CN103946704A - 用于现场护理诊断使用的生物涂覆型压电生物传感器平台 - Google Patents

用于现场护理诊断使用的生物涂覆型压电生物传感器平台 Download PDF

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Abstract

生物传感器组件（芯片）是基于直接生物涂覆方法的，所述直接生物涂覆方法引起了锚定物质在压电活性晶体表面上的牢固且稳定的非共价结合，所述锚定物质例如有抗生物素蛋白或具有特异性结合搭配物的其他蛋白质或寡核苷酸或聚核苷酸。构想了在生物分析法中的特定应用。锚定物质的稳定单层形成了反应性层，其可用于结合用以捕捉和检测生物流体样品中的分析物的捕捉试剂，例如生物素化抗体。一些实施例是针对一种在特定的声波板模式生物传感器上施加有前述生物涂层的生物传感器，其中在晶体的生物涂覆膜的相对侧上存在交叉指型转换器（IDT）。其他实施例涉及合并所述生物涂层的多阵列装置，用于检测所述装置上的多种分析物。应用包括用于检测感染的现场护理诊断。

Description

用于现场护理诊断使用的生物涂覆型压电生物传感器平台
本申请案是作为艾维纳分子技术有限责任公司（Aviana Molecular Technologies,LLC）（一家美国公司，它是除美国之外的所有国家的指定的申请人）、美国公民LisaLaury-Kleintop、台湾公民Hsu-Cheng Ou以及美国公民Herman Rutner（他们仅是美国的指定的申请人）名下的PCT国际专利申请案在2012年8月27日递交的，并且要求2011年8月26日递交的美国临时专利申请案序列号61/527,716的优先权，该申请案在此以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明大体上涉及用于分析含有目标分析物的测试样品的装置和方法，所述目标分析物包括蛋白质和核酸。本发明使用集成芯片作为具有生物涂层的敏感生物传感器，所述生物涂层具有不可逆地将抗生物素蛋白或另一种蛋白/核苷酸结合到压电材料（例如晶体）表面上的能力。所得到的平台技术适用于多种生物传感器的研发。在更特定的实施例中，所述生物涂层是直接涂覆到压电材料表面上的而不存在介入涂层。在另一特定实施例中，本发明涉及一种声波板模式生物传感器，其中在与承载生物涂覆膜的侧面相反的表面上存在交叉指型转换器（IDT），避免了晶体上的保护性涂层和波导的需求。
背景技术
利用敏感的、特异性的和快速的检测技术的低成本、大量生产的现场护理（POC）生物传感器对全球的人类和兽医保健具有潜在地巨大的流行病学影响。及时地检测和治疗影响人类和动物的通常占流行病比例的感染性疾病，尤其是急性的感染性疾病的合适的装置将最大程度的使社会需求受益。合适的POC装置应必须是以较低成本和较大数量制造的，以允许对潜在暴露个人的较大群体进行监测。这些传感器需要是足够稳固的，以便在不利的条件下使用，例如热带和亚热带气候，并且还需要能够在资源丰富和资源有限的环境中由非实验室培训人员简单地使用。此外，此类装置应该是单次使用、低成本以及一次性的，从而不会成为疾病的传播体。当前方法水平的POC装置（如横向流动装置）并不满足此需求，这是因为结果的灵敏度较低和/或可变性较高，以及其他缺陷。另一方面，非常敏感的诊断工具（例如核苷酸检测）需要复杂的分离和处理，使得这些诊断装置难以用于现场环境。基于实验室的系统是精确的（敏感的和特异性的），但是它们不易于运输的或速度慢，并且它们需要专门培训过的人员进行操作。本发明描述了一种产生高度敏感的生物传感器的方法，所述生物传感器可以在许多环境下用作POC装置。这些生物传感器在已知的（以及创新的）声波传感器上提供了一种可扩展的生物涂层，使得在多种非生物环境中使用的传感器可供在非实验室（例如现场）环境的POC装置中使用。
众所周知，在压电晶体中产生的声波当施加到装置时是极其敏感的，由于质量和/或粘度的改变，导致在所述质量的应用之前和之后的此类声波的频率和/或相位或幅度的改变，这可以电子地进行测量并且与所述质量的存在相关。因此，它们被用作非常敏感的化学或气体传感器，所述化学或气体传感器能够检测十亿分率的质量变化或非常小的温度变化或气体浓度的变化。然而，由压电活性材料（例如晶体）制成的作为生物传感器的这些装置的使用仅获得了有限的成功，这要么是因为所施加的生物流体抑制了所产生的波，要么是因为所施加的膜是难以始终如一地以大规模制造的，从而将它们限制于资源丰富的复杂环境中，例如研究实验室。
使这些声波传感器具有作为生物传感器的功能的尝试已经导致了冗长的或不一致的结果，并且难以对方法进行放大。此外，这些涂覆方法还必须考虑到附着到这些晶体上的用于传输声波的电气导电单元，并且具体来说必须不会干扰波的传输。（类似地，晶体结构必须是与波传输相容的。）另外，所述生物涂覆方法必须不会使声波衰减或毁坏。鉴于这些多种局限性，生物涂层方面的发展一直以来都使用一种类似的方法，即，将化学试剂附着到晶体表面，而晶体表面还可以结合例如抗体等生物活性剂。有两种方法通常用于沉积第一功能涂层：一种方法涉及涂覆真空溅射的金的薄层，所述涂层可以与异双官能硫醇或衍生的二硫化物（例如羧甲基-聚乙二醇-硫醇，5000，莱桑生物（LaysanBio））上的硫官能团反应，并且另一种方法涉及采用合适的市售异双官能硅烷（例如3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）、3-缩水甘油醚氧基丙基三乙氧基硅烷（GOPS）、3-巯基丙基三乙氧基硅烷（MPTS））对压电式传感器表面上的羟基进行直接官能化，以与硅烷形成共价的一价或二价硅酸盐键。另一种抗生物素蛋白附着方法涉及首先将脂质（化学年报（Annals of Chem.），第69卷：4808-4813）和水凝胶沉积到表面声波传感器上（澳大利亚专利07473551），随后进行抗生物素蛋白的沉积。
这些方法通常是耗费时间的并且用于涂覆的方法是复杂的。它们需要与异双官能硅烷试剂进行长期的液相接触。这些硅烷通常是作为非反应性溶剂（如甲苯、2-丙醇）中或含水溶剂等中的溶液形式提供的，以沉积单层或多层。然而，出于若干原因，此过程是难以控制的。首先，所述硅烷中的一些，例如三甲氧基硅烷，是非常容易发生反应的；而其他的硅烷，如三乙氧基硅烷，反应性稍弱但是在水解下不太稳定。另一原因是因为硅烷的反应性、它们所拥有的若干可键联基团以及它们倾向于与额外的硅烷分子发生反应并且键联，所以难以获得单层的硅烷沉积物，而这以难以控制和维持均一性的方式改变了被涂覆的衬底的透射特性。即使是痕量水的存在也会额外地使过程控制变得复杂，因为硅烷通过形成反应性的硅醇或硅二醇而变得更加容易交联。通常使用的APTES尤其容易形成多层。异双官能硅烷GOPS具有环氧基团或环氧乙烷基团，主要取决于pH值，所述基团选择性地与硫醇、胺和羟基发生反应，例如，在大约7的pH值下与硫醇发生反应，在大约9的pH值下与氨基发生反应，并且在大于10的pH值下与羟基发生反应。它可以用于与抗体上的一个或多个胺基直接偶联，或者与固定化抗生物素蛋白（例如中性抗生物素蛋白（neutravidin））上的大约一半的氨基直接偶联。但是这些流程涉及湿法化学和共价键，它们使涂覆方法复杂化并造成延迟并且增大了副反应的可能性，而这会干扰所得到的装置的精确性。（GT Hermanson，生物偶联技术（BioconjugateTechniques），1996，第142页）。
总体来说，用于在压电材料上沉积中间和最终的蛋白层的现有技术SAM方法需要连续的步骤，包括在含水溶剂或惰性非质子媒介中与多种试剂一起培育、中间冲洗、pH值变化和最终暴露于结合蛋白以完成所希望的功能性SAM亲和性生物传感器。这些逐步过程可能会耗费数小时或者甚至数天，并且可能产生功能上可变的、昂贵的且因此在POC生物传感器应用中无法接受的SAM生物传感器。所属领域中的这些方法显然不适于在低成本下的以及在可扩展的高通量模式的潜在地具有数百万的一次性使用的生物传感器中（其中方法变化或者失败将是非常不希望的）的均一生物传感器的持续的且有成本效益的生产。
本发明部分地描述了一种方法，该方法允许蛋白质（例如，不仅是抗生物素蛋白，而且还有具有必需的可键联基团的其他生物材料（核酸、其他蛋白质））直接结合在晶体表面上，从而带来了用于制造均一且可信赖的生物传感器的稳定且可扩展的方法。本发明进一步合并使用了两种类型的传感器，即，体波和水平剪切表面声波，并且可以在多种压电活性的晶体材料上使用。使用此直接涂层，本发明已经克服了上述的许多困难。
虽然用于形成声波引导的压电材料是众所周知的并且包括铌酸锂、钽酸锂、石英和若干其他物质，但是每一者在平台装置的开发中都提供了独特的优势和劣势。因此，希望的是任何涂覆方法都可以适用于全部的压电材料衬底，以便提供用于检测自然界中的造成感染和感染后果的各式各样的多种介质的最大潜在变化，所述介质包括（但不限于）细菌、病毒、蛋白质、核苷酸、寄生虫、真菌等等，并且值得注意的是其单独组分以及例如病原体片段等较大的粒子。
发明内容
描述了一种声波生物传感器系统，其合并了沉积在压电介质（晶体）的传感器表面上的生物膜。所述生物膜包括一种存在特异性结合搭配物的生物活性锚定物质的涂层，所述生物活性锚定物质例如是抗生物素蛋白（而且还可以使用具有特异性结合搭配物的其他蛋白质（例如配体）和核酸（例如寡核苷酸和聚核苷酸）），所述涂层形成了直接位于晶体表面上的稳定单层。所述方法适用于按比例增大,从而使用自动化或半自动化技术进行大规模制造。
因此，本发明是针对一种生物传感器及其制造和使用方法，所述生物传感器包括在压电表面上直接涂覆有锚定层（例如抗生物素蛋白膜）的压电介质。在抗生物素蛋白涂层的情况下，为了检测生物样品中的目标分析物，将生物素化的捕捉试剂结合到生物膜。在其他锚定物质的情况下，捕捉试剂必须是由针对锚定物质的特异性结合搭配物衍生的。将含有目标分析物的生物样品与生物膜接触放置。捕捉试剂特异性地识别目标分析物并且结合到目标分析物。结合被检测为横越传感器表面的声波的扰动（频率、相位和/或幅度的改变）。这种扰动随后被转化为电子信号以用于进一步的分析，即，与目标分析物的存在的相关性以及任选地其量化。
在另一方面中，所述生物传感器基底可以由二氧化硅、氧化锆、二氧化钛等的中间衬底层来修饰，这不是通过昂贵的且冗长的热真空溅射方法来常规地完成的，而是通过硅酸盐、钛酸盐、锆酸盐等的共价结合的简单两步方法完成的，方法是在受控的条件下用裸露的压电芯片基底表面接触适当介质中的对应的盐，随后借助于酸处理步骤将结合的衬底层转化为二氧化硅、二氧化钛、氧化锆等的层，由此取决于盐浓度和接触时间，形成具有可控厚度的均一的二级氧化物层，其中此种中间氧化物层（或多层）可以随后由稳定结合的锚定层（例如，抗生物素蛋白）来涂覆，所述锚定层适用于与特异性捕捉试剂（例如，针对特异性分析物目标的抗体）反应，所述特异性捕捉试剂是通过与锚定材料（例如，生物素基团）的特异性结合搭配物而被适当地修饰的。
在包括硅酸盐、钛酸盐、锆酸盐等的中间涂层的生物传感器的又一方面中，可以任选地将最佳浓度和pH值下的涂层溶液与对碱稳定的抗生物素蛋白混合并且使其干燥，由此将盐结合到基底层并且同时部分地在玻璃状的结合盐膜中包埋抗生物素蛋白，这在酸处理之后将结合的盐膜转化为稳定地包封抗生物素蛋白的多孔氧化物层，所述抗生物素蛋白仍然具有可用于结合生物素化捕捉试剂的大量的暴露的生物素位点。
在另外的其他方面，本发明是针对一种涂覆生物传感器的方法，所述生物传感器适用于使用声波在生物样品中检测一种或多种分析物，所述生物传感器包括具有附着到其上的锚定层（例如，抗生物素蛋白层）的压电材料，所述方法包括将抗生物素蛋白沉积到压电材料的一个表面的一部分上，所述部分适于接收生物样品，和通过包括用本文中所揭示的方法进行涂覆的步骤，直接或间接地将所述附着的抗生物素蛋白固定到所述压电表面部分上。
本发明进一步包括用于快速POC诊断的系统中的新颖压电生物传感器装置和平台的使用。因此，本发明的生物传感器提供了一种作为POC诊断工具的敏感的、便宜的且简单的方法和相关装置的依据。本发明允许一种在现有的制造设施或传送带上使用新颖的快速涂覆方法的简单制造方法，产生了新颖的单次使用的、潜在地一次性的生物传感器，所述生物传感器可以用作临床诊断中的有成本效益的替代性现场护理（POC）。此类生物传感器可以提供所需的灵敏度，可以在需要时快速地进行部署，并且因此将是在发达世界以及资源有限国家中均有用的。具体来说，这些POC生物传感器在涉及以下内容的领域中可以是尤其有益的：检测、抑制和治疗影响人类和动物的急性感染性疾病，以及检测在患病和健康病人的诊断和监护中有用的特异性生物化学标记。
一种声波生物传感器组件,其包括压电晶体，所述压电晶体包括直接结合到压电材料的表面的锚定物质层，所述锚定物质具有结合到捕捉试剂的性质，所述捕捉试剂包括或由针对所述锚定物质的特异性结合搭配物组成。
一种用包括锚定物质的生物膜涂覆压电材料的表面的方法，所述锚定物质具有结合到捕捉试剂的性质，所述捕捉试剂包括或由针对所述锚定物质的特异性结合搭配物组成，所述方法包括：
a.处理压电材料的晶体表面以增大晶体表面的表面能；
b.将锚定物质层施加到晶体表面；
c.在晶体表面上形成化学吸附型锚定层。
一种用包括锚定物质的生物膜涂覆压电材料表面的方法，所述锚定物质具有结合到捕捉试剂的性质，所述捕捉试剂包括或由针对所述锚定物质的特异性结合搭配物组成，所述方法包括：
a.向压电材料的晶体表面施加硅酸盐、锆酸盐或钛酸盐的溶液并且与酸反应以分别形成二氧化硅、氧化锆或二氧化钛的中间层；
b.将锚定物质层施加到中间层，以在晶体表面上形成锚定层。
一种声波生物传感器，其包括：
a.压电晶体，所述压电晶体包括直接结合到压电晶体的表面的锚定物质层，所述层中的锚定物质还结合到捕捉试剂，所述捕捉试剂包括或由针对所述锚定物质的特异性结合搭配物组成并且特异性地识别在生物流体中存在的分析物；
b.声波发生器，所述声波发生器产生波，其中捕捉试剂与分析物之间的反应引起了声波特性的可检测的改变。
一种用于确定生物流体样品中的分析物的存在或数量的方法，所述方法包括：
用包括捕捉试剂的组合物接触前述生物传感器组件，所述捕捉试剂包括或由针对所述锚定物质的特异性结合搭配物组成并且还特异性地识别分析物；
使得捕捉试剂结合到锚定物质，形成捕捉试剂层；
用生物流体样品接触结合的捕捉试剂；
和跨越压电表面产生声波；和
测量由分析物结合到捕捉试剂层引起的波的幅度、相位或频率的任何改变。
附图说明
图1：铌酸锂晶体上的中性抗生物素蛋白涂层的原子力显微法（AFM）.AFM图像分析使用实例1中描述的方法示出了大约3nm到4nm的中性抗生物素蛋白涂层。图(a)示出了未结合中性抗生物素蛋白的芯片的实时形貌特征曲线。图(b)示出了具有1μm的纳米凹痕区域的中性抗生物素蛋白涂覆表面的10μm的扫描。图(c)是在压痕具有大约3.229nm的深度之后结合到芯片的抗生物素蛋白的形貌特征曲线。
图2：具有添加的抗登革热抗体的铌酸锂晶体上的中性抗生物素蛋白涂层的原子力显微法.中性抗生物素蛋白通过抗登革热抗体的添加结合到铌酸锂芯片。图(a)示出了在中性抗生物素蛋白中用Ab表面制成的纳米凹痕区域的10μm的扫描，方法是扫描芯片的1μm的区域。图(b)示出了图(a)的4.6μm的放大部分。图(c)是示出了深度为0.269nm（或6-9nm的深度）的形貌特征曲线。
图3：用于确认铌酸锂芯片的表面上的抗生物素蛋白的FITC标记的生物素珠粒.示出了在铌酸锂芯片的表面上不具有(a)或具有(b)抗生物素蛋白的生物素珠粒（英杰公司）的荧光图像（200x）。(a)中的箭头表示珠粒与晶体的非特异性结合。(b)中的箭头表示珠粒与晶体上的抗生物素蛋白涂层的结合。
图4：抗生物素蛋白结合的稳定性.在超过一个月的周期内确定结合到铌酸锂的抗生物素蛋白的光学密度（O.D.）。抗生物素蛋白涂覆芯片储存在4℃下并且每周对其进行测试。对于第1周、第2周和第4周来说，所述结合保持大致相同（在第3周的衰退被视作是无效的并且这是由于错误的试剂造成的）。
图5：结合到铌酸锂的抗生物素蛋白.使用所描述的方法将抗生物素蛋白结合到涂覆在铌酸锂上的SiO2。图A示出了结合到涂覆在铌酸锂上的二氧化硅的抗生物素蛋白的光学密度（O.D.）。对490nm下的具有或不具有抗生物素蛋白的生物素HRP的吸收值进行比较。所述曲线示出了具有1.4的O.D读数差异的抗生物素蛋白的良好结合。图B比较了与涂覆在铌酸锂上的二氧化硅结合的中性抗生物素蛋白与抗生物素蛋白。
图6：结合到沙眼衣原体的原质小体（EB）的AMT芯片的荧光显微镜图像.用DAPI斑点（图B的箭头）示出了已经结合EB的AMT芯片的荧光图像以及与没有衣原体材料的阴性对照（部分A）相比的FITC标记的抗沙眼衣原体Ab（图C的箭头）的荧光图像。DAPI和FITC标记的存在证实了结合的材料是细胞的（DAPI）并且是衣原体（FITC）。
图7：衣原体和抗衣原体抗体的频率偏移.在向105个EB添加0.25μg/ml生物素化抗EB LPS之后，在根据本发明的流程用抗生物素蛋白制备的芯片上示出了偏离稳定基线的频率偏移。
图8：在添加登革热病毒时的频率偏移.在根据本发明的流程用抗生物素蛋白和4μg/ml的2型抗登革热制备的芯片上示出了偏离稳定基线的频率偏移。在添加8μg/ml的登革热病毒时，基线频率发生了改变。
图9：在将抗体单独添加到仅结合中性抗生物素蛋白的芯片时的频率偏移.当1:200稀释度的生物素化抗沙眼衣原体（MOMP）被添加到具有结合抗生物素蛋白的芯片时在箭头1和箭头2之间示出了4.5MHz的频率偏移。
图10：声波板模式（APM）的理论模型.一种适用于本发明的APM的理论模型（APM被指定为Q-TBWF）。感测区域对应于流体腔室，而生物样品放置在压电衬底的顶部。波是在底部产生的并且移动穿过所述压电介质以检测结合到顶部表面的分析物（经由直接附着到表面的抗生物素蛋白分子）。IDT是位于底部表面的(未图示)。在遇到过量的捕获的分析物之后，所述波的频率将发生改变。
图11：集成式多阵列装置的示意图.示出了具有APM模式的单个延迟线结构的装置的示意性设计。在所述APM模式中，电子元件（例如，IDT）是施加到与生物元件和流体元件发生接触的一侧的相对侧上的衬底上的。图A是具有单个延迟线结构的装置的顶部透视图。图B是具有三个延迟管（多通道芯片）的顶面透视图。
具体实施方式
定义
以下术语应具有下文中赋予它们的含义。
“锚定物质”表示结合到(i)压电晶体（用于“直接”结合）或者结合到其上的中间涂层以及(ii)结合到“捕捉试剂”（如同下文所定义的）这两者的涂层材料。所述术语包括抗生物素蛋白，一种通过其结合生物素的能力在功能上定义的蛋白质家族的成员，生物素充当它们的特异性结合搭配物（例如，抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、中性抗生物素蛋白)，以及寡核苷酸和聚核苷酸以及具有特异性结合搭配物的蛋白质，所述搭配物可以用于修饰捕捉试剂并且因此使得捕捉试剂结合到锚定物涂覆的压电材料。还包括天然存在的碳水化合物结合性凝集素，所述凝集素结合到碳水化合物基团，例如，在抗体和抗体片段（例如，Fc片段）上。使用捕捉试剂作为锚定物通常并不是优选的，这是因为改变捕捉试剂的构象或者甚至部分使捕捉试剂变性的风险将影响测试的精确性。寡核苷酸和聚核苷酸可以通过离子或偶极子位点结合到压电材料，要么是直接的要么是通过施加的中间银涂层，例如通过离子交换方法。它们的特异性结合搭配物是互补的核苷酸分子并且那些可以用于修饰捕捉试剂。
“捕捉试剂”意思是特异性地结合到生物样品中的分析物的一种物质，因此它可以用于通过从生物样品捕捉分析物而对其进行识别和/或定量。所述术语包括抗体、适体和其片段（没有限制）。捕捉试剂将结合到经过或未经过键联基团修饰的锚定物质，所述键联基团是锚定物质的特异性结合搭配物（例如，生物素化或互补核酸）。换句话说，捕捉试剂是或者包括锚定物质的特异性结合搭配物并且同时特异性地识别一种分析物。
在应用于锚定物质与压电表面的结合时，“直接”或“直接地”意思是无需在压电晶体上涂覆中间涂层即可结合到压电晶体。压电表面可以被修饰，例如通过应用等离子体、紫外辐射，或通过银离子的离子交换沉积，其取代了所述表面上的金属离子但是并不在压电表面上在表面金属离子上沉积额外的中间材料层。排除了中间涂层，例如由硅烷处理、或形成共价键的任何其他反应、或金、银或铜层沉积所产生的那些涂层。
先前在现有技术中采用的生物膜不适合并且不适用于制造低成本、一次性使用的生物传感器，尤其是在筛查潜在地较大群体需要较大量的情况下。典型的实例包括硅烷（美国专利公开案号2011/0053139）或水凝胶（美国专利公开案号2006/0024813）的使用。本发明描述了一种新颖类型的生物膜，一种用于将其施加到衬底的方法，和此生物膜在合并若干声波模式中的任一者的生物传感器中的使用，以及这些生物传感器在诊断POC和生物医学研究中的应用。所述生物膜的应用包括涂层蛋白质，所述涂层蛋白质可以作为稳定的单层与结合搭配物直接偶联到晶体表面上，这是易于按比例增大以进行大规模生产的。所述衬底生物膜可以适用于若干声波模式并且可以在多阵列微传感器中使用，用于并行地进行若干测试。此外，所述涂层可以施加于多种压电材料，例如，铌酸锂、钽酸锂和石英微晶体等等。声波是由穿过压电衬底或者在压电衬底上传播的波的模式来描述的。取决于材料和边界条件，许多组合都是可能的。用于每个传感器的交叉指型转换器（IDT）提供了电活化场，输入转换器提供了在晶体中传播波的电输入，所述波是基于晶体切割和转换器的放置。通过输出转换器读取导致波的改变的任何晶体改变，并且将其输送到处理器以进行分析。
本发明进一步描述了一种用于声波板模式的新颖应用。
1.生物涂覆方法
本发明描述了一种新颖的生物涂覆方法，所述方法适用于所有类型的声波以及在声波传感器的制造中使用的所有类型的压电材料。一个实施例包括它们在主体模式下的使用，其中在与沉积生物膜的地方相对的压电材料表面上安置IDT。合适的声波可以包括所有主体模式、声波板模式以及水平剪切板模式。在另一实施例中，相关的生物涂层可以用作表面和水平剪切模式的声波导，其根据在相对的压电表面上具有IDT和生物涂层的要求进行分配。
A.直接涂覆：所述涂覆涉及简单且快速的涂覆化学法，其是在几秒或几分钟而非几小时内执行的；使用可扩展的、持续的以及线内的方法制造的；易于以最少的操作人员干预实现自动化；产生较少数目的废品；并且产生少量的有害废物。此涂覆方法直接在压电表面上沉积锚定物质，而无需中间材料层。
抗生物素蛋白是来源于蛋白的蛋白质，例如，从禽类、爬行类和两栖类物种中获得，并且已经被用于多种生物化学反应中。抗生物素蛋白家族包括中性抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素以及抗生物素蛋白，所有的这些蛋白质都是通过它们以高亲和力和特异性结合生物素的能力在功能上定义的。抗生物素蛋白还可以包括细菌抗生物素蛋白，例如抗生蛋白链菌素，以及修饰过的抗生物素蛋白，如中性抗生物素蛋白（来自赛默飞世尔科技公司（Thermo Scientific）的去糖基化抗生物素蛋白-www.thermoscientific.com）。它们是较小的寡聚蛋白质，每个包括四个（或两个）相同的亚单位，每个亚单位具有针对生物素的单个结合位点。当结合到本发明中的生物传感器的表面时，两个位点是面对压电材料表面的，并且因此是不可用于生物素结合的。剩余的两个位点是背对压电材料的并且是可用于生物素结合的。抗生物素蛋白对生物素的结合亲和力，虽然是非共价的，但是是非常高的，以致可以将其视作不可逆的。抗生物素蛋白的解离常数（KD）大约是10-15M，使其成为已知的最强非共价键之一。在其四聚物形式中，抗生物素蛋白的大小被估计为在66到69kDa之间。所述分子量的10%是归因于由四个到五个甘露糖以及三个N-乙酰葡糖胺残基组成的碳水化合物含量。抗生物素蛋白的碳水化合物部分含有在结构和组成上类似的至少三个独特的寡糖结构类型。
生物素，也被称为d-生物素或者维生素H、维生素B7和辅酶R，是抗生物素蛋白的一种特异性结合搭配物。它是可以从包括西格玛-奥德里奇公司（Sigma Aldrich）在内的多个供应商处购得的。
本发明人发现可以在本文中讨论的条件下将锚定物质（例如，抗生物素蛋白）直接涂覆到压电材料（包括所有的活性压电材料）上。使用此方法，优选地在单层中，锚定物质成功地直接附着到压电晶体表面并且形成了较强的且稳定的非共价键。如图1的图B和图C所示，在一个实施例中，抗生物素蛋白在铌酸锂芯片上形成了大约3到4纳米的单层。使用原子力显微法（AFM），单个的大部分均一的单层被确定为预期用于“薄煎饼型”化学吸附的抗生物素蛋白。AFM测量涉及在PBS中并且随后在蒸馏水中进行两个小时的彻底洗涤，并且随后对经过中性抗生物素蛋白涂覆的芯片成像。图A示出了芯片上未结合中性抗生物素蛋白的空白芯片的实时形貌特征曲线。图B是经过抗生物素蛋白涂覆的芯片上的具有1μm纳米凹痕部分的一个区域的10μm扫描。Z值被定义为从芯片表面上抗生物素蛋白的顶部到最高峰的距离。如同从图C中的形貌特征曲线所确定的，对于在结合到晶体的抗生物素蛋白中形成的典型的压痕，深度是3.229nm。压痕的深度被确定为在3到4nm的范围内。典型的中性抗生物素蛋白的大小为大约5.6x5x4nm（生物物理杂志（Biophys J.），2008年4月1日；94(7)：2706-2715；2008年1月公布在网上，10.1529/biophysj.107.119271，使用声波传感器的表面结合DNA的大小和形状的定量测定（A Quantitative Determination of Size and Shape of Surface-bound DNAUsing an Acoustic Wave Sensor），托托斯（Tsortos）等人，PMCID:PMC2267124）。为了评估中性抗生物素蛋白层的深度，在一个点上制造压痕并且再次扫描。压痕方法允许对结合到表面的抗生物素蛋白的深度进行计算。单层高度是从压痕的顶部到压痕的底部测量的。在未涂覆的芯片中，压痕并不会造成任何深度改变。这些扫描都是在10微米的空间内进行的。
图2描绘了将生物素化的抗登革热抗体合并到经过中性抗生物素蛋白涂覆的铌酸锂晶体上。使用本发明的方法将抗生物素蛋白结合到铌酸锂芯片，随后在室温下施加含4μg/mL的生物素化抗登革热抗体的0.05%BSA-PBS历时30分钟。在PBS中彻底洗涤2小时和随后用蒸馏水冲洗之后，将芯片浸没到蒸馏水中并且使用AFM成像。图A示出了在结合有抗体的抗生物素蛋白中形成的纳米凹痕区域的10μm扫描。图B是图A的4.6μm放大部分。如同在图C的形貌特征曲线中所示的，显示压痕为6-9nm的深度。深度为9.269nm。深度是从芯片上抗生物素蛋白的顶部到“孔”的底部或芯片自身的顶部来测量的。鉴于抗体的尺寸是14.2nm×8.5nm×3.8nm，压痕的深度显示抗体结合到抗生物素蛋白。
不受限于特定理论，人们相信，此结合的强度是由下文论述的暴露条件引起的，从而导致了锚定物质（例如，抗生物素蛋白）与晶体表面的较强的非共价结合。此结合可能是通过抗生物素蛋白上的反应性氨基酸（例如，与晶体表面形成键的精氨酸、半胱氨酸和赖氨酸）的一些侧链而发生的。可以与压电表面形成键的其他侧链是在不带电的和带电的极性氨基酸上的（例如，不带电的丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、酪氨酸；带电的天冬胺酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸）。当寡核苷酸或聚核苷酸被用作锚定物质时，它们通过离子或偶极子位点结合，并且一旦固定，它们就结合到捕捉试剂上，所述捕捉试剂可以是互补的寡核苷酸或聚核苷酸或者可以由互补的寡核苷酸或聚核苷酸修饰。实际上，如果分析物是核酸，那么捕捉试剂可以是在一个部分上结合锚定试剂并且在另一部分上结合分析物的杂合型寡核苷酸或聚核苷酸。
在涂覆之前，等离子体处理通过产生高反应性的物质几乎移除了晶体表面上所有的有机污染物。存在两种机制被认为有助于使锚定物质附着到晶体表面：等离子体处理诱发更高的表面能，其允许施加的流体/液体得到更好的润湿，从而引起晶体与锚定物质之间更好的接触，以及在表面上引入例如胺、羧基和羟基等官能团，因此经由结合提供了界面粘附。无论哪种机制，晶体表面上的锚定物的涂覆在一些实施例中不需要中间涂层，并且在任何情况下都不需要共价键，而共价键是需要湿法化学的。由此形成的键被认为是由于化学吸附引起的，化学吸附是比物理吸附更加牢固的附着形式。
进一步认为所得到的锚定物质上的反应性基团与晶体上的反应性物质之间潜在的结合是都有可能涉及多点相互作用的，每个都是较弱的，但是共同地合作以按指数律成比例的增大到较强的结合，方法是通过也可以在DNA链中的碱基对的较弱的结合中看到的“拉链”或“维可牢”效果，这种结合是难以破坏的，除非是在极端的热量条件下。这些条件将不适用于生物传感器，因为需要保护在此反应中使用的抗体，防止其发生不利于测试精确度的变性和/或构象改变。
在一些实施例中，在用例如抗生物素蛋白等锚定物质涂覆传感器之前，执行以下步骤。使用常规的显微光刻法，由压电晶片制成单独的芯片。通过将IDT侧安装在筒式壳体的下部部分内，IDT可以紧固在涂覆芯片的相对侧上。通过使用例如等离子体处理来清洁所述表面，晶体表面上所有的有机物质首先必须得到很好的清洁，所述等离子体处理可以包括例如暴露于大气等离子体产生的喷射流（等离子体处理公司（Plasma TreatCo.））。或者或此外，也可以应用紫外辐射臭氧处理。通过喷雾或接触传递（例如，通过类似于打印的方法，例如，喷墨或滚筒应用），在合适的溶剂中施加锚定层（通常5到10秒）、即抗生物素蛋白，以形成薄且均一的液体膜或微点模式。应该对膜中的锚定物质的量进行计算以形成单层。当然，精确的量将取决于锚定物质的选择并且取决于其对于压电表面的亲和性。锚定物质的通常适用范围是0.01mg/ml到5mg/ml；在一些实施例中已发现0.01到2mg/ml是可以工作的范围；而在一些实施例中进一步将范围缩小到0.01mg/ml到1.0mg/ml。下一个步骤包括用热空气流快速干燥，形成了稳定的抗生物素蛋白层以作为第一粘合剂层。在所得到的传感器可以进一步由特异性地识别特定分析物的任何希望的捕捉试剂修饰或者可以与已经暴露于并且结合到分析物的捕捉试剂反应的意义上，所得到的传感器是通用的。在这种通用状态下，可以对它进行密封（优选地在N2气氛下）和储存直到需要为止。
一个实施例包括含有中性抗生物素蛋白的试剂组成：水中的0.05到5mg/ml，作为每0.5x1cm压电材料表面具有小于10μl流体（大约3-10μl流体/0.5cm2并且优选地为5-10μl）的薄层施加。使用常规的生物素化试剂和相关方法（英杰公司（Invitrogen））制备生物素化的捕捉试剂。取代程度通常是每个捕捉试剂3到5个生物素，捕捉试剂通常是IgG，但是核酸或任何其他蛋白捕捉试剂在原则上都是可以使用的。针对在实例中定义的不同目标抗原的捕捉中所需的特定需求来优化涂层缓冲液的浓度，但这种操作是在本领域的技术范围内的。
用于生物素化的捕捉试剂的涂层缓冲液的一个实例：0.01M PBS缓冲液，其还可含有糖（例如1-10%海藻糖或蔗糖）和5-10%纯化甘油。糖和甘油充当防腐剂和囊封剂。添加叠氮化钠（0.01到0.05%）作为抗微生物剂，但是代替地可以使用另外的此类试剂。
图3示出了当在荧光显微镜上成像时生物素化的荧光胶乳珠粒（FITC加载的，1.1μm，来自英杰公司）的特异性结合的确认。在所述确认中，使用如上文所描述的方法将0.25mg/ml的抗生物素蛋白结合到铌酸锂。在用PBS和去离子水彻底洗涤之后，将每μL含有10,000个珠粒的1μm体积的被FITC标记的生物素珠粒（英杰公司）添加到芯片并且在室温下培育30分钟。在用水进行另一次洗涤之后，在荧光显微镜（200x）下对芯片成像。图A中的箭头是非特异性结合的迹线（参见箭头），而图B中的箭头表示珠粒的特异性结合。结合珠粒在用含有吐温20的缓冲液轻柔洗涤时对高达若干pN的流体动力学或流动应力具有抗性，因此它们足够稳定地结合到铌酸盐表面上的多个固定抗生物素蛋白上，以用于本发明的传感器的多种用途。
生物传感器的抗生物素蛋白涂层的稳定性是出人意料的并且是归因于与物理吸附相比更加牢固的化学吸附过程。已发现物理吸附结合是易于通过缓冲液和试剂去除的，并且容易发生热损伤，尤其是当储存在50℃以上的高温下时。因此，化学吸附过程当与捕捉试剂组合使用时提供了一种改进的低成本通用生物传感器，用于捕捉和检测特异性目标实体。
因此，如本发明所描述的涂覆方法能够快速地形成锚定物质的热稳定单层，由此使用简单的低成本方法提供可储存的通用生物传感器芯片，其与同样具有生物素化抗体的现有生物传感器相比具有潜在更好的长期稳定性。当使用这种方法制成的经过抗生物素蛋白涂覆的芯片在原子力显微镜下检测时，观察到单个的基本上均一的3-4纳米的单层。参见图2A。
本发明进一步考虑以可控制的表面密度完成形成涂层的单层，其中表面密度被定义为作为完整单层的毯状物占据生物传感器表面的分子的数目。分子停放区域是以每个分子的纳米平方数给出的。因此，当生物传感器的总表面积已知时，可以确定已知表面积的完整生物传感器表面上的沉积分子的数目，并且可以对涂层溶液中的锚定物质的浓度进行调节以产生希望的单层。固定的或未固定的单层或亚单层与多层相比是优选的，多层在洗涤期间或在它们的含有捕捉试剂的层中具有较小的稳定性。这在使用含有例如吐温20或皂苷等表面活性剂的洗涤流体时是尤其相关的。
B.经过涂覆的生物传感器的稳定性：一旦施加，稳定的锚定层任选地进一步通过使用可逆的交联剂（例如甲醛蒸气）进行交联而得到稳定，然而也可以使用其他同型双官能交联剂，例如乙二醛或戊二醛。通过暴露于磷酸盐缓冲液（10%）最多24小时或如同在标准组织化学中所进行的采用甲醇、异丙醇或丙酮的短暂溶剂固定来实现交联。通过遵循供应商的说明书中所陈述的建议时间和浓度避免了过度交联，因此抗生物素蛋白上的2个或3个剩余的暴露的生物素结合位点不会受到影响。任选地，可以通过事先暴露于可逆结合的脱硫生物素（西格玛公司）而防止结合位点被破坏，所述可逆结合的脱硫生物素随后易于被生物素或生物素化的捕捉试剂取代。这之后也可以在最高70℃的温度下进行几分钟的热固定，因为已经发现某些锚定物质（例如，抗生蛋白链菌素）在最高80℃下的溶液中是稳定的（邦氏实验室（Bang's Labs））。
当直接涂覆在芯片时，抗生物素蛋白能够以所需的灵敏度结合任何生物素化试剂，这与单层类似并且优于不太稳定的多层。当在与本文所述的浓度相比以更高的抗生物素蛋白浓度形成时或如US20110053139（通过引用的方式并入）中所述用硅烷层形成时，所述方法很可能不按与本发明的方法相同的亲和性结合抗生物素蛋白，并且倾向于在生物传感器的使用期间洗脱。然而，本发明的直接涂覆方法提供了充足的生物素结合位点，以允许特异性试剂与涂层的稳定附着，这种稳定性即使是在与仍然可用的生物素结合位点中的一者或两者反应的较大的生物素化抗体的结合之后仍然持续。这些特征即使是在洗涤期间或升温之后暴露于来自流体力的流体动力学应力时也得到了维持。
如图4中所示，不同类型的抗生物素蛋白可以用于涂层中并且也是非常稳定的。图4示出了结合到铌酸锂的抗生物素蛋白在4℃下储存一个月的时间内的光学密度。所述芯片是根据本发明的方法制备的。在用PBS充分洗涤之后，将芯片浸没于无菌PBS中储存并且在4℃下放置最多一个月。每周一次，使用邻苯基二胺二盐酸盐片剂（西格玛公司）用生物素辣根过氧化酶分析法对阳性对照（+抗生物素蛋白）和阴性对照（-抗生物素蛋白）芯片进行测试。在添加底物和终止反应溶液（硫酸2.5m）之后，用Bio-TekSynergy HT酶标仪读取图4中的O.D.。O.D.显示抗生物素蛋白与芯片的结合与最初结合时一样普遍。
在固定状态下，通用抗生物素蛋白生物传感器（也称作生物传感器组件）的极好的热稳定性在将用于无法轻易获得冷冻机储存的热带气候的任何POC测试中都是非常重要的。因此，所述通用抗生物素蛋白生物传感器并不需要保护性涂层，但是它需要保持密封，优选地在氮气氛中。通过PAFRA TM方法（US5,098,893和EP0223221）在单次使用的现成样本处理管内部实现了目标特异性抗体制剂在稳定玻璃态下的稳定化，所述PAFRA TM方法已经成功地用于不稳定酶的室温储存。举例来说，可以使用含有例如糖和甘油等防腐剂的涂层缓冲液。
C.间接涂覆方法除了直接涂覆晶体表面之外，本文所述的方法还可以用于将抗生物素蛋白涂覆在用于涂覆晶体表面的其他材料上，包括现有技术的预涂层（但不限于此）。更为广泛的应用也是可能的：例如，直接制造当前在多个步骤中制造的经过抗生物素蛋白涂覆的磁性或胶乳粒子或横向流动膜。硅酸钠或二氧化硅通常用于涂覆表面，以作为波导保护水平剪切波。本发明的抗生物素蛋白结合方法很好地结合到二氧化硅或玻璃态表面上，因此它可以叠加在波导表面上。此外，所述方法可以应用于在不可逆的玻璃态层中捕捉抗生物素蛋白，所述玻璃态层用酸转化为二氧化硅-Nav层，获得了如在US2011/0053139中所教示的结合和二氧化硅导引层。在其他实施例中，涂覆在晶体表面上的金属离子，例如银（其结合所述表面并且使所述表面变黑）、铜、金或铁，可以提供用于本文揭示的方法的间接涂覆的衬底。银盐或金盐也可以结合并且形成表面结合硫醇和二硫化物的蛋白质（如IgG），和抗生物素蛋白。
通过用硅酸钠溶液接触铌酸锂晶体将抗生物素蛋白涂覆在沉积在压电材料表面上的二氧化硅（SiO2）涂层上，抗生物素蛋白随后结合到如上文所描述的用于直接结合的二氧化硅涂层上。
如图5所示，抗生物素蛋白确实结合到SiO2上，以使用本文所述的方法涂覆铌酸锂。在彻底PBS洗涤和阻断步骤之后，将生物素HRP添加到芯片中并且在室温下培育45分钟。添加底物以诱导HRP酶的变色20分钟，之后添加终止溶液。在图5的图A中，在490nm下读取吸收度（O.D.）。结合到二氧化硅的抗生物素蛋白的O.D.在左列示出，而没有抗生物素蛋白的二氧化硅则在右列示出。从阳性值（1.6）中减去阴性值（0.2），O.D.的读数仍然是1.4，这被视作是抗生物素蛋白的良好结合。（图5的图B比较了抗生物素蛋白的结合与中性抗生物素蛋白的结合。抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白都具有大致相同的O.D.。然而，此实验中的抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白是直接涂覆在压电表面上的。图B呈现了在扣除阴性测量值之后的两个阳性抗生物素蛋白测量值的平均值。）
D.将分析物结合到涂覆的生物传感器
在一些实施例中，晶体表面上结合的抗生物素蛋白需要活化以结合所关注的分析物。活化包括例如抗体等生物素化粘合剂，其对于所关注的分析物抗原具有特异性。抗体或其他试剂在附着到经过抗生物素蛋白涂覆的芯片之前进行生物素化。抗体可以在附着到抗生物素蛋白底物之后或之前结合到其分析物抗原上。分析物生物素化抗体复合物可以在传感器之外形成并且随后所述复合物可以与传感器接触，由此抗体上的生物素将结合到经过抗生物素蛋白涂覆的芯片。这两种方法中的哪一种是优选的取决于分析物并且取决于样品处理。这两种方法都是在本发明的范围内的。再次使用AFM，对于具有结合到芯片表面上的抗生物素蛋白的特定抗体的表面涂层的分析确定了6到9nm的深度，表明所述抗体确实结合到抗生物素蛋白层。（参见图2）
施加抗原特异性的生物素化捕捉试剂以形成第二层，所述第二层由非干燥介质中的结合且过量的自由的生物素化试剂组成，所述介质也含有本领域中已知的蛋白稳定剂，例如（但不限于）蔗糖、海藻糖、甘油等等。多种试剂可以是生物素化的，其中最常使用的是生物素化抗体，其特异性地识别所关注的分析物。可以通过化学或酶促方式对蛋白捕捉试剂进行生物素化。化学生物素化利用多种已知的偶联化学反应以产生胺、羧酸酯、巯基和碳水化合物的非特异性生物素化。还应理解N-羟基丁二酰亚胺（NHS）-偶联赋予了蛋白中的任何伯胺的生物素化。利用细菌生物素连接酶的酶生物素化引起了特定序列内的特异性赖氨酸的生物素化。大多数化学生物素化试剂是由经由键联基团连接到生物素的戊酸侧链的反应性基团组成。酶生物素化最通常是通过在所关注的蛋白质的N端、C端或内部环处将所述蛋白质键联到15个氨基酸肽（被称为AviTag或受体肽（AP））来进行的。这些生物素化技术是已知的。
捕捉试剂可以是抗体或适体或由以下各项中的任何一者形成的其他特异性配体或受体：生物素化的寡核苷酸、核苷酸、核酸（Pon,Richard T.(1991)，“用于自动化合成5′-生物素化寡核苷酸的长链生物素亚磷酰胺试剂（A long chain biotin phosphoramiditereagent for the automated synthesis of5′-biotinylated oligonucleotides）”，四面体通讯（Tetrahedron Letters）32(14)：1715-8）、蛋白质、肽和包括IgA、IgG、IgM、IgE的抗体、酶类、酶辅因子、酶抑制剂、膜受体、激酶、蛋白质A、聚尿苷酸、聚腺苷酸、聚赖氨酸受体、多糖、螯合剂、碳水化合物、糖。
一旦结合，捕捉试剂就短暂地暴露于热空气中以实现来自所施加流体的水的部分移除，形成保护性的且稳定的凝胶，所述凝胶将确保抗体等结合蛋白质粘合剂在非干燥凝胶层中的长期稳定性，这允许第二抗原特异性粘合剂层的基本上完整的随时间而变的形成。这些玻璃状层任选地经过脱水，用于在套筒的袋的内部的二氧化硅干燥剂颗粒或分子筛的存在下储存。套筒的上部腔室经过密封以形成流体隔室。随后在塑料的储存袋内部对具有腔室的套筒进行密封，优选地是在N2气氛中。
锚定物质（抗生物素蛋白）与生物素化捕捉试剂之间的结合导致在芯片上形成第二捕捉试剂层。在使用之前，在分析过程期间保护性凝胶层中的任何残余的未结合的生物素化捕捉试剂和其他组分可以通过用分析缓冲液或甚至用样本流体进行简单冲洗而轻易地移除。如图6和图7所示，已经证实这些传感器检测到了抗原。当捕捉试剂是抗体时，它可以按范围在0.025到25μg/ml的含量（举例来说且不限于）来施加。
E.使用生物传感器的分析物的结合和疾病检测
根据本发明的生物传感器可以很容易地批量生产，以便在配备含有特异性地结合到所关注的分析物的捕捉试剂的适合的正确生物膜涂层时，检测多种试剂和生物化学标记。可以利用此集成式生物传感器的应用的实例包括人类和兽医诊断学。分析物被定义为作为传染物或者在传染物中发现或者由传染物产生并且可以用于检测的任何物质，包括但不限于寡核苷酸、核酸、蛋白质、肽、病原体片段、裂解病原体和包括IgA、IgG、IgM、IgE在内的抗体、酶、酶辅因子、酶抑制剂、毒素、膜受体、激酶、蛋白质A、聚尿苷酸、聚腺苷酸、聚赖氨酸、多糖和螯合剂。先前已经描述了抗原-抗体相互作用的检测（美国专利案号4,236,893、4,242,096和4,314,821，所有这些明确地通过引用的方式并入本文中）。另外，本发明的范围还涵盖在全细胞（包括原核（例如病原性细菌）和真核细胞，包括哺乳动物肿瘤细胞）、病毒（包括逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒、慢病毒等）、真菌、寄生虫和孢子（包括传染物的表型变化，例如血清变型或血清型）的检测方面的应用。
F.压电材料的类型
多种压电材料适合用于本发明中而不会受到限制。还包括（但不限于）所有大小的抛光晶片，所述晶片是按不同晶体取向市售的，其尤其适用于在表面声波（SAW）或体声波（BAW）模式下的表面声波的传播。虽然晶体两侧都抛光是优选的，但是在一些应用中单侧抛光材料也是适用的。所有的各种晶体取向都涵盖在本发明的范围内。兰克赛（langasite）晶体也是合适的。实例是铌酸铅镁/钛酸铅（PMN-PT)、锆铌酸铅/钛酸铅（PZN-PT）、铌酸锂（LiNbO3）、具有掺杂物的铌酸锂、四硼酸锂（Li2B4O7）、钽酸锂和石英（但不限于此）。钛酸钡（BaTiO3）也是用于室温应用的压电晶体的非铅来源。
可以用于本发明的其他晶体的实例包括以下各项：块磷铝矿（泄漏的SAW）、正磷酸镓（瑞利（rayleigh））、铌酸钾（SAW和BAW候选）、锆钛酸钡、氧化硼酸镧钙（可能用于未来的SAW）、兰克赛晶体（如硅酸镧镓）；陶瓷，例如钙钛矿型陶瓷结构（KNbO3、Ba2NaNb5O5、SrTiO3、Pb2KNb5O15、铁酸铋、NaxWO）、锆钛酸铅（用于谐振器或转换器）、硫化镉（通常的光电阻传感器）、氧化锌（由于OH基团的反应性可以作为膜施加）、砷化镓、氧化铋和氧化锗（光学器件/绝缘体）、氮化铝（作为压电膜），以及聚偏二氟乙烯（PVDF膜）。
此外，可以使用多晶体元件。具体来说，它们将适用于出于多种目的在多个方向上传播波。并且，压电膜可以以夹层形式结合到非压电材料，且因此此类构造不是排除于本发明之外的先验结果。
2.声波传感器
对于压电晶体谐振器，声波在晶体的主体内行进（即，主体模式）或在晶体的表面上行进，已发现这两者都有若干种形式。体声波（“BAW”）穿过晶体介质行进，并且通常使用的BAW装置是厚度剪切模式（TSM）、声波板模式（APM）以及水平剪切板模式（SH-APM）。通常使用的SAW装置包括水平剪切表面声波（SH-SAW）、表面横波（STW）以及洛夫波（LW）。在生物传感器中，这些波不应是衰减的，或它们丧失以所需的灵敏度检测生物流体中的分析物的能力。无论波的类型如何，在不显著地衰减波的情况下保持质量变化的联系是传感器开发中的一个重要问题。在本发明中，虽然考虑到所有这些波模式，但是最终的模式选择需要是对生物质量变化极度敏感的，而不会在与流体接触时使所述波衰减。为了实现此目标，传感器的配置也很重要。因此，本发明的传感器的结构以及与每个传感器一起使用的波的性质得到了优化。
由于体波穿过晶体材料行进，因此它们被认为是不太敏感的生物传感器。体波灵敏度需要以简单且一致的生物涂层（例如通过本发明提供的）来保持，因为当进一步从产生的体波中移除质量结合并且质量与波频率之间的相关性丧失或减弱时，会丧失灵敏度。因此，体波可以与根据本发明的锚定物质涂层一起使用。
此外，所述生物涂层必须是易于施加的并且在装置到装置之间是一致的，否则的话装置之间的可变性将使它们难以在治疗是基于诊断且诊断精确度是取决于装置灵敏度（而特异性主要取决于捕捉试剂）的卫生保健环境中使用。此外，所选择的生物涂层必须一致地且可再现地结合捕捉试剂，否则的话可变性将导致遗漏的或不精确的诊断（如同在包括硅烷、水凝胶或聚合物涂层的现有技术装置的情况中，所述现有技术装置无法一致地提供均一涂层且不以一致的强度结合蛋白质）。
虽然表面产生的波对质量变化更加敏感，但是例如STW等常规的SAW装置通常是用于生物流体的较差的选择，因为它们以相当深的深度穿透到生物流体中，由此减弱了所述波。SH-SAW提供了更好的生物传感器，因为波是水平地极化的，然而它们需要通过波导进行保护。
本发明克服了围绕多种类型的表面声波作为生物传感器的使用的许多问题。这是通过使用新颖的压电生物传感器配置而完成的，所述压电生物传感器配置在一些实施例中利用了所描述的声波板模式（APM）波，但是在其他实施例中可以采用替代性的波形式，例如本文所描述的SH-SHEAR。获得了用于在含水的流体中分析生物样品的快速且有成本效益的系统。在一些实施例中，这部分地是通过在与流体接触的压电介质的表面（或部分）与两个(2)IDT元件所接触的压电晶体的相对表面或孤立部分之间提供流体不可渗透的屏障而实现的。所述屏障可以呈防漏腔室的形式，其中流体得到限制。当使用所述装置时，压电介质的所述部分将与流体样品接触，形成所述腔室的一个壁。获得了适用于检测含水生物流体中的目标实体的简单的集成式生物传感器。
这种新颖的生物传感器还包括生物膜芯片，所述芯片可以带有根据本发明的新颖的直接涂层，或者可以带有与如上文所描述的中间层叠加的间接涂层。因此，本发明的具体实施例是一种集成芯片，其中生物膜和专用APM模式压电生物传感器形成了用于POC诊断装置的平台的分析组件并且其中根据本发明对分析组件进行了描述。
在一些实施例中，本发明在生物涂覆方法中合并了新颖的化学反应并且改进了压电式传感器以产生利用声波板模式波的新颖的压电生物传感器配置，所述波是从位于表面上的IDT处产生的，并且对在目标实体的分子检测中使用的捕捉试剂进行了侧接。APM是分开的或屏蔽的以免受沿IDT的平面作为瑞利波行进的横向波的干扰。在其他具体实施例中，本发明合并了一种生物传感器设计，其具有屏蔽电气组件（如IDT）和位于含有感测表面的流体腔室的任一侧上的绝缘膜的电气连接。所述感测表面含有非绝缘区域，其特异性地涂覆有一层或多层固定试剂，包括被设计用于捕捉流体样品中的目标实体的目标特异性捕捉试剂。通过附着到感测表面上的流体隔室的尺寸确定生物流体样品的体积。通过敏感的商业信号分析仪检测（例如网络分析仪，例如由安捷伦公司（Agilent）制造的那些）由结合的目标实体产生的APM信号的波扰动。
本发明改进了在商业或实验生物传感器中使用的现有技术，方法是在压电生物传感器中合并了APM，由此APM能够以较高的灵敏度响应于压电表面的相对侧上的频率改变，而无需层导引或波导。本发明进一步考虑了捕捉层的使用，如同在美国公开申请案号2011/0136262中讨论的（所述申请案以引用的方式并入），以及在传染物、其片段，以及生物样品中的衍生的毒素或蛋白质的快速检测中采用用于目标事件的多路复用分析的微通道的其他内容。
本发明的一些生物传感器实施例可以在某些方面类似于常规的基于SH-SAW的传感器。因此，举例来说，在一些实施例中，本发明的生物传感器还使用可以是例如基于铌酸盐、石英、二氧化硅或钽酸盐的压电表面（作为本文中提供的其他材料中的一种选择）；位于相同压电表面上的成组输入和输出IDT，作为通常由覆盖大量的依次沉积的底层形成的目标特异性粘合剂层；来自流体样本的目标分子的捕捉；以及由于结合质量的波的本质的变化的结合目标的检测。基于这些现有技术传感器的本发明的生物传感器采用了如下文所描述的施加锚定涂层的非常简单的方法。
然而，其他实施例的不同之处在于在现有技术中报道的与SAW生物传感器不同的额外的重要方面，方法是利用结合目标所位于的沿着压电表面的裸露的或非绝缘区域，而声波是在相对侧上产生的并且穿越了晶体的物质。除了使用瑞利波来检测所述表面上的分子之外，使用APM（主体或板模式波）来感测相对侧上的液相中附着的分子。不同于瑞利波，APM能够在液体中操作并且检测相对表面上的变化。根据实验结果，APM具有在IF范围内的高Q因子（大于1000）。更高的因子产生更高的灵敏度和更多的频率变化。
因此，本发明的一些实施例采用了APM模式。图10示出了用于瑞利波的理论模型和用于本发明中的应用的128°YX切割或Z切割LiNbO3衬底上的APM。感测区域对应于流体腔室，而待测试的生物样品放置在压电衬底的顶部。所述波是在底部产生的并且移动穿过压电介质以检测结合到顶部表面的分析物（经由直接附着到表面上的抗生物素蛋白分子），在遇到额外量的捕获分析物之后，波的频率将发生改变。虽然已经在图10中描述了128°YX切割或Z切割，但是在本发明中也可以考虑其他切割，可以对这些切割进行优化以通过常规实验提供相同或大约相同的灵敏度。合并了用于APM的ZX切割的另一实施例如Andle,J.C等人，传感器和致动器（Sensors and Actuators）B24-25（1995）129-133：“选择性声波板模式DNA传感器（Selective acoustic plate mode DNAsensor）”所描述。
在另一实施例中，使用SAW波来检测结合在128°YX切割LiNbO3衬底的相对侧上的分子。所结合的分子质量干扰了SAW并且改变了它们的反射。可以按多种方法测量频率的变化，例如，测量谐波的中心频率中的位移。
在图11的图A和图11的图B中示意性地描绘了用于所述生物传感器的两个实施例。图A示出了具有接触点(1)的生物传感器套筒或壳体（10）。能够产生APM波的例如LiNbO3等压电衬底是一些适当的选择，其中优选的材料在一些实施例中是128°YX切割或Z切割铌酸锂（LiNbO3）。所述生物芯片还包括交叉指型转换器（IDT）作为IDT波发生器(2)和IDT波接收器(3)以及功能化的裸露晶体的功能化表面的绝缘区域中的其他电气组件。绝缘体可以例如由已知的聚合性绝缘膜组成。含有目标实体或分析物的生物流体样品在穿过可选的滤波器(6)的初步过滤之后穿过入口端口(5)进入流体腔室(4)。捕捉试剂(7)附着到功能化的表面的非绝缘区域上。抗原(8)与受体(7)的结合在来自遍及流体腔室的IDT波发生器(2)的APM波的流动中产生了扰动，通过相对侧上的IDT波接收器(3)，这种扰动作为修饰过的APM波得到检测（修饰反映在其频率中）。流体入口端口上的流体过滤器(6)是任选地需要的，以排除由于较大的非目标微粒的潜在的非特异性结合（NSB）。流体随后穿过出口端口(9)离开所述腔室。IDT是位于相对表面上的事实可以在图10中进行说明，图10虽然是理论上的，但是示出了所述配置。
图11的图B描绘了根据本发明的具有多个以下通道的涂覆生物传感器：分析物通道15、阳性对照通道16和参考通道17。图11中的元件(1-6)对应于图10中的(1-6)。(7)是出口端口，(8)是输出连接器，(9)是输入连接器，10是晶体衬底。
3.多阵列装置
本发明的另一实施例是单个的、一次性套筒系统的制造，所述系统涵盖了利用多种波模式和增强的单个传感器或多个传感器。每个套筒以最少量合并了传感器以及用于包封所述传感器且处理流体套筒内的流体的系统。传感器的利用可以通过与读取器系统直接有线接触或者通过无线模式。
在最简单的实施例中，每个传感器都合并有应用于压电衬底的电子元件和/或生物元件。图11的图A描绘了具有在声波板模式（APM模式）中使用的单个延迟线结构的传感器的一个实施例。在所述APM模式中，电子元件是相对于生物元件和流体元件发生接触的一侧施加在衬底的相对侧上的。在其他波模式（例如SAW或SH-SAW）中，这些元件可以与生物元件和流体元件一样放置在衬底的相同侧上，其中添加或不添加波导。能够产生APM波的压电衬底是涵盖在此实施例的范围内的。一个实例是一种材料，即，128°YX切割或Z切割铌酸锂（LiNbO3）。其他实施例合并了SH-SHEAR波。所述波导通常由聚合物组成，但是也可以通过聚合物的组合或金属的组合或单独的金属制成。延迟线合并有接触点(1)和交叉指型转换器(2)和(3)。如果使用无线系统来询问电路的话，那么可能不需要接触点(1)。交叉指型转换器（IDT）是按匹配对（或多个匹配对）实施的，其中每组包括IDT波发生器(2)和IDT波接收器(3)。在一些实施例中，发生器和接收器可以是相同的。考虑合并的其他元件包括（但不限于）反射器、放大器、额外的接地、吸收器或由已知的聚合性绝缘膜组成的绝缘体的使用。
在图11的图A中示出了传感器的非电子元件。所述流体套筒含有流体腔室(4)、入口端口(5)和可选的串联过滤器(6)。在穿过可选的串联过滤器(6)进行过滤之后，含有目标实体或分析物的生物流体样品穿过入口端口(5)进入流体腔室(4)。流体腔室(4)可以与电子元件位于相同侧上（如同在SH-SAW模式的情况下）或者相对侧上（对于用作APM模式传感器）。当生物流体样品与衬底接触时流体腔室(4)是预定义的区域（具有或不具有生物膜或其他修饰）。捕捉试剂(7)附着到压电衬底表面的一个区域（如同通过流体腔室(4)的可能是或可能不是绝缘的区域定义的）。抗原(8)与受体(7)的结合对遍及流体腔室的来自IDT波发生器(2)的APM波的流动造成了扰动，这种扰动通过相对侧上的IDT波接收器(3)被检测为修饰过的APM波（修饰反映在其频率、幅度、相位或其他衍生信息中）。流体入口端口上的流体过滤器(6)是可选的，但是可能是必需的，从而排除潜在的非特异性结合剂（NSB），其是来源于更大的非目标微粒的。流体随后穿过出口端口(9)离开所述腔室到达废弃物容器。
图11的图B描绘了具有并行配置的三个延迟线的APM模式传感器的一个实施例：活化的延迟线、阳性对照延迟线和参考延迟线。此结构可以扩展为包括额外的延迟线或多个传感器以配置多阵列的单个的、一次性系统，以诊断单个感染性元素或条件，量化感染或疾病的程度或区别密切相关的疾病、具有类似症状的疾病或频繁地同时发生的感染，例如，性传播的疾病组。具有多个延迟线的传感器或多个传感器还可以放置在并排的、错开的或径向的配置中。
实例1：用于涂覆带有中性抗生物素蛋白和生物素化抗体的生物传感器芯片的手动方法：
所有的这些方法实际上已经执行过了。
a.无需固定的涂覆：在施加抗生物素蛋白之前在大气压下用等离子体产生装置（例如等离子体处理公司，美国伊利诺斯州埃尔金市（Plasma Treat USA,Elgin,IL））清洁和活化LiNbO3表面大约1-10秒，抗生物素蛋白的施加是通过以0.5mg/ml的抗生物素蛋白浓度在PBS中的含有50%的甘油的溶液中油墨喷射抗生物素蛋白实现的，随后使用来自热风枪的温空气在大约50℃下进行短暂的干燥或在室温下进行大约30分钟的干燥，以将抗生物素蛋白结合到表面，现在生物传感器准备好进行使用或包装。
任选地，中性抗生物素蛋白的沉积之后是固定步骤。
b.采用热固定的涂覆：如实例1a中所描述的通过油墨喷射来施加中性抗生物素蛋白。可以通过用红外加热灯在最多30分钟内加热到大约30-50℃将中性抗生物素蛋白固定到压电衬底上。
c.采用溶剂固定的涂覆：在实例1a中制作的且由热风枪干燥的生物传感器的涂覆区域；随后暴露于用100%的异丙醇或丙酮饱和的空气流中大约15秒，所述空气流是通过在这些溶剂中鼓泡制成的，随后短暂的暴露于氮气流中。
d.采用蒸汽的涂覆：如同实例1a中的固定的中性抗生物素蛋白的固定是通过加热干燥以及随后暴露于用甲醛饱和的空气流中，所述空气流是通过在10%的甲醛溶液中对空气鼓泡制成的，并且旨在使中性抗生物素蛋白层干燥大约15秒，随后用氮气干燥大约15秒。
e.将生物素化的抗体附着到芯片上的抗生物素蛋白涂层：所选定的针对特定分析物的抗体是使用市售的试剂盒（例如，英诺华生物科学（Innova Bioscience）或飞世尔科学（Fisher Scientific））生物素化的。使用0.05%的BSA/PBS缓冲液将生物素化抗体稀释到希望的浓度。基于在制造商的说明书中提供的抗体的已知的亲和性，在室温下在抗生物素蛋白固定的芯片上将此抗体制备物培育15-60分钟。
实例2：自动化涂覆方法
a.用于中性抗生物素蛋白生物传感器的自动化直接涂覆模式：
一些实施例的联机生产涉及在附着到生物传感器壳体的下部部分的压电晶体上的中性抗生物素蛋白涂层的沉积，所述壳体随后被安装在传送带上。在等离子体处理之后，传感器移动到中性抗生物素蛋白喷墨站并且由含有0.01到5.0mg/ml或0.01-2.0mg/ml或每0.5平方厘米区域0.01-1.0mg/mlby重量的中性抗生物素蛋白的5-10μl流体涂覆。通过短暂地暴露于来自热风枪的热量（大约50℃），所述流体得到蒸发并且中性抗生物素蛋白固定在生物传感器上。随后盖上壳体的上盖以形成生物传感器套筒的防漏流体腔室。
b.用于涂覆具有生物素化抗体的中性抗生物素蛋白的自动化涂覆模式：
使用如同上文在2a中描述的类似的喷墨方法，在室温下在pH值为7.4的、1-10%海藻糖、1-5%甘油、0.05%叠氮化钠的0.01M PBS-0.1%BSA的非干燥的稳定凝胶基质中涂覆稀释到适当稀释度的生物素化抗体，随后用来自热风枪的温空气部分蒸发大约1分钟。在随后的塑料袋中的储存期间，生物传感器上的凝胶涂层被留在表面上以用固定的中性抗生物素蛋白完成与生物素化抗体的反应。
c.用于涂覆带有生物素化寡核苷酸的抗生物素蛋白的自动涂覆模式：
执行实例2b的方法，但是代替地在凝胶基质中稀释生物素化寡核苷酸。
d.组装和包装：在步骤a、b或c的涂覆方法之后，套筒外壳的上部部分进行附着以形成流体腔室，所述流体腔室完全与芯片的背侧上的电子组件分离。
此实例的自动化涂覆方法也可以在常规类型的传感器（即，那些具有中间涂层的）上实践，并且在中间的氧化物涂层已经用根据本发明的实施例的简单的两步方法施加的传感器上实践。
实例3：生物传感器上的检测到的沙眼衣原体
实验是用沙眼衣原体进行的，沙眼衣原体是一种专性的细胞内细菌，其会在女性和男性中引起性传播疾病。在实例1中描述了用于涂覆抗生物素蛋白和抗体的流程。所使用的抗体是针对沙眼衣原体（阿布凯姆（Abcam））的主要外膜（MOMP）的单克隆抗体，所述抗体是生物素化的并且在0.25μg/ml下使用。沙眼衣原体是从麦克罗比公司（Microbia）获得的，并且在每毫升105个的浓度下悬浮于PBS/缓冲液中；在一个类似实验中，单克隆抗体是针对沙眼衣原体原质小体脂多糖（梅迪克斯公司（Medix））产生的。在室温下将生物素化的抗EB LPS的105EB+0.25μg/mL的原质小体（EB）等分试样培育30分钟并且随后添加到所述芯片。图6和图7描绘了用这些特异性感染性抗原进行的实验的结果。图6是采用带有结合到抗体的沙眼衣原体原质小体的AMT芯片的荧光显微镜切片的一系列黑色和白色踪迹，所述抗体结合到中性抗生物素蛋白。部分A描绘了阴性对照（具有单独抗生物素蛋白并且不具有抗体的芯片）的图像，用于部分B的显色剂是核酸DAPI并且用于部分C的是FITC标记的抗-抗沙眼抗体。此实验确认了芯片上的细胞材料的存在，这示出了抗原是结合到固定抗体的，而所述抗体又结合到抗生物素蛋白锚定物。
图7是随时间变化的频率的曲线图，并且示出了随着衣原体与抗衣原体的结合的频率偏移。如实例1中所描述的芯片是用抗生物素蛋白制备的并且是在如上文所描述的套筒中组装的。执行两个1小时（1x）的PBS基线测量以确保芯片的稳定性。频率的逐渐的倾斜是由于流体中的温度改变。它将最终在30分钟之后稳定下来（未图示）。在室温下将抗体-抗原混合物培育30分钟，并且随后在第三区段中添加到芯片持续1小时。第四区段是在用PBS彻底洗涤芯片之后的读数。从基线1中减去最终洗涤获得了一个频率偏移，产生了223.66Hz的值并且示出EB结合到所述芯片。
所述传感器使用了在图11中示意性描述的配置，但是具有单个通道并且是使用丙烯酸的多个层以及粘着剂的若干层和透明薄片组装的，以形成围绕所述传感器的形式配适的套筒，其中在传感器的接触点的底部并且在顶部上、入口和出口端口上进行曝光。所述实验是使用安捷伦HP8753E信号分析仪进行的。在此实验中，在基线缓冲液施用和之后的抗体施用以及随后的最终衣原体抗原施用之间观察到了800MHz的频率偏移。尽管存在最终的洗涤，但是频率偏移仍然保持，这指示出抗原是造成声波板模式传感器的频率改变的原因。
实例4：生物传感器上检测到的登革热病毒
用于涂覆抗生物素蛋白和抗体的流程是在实例1中描述的。图8描绘了当悬浮在PBS缓冲液中时针对用登革热病毒进行的实验的频率偏移。登革热病毒是一种引起登革热发烧的黄病毒，其每年大约影响一亿人。它是通过城市居住的蚊子埃及伊蚊（Aedipusegyptii）传播的。四种血清型是已知的，虽然在任何一个时间点处仅有一种血清型造成感染。血清型可以在若干年内发生改变。血清型2是当前已知的最常见血清型。针对登革热病毒的实验采用了0.05%BSA-PBS中的4μg/ml的对抗血清型2抗体（凡尔登公司（Feldan））的单克隆包膜蛋白，在室温下培育30分钟。执行PBS洗涤以移除过量抗体。登革热类型2抗原是从Microbix获得的。病毒以市售原料的标准浓度（1X）PBS/缓冲液（每毫升104个或8μg/ml）悬浮（这类似于急性感染条件下的人类病毒血症的程度）。声波板模式传感器和波发生器与实例3中的相同。在基线缓冲液（对照）与抗体制备物的应用和附着之后的传感器以及之后的登革热病毒抗原的应用之间观察到500MHZ的频率偏移。尽管存在最终的洗涤，但是频率偏移仍然保持，这指示出抗原是造成声波板模式传感器的频率改变的原因。结果在图8中示出，图8是峰频率与时间的曲线图并且表明了频率偏移。执行两个PBS（1x）基线测量以确保芯片的稳定性，每个小时执行一个。在第三区段中将登革热病毒添加到所述芯片1小时。第四区段是在用额外的PBS彻底洗涤芯片之后的读数。从基线1中减去最终洗涤确定了一个频率偏移，以获得278.62Hz的值，示出了病毒结合到所述芯片。
实例5：蛋白质检测
图9是频率与时间的曲线并且描绘了在芯片暴露于抗体之前和之后看到的频率偏移。在实例1中描述了用于涂覆此抗体的方法。所述传感器与实例3中的相同。箭头1示出了当只有抗生物素蛋白已经结合到传感器时从传感器接收到的频率。箭头2示出了在施加抗体之后从所述传感器接收到的频率。所述抗体是一种针对生物素化的沙眼衣原体的原质小体的多株抗体并且是在1:200的稀释度下使用的（马萨诸塞州剑桥市的阿布凯姆（Abcam,Cambridge,Massachusetts）-AV20387）。可以看到100MHZ的改变，变换是由于将抗体添加到芯片而发生的。
除非另有定义，否则本文中所用的所有技术及科学术语均具有如一般技术者通常了解的相同含义。
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所属领域的技术人员只需使用常规实验即可识别或能够确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等效物。此类等效物是意图由上文的权利要求书涵盖的。
本文中所引用的所有专利和其他文献都通过全文引用的方式并入。

Claims (32)

1.一种声波生物传感器组件，其包括压电晶体，所述压电晶体包括直接结合到压电材料的表面的锚定物质层，所述锚定物质具有结合到捕捉试剂的性质，所述捕捉试剂包括或由针对所述锚定物质的特异性结合搭配物组成。
2.根据权利要求1所述的生物传感器组件，其中所述锚定物质是抗生物素蛋白，优选地是抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素。
3.根据权利要求1所述的生物传感器组件，其中所述锚定物质层是单层。
4.根据权利要求1所述的生物传感器组件，其中所述压电材料选自由以下组成的群组：兰格奈特（langanite）晶体、铌酸铅镁、钛酸铅、锆铌酸铅、钛酸铅、铌酸锂、具有掺杂物的铌酸锂、四硼酸锂、钽酸锂、石英、钛酸钡、块磷铝矿、正磷酸镓、铌酸钾、锆钛酸钡、氧化硼酸镧钙、兰克赛（langasite）晶体、硅酸镧镓、钙钛矿型陶瓷结构、铁酸铋、锆钛酸铅、硫化镉、氧化锌、砷化镓、氧化铋和氧化锗、氮化铝和聚偏二氟乙烯。
5.根据权利要求1所述的生物传感器组件，其中所述压电材料是铌酸锂。
6.根据权利要求1所述的生物传感器组件，其进一步包括壳体和流体腔室，其中带有所述锚定层的所述压电材料的所述表面形成了所述腔室的壁。
7.根据权利要求1所述的生物传感器组件，其中所述锚定物质是寡核苷酸或聚核苷酸。
8.根据权利要求1所述的生物传感器组件，其进一步包括声波发生器和声波接收器。
9.根据权利要求8所述的生物传感器组件，其中所述波发生器产生体声波或表面声波。
10.根据权利要求9所述的生物传感器组件，其中所述体声波发生器产生选自由以下组成的群组的波：厚度剪切模式、声波板模式和水平板模式。
11.根据权利要求9所述的生物传感器组件，其中所述表面声波发生器产生选自由以下组成的群组的波：水平剪切表面声波、表面横波以及洛夫波。
12.一种用包括锚定物质的生物膜涂覆压电材料的表面的方法，所述锚定物质具有结合到捕捉试剂的性质，所述捕捉试剂包括或由针对所述锚定物质的特异性结合搭配物组成，所述方法包括：
a.处理压电材料的晶体表面以增大所述晶体表面的表面能；
b.将一层所述锚定物质施加到所述晶体表面；
c.在所述晶体表面上形成化学吸附型锚定层。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述处理步骤包括等离子体处理。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述等离子体处理包括暴露于大气等离子体喷射流大约5到10秒。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述压电材料选自由以下组成的群组：兰格奈特晶体、铌酸铅镁、钛酸铅、锆铌酸铅、钛酸铅、铌酸锂、具有掺杂物的铌酸锂、四硼酸锂、钽酸锂、石英、钛酸钡、块磷铝矿、正磷酸镓、铌酸钾、锆钛酸钡、氧化硼酸镧钙、兰克赛晶体、硅酸镧镓、钙钛矿型陶瓷结构、铁酸铋、锆钛酸铅、硫化镉、氧化锌、砷化镓、氧化铋和氧化锗、氮化铝和聚偏二氟乙烯。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述压电材料是铌酸锂。
17.根据权利要求12所述的方法，其中所述施加步骤包括将所述锚定物质喷雾或接触传递到所述表面层上以在所述表面上形成薄的均一的液体膜。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述薄的均一的液体膜是微点。
19.根据权利要求12所述的方法，其中所述锚定物质是抗生物素蛋白，优选地是抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述施加步骤进一步包括干燥所述锚定层。
21.根据权利要求12所述的方法，其进一步包括：用包括捕捉试剂的组合物接触所述结合的锚定物质层，所述捕捉试剂具有特异性地识别生物流体中的分析物的特性，和使得所述捕捉试剂通过所述锚定物质的特异性结合搭配物结合到所述锚定物质。
22.一种用包括锚定物质的生物膜涂覆压电材料的表面的方法，所述锚定物质具有结合到捕捉试剂的性质，所述捕捉试剂包括或由针对所述锚定物质的特异性结合搭配物组成，所述方法包括：
a.向压电材料的晶体表面施加硅酸盐、锆酸盐或钛酸盐的溶液并且与酸反应以分别形成二氧化硅、氧化锆或二氧化钛的中间层；
b.将一层所述锚定物质施加到所述中间层，以在所述晶体表面上形成锚定层。
23.一种声波生物传感器，其包括：
a.压电晶体，所述压电晶体包括直接结合到所述压电晶体的表面的锚定物质层，所述层中的所述锚定物质还结合到捕捉试剂，所述捕捉试剂包括或由针对所述锚定物质的特异性结合搭配物组成并且特异性地识别在生物流体中存在的分析物；
b.声波发生器，所述发生器产生波，其中所述捕捉试剂与分析物之间的反应引起了所述声波的特性的可检测的改变。
24.根据权利要求23所述的生物传感器，其中所述晶体是铌酸锂。
25.根据权利要求23所述的生物传感器，其中所述锚定层是单层。
26.根据权利要求23所述的生物传感器，其中所述捕捉试剂特异性地识别选自由以下组成的群组的分析物：全细胞、细菌、真核细胞、肿瘤细胞、病毒、真菌、寄生虫和孢子，以及前述各项中的任何一个的片段、蛋白质核酸和毒素。
27.根据权利要求23所述的生物传感器，其中所述捕捉试剂对沙眼衣原体具有特异性。
28.根据权利要求23所述的生物传感器，其中所述捕捉试剂对登革热病毒具有特异性。
29.根据权利要求23所述的生物传感器，其中所述声波是BAW。
30.根据权利要求23所述的生物传感器，其进一步包括用于接收生物流体样品的腔室。
31.根据权利要求23所述的生物传感器，其在所述生物涂覆的压电晶体上包括多个通道，其中每个通道包括不同的捕捉试剂层，或者是不包括捕捉试剂的对照通道，所述通道允许同时进行多个分析。
32.一种用于确定生物流体样品中的分析物的存在或数量的方法，所述方法包括：
用包括捕捉试剂的组合物接触权利要求1的组件，所述捕捉试剂包括或由针对所述锚定物质的特异性结合搭配物组成并且还特异性地识别分析物；
使得所述捕捉试剂结合到所述锚定物质，形成捕捉试剂层；
用生物流体样品接触所述结合的捕捉试剂层；
和跨越所述压电表面产生声波；和
测量由分析物结合到所述捕捉试剂层引起的波的幅度、相位或频率的任何改变。
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