CN1142435C - 分子相互作用的测量及应用 - Google Patents

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Abstract

确定结合对之间的亲和力，或确定取决于该亲和力的结合对的性能的方法，包括以下步骤：(i)使结合对接触，结合对之一被固定在一个表面上；(ii)振荡该表面使振荡振幅增加到该结合对相分离的值；以及(iii)检测分离现象。可使用类似的方法从组合物中分离出靶分析物。用于确定结合对之间的亲和力的装置，包括：具有固定在其上的结合对(16)的表面(10)；用于以增加的振幅振荡表面的装置；以及用于检测分离过程的装置(14，15)。

Description

分子相互作用的测量及应用
技术领域
本发明涉及分子相互作用的测量和分离，分类及测量粒子尺寸大小的方法。特别是，本发明涉及不同结合对之间，例如抗体-抗原之间相互作用的亲和力的测量。
背景技术
特定分子识别是一种基本方法，为酶-配体相互作用，抗体-抗原相互作用和分子到受体的结合的基础。分子识别是通过非-共价键相互作用，例如静电相互作用(氢键)和疏水性相互作用而实现的。结合常数和自由能，焓变和熵变的热动力测量提供了分子识别基础的理解，特别是在连同X-射线衍射的信息，和连同可能的定位诱变的信息时，更是如此。
已用原子力显微镜(AFM)和表面力装置进行了相互作用力的直接测量。尽管AFM能够测量键断裂力，但是该技术具有一次只能进行一种测量的缺点。目前，AFM已在抗生物素蛋白-生物素相互作用(Forin等人，科学，1995；264：415)，DNA杂化(Boland等人，PNAS，1995；95：5291)，抗体-抗原相互作用(Dammer等人，Biophys.J.，1996；70：2437)和附着糖蛋白(Dammer等人，科学，1995；267：1173)上应用。
在生物分子相对于配体的相对亲和力的基础上对其进行分离是一项公认的技术。例如，在亲和力色谱法中，要被分离的成分通过一个盛有特定配体的圆柱。所关心的成分优选并牢固地结合到圆柱上并保留于此，而其他成分被除去。被结合的物质可在随后的步骤中洗提出。
分离技术是许多研究实验的重要部分。增加这些技术的灵敏性和选择性是所需的。
Kolomenskii等人在应用物理1998；84(4)：2404-10的文章公开了使用激光产生的表面声音脉冲实施的表面清洁和附着研究。脉冲是处于低重复频率(20Hz)和恒定能量的。这个程序是在真空中实施的，因此并不适合于商业利用。光学显微镜被用于检测粒子的除去，但不可能区别不同尺寸的粒子。
WO-A-98/45692公开了压电晶体传感器的使用，用于确定笼形水合物的形成/分解。Kurosawa等人在Chem.Pharm.Bull，1990；38(5)：1117-20中的文章报道了使用所述传感器用于检测含有抗体的乳胶的凝聚。WO-A-98/40739也公开了所述的传感器，其包括一块平板，在该平板上固定特定的结合实体，用于指示介质中细胞的存在。通过测量处于恒定电压的响应频率的变化应用这些传感器。
目前，只要有可能，大多数的病毒是通过在细胞中培养样品检测的，这是由于该方法比较灵敏，尽管它比较耗时。在临床样品中的病毒性DNA或RNA的直接检测可通过使用PCR和为所关心的病毒特制的特定引物而完成。由于PCR涉及放大步骤，交叉污染是一个主要的问题并且难以建立可靠定量方法。其他直接方法包括电子显微镜术，免疫电子显微镜术，和以具有酶连接抗体的抗原检测为基础的方法。这些方法灵敏性通常相对较差，因此需要大量的病毒颗粒。
发明内容
本发明是建立在实现靶分子(target molecule)，或附着于颗粒的靶分子和表面之间的结合基础上的，该结合可以以增加的振幅机械振荡表面而破裂，导致靶分子或颗粒从该表面上脱离。所需的加速度和由此所需的力将取决于多种因素，包括分子或颗粒的质量，与表面结合的本质，和靶分子或颗粒的几何形状或尺寸。因此本发明可被用于不同靶分子的分离或大小测量，或检测它们的存在。
根据本发明的第一方面，一种从组合物中分离靶分析物的方法，包括以下步骤：
(i)以分析物的一个结合对(binding partner)接触组合物，该结合对被固定在一个表面上；以及
(ii)振荡该表面，以使振荡振幅增加到从该表面上选择性地除去分析物或组合物的其他成分的值。
另外，本发明可被用于一种确定颗粒存在或尺寸，或结合对之间的亲和力的方法中。根据本发明的第二方面，一种测量结合对之间的亲和力，或依据该亲和力确定结合对的性能的方法，包括以下步骤：
(i)使结合对接触，结合对之一被固定在一个表面上；
(ii)振荡该表面使振荡振幅增加到该结合对相分离的值；以及
(iii)检测分离现象。
在第二方面，本发明可被应用于各种物理和化学键，范围从诸如氢键的相对较弱相互作用到共价键。
根据本发明用于确定结合对之间亲和力的装置，包括：一个表面，具有固定在其上的一个结合对；一个振荡器，以增加的振幅振荡该表面；以及一个检测器，用于检测声发射。
用于确定结合对之间亲和力的装置，包括：一个表面，具有固定在其上的一个结合对；一个振荡器，在该表面的平面内以增加的振幅振荡该表面；以及一个检测器，用于检测分离现象。
特别是，该装置可包括声转换器件(ATD)，例如石英晶体微量天平(QCM)或表面声波器件，或诸如通过施加交变电压或磁场可用于振荡的任何压电材料。与AFM相比这些是便宜的设备并且是多元的。使用所述装置的另一优点为多数的键同时断开，产生可检测的声音和在特定加速度的尖噪声峰(施加电压到ATD)。另一优点为ATD可被用作灵敏的传声器，以检测分离过程发生时的声发射。
在使用ATD的大多数现有技术实验中，在以恒定电压驱动ATD时已测量响应频率或相位中的变化。相反，本发明包括增加ATD的驱动电压和由此的振荡振幅。
本发明对于分离，分类和测量尺寸具有广泛的应用。实例表明，在空气中，使用具有biotinylated表面和高于0.1V但低于6V驱动电压的QCM，标记为抗生蛋白链菌素的球体可从常态的乳胶球体中分离出来。常态的乳胶球体从表面上除去，只留下附着于该表面的标记为抗生蛋白链菌素的球体(以强的抗生蛋白链菌素-生物素键)。这就开辟了一种以施加特定时间长度的可变力为基础的新型分离科学及应用，例如，用于粒子尺寸测量和分类，细胞分类，噬菌体的摄全景(panning)以及新型生物传感器的设计。所述的分离方法是低成本的，并且可容易地实现多元化和自动化。例如，可能在相同的微量天平的不同位置上沉积不同的靶并且同时从多个靶中筛选配体库。固定尺寸的病毒粒子的检测和分析是该应用的另一范围。本发明同等重要地提供一种新型，敏感的和可能定量的工具，以探索涉及分子识别中的力。
附图说明
图1示出了本发明实例1-5的装置的示意图。
图2-7示出了来自实施例的某些结果。图2A，2B，3A，3B，4A，4B，4C，4D，6B，7是信噪(S；任意单位)对振幅(A；伏特)的图表。图5A，5B，6A是信噪对颗粒数量(N)的图表。
图8示出了本发明优选装置的一般性示意图。
图9示出了本发明使用的优选基于SAW的传感器。
图10示出了来自实施例的某些结果，它是信噪(S；任意单位)对振幅(A；伏特)的图表
具体实施方式
本发明使用可进行振荡的传感器装置。该传感器可以多种方式进行振荡，例如，通过使用表面声波器件，共振石英晶体器件，声板模式和薄膜弯曲板器件。
适合用于本发明的许多不同的传感器是从商业来源得到的。可用于本发明的传感器的描述包含在Ballantine等人(1997)Academic Press的声波传感器中。该传感器优选为表面声波器件，或更优选为石英晶体微量天平(QCM)。
QCM典型为在上下表面具有金电极的晶体石英的圆盘。当交变电压施加到电极上时，由于逆压电效应，它经历剪切振荡作用，。增加该电压增加了QCM振荡的振幅。
石英晶体也是灵敏的传声器，并可被用于检测由破裂过程造成的声发射。在技术上激励处于与主共振频率对应的频率的振荡，和检测靠近另一模式的声发射是比较容易的。例如，QCM以其共振频率驱动，声发射在其第三谐波处检测。
为了说明，术语“分析物”可被用于描述结合对或与固定在表面上的结合对相接触的成分。接触之后，凭借分子间的相互作用分析物被束缚在传感器上并受到加速，因此一种力被施加到分析物上。随着振荡的振幅增加，在特定的临界力上，发生键的破裂。因此先前结合的分析物粒子在表面上自由滚动。
分析物可为凭借分子间相互作用能够保持在传感器上的任何微观实体。分析物可为蛋白质，抗体，抗原，酶，酶抑制剂或多核苷酸。分析物也可为大颗粒，例如细菌，细胞，病毒，蛋白感染素或噬菌体。特别适用于本发明颗粒的其他例子包括任何材料的微球体，例如，硅，金或乳胶，或诸如质粒的高分子。表面固定的结合对可为相同的类型，因此可依靠适当的物理或化学键加以选择。
较小分析物的分离优选以声发射检测。较大颗粒也可被光学装置，例如显微镜检测。
在本发明的第一方面，分离是凭借与结合对的相互作用将靶分子固定在传感器表面上执行的。然后振荡该表面以分裂传感器表面上的分子。振荡是通过稳定增加振幅和由此的加速度执行的，并可选择或者从表面上除去靶分子，或者从表面上除去组合物的其他成分，留下结合在表面上的靶分子。在优选实施方案中，传感器表面是通过使用压电声波器件，例如QCM振荡的。相同的压电器件可被用作传声器以检测由破裂过程产生的音响噪声。
可应用分离技术选择与特定结合对强相互作用的分子。例如，该技术可被用于选择具有表示在细胞表面的特殊受体分子的细胞，或者用于选择与特定配体具有强亲和力的抗体。
不同的配体可通过例如接触晒印或掩模的使用或光刻固定在表面的不同位置上。然后可能同时筛选几种强结合对和几种不同配体的混合物。特别是，本发明可和芯片(chip)一起使用，该芯片具有不同的材料，诸如固定在其上的受体。一般地说，芯片可显示其允许对不同传染，病原体，蛋白感染素，食物过敏原，病毒，细菌等进行检验的材料，例如在人和动物的临床检验，食物和水的卫生检测中。而且，本发明可被用于库筛选，噬菌体显示等。
本发明的第二方面为确定颗粒存在或大小，或分子间的亲和力程度的方法。优选地，一种分子被固定在传感器表面另一种分子被固定于一种颗粒上，例如微球体。然后凭借所关心的分子间的相互作用颗粒被附着于传感器上。然后通过对传感器施加电压振荡功能颗粒。随着振荡振幅的增加，力达到键破裂发生的临界值。这时，通过使用灵敏的放大器可检测特征噪声，并且例如在光学显微镜下可观测到颗粒的运动。信号的大小取决于束缚在传感器表面上的颗粒的数量。典型地，如果使用如在实例1中描述的QCM和物理吸附的微球体，在0.1-1V检测噪声，取决于微球体的大小，当在显微镜下观测微球体正在滑动和消失时开始发生。可绘制产生的噪声对振幅(或施加电压)的图表，其被称作破裂力光谱。从图表上可明显看出键破裂的点，在该点上为噪声峰值。因此，可确定键破裂的临界电压。使用具有已知键密度和键能的颗粒的合适标定实验允许这种方法定量进行。此外，声发射峰的高度是束缚颗粒数量的量度。
本发明可被用于研究任何的分子间相互作用，但特别适合研究酶/配体相互作用，抗体/抗原相互作用和受体/配体相互作用或高分子及其自然结合对间的相互作用。该方法也可被用于研究多核苷酸的杂化现象。因此，在本发明的第一方面，例如配体可为蛋白质，抗体或抗原，酶，酶抑制剂，多核苷酸或诸如大质体或病毒的高分子。在本发明的第二方面，任何一种材料可被束缚在表面或颗粒上。
下面的实例阐明本发明。
在实例中，断裂力光谱被用于测量表面和小颗粒间的粘合力。这种效果是以单调增加的振幅和由此增加的加速度振荡微颗粒在其上的表面为基础的。这是用压电声波器件驱动表面得到的，在这种情况下为石英晶体微量天平(QCM)。随着振幅的增加，加速度和由此施加在颗粒上的力也增加。颗粒附着于表面的键的断裂导致音响噪声并且相同的压电器件被用作灵敏传声器以检测由破裂过程产生的噪声。用于实例1至5的装置的略图显示在图1中；优选装置的一般略图显示在图8中。
特别是，图1示出了一种电路，包括压电转换器10，纯正弦曲线发生器11，3f+Δf发生器12，3f+Δf过滤器13，同步放大器和模拟数字转换器14和计算机15，其具有以箭头示出的数据输入和控制输出。在实例1-5中，f＝14.2MHz，Δf为82KHz。颗粒16被放置在衬底表面上。
图8示出了压电转换器21(例如QCM，SAW器件等)，和可变增益放大器22，其具有输入23和输出24，在信号25的控制下能够平稳传送升高的输出振幅。该电路也包括带通接收器26(例如相似于SSB收音机接收器)，通过链28提供数据的一个或几个模拟数字转换器27。而且，该电路包括控制器，记录和数据信号处理器件29(例如计算机或专门的DSP处理器)。以虚线30指示的接点可被更优化的过滤和耦合装置取代，例如可为无源L，C，R网络。
在使用图8的电路时，放大器22和转换器21，连同任选的过滤/耦合装置30，提供一种简单的振荡器网络，优选以转换器最有效率的频率振荡；对于QCM其可为基系共振频率。例如，振荡频率(F)为14MHz。在控制器29凭借控制链接25的控制下在输出24上的驱动电压的振幅平稳上升。在点30的声发射浮起信号可通过任选的过滤器/偶合器纯化，然后被馈送到带通接收器26的输入中。可通过最大的信号噪声标准，例如靠近例如42.082MHz的第三谐波(3*F+Δf)的谐振模，可选择工作的接收器频率频带。
单或正交输出信号被高动态范围的一个或几个模拟数字转换器27转换。然后，在29数据被进一步数字处理，以提取出有用的信号，然后被记录和/或呈现给观测者。放大器22可另外装配有无源输出和/或输入过滤器，以提高信噪比，而且保证振荡器在正确的频率和通过转换器的电流至电压的相位移下工作。
图9描述了本发明使用的优选基于SAW的传感器。其包括装置31，用于产生输出32处具有增加的振幅的RF电压，其驱动转换器电极33。电极装置33被优化，用于产生压电衬底34处的高振幅SAW。电极装置37被优化，用于声发射最好地转换为电信号。该图案可能是复杂的，包括一对或多对电极。器件还包括控制单元35，用于凭借链接36控制发生器31和用于接收在一个或多个输入38处的产生信号，并执行数据信号处理，例如相关分析。
在使用基于SAW的传感器时，发生器31产生RF电压，其适合于提供输出32处的有效转换频率，并且被馈送到位于压电衬底34(虚线)上的产生转换器电极33上。在控制器35凭借控制链接36的控制下RF电压的振幅随着时间升高。接收电极37将自有效面积出现的声发射转换成电信号，其被馈送到接收器/控制器35和输入38。模拟数字转换后得到的数据则经历信号处理，以提出有用的信号。然后结果最终被记录和/或呈现给操作者。
来自实施例的某些结果显示在图2至7和10中。图2A，2B，3A，3B，4A，4B，4C，4D，6B，7和10是信噪(S；任意单位)对振幅(A；伏特)的图表。图5A，5B，6A和6C是信噪对颗粒数量(N)的图表。
使用下述的缩写：
BSA：牛血清清蛋白
LB：Luria汤
DIC：二甲基氨基异丙基氯化物
DMAP：二甲基氨基嘧啶
EDD：1，3-二甲基氨基丙基-3己基二亚胺碳
NHS：N-羟基丁二酰亚胺
PBS：磷酸盐缓冲盐水
实例1
借助于若干数量的所关心的键，直径为5μm的乳胶球体被附着在QCM传感器表面上。使用的球体的覆盖范围为QCM表面面积的1％。球体的直径只具有1％的偏差。
QCM传感器包括以35°声横切，并且直径8.25mm的抛光石英板。沉积铬层(20-30nm厚)和随后的金层(100-120nm厚)。
在空气中进行的实验研究三种不同的键：物理键(乳胶-金)，抗生蛋白链菌素-生物素键和共价键(酰胺键)。通过将乳胶球体直接放置在传感器表面上并在氮气中干燥形成物理键。通过将biotinylated BSA施加到表面上并在氮气中干燥形成抗生蛋白链菌素-生物素键。通过使用溶解在乙醇中的链端为酸的硫醇(12-巯基十二烷酸)形成硫醇单层而形成化学键；然后使用EDC-NHS对其活化，加入链端为胺的球体以形成酰胺键。
这些实验是在一种室中进行的，该室装配有两个光学窗口：一个用于提供样品的激光照射，另一个用于凭借光学显微镜允许观测分散的激光。QCM被放置在该室中。型号为DS345(斯坦福研究系统)的信号发生器，被用于驱动QCM。颗粒的运动和分离是使用装配有CCD松下WL-SL300摄影机的Olympus BH-2光学显微镜观测的。主测量器件为同步放大器，SR844(斯坦福研究系统)。使用与第一个同步的第二发生器参考信号被馈送到同步放大器上。所有的器件被连接到计算机上用于实验的控制和数据的收集。
图2A示出了抗生蛋白链菌素-生物素(1)和化学键(2)的破裂力光谱；图2B是物理键的光谱。
通过记录破裂力光谱，用实验方法确定这些键断裂所需的力或电压是可能的。这可被用于分离。如图2A所示，如果有5μm球体的混合物，其中的一些在表面上具有抗生蛋白链菌素，另一些则没有，然后通过将高于0.1V但低于6V的电压，比方说1V施加到在表面上具有生物素的QCM上，分离这两组球体是可能的，以在表面上只提供标记为抗生蛋白链菌素的球体。该技术也可被用于检测标记为抗生蛋白链菌素的球体，这是由于如果在1V振荡，只有这些球体会结合在表面上。
为了使测量结果定量化，在实验数据的基础上，考虑到微球体上的力的估计，已在不同的电压下计算QCM的振荡振幅。这种估计是通过测量QCM的功率消耗和它的Q因子(或品质因数-倒数相对共振带宽＝f/Δf共振)进行的。振幅A由下式给出：A＝[QP/2π3f3M]l/2
其中Q为Q或品质因数(比优数)，P为QCM消耗的电功率，f为石英晶体的共振频率，M是涉及运动的QCM石英板的有效质量。在6V时Q因子确定为c.15000，其给出60nm的QCM震动振幅的一种估计。因此球体上的力为9μN。这应该与断裂160pN2的单抗生蛋白链菌素-生物素键所需的力相比较，并指示出近似60000的键同时断裂。估计指出这对应于球体和表面之间的50％或更多的初始抗生蛋白链菌素-生物素键。这就意味着球体附着于表面的多数键同时断裂。这就产生了在破裂力光谱中观测到的尖峰和键断开时的可检测到的噪声。实例2
该实例表明本发明的方法也可在溶液中进行。QCM的Q因子由于积液会减小，因此与空气相比减小了处于特定电压的振荡振幅。将有粘滞力作用在微球体上，并且其有效质量将增加，这是由于水的相关层增加了球体上的力。
图3示出了凭借抗生蛋白链菌素-生物素(图3A)和化学键(图3B)附着在表面上的5μm乳胶球体的破裂力光谱。破裂分别发生在1V和10V。
凭借为六的因子，抗生蛋白链菌素-生物素键的临界电压从空气到水中的6V减小为1V，并且水中化学键的断裂，指示出后一种效果是主要的。因此，该实施例明显地描述出键断裂和由此的分离和生物传感在水基液体或另一液体中是可能的。
假如物理、抗生蛋白链菌素-生物素和化学键的键密度是相同的，并且由于相同尺寸的微球体已被用在这些实验中，可得到破裂力的相对尺度。对于物理：抗生蛋白链菌素-生物素：化学键为1∶60∶600。这个比例看来是合理的并显示出该方法的动态范围。通过实施具有已知键密度的合适校准实验，使这些测量结果定量化应该是可能的。实例3
由于噬菌体和麦芽糖结合的相互作用是容易表征和容易得到的，该实施例描述了病毒的检测，特别是遗传改进的噬菌体的检测，该噬菌体显示熔化到噬菌体pIII病毒外壳蛋白质的麦芽糖结合蛋白质。噬菌体是长的，细的细丝状病毒，由长度1μm和直径6nm的柔性棒构成。遗传改进的噬菌体另外显示出在病毒一端相当于5个麦芽糖结合蛋白质作为到噬菌体pIII病毒外壳蛋白质上的熔合；参考McCafferty等人，自然，1990，348：552。在直链淀粉树脂上可特殊净化这些噬菌体。
麦芽糖结合蛋白质熔化到吲哚甘油磷酸盐合酶的氨基末端被显示在fd噬菌体的表面，作为一种到基因III-编码病毒外科蛋白质的氨基末端结合。为此，构造一种fd噬菌体媒介，pJB113；其编码MaIE(E.coli)，trp(E.coli)和基因III之间的遗传融合。该噬菌体媒介携带四环素抵抗标记。未改进的竞争者噬菌体为携带卡那霉素抵抗标记的VCS M13K07辅助噬菌体(Stratagene)。
通过浸染3mL Escherichia coli菌株TG1的中间对数相位(logphase)LB培养物和10μL的噬菌体原料得到1×1012cfu/mL的抗菌素浓度。在37℃摇动(250rpm)2小时后，1mL的培养物被接种到100ml的LB中并在37℃摇动(350rpm)1小时。四环素(10μg/mL)或卡那霉素(50μg/mL)被分别加入到pJB113或VCS培养物中，该培养物是在30℃，250rpm过夜生长的。细菌被压成丸(15分钟，4.1krpm)，通过加入NaCl和PEG6000分别到达最终的0.5和4％(V/V)的浓度噬菌体从上层清液沉淀出。在冰中1小时后，噬菌体被离心作用(30分钟，4.1krpm)回收，并且噬菌体丸被重新悬浮在1ml的H2O中并保存在4℃。
可溶解的淀粉(500mg，0.01mmol，1eq.)被溶解在DMF(10ml)中并搅拌5分钟(部分可溶解)。向DMF(0.5ml)中的11-巯基十二烷酸(11.5mg，0.05mmol，5eq.)加入DIC(7.8μl，6.3mg，0.05mmol，5eq.)和DMAP(cat.)，并且该溶液被加入到淀粉溶液中。在室温下搅拌反应过夜。然后使用具有10000MW膜定点(membrane cut off)的搅拌细胞净化该反应，通过用milliQ水冲洗该溶液(50mL6次)并浓缩，继之以冷冻脱水过夜。
使用包含硫醇基的改性淀粉制备表面，使得它能化学耦合到表面上。QCM(如实例1制备的)放置在甲醇中的淀粉溶液(1μg/ml)中12小时。然后样品被水洗并在氮气流下干燥。病毒被从溶液中沉积在表面上并在室温下干燥，用于空气中的实验。通过稀释制备不同的病毒浓度。为执行具有阻塞麦芽糖结合蛋白质的麦芽糖的实验，100nM的麦芽糖加入到噬菌体的溶液中。
QCM的表面因此覆盖有一层可溶解的马铃薯淀粉(其包含麦芽糖的支聚物)，凭借硫-金键化学附着在金表面上。实验在空气和水中进行。
图4A示出了对于麦芽糖结合噬菌体(-)和未改进的噬菌体(…)的相等组合物，在水中得到的破裂力光谱，正在获得的扫描超过500秒。在金电极的表面上大约有500兆的每种类型的噬菌体。对于未改进并由此非特异性结合(non-specifically bound)的噬菌体，破裂峰检测在1.2V。对于麦芽糖结合噬菌体相应的破裂峰为大约9V，并且由于在键断裂时释放出较多的能量，峰值要比非特异性结合的噬菌体的强。在空气中，一直到10V观测不到特异性结合(specifically bound)的麦芽糖结合噬菌体的峰值；图4B示出了仅仅对非特异性结合的噬菌体的空气中的数据。峰出现在7.5V，比水中出现的峰增加了近似6。第二扫描(…)几乎没有峰值，表明噬菌体已从表面上清除掉。这就证实额外的粘滞摩擦力和颗粒的有效质量的增加使得在水中比在空气中容易断裂噬菌体颗粒和表面间的键。
在破裂力光谱中的峰的尖度明显地键破裂发生在临界电压的观测有关；这导致音响噪声发生在短时间期间，因此使得该方法非常灵敏。另外，来自明确结合噬菌体的信号被从非明确结合噬菌体中分离出来，并且具有较高振幅，这意味着非明确吸收不影响明确吸收的测量。与破裂未改进的噬菌体和表面之间的非明确相互作用所需的力相比，需要较大的力以破裂显示在噬菌体上的麦芽糖结合蛋白质和涂有淀粉的表面之间的明确相互作用。
图4C示出了利用麦芽糖结合噬菌体在其结合部位被麦芽糖阻塞，然后噬菌体被沉积在QCM的中心(上图)或整个表面上(下图)时在空气中进行的控制实验的结果；这显示出与未改进噬菌体相似的特性，证明该差别是由这些特定相互作用产生的。图4D示出了在表面上只有1000噬菌体的水中的破裂光谱，并指出破裂过程仍能检测。由于QCM的Q或品质因数发生很小的变化，作为积液变化的结果，峰的位置有小的偏移。
该数据也表明通过高于破裂非特异性结合噬菌体的键的电压但低于破裂麦芽糖结合噬菌体的键的电压驱动QCM，从麦芽糖结合噬菌体中分离非特异性结合的噬菌体应该是可能的。这提示了另一种方法以筛选用于结合的噬菌体库，其中通过控制施加电压的大小和施加的时间而控制留在表面上的噬菌体的结合亲和力，前提是噬菌体保持存活。
为了确定该方法的灵敏度，用水中的麦芽糖结合噬菌体进行稀释实验。图5A示出了(对于靠近9V的最强噪声峰)信号的功率与噬菌体的数量成线形关系，在至少5个数量级幅度上并且在QCM上近似200个噬菌体的存在可以99％的可能性检测出。图5B示出了空气中的非明确结合噬菌体相似的曲线，指出99％可能性的100个噬菌体的检测灵敏性。通过使用AFM直接成像而确定低稀释度的麦芽糖结合噬菌体在表面上的数量。
该实施例表明可检测QCM表面上的噬菌体的数量。相反，使用PCR，病毒DNA复制的数量在溶液中被检测。如果假定溶液样品中的所有病毒颗粒将结合到表面上，这在如果有强病毒-表面相互作用或者该溶液允许蒸发而在表面上留下病毒时会发生，那么灵敏度的直接比较是可能的。通过该实例(这是未优化的)PCR的灵敏度是大约每毫升100份的病毒DNA复制，这可与噬菌体检测灵敏度相比较。可提高电子学方法，还有提高灵敏度的余地，可能至少一个数量级。例如，在这些实验中，噬菌体被均匀地沉积在QCM的表面上。然而QCM的振幅和灵敏度具有空间相关性，这意味着主要信号来自于QCM的中心(如图4C所示)。这意味着如果噬菌体只被沉积在QCM的中心，可记录较少并由此更强的峰，导致灵敏度的提高。
通过使用附着在QCM表面上的病毒的特定抗体，该方法可直接应用到人类病毒的检测中。这些抗体形成附着在QCM表面的病毒间的特定相互作用。这些抗体形成病毒和表面间的特定相互作用，其在特定表面加速度时可被断裂。出现在样品中的相似尺寸或较大颗粒的非明确吸收将导致峰出现在低电压，如现已示出的，并且这不应该影响分析，尽管表面上的大分子的吸收可减小得到用于结合病毒的抗体数量。许多普通的病毒具有的有效质量比在该实施例中使用的噬菌体的大，尽管与表面的特定相互作用的数量和强度将是不同的。这意味着需要的电压应为相似的数量级或更小。
该实施例表明破裂力光谱不需要放大步骤，是定量的，并具有直接的和低成本的可能性。这可导致多种情况中的病毒传染的快速诊断，包括在临床环境中的病人或农业中的植物和动物。
实例4
该实施例阐明了病毒结合化验。为了该化验，石英晶体微量天平芯片由抛光的石英片做成，AT切割35℃的角度(HyQ，Cambridge，UK)，并在Edwards气相沉积器中沉积上30nm厚的铬粘附层，然后是如被校准的电导确定的200nm的金层。然后这些芯片被浸入到1mM的光谱级乙醇中的巯基十二烷酸的溶液中18小时，彻底地用乙醇和水冲洗，然后在氮气流下吹干。然后这些芯片被浸入到NHS(100mM)和EDC(400mM)的混合物中20分钟。用水对其彻底冲洗，然后浸入在50μg/ml老鼠单克隆IgG抗体溶液1小时，该抗体出现抵抗pH7.0的10mMPBS中的HSV1糖蛋白D。然后用水冲洗并浸入在pH8.5的1M乙醇胺溶液中10分钟。然后彻底用水冲洗并保存在4℃的1mlPBS中。
使用具有乳胶球体的内标准的电镜，确定Ficoll-纯化的储备溶液中的病毒颗粒/ml的数量。在包含BSA(0.1mg/ml)的PBS(10mMNa2HPO4/NaH2PO4，2.7mM KCl，120mM NaCl，pH7.4)中制备浓度为5×1010病毒颗粒/ml的HSV gD+储备溶液的系列十倍稀释液并保存在4℃。然后在仪器中QCM芯片被安装上无焊料的接触，或者1μl或者40μl的稀释液被放置在涂有抗-gD IgG抗体的芯片表面上。40分钟后，表面被用水彻底冲洗，然后覆盖上40μl的PBS并且QCM从0-10V扫描。
结果显示在图6中。图6A是信号对1μl(o)和40μl(□)样品的gD+疱疹单一病毒颗粒数量的图表；线纯度是好的。图6B是噪声对gD+和gD-病毒振幅的图表。与表面上的抗体没有明确相互作用的gD-病毒显示不出峰；相反，gD+病毒显示出7.5V附近的尖峰。
实例5
为了细菌结合化验，如在实施例4中的制备QCM芯片。E.coil和S.aureus(实验室菌株)被培养在脑心脏/0.5％酵母萃取肉汤中并在37℃下培养过夜。每种培养物的1ml样品被调整到如被光密度所确定的1010cfu/ml的浓度，在12000g离心2分钟；球粒被重新悬浮在无菌的PBS中。以与实施例4描述的抗-HSV抗体相似的方式，10μl的细菌悬浮液被放置在涂有抗-E.coil IgG抗体的QCM芯片上。40分钟后，表面被彻底用水冲洗，涂有40μl的PBS，并且QCM从0-10V扫描。
结果显示在图7中，噪声/振幅图显示出E.coil大约6V的尖峰，而S.aureus没有峰。
实例6
在该实施例，使用如图9所示的SAW器件。在这种情况下，使用单一仪器(HP8512a，Hewlett Packard)，其在单一仪器中结合放大器1和接收器和控制器5。该仪器设置为连续波和功率扫描模式。SAW器件是从RF Monolitics，Inc.商业可得的RF1171。直径1μm的大约10000乳胶球体，被沉积在SAW的表面上。由此产生的光谱显示在图10中。观测到很多的峰，它们在干净的表面上没有出现。这表明SAWA器件可被用于检测破裂现象。不同的峰可能对应于不同大小表面上的球体簇，因此在不同的位置可观测到这些峰。

Claims (28)

1.一种确定结合对之间的亲和力的方法，其中依据该亲和力可以确定结合对的性能，所述方法包括以下步骤：
(i)使结合对接触，结合对之一被固定在一个表面上；
(ii)振荡该表面使振荡振幅增加到该结合对相分离的值；以及
(iii)检测分离现象。
2.一种从组合物中分离靶分析物的方法，包括以下步骤：
(i)以分析物的一个结合对接触组合物，该结合对被固定在一个表面上；以及
(ii)振荡该表面，以使振荡振幅增加到从该表面上选择性地除去分析物或组合物的其他成分的值。
3.如权利要求1的方法，用于确定结合对之间的结合强度。
4.如权利要求1的方法，用于确定其他结合对的存在。
5.如权利要求1的方法，其中其他结合对为颗粒或固定在颗粒上。
6.如权利要求5的方法，用于确定颗粒的大小或存在。
7.如权利要求1-6中任一个的方法，其中每个结合对为蛋白质，抗体，抗原，酶，酶抑制剂或多核苷酸。
8.如权利要求1-6中任一个的方法，其中结合对为细胞，细菌，病毒，蛋白感染素或噬菌体。
9.如权利要求1-6中任一个的方法，其中不同的结合对被固定在表面的不同位置上。
10.如权利要求1-6中任一个的方法，其中分离现象被声发射检测。
11.如权利要求1-6中任一个的方法，其中该表面为压电转换器或声转换器的一部分。
12.如权利要求11的方法，其中转换器为石英晶体微量天平或表面声波器件。
13.如权利要求1-6中任一个的方法，其在液体中实施。
14.如权利要求1-6中任一项的方法，其在空气中实施。
15.如权利要求10的方法，其中该表面在对应于一个主共振频率的频率上振荡，而声发射在另一个模式附近被检测。
16.如权利要求15的方法，其中该表面是石英晶体微量天平的一部分，该石英晶体微量天平通过在其谐振频率上驱动它而振荡，该石英晶体微量天平在第三谐波上检测声发射。
17.如权利要求1-6中任一项的方法，其中该表面是在表面的平面内振荡。
18.如权利要求1-6中任一项的方法，其中步骤(ii)包括以单调增加的振幅振荡该表面。
19.用于确定结合对之间亲和力的装置，包括：
一个表面，具有固定在其上的一个结合对；
一个振荡器，以增加的振幅振荡该表面；以及
一个检测器，用于检测声发射。
20.用于确定结合对之间亲和力的装置，包括：
一个表面，具有固定在其上的一个结合对；
一个振荡器，在该表面的平面内以增加的振幅振荡该表面；以及
一个检测器，用于检测分离现象。
21.如权利要求20的装置，其中检测器检测声发射。
22.如权利要求19-21中任一项的装置，其中固定的结合对为蛋白质，抗体，抗原，酶，酶抑制剂或多核苷酸。
23.如权利要求19-21中任一项的装置，其中固定的结合对为细胞，细菌，病毒，蛋白感染素或噬菌体。
24.如权利要求19-21中任一项的装置，其中不同的结合对被固定在表面的不同位置上。
25.如权利要求19-21中任一项的装置，其中振荡器和检测器装置包括压电转换器或声转换器。
26.如权利要求25的装置，其中转换器为石英晶体微量天平或表面声波器件。
27.如权利要求19-21中任一项的装置，其中振荡器适合于以对应于主共振频率的频率振荡该表面，检测器适合于检测靠近另一模式的声发射。
28.如权利要求27的装置，其中振荡器和检测器包括石英晶体微量天平，振荡器适合于以石英晶体微量天平的共振频率驱动石英晶体微量天平，检测器适合于在第三谐波上检测声发射。
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