JP2002541479A - トランスフォーミング増殖因子−β1の定量方法およびそれを用いた癌検査方法 - Google Patents

トランスフォーミング増殖因子−β1の定量方法およびそれを用いた癌検査方法

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ジン・ソンウォン
シン・ホーン
リム・チャンギ
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ハンミ ファーム. シーオー., エルティーディー.
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Abstract

(57)【要約】 試料中のTGF−β1の量を、試料をTGF−β1特異的受容体で処理してTGF−β1および受容体の間に複合体を形成させ、複合体の量を測定することによって定量する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】 発明の分野 本発明は、体液中のトランスフォーミング増殖因子‐β1(TGF−β1)の濃
度を定量する方法、それを用いた癌検査方法およびTGF−β1−特異的なモノ
クローナル抗体に関する。
【0002】 発明の背景 トランスフォーミング増殖因子−β(Transforming Growth Factor beta; TGF-
β)は、種々の細胞の増殖と分化を調節するが、この作用は細胞の立体配置と他
の成長因子の存在有無に依存する(Sporn et al., Science, 233:532-534(1986);
Roberts and Sporn, Adv. Cancer Res., 51:107-145(1988))。
【0003】 三つの形態のTGF-β因子、即ちTGF−β1、−β2および−β3は哺乳動物
に出現するが、これらのうち、TGF−β1は生理学的メカニズムおよび疾病の
進行過程において非常に重要な役割を果すことが知られている。TGF−β1は
、発癌などの侵入過程(invasion process)においてその作用が異常であると報告
されている。これは、TGF−β1が癌の検査において腫瘍マーカー(tumor mar
ker)として有用であり、高感度で体液中のTGF−β1を定量する方法が癌検査
に重要であり得ることを示す。
【0004】 ヨーロッパ特許公開第0 722 773 A1号は、血液試料中のTGF−β1の濃度を
測定することによって癌を検査する方法として、TGF−β1をOH−カーボネ
ート化ヒドロキシアパタイト(OH-carbonated hydroxyapatite)のような吸着剤に
吸着させた後、吸着されたTGF−β1を緩衝溶液で溶出させ、TGF−β1の
濃度をUV分光計で測定する方法を開示している。しかし、この方法は、測定値
に大きな誤差があるので感度が低く、不正確であるという問題がある。
【0005】 したがって、血漿中のTGF−β1の濃度を定量するための改善された方法の
開発が求められていた。
【0006】 発明の要約 したがって、本発明の目的は、試料中のTGF−β1の濃度を高感度で正確に
測定する方法を提供することである。
【0007】 本発明の他の目的は、前記方法を用いて癌を検査する方法を提供することであ
る。
【0008】 本発明のまた他の目的は、癌を検査するための組成物を提供することである。
【0009】 本発明のまた他の目的は、TGF−β1−特異的なモノクローナル抗体および
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を提供することである。
【0010】 本発明の一実施態様によって、本発明では、試料をTGF−β1特異的受容体
で処理してTGF−β1と受容体の間に複合体を形成させ、この複合体の量を測
定する段階を含む試料中のTGF−β1の量を定量する方法が提供される。
【0011】 発明の詳細な説明 本発明に使用され得るTGF−β1特異的受容体としては、TGF−β1 I
型、 II型、III型(RI、RIIおよびRIII)などがあり、特に、TGF−β1 II
I型受容体(RIII)が好ましい。前記TGF−β1受容体は、通常の方法に従って
哺乳動物細胞株または昆虫細胞株においてTGF−β1受容体を発現させて得ら
れる(Burnad, J. P. et al., Virology 101, 286-290, 1980)。たとえば、TG
F−β1受容体は、TGF−β1受容体遺伝子を含む組換えバキュロウイルス(b
aculovirus)であって、Sf21(Invitrogen, Netherlands)のような昆虫細胞株
を感染させ、昆虫細胞株に発現された不溶性受容体タンパク質を抽出し、抽出し
た不溶性受容体タンパク質をグアニジンHClまたはウレアで可溶化させた後、
TGF−β1に対する結合能を回復させるためにグアニジンHClまたはウレア
を除去して、可溶化された受容体タンパク質をリフォールディングすることによ
って得られる。
【0012】 本発明に使用され得るTGF−β1−特異的な抗体は、哺乳動物にTGF−β
1またはその一部を免疫化させて製造できる。TGF−β1−特異的な抗体はT
GF−β1に対してのみ特異性を有するモノクローナル抗体であるか、ポリクロ
ーナル抗体である。
【0013】 本発明による血漿または尿などの体液中のTGF−β1の量を定量する好まし
い方法は、 (a)TGF−β1特異的受容体を固体支持体に付着させる段階、 (b)体液試料を固体支持体に付着した受容体に加えてTGF−β1−受容体複
合体を形成させる段階; (c)標識(label)が付されたTGF−β1特異的抗体を複合体に結合させる段階
;および (d)検出マーカーとして標識を用いてTGF−β1の量を測定する段階を含む。
【0014】 本発明に使用され得る代表的な標識としては、ホースラディッシュペルオキシ
ダーゼ、ビオチンおよびフルオルセインがある。
【0015】 本発明の最も好ましい実施態様は、TGF−β1受容体をマイクロタイタープ
レートのウエルのような固体支持体に付着させ、TGF−β1を含む試料を適切
に稀釈してTGF−β1受容体に加えて、TGF−β1とTGF−β1受容体の
間に複合体を形成させ、リン酸塩緩衝溶液(PBS)で支持体を洗浄した後、これに
、発色酵素が結合された抗TGF−β1抗体を加えて発色させた後、反応溶液の
吸光度を測定して試料中のTGF−β1の量を測定する段階を含む。
【0016】 本発明の第二の実施態様において、TGF−β1−特異的な受容体を含む液体
を支持体に付着したTGF−β1受容体の代りに使用できる。この方法において
は、試料をTGF−β1−特異的な受容体を含む液体に加え、これに標識が付さ
れたTGF−β1−特異的な抗体を加えた後、抗体-TGF−β1−受容体複合
体を沈殿させ、吸光度を測定することによって試料中のTGF−β1の量を定量
することができる。
【0017】 本発明の方法は、30pg/mlまたはその以下の非常に低い濃度範囲におい
てもTGF−β1を検出することができる。
【0018】 癌患者体液中のTGF−β1濃度は、健常者のものとは著しく異なるので、前
記方法は癌の診断に特に有用である。したがって、患者の体液中、たとえば、血
漿または尿中のTGF−β1の量を測定し、これを健常者のTGF−β1の濃度
と比較する前記方法を繰返すことによって癌を検査することができる。
【0019】 癌を診断するための本発明の好ましい方法は、 (a)TGF−β1受容体を固体支持体に付着させる段階; (b)体液試料を前記支持体に付着した受容体に加えてTGF−β1受容体複合
体を形成させる段階; (c)標識が付されたTGF−β1−特異的な抗体を前記複合体に結合させる段
階; (d)検出マーカーとして標識を用いてTGF−β1の量を測定する段階;およ
び (e)前記TGF−β1の量を健常者のものと比較する段階を含む。
【0020】 前記方法は、特に胃癌、肝癌、乳房癌、肺癌、直・大腸癌、前立腺癌および子
宮頸部癌の検査に効果的である。
【0021】 前記癌を検査するための方法に使用され得る組成物は、TGF−β1受容体、
好ましくは、III型受容体、およびTGF−β1特異的抗体を含む。
【0022】 検査感度を向上させるために、通常の細胞融合法に従って、免疫源としてTG
F−β1全分子または一部抗原決定基を用いてTGF−β1特異的なモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を製造し、ハイブリドーマ細胞株から
モノクローナル抗体を分離することによってモノクローナル抗体を得る。たとえ
ば、ハイブリドーマ細胞株は、ヒトTGF−β1でマウスを免疫化し、コーラー
およびミルステインによって開示された細胞融合法(Kohler and Milstein, Eur.
J. Imunol., 6:511- (1976))に従って脾臓細胞と骨髄腫細胞を融合させ、ヒト
TGF−β1抗原に対してのみ特異的に反応するハイブリドーマ細胞株を酵素免
疫分析法(ELISA)を用いて選別し、免疫拡散法を用いてハイブリドーマ細胞株に
よって産生されるモノクローナル抗体のサブクラスを決定し、そして高い抗体力
価を有するIgG1サブクラスを分泌するハイブリドーマ細胞株を選別する。こ
のようにして得られたハイブリドーマ細胞株を、hTGF-46と命名し、特許手続上
の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定により、1998年4
月20日付で韓国生命工学研究所遺伝子銀行(Korean Collection for Type Cult
ures(KCTC);住所:大韓民国大田廣域市儒城區魚隠洞52番地)に寄託番号第K
CTC 0460BP号として寄託した。
【0023】 ハイブリドーマ細胞株はhTGF−46は、ベータ−リンフォーマ(β-limpho
ma)に由来し、継続的に分裂しながらヒトTGF−β1に特異的なIgGlサブ
クラス抗体を生成する。前記ハイブリドーマ細胞株は、10%ウシ胎児血清を含
むRPMI 1640培地(Giboco-BRL, USA)を用いて5% COと100%
湿度の雰囲気の下、37℃で培養し得る。細胞数は、12〜14時間に2倍にな
る。該ハイブリドーマ細胞株は、培養フラスコの底に付着せず、培養培地に浮い
て、直径15〜20μmの丸い形態をしている。
【0024】 前記ハイブリドーマ細胞株からTGF−β1特異的なモノクローナル抗体を大
量産生するために、前記ハイブリドーマ細胞株をマウスに注射し、腹腔が脹れ上
がったとき高濃度のハイブリドーマ細胞を含む腹水液を取った後、これらからモ
ノクローナル抗体を分離する。
【0025】 TGF−β1、 β2およびβ3をウエスタンブロッティング法に従って電気
泳動を行うと、本発明のモノクローナル抗体はTGF−β2やβ3は認識せず、
TGF−β1のみを特異的に認識する。このような結果は、本発明のモノクロー
ナル抗体がTGF−β1に対してのみ特異性を有することを示す。また、本発明
のモノクローナル抗体は、ヒトTGF−β1に対して高い結合親和度を示し、ヒ
トTGF−β1の5〜80番目のアミノ酸残基に対応するエピト−プ部位に結合
する。
【0026】 下記実施例は本発明をさらに詳細に説明するためのものであり、本発明の範囲
を制限するものではない。
【0027】 また、下記固体混合物中の固体、液体中の液体、および液体中の固体に対して
下記の百分率は、各々重量/重量、容量/容量および重量/容量に基づいたもの
であり、特に言及しない限りすべての反応は室温で行われた。
【0028】 実施例1:受容体に対するTGF−β1の敏感性 (段階1)TGF−β1 III型受容体の製造 ヒトTGF−β1 III型受容体の全長cDNA配列を含むプラスミドpCEP4(In
vitrogen社、The Netherlands)を、プライマーRIII 1およびRIII 2(配列
番号:1および2)を用いて重合連鎖反応(PCR)を行って、400アミノ酸残基(
酸1−400)からなる受容体の細胞外ドメインをコードするDNA断片を得た
。このようにして得られたDNA断片をバキュロウイルスベクターpCRBac(Invit
rogen社、The Netherlands)に挿入して組換えプラスミドpCRBac-TGFRを得た。大
腸菌を前記組換えプラスミドpCRBac-TGFRで形質転換し、形質転換された大腸菌
細胞をアンピシリンを含むLB培地のような選別培地上で選別した。
【0029】 ベクターpCRBac-TGFRとBac-N-Blue DNA(Invitrogen社、The Netherlands)をリ
ポソーム形質移入法(Burand, J.P., Virology, 101, 286-290(1980))を用いて昆
虫細胞株Sf−21(Invitrogen社、The Netherlands)に同時導入し、3日間培
養してウイルス生成物を得た。3日後、このようにして得られたウイルスは検出
マーカーとしてlacZ遺伝子を用いてプラーク分析を行って組換えウイルスを
選別した。このようにして得られた組換えウイルスを正方向プライマー(配列番
号3)および逆方向プライマー(配列番号4)を用いてPCRを行ってTGF−β
1受容体遺伝子の存在の有無を確認した。この際、野性バキュロウイルスは、8
39bpのPCR生成物を示したが、組換えウイルスは1.5kbpの生成物を
産生した。
【0030】 昆虫細胞株Sf21を組換えウイルスで感染させた後、5日間培養した。培養
液を遠心分離して細胞浮遊物を除去し、ウイルスを含む上澄液を収穫した。
【0031】 上澄液に昆虫細胞株Sf21を接種した後、10%ウシ胎児血清(FBS)、7
.3%TCイーストレート(yeastolate)、ラクトアルブミン加水分解物を含むグ
レース昆虫(Grace Insect)培地(Invitrogen社、The Netherlands)で27℃で7
2時間培養した。培養液を遠心分離して細胞を集めた後、細胞をPBSで洗浄し
た。これに、タンパク質融解緩衝液(50 mM Tris-HCl(pH 7.5)、50mM Na
Cl、10mM β−メルカプトエタノール、1% Triton X-100および2mM
BMSF)を加えた後、反応溶液を100℃で10分間加熱して試料を調製し
た。
【0032】 前記試料を12.5%SDS−ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動を行い、
クマシーブリリアントブルー(coomassie brilliant blue)でゲルを染色した。ゲ
ル上で分離したタンパク質は電気的にフィルターに移し、R&Dシステム社から
購入したTGF−β1に対する抗体をフィルターのタンパク質と結合させた後、
ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)が結合された抗IgG2次抗体(C
hemicon, USA)を用いてTGF−β1を分析するというウエスタンブロッティン
グ法によってTGF−β1 III型受容体の発現を確認した。
【0033】 TGF−β1受容体は不溶性であるため、8MグアニジンHCl(pH 8.0)を試
料に加え、反応溶液を1時間攪拌した。反応溶液を7,000rpmで40分間
遠心分離した後、上澄液を2mg/mlのタンパク質濃度に調整した。TGF−
β1とTGF−β1受容体との結合能を回復させるように、反応溶液にリフォー
ルディング緩衝溶液(100 mM Tris, 0.5 M arginin, 0.2 M EDTA, pH 8.0)を15
0μg/mlのタンパク質濃度で加え、10℃で40時間保管した。TGF−β
1受容体を効果的にリフォールドするために、反応溶液を20mM Tris溶
液(pH 8.0)で段階的に4時間ずつ2回、一晩中一回、2時間ずつ2回透析した。
【0034】 (段階2)TGF−β1に対するTGF−β1 III型受容体の敏感性 前記段階1で得られたTGF−β1 III型受容体2μgずつをマイクロタイタ
ープレートの各ウエルに加え、反応プレートを常温で24時間放置してプレート
に受容体を付着させた。精製されたTGF−β1 2ng(R & D systems Inc.,
USA)をPBSに溶かし、段階的に稀釈液を製造した。各希釈液を100μlの量
でウエルに加え、常温で3時間保持して受容体とTGF−β1を結合させた。各
ウエルをツイーン(Tween)20 0.05%(PBST溶液)を含むPBSで洗浄し
た後、HRPが結合された抗TGF−β1抗体(R & D systems Inc., USA)を加
え、室温で1.5時間反応させた。ウェルをPBSTで洗浄した後、HRPの基
質であるTMB-ELISA(Gibco-BRL) 100μlを加え、常温で20分間反応させて
発色させた。2N硫酸25μlを加えて反応を停止させた。反応溶液の吸光度を
450nmの測定波長、570nmの補正波長で測定し、標準吸光−濃度相関関
係を求めてその結果をプロットした。
【0035】 図1は、このようにして得られた相関関係が0.999の相関係数と0.28の
勾配を有する直線であることを示す。傾きは、測定に用いられた受容体の感度を
示し、TGF−β1 III型受容体はTGF−β1結合に対して非常に優れた感度
を有するとみられる。また、図1における相関関係はTGF−β1の非常に低い
濃度、10pg/ml以下においても本発明の方法によって検出されることを示
す。
【0036】 一方、TGF−β1 II型受容体の感度を調べるために、TGF−β1 II型
受容体(R & D systems Inc.)を用いて前記操作を繰返した。図にプロットされた
結果はTGF−β1 II型受容体を用いて得られた相関関係もまた0.999の相
関係数と0.57の傾きを有する直線であることを示す。したがって、II型受容
体をTGF−β1の濃度を定量するために使用できるが、その感度はIII型受容
体に比べて相当低いことが分かる。
【0037】 実施例2:TGF−β1に対するTGF−β1 III型受容体の結合特異度 TGF−β1の代りに2,000pg/mlのTGF−β1、2,000pg/
mlのTGF-β2および2,000pg/mlのTGF−β3(R&D Systems Inc.)を
含む混合液を用いたことを除いては実施例1の段階2の操作を繰返した。対照群
として2,000pg/mlのTGF−β1を用いて実施例1の段階2を繰返し
た。その結果を下記表1に示す。
【0038】
【表1】
【0039】 表1から分かるように、TGF−β1 III型受容体はTGF−β2または T
GF−β3との交差反応を起さずにTGF−β1とのみ結合する。
【0040】 実施例3:モノクローナル抗体を用いた癌患者の血漿中TGF−β1濃度測定 101名の健常者および111名の胃癌患者、100名の肝癌患者、151名
の乳房癌患者から血液試料を採取した。抗凝固剤として15%エチレンジアミン
四酢酸(EDTA)0.081mlを含むVacuumtainerで血液試料を集めた後、反
応混合物を3,000rpmで20分間遠心分離して血漿試料を得た。血漿試料
0.1mlに2.5N酢酸/10Mウレア溶液0.1mlを入れた。反応混合物を
10分間放置し、1Mヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸(EPES)
を含む2.7N NaOH溶液0.1mlで中和したた。このようにして得られた
、活性化された血漿をPBST溶液で4倍稀釈してTGF−β1濃度測定のため
の次の過程に使用する血漿試料を得た。
【0041】 このようにして得られた血漿試料0.1mlとTGF−β1標準物質(0, 100,
1,000および2,000 pg/ml)0.1mlを各々TGF−β1 III型受容体を含
む96ウェルプレートのウェルに加え、室温で3時間放置した後、PBST溶液
で3回洗浄した。これに、精製されたTGF−β1モノクローナル抗体−HRP
結合体(Sigma)を各ウェルに加え、室温で1.5時間放置した後、PBST溶液で
3回洗浄した。HRPの基質であるTMB−ELISA(Gibco-BRL, USA)100
μlを各ウェルに加え、プレートを室温で20分間発色させた。発色反応は2N
硫酸25μlを加えて中止させた。反応溶液の吸光度を450nmの測定波長、
570nmの補正波長で測定した。血漿試料中のTGF−β1の濃度は標準溶液
を用いて得られた標準曲線に基づいて測定し、その結果を下記表2および図2に
示す。
【0042】
【表2】
【0043】 各患者群の血漿中TGF−β1濃度の分布様相を示す図2から分かるように、
癌患者の血漿試料は健常者の血漿試料とは全く違うTGF−β1濃度分布様相を
示した。このような結果は、前述の癌が本発明の方法に従って血漿中TGF−β
1の濃度を測定することによって効果的に検出され得ることを示す。
【0044】 実施例4:モノクローナル抗体を用いた癌患者の血漿中TGF−β1濃度測定 288名の健常者および29名の肺癌患者、48名の直・大腸癌患者、50名
の前立腺癌患者および88名の子宮頸部癌患者から採取した血液試料を用いて実
施例3と同様の操作を繰返して各々の血漿中TGF−β1濃度を測定し、その結
果を下記表3および図3に示す。
【0045】
【表3】 註) P<0.01
【0046】 各患者群の血漿中TGF−β1濃度の分布様相を示す表3から分かるように、
癌患者らの血漿試料は健常者群の血漿試料とは全く違うTGF−β1濃度の分布
様相を示す。このような結果は、前述の癌を本発明の方法に従って血漿中TGF
−β1の濃度を測定することによって検出し得ることを示す。
【0047】 実施例5:モノクローナル抗体を用いた癌患者の血漿中TGF−β1濃度測定
モノクローナル抗体の代りにポリクローナル抗体を用いることを除いては、50
名の健常者および50名の肝癌患者および50名の乳房癌患者から採取した血液
を用いて実施例3と同様の操作を繰返して各々の血漿中TGF−β1濃度を測定
し、その結果を下記表4に示す。
【0048】
【表4】 註) P<0.01
【0049】 前記表4から分かるように、癌患者らの血漿試料は健常者の血漿試料とは全く
違うTGF−β1濃度の分布様相を示す。このような結果は、前述の癌を前記操
作に従って血漿中TGF−β1の濃度を測定することによって検出し得ることを
示す。
【0050】 実施例6:TGF−β1に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ細胞株の製造 (段階1)マウスの免疫化 TGF−β1を完全フロインドアジュバント(Complete Freund Adjuvant)と同
量で混合物が液体になるまで混合し、反応混合物を生後7週齢のBalb/cマウスの
尾静脈内に100μlの量で注射した。2週間後1次注射と同量のTGF−β1
をフロインド不完全アジュバント(Freund's incomplete adjuvant)と混合してマ
ウスの尾静脈に注射した。4〜5日後、尾から小量の血液を採血し、ELISA
方法でTGF−β1に対する抗体の存在を確認した。次の細胞融合実験3〜4日
前に0.85% PBSに溶かしたヒトTGF−β1 30μgを静脈内に注射
した。
【0051】 (段階2)細胞融合 細胞融合操作において母細胞としては骨髄腫(myeloma) 細胞 SP2/0・Ag14(ATC
C CRL 1581)を用いた。この母細胞は、10%FBSを含むRPMI培地で最大
密度5x10/mlを保持しながら培養した。
【0052】 段階1で得られた、免疫化されたマウスをエーテルで麻酔し、脾臓組織を除去
して組織ホモジナイザーで均質化した。均質化物をHBSS(Gibco-BRL,USA)中
で懸濁し、懸濁液を15ml遠心分離管に入れ、遠心分離した。この操作を2回
繰返して脾臓細胞を十分洗浄した。母細胞であるSP2/0・Ag14もHBS
S中に懸濁させ、遠心分離する操作を2回繰返した。脾臓細胞とSP2/0・A
g14を各々HBSS 10mlに再懸濁した後、各懸濁液中の細胞数を数えた
。各懸濁液から採った10の脾臓細胞と10のSP2/0・Ag14細胞を
遠心分離管で混合した後、さらに遠心分離して細胞を沈澱させた。遠心分離管を
指で軽く叩いて沈澱物を分散させた後、37℃で1分間保持した。これに、45
%PEG(w/v)および5%DMSO(w/v)を含むHBSS 1mlを1分間加えた
後、1分間ふりまぜた。その後、これにRPMI培地 9mlを3分間入れ、遠
心分離管をふりまぜながら細胞懸濁液の総量が50mlになるまでRPMIを加
えた。この懸濁液を遠心分離した後、このようにして得られた細胞ペレットをH
AT培地(Gibco-BRL, USA)で1〜2x10/ml濃度で再懸濁させ、96−ウ
ェルマイクロタイタープレートの各ウェルに再懸濁液0.2mlずつ入れた後、
37℃、5%CO、100%湿度を保持しながら、培養器中で数日間培養した
【0053】 (段階3)モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選別 段階2で製造したハイブリドーマ細胞を、ヒトのTGF−β1を用いたELI
SA分析方法を次の通り行って、ヒトTGF−β1抗原にのみ特異的に反応する
細胞を得た。
【0054】 マイクロタイタープレートのウェルにヒトTGF−β1抗原を各ウエル当り5
0μl(2μg/ml)ずつ加え、室温で12時間放置してプレート表面に抗原を
付着した。該ウェルをPBST溶液で洗浄して付着しなかった抗原を除去した。
【0055】 段階2で得られたハイブリドーマ細胞培養液を各ウェルに細胞当り50μlず
つ加え、37℃で1時間放置した。ウェルをPBST溶液で洗浄して培養液を除
去した。これに、ヤギ抗−マウスIgG−HRP(Sigma, USA)を加え、室温で1
時間反応させた後、PBST溶液で十分洗浄した。基質溶液(OPD, Sigma)100
μlをこれに加え、室温で20分間放置し、反応溶液の吸光度を492nmで測
定した。
【0056】 その結果、ヒトTGF−β1抗原に特異的に高い結合力を有する抗体を分泌す
るハイブリドーマ細胞株がまず選別され、これらのハイブリドーマ細胞株は各々
ヒトTGF−β1、β2およびβ3を用いてELISAを行ってヒトのTGF−
β1抗原にのみ特異的に反応するハイブリドーマ細胞株をスクリーニングした。
このようにして得られた各々のハイブリドーマ細胞を制限稀釈(limiting diluti
on)してモノクローナル抗体を産生する7つのハイブリドーマ細胞株クローン、
hTGF−7,−8、−31、−46、−70、−119および−119および
−207を得た。これらのクローンは凍結乾燥して保管した。
【0057】 ハイブリドーマ細胞培養液を遠心分離し、上澄液でELISAを行って抗体力
価を測定した後、二重免疫拡散法(immunotype kit, Sigma)を行って抗体のサブ
クラスタイプ(subclass type)を確認した。その結果を下記表5に示す。
【0058】
【表5】
【0059】 図5から分かるように、7つのすべてのクローンはIgG1であった。
【0060】 7つのクローンのうち、最も高い力価を示すクローン、hTGF−46を選別
し、マウスの腹腔内に注射した。次いで、前記マウスから腹水液を採取し、ウエ
スタンブロッティングを行った。この結果は、ハイブリドーマ細胞株クローンh
TGF−46がヒトTGF−β1に対する高い特異性を有するモノクローナル抗
体を分泌することを示した。前記ハイブリドーマ細胞株hTGF−46を特許手
続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定により、1998
年4月20日付で韓国生命工学研究所遺伝子銀行(Korean Collection for Type
Cultures(KCTC);住所:大韓民国大田廣域市儒城區魚隠洞52番地)に寄託番号
第KCTC 0460BP号として寄託した。
【0061】 実施例7:TGF−β1に対するモノクローナル抗体の産生 実施例6で得られたハイブリドーマ細胞株を用いてTGF−β1に対するモノ
クローナル抗体を生産するために、Balb/cマウスにプリスタン(pristane)
0.5mlを腹腔内に注射し、1週間後、各々のマウスに5x10ハイブリド
ーマ細胞を注射した。腹腔が脹れ上がったマウスから高濃度のハイブリドーマを
含む複数液を採取し、これを10,000rpmで遠心分離してハイブリドーマ
細胞を除去した。上澄液を−20℃で保管した。
【0062】 プロテインGビーズをカラムに充填した後、1xPBSで4回洗浄した。前記
上澄液2mlを分当り5滴の流速でカラムに滴下し、0.1グリシン−HCl溶液
を10分当り1滴の流速でカラムに導入してIgGを溶出させた。
【0063】 HRPを1.25%グルタールアルデヒドを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝
液(pH6.5)で活性化させ、活性化されたHRPを炭酸塩緩衝液(pH9.2)で
透析した。透析されたHRPをIgGと反応させてHRP−結合IgGを得た。
反応が終了した後、RZ値(A403/A280)は、280nmと403nmでの反応溶
液の吸光度を測定することによって決定した。酵素が結合された抗体の活性を測
定するために、マイクロタイタープレートの各ウェルにTGF−β1 1μgを
コーティングした後、HRP−結合IgGと反応させて活性度を調査した。また
、HRP−結合IgGをウエスタンブロッティングを行ってこれらの活性度を確
認した。
【0064】 実施例8:ウエスタンブロッティング 実施例7で得られたTGF−β1特異的なモノクローナル抗体がTGF−β2
およびβ3と反応するかどうかを確認するために、前記モノクローナル抗体をS
DS−PAGEおよびウエスタンブロッティング方法を下記の通り行った。
【0065】 ヒトTGF−β1、β2およびβ3タンパク質を10% SDS−ポリアクリ
ルアミドゲルにSDS−PAGEを行った後、ニトロセルロースフィルタ膜に電
気的に移した。膜を3%ウシ血清アルブミン溶液で室温で12〜14時間処理し
てタンパク質の非特異的な反応を遮断した。この膜を0.5%ツイーン20を含
むPBSで3回洗浄した後、HRPが結合された抗マウスIgG(Sigma,USA)と
室温で反応させた。この膜を0.5%ツイーン20を含むPBSで洗浄した後、
基質溶液(TMB, Gibco-BRL,USA)を膜に加えて発色反応させた。
【0066】 その結果は、本発明のモノクローナル抗体は、ヒトTGF−β1にのみ反応し
、ヒトTGF−β2やヒトTGF−β3とは反応しなかったことを示す。したが
って、本発明のモノクローナル抗体は、ヒトTGF−β1にのみ特異的に反応す
る抗体であることを確認した。
【0067】 本発明を具体的な実施態様と関連させて記述したが、添付した特許請求の範囲
によって定義される本発明の範囲内で、当該分野の熟練者が本発明を多様に変形
および変化させ得ると理解されなければならない。
【0068】 特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約 国際様式 下記国際寄託機関で定めた規則7.1に基づいて発行された原寄託に関する受託証 受領人:チェ ヨンギョン 300-200大韓民国大田広域市東区龍田洞山1番地新東亜Apt.1-203
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】 TGF−β1 III型およびII型受容体の各々に対して実施例1 で得られた吸光度−TGF−β1濃度を示す。
【図2】 健常者、胃癌患者、肝癌患者および乳房癌患者から採取した血漿
試料中のTGF−β1濃度の相対的分布を示す。
【図3】 健常者、肺癌患者、直・大腸癌患者、前立腺癌患者および子宮頸
部癌患者から採取した血漿試料中のTGF−β1濃度の相対的分布を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),AU,BR,C A,CN,ID,IN,JP,MX,NZ,RU,SG ,TR,US (72)発明者 リム・チャンギ 大韓民国463−110キョンギド、ソンナム シ、ブンダンク、ブルジョンドン、ハンジ ン・アパートメント803−1401 Fターム(参考) 4B064 AG27 CA20 DA14 4B065 AA91X AA94Y AB05 BA08 CA25 CA46 4H045 AA11 AA30 CA40 DA76 EA51 FA74

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 試料中のTGF−β1の量を定量する方法であって、試料を
    TGF−β1特異的受容体で処理し、TGF−β1と受容体の間に複合体を形成
    させ、複合体の量を測定する段階を含むことを特徴とする方法。
  2. 【請求項2】 (a)TGF−β1特異的受容体を固体支持体に付着させる段
    階; (b)付着した受容体に試料を加えてTGF−β1−受容体複合体を形成させる
    段階; (c)標識が付されたTGF−β1特異的抗体を前記複合体と結合させる段階;
    および (d)検出マーカーとして前記標識を用いてTGF−β1の量を測定する段階を
    含む、請求項1記載の方法。
  3. 【請求項3】 前記TGF−β1特異的受容体が、TGF−β1 III型受
    容体である、請求項1または2記載の方法。
  4. 【請求項4】 前記TGF−β1特異的抗体が、TGF−β1またはその一
    部で哺乳動物を免疫化させて製造される、請求項2記載の方法。
  5. 【請求項5】 前記抗体が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体
    である、請求項4記載の方法。
  6. 【請求項6】 前記モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞株hTGF-46
    (KCTC 0460BP)から産生される、請求項5記載の方法。
  7. 【請求項7】 前記試料中のTGF−β1の濃度が、30pg/mlまたは
    その以下である、請求項1または2記載の方法。
  8. 【請求項8】 前記標識が、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ビオチ
    ンまたはフルオルセチンである、請求項2記載の方法。
  9. 【請求項9】 患者から採取した体液試料をTGF−β1特異的受容体で処
    理して受容体と試料中に存在するTGF−β1の間に複合体を形成させる段階、
    複合体の量を測定して試料中のTGF−β1の濃度を定量する段階;および前記
    TGF−β1濃度を健常者のものと比較する段階を含む、患者の癌を検査する方
    法。
  10. 【請求項10】 (a)TGF−β1特異的受容体を固体支持体に付着させる
    段階; (b)付着した受容体に試料を加えてTGF−β1受容体−複合体を形成させる
    段階; (c)標識が付されたTGF−β1特異的抗体を前記複合体と結合させる段階; (d)検出マーカーとして前記標識を用いて試料中のTGF−β1の濃度を測定
    する段階;および (e)TGF−β1濃度を健常者のものと比較する段階を含む、請求項9記載の
    方法。
  11. 【請求項11】 前記TGF−β1特異的受容体が、TGF−β1 III型受
    容体である、請求項9または10記載の方法。
  12. 【請求項12】 前記TGF−β1特異的抗体が、TGF−β1またはその
    一部で哺乳動物を免疫化させて製造される抗体である、請求項10記載の方法。
  13. 【請求項13】 前記抗体が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗
    体である、請求項12記載の方法。
  14. 【請求項14】 前記モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞株hTGF-4
    6 (KCTC 0460BP)から産生される、請求項13記載の方法。
  15. 【請求項15】 前記試料中のTGF−β1の濃度が30pg/mlまたは
    その以下である、請求項9または10記載の方法。
  16. 【請求項16】 前記標識が、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ビオ
    チンまたはフルオルセチンである、請求項10記載の方法。
  17. 【請求項17】 前記癌が、胃癌、肝癌、乳房癌、肺癌、直・大腸癌、前立
    腺癌および子宮頸部癌からなる群から選ばれる、請求項9または10記載の方法
  18. 【請求項18】 前記体液が、血漿または尿である、請求項9または10記
    載の方法。
  19. 【請求項19】 TGF−β1特異的受容体およびTGF−β1特異的抗体
    を含むことを特徴とする、癌検査用組成物。
  20. 【請求項20】 前記TGF−β1特異的受容体が、TGF−β1 III型受
    容体である、請求項19記載の組成物。
  21. 【請求項21】 ヒトTGF−β1特異的なモノクローナル抗体を産生する
    ハイブリドーマ細胞株hTGF-46(寄託番号: KCTC 0460BP)。
  22. 【請求項22】 ハイブリドーマ細胞株hTGF-46(寄託番号: KCTC 0460BP)に
    よって産生される、ヒトTGF−β1特異的なモノクローナル抗体。
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