JP2002541479A

JP2002541479A - トランスフォーミング増殖因子−β１の定量方法およびそれを用いた癌検査方法

Info

Publication number: JP2002541479A
Application number: JP2000611074A
Authority: JP
Inventors: ジン・ソンウォン; シン・ホーン; リム・チャンギ
Original assignee: ハンミファーム．シーオー．，エルティーディー．
Priority date: 1999-04-09
Filing date: 2000-04-10
Publication date: 2002-12-03
Also published as: BR0009607A; EP1166112A1; WO2000062062A1; TR200102917T2; NZ514596A; AU768029B2; MXPA01009942A; ID30316A; CN1355882A; EP1166112A4; AU4147100A; CA2369892A1

Abstract

(57)【要約】試料中のＴＧＦ−β１の量を、試料をＴＧＦ−β１特異的受容体で処理してＴＧＦ−β１および受容体の間に複合体を形成させ、複合体の量を測定することによって定量する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、体液中のトランスフォーミング増殖因子‐β１(ＴＧＦ−β１)の濃
度を定量する方法、それを用いた癌検査方法およびＴＧＦ−β１−特異的なモノ
クローナル抗体に関する。

【０００２】発明の背景トランスフォーミング増殖因子−β(Transforming Growth Factor beta; TGF-
β)は、種々の細胞の増殖と分化を調節するが、この作用は細胞の立体配置と他
の成長因子の存在有無に依存する(Sporn et al., Science, 233:532-534(1986);
Roberts and Sporn, Adv. Cancer Res., 51:107-145(1988))。

【０００３】三つの形態のTGF-β因子、即ちＴＧＦ−β１、−β２および−β３は哺乳動物
に出現するが、これらのうち、ＴＧＦ−β１は生理学的メカニズムおよび疾病の
進行過程において非常に重要な役割を果すことが知られている。ＴＧＦ−β１は
、発癌などの侵入過程(invasion process)においてその作用が異常であると報告
されている。これは、ＴＧＦ−β１が癌の検査において腫瘍マーカー(tumor mar
ker)として有用であり、高感度で体液中のＴＧＦ−β１を定量する方法が癌検査
に重要であり得ることを示す。

【０００４】ヨーロッパ特許公開第0 722 773 A1号は、血液試料中のＴＧＦ−β１の濃度を
測定することによって癌を検査する方法として、ＴＧＦ−β１をＯＨ−カーボネ
ート化ヒドロキシアパタイト(OH-carbonated hydroxyapatite)のような吸着剤に
吸着させた後、吸着されたＴＧＦ−β１を緩衝溶液で溶出させ、ＴＧＦ−β１の
濃度をＵＶ分光計で測定する方法を開示している。しかし、この方法は、測定値
に大きな誤差があるので感度が低く、不正確であるという問題がある。

【０００５】したがって、血漿中のＴＧＦ−β１の濃度を定量するための改善された方法の
開発が求められていた。

【０００６】発明の要約したがって、本発明の目的は、試料中のＴＧＦ−β１の濃度を高感度で正確に
測定する方法を提供することである。

【０００７】本発明の他の目的は、前記方法を用いて癌を検査する方法を提供することであ
る。

【０００８】本発明のまた他の目的は、癌を検査するための組成物を提供することである。

【０００９】本発明のまた他の目的は、ＴＧＦ−β１−特異的なモノクローナル抗体および
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を提供することである。

【００１０】本発明の一実施態様によって、本発明では、試料をＴＧＦ−β１特異的受容体
で処理してＴＧＦ−β１と受容体の間に複合体を形成させ、この複合体の量を測
定する段階を含む試料中のＴＧＦ−β１の量を定量する方法が提供される。

【００１１】発明の詳細な説明本発明に使用され得るＴＧＦ−β１特異的受容体としては、ＴＧＦ−β１Ｉ
型、 II型、III型(ＲＩ、ＲIIおよびＲIII)などがあり、特に、ＴＧＦ−β１ II
I型受容体(ＲIII)が好ましい。前記ＴＧＦ−β１受容体は、通常の方法に従って
哺乳動物細胞株または昆虫細胞株においてＴＧＦ−β１受容体を発現させて得ら
れる(Burnad, J. P. et al., Virology 101, 286-290, 1980)。たとえば、ＴＧ
Ｆ−β１受容体は、ＴＧＦ−β１受容体遺伝子を含む組換えバキュロウイルス(b
aculovirus)であって、Ｓｆ２１(Invitrogen, Netherlands)のような昆虫細胞株
を感染させ、昆虫細胞株に発現された不溶性受容体タンパク質を抽出し、抽出し
た不溶性受容体タンパク質をグアニジンＨＣlまたはウレアで可溶化させた後、
ＴＧＦ−β１に対する結合能を回復させるためにグアニジンＨＣlまたはウレア
を除去して、可溶化された受容体タンパク質をリフォールディングすることによ
って得られる。

【００１２】本発明に使用され得るＴＧＦ−β１−特異的な抗体は、哺乳動物にＴＧＦ−β
１またはその一部を免疫化させて製造できる。ＴＧＦ−β１−特異的な抗体はＴ
ＧＦ−β１に対してのみ特異性を有するモノクローナル抗体であるか、ポリクロ
ーナル抗体である。

【００１３】本発明による血漿または尿などの体液中のＴＧＦ−β１の量を定量する好まし
い方法は、 (ａ)ＴＧＦ−β１特異的受容体を固体支持体に付着させる段階、 (ｂ)体液試料を固体支持体に付着した受容体に加えてＴＧＦ−β１−受容体複
合体を形成させる段階； (ｃ)標識(label)が付されたＴＧＦ−β１特異的抗体を複合体に結合させる段階
；および (ｄ)検出マーカーとして標識を用いてＴＧＦ−β１の量を測定する段階を含む。

【００１４】本発明に使用され得る代表的な標識としては、ホースラディッシュペルオキシ
ダーゼ、ビオチンおよびフルオルセインがある。

【００１５】本発明の最も好ましい実施態様は、ＴＧＦ−β１受容体をマイクロタイタープ
レートのウエルのような固体支持体に付着させ、ＴＧＦ−β１を含む試料を適切
に稀釈してＴＧＦ−β１受容体に加えて、ＴＧＦ−β１とＴＧＦ−β１受容体の
間に複合体を形成させ、リン酸塩緩衝溶液(PBS)で支持体を洗浄した後、これに
、発色酵素が結合された抗ＴＧＦ−β１抗体を加えて発色させた後、反応溶液の
吸光度を測定して試料中のＴＧＦ−β１の量を測定する段階を含む。

【００１６】本発明の第二の実施態様において、ＴＧＦ−β１−特異的な受容体を含む液体
を支持体に付着したＴＧＦ−β１受容体の代りに使用できる。この方法において
は、試料をＴＧＦ−β１−特異的な受容体を含む液体に加え、これに標識が付さ
れたＴＧＦ−β１−特異的な抗体を加えた後、抗体-ＴＧＦ−β１−受容体複合
体を沈殿させ、吸光度を測定することによって試料中のＴＧＦ−β１の量を定量
することができる。

【００１７】本発明の方法は、３０ｐｇ／ｍｌまたはその以下の非常に低い濃度範囲におい
てもＴＧＦ−β１を検出することができる。

【００１８】癌患者体液中のＴＧＦ−β１濃度は、健常者のものとは著しく異なるので、前
記方法は癌の診断に特に有用である。したがって、患者の体液中、たとえば、血
漿または尿中のＴＧＦ−β１の量を測定し、これを健常者のＴＧＦ−β１の濃度
と比較する前記方法を繰返すことによって癌を検査することができる。

【００１９】癌を診断するための本発明の好ましい方法は、 (ａ)ＴＧＦ−β１受容体を固体支持体に付着させる段階； (ｂ)体液試料を前記支持体に付着した受容体に加えてＴＧＦ−β１受容体複合
体を形成させる段階； (ｃ)標識が付されたＴＧＦ−β１−特異的な抗体を前記複合体に結合させる段
階； (ｄ)検出マーカーとして標識を用いてＴＧＦ−β１の量を測定する段階；およ
び (ｅ)前記ＴＧＦ−β１の量を健常者のものと比較する段階を含む。

【００２０】前記方法は、特に胃癌、肝癌、乳房癌、肺癌、直・大腸癌、前立腺癌および子
宮頸部癌の検査に効果的である。

【００２１】前記癌を検査するための方法に使用され得る組成物は、ＴＧＦ−β１受容体、
好ましくは、III型受容体、およびＴＧＦ−β１特異的抗体を含む。

【００２２】検査感度を向上させるために、通常の細胞融合法に従って、免疫源としてＴＧ
Ｆ−β１全分子または一部抗原決定基を用いてＴＧＦ−β１特異的なモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を製造し、ハイブリドーマ細胞株から
モノクローナル抗体を分離することによってモノクローナル抗体を得る。たとえ
ば、ハイブリドーマ細胞株は、ヒトＴＧＦ−β１でマウスを免疫化し、コーラー
およびミルステインによって開示された細胞融合法(Kohler and Milstein, Eur.
J. Imunol., 6:511- (1976))に従って脾臓細胞と骨髄腫細胞を融合させ、ヒト
ＴＧＦ−β１抗原に対してのみ特異的に反応するハイブリドーマ細胞株を酵素免
疫分析法(ELISA)を用いて選別し、免疫拡散法を用いてハイブリドーマ細胞株に
よって産生されるモノクローナル抗体のサブクラスを決定し、そして高い抗体力
価を有するＩｇＧ１サブクラスを分泌するハイブリドーマ細胞株を選別する。こ
のようにして得られたハイブリドーマ細胞株を、hTGF-46と命名し、特許手続上
の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定により、１９９８年４
月２０日付で韓国生命工学研究所遺伝子銀行(Korean Collection for Type Cult
ures(KCTC)；住所：大韓民国大田廣域市儒城區魚隠洞５２番地)に寄託番号第Ｋ
ＣＴＣ０４６０ＢＰ号として寄託した。

【００２３】ハイブリドーマ細胞株はｈＴＧＦ−４６は、ベータ−リンフォーマ(β-limpho
ma)に由来し、継続的に分裂しながらヒトＴＧＦ−β１に特異的なＩｇＧｌサブ
クラス抗体を生成する。前記ハイブリドーマ細胞株は、１０％ウシ胎児血清を含
むＲＰＭＩ１６４０培地(Giboco-BRL, USA)を用いて５％ＣＯ_２と１００％
湿度の雰囲気の下、３７℃で培養し得る。細胞数は、１２〜１４時間に２倍にな
る。該ハイブリドーマ細胞株は、培養フラスコの底に付着せず、培養培地に浮い
て、直径１５〜２０μｍの丸い形態をしている。

【００２４】前記ハイブリドーマ細胞株からＴＧＦ−β１特異的なモノクローナル抗体を大
量産生するために、前記ハイブリドーマ細胞株をマウスに注射し、腹腔が脹れ上
がったとき高濃度のハイブリドーマ細胞を含む腹水液を取った後、これらからモ
ノクローナル抗体を分離する。

【００２５】ＴＧＦ−β１、 β２およびβ３をウエスタンブロッティング法に従って電気
泳動を行うと、本発明のモノクローナル抗体はＴＧＦ−β２やβ3は認識せず、
ＴＧＦ−β１のみを特異的に認識する。このような結果は、本発明のモノクロー
ナル抗体がＴＧＦ−β１に対してのみ特異性を有することを示す。また、本発明
のモノクローナル抗体は、ヒトＴＧＦ−β１に対して高い結合親和度を示し、ヒ
トＴＧＦ−β１の５〜８０番目のアミノ酸残基に対応するエピト−プ部位に結合
する。

【００２６】下記実施例は本発明をさらに詳細に説明するためのものであり、本発明の範囲
を制限するものではない。

【００２７】また、下記固体混合物中の固体、液体中の液体、および液体中の固体に対して
下記の百分率は、各々重量／重量、容量／容量および重量／容量に基づいたもの
であり、特に言及しない限りすべての反応は室温で行われた。

【００２８】実施例１：受容体に対するＴＧＦ−β１の敏感性 (段階１)ＴＧＦ−β１ III型受容体の製造ヒトＴＧＦ−β１ III型受容体の全長ｃＤＮＡ配列を含むプラスミドpCEP4(In
vitrogen社、The Netherlands)を、プライマーＲIII １およびＲIII ２(配列
番号：１および２)を用いて重合連鎖反応(PCR)を行って、４００アミノ酸残基(
酸１−４００)からなる受容体の細胞外ドメインをコードするＤＮＡ断片を得た
。このようにして得られたＤＮＡ断片をバキュロウイルスベクターpCRBac(Invit
rogen社、The Netherlands)に挿入して組換えプラスミドpCRBac-TGFRを得た。大
腸菌を前記組換えプラスミドpCRBac-TGFRで形質転換し、形質転換された大腸菌
細胞をアンピシリンを含むＬＢ培地のような選別培地上で選別した。

【００２９】ベクターpCRBac-TGFRとBac-N-Blue DNA(Invitrogen社、The Netherlands)をリ
ポソーム形質移入法(Burand, J.P., Virology, 101, 286-290(1980))を用いて昆
虫細胞株Ｓｆ−２１(Invitrogen社、The Netherlands)に同時導入し、３日間培
養してウイルス生成物を得た。３日後、このようにして得られたウイルスは検出
マーカーとしてｌａｃＺ遺伝子を用いてプラーク分析を行って組換えウイルスを
選別した。このようにして得られた組換えウイルスを正方向プライマー(配列番
号３)および逆方向プライマー(配列番号４)を用いてＰＣＲを行ってＴＧＦ−β
１受容体遺伝子の存在の有無を確認した。この際、野性バキュロウイルスは、８
３９ｂｐのＰＣＲ生成物を示したが、組換えウイルスは１.５ｋｂｐの生成物を
産生した。

【００３０】昆虫細胞株Ｓｆ２１を組換えウイルスで感染させた後、５日間培養した。培養
液を遠心分離して細胞浮遊物を除去し、ウイルスを含む上澄液を収穫した。

【００３１】上澄液に昆虫細胞株Ｓｆ２１を接種した後、１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)、７
.３％ＴＣイーストレート(yeastolate)、ラクトアルブミン加水分解物を含むグ
レース昆虫(Grace Insect)培地(Invitrogen社、The Netherlands)で２７℃で７
２時間培養した。培養液を遠心分離して細胞を集めた後、細胞をＰＢＳで洗浄し
た。これに、タンパク質融解緩衝液(50 mM Tris-ＨＣl(pH 7.5)、５０ｍＭＮa
Ｃl、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、１％ Triton X-100および２ｍＭ
ＢＭＳＦ)を加えた後、反応溶液を１００℃で１０分間加熱して試料を調製し
た。

【００３２】前記試料を１２.５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動を行い、
クマシーブリリアントブルー(coomassie brilliant blue)でゲルを染色した。ゲ
ル上で分離したタンパク質は電気的にフィルターに移し、Ｒ＆Ｄシステム社から
購入したＴＧＦ−β１に対する抗体をフィルターのタンパク質と結合させた後、
ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)が結合された抗ＩｇＧ２次抗体(C
hemicon, USA)を用いてＴＧＦ−β１を分析するというウエスタンブロッティン
グ法によってＴＧＦ−β１ III型受容体の発現を確認した。

【００３３】ＴＧＦ−β１受容体は不溶性であるため、８ＭグアニジンＨＣl(pH 8.0)を試
料に加え、反応溶液を１時間攪拌した。反応溶液を７,０００ｒｐｍで４０分間
遠心分離した後、上澄液を２ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に調整した。ＴＧＦ−
β１とＴＧＦ−β１受容体との結合能を回復させるように、反応溶液にリフォー
ルディング緩衝溶液(100 mM Tris, 0.5 M arginin, 0.2 M EDTA, pH 8.0)を１５
０μｇ／ｍｌのタンパク質濃度で加え、１０℃で４０時間保管した。ＴＧＦ−β
１受容体を効果的にリフォールドするために、反応溶液を２０ｍＭＴｒｉｓ溶
液(pH 8.0)で段階的に４時間ずつ２回、一晩中一回、２時間ずつ２回透析した。

【００３４】 (段階２)ＴＧＦ−β１に対するＴＧＦ−β１ III型受容体の敏感性前記段階１で得られたＴＧＦ−β１ III型受容体２μｇずつをマイクロタイタ
ープレートの各ウエルに加え、反応プレートを常温で２４時間放置してプレート
に受容体を付着させた。精製されたＴＧＦ−β１２ｎｇ(R & D systems Inc.,
USA)をＰＢＳに溶かし、段階的に稀釈液を製造した。各希釈液を１００μｌの量
でウエルに加え、常温で３時間保持して受容体とＴＧＦ−β１を結合させた。各
ウエルをツイーン(Tween)２００.０５％(ＰＢＳＴ溶液)を含むＰＢＳで洗浄し
た後、ＨＲＰが結合された抗ＴＧＦ−β１抗体(R & D systems Inc., USA)を加
え、室温で１.５時間反応させた。ウェルをＰＢＳＴで洗浄した後、ＨＲＰの基
質であるTMB-ELISA(Gibco-BRL) １００μｌを加え、常温で２０分間反応させて
発色させた。２Ｎ硫酸２５μｌを加えて反応を停止させた。反応溶液の吸光度を
４５０ｎｍの測定波長、５７０ｎｍの補正波長で測定し、標準吸光−濃度相関関
係を求めてその結果をプロットした。

【００３５】図１は、このようにして得られた相関関係が０.９９９の相関係数と０.２８の
勾配を有する直線であることを示す。傾きは、測定に用いられた受容体の感度を
示し、ＴＧＦ−β１ III型受容体はＴＧＦ−β１結合に対して非常に優れた感度
を有するとみられる。また、図１における相関関係はＴＧＦ−β１の非常に低い
濃度、１０ｐｇ／ｍｌ以下においても本発明の方法によって検出されることを示
す。

【００３６】一方、ＴＧＦ−β１ II型受容体の感度を調べるために、ＴＧＦ−β１ II型
受容体(R & D systems Inc.)を用いて前記操作を繰返した。図にプロットされた
結果はＴＧＦ−β１ II型受容体を用いて得られた相関関係もまた０.９９９の相
関係数と０.５７の傾きを有する直線であることを示す。したがって、II型受容
体をＴＧＦ−β１の濃度を定量するために使用できるが、その感度はIII型受容
体に比べて相当低いことが分かる。

【００３７】実施例２：ＴＧＦ−β１に対するＴＧＦ−β１ III型受容体の結合特異度ＴＧＦ−β１の代りに２,０００ｐｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１、２,０００ｐｇ／
ｍｌのTGF-β2および２,０００ｐｇ/ｍｌのＴＧＦ−β３(R&D Systems Inc.)を
含む混合液を用いたことを除いては実施例１の段階２の操作を繰返した。対照群
として２,０００ｐｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１を用いて実施例１の段階２を繰返し
た。その結果を下記表１に示す。

【００３８】

【表１】

【００３９】表１から分かるように、ＴＧＦ−β１ III型受容体はＴＧＦ−β２またはＴ
ＧＦ−β３との交差反応を起さずにＴＧＦ−β１とのみ結合する。

【００４０】実施例３：モノクローナル抗体を用いた癌患者の血漿中ＴＧＦ−β１濃度測定１０１名の健常者および１１１名の胃癌患者、１００名の肝癌患者、１５１名
の乳房癌患者から血液試料を採取した。抗凝固剤として１５％エチレンジアミン
四酢酸(ＥＤＴＡ)０.０８１ｍｌを含むVacuumtainerで血液試料を集めた後、反
応混合物を３,０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して血漿試料を得た。血漿試料
０.１ｍｌに２.５Ｎ酢酸／１０Ｍウレア溶液０.１ｍｌを入れた。反応混合物を
１０分間放置し、１Ｍヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸(ＥＰＥＳ)
を含む２.７ＮＮaＯＨ溶液０.１ｍｌで中和したた。このようにして得られた
、活性化された血漿をＰＢＳＴ溶液で４倍稀釈してＴＧＦ−β１濃度測定のため
の次の過程に使用する血漿試料を得た。

【００４１】このようにして得られた血漿試料０.１ｍｌとＴＧＦ−β１標準物質(0, 100,
1,000および2,000 ｐｇ／ｍｌ)０.１ｍｌを各々ＴＧＦ−β１ III型受容体を含
む９６ウェルプレートのウェルに加え、室温で３時間放置した後、ＰＢＳＴ溶液
で３回洗浄した。これに、精製されたＴＧＦ−β１モノクローナル抗体−ＨＲＰ
結合体(Sigma)を各ウェルに加え、室温で１.５時間放置した後、ＰＢＳＴ溶液で
３回洗浄した。ＨＲＰの基質であるＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ(Gibco-BRL, USA)１００
μｌを各ウェルに加え、プレートを室温で２０分間発色させた。発色反応は２Ｎ
硫酸２５μｌを加えて中止させた。反応溶液の吸光度を４５０ｎｍの測定波長、
５７０ｎｍの補正波長で測定した。血漿試料中のＴＧＦ−β１の濃度は標準溶液
を用いて得られた標準曲線に基づいて測定し、その結果を下記表２および図２に
示す。

【００４２】

【表２】

【００４３】各患者群の血漿中ＴＧＦ−β１濃度の分布様相を示す図２から分かるように、
癌患者の血漿試料は健常者の血漿試料とは全く違うＴＧＦ−β１濃度分布様相を
示した。このような結果は、前述の癌が本発明の方法に従って血漿中ＴＧＦ−β
１の濃度を測定することによって効果的に検出され得ることを示す。

【００４４】実施例４：モノクローナル抗体を用いた癌患者の血漿中ＴＧＦ−β１濃度測定２８８名の健常者および２９名の肺癌患者、４８名の直・大腸癌患者、５０名
の前立腺癌患者および８８名の子宮頸部癌患者から採取した血液試料を用いて実
施例３と同様の操作を繰返して各々の血漿中ＴＧＦ−β１濃度を測定し、その結
果を下記表３および図３に示す。

【００４５】

【表３】註) P<0.01

【００４６】各患者群の血漿中ＴＧＦ−β１濃度の分布様相を示す表３から分かるように、
癌患者らの血漿試料は健常者群の血漿試料とは全く違うＴＧＦ−β１濃度の分布
様相を示す。このような結果は、前述の癌を本発明の方法に従って血漿中ＴＧＦ
−β１の濃度を測定することによって検出し得ることを示す。

【００４７】実施例５：モノクローナル抗体を用いた癌患者の血漿中ＴＧＦ−β１濃度測定
モノクローナル抗体の代りにポリクローナル抗体を用いることを除いては、５０
名の健常者および５０名の肝癌患者および５０名の乳房癌患者から採取した血液
を用いて実施例３と同様の操作を繰返して各々の血漿中ＴＧＦ−β１濃度を測定
し、その結果を下記表４に示す。

【００４８】

【表４】註) P<0.01

【００４９】前記表４から分かるように、癌患者らの血漿試料は健常者の血漿試料とは全く
違うＴＧＦ−β１濃度の分布様相を示す。このような結果は、前述の癌を前記操
作に従って血漿中ＴＧＦ−β１の濃度を測定することによって検出し得ることを
示す。

【００５０】実施例６：ＴＧＦ−β１に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ細胞株の製造 (段階１)マウスの免疫化ＴＧＦ−β１を完全フロインドアジュバント(Complete Freund Adjuvant)と同
量で混合物が液体になるまで混合し、反応混合物を生後７週齢のBalb/cマウスの
尾静脈内に１００μｌの量で注射した。２週間後１次注射と同量のＴＧＦ−β１
をフロインド不完全アジュバント(Freund's incomplete adjuvant)と混合してマ
ウスの尾静脈に注射した。４〜５日後、尾から小量の血液を採血し、ＥＬＩＳＡ
方法でＴＧＦ−β１に対する抗体の存在を確認した。次の細胞融合実験３〜４日
前に０.８５％ＰＢＳに溶かしたヒトＴＧＦ−β１３０μｇを静脈内に注射
した。

【００５１】 (段階２)細胞融合細胞融合操作において母細胞としては骨髄腫(myeloma) 細胞 SP2/0・Ag14(ATC
C CRL 1581)を用いた。この母細胞は、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で最大
密度５ｘ１０^５／ｍｌを保持しながら培養した。

【００５２】段階１で得られた、免疫化されたマウスをエーテルで麻酔し、脾臓組織を除去
して組織ホモジナイザーで均質化した。均質化物をＨＢＳＳ(Gibco-BRL,USA)中
で懸濁し、懸濁液を１５ｍｌ遠心分離管に入れ、遠心分離した。この操作を２回
繰返して脾臓細胞を十分洗浄した。母細胞であるＳＰ２／０・Ａｇ１４もＨＢＳ
Ｓ中に懸濁させ、遠心分離する操作を２回繰返した。脾臓細胞とＳＰ２／０・Ａ
ｇ１４を各々ＨＢＳＳ１０ｍｌに再懸濁した後、各懸濁液中の細胞数を数えた
。各懸濁液から採った１０^８の脾臓細胞と１０^７のＳＰ２／０・Ａｇ１４細胞を
遠心分離管で混合した後、さらに遠心分離して細胞を沈澱させた。遠心分離管を
指で軽く叩いて沈澱物を分散させた後、３７℃で１分間保持した。これに、４５
％ＰＥＧ(w/v)および５％ＤＭＳＯ(w/v)を含むＨＢＳＳ１ｍｌを１分間加えた
後、１分間ふりまぜた。その後、これにＲＰＭＩ培地９ｍｌを３分間入れ、遠
心分離管をふりまぜながら細胞懸濁液の総量が５０ｍｌになるまでＲＰＭＩを加
えた。この懸濁液を遠心分離した後、このようにして得られた細胞ペレットをＨ
ＡＴ培地(Gibco-BRL, USA)で１〜２ｘ１０^５／ｍｌ濃度で再懸濁させ、９６−ウ
ェルマイクロタイタープレートの各ウェルに再懸濁液０.２ｍｌずつ入れた後、
３７℃、５％ＣＯ_２、１００％湿度を保持しながら、培養器中で数日間培養した
。

【００５３】 (段階３)モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選別段階２で製造したハイブリドーマ細胞を、ヒトのＴＧＦ−β１を用いたＥＬＩ
ＳＡ分析方法を次の通り行って、ヒトＴＧＦ−β１抗原にのみ特異的に反応する
細胞を得た。

【００５４】マイクロタイタープレートのウェルにヒトＴＧＦ−β１抗原を各ウエル当り５
０μｌ(２μｇ／ｍｌ)ずつ加え、室温で１２時間放置してプレート表面に抗原を
付着した。該ウェルをＰＢＳＴ溶液で洗浄して付着しなかった抗原を除去した。

【００５５】段階２で得られたハイブリドーマ細胞培養液を各ウェルに細胞当り５０μｌず
つ加え、３７℃で１時間放置した。ウェルをＰＢＳＴ溶液で洗浄して培養液を除
去した。これに、ヤギ抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ(Sigma, USA)を加え、室温で１
時間反応させた後、ＰＢＳＴ溶液で十分洗浄した。基質溶液(OPD, Sigma)１００
μｌをこれに加え、室温で２０分間放置し、反応溶液の吸光度を４９２ｎｍで測
定した。

【００５６】その結果、ヒトＴＧＦ−β１抗原に特異的に高い結合力を有する抗体を分泌す
るハイブリドーマ細胞株がまず選別され、これらのハイブリドーマ細胞株は各々
ヒトＴＧＦ−β１、β２およびβ３を用いてＥＬＩＳＡを行ってヒトのＴＧＦ−
β１抗原にのみ特異的に反応するハイブリドーマ細胞株をスクリーニングした。
このようにして得られた各々のハイブリドーマ細胞を制限稀釈(limiting diluti
on)してモノクローナル抗体を産生する７つのハイブリドーマ細胞株クローン、
ｈＴＧＦ−７,−８、−３１、−４６、−７０、−１１９および−１１９および
−２０７を得た。これらのクローンは凍結乾燥して保管した。

【００５７】ハイブリドーマ細胞培養液を遠心分離し、上澄液でＥＬＩＳＡを行って抗体力
価を測定した後、二重免疫拡散法(immunotype kit, Sigma)を行って抗体のサブ
クラスタイプ(subclass type)を確認した。その結果を下記表５に示す。

【００５８】

【表５】

【００５９】図５から分かるように、７つのすべてのクローンはIgG1であった。

【００６０】７つのクローンのうち、最も高い力価を示すクローン、ｈＴＧＦ−４６を選別
し、マウスの腹腔内に注射した。次いで、前記マウスから腹水液を採取し、ウエ
スタンブロッティングを行った。この結果は、ハイブリドーマ細胞株クローンｈ
ＴＧＦ−４６がヒトＴＧＦ−β１に対する高い特異性を有するモノクローナル抗
体を分泌することを示した。前記ハイブリドーマ細胞株ｈＴＧＦ−４６を特許手
続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定により、１９９８
年４月２０日付で韓国生命工学研究所遺伝子銀行(Korean Collection for Type
Cultures(KCTC)；住所：大韓民国大田廣域市儒城區魚隠洞５２番地)に寄託番号
第ＫＣＴＣ０４６０ＢＰ号として寄託した。

【００６１】実施例７：ＴＧＦ−β１に対するモノクローナル抗体の産生実施例６で得られたハイブリドーマ細胞株を用いてＴＧＦ−β１に対するモノ
クローナル抗体を生産するために、Ｂａｌｂ/ｃマウスにプリスタン(pristane)
０.５ｍｌを腹腔内に注射し、１週間後、各々のマウスに５ｘ１０^６ハイブリド
ーマ細胞を注射した。腹腔が脹れ上がったマウスから高濃度のハイブリドーマを
含む複数液を採取し、これを１０,０００ｒｐｍで遠心分離してハイブリドーマ
細胞を除去した。上澄液を−２０℃で保管した。

【００６２】プロテインＧビーズをカラムに充填した後、１ｘＰＢＳで４回洗浄した。前記
上澄液２ｍｌを分当り５滴の流速でカラムに滴下し、０.１グリシン−ＨＣl溶液
を１０分当り１滴の流速でカラムに導入してＩｇＧを溶出させた。

【００６３】ＨＲＰを１.２５％グルタールアルデヒドを含む０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液(ｐＨ６.５)で活性化させ、活性化されたＨＲＰを炭酸塩緩衝液(ｐＨ９.２)で
透析した。透析されたＨＲＰをＩｇＧと反応させてＨＲＰ−結合ＩｇＧを得た。
反応が終了した後、ＲＺ値(A₄₀₃/A₂₈₀)は、２８０ｎｍと４０３ｎｍでの反応溶
液の吸光度を測定することによって決定した。酵素が結合された抗体の活性を測
定するために、マイクロタイタープレートの各ウェルにＴＧＦ−β１１μｇを
コーティングした後、ＨＲＰ−結合ＩｇＧと反応させて活性度を調査した。また
、ＨＲＰ−結合ＩｇＧをウエスタンブロッティングを行ってこれらの活性度を確
認した。

【００６４】実施例８：ウエスタンブロッティング実施例７で得られたＴＧＦ−β１特異的なモノクローナル抗体がＴＧＦ−β２
およびβ３と反応するかどうかを確認するために、前記モノクローナル抗体をＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティング方法を下記の通り行った。

【００６５】ヒトＴＧＦ−β１、β２およびβ３タンパク質を１０％ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲルにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ニトロセルロースフィルタ膜に電
気的に移した。膜を３％ウシ血清アルブミン溶液で室温で１２〜１４時間処理し
てタンパク質の非特異的な反応を遮断した。この膜を０.５％ツイーン２０を含
むＰＢＳで３回洗浄した後、ＨＲＰが結合された抗マウスＩｇＧ(Sigma,USA)と
室温で反応させた。この膜を０.５％ツイーン２０を含むＰＢＳで洗浄した後、
基質溶液(TMB, Gibco-BRL,USA)を膜に加えて発色反応させた。

【００６６】その結果は、本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＴＧＦ−β１にのみ反応し
、ヒトＴＧＦ−β２やヒトＴＧＦ−β３とは反応しなかったことを示す。したが
って、本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＴＧＦ−β１にのみ特異的に反応す
る抗体であることを確認した。

【００６７】本発明を具体的な実施態様と関連させて記述したが、添付した特許請求の範囲
によって定義される本発明の範囲内で、当該分野の熟練者が本発明を多様に変形
および変化させ得ると理解されなければならない。

【００６８】特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約国際様式下記国際寄託機関で定めた規則7.1に基づいて発行された原寄託に関する受託証受領人：チェヨンギョン 300-200大韓民国大田広域市東区龍田洞山1番地新東亜Apt.1-203

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＴＧＦ−β１ III型およびII型受容体の各々に対して実施例１で得られた吸光度−ＴＧＦ−β１濃度を示す。

【図２】健常者、胃癌患者、肝癌患者および乳房癌患者から採取した血漿
試料中のＴＧＦ−β１濃度の相対的分布を示す。

【図３】健常者、肺癌患者、直・大腸癌患者、前立腺癌患者および子宮頸
部癌患者から採取した血漿試料中のＴＧＦ−β１濃度の相対的分布を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＩＤ，ＩＮ，ＪＰ，ＭＸ，ＮＺ，ＲＵ，ＳＧ，ＴＲ，ＵＳ (72)発明者リム・チャンギ大韓民国463−110キョンギド、ソンナムシ、ブンダンク、ブルジョンドン、ハンジン・アパートメント803−1401 Ｆターム(参考） 4B064 AG27 CA20 DA14 4B065 AA91X AA94Y AB05 BA08 CA25 CA46 4H045 AA11 AA30 CA40 DA76 EA51 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料中のＴＧＦ−β１の量を定量する方法であって、試料を
ＴＧＦ−β１特異的受容体で処理し、ＴＧＦ−β１と受容体の間に複合体を形成
させ、複合体の量を測定する段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】 (ａ)ＴＧＦ−β１特異的受容体を固体支持体に付着させる段
階； (ｂ)付着した受容体に試料を加えてＴＧＦ−β１−受容体複合体を形成させる
段階； (ｃ)標識が付されたＴＧＦ−β１特異的抗体を前記複合体と結合させる段階；
および (ｄ)検出マーカーとして前記標識を用いてＴＧＦ−β１の量を測定する段階を
含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】前記ＴＧＦ−β１特異的受容体が、ＴＧＦ−β１ III型受
容体である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】前記ＴＧＦ−β１特異的抗体が、ＴＧＦ−β１またはその一
部で哺乳動物を免疫化させて製造される、請求項２記載の方法。
【請求項５】前記抗体が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体
である、請求項４記載の方法。
【請求項６】前記モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞株hTGF-46
(KCTC 0460BP)から産生される、請求項５記載の方法。
【請求項７】前記試料中のＴＧＦ−β１の濃度が、３０ｐｇ／ｍｌまたは
その以下である、請求項１または２記載の方法。
【請求項８】前記標識が、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ビオチ
ンまたはフルオルセチンである、請求項２記載の方法。
【請求項９】患者から採取した体液試料をＴＧＦ−β１特異的受容体で処
理して受容体と試料中に存在するＴＧＦ−β１の間に複合体を形成させる段階、
複合体の量を測定して試料中のＴＧＦ−β１の濃度を定量する段階；および前記
ＴＧＦ−β１濃度を健常者のものと比較する段階を含む、患者の癌を検査する方
法。
【請求項１０】 (ａ)ＴＧＦ−β１特異的受容体を固体支持体に付着させる
段階； (ｂ)付着した受容体に試料を加えてＴＧＦ−β１受容体−複合体を形成させる
段階； (ｃ)標識が付されたＴＧＦ−β１特異的抗体を前記複合体と結合させる段階； (ｄ)検出マーカーとして前記標識を用いて試料中のＴＧＦ−β１の濃度を測定
する段階；および (ｅ)ＴＧＦ−β１濃度を健常者のものと比較する段階を含む、請求項９記載の
方法。
【請求項１１】前記ＴＧＦ−β１特異的受容体が、ＴＧＦ−β１ III型受
容体である、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】前記ＴＧＦ−β１特異的抗体が、ＴＧＦ−β１またはその
一部で哺乳動物を免疫化させて製造される抗体である、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】前記抗体が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗
体である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】前記モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞株hTGF-4
6 (KCTC 0460BP)から産生される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】前記試料中のＴＧＦ−β１の濃度が３０ｐｇ／ｍｌまたは
その以下である、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１６】前記標識が、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ビオ
チンまたはフルオルセチンである、請求項１０記載の方法。
【請求項１７】前記癌が、胃癌、肝癌、乳房癌、肺癌、直・大腸癌、前立
腺癌および子宮頸部癌からなる群から選ばれる、請求項９または１０記載の方法
。
【請求項１８】前記体液が、血漿または尿である、請求項９または１０記
載の方法。
【請求項１９】ＴＧＦ−β１特異的受容体およびＴＧＦ−β１特異的抗体
を含むことを特徴とする、癌検査用組成物。
【請求項２０】前記ＴＧＦ−β１特異的受容体が、ＴＧＦ−β１ III型受
容体である、請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】ヒトＴＧＦ−β１特異的なモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマ細胞株hTGF-46(寄託番号: KCTC 0460BP)。
【請求項２２】ハイブリドーマ細胞株hTGF-46(寄託番号: KCTC 0460BP)に
よって産生される、ヒトＴＧＦ−β１特異的なモノクローナル抗体。