektrostatische
Wechselwirkung (Wasserstoffbrückenbindung) und
hydrophobe Wechselwirkungen. Thermodynamische Messungen der Bindungskonstanten
und der freien Energie, Enthalpie- und Entropieänderungen geben Einblicke in
die molekulare Grundlagen der Erkennung, insbesondere wenn sie gekoppelt
sind mit Ergebnissen aus der Röntgenbeugung
und der ortsgerichteten Mutagenese, wenn möglich.
-
Die
direkte Messung der Wechselwirkungskraft wurde mithilfe der Rasterkraftmikroskopie (AFM)
sowie der Oberflächenkraftmessapparatur [SFA]
durchgeführt.
Obwohl die AFM die Kräfte
des Bindungsbruchs messen kann, weist das Verfahren den Nachteil
auf, dass nicht mehrere Messungen gleichzeitig erfolgen können. Bisher
ist AFM bei Avidin-Biotin-Wechselwirkungen (Florin et al, Science, 1995;
264:415), bei der DNA-Hybridisierung (Boland et al, PNAS, 1995;
92:5291), Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen
(Dammer et al, Biophys. J., 1996; 70:2437) und Haftglykoproteinen
(Dammer et al, Science, 1995 ; 267:1173) angewandt worden.
-
Die
Trennung von biologischen Molekülen auf
der Grundlage ihrer relativen Affinität zu Liganden ist ein anerkanntes
Verfahren. So werden zum Beispiel in der Affinitätschromatographie die zu trennenden
Bestandteile durch eine Säule
gegeben, die einen bestimmten Liganden enthält. Der interessierende Bestandteil
bindet bevorzugt und stark an die Säule und wird in der Säule zurückbehalten,
während
die anderen Bestandteile entfernt werden. Der gebundene Stoff kann
zu einem späteren
Zeitpunkt aus der Säule
herausgelöst
werden.
-
Trennverfahren
sind ein wichtiger Bestandteil vieler Forschungsversuche. Die Erhöhung der Empfindlichkeit
oder Selektivität
dieser Verfahren ist daher wünschenswert.
-
Kolomenskii
et al, J. Appl. Phys., 1998; 84(4):2404–10, beschreibt Untersuchungen
zur Oberflächenreinigung
und Haftung, die mithilfe von lasererzeugten Oberflächenschallimpulsen
durchgeführt
wurden. Die Impulse wiesen eine niedrige Wiederholfrequenz (20 Hz)
und gleich bleibende Energie auf. Das Verfahren wurde im Vakuum
durchgeführt und
ist daher nicht zur wirtschaftlichen Nutzung geeignet. Zur Erfassung
der Entfernung der Teilchen wurde ein Lichtmikroskop verwendet und
es war nicht möglich,
zwischen Teilchen verschiedener Größe zu unterscheiden.
-
WO-A-98/45692
offenbart die Verwendung eines Piezokristallsensors zur Bestimmung
der Bildung / Dissoziation von Clathrathydraten. Kurosawa et al,
Chem. Pharm. Bull, 1990; 38(5):1117–20, beschreibt die Verwendung
eines solchen Sensors zur Erfassung der Agglutination bei auf Latex
befindlichen Antikörpern.
WO-A-98/40739 offenbart ebenfalls einen solchen Sensor, der eine
Scheibe enthält, auf
der bestimmte Bindungseinheiten immobilisiert sind, und der eingesetzt
wird, um das Vorhandensein von Zellen in einem Träger anzuzeigen.
Diese Sensoren messen eine Änderung
der Resonanzfrequenz bei gleich bleibender Spannung.
-
Zurzeit
werden, wo möglich,
die meisten Viren nachgewiesen, indem die Probe in Zellen gezüchtet wird,
da dieses Verfahren empfindlich, jedoch zeitaufwendig ist. Der direkte
Nachweis von viraler DNA oder RNA in klinischen Proben kann mithilfe
der Polymerase-Kettenreaktion und bestimmten Primern erfolgen, die
auf das interessierende Virus zugeschnitten sind. Da die Polymerase-Kettenreaktion
einen Verstärkungsschritt
beinhaltet, ist Kreuzkontamination ein Hauptproblem und es ist schwierig,
zuverlässige
quantitative Verfahren zu schaffen. Weitere direkte Verfahren sind
die Elektronenmikroskopie, die Immunelektronenmikroskopie sowie
Verfahren, die auf dem Antigennachweis mit enzymgekoppelten Antikörpern beruhen.
Diese Verfahren sind häufig recht
unempfindlich und erfordern daher verhältnismäßig große Mengen der Viruspartikel.
-
KURZDARSTELLUNG
DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass die Bindungen
zwischen einem Zielmolekül
oder ein mit einem Teilchen verbundenes Zielmolekül und einer
Oberfläche aufgebrochen
werden können,
indem die Oberfläche
bei steigender Amplitude mechanisch in Schwingungen versetzt wird,
was zur Ablösung
des Zielmoleküls
oder Teilchens von der Oberfläche
führt.
Die erforderliche Beschleunigung und damit Kraft hängt von
einer Vielzahl von Größen ab,
einschließlich
der Masse des Moleküls
oder Teilchens, der Art der Bindung an die Oberfläche und
der geometrischen Form oder Größe des Zielmoleküls oder
Teilchens. Die vorliegende Erfindung kann daher zur Trennung oder
Klassierung verschiedener Zielmoleküle eingesetzt werden oder zum
Nachweis ihres Vorhandenseins.
-
Gemäß einem
ersten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren
zur Abtrennung eines Zielanalyten aus einer Zusammensetzung die
folgenden Schritte:
- (i) die Zusammensetzung
mit einem Bindungspartner für
den Analyt in Berührung
bringen, wobei der Bindungspartner auf einer Oberfläche immobilisiert
ist; und
- (ii) die Oberfläche
in Schwingungen versetzen, sodass die Amplitude auf einen Wert ansteigt,
bei dem der Analyt oder andere Bestandteile der Zusammensetzung
von der Oberfläche
entfernt werden.
-
Die
vorliegende Erfindung kann zur Bestimmung des Vorhandenseins oder
der Größe von Teilchen,
oder zur Bestimmung der Affinität
zwischen Bindungspartnern eingesetzt werden.
-
Die
Erfindung kann bei einer Vielzahl physikalischer und chemischer
Bindungen angewendet werden, von recht schwachen Wechselwirkungen wie
Wasserstoffbrückenbindungen
bis zu kovalenten Bindungen.
-
Eine
Vorrichtung, die für
die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist, umfasst
eine Oberfläche,
auf der ein Bindungspartner immobilisiert ist; Mittel, um die Oberfläche mit
steigender Amplitude in Schwingungen zu versetzen; und Vorrichtungen
zur Erfassung eines Dissoziationsvorgangs.
-
Insbesondere
kann die Vorrichtung ein Schallwandlerelement (ATD) enthalten, z.B.
eine Schwingquarzmikrowaage (QCM) oder Oberflächenwellenelemente oder jegliches
piezoelektrische Material, das in Schwingungen versetzt werden kann, z.B.
durch Anlegen einer Wechselspannung oder eines magnetischen Felds.
Hierbei handelt es sich um kostengünstige Vorrichtungen im Vergleich
zu einem AFM und sie können
mehrfach genutzt werden. Ein weiterer Vorteil der Verwendung einer
solchen Vorrichtung ist, dass die meisten Bindungen gleichzeitig aufgebrochen
werden, was zu einem nachweisbaren Geräusch führt und zu scharfen Rauschpeaks
bei bestimmten Beschleunigungen (an das ATD angelegte Spannung).
Ein weiterer Vorteil ist, dass das ATD als empfindliches Mikrofon
zur Erfassung der Schallemission verwendet werden kann, wenn der
Dissoziationsvorgang erfolgt.
-
In
den meisten Versuchen nach dem Stand der Technik, in denen ein ATD
verwendet wird, wurden Änderungen
der Resonanzfrequenz oder Phase gemessen, wenn das ATD mit gleich
bleibender Spannung angesteuert wird. Im Gegensatz dazu wird bei
der vorliegenden Erfindung die Ansteuerspannung und damit die Schwingungsamplitude
des ATD erhöht.
-
Die
vorliegende Erfindung weist vielfältige Anwendungsmöglichkeiten
bei der Trennung, Sortierung und Klassierung auf. Die Beispiele
zeigen, dass mit Streptavidin markierte Kugeln von normalen Latexkugeln
an Luft mittels einer QCM mit einer biotinylierten Oberfläche und
bei einer Ansteuerspannung über
0,1 V jedoch unter 6 V abgetrennt werden können. Die normalen Latexkugeln
werden von der Oberfläche
entfernt und nur die mit Streptavidin markierten Kugeln bleiben
an der Oberfläche
angeheftet (durch die stärkere
Streptavidin-Biotin-Bindung). Dadurch wird eine neue Form von Trennungsverfahren erschlossen,
die darauf beruht, eine bestimmte Zeit lang eine veränderliche
Kraft aufzubringen, die zum Beispiel angewendet werden kann für die Klassierung
und Sortierung von Teilchen, die Sortierung von Zellen, die Suche
nach Phagen sowie für
die Gestaltung neuer Biosensoren. Ein solches Trennverfahren ist
kostengünstig
und kann leicht mehrfach genutzt und automatisiert werden. So ist
es zum Beispiel möglich,
verschiedene Zieleinheiten an verschiedenen Punkten auf der gleichen
Mikrowaage aufzubringen und eine Liganden-Bibliothek mit mehreren
Zieleinheiten gleichzeitig zu vergleichen. Der Nachweis und die
Untersuchung von Viruspartikeln, die eine feste Größe aufweisen,
stellt ein weiteres Anwendungsgebiet dar. Ebenso wichtig ist, dass
die Erfindung ein neues, empfindliches und möglicherweise quantitatives
Hilfsmittel zur Untersuchung der Kräfte darstellt, die bei der
Molekülerkennung
auftreten.
-
BESCHREIBUNG
-
In
der vorliegenden Erfindung sind Sensorvorrichtungen eingesetzt,
die in Schwingungen versetzt werden können. Der Sensor kann auf verschiedene
Arten in Schwingungen versetzt werden, z.B. durch den Einsatz von
Oberflächenwellenelementen, Schwingquarzelementen,
akustischen Plattenmoden und Biegeplattenelementen aus dünnen Membranen.
-
Viele
verschiedene Sensoren, die für
den Einsatz in der Erfindung geeignet sind, sind von gewerblichen
Quellen zu beziehen. Eine Beschreibung von Sensoren, die für die vorliegende
Erfindung verwendet werden können,
ist enthalten in Acoustic Wave Sensors, Ballantine et al., (1997)
Academic Press. Der Sensor ist vorzugsweise ein Oberflächenwellenelement
oder insbesondere eine Schwingquarzmikrowaage (QCM).
-
Die
QCM besteht üblicherweise
aus einer Scheibe aus kristallinem Quarz mit Goldelektroden auf
der Ober- und Unterseite. Aufgrund des umgekehrten Piezoeffekts
erfährt
sie eine Scherschwingung, wenn eine Wechselspannung an die Elektroden
angelegt wird. Eine Erhöhung
der Spannung führt
zur Erhöhung
der Schwingungsamplitude der QCM.
-
Der
Quarzkristall ist außerdem
ein empfindliches Mikrofon und kann zur Erfassung der Schallemission
verwendet werden, die durch den Aufspaltungsvorgang zustande kommt.
Es ist technisch einfacher, Schwingungen mit einer Frequenz anzuregen,
die einer Hauptresonanzfrequenz entspricht und die Schallemission
nahe einer weiteren Schwingungsart zu erfassen. Zum Beispiel wird
die QCM mit ihrer Resonanzfrequenz angesteuert und die Schallemission
wird bei ihrer dritten Harmonischen erfasst.
-
Zur
Veranschaulichung kann der Begriff „Analyt" zur Beschreibung des Bindungspartners oder
Bestandteils verwendet werden, der den auf der Oberfläche immobilisierten
Bindungspartner berührt. Nach
der Berührung
bindet der Analyt durch zwischenmolekulare Wechselwirkung an den
Sensor und erfährt
eine Beschleunigung und dadurch wird eine Kraft auf den Analyten
ausgeübt.
Die Schwingungsamplitude steigt und bei einer bestimmten Grenzkraft
erfolgt der Bindungsbruch. Ein bislang gebundener Analyt kann sich
somit frei auf der Oberfläche
bewegen.
-
Der
Analyt kann jede mikroskopische Einheit sein, die auf dem Sensor
durch eine zwischenmolekulare Wechselwirkung zurückbehalten werden kann. Der
Analyt kann ein Eiweiß,
Antikörper,
Antigen, Enzym, Enzyminhibitor oder Polynukleotid sein. Der Analyt
kann auch ein größeres Teilchen
sein wie eine Bakterie, Zelle, ein Virus, Prion oder Phage. Weitere
Beispiele für
Teilchen, die besonders zur Verwendung für die vorliegende Erfindung
geeignet sind, umfassen Mikrokügelchen
jedes Stoffs, z.B. Siliziumdioxid, Gold oder Latex, oder große Makromoleküle wie Plasmiden.
Der auf der Oberfläche
immobilisierte Bindungspartner kann von der gleichen Art sein und
kann entsprechend gewählt
werden und abhängig
von der passenden physikalischen oder chemischen Bindung.
-
Die
Dissoziation kleinerer Analyten wird vorzugsweise durch Schallemission
erfasst. Größere Teilchen
können
auch durch optische Hilfsmittel erfasst werden, z.B. Mikroskopie.
-
Gemäß dem ersten
Gesichtspunkt der Erfindung wird die Trennung durchgeführt durch
Immobilisierung des Zielmoleküls
auf einer Sensoroberfläche über eine
Wechselwirkung mit einem Bindungspartner. Die Oberfläche kann
dann in Schwingungen versetzt werden, um die Moleküle auf der
Oberfläche des
Sensors zu spalten. Die Schwingungen werden durch stetige Steigerung
der Amplitude und damit der Beschleunigung erzielt und können entweder
gewählt
werden, um das Zielmolekül
von der Oberfläche
zu entfernen oder um andere Bestandteile der Zusammensetzung von
der Oberfläche
zu entfernen, sodass das Zielmolekül an die Oberfläche gebunden bleibt.
In einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Sensoroberfläche
mithilfe eines piezoelektrischen Elements in Schwingungen versetzt,
z.B. einer QCM. Dasselbe Piezoelement kann als Mikrofon verwendet
werden, um Schallwellen zu erfassen, die durch einen Aufspaltungsvorgang
entstehen.
-
Das
Trennverfahren kann angewendet werden, um nach Molekülen zu suchen,
die starke Wechselwirkungen mit einem bestimmten Bindungspartner aufweisen.
So kann das Verfahren zum Beispiel angewendet werden, um Zellen
auszusortieren, die bestimmte Rezeptormoleküle an der Zelloberfläche aufweisen
oder um nach Antikörpern
mit starker Affinität zu
einem bestimmten Liganden zu suchen.
-
Verschiedene
Liganden können
an verschiedenen Punkten auf der Oberfläche angeordnet werden, zum
Beispiel durch das Kontaktbelichtungsverfahren oder den Einsatz
von Masken oder Fotolithografie. Danach kann ein Gemisch auf mehrere
Partner mit starken Bindungen hin mit mehreren verschiedenen Liganden
gleichzeitig durchsucht werden.
-
Insbesondere
können
bei der Erfindung Plättchen
benutzt werden, die verschiedene Stoffe wie Rezeptoren aufweisen,
die darauf immobilisiert sind. Allgemeiner können die Plättchen Stoffe aufweisen, die
eine Prüfung
auf verschiedene Infektionen, Krankheitserreger, Prione, Lebensmittelallergene,
Viren, Bakterien usw. hin ermöglichen,
z.B. bei klinischen Versuchen an Mensch und Tier und zur Hygieneüberwachung
bei Lebensmitteln und Wasser. Weiterhin kann die Erfindung beim
Screening von Bibliotheken, Phagendisplay usw. eingesetzt werden.
-
Der
zweite Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren
zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Größe von Teilchen, oder des Affinitätsgrads
zwischen Molekülen.
Vorzugsweise ist ein Molekül
an einer Sensoroberfläche
immobilisiert und das andere ist an einem Teilchen immobilisiert,
z.B. einem Mikrokügelchen.
Das Teilchen wird dann an den Sensor über die interessierende zwischenmolekulare
Wechselwirkung angeheftet. Die funktionalisierten Teilchen werden
dann durch Anlegen einer Spannung an den Sensor in Schwingungen versetzt.
Mit steigender Schwingungsamplitude erreicht die Kraft einen kritischen
Wert, bei dem der Bindungsbruch erfolgt. An diesem Punkt kann mithilfe
eines empfindlichen Verstärkers
ein kennzeichnendes Geräusch
erfasst werden, und die Bewegung der Teilchen kann beobachtet werden,
z.B. mit einem Lichtmikroskop. Die Stärke des Signals hängt von
der Anzahl der Teilchen ab, die an die Sensoroberfläche gebunden
sind. Wenn die QCM, wie nachfolgend in Beispiel 1 beschrieben, verwendet
wird, mit physisorbierten Mikrokügelchen,
wird ein Rauschen üblicherweise
bei 0,1- V erfasst,
abhängig
von der Größe der Mikrokügelchen,
wobei dies einsetzt, wenn im Mikroskop zu sehen ist, dass die Mikrokügelchen
sich verschieben und fortbewegen. Das erzeugte Rauschen kann gegen
die Amplitude (oder angelegte Spannung) aufgetragen werden, was
als Aufspaltungskraft-Spektrum
bezeichnet wird. Der Punkt, an dem der Bindungsbruch erfolgt, ist
aus der Darstellung zu erkennen, da es einen Rausch-Peak gibt. Folglich kann
die Spannung bestimmt werden, bei der der Bindungsbruch erfolgt.
Durch geeignete Eichversuche mit Teilchen, die bekannte Bindungsdichten
und -stärken
aufweisen, kann dieses Verfahren quantitativ gemacht werden. Weiterhin
ist die Höhe
des Schallemissions-Peaks ein Maß für die Anzahl gebundener Teilchen.
-
Die
vorliegende Erfindung kann zur Untersuchung jeder zwischenmolekularen
Wechselwirkung benutzt werden, ist jedoch insbesondere geeignet zur
Untersuchung von Enzym-Ligand-Wechselwirkungen,
Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen
und Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen oder einer Wechselwirkung zwischen
einem großen
Makromolekül
und seinem natürlichem
Bindungspartner. Das Verfahren kann auch zur Untersuchung von Hybridisierungsvorgängen zwischen
Polynukleotiden verwendet werden. Daher kann der Ligand gemäß dem ersten
Gesichtspunkt der Erfindung zum Beispiel ein Eiweiß, Antikörper oder
Antigen sein, ein Enzym, Enzyminhibitor, Polynukleotid oder ein
größeres Makromolekül wie ein
großes
Plasmid oder ein Virus. Gemäß dem zweiten
Gesichtspunkt der Erfindung kann jeder Stoff an die Oberfläche oder
das Teilchen gebunden sein.
-
Die
folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
-
In
den Beispielen wird die Spektroskopie der Kraft der Aufspaltung
zur Messung der Adhäsionskräfte zwischen
einer Oberfläche
und einem kleinen Teilchen verwendet. Diese Wirkung beruht darauf, eine
Oberfläche
mit Mikroteilchen darauf in Schwingungen zu versetzen, mit monoton
steigender Amplitude und somit steigender Beschleunigung. Dies wird erreicht
durch Ansteuern der Oberfläche
mit einem piezoelektrischen Element, in diesem Fall mit einer Schwingquarzmikrowaage
(QCM). Wenn die Amplitude steigt, steigt auch die Beschleunigung
und somit die Kraft, die auf das Teilchen ausgeübt wird. Der Bruch sämtlicher
Bindungen, die das Teilchen mit der Oberfläche verbinden, verursacht Schallwellen
und die gleiche piezoelektrische Einrichtung wird als empfindliches
Mikrofon verwendet, um diese Schallwellen zu erfassen, die durch
den Aufspaltungsvorgang erzeugt werden. Eine vereinfachte Darstellung der
Vorrichtung, die in Beispielen 1 bis 5 verwendet wird, ist in 1 gezeigt;
eine allgemeinere vereinfachte Darstellung der bevorzugten Vorrichtung
ist in 8 gezeigt.
-
Genauer
gesagt zeigt 1 einen Schaltplan, der einen
piezoelektrischen Wandler (10) umfasst, einen Erzeuger
zur Erzeugung einer reinen f-Sinusschwingung (11), einen
3f + Δf-Erzeuger
(12), einen 3f + Δf-Filter
(13), einen Lock-in-Verstärker und Analog-Digital-Wandler
(14) und einen Computer (15), der einen Dateneingang
und einen Regelausgang aufweist, die durch die Pfeile angezeigt
sind. In den Beispielen 1 bis 5 ist f = 14,2 MHz und Δf ist 82 kHz.
Teilchen (16) sind auf der Oberfläche des Trägers angeordnet.
-
8 zeigt
einen piezoelektrischen Wandler (21) (z.B. QCM, Oberflächenwellenelement
usw.) und einen Regelverstärker
(22) mit Eingang (23) und Ausgang (24),
die in der Lage sind, geregelt durch ein Signal (25) eine
gleichmäßig steigende
Ausgangsamplitude zu liefern. Der Schaltplan umfasst auch einen
Bandpassempfänger
(26) (zum Beispiel ähnlich
einem ESB-Empfänger)
und einen oder mehrere Analog-Digital-Wandler (27), die über eine
Verbindung (28) Daten liefern. Der Schaltplan umfasst außerdem ein
Regel-, Aufnahme- und Datensignalverarbeitungsgerät (29)
(zum Beispiel einen Computer oder spezialisierten digitalen Signalprozessor). Der
Kontakt, der durch eine unterbrochene Linie (30) angezeigt
ist, kann ersetzt werden durch verbesserte Filter- und Kopplungsvorrichtungen,
z.B. kann es ein passives L, C, R Netzwerk sein.
-
Bei
Verwendung des Schaltplanes, der in 8 gezeigt
ist, stellen der Verstärker
(22) mit dem Wandler (21), gemeinsam mit wahlweisen
Filter-/Kopplungsmitteln (30) ein einfaches Oszillatornetzwerk
dar, das vorzugsweise mit einer Frequenz Schwingungen erzeugt, bei
der der Wandler wirksam ist; bei QCM kann das eine Resonanzfrequenz
der Fundamentalserie sein. Diese Schwingungsfrequenz (F) ist z.B.
14 MHz. Geregelt durch den Regler (29) über die Verbindung (25)
steigt die Amplitude der Ansteuerspannung an Ausgang (24)
gleichmäßig. Das austretende
Schallemissionssignal an Punkt (30) kann mithilfe eines
wahlweisen Filters/Kopplers geglättet
werden und dann dem Eingang des Bandpassempfängers (26) zugeführt werden.
Der Arbeitsfrequenzbereich des Empfängers kann nach einem maximalen
Signal-Rausch-Kriterium gewählt
werden, z.B. der Resonanzschwingungstyp nahe der dritten Harmonischen
(3*F + ΔF),
z.B. 42,082 MHz.
-
Ein
oder mehrere Analog-Digital-Wandler (27) mit einem großen dynamischen
Bereich wandeln einfache oder phasenverschobene Ausgangssignale.
Die Daten werden dann digital bei (29) weiterverarbeitet,
um ein Nutzsignal zu gewinnen, und dann aufgezeichnet und/oder dem
Betrachter angezeigt. Der Verstärker
(22) kann zusätzlich
mit einem oder mehreren passiven Ausgangs- und/oder Eingangsfilter(n)
ausgestattet sein, die das Signal-Rausch-Verhältnis verbessern und auch gewährleisten,
dass der Oszillator über
den Wandler bei der richtigen Frequenz und der richtigen Phasenverschiebung
von Strom zu Spannung arbeitet.
-
9 zeigt
einen bevorzugten Oberflächenwellen-Sensor
zur Verwendung in der Erfindung. Er umfasst Mittel (31)
zur Erzeugung einer Hochfrequenzspannung an Ausgang (32)
mit steigender Amplitude, die die Wandlerelektroden (33)
ansteuert. Die Elektrodenanordnung (33) ist für die Erzeugung
von Oberflächenwellen
mit hoher Amplitude an einem Piezosubstrat (34) optimiert.
Die Elektrodenanordnung (37) ist für die bestmögliche Wandlung von Schallemission
in ein elektrisches Signal optimiert. Die Anordnung kann vielschichtig
sein und ein oder mehrere Elektrodenpaar(e) umfassen. Die Vorrichtung
umfasst außerdem
eine Regeleinheit (35) zur Regelung des Erzeugers (31) über eine
Verbindung (36) und zum Empfang der erzeugten Signale an
einem oder mehreren Eingängen
(38) und zur Datensignalverarbeitung, z.B. Korrelationsanalyse.
-
Bei
Verwendung des Oberflächenwellen-Sensors
erzeugt der Erzeuger (31) eine Hochfrequenzspannung, die
geeignet ist, eine wirksame Wandlerfrequenz an Ausgang (32)
zu schaffen, und diese wird dann den erzeugenden Wandlerelektroden
(33) zugeführt,
die auf dem Piezosubstrat (34) (gepunktete Linie) angeordnet
sind. Die Amplitude der Hochfrequenzspannung steigt über die
Zeit, geregelt durch die Regeleinheit (35) über die
Verbindung (36). Die Empfängerelektroden (37)
wandeln die Schallemission, die von der wirksamen Fläche kommt,
in ein elektrisches Signal um, das dem Empfänger/der Regeleinheit (35)
und dem Eingang/den Eingängen
(38) zugeführt
wird. Die Daten, die nach der Analog-Digital-Wandlung entstehen,
werden einer Signalverarbeitung unterzogen, um Nutzsignale zu erhalten.
Die Ergebnisse werden schließlich
aufgezeichnet und/oder dem Bediener angezeigt.
-
Einige
Ergebnisse der Beispiele sind in 2 bis 7 und
in 10 gezeigt. In 2A, 2B, 3A, 3B, 4A, 4B, 4C, 4D, 6B, 7 und 10 ist
Signalrauschen (S; willkürliche
Einheiten) gegen Amplitude (A; Volt) dargestellt. In 5A, 5B, 6A und 6C ist Signalrauschen (S; willkürliche Einheiten)
gegen Teilchenzahl (N) dargestellt.
-
Die
folgenden Abkürzungen
werden verwendet:
- BSA:
- Rinderserumalbumin
- LB:
- Luria Nährmedium
- DIC:
- Dimethylaminoisopropylchlorid
- DMAP:
- Dimethylaminopyridin
- EDC:
- 1,3-Dimethylaminopropyl-3-Ethylcarbodiimidin
- NHS:
- N-Hydroxysuccinimid
- PBS:
- phosphatgepufferte
Kochsalzlösung
-
Beispiel 1
-
Latexkugeln
mit einem Durchmesser von 5 μm
wurden mit der Oberfläche
eines QCM-Sensors über
eine große
Anzahl der interessierenden Bindung verbunden. Der Grad der Bedeckung
der verwendeten Kugeln betrug 1 % der Oberfläche der QCM. Die Kugeln wiesen
nur 1 % Abweichung in ihrem Durchmesser auf.
-
Der
QCM-Sensor enthielt polierte Quarzscheiben, mit einem AT-Schnitt
bei 35° hergestellt, 8,25
mm im Durchmesser. Es wurden Chromschichten (20 bis 30 nm dick)
und anschließend
Goldschichten (100 bis 120 nm dick) aufgebracht.
-
Drei
verschiedene Bindungen wurden bei Versuchen untersucht, die an Luft
durchgeführt
wurden: eine physikalische Bindung (Latex-Gold), eine Streptavidin-Biotin-Bindung und
eine kovalente Bindung (Amidbindung). Die physikalische Bindung
wurde durch unmittelbares Aufbringen der Latexkugeln auf der Sensoroberfläche und
Trocknung in Stickstoff hergestellt. Die Streptavidin-Biotin-Bindung wurde durch
Aufbringen von biotinyliertem BSA auf die Oberfläche und Trocknung in Stickstoff
hergestellt. Die chemische Bindung wurde hergestellt, indem unter
Verwendung eines in Ethanol gelösten
Thiols mit endständiger
Säuregruppe
(12-Merkaptododekansäure)
eine Thiolmonolage gebildet wurde; diese wurde dann mit EDC-NHS
aktiviert und die Kugeln mit endständiger Aminogruppe wurden dann
hinzugegeben, um die Amidbindung zu bilden.
-
Die
Versuche wurden in einer Kammer durchgeführt, die mit zwei optischen
Fenstern versehen ist: eins um die Laserbeleuchtung der Probe zu gewährleisten
und das andere um die Beobachtung des gestreuten Laserlichts mit
einem Lichtmikroskop zu ermöglichen.
Die QCM wurde in die Kammer gestellt. Ein Signalerzeuger, Ausführung DS345
(Stanford Research Systems), wurde zur Ansteuerung der QCM verwendet.
-
Bewegung
und Ablösung
der Teilchen wurden mit einem Olympus BH-2 Lichtmikroskop beobachtet,
ausgestattet mit einer CCD Panasonic WL-SL300 Videokamera. Die Hauptmesseinrichtung war
ein Lock-In-Verstärker,
SR 844 (Stanford Research Systems). Das Bezugssignal wurde dem Lock-In-Verstärker über einen
zweiten Erzeuger zugeführt,
der auf den ersten abgestimmt wurde. Sämtliche Vorrichtungen wurden
zur Regelung des Versuchs und zur Datenerfassung an einen Computer angeschlossen.
-
2A zeigt
das Aufspaltungskraft-Spektrum für
die Streptavidin-Biotin-Bindung (1) und für die chemische
Bindung (2); 2B ist das Spektrum für die physikalische
Bindung.
-
Durch
die Aufnahme der Aufspaltungskraft-Spektren ist es möglich, mit
Versuchen die Kraft oder Spannung zu bestimmen, die notwendig ist,
um die Bindungen aufzuspalten. Dies kann zur Trennung verwendet
werden. Wie in 2A dargestellt, können, wenn
ein Gemisch von 5 μm-Kugeln vorhanden ist,
von denen einige auf der Oberfläche
Streptavidin aufweisen und einige nicht, durch Anlegen einer Spannung
an eine QCM mit Biotin auf der Oberfläche von über 0,1 V, aber unter 6 V,
z.B. 1 V, die zwei Mengen Kugeln getrennt werden, damit nur mit
Streptavidin markierte Kugeln auf der Oberfläche zurückbleiben. Dieses Verfahren
kann auch angewendet werden, um mit Streptavidin markierte Kugeln
nachzuweisen, da sich nur diese Kugeln an die Oberfläche binden
würden,
wenn sie bei 1 V in Schwingungen versetzt wird.
-
Um
die Messung quantitativ zu machen, wurde die Schwingungsamplitude
der QCM bei verschiedenen Spannungen auf der Grundlage von Versuchsdaten
berechnet, um damit die Kraft auf die Mikrokugel einschätzen zu
können.
Diese Schätzung erfolgte
durch Messung des Stromverbrauchs der QCM und ihres Q-Faktors (oder
Gütefaktor – die umgekehrte
relative Resonanzbandbreite = f/ΔfResonanz). Die Amplitude A ist gegeben durch: A = [QP/2π3 faM]1/2 wobei
Q der Q- oder Gütefaktor
ist, P der elektrische Strom, der von der QCM verbraucht wird, f
die Resonanzfrequenz des Quarzkristalls und M die effektive Masse
der QCM-Quarzscheibe, die in die Bewegung einbezogen ist. Der Q-Faktor
wurde bei 6 V als etwa 15.000 bestimmt, wodurch sich eine Schätzung der Schwingungsamplitude
der QCM von 60 nm ergibt. Die Kraft auf die Kugel beträgt daher
9 μN. Das müsste mit
der Kraft von 160 pN2 verglichen werden, die
benötigt
wird, um eine einzige Streptavidin-Biotin-Bindung aufzuspalten und
zeigt, dass etwa 60.000 Bindungen gleichzeitig aufgespalten werden. Schätzungen
geben an, dass dies 50 % oder mehr von der Anfangsmenge der Streptavidin-Biotin-Bindungen
zwischen der Kugel und der Oberfläche entspricht. Das bedeutet,
dass die meisten Bindungen, die die Kugel mit der Oberfläche verbinden,
gleichzeitig aufgespalten werden. Dadurch kommen die scharfen Peaks
zustande, die in den Spektren der Kraft der Aufspaltung beobachtet
wurden sowie das nachweisbare Rauschen bei der Trennung der Bindung.
-
Beispiel 2
-
Dieses
Beispiel zeigt, dass die Verfahren der Erfindung auch in Lösung durchgeführt werden
können.
Der Q-Faktor der QCM wird aufgrund der Flüssigkeitsbelastung sinken und
senkt dadurch die Schwingungsamplitude bei einer bestimmten Spannung,
im Vergleich zu Luft. Es werden Zähigkeitskräfte vorhanden sein, die auf
die Mikrokugel einwirken und ihre effektive Masse wird aufgrund
der damit verbundenen Wasserschicht zunehmen und die Kraft auf die
Kugel erhöhen.
-
3 zeigt
das Aufspaltungskraft-Spektrum für
5 μm-Latexkugeln, die über eine
Streptavidin-Biotin-Bindung (3A) und
eine chemische Bindung (3B) mit
der Oberfläche
verbunden sind. Die Aufspaltung findet bei 1 V bzw. 10 V statt.
-
Ein
Rückgang
der kritischen Spannung bei der Streptavidin-Biotin-Bindung um den Faktor sechs,
von 6 V auf 1 V beim Übergang
von Luft zu Wasser, und die Trennung der chemischen Bindung in Wasser
weisen darauf hin, dass die letztere Wirkung vorherrschend ist.
Dieses Beispiel zeigt damit deutlich, dass die Lösung von Bindungen und damit auch
Trennung und biosensorische Wirkung in Wasser, Flüssigkeit
oder anderem möglich
sind.
-
Angenommen,
dass die Bindungsdichte bei der physikalischen, der Streptavidin-Biotin-
und der chemischen Bindung gleich ist und da Mikrokugeln gleicher
Größe bei diesen
Versuchen verwendet wurden, kann ein verhältnismäßiger Maßstab der Kraft der Aufspaltung
erzielt werden. Dieser beträgt
1 : 60 600 für
die physikalische Streptavidin-Biotinchemische Bindung. Dieser Maßstab erscheint
vernünftig und
veranschaulicht den dynamischen Bereich dieses Verfahrens. Mit der
Durchführung
geeigneter Eichversuche mit bekannten Bindungsdichten sollte es
möglich
sein, diese Messungen quantitativ zu machen.
-
Beispiel 3
-
Das
Beispiel veranschaulicht den Nachweis von Viren und insbesondere
von genetisch veränderten
Bakteriophagen, die ein Maltose bindendes Eiweiß aufweisen, das mit dem pIII-Hüllprotein der Phagen verschmolzen
ist, da sowohl die Phagen als auch die Maltosebindungswechselwirkung
hinreichend beschrieben und leicht verfügbar sind. Der Phage ist ein
langer, dünner,
fadenförmiger
Virus, der aus einem beweglichen Stab von 1 μm Länge und 6 nm Durchmesser besteht.
Die genetisch veränderten Phagen
präsentieren
zusätzlich
bis zu 5 Maltose bindende Eiweiße
an einem Ende des Virus als Verbindungen mit dem pIII-Hüllprotein
des Phagen auf; siehe McCafferty et al, Nature, 1990, 348:552. Diese Phagen
können
spezifisch an Amyloseharz gereinigt werden.
-
Eine
Verschmelzung eines Maltose bindenden Eiweißes mit der Aminoendgruppe
der Indolglyzerolphosphatsynthase wurde auf der Oberfläche einer
fd-Phage als eine Verschmelzung mit der Aminoendgruppe des mit dem
Gen III verschlüsselten
Hüllproteins
präsentiert.
Zu diesem Zweck wurde ein fd-Phagenvektor,
pJB113, erzeugt; er verschlüsselte eine
genetische Fusion zwischen MalE (E. coli), trpC (E. coli) und Gen
III. Dieser Phagenvektor trug einen Tetrazyklin-Resistenzmarker. Der unveränderte Konkurrenzphage
war der VCS M13 K07 Helferphage (Stratagen), der einen Kanamyzin-Resistenzmarker trug.
-
Durch
Zugabe von 10 μl
Phagenstammlösung
zu 3 ml einer LB-Kultur
des Escherichia coli Stamms TG1 mit mittlerer logarithmischer Phase wurde
eine Bakteriophagen-Konzen tration von 1 × 1012 KBE/ml
erzielt. Nach 2 Stunden Schütteln
(250 rpm) bei 37 °C
wurde 1 ml der Kultur in 100 ml LB eingeimpft und bei 350 rpm, 37 °C eine Stunde
lang geschüttelt.
Tetrazyklin (10 μg/ml)
oder Kanamyzin (50 μg/ml)
wurde zu der pJB113- bzw. VCS-Kultur hinzugegeben, die über Nacht
bei 30 °C,
250 rpm wachsen gelassen wurde. Die Bakterien wurden in Pellets
geformt (15 Min., 4,1 krpm) und die Phagen aus dem Überstand
durch Zugabe von NaCl und PEG6000 ausgefällt bis auf eine Endkonzentration
von 0, 5 M bzw. 4 % (v/v). Nachdem sie für eine Stunde auf Eis gestellt
wurden, wurden die Phagen durch Schleudern (30 Min., 4,1 krpm) zurückgewonnen
und das Phagenpellet wurde in 1 ml H2O resuspendiert
und bei 4 °C
gelagert.
-
Lösliche Stärke (500
mg, 0,01 mmol, 1 val) wurde in DMF (10 ml) gelöst und 5 Min. gerührt (teilweise
löslich).
DIC (7,8 μl,
6,3 mg, 0,05 mmol, 5 val) und DMAP (kat.) wurden zu 11-Merkaptododekansäure (11,5
mg, 0,05 mmol, 5 val) in DMF (0,5 ml) hinzugegeben und diese Lösung wurde
zu der Stärkelösung hinzugegeben.
Die Reaktion wurde über
Nacht bei Raumtemperatur rühren
gelassen. Die Reaktion wurde dann mithilfe einer Rührzelle
mit einer Membran, Trenngrenze 10000 MW, durch Spülen der
Lösung
mit milliQ-Wasser (6mal 50 ml) und Konzentrieren gereinigt, gefolgt
von Gefriertrocknung über Nacht.
-
Die
Oberfläche
wurde mit der veränderten Stärke vorbehandelt,
die eine Thiolgruppe enthielt, sodass sie chemisch mit der Oberfläche gekoppelt werden
konnte. Die QCM (wie in Beispiel 1 vorbereitet) wurde für 12 Stunden
in eine Lösung
der Stärke in
Methanol (1 μg
pro ml) gesetzt. Die Proben wurden dann gewaschen und unter einem
Stickstoffstrom getrocknet. Die Viren wurden aus der Lösung auf die Oberfläche aufgebracht
und bei Raumtemperatur getrocknet, für die Versuche an Luft. Verschiedene
Virenkonzentrationen wurden durch Verdünnung hergestellt. Um die Versuche
durchzuführen,
bei denen die Maltose das Maltose bindende Eiweiß hemmt, wurden 100 nM Maltose
zu der Phagenlösung
hinzugegeben.
-
Die
Oberfläche
der QCM wurde somit mit einer Schicht löslicher Kartoffelstärke beschichtet
(die verzweigte Polymere der Maltose enthält), die chemisch mit der Goldoberfläche über eine
Schwefel-Gold-Bindung verbunden ist. Die Versuche wurden sowohl
an Luft als auch in Wasser durchgeführt.
-
4A zeigt
das Aufspaltungskraft-Spektrum, das in Wasser bei einer Mischung,
die zu gleichen Teilen aus Maltose bindenden Phagen (–) und unveränderten
Phagen (...) bestand, entstanden ist, wobei die Abtastung über 500
Sekunden erfolgte. Es sind etwa 500 Millionen von jeder Phagenart
auf der Oberfläche
der Goldelektrode vorhanden. Bei den unveränderten und damit unspezifisch
gebundenen Phagen wurde ein Aufspaltungs-Peak bei 1,2 V erfasst.
Die entsprechenden Aufspaltungs-Peaks der Maltose bindenden Phagen
lagen um 9 V und sind stärker
als bei den unspezifisch gebundenen Phagen aufgrund der höheren Energie,
die bei der Trennung der Bindung frei wird. An Luft wurden bis 10
V keine Peaks von den spezifisch gebundenen Maltose bindenden Phagen
beobachtet; 4B zeigt die Ergebnisse an Luft
nur für
die unspezifisch gebundenen Phagen. Der Peak erscheint bei 7,5 V,
ein Anstieg von etwa 6 über
dem Peak, der in Wasser gefunden wurde. Eine zweite Abtastung (...)
weist so gut wie keine Peaks auf, was darauf hinweist, dass die
Phagen von der Oberfläche
entfernt wurden. Damit ist bestätigt,
dass die zusätzlichen
Flüssigkeitsreibungskräfte und
der Anstieg der effektiven Masse des Teilchens es leichter machen,
die Bindungen zwischen den Phagenpartikeln und der Oberfläche in Wasser aufzuspalten
als an Luft.
-
Wie
scharf die Peaks im Aufspaltungskraft-Spektrum sind, ist offensichtlich
mit der Beobachtung verbunden, dass die Aufspaltung der Bindung
bei einer Schwellenspannung auftritt; dadurch kommt es zu den Schallschwingungen,
die in einer kurzen Zeitdauer auftreten und damit das Verfahren sehr
empfindlich machen. Außerdem
ist das Signal von den spezifisch bindenden Phagen klar getrennt von
den unspezifisch bindenden Phagen und bei einer höheren Amplitude,
was bedeutet, dass die unspezifische Adsorption die Messung der
spezifischen Adsorption nicht beeinflusst. Es ist eine viel größere Kraft
notwendig, um die spezifische Wechselwirkung zwischen den Maltose
bindenden Eiweißen
auf den Phagen und der mit Stärke
beschichteten Oberfläche aufzuspalten
als die, die notwendig ist, die unspezifische Wechselwirkung zwischen
unveränderten
Phagen und der Oberfläche
aufzuspalten.
-
4C zeigt
das Ergebnis eines Gegenversuchs, der an Luft mit den Maltose bindenden
Phagen durchgeführt
wurde, wenn deren Bindungsstelle mit Maltose blockiert ist und die
Phagen dann in der Mitte der QCM (obere Darstellung) oder über die
gesamte Oberfläche
(untere Darstellung) aufgebracht sind; es ergab sich ein ähnliches
Verhalten wie bei den unveränderten
Phagen, sodass bestätigt
werden konnte, dass der Unterschied auf diese spezifischen Wechselwirkungen
zurückzuführen ist. 4D zeigt das
Aufspaltungskraft-Spektrum in Wasser mit nur 1000 Phagen auf der
Oberfläche
und zeigt, dass der Aufspaltungsvorgang immer noch nachweisbar ist. Es
ist eine kleine Verschiebung in der Peak-Lage vorhanden, die auf
kleinere Veränderungen
des Q- oder Gütefaktors
der QCM zurückzuführen ist,
im Ergebnis der Belastungsveränderung.
-
Die
Ergebnisse lassen auch darauf schließen, dass es möglich sein
sollte, die unspezifisch gebundenen Phagen von den Maltose bindenden
Phagen abzutrennen, indem die QCM mit einer Spannung angesteuert
wird, die über
der liegt, die notwendig ist, die Bindungen mit den unspezifisch
gebundenen Phagen aufzuspalten, aber unter der für die Maltose bindenden Phagen.
Dies deutet auf eine andere Möglichkeit
hin, Phagenbibliotheken auf Bindung hin zu durchsuchen, wobei die
Bindungsaffinität
der Phagen, die auf der Oberfläche
geblieben sind, überprüft wird
durch Überprüfung der
Höhe der
angelegten Spannung und der Dauer, während der sie angelegt wird,
vorausgesetzt, dass die Phagen lebensfähig bleiben.
-
Um
die Empfindlichkeit des Verfahrens zu bestimmen, wurde ein Verdünnungsversuch
durchgeführt,
mit den Maltose bindenden Phagen in Wasser. 5A zeigt
(bei den stärksten
Rausch-Peaks um 9 V), dass die Stärke des Signals über mindestens
fünf Größenordnungen
auf einer Linie mit der Anzahl der Phagen verläuft und dass die Anwesenheit
von etwa 200 Phagen auf der QCM mit 99 % Wahrscheinlichkeit nachgewiesen
werden kann. 5B zeigt eine ähnliche
Kurve für
die unspezifisch bindenden Phagen an Luft und gibt eine Nachweisempfindlichkeit
von 100 Phagen mit 99 Wahrscheinlichkeit an. Die Anzahl der Maltose
bindenden Phagen auf der Oberfläche
bei geringer Verdünnung
wurde durch direkte Bildgebung mittels eines AFM bestätigt.
-
Dieses
Beispiel zeigt, dass die Anzahl der Phagen auf der QCM-Oberfläche nachgewiesen
werden kann. Im Gegensatz dazu wird mit der Polymerase-Kettenreaktion
die Anzahl der Nachbildungen viraler DNA in Lösung nachgewiesen. Wird angenommen,
dass sich sämtliche
Viruspartikel in der Probelösung
an die Oberfläche
binden, was geschehen wird, wenn entweder eine starke Wechselwirkung zwischen
Virus und Oberfläche
vorhanden ist oder die Lösung
verdampfen kann, sodass die Viren auf der Oberfläche zurückbleiben, dann ist ein direkter Vergleich
der Empfindlichkeit möglich.
Die Empfindlichkeit der Polymerase-Kettenreaktion liegt bei etwa 100
Nachbildungen viraler DNA pro ml, was vergleichbar mit der Nachweisempfindlichkeit
für Phagen
nach diesem Beispiel ist (das nicht optimiert ist). Die Elektronik
kann verbessert werden und es ist Spielraum für die weitere Verbesserung
der Empfindlichkeit vorhanden, um möglicherweise mindestens eine
Größenordnung.
Zum Beispiel wurden die Phagen in diesen Versuchen gleichmäßig über die
Oberfläche
der QCM verteilt. Jedoch weisen sowohl die Amplitude als auch die
Empfindlichkeit der QCM eine räumliche
Abhängigkeit
auf, was bedeutet, dass das vorherrschende Signal aus der Mitte
der QCM kommt (wie in 4C gezeigt). Das bedeutet, dass
weniger und damit stärkere
Peaks aufgezeichnet werden könnten,
wenn die Phagen nur in der Mitte der QCM aufgebracht würden, was
zu einer verbesserten Empfindlichkeit führen würde.
-
Dieses
Verfahren kann einfach auf den Nachweis von menschlichen Viren ausgeweitet
werden, durch die Verwendung spezifischer Antikörper des Virus', die an die Oberfläche der
QCM gebunden sind. Diese Antikörper
bilden spezifische Wechselwirkungen zwischen dem Virus, der an die
Oberfläche der
QCM gebunden ist. Diese Antikörper
bilden spezifische Wechselwirkungen zwischen dem Virus und der Oberfläche, die
bei einer bestimmten Oberflächenbeschleunigung
aufgespalten werden können.
Unspezifische Adsorption durch ähnlich
große oder
größere Teilchen,
die in der Probe vorliegen, ergibt Peaks bei niedriger Spannung,
wie jetzt gezeigt werden konnte, und dies sollte die Untersuchung nicht
beeinflussen, obwohl die Adsorption durch Makromoleküle auf der
Oberfläche
die Anzahl der Antikörper
senken kann, die für
die Bindung an den Virus verfügbar
sind. Die meisten gewöhnlichen
Viren weisen eine größere effektive
Masse auf als die Phagen, die für
dieses Beispiel verwendet wurden, obwohl die Anzahl und Stärke der
spezifischen Wechselwirkungen mit der Oberfläche unterschiedlich sein werden. Das
bedeutet, dass die erforderliche Spannung ähnlich hoch oder niedriger
sein sollte.
-
Dieses
Beispiel zeigt, dass die Spektroskopie der Kraft der Aufspaltung
keinen Verstärkungsschritt
erfordert, quantitativ ist und das Vermögen hat, schnell und kostengünstig zu
sein. Dies könnte
zur schnellen Erkennung einer Virusinfektion in vielen Situationen
führen,
einschließlich
bei Patienten in einem klinischen Umfeld oder bei Pflanzen und Tieren in
der Landwirtschaft.
-
Beispiel 4
-
Dieses
Beispiel veranschaulicht einen Virusbindungstest. Für diese
Untersuchung wurden Schwingquarzmikrowaagen-Plättchen
aus polierten Quarzscheiben, mit einem AT-Schnitt in einem Winkel
von 35 °C
(HyQ, Cambridge, UK) hergestellt und in einem Edwards-Vakuumbedampfer
mit einer 30 nm dicken Haftschicht aus Chrom beschichtet, dann mit
einer 200 nm Schicht Gold, wie durch geeichte elektrische Leitfähigkeit
bestimmt. Diese Plättchen wurden
anschließend
18 Stunden lang in eine 1 mM Lösung
Merkaptododekansäure
in Ethanol spektroskopischer Reinheit eingetaucht, gründlich mit
Ethanol und anschließend
mit Wasser gespült
und dann unter einem Strom Stickstoff getrocknet. Diese Plättchen wurden
anschließend
20 Min. lang in eine Mischung aus NHS (100 mM) und EDC (400 mM)
eingetaucht. Sie wurden gründlich
mit Wasser gespült,
anschließend
1 Stunde lang in eine 50 μg/ml
Lösung
monoklonaler Maus-IgG-Antikörper
eingetaucht, die gegen HSV I Glykoprotein D in 10 mM PBS bei pH
7,0 hergestellt wurde. Sie wurden anschließend mit Wasser gespült und 10
Min. lang in eine 1 M Lösung
Ethanolamin bei pH 8,5 eingetaucht. Sie wurden dann gründlich mit
Wasser gespült
und bei 4 °C
in 1 ml PBS gelagert.
-
Die
Anzahl der Viruspartikel/ml in einer mit Ficoll gereinigten Virusstammlösung wurde
mithilfe der Elektronenmikroskopie mit einem inneren Standard von
Latexkugeln bestimmt. Zehnfache Reihenverdünnungen einer HSV gD+ Stammlösung
bei einer Konzentration von 5 × 1010 Viruspartikeln/ml wurden in PBS (10 mM
Na2HPO4/ NaH2PO4, 2,7 mM KCl,
120 mM NaCl, pH 7,4) durchgeführt,
das BSA (0,1 mg/ml) enthielt und bei 4 °C gelagert. Die QCM-Plättchen wurden
dann mit lötfreien
Kontakten in dem Gerät
befestigt und entweder 1 μl
oder 40 μl
von jeder dieser Verdünnungen
wurden auf die Oberfläche
der Plättchen
aufgebracht, die mit dem anti-gD IgG-Antikörper beschichtet waren. Nach
40 Min. wurde die Oberfläche
gründlich
mit Wasser gereinigt, anschließend mit
40 μl PBS
bedeckt und die QCM wurde von 0–10 V
abgetastet.
-
Die
Ergebnisse sind in 6. dargestellt. In 6A ist
Signal (Rausch-Peak nahe 7,5 V) gegen die Anzahl der gD+ Herpes-simplex-Viruspartikel
bei den Proben mit 1 μl
(o) und 40 μl
(⎕) dargestellt; die Reinheit der Linie ist gut. In 6B ist
Rauschen gegen Amplitude für
den gD+- und
gD-- Virus dargestellt. Der gD--Virus,
der keine spezifische Wechselwirkung mit dem Antikörper auf
der Oberfläche
aufweist, zeigt keinen Peak; im Gegensatz dazu zeigt der gD+-Virus einen scharfen Peak nahe 7,5 V.
-
Beispiel 5
-
Für diesen
Bakterienbindungstest wurden QCM-Plättchen wie in Beispiel 4 hergestellt.
E. coli und S. aureus (Laborstämme)
wurden in Hirn-Herz/0,5 % Hefeextrakt-Nährmedium gezüchtet und über Nacht
bei 37 °C
angesetzt. 1 ml Probe jeder Kultur wurde an eine Konzentration von
1010 KBE/ml angeglichen, wie durch optische
Dichte bestimmt, und 2 Min. lang bei 12.000 g zentrifugiert; das
Pellet wurde in sterilem PBS resuspendiert. 10 μl der Bakteriensuspension wurden
auf ein QCM-Plättchen
aufgebracht, das mit einem anti-E. coli IgG-Antikörper auf ähnliche
Weise beschichtet war, wie in Beispiel 4 für den anti-HSV-Antikörper beschrieben.
Nach 40 min. wurde die Oberfläche
gründlich
mit Wasser gereinigt, mit 40 μl
PBS bedeckt und die QCM anschließend von 0–10 V abgetastet.
-
Die
Ergebnisse sind in 7 dargestellt. Die Rauschen/Amplitude-Darstellung
zeigt ein scharfes Signal bei etwa 6 V für E. coli und keins für S. aureus.
-
Beispiel 6
-
In
diesem Beispiel wurde ein Oberflächenwellenelement
verwendet, wie in 9 gezeigt. In diesem Fall wurde
ein einziges Gerät
benutzt (HP8512a, Hewlett Packard), das einen Verstärker (1)
und Empfänger
und Regeleinheit (5) in einem einzigen Gerät verbindet.
Das Gerät
ist auf eine Dauerstrich- und Power Sweep-Betriebsart eingestellt.
Das Oberflächenwellenelement
war das handelsübliche RF1171
von RF Monolitics, Inc. Etwa 100,00 Latexkugeln, 1 μm im Durchmesser,
wurden auf die Oberfläche
des Oberflächenwellenelement
aufgebracht. Das entstandene Spektrum ist in 10 dargestellt. Eine
Zahl von Peaks werden beobachtet, die auf der sauberen Oberfläche nicht
vorhanden sind. Das zeigt, dass ein SAWS-Bauelement eingesetzt werden
kann, um den Aufspaltungsvorgang nachzuweisen. Die verschiedenen
Peaks entsprechen wahrscheinlich Kugelanhäufungen verschiedener Größe auf der
Oberfläche
und damit werden die Peaks an verschiedenen Stellen beobachtet.