ES2226825T3 - Medicion y utilizacion de las interacciones moleculares. - Google Patents
Medicion y utilizacion de las interacciones moleculares.Info
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Abstract
Procedimiento para separar un analito diana de una composición, que comprende las siguientes etapas: (i) poner en contacto la composición con un componente específico de enlace para el analito, siendo inmovilizado el componente específico de enlace en la superficie; y (ii)hacer oscilar la superficie de modo que la amplitud aumenta hasta un valor al cual el analito, u otro componente de la composición, es eliminado de la superficie.
Description
Medición y utilización de las interacciones
moleculares.
La presente invención está relacionada con los
procedimientos utilizados para medir las interacciones moleculares y
para separar, ordenar y medir el tamaño de las partículas. En
particular, la presente invención está relacionada con la medición
de la afinidad entre diferentes componentes específicos de enlace,
por ejemplo, en la interacción
anticuerpo-antígeno.
El reconocimiento molecular específico es un
proceso fundamental, siendo la base de las interacciones
enzima-ligando, anticuerpo-antígeno
y el enlace de las moléculas a los receptores. El reconocimiento
molecular se consigue gracias a interacciones no covalentes tales
como la interacción electrostática (puentes de hidrógeno) e
interacciones hidrofóbicas. Las mediciones termodinámicas de
constantes de enlace y energía libre, y cambios de entalpía y
entropía, ofrecen los elementos para la base molecular del
reconocimiento, especialmente cuando se asocian con información
obtenida por difracción de rayos X y, cuando es posible, mutagénesis
dirigida.
La medición directa de la fuerza de interacción
se ha realizado con microscopía de fuerza atómica (AFM) además del
aparato de fuerza superficial. Aunque la AFM puede medir fuerzas de
ruptura de enlace, la técnica adolece del inconveniente de que
solamente puede realizarse una única medición cada vez. Hasta la
fecha, la AFM ha sido empleada en interacciones
avidina-biotina (Florin et al, Science, 1995;
264:415), en hibridación de ADN (Boland et al, PNAS, 1995;
92:5291), en interacciones anticuerpo-antígeno
(Dammer et al, Biophys. J., 1996; 70:2437) y en
glucoproteínas de adhesión (Dammer et al, Science, 1995;
267:1173).
La separación de las moléculas biológicas
basándose en sus afinidades relativas para ligandos es una técnica
bien conocida. Por ejemplo, en cromatografía de afinidad, los
componentes a separar se introducen en una columna que contiene un
ligando específico. El componente de interés se adhiere
preferentemente y con fuerza a la columna y se ve retenido en dicha
columna mientras los otros componentes son eliminados. El material
que ha quedado unido puede ser extraído de la columna en una etapa
posterior.
Las tecnologías de separación son un parte
importante de muchos experimentos de investigación. Se pretende
poder aumentar la sensibilidad o selectividad de dichas
técnicas.
Kolomenskii et al, J. Appl. Phys., 1998;
84(4):2404-10 dan a conocer estudios de
limpieza y adhesión en superficies realizados empleando impulsos
acústicos superficiales generados con láser. Dichos impulsos se
generaron con un ritmo de repetición bajo (20 Hz) y energía
constante. El procedimiento se efectuó en vacío y, por lo tanto, no
resulta apto para su explotación comercial. Un microscopio óptico
fue empleado para detectar la eliminación de partículas y resultó
imposible distinguir entre las partículas de diferente tamaño.
El documento
WO-A-98/45692 da a conocer la
utilización de un sensor de cristal piezoeléctrico para determinar
la formación/disociación de hidratos de clatrato. Kurosawa et
al, Chem. Pharm. Bull, 1990;
38(5):1117-20, informa de que usaron dicho
sensor para la detección de aglutinación de látex con recubrimiento
de anticuerpo. El documento
WO-A-98/40739 también da a conocer
dicho sensor, comprendiendo una placa en la que las entidades
específicas de enlace son inmovilizadas, con el fin de usarla para
indicar la presencia de células en un medio. Dichos sensores son
utilizados para medir un cambio en la frecuencia de resonancia a
voltaje constante.
Actualmente, cuando es posible, la mayoría de
virus son detectados cultivando el espécimen en células, ya que
dicho procedimiento es sensible a pesar de ser lento. La detección
directa de ADN o ARN víricos en muestras clínicas se puede conseguir
utilizando la PCR y cebadores específicos diseñados para el virus de
interés. Dado que la PCR implica una etapa de amplificación, la
contaminación cruzada es un problema importante y resulta difícil
poder establecer procedimiento s cuantitativos fiables. Otros
procedimientos directos comprenden la microscopía electrónica, la
microscopía electrónica inmune, y procedimiento basados en la
detección del antígeno con anticuerpos enlazados con enzimas. Dichos
procedimiento s resultan a menudo relativamente insensibles y, por
consiguiente, requieren cantidades relativamente grandes de
partículas víricas.
La presente invención está basada en darse cuenta
de que los enlaces entre una molécula diana, o una molécula diana
unida a una partícula, y una superficie, pueden ser separados
mediante la oscilación mecánica de dicha superficie a una amplitud
creciente, produciendo el desprendimiento de la molécula o partícula
diana de la superficie. La aceleración requerida y, por lo tanto la
fuerza, dependerán de múltiples factores, comprendiendo la masa de
la molécula o partícula, la naturaleza del enlace a la superficie y
la forma geométrica o tamaño de la molécula o partícula diana. Por
lo tanto, la presente invención puede utilizarse para separar o
medir diferentes moléculas diana, o detectar su presencia.
Según un primer aspecto de la presente invención,
un procedimiento para separar el analito a determinar de una
composición comprende las siguientes etapas:
- (i)
- poner en contacto la composición con el componente específico de enlace para el analito, encontrándose inmovilizado dicho componente específico de enlace en la superficie; y
- (ii)
- hacer oscilar la superficie de tal modo que la amplitud aumente hasta un valor en que el analito, u otros componentes de la composición, sea eliminado de la superficie
La presente invención puede ser utilizada para
determinar la presencia o tamaño de partículas, o la afinidad entre
componentes específicos de enlace.
La presente invención puede ser aplicada a una
variedad de enlaces físicos y químicos, comprendiendo desde
interacciones relativamente débiles tales como los puentes de
hidrógeno hasta los enlaces covalentes.
El aparato apto para ser utilizado en la presente
invención comprende una superficie que presenta un componente
específico de enlace inmovilizado en la misma; unos medios para
hacer oscilar la superficie con una amplitud creciente; y unos
medios para detectar un fenómeno de disociación.
En particular, el aparato puede comprender un
dispositivo transductor acústico (ATD), por ejemplo, una
microbalanza de cristal de cuarzo (QCM) o un dispositivo de onda
acústica superficial, o cualquier material piezoeléctrico que pueda
hacerse oscilar, por ejemplo, aplicando un voltaje alterno o un
campo magnético. Dichos dispositivos son baratos en comparación con
un AFM y pueden ser empleados en multitarea. Otra ventaja de
utilizar dicho aparato consiste en que la mayoría de los enlaces se
rompen simultáneamente, dando lugar a un sonido detectable y picos
de sonido agudos a aceleraciones específicas (voltaje aplicado al
ATD). Otra ventaja consiste en que el ATD puede ser empleado como
micrófono sensible, para detectar la emisión acústica que se produce
cuando tiene lugar la disociación.
En la mayoría de experimentos previos utilizando
un ATD, se midieron cambios en la frecuencia o fase de resonancia
cuando el ATD es accionado a voltaje constante. En cambio, la
presente invención implica aumentar el voltaje de funcionamiento y
por lo tanto la amplitud de oscilación del ATD.
La presente invención presenta amplias
aplicaciones para la separación, ordenación y medición. Los Ejemplos
ilustran que, en el aire, las esferas marcadas con estreptavidina
pueden ser separadas de las esferas de látex normal empleando una
QCM con una superficie biotinilada y con un voltaje de
funcionamiento superior a 0,1 V pero inferior a 6 V. Las esferas de
látex normal son eliminadas de la superficie, dejando únicamente las
esferas de estreptavidina adheridas a la superficie (debido a un
enlace más fuerte estreptavidina-biotina). Esto abre
un nuevo tipo de ciencia de separación basado en la fuerza variable
que se aplica durante una cierto tiempo, con aplicación, por
ejemplo, en la medición y ordenación de partículas, ordenación de
células, filtrado de fagos así como el diseño de nuevos biosensores.
Dicho procedimiento de separación es de bajo coste y puede ser
empleado fácilmente en multitarea y automatizado. Por ejemplo, es
posible depositar diferentes dianas en diferentes posiciones en la
misma microbalanza y seleccionar una genoteca de ligandos contra
múltiples dianas simultáneamente. La detección y el análisis de
partículas víricas, las cuales presentan un tamaño fijo, es otra
área de aplicación. De manera igualmente importante, la presente
invención proporciona una nueva herramienta, sensible y
potencialmente cuantitativa, para investigar las fuerzas implicadas
en el reconocimiento molecular.
La presente invención emplea un aparato sensor
que puede hacerse oscilar. Se puede hacer oscilar dicho sensor de
diferentes maneras, por ejemplo, utilizando dispositivos de onda
acústica superficial, dispositivos de resonancia con cristal de
cuarzo, dispositivos de modo de placa acústica y de placa flexible
de membrana fina.
Muchos sensores diferentes, adecuados para ser
utilizados en la presente invención, se encuentran disponibles a
partir de diferentes proveedores. Una descripción de sensores que
pueden ser utilizados en la presente invención se encuentra en
Acoustic Wave Sensors, Ballantine et al., (1997) Academic
Press. El sensor es preferentemente un dispositivo de onda acústica
superficial, o de un modo más preferente, una microbalanza de
cristal de cuarzo (QCM).
La QCM es típicamente un disco de cuarzo
cristalino con electrodos de oro en las superficies superior e
inferior. Experimenta una oscilación de cizalladura cuando se aplica
a los electrodos un voltaje alterno, debido al efecto piezoeléctrico
contrario. El aumento del voltaje hace aumentar la amplitud de
oscilación de la QCM.
El cristal de cuarzo también es un micrófono
sensible y puede ser utilizado para detectar una emisión acústica
cuando tiene lugar la ruptura. Técnicamente es más fácil provocar
oscilaciones a una frecuencia correspondiente a una mayor frecuencia
de resonancia, y detectar la emisión acústica cercana a otro modo. A
título de ejemplo, la QCM se hace funcionar a su frecuencia de
resonancia, y la emisión acústica se detecta a su tercer
armónico.
A título ilustrativo, el término "analito"
puede ser empleado para describir la molécula o componente que se
enlaza y que entra en contacto con el componente específico de
enlace inmovilizado en la superficie. Una vez se ha producido el
contacto, el analito se ve unido al sensor debido a una interacción
molecular y sometido a aceleración y, por lo tanto, se ejerce una
fuerza sobre el analito. A medición que aumenta la amplitud de
oscilación, y cuando se llega a una fuerza crítica en particular,
tiene lugar la ruptura del enlace. De este modo, una partícula
analito previamente enlazada se libera y puede moverse en la
superficie.
El analito puede ser cualquier entidad
microscópica capaz de ser retenida en el sensor mediante la
interacción molecular. El analito puede ser una proteína,
anticuerpo, antígeno, enzima, inhibidor enzimático o polinucleótido.
El analito puede ser también una partícula mayor, tal como una
bacteria, célula, virus, prión o fago. Ejemplos posteriores de
partículas especialmente adecuadas para su utilización en la
presente invención comprenden microesferas de cualquier materia, por
ejemplo sílice, oro o látex, o moléculas mayores tales como los
plásmidos. Los componentes específicos de enlace inmovilizados en la
superficie pueden ser del mismo tipo y pueden ser escogidos en
consecuencia, y en función del enlace físico o químico adecuado.
La disociación de analitos menores se detecta
preferentemente con la emisión acústica. Las partículas mayores
pueden ser también detectadas con los medios ópticos, por ejemplo,
con un microscopio.
Según el primer aspecto de esta invención, la
separación se realiza inmovilizando la molécula diana a una
superficie sensora mediante la interacción con el componente
específico de enlace. Entonces, puede hacerse oscilar la superficie
para desorganizar las moléculas que se encuentran en la superficie
del sensor. La oscilación se realiza aumentando de manera constante
la amplitud y, por lo tanto, la aceleración, y puede ser
seleccionada tanto para eliminar la molécula diana de la superficie
como para eliminar otros componentes de la composición de la
superficie, dejando la molécula diana enlazada a dicha superficie.
En una forma de realización preferida, la superficie sensora se hace
oscilar utilizando un dispositivo piezoeléctrico de onda acústica,
por ejemplo, una QCM. El mismo dispositivo piezoeléctrico puede
utilizarse como micrófono para detectar ruido acústico producido
cuando tiene lugar ruptura.
La técnica de separación puede ser aplicada para
seleccionar moléculas que interaccionan fuertemente con un
componente específico de enlace en particular. Por ejemplo, la
técnica puede ser aplicada para seleccionar células con moléculas
receptoras particulares expresadas en la superficie celular, o para
seleccionar anticuerpos con una fuerte afinidad hacia un ligando en
particular.
Los ligandos diferentes pueden ser localizados en
diferentes posiciones de la superficie mediante, por ejemplo,
impresión por contacto o empleando máscaras o fotolitografía.
Entonces es posible seleccionar una composición de múltiples
componentes específicos de enlace fuertemente unidos con distintos
ligandos simultáneamente. En particular, la presente invención puede
ser utilizada con chips que presenten distintos materiales tales
como receptores inmovilizados encima. De un modo más general, los
chips pueden mostrar materiales que permiten hacer pruebas para
diferentes infecciones, patógenos, priones, alérgenos alimentarios,
virus, bacterias, etc., por ejemplo en pruebas clínicas con humanos
y animales, y para un control sanitario de alimentos y agua.
Posteriormente, la presente invención puede utilizarse para
funciones de selección en una genoteca, poner de manifiesto a fagos,
etc.
El segundo aspecto de la presente invención es un
procedimiento para determinar la presencia o tamaño de partículas, o
los niveles de afinidad entre las moléculas. Preferentemente, una
molécula es inmovilizada en la superficie sensora y la otra es
inmovilizada en una partícula, por ejemplo, una microesfera.
Entonces, la partícula se une al sensor por medio de la interacción
molecular que interesa. A continuación, se hacen oscilar las
partículas funcionalizadas aplicando un voltaje al sensor. A
medición que la amplitud de oscilación aumenta, la fuerza alcanza un
valor crítico en el que tiene lugar la rotura del enlace. En este
punto, un ruido característico puede ser detectado utilizando un
amplificador sensible y se puede observar el movimiento de las
partículas, por ejemplo empleando un microscopio óptico. La magnitud
de la señal depende del número de partículas unidas a la superficie
del sensor. Típicamente, si la QCM se utiliza tal como se describe
posteriormente, en el Ejemplo 1, con microesferas fisisorbidas, el
ruido se detecta a 0,1 - 1 V, dependiendo del tamaño de las
microesferas, apareciendo cuando se observa al microscopio cómo las
microesferas se liberan y se deslizan. Puede realizarse un diagrama
del ruido generado con relación a la amplitud (o voltaje aplicado),
al que nos referiremos como espectro de fuerza de ruptura. En el
punto en el que las roturas de los enlaces serán aparentes en el
diagrama, habrá un pico de ruido. Por lo tanto, puede determinarse
el voltaje crítico en el que tiene lugar la rotura del enlace.
Experimentos adecuados de calibrado, empleando partículas de las que
se conoce las densidades y fuerzas de enlace, permiten que dicho
procedimiento sea cuantitativo. Más adelante, la altura del pico de
emisión acústica es una medición del número de partículas
enlazadas.
La presente invención puede ser utilizada para
estudiar cualquier interacción molecular, pero resulta
particularmente adecuada para el estudio de las interacciones
enzima/ligando, interacciones anitcuerpo/antígeno e interacciones
receptor/ligando o una interacción entre una macromolécula grande y
su componente específico de enlace natural. El procedimiento también
puede ser aplicado al estudio de fenómenos de hibridación entre
polinucleótidos. De este modo, en el primer aspecto de la presente
invención, el ligando puede ser, por ejemplo, una proteína, un
anticuerpo o antígeno, un enzima, un enzima inhibidor, un
polinucleótido, o una macromolécula grande tal como un plásmido
grande o un virus. Cualquiera de dichos materiales puede unirse a la
superficie o partícula, en el segundo aspecto de la presente
invención.
Los siguientes Ejemplos ilustran la presente
invención.
En los Ejemplos, para medir las fuerzas de
adhesión entre la superficie y una partícula pequeña se emplea la
espectroscopia de fuerza de ruptura. El efecto se basa en hacer
oscilar una superficie, con micropartículas sobre la misma, a una
amplitud uniformemente creciente y, por lo tanto, aceleración
creciente. Esto se consigue accionar la superficie con un
dispositivo piezoeléctrico de onda acústica, en este caso una
microbalanza de cristal de cuarzo (QCM). A medición que aumenta la
amplitud, la aceleración hace lo mismo y, por lo tanto, la fuerza
ejercida sobre la partícula. La ruptura de todos los enlaces que
unen la partícula a la superficie ocasiona un ruido y el mismo
dispositivo piezoeléctrico puede ser utilizado como micrófono
sensible para detectar dicho ruido, producido cuando tiene lugar la
ruptura. Una representación esquemática del aparato empleado en los
ejemplos del 1 al 5 se ilustra en la Figura 1; una representación
esquemática más general del aparato preferente se ilustra en la
Figura 8.
Más específicamente, la Figura 1 ilustra un
circuito que comprende un transductor piezoeléctrico, 10; un
generador f sinusoidal puro, 11; un generador 3f + \Deltaf, 12; un
filtro 3f + \Deltaf, 13; un amplificador y convertidor analógico a
digital Lock-in, 14; y un ordenador, 15, con
dispositivo de entrada de datos y salida de control señalados con
las flechas. En los Ejemplos del 1 al 5, f = 14,2 MHz y \Deltaf es
82 kHz. Las partículas, 16, se sitúan en la superficie del
sustrato.
La Figura 8 ilustra un transductor piezoeléctrico
21 (del tipo QCM, dispositivo SAW, etc.), y un amplificador de
ganancia variable 22, con entrada 23, y salida 24, capaz de producir
un aumento suave de la amplitud de salida bajo el control de una
señal 25. El circuito también comprende un receptor
paso-banda, 26 (por ejemplo similar a un receptor de
radio SSB), y un convertidor o convertidores de analógico a digital
27, suministrando datos por medio de una conexión, 28. Además, el
circuito comprende un dispositivo controlador, grabador y procesador
señal de datos 29 (por ejemplo un ordenador o un procesador DSP
dedicado). El contacto indicado con una línea discontinua 30, puede
ser remplazado por medios más optimizados de filtrado y
acoplamiento, por ejemplo, puede ser una red L, C, R pasiva.
Cuando se utiliza el circuito ilustrado en la
Figura 8, el amplificador 22, con el transductor, 21, en combinación
con los medios opcionales de filtrado/acoplamiento 30, proporcionan
una red de oscilador simple, oscilando preferentemente a una
frecuencia en la que el transductor es eficaz; para la QCM puede ser
fundamental una frecuencia de resonancia en serie. Dicha frecuencia
de oscilación (F) es, por ejemplo, 14 MHz. La amplitud del voltaje
de funcionamiento en la salida, 24, aumenta suavemente bajo el
control del controlador, 29, mediante la conexión del control, 25.
La señal resultante de la emisión acústica en el punto, 30, puede
ser purificada mediante un filtro/acoplador opcional y entonces
transmitirse a la entrada del receptor paso-banda,
26. La banda de frecuencia del receptor que funciona puede ser
seleccionada siguiendo un criterio de correspondencia entre la
máxima señal y el ruido, por ejemplo, el modo de resonancia
localizado cerca del tercer armónico (3F + \DeltaF), por ejemplo,
42,082 MHz.
Las señales de salida simple o en cuadratura son
convertidas por un conversor o conversores de analógico a digital
27, de alto rango dinámico. Entonces los datos son procesados
digitalmente en el 29, a fin de obtener la señal útil, y
posteriormente grabarla y/o proporcionarla al observador. El
amplificador 22 puede ser equipado adicionalmente con uno o más
filtros de entrada y/o salida, mejorando la señal hasta un índice de
ruido, y también garantizando que el oscilador funcione en las
correctas frecuencia y cambio de fase de corriente a voltaje a
través del transductor.
La Figura 9 ilustra un sensor preferente basado
en el SAW para ser empleado en la presente invención. Comprende unos
medios 31, para generar voltaje RF en la salida, 32, aumentando la
amplitud que hace funcionar los electrodos del transductor, 33. La
disposición de los electrodos 33 se optimiza para generar una alta
amplitud SAW en el piezosustrato 34. La disposición de los
electrodos, 37, se optimiza para la mejor transducción de la emisión
acústica a una señal eléctrica. El diseño puede ser complejo,
comprendiendo uno o más pares de electrodos. El dispositivo
comprende, además, de una unidad de control, 35, para controlar el
generador, 31, mediante una conexión, 36, y para recibir las señales
generadas en una o más entradas, 38, y realizar el proceso de la
señal de los datos, por ejemplo, un análisis de correlación.
Cuando se utiliza el sensor basado en el SAW, el
generador, 31, genera un voltaje RF que es adecuado para
proporcionar una frecuencia de transducción eficaz en la salida, 32,
y éste se transmite a los electrodos transductores generados, 33,
dispuestos en el piezosustrato, 34 (línea punteada). La amplitud del
voltaje RF aumenta con el tiempo bajo el control del controlador,
35, mediante la conexión de control, 36. Los electrodos receptores,
37, transducen la emisión acústica que surge del área activa hacia
la señal eléctrica que se transmite al controlador/receptor, 35, y
la(s) entrada(s), 38. Los datos obtenidos una vez se
ha realizado la conversión de analógico a digital experimentan un
procesamiento de señal con el objetivo de extraer las señales
útiles. Entonces los resultados son finalmente grabados y/o
proporcionados al operador.
Ciertos resultados de los Ejemplos se ilustran en
las Figuras de la 2 a la 7 y en la 10. Las Figuras 2A, 2B, 3A, 3B,
4A, 4B, 4C, 4D, 6B, 7 y 10 son diagramas que relacionan el ruido de
señal (S; unidades arbitrarias) con la amplitud (A; voltios). Las
Figuras 5A, 5B, 6A y 6C son diagramas que relacionan el ruido de
señal con el número de partículas (N).
Se emplean las siguientes abreviaciones:
BSA: Albúmina de suero bovino
LB: Caldo de cultivo Luria
DIC: Cloruro de dimetilaminoisopropil
DMAP: Dimetilaminopiridina
EDC:
1,3-dimetilaminopropil-3-etilcarbodiimida
NHS: N-hidroxisuccinimida
PBS: tampón fosfato salino
Las esferas de látex, de 5 \mum de diámetro, se
sujetaron a la superficie del sensor de la QCM mediante un número
importante de enlaces que nos interesan. La cobertura de la esfera
que se empleó fue un 1% del área de la superficie de la QCM. Las
esferas presentaban solamente un 1% de variación en su diámetro.
El sensor de la QCM comprendía de placas de
cuarzo pulido, de corte transversal acústico a 35º y 8,25 mm de
diámetro. Se depositaron capas de cromo (con un espesor de 20 a 30
nm) y a continuación oro (con un espesor de 100 a 120 nm).
Se estudiaron tres enlaces diferentes en
experimentos realizados en aire: un enlace físico
(látex-oro), un enlace
estreptavidina-biotina y un enlace covalente (enlace
realizado mediante una amida). El enlace físico se realizó
disponiendo las esferas de látex directamente en la superficie del
sensor y secándola en nitrógeno. El enlace
estreptavidina-biotina se realizó aplicando BSA
biotinilada a la superficie y secándola en nitrógeno. El enlace
químico se realizó formando una monocapa de tiol empleando un tiol
de terminación ácida (ácido 12-mercaptododecanoico)
disuelto en etanol; a continuación éste fue activado empleando
EDC-NHS, y las esferas con una terminación de amina
fueron añadidas para formar el enlace amida.
Los experimentos se realizaron en una cámara
equipada con dos ventanas ópticas: una para proporcionar la
iluminación láser de la muestra, y la otra para permitir la
observación de la luz láser dispersa mediante un microscopio óptico.
La QCM fue dispuesta en la cámara. Un generador de señal, Modelo
DS345 (Standford Research Systems), fue empleado para accionar la
QCM. El movimiento y desprendimiento de partículas fue observado
empleando un microscopio óptico Olympus BH-2
equipado con una vídeo cámara CCD Panasonic
WL-SL300. El principal dispositivo de medición fue
un amplificador Lock-in, SR 844 (Standford Research
Systems). La señal de referencia se envió al Lock-in
empleando un segundo generador sincronizado con el primero. Todos
los dispositivos estaban conectados a un ordenador para el control
del experimento y recopilación de los datos.
La figura 2A ilustra el espectro de fuerza de
rotura para la estreptavidina-biotina (1) y el
enlace químico (2); la figura 2B es el espectro para el enlace
físico.
Es posible determinar experimentalmente la fuerza
o el voltaje requerido para romper los enlaces mediante la grabación
de los espectros de fuerza de ruptura. Esto puede ser utilizado para
la separación. Tal como se ilustra en la Figura 2A, si hay una
mezcla de esferas de 5 \mum, alguna de las cuales presenta
estreptavidina en la superficie aunque otras no, entonces aplicando
un voltaje por encima de los 0,1 V pero por debajo de los 6 V, por
ejemplo 1 V, a una QCM con biotina en la superficie, es posible
separar los dos conjuntos de esferas para proporcionar solamente las
esferas marcadas con estreptavidina, en la superficie. Esta técnica
puede emplearse también para detectar esferas marcadas con
estreptavidina ya que solamente dichas esferas se unirían a la
superficie si se la hace oscilar a 1 V.
Para realizar la medición de tipo cuantitativo,
la amplitud de oscilación de la QCM ha sido calculada a diferentes
voltajes, basándose en datos experimentales, permitiendo la
estimación de la fuerza en la microesfera. Dicho cálculo se realizó
midiendo el consumo de energía de la QCM y su factor Q (o factor de
mérito - ancho de banda de la resonancia relativa recíproca =
f/\Deltaf_{resonancia}). La amplitud A viene dada por:
A =
[QP/2\pi^{3}f^{3}M]^{1/2}
en la que Q representa a Q o factor
de mérito, P es la energía eléctrica consumida por la QCM, f
es la frecuencia de resonancia del cristal de cuarzo y M es la masa
efectiva de la placa de cuarzo de la QCM implicada en el movimiento.
Se determinó que el factor Q era de aproximadamente 15.000 a 6 V, lo
que proporciona una estimación de la amplitud vibracional de la QCM
de 60 nm. Por lo tanto la fuerza en la esfera es de 9 \muN. Se
debería comparar dicho valor con la fuerza necesitada para romper un
enlace simple de estreptavidina-biotina de 160
pN^{2} e indica que aproximadamente 60.000 enlaces se rompen
simultáneamente. La estimación indica que esto corresponde al 50% o
más de los enlaces de la estreptavidina-biotina
inicial entre la esfera y la superficie. Esto significa que la
mayoría de los enlaces que unen las esferas a la superficie se
rompen simultáneamente. Esto origina los picos agudos observados en
el espectro de fuerza de ruptura y el ruido detectable cuando se
rompe el
enlace.
El presente ejemplo ilustra que los
procedimientos de la presente invención también pueden realizarse en
solución. El factor Q de la QCM disminuirá debido a la carga
líquida, reduciendo así la amplitud de oscilación a un voltaje en
particular cuando se compara con el aire. Habrá fuerzas de
viscosidad actuando en la microesfera y su masa efectiva aumentará,
debido a la capa asociada de agua, aumentando la fuerza en la
esfera.
La Figura 3 ilustra el espectro de fuerza de
ruptura para esferas de 5 \mum unidas a la superficie mediante la
estreptavidina-biotina (Fig. 3A) y un enlace químico
(Fig. 3B). La ruptura tiene lugar a 1 V y 10 V respectivamente.
Una reducción en el voltaje crítico para el
enlace de la estreptavidina-biotina, por un factor
de seis, de 6 V a 1 V al pasar del aire al agua, y la ruptura del
enlace químico en el agua, indica que este último efecto es
dominante. De este modo, este Ejemplo demuestra claramente que la
ruptura de enlaces y, por lo tanto, la separación y biodetección,
son posibles en agua o en otro líquido.
Suponiendo que la densidad de enlace para los
enlaces de tipo físico, estreptavidina-biotina y
químico es la misma ya que se han utilizado en estos experimentos
microesferas del mismo tamaño, se puede obtener una escala relativa
de fuerza de ruptura. Esta escala es 1:60:600 para los enlaces de
tipo físico: estreptavidina - biotina: químico. Esta escala parece
razonable y demuestra el rango dinámico de este método. Realizando
experimentos adecuados de calibración con densidades de enlace
conocidas, debería ser posible hacer que estas mediciones fueran
cuantitativas.
El presente ejemplo demuestra que es posible la
detección de virus y, en particular, bacteriófagos modificados
genéticamente que presentan una proteína que se enlaza
específicamente con la maltosa unida a la cubierta proteica del fago
pIII, ya que tanto el fago como la interacción con la proteína que
se enlaza específicamente con la maltosa, son bien conocidas y están
disponibles de inmediato. El fago es un virus largo, delgado y
filamentoso que consiste en un cilindro flexible de 1 \mum de
largo y 6 nm de diámetro. El fago modificado genéticamente presenta
además hasta 5 proteínas que se enlazan específicamente con la
maltosa en un extremo del virus y que sirven para la fusión a la
cubierta proteica del fago pIII; ver McCafferty et al,
Nature, 1990, 348:552. Estos fagos pueden ser purificados
específicamente en resina de amilosa.
Una fusión de la proteína que se enlaza
específicamente con la maltosa al extremo amino de la indol glicerol
fosfato sintasa se presentó en la superficie del fago fd como fusión
al extremo amino de la proteína de la cubierta codificada por el gen
III. Con este propósito, un vector del fago fd, pJB113, fue
construido; dicho vector codificaba una fusión genética entre
MalE (E. Coli), trpC (E. Coli) y el gen III. Dicho
vector del fago llevaba un marcador de la resistencia a la
tetraciclina. El fago competidor inmodificado era el fago helper VCS
M13 K07 (Stratagene) llevando un marcador de resistencia a la
kanamicina.
Se obtuvieron concentraciones de bacteriófagos de
1 x 10^{12} cfu/ml infectando 3 ml a media fase logarítmica
cultivo LB de la cepa de Escherichia coli TG1 con un stock de
10 \mul de fago. Tras 2 horas de agitación (250 rpm) a 37ºC, 1 ml
del cultivo fue inoculado en 100 ml LB y agitado a 350 rpm 37ºC
durante una hora. Se añadió tetraciclina (10 \mug/ml) o kanamicina
(50 \mug/ml) al cultivo de pJB113 o al de VCS, respectivamente,
los cuales se hacían crecer por la noche a 30ºC a 250 rpm. Se hizo
sedimentar las bacterias (15 min., 4,1 krpm) y los fagos
precipitados del sobrenadante mediante la adición de NaCl y PEG6000
hasta concentraciones finales de 0,5 M y 4% (v/v) respectivamente.
Después de permanecer durante 1 hora en hielo, los fagos fueron
recuperados por centrifugación (30 min., 4,1 kprm) y el sedimento
de los fagos fue resuspendido en 1 ml de H_{2}O y conservado a
4ºC.
Se disolvió almidón soluble (500 mg, 0,01 mmol, 1
eq.) en DMF (10 ml) y se agitó durante 5 minutos (parcialmente
soluble). Se añadió DIC (7,8 \mul, 6,3 mg, 0,05 mmol, 5 eq.) y
DMAP (cat.) al ácido 11-mercaptododecanoico (11,5
mg, 0,05 mmol, 5 eq.) en DMF (0,5 ml) y esta solución se añadió a
la solución de almidón. Se dejó que se desarrollase la reacción en
el agitador a temperatura ambiente durante la noche. Entonces la
reacción se purificó empleando una célula de agitación con una
membrana de 10.000 MW como máximo, aclarando la solución con agua
milliQ (6 veces 50 ml) y un proceso de concentración; a continuación
se liofilizó durante la noche.
La superficie estaba preparada empleando el
almidón modificado que contenía un grupo tiol de modo que podía
adherirse químicamente a la superficie. La QCM (preparada del mismo
modo del Ejemplo 1) se colocó en una solución de almidón en metanol
(1 \mug por ml) durante 12 horas. Entonces se lavaron y secaron
las muestras con un chorro de nitrógeno. Los virus de la solución se
depositaron en la superficie y se secaron a temperatura ambiente
para los experimentos en el aire. Se prepararon diferentes
concentraciones de virus mediante dilución. Para realizar los
experimentos con la maltosa bloqueando la proteína que se enlaza
específicamente con la maltosa, se añadieron 10 nM de maltosa a la
solución fagos.
De este modo la superficie de la QCM fue
revestida con una capa de almidón soluble de patata (que contenía
polímeros ramificados de maltosa), químicamente unido a la
superficie de oro mediante un enlace sulfuro-oro. Se
realizaron experimentos tanto en aire como en agua.
La Figura 4A ilustra el espectro de fuerza de
ruptura obtenido en agua para una mezcla equitativa de fagos que se
enlazan específicamente con la maltosa (-) y fagos inmodificados
(...) obteniéndose la lectura después de 500 segundos. Hay
aproximadamente 500 millones da cada tipo de fago en la superficie
del electrodo de oro. Para los fagos inmodificados y, por lo tanto,
enlazados de un modo no específico, se detectó un pico de rotura a
12 V. Los picos de rotura correspondiente a los fagos que se enlazan
específicamente con la maltosa fueron detectados alrededor de 9 V y
además, con mayor intensidad que los fagos con enlaces no
específicos debido a la mayor cantidad de energía liberada en la
rotura del enlace. En el aire, a 10 V no se observaron picos
producidos por los fagos que se enlazan específicamente con la
maltosa enlazados de modo específico; la Figura 4B ilustra los datos
en aire para solamente los fagos enlazados de modo no específico. El
pico tiene lugar a 7,5 V, un aumento de aproximadamente 6 respecto
el pico obtenido en agua. Una segunda lectura (...) no presenta
prácticamente picos, indicando esto que los fagos han sido
eliminados de la superficie. Dicho comportamiento nos confirma que
las fuerzas adicionales de fricción viscosa y el aumento en masa
efectiva de la partícula hacen más fácil la ruptura de los enlaces
entre las partículas de fago y la superficie en agua que en
aire.
La agudeza de los picos en el espectro de fuerza
de ruptura está aparentemente relacionada con la observación de que
la ruptura de los enlaces tiene lugar a un voltaje límite; esto
ocasiona la producción del ruido acústico en un periodo corto de
tiempo y, por lo tanto, convierte el procedimiento en muy sensible.
Además, la señal que proviene de los fagos que se enlazan
específicamente está bien separada de la que proviene de los fagos
que se enlazan no específicamente y se presenta con una mayor
amplitud, lo cual significa que la adsorción no específica no afecta
la medición de la adsorción específica. Se requiere una fuerza mucho
mayor para romper la interacción específica entre las proteínas que
se enlazan específicamente con la maltosa que presenta el fago y la
superficie revestida con almidón si se compara con la requerida para
romper las interacciones no específicas entre el fago inmodificado y
la superficie.
La Figura 4C ilustra el resultado de un
experimento de control realizado en aire con los fagos que se
enlazan específicamente con la maltosa cuando se bloquea con maltosa
la zona de enlace y entonces los fagos se depositan en la QCM en el
centro (diagrama superior) o sobre la superficie entera (diagrama
inferior); se trata de un comportamiento similar al del de los fagos
inmodificados, confirmando que la diferencia es debida a dichas
interacciones específicas. La Figura 4D ilustra el espectro de
fuerza de ruptura en agua solamente con 1.000 fagos en la
superficie, e indica que el suceso de la ruptura es aún detectable.
Se produce un pequeño cambio en la posición del pico debido a
cambios menores en la Q o factor de calidad de la QCM, como
resultado del cambio en la carga.
Los datos también sugieren que debería ser
posible separar los fagos enlazados no específicamente de los fagos
que se enlazan específicamente a la maltosa accionando la QCM a un
voltaje superior al necesario para romper los enlaces de los fagos
no específicos pero inferior al necesario para los fagos que se
enlazan específicamente con la maltosa. Esto sugiere una manera
alternativa de seleccionar genotecas de fagos para enlaces, en la
que la afinidad de enlace del fago que permanece en la superficie
está controlada mediante el control del valor del voltaje aplicado y
el tiempo durante el cual es aplicado, siempre y cuando el fago
permanezca viable.
Para determinar la sensibilidad del
procedimiento, se realizó un experimento de dilución, con el fago
que se enlaza específicamente en agua. La Figura 5A ilustra (para
los picos de ruido más intensos cercanos a 9 V) que la energía de la
señal se comporta de modo lineal respecto el número de fagos por
encima de al menos cinco órdenes de magnitud y que la presencia de
aproximadamente 200 fagos en la QCM puede ser detectada con un 99%
de probabilidad. La Figura 5B ilustra una curva similar para los
fagos que se enlazan de modo no específico en el aire, indicando una
sensibilidad de detección de 100 fagos con el 99% de probabilidad.
El número de fagos que se enlazan específicamente con la maltosa en
la superficie a baja dilución fue confirmado mediante la formación
de imágenes directas utilizando una AFM.
El presente ejemplo ilustra que el número de
fagos en la superficie de la QCM puede ser detectado. A diferencia
de cuando se utiliza la PCR, el número de copias de ADN vírico es
detectado en la solución. Si se supone que todas las partículas
víricas en la muestra de la solución se unirán a la superficie, lo
cual ocurrirá si hay tanto una interacción fuerte
virus-superficie como si se permite que la solución
se evapore dejando los virus en la superficie, entonces es posible
una comparación directa de sensibilidad. La sensibilidad de la PCR
es de alrededor de 100 copias de ADN vírico por ml. Esto es
comparable a la sensibilidad de detección para el fago, mediante el
presente Ejemplo (el cual no está optimizado). Puede mejorarse el
sistema electrónico y hoy se puede mejorar aún más la sensibilidad,
posiblemente en un orden de magnitud como mínimo. Por ejemplo, en
dichos experimentos, los fagos fueron depositados uniformemente
sobre la superficie de la QCM. No obstante, tanto la amplitud como
la sensibilidad de la QCM presentan una dependencia espacial lo cual
significa que la señal dominante proviene del centro de la QCM (tal
como se representa en la Figura 4C). Esto significa que si los fagos
son depositados en el centro de la QCM, podrán registrarse un número
menor de picos y, por lo tanto, más intensos, obteniendo una mejora
en la sensibilidad.
El presente procedimiento puede ser desarrollado
directamente para la detección de virus humanos mediante el uso de
anticuerpos específicos contra los virus unidos a la superficie de
la QCM. Dichos anticuerpos forman interacciones específicas entre
los virus unidos a la superficie QCM. Dichos anticuerpos forman
interacciones específicas entre los virus a la superficie que pueden
ser separadas a una aceleración de la superficie en particular. La
adsorción no específica de partículas de tamaño similar o más
grandes presentes en la muestra ocasionará la aparición de picos a
bajo voltaje, tal como ha sido presentado ahora, y esto no debería
afectar el análisis a pesar de que la adsorción por macromoléculas
en la superficie puede reducir el número de anticuerpos disponible
para enlazar con el virus. Los virus más comunes presentan una mayor
masa efectiva que los fagos empleados en este Ejemplo aunque el
número y fuerza de las interacciones específicas con la superficie
serán distintos. Esto significa que el voltaje requerido debería ser
de una magnitud similar o menor.
El presente Ejemplo ilustra cómo la
espectroscopia de fuerza de ruptura no requiere ninguna etapa de
amplificación, es cuantitativa, y tiene el potencial de ser
inmediata y de bajo coste. Esto podría permitir un diagnóstico
rápido de infecciones víricas en muchas situaciones incluyendo el
caso de pacientes en un ambiente hospitalario o el de plantas y
animales en agricultura.
El presente Ejemplo ilustra un experimento de
enlace para virus. Para dicho experimento, se desarrollaron chips de
cristal de cuarzo para la microbalanza a partir de placas de cuarzo
pulido AT, cortadas en un ángulo de 35º (HyQ, Cambridge, R.U.) y
fueron revestidos en un depositador de vapor Edwards con una capa de
adhesión de cromo de 30 nm de espesor y posteriormente una capa de
oro de 200 nm como se determinó a partir del calibrado de la
conductancia eléctrica. A continuación, dichos chips fueron
sumergidos en una solución de 1 mM de ácido mercaptododecanoico en
etanol de grado espectroscópico durante 18 h, lavado exhaustivamente
con etanol y a continuación con agua, y posteriormente secado con un
chorro de nitrógeno. A continuación, dichos chips fueron sumergidos
en una mezcla de NHS (100 mM) y EDC (400 mM) durante 20 minutos. Se
lavaron exhaustivamente con agua y entonces fueron sumergidos
durante 1 h en una solución de 50 \mug/ml de anticuerpos IgG
monoclonales de ratón que actúan contra la glucoproteína D del HSV I
en 10 mM PBS a pH 7,0. A continuación fueron lavados con agua y
sumergidos durante 10 minutos en una solución 1M de etanolamina a pH
8,5. Entonces fueron lavados exhaustivamente con agua y conservados
a 4ºC en 1 ml de PBS.
El número de partículas víricas/ml en una
solución Ficoll-purificada de una reserva de virus
fue determinado empleando un microscopio electrónico con estándar
interno de esferas de látex. Se prepararon soluciones seriadas
decuplicadas de una solución de una reserva de HSV gD^{+} a una
concentración de 5 x 10^{10} partículas víricas/ml en PBS (10 mM
Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4}, 2,7 mM KCl, 120 mM NaCl, pH
7,4) conteniendo BSA (0,1 mg/ml) y conservadas a 4ºC. Entonces se
montaron los chips de la QCM en el instrumento con contactos sin
soldadura y tanto 1 \mul como 40 \mul de cada una de dichas
diluciones se colocó encima de la superficie del chip revestida con
el anticuerpo IgG anti-gD. Después de 40 minutos la
superficie fue lavada a fondo con agua y posteriormente cubierta con
40 \mul de PBS y la QCM sometida a un voltaje de 0 a 10 V.
Los resultados se ilustran en la Figura 6. La
Figura 6A es un diagrama de la señal (el pico de ruido cercano a los
7,5 V) en relación con el número de partículas de virus de herpes
simplex gD^{+} para muestras de 1 \mul (o) y 40 \mul
(\oblong). La pureza de la línea es buena. La Figura 6B es un
diagrama del ruido en relación con la amplitud para el virus
gD^{+} y el virus gD^{-}. El virus gD^{-}, que no tiene
interacción específica con el anticuerpo en la superficie, no
produce ningún pico; en cambio, el virus gD^{+} presenta un pico
agudo cerca de los 7,5 V.
Para el presente experimento de enlace
bacteriano, los chips de la QCM fueron preparados del mismo modo que
en el Ejemplo 4. Se cultivaron E. Coli y S. Aureus
(cepas de laboratorio) en caldo de cultivo de cerebro y corazón/0,5%
de extracto de levadura e incubado durante la noche a 37ºC. Una
muestra de 1 ml de cada cultivo fue ajustada a una concentración de
10^{10} cfu/ml tal como se determinó por densidad óptica, y
centrifugada a 12.000 g durante 2 minutos; el sedimento fue
resuspendido en PBS estéril. 10 \mul de la suspensión bacteriana
se colocó encima de un chip de la QCM revestido con anticuerpos IgG
anti-E. Coli de un modo similar al que ha sido presentado en
el Ejemplo 4 para el anticuerpo anti-HSV. Después de
40 minutos, la superficie se lavó a fondo con agua y posteriormente
cubierta con 40 \mul de PBS y la QCM sometida a un voltaje de 0 a
10 V.
Los resultados se ilustran en la Figura 7. El
diagrama de ruido/amplitud presenta una señal aguda hacia los 6 V
para la E. Coli y ninguna para el S. Aureus.
En el presente ejemplo, se empleó un dispositivo
SAW, tal como se ilustra en la Figura 9. En este caso, se usó un
único instrumento (HP8512a, Hewlett Packard) el cual combina un
amplificador y receptor y controlador en un único instrumento. Dicho
instrumento se pone en modo "Continous Wave and Power Sweep".
El dispositivo SAW empleado fue el RF1171 de RF Monolitics, Inc.,
disponible comercialmente. Alrededor de 100,00 esferas de látex, de
1 \mum de diámetro, fueron depositadas en la superficie del
dispositivo SAW. El espectro resultante se proporciona en la Figura
10. Se observa un número de picos que no se presentan en la
superficie limpia. Esto demuestra que un dispositivo SAW puede ser
utilizado para detectar las rupturas. Los diferentes picos
probablemente corresponden a grupos de esferas en la superficie de
diferentes tamaños y, por lo tanto, los picos se observan en
posiciones distintas.
Claims (27)
1. Procedimiento para separar un analito diana de
una composición, que comprende las siguientes etapas:
- (i)
- poner en contacto la composición con un componente específico de enlace para el analito, siendo inmovilizado el componente específico de enlace en la superficie; y
- (ii)
- hacer oscilar la superficie de modo que la amplitud aumenta hasta un valor al cual el analito, u otro componente de la composición, es eliminado de la superficie.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que el analito u otro componente es selectivamente eliminado y
separado.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que se detecta la eliminación del analito de otro componente.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, para
determinar la afinidad entre los componentes específicos de enlace,
o la propiedad de uno de los componentes específicos de enlace
dependiendo de la afinidad.
5. Procedimiento según la reivindicación 3, para
determinar la fuerza de enlace entre los componentes específicos de
enlace.
6. Procedimiento según la reivindicación 3, para
determinar la presencia del otro componente específico de
enlace.
7. Procedimiento según la reivindicación 3, en el
que el otro componente específico de enlace es una partícula o se
encuentra inmovilizado a ella.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, para
determinar el tamaño o presencia de la partícula.
9. Procedimiento según las reivindicaciones 3 a
8, en el que el suceso de la disociación es detectado por medio de
una emisión acústica.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que se hace oscilar la superficie a una frecuencia
correspondiente a una mayor frecuencia de resonancia, y la emisión
acústica es detectada en la proximidad de otra frecuencia de
resonancia.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que la superficie forma parte de una microbalanza de cristal de
cuarzo (QCM), haciéndose oscilar la QCM accionándola a su frecuencia
de resonancia fundamental y la QCM detecta la emisión acústica en un
valor próximo al triple del fundamental.
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el compuesto específico de
enlace, o ambos, es una proteína, anticuerpo, antígeno, enzima,
inhibidor enzimático o polinucleótido.
13. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a
11, en el que el compuesto específico de enlace, o ambos, es una
célula, bacteria, virus, prión o fago.
14. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que diferentes compuestos
específicos de enlace son inmovilizados en distintas posiciones en
la superficie.
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la superficie forma parte de
un transductor piezoeléctrico o un transductor acústico.
16. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que el transductor es una microbalanza de cristal de cuarzo o un
dispositivo de onda acústica superficial.
17. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que se desarrolla en un líquido.
18. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a
16, que se desarrolla en el aire.
19. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que se hace oscilar la superficie
en el plano de la superficie.
20. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (ii) comprende la
oscilación de la superficie a una amplitud que aumenta de manera
monótona.
21. Aparato para detectar la disociación de
compuestos específicos de enlace que comprende:
un dispositivo transductor acústico que incluye
una superficie que presenta uno de los componentes específicos de
enlace inmovilizado a la misma;
un oscilador, para oscilar la superficie a una
amplitud creciente en el plano de la superficie; y
un detector, para detectar un cambio de amplitud
de la otra oscilación simultánea, causada por el suceso de
disociación.
22. Aparato según la reivindicación 21, en el que
el detector detecta emisiones acústicas.
23. Aparato según las reivindicaciones 21 ó 22,
en el que el componente específico de enlace inmovilizado es una
proteína, anticuerpo, antígeno, enzima, inhibidor enzimático o
polinucleótido.
24. Aparato según las reivindicaciones 21 ó 22,
en el que el componente específico de enlace inmovilizado es una
célula, bacteria, virus, prión o fago.
25. Aparato según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 24, en el que los diferentes componentes
específicos de enlace son inmovilizados en distintas posiciones de
la superficie.
26. Aparato según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 25, en el que los medios del oscilador y del
detector comprenden un transductor piezoeléctrico y un transductor
acústico.
27. Aparato según la reivindicación 26, en el que
el transductor es una microbalanza de cristal de cuarzo o un
dispositivo de onda acústica superficial.
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