CN1101474C - 微型石英谐振阵列基因传感器芯片 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的是一种微型压电石英谐振器阵列基因传感器芯片，它是利用微细加工技术直接在石英晶体上刻蚀出超簿石英谐振器阵列，然后对应地固化大量的探针，所以一次可以对大量的DNA分子或RNA分子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化不能提高、检测目的分子数量少等不足；本发明所述的基因芯片具有可原位测定、无需标记、即时获得检测信息、体积较小便于携带、使用方便、成本低廉等优点。

Description

微型石英谐振阵列基因传感器芯片

本发明涉及的是一种微型石英谐振阵列基因传感器芯片，具体地讲，所述的基因传感器芯片是用于组合靶基因自动检测仪中的。

随着人类基因组计划的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展，基因序列数据库正以前所未有的速度迅速增长。

然而，如何研究众多基因的生物信息及其在生命过程中所担负的功能成了本领域研究人员需要解决的课题，这就对大量的脱氧核糖核酸DNA、核糖核酸RNA序列测定及其分析提出了准确快速的要求。

基因芯片又称DNA芯片或生物芯片的出现为解决此类课题提供了可能的解决办法；所谓基因芯片(Gene chip)，是指将大量探针分子固定于支持物上，然后与样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱而判断样品中靶分子的存在极其数量。由于用该技术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可以对大量的DNA分子或RNA分子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少等不足，但是现有技术并未披露如何将所得到的信号实时地和压电石英晶体传感器接合并且实时地得到靶分子的存在极其数量。

本发明的目的在于提供一种微型石英谐振阵列基因传感器芯片，以利用所述基因芯片并结合其他方法和仪器对人类遗传病、肿瘤和传染性疾病进行基因诊断、基因分型等的自动检测。

本发明所述的微型石英谐振阵列基因传感器芯片是利用微细加工技术直接在石英晶体上刻蚀出超簿石英谐振器阵列，然后将大量探针分子固定于镀有金或银膜层的石英晶体支持物上，晶体两侧通过银电极施加一定的电压，而后使探针与标本进行杂交，由于杂交与否会导致石英晶体谐振频率的改变，通过检测石英晶体谐振频率的变化值即可判断样品有无靶分子以及数量多少。

下面是本发明的附图说明，通过下面的说明并结合以下的详细描述，可以更清楚地理解本发明的原理和构造，其中：

附图1是本发明所述的组合靶基因自动检测仪中采用的DNA芯片示意图；

附图2是附图1所述的芯片的A-A向剖视图；

附图3是本发明所述的芯片的电极、探针的固定情况示意图；

下面是本发明上述附图的各部件的标号，其中，1探针层，2是上金(或银)膜层，3是石英晶体，4是下金(或银)膜层，5基座，6是银电极，7是探针(或者称已知基因片断)，8是支撑物。

下面是对本发明所述的微型石英谐振阵列基因传感器芯片进行详细描述。

本发明所述的基因传感器芯片的特点是将基因芯片技术与石英晶体压电传感器技术相结合，构成独特的组合结构，本发明中称之为基因传感器芯片。

本发明所述的石英晶体谐振阵列是利用微细加工技术，直接在石英晶体上刻蚀出超簿石英谐振器阵列，由于微细加工技术使其易于成批制备，可大大降低传感器芯片成本。

本发明所述的石英谐振阵列基因传感器芯片涉及的基本技术原理如下：

1、压电现象及压电原理

晶体受外界机械压力的作用，在其表面上产生电荷的现象，称为压电效应。

1880年，雅克.居里和皮埃尔.居里兄弟首先发现石英等一些晶体的压电现象并指出，某些电介质物质，在沿一定方向受到外力的作用变形时，内部会产生极化现象，同时在其表面上产生电荷；当外力去掉以后，又重新回到不带电的状态；而且，晶体表面所形成的电荷和外加压力成正比。

现有技术将这种机械能转变为电能的现象，称为“顺压电效应”。

相反，在电介质极化的方向上施加电场，它会产生机械变形；当去掉外加电场时，电介质的变形随之消失。

这种将电能转变成机械能的现象，被称为“逆压电效应”。

现有技术中将具有压电效应的电介质物质统称为压电材料。

在自然界中，大多数晶体都具有压电效应。但多数晶体的压电效应过于微弱，没有实用价值。

比较常见的压电材料有石英、陶瓷等，还包括一些合成和天然的聚合物，如聚偏氟乙烯及DNA、蛋白质等具有一定取向的生物结构，其中石英因其良好的机械、电化学和温度等综合性能，成为压电传感，特别是压电化学和压电生物传感的主要元件。

石英是一种各向异性晶体，按不同方向切割晶体，其物理性质(如弹性、压电效应、温度特性等)相差很大。

研究人员发现，当交变激励电压施加于压电晶体两侧的电极时，晶体会产生机械变形振荡，当交变电压频率达到晶体固有频率时，振幅加大，形成压电谐振，此特定频率称为谐振频率。

依据压电传感的敏感机理，用压电晶体为谐振结构，可以发现其输出信号(谐振频率)与晶体的物理尺寸和性质密切相关。

2、晶体液相振荡理论

由于压电传感器均是通过测量振荡频率的变化来获取所需的信息，因而对在液相中振荡的晶体，首先遇到并必需了解的两个问题是：①影响晶体振荡活性(活力)的因素有哪些，或者说晶体在不同性质溶液中的振荡区间由什么决定；②溶液性质对晶体振荡频率影响如何。只有解决了这两个问题，才能使晶体振荡(应用)体系拓宽，也才能准确地根据晶体振荡频率变化来获取质量传感的信息。

近年来，随着石英晶体液相振荡获得成功，人们对石英晶体液相振荡特性的认识越来越深入。石英晶体的应用范围也得到拓宽，特别是在生物学中的应用。研究人员发现，在液相中，石英晶体微天平不仅对质量敏感，而且会受到外界温度、气压、磁场起伏、冲击震荡、和液体密度、粘度、介电常数、电导、以及流过晶体的激励电流起伏等因素的影响。

已经有很多人在液体环境中进行了将压电石英晶体响应器做为检测器的研究，这些研究证实，质量负载和粘性耦合是导致压电石英晶体频率变化的两个主要作用机理。

因此，本发明的研究人员摸索了一套相适应的标本处理方法并严格控制检测条件；现有技术表明，在对压电石英晶体二端施加电压后，被施压的压电石英晶体频率施固定的，本发明的研究人员在此基础上，在压电晶体上固定探针，这样就会导致整体频率的变化，但是，变化后的频率仍然是固定值，如果在同一块晶体通过刻蚀方法得到超薄石英谐振器阵列，就在该阵列中选择至少一个作为参比检测传感器芯片，这样就能扣除由上述因素造成的背景和因外界因素产生的频率漂移，获得稳定的基准频率和真实可靠的实验结果。

3、杂交原理简介

Watson和Crick等人于1953年提出了DNA的双螺旋结构模型的概念。他们指出：

(1)DNA分子是由两条方向相反的平行多核苷酸链构成的，这两条链在化学上具有相反方向。

(2)碱基成对有一定规律：Chargaff等应用层析法对多种生物DNA的碱基组成进行分析，发现DNA中腺嘌呤数目(A)与胸腺嘧啶(T)的数目相等，胞嘧啶(C)的数目与鸟嘌呤(G)数目相等。因此，在DNA中有四种可能的碱基对：A-T、T-A、G-C、C-G。

(3)两条链主要由碱基间的氢键相连：碱基对的平面穿过螺旋轴，约与螺旋轴垂直。AT间可形成两条氢键，GC间可形成三条氢键。同时，对于DNA双螺旋的结构稳定而言，还需借助疏水键的作用力。

(4)由于四种碱基对都适合此模型，每条链可以有任意的碱基顺序，但由于碱基成对的规律性，如一条链的碱基顺序已确定，则另一条链必有相对应的碱基顺序。

由于DNA双螺旋结构主要靠氢键和疏水键维系，因此加热、酸碱、有机溶剂等凡是能破坏氢键和疏水键的因素都能引起变性，使DNA的双螺旋结构变为无规则线团。不同变性DNA片段之间，通过碱基互补配对进行的“复性”称为杂交。杂交不仅可以发生在DNA与DNA链间，也可在DNA与RNA链的同源序列之间进行。杂交过程中两条互补的单链DNA以非共价键方式形成双键杂合体。当其中一条链的序列已知时，通过检测杂交过程，就可以探明未知DNA样品中是否含有与已知序列互补的DNA存在。

本发明所述的将压电基因传感器芯片用于靶基因检测的基本工作原理是：在某个固体支持物上固定一段基因，具体地讲，所述的固定支持物可以是压电石英晶体，在压电石英晶体的二端通过银电极施加电压，从而得到一固定的频率，然后利用其在溶液中同与之互补的寡核苷酸进行杂交，杂交过程的质量负载和粘性耦合的变化通过导致石英压电晶体的频率变化，将该频率的变化值通过分析就可以得出是否杂交以及杂交的数量，从而实现了液相中具体的DNA的检测。已知基因片断在支持物上的固定情况如图3所示。

传统的DNA杂交反应都要求使用标记方法来检测杂交信号，这些方法允许原位检测，而且可以灵敏度很高。如：PCR技术的检测限能达到nmol/l；DNA计算机技术也提供了从大量混合体系中检测某一具体DNA序列的方法；由于短波荧光和共聚焦显微镜技术的应用，荧光标记法已经成为检测微量DNA非常灵敏的常用方法。但这些方法也具有一定的不足：①探针标记和修饰价格昂贵、操作烦琐；②标记探针的前、后处理复杂；③很难准确获得杂交过程中的绝对数量及杂交耗时等定量信息；④杂交时间长，往往需要几个小时，甚至几天；⑤往往需要特殊的试验设备和条件；⑥对操作人员的技术要求很高，不易掌握。也有不少研究者应用SPR方法来实现液相标记和未标记DNA杂交的定量和原位监测，但该方法存在仪器昂贵、定量不准确等缺点。

在本发明中，研究人员主要应用了石英晶体微天平QCM(Quartz CrystalMicrobalance)技术即压电传感器技术并结合基因芯片技术来检测DNA，并比较了不同固定方法对传感器响应时间、杂交效率等情况的影响。

压电基因传感器是基于体声波器件-压电石英谐振器对其表面质量变化的敏感(质量灵敏度可达ng级)，无须杂交指示剂直接检测传感器表面的DNA杂交反应，此类传感器也有称为体声波和石英(晶体)微/纳天平DNA传感器。

基因探针--单链DNA片段(寡核苷酸)在传感器表面的固定化，是基因传感器的首要和基本条件。

在传感器DNA探针固定化方法的研究中，Nicolili等用LB膜技术在石英谐振器上沉积得到与脂肪胺混合的ssDNA的单分子层，有很好的杂交反应活性；Fawcett等在传感器表面分别用疏水性的聚苯烯、聚乙烯和丙烯酸的共聚物交联固定探针，初步探讨了高分子在研制DNA传感器中的应用。由于生物大分子易在亲水性表面吸附，为使探针活性达到最大，同时降低非特异性的吸附，应尽可能减弱传感器表面除探针位点外的生物亲和性，在疏水性高分子表面接上反应位点可能成为杂交型DNA传感器的理想表面。

本发明采用的探针的固定方法包括有吸附法、共价键合法和组合法三种探针固定化方法，采用现有技术中的后两类方法，虽然可得到牢固的探针修饰层，但其表面杂交反应活性位点少，且方法复杂。

本发明的研究人员注意到，利用具备某些结构的分子的自组装作用，制备末端修饰的探针，使其在表面自然形成稳定、高度有序的单分子层(SAMs)，无疑具有理想的反应活性，本发明优选采用巯基进行末端修饰，即优选采用巯基共价键结合法。

本发明所述的组合靶基因自动检测仪的微型压电石英谐振器阵列的构造如附图1、2、3所示。其中设有AT切石英晶体3，在石英晶体的上下表面镀有金(银)膜层2、4，在上金膜层的上表面固化有探针层1以及银电极6，所述的探针层实际上由多个DNA探针组成，各探针之间设有沟槽9，下金膜层4的下表面和玻璃基座5热压键合。

实际上，本发明所述的微型压电石英谐振器可以是单块石英晶体固化一种探针，也可以采用微型压电石英谐振器阵列，这样就可以在一块石英晶体上被刻蚀的大量小块上设有大量的探针，见附图1，通常设有至少9种探针。

本发明可以采用在一个芯片上标记不同种类的探针(即多种特异的基因片段--核苷酸序列)。探针种类的不同，检测的基因信息就不同；如果仅标记一种探针，可对不同来源的多个标本进行同种基因信息的检测和分析(如某种病原体：乙肝病毒等)；如标记多种探针，即可对一个标本的多种基因信息进行诊断和分析(如：检测肝炎时，可以固定多种探针检测甲、乙、丙等肝炎)。

本发明所采用的微型压电石英谐振器阵列构制的芯片的灵敏度可达pg级；特异性与目前所用标记检测技术相同。

下面是本发明的归纳：

其中，本发明所述的微型压电石英谐振器阵列基因传感器芯片包括被刻蚀成阵列的AT切石英晶体3，在石英晶体的下表面镀有金属膜层4，在石英晶体阵的上表面镀有呈相同阵列的金属膜层2，在呈阵列的上金属膜层2的上表面固化有探针阵列层1，相应的探针7处固定有电极6，下金属膜层与基座5热压键合；所述的阵列数至少为一个，优选至少为六个，最好至少为九个；其中，所述阵列的块数和被固化的探针层1的数量是相同的；所述阵列所呈现的块之间设有沟槽9；所述的金属膜层可以是金膜层或银膜层；所述的电极是银电极；所述的基座是玻璃基座；为了减小其它因素的影响，在所述阵列中固化有同样探针中的一个被作为参比检测；本发明采用的固化方法可以是吸附法、共价键合法和组合法，但优选采用巯基末端修饰共价键结合法。

本发明所述的基因传感器芯片的保护范围可见权利要求，但不仅限于此，在本发明构思下对本发明所述的基因传感器芯片的结构所作的改变都应该在本发明的保护范围之内。

本发明所述的基因传感器芯片具有价廉、便携、使用方便、可原位和实时监测、无需标记、可长期保存、反应敏感性高以及可同时检测多组标本的优点。

Claims (12)

1、一种微型压电石英谐振器阵列基因传感器芯片，其特征在于所述的芯片包括被刻蚀成阵列的AT切石英晶体(3)，在石英晶体的下表面镀有金属膜层(4)，在石英晶体阵的上表面镀有呈相同阵列的金属膜层(2)，在呈阵列的上金属膜层(2)的上表面固化有探针阵列层(1)，相应的探针(7)处固定有电极(6)，下金属膜层与基座(5)热压键合。

2、根据权利要求1所述的芯片，其特征在于所述的阵列数至少为一个。

3、根据权利要求1所述的芯片，其特征在于所述的阵列数优选至少为六个。

4、根据权利要求1所述的芯片，其特征在于所述的阵列数最好至少为九个。

5、根据权利要求1所述的芯片，其特征在于所述的阵列数和被固化的探针层1的数量是相同的。

6、根据权利要求1所述的基因传感器芯片，其特征在于所述的阵列所呈现的块之间设有沟槽(9)。

7、根据权利要求1所述的基因传感器芯片，其特征在于所述的金属膜层是金膜层或银膜层。

8、根据权利要求1所述的基因传感器芯片，其特征在于所述的电极是银电极；

9、根据权利要求1所述的基因传感器芯片，其特征在于所述的基座是玻璃基座。

10、根据权利要求1所述的基因传感器芯片，其特征在于所述阵列中固化有同样探针中的一个被作为参比检测。

11、根据权利要求1所述的基因传感器芯片，其特征在于所述固化可以是吸附法、共价键合法和组合法。

12、根据权利要求1或11所述的基因传感器芯片，其特征在于所述的固化优选采用巯基末端修饰共价键结合法。

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