JP2002510198A - スクリーニングのための骨形態形成タンパク質（ｂｍｐ）受容体複合体の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞分化活性のスクリーニングのために、骨形態形成タンパク質タイプＩＩ受容体の使用に関するもので、前記タイプＩＩ受容体はタイプＩ受容体と共に、アクチビンと骨形態形成タンパク質の間に位置する。本発明はさらに、この受容体をコードするＤＮＡを含む細胞および前記ＤＮＡに関するものである。本発明は、化合物が新規ＢＭＰ複合体に結合することが可能かどうか、および試験化合物がＢＭＰ受容体タンパク質複合体への結合にシグナルを発生するかどうかを測定する方法に関するものである。本発明はさらに、新規ＢＭＰ複合体を用いて、臨床試料中のＢＭＰ受容体リガンドの濃度を測定する方法に関するものである。本発明はさらにまた、この複合体、またはその可溶性フラグメントの成分をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで同時発現させた宿主細胞に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 スクリーニングのための骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）受容体複合体の使用 技術分野 本発明は、骨の形成、発育および細胞分化の分野に関するものである。特に、 本発明は、アクチビンと骨形態形成タンパク質の間に位置するタイプＩＩ受容体 を、Ｉ型受容体と共に、細胞分化活性をスクリーニングのために用いることに関 するものである。本発明はさらに、この受容体をコードするＤＮＡと、Ｉ型骨形 態形成タンパク質受容体をコードするＤＮＡとを、同時トランスフェクションし た（ｃｏ−ｔａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｅｄ）細胞に関するものである。 背景 ヒトおよびその他の温血動物は数多くの骨に関する障害に苛まれることがある 。このような疾患の範囲は骨折から骨粗鬆症などの衰弱疾患におよぶ。健常人の 場合、一般的に骨成長は正常に進行し、骨折は薬理学的介入を必要とせずに治癒 するが、ある種の場合では、骨が弱まって適切に治癒されないであろう。例えば 、高齢者および副腎皮質ホルモンによる治療を受けている患者（例えば、移植患 者）では、治癒はゆっくりと進行する。骨粗鬆症とは、骨の硬組織の損失が新規 な硬組織の発育に対して不釣り合いとなっている状態をいう。骨粗鬆症は一般に 、骨量の減少または骨格組織の萎縮と定義することができ、髄質や骨の空間が広 がり、結合繊維が減少し、緻密骨が脆くなることである。骨に関連する障害の他 の例としては、関節軟骨の変質および摩耗ならびに関節表面での新たな骨の形成 を特徴とする可動関節の障害である変形性関節炎がある。 種々の治療がこのような骨に関連する障害に利用できる一方で、最適な結果が 得られる治療法はない。骨に関連する障害を治療する人々が直面している困難性 の１つは、骨代謝および骨に関連する障害の徹底した理解が不足していることで ある。これらを理解する鍵は、骨成長に関与するそれぞれの要素を同定し、特徴 を明らかにすることである。骨形態形成タンパク質（ＢＭＰｓ）が、骨の形成お よび発育において何らかの役割を担っていることが実証されている（Ｊ．Ｍ．Ｗ ｏｚｎｅｙ、Ｍｏｌｅｃ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐ．、３ ２：１６０−１６７頁（１９９２）；Ｂ．Ｌ．Ｍ Ｈｏｇａｎ、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄ ｅｖ．１０：１５８０−１５９４（１９９６））。 さらに、ＢＭＰｓの役割は骨のみに限定されるものではないと考えられる。Ｂ ＭＰｓが、脳、腎臓、重層扁平上皮、および毛包などの他の組織において有意な 濃度で検出されたという知見（Ｎ．Ａ．Ｗａｌｌ，Ｍ．Ｂｌｅｓｓｉｎｇ，Ｃ． Ｖ．Ｅ．Ｗｒｉｇｈｔ、およびＢ．Ｌ．Ｍ．Ｈｏｇａｎ、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ ｌ．、１２０：４９３−５０２（１９９３）；Ｅ．Ｏｚｋａｙｎａｋ、Ｐ．Ｎ． Ｊ．Ｓｃｈｎｅｇｅｌｓｂｅｒｇ、Ｄ．Ｆ．Ｊｉｎ、Ｇ．Ｍ．Ｃｌｉｆｆｏｒｄ 、Ｆ．Ｄ．Ｗａｒｒｅｎ、Ｅ．Ａ．Ｄｒｉｅｒ、ａｎｄ Ｈ．Ｏｐｐｅｒｍａｎ ｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：２５２２０−２５２２７（１９９２） ；Ｋ．Ｍ．Ｌｙｏｎｓ、Ｃ．Ｍ．Ｊｏｎｅｓ、ａｎｄ Ｂ．Ｌ．Ｍ．Ｈｏｇａｎ 、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、７：４０８−４１２（１９９１）； Ｖ．Ｄｒｏｚｄｏｆｆ、Ｎ．Ａ．Ｗａｌｌ、ａｎｄ Ｗ．Ｊ．Ｐｌｅｄｇｅｒ、 Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ．Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、９１：５５２８−５５３２（１９９４ ））によって、ＢＭＰｓが発育や分化において別の役割を担っている可能性が示 唆される。このことを支持するように、ＢＭＰｓは最近、神経細胞分化を促進し たり、毛包形成に影響を与えたり、心臓や腎臓の発育や、その他の種々の器官の 発育に関わっていることが見い出されている（Ｋ．Ｂａｓｌｅｒ，Ｔ．Ｅｄｌｕ ｎｄ、Ｔ．Ｍ．Ｊｅｓｓｅｌｌ、ａｎｄ Ｔ．Ｙａｍａｄａ、Ｃｅｌｌ、７３： ６８７−７０２（１９９３）；Ｖ．Ｍ．Ｐａｒａｌｋａｒ、Ｂ．Ｓ．Ｗｅｅｋｓ ，Ｙ．Ｍ．Ｙｕ，Ｈ．Ｋ．Ｋｌｅｉｎｍａｎ、ａｎｄ Ａ．Ｈ．Ｒｅｄｄｉ、Ｊ ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１１９：１７２１−１７２８（１９９２）；Ｍ．Ｂｌ ｅｓｓｉｎｇ、Ｌ．Ｂ．Ｎａｎｎｃｙ、Ｌ．Ｅ．Ｋｉｎｇ、Ｃ．Ｍ．Ｊｏｎｅｓ 、ａｎｄ Ｂ．Ｌ．Ｈｏｒｇａｎ、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、７：２０４−２１５ （１９９３）；Ａ．Ｔ．Ｄｕｄｌｅｙ、Ｋ．Ｍ．Ｌｙｏｎｓ、ａｎｄ Ｅ．Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．９：２７９５−２８０７（１９９５ ）；Ｇ．Ｃ．Ｌｕｏ，Ａ．Ｌ．Ｊ．Ｊ．Ｈｏｆｍａｎｎ、Ｍ．Ｂｒｏｎｃｋｅｒ ｓ、Ａ． Ｓｏｈｏｃｋｉ、Ａ．Ｂｒａｄｌｅｙ、ａｎｄ Ｇ．Ｋａｒｓｅｎｔｙ、Ｇｅｎ ｅｓ ＆ Ｄｅｖ．９：２８０８−２８２０（１９９５）；Ｔ．Ｍ．Ｓｃｈｕｌ ｔｈｅｉｓｓ、Ｊ．Ｂ．Ｅ．Ｂｕｒｃｈ、ａｎｄ Ａ．Ｂ．Ｌａｓｓｅｒ、Ｇｅ ｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．１１：４５１−４６２（１９９７）；Ｂ．Ｌ．Ｍ．Ｈｏｒ ｇａｎ、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．、１０：１５８０−１５９４（１９９６）） 。 ＢＭＰは、ＢＭＰ反応性細胞の原形質膜上で発現される特異的なＢＭＰ受容体 に結合することによって、生物学的な効果を開始する。受容体はタンパク質であ って、通常は細胞膜に広がっており、細胞の外側からリガンドが結合し、この結 合によって細胞の機能を変化させるシグナルが細胞の内側へ送られる。この場合 、リガンドはタンパク質ＢＭＰであり、シグナルにより細胞分化が誘導される。 ＢＭＰ受容体は特異的にＢＭＰｓと結合するの能力を有するので、精製された ＢＭＰ受容体組成物は、診断や治療で用いるＢＭＰ受容体抗体の作製と同様に、 ＢＭＰｓの臨床アッセイに有用である。さらに、精製した可溶性ＢＭＰ受容体組 成物は、ＢＭＰｓを結合または除去する治療に直接用いることができ、これによ って骨や他の組織でのＢＭＰｓの活性を調節する手段が与えられる。ＢＭＰ受容 体の構造的特徴や生物学的特徴、および組織の成長／形成の刺激の際の、ＢＭＰ に対する種々の細胞集団の反応におけるＢＭＰｓの果たす役割の研究のため、あ るいは治療、診断またはアッセイにおいて効果的にＢＭＰ受容体を用いるために 、ＢＭＰ受容体の精製組成物が必要である。しかしながら、このような組成物は 、組換えＤＮＡ技術を用いて受容体をコードする遺伝子のクローニングおよび発 現によってのみ、実用的な収率で得ることができる。生化学分析に用いるＢＭＰ 受容体を精製する努力、またはＢＭＰ受容体をコードする哺乳類遺伝子をクロー ニングおよび発現する努力は、受容体タンパク質やｍＲＮＡの適切な供給源がな いことが妨げとなっている。本発明以前は、本明細書で記述した受容体サブユニ ットから成る高親和性ＢＭＰ受容体を高レベルで発現することが知られている細 胞系が少なく、このことがタンパク質のアミノ酸配列決定のための受容体の精製 や、直接発現クローニング用の遺伝子ライブラリーの構築を妨げていた。ＢＭＰ 受容体の配列が得られることによって、生化学分析用やスクリーニング実験に用 いるための、高レベルの組換えＢＭＰ受容体を有する細胞系を生成すること が可能になるであろう。 ＢＭＰｓは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの構成員である。ＴＧＦ−βスー パーファミリーの他の構成員には、ＴＧＦ−β、アクチビン、インヒビン、抗ミ ュラー管抑制物質、および成長−分化因子（ＧＤＦｓ）が含まれる（Ｂ．Ｌ．Ｍ Ｈｏｇａｎ、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．１０：１５８０−１５９４（１９９６ ））。予想通りに、種々のＴＧＦ−βスーパーファミリー構成員の受容体は、類 似した構造的特徴を有している。ＴＧＦ−βリガンドスーパーファミリーの受容 体は、典型的にはタイプＩとタイプＩＩと称する２つのサブグループの１つに分 類される。タイプＩおよびタイプＩＩの受容体の分類自体は、アミノ酸配列の特 徴に基づいている。タイプＩおよびタイプＩＩの受容体はいずれも、比較的小さ な細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通領域、およびセリン／トレオニンキナー ゼ活性を示すと考えられる細胞内タンパク質キナーゼドメインを有している（Ｌ ｉｎ ａｎｄ Ｍｏｕｓｔａｋａｓ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４０：３３７−３４９（１９９４）；Ｌ．Ｓ．Ｍａｔ ｈｅｗｓ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１５：３１０−３２５（１９ ９４）；Ｌ．Ａｔｔｉｓａｎｏ、Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ、Ｆ．Ｌｏｐｅｚ−Ｃａｓ ｉｌｌａｓ、ａｎｄ Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂ ｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１２２２：７１−８０（１９９４）；Ｐ．Ｔｅ ｎ Ｄｉｊｋｅ、Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ、ａｎｄ Ｃ．−Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ、Ｃ ｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８：１３９ −１４５（１９９６）、Ｈ．ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｐ．Ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ、Ｃ ．−Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ、ａｎｄ Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ，Ｂｏｎｅ １９：５６ ９−５７４（１９９６）、Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｆ．Ｗｅｉｓ−Ｇａｒｃｉａ 、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖｅｙｓ ２７：４１−６４（１９９６））。 現在までにクローニングされたタイプＩ受容体は、異なるファミリーに属し、 そのキナーゼドメインは相関性が高く、８５％より高いの配列の相同性を有して いる（Ｂ．Ｂ．Ｋｏｅｎｉｇ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃ ｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４：５９６１−５９７４（１９９４））。 タイプＩ受容体の細胞内の膜近傍（ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎ）領域は、膜貫通 領域由来の３５〜４０アミノ酸のＳＧＳＧＳＧモチーフが特徴であり、かつこれ らの受容体のカルボキシ末端は極めて短い（Ｂ．Ｂ．Ｋｏｅｎｉｇ ｅｔ ａｌ ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏ１ｏｇｙ、１４： ５９６１−５９７４（１９９４）；Ｌ．Ａｔｔｉｓａｎｏ、Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ 、Ｆ．Ｌｏｐｅｚ−Ｃａｓｉｌｌａｓ、ａｎｄ Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｂｉｏ ｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１２２２：７１−８ ０（１９９４））。タイプＩ受容体の細胞外ドメインは、膜貫通領域の２５〜３ ０アミノ酸の中に位置した「システインボックス」と呼ばれるシステイン残基の 特徴的な群（ｃｌｕｓｔｅｒ）と、推定シグナル配列の後に位置する「上流シス テインボックス」と呼ばれるもう一つのシステイン残基の群とを含む（Ｂ．Ｂ． Ｋｏｅｎｉｇ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４：５９６１−５９７４（１９９４）；Ｌ．Ａｔｔｉｓａ ｎｏ、ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａ ｃｔａ、１２２２：７１−８０（１９９４）；Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｆ．Ｗｅ ｉｓ−Ｇａｒｃｉａ，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖｅｙｓ ２７：４１−６４（１９ ９６））。 ＢＭＰｓに対する３つの異なる哺乳類タイプＩ受容体、すなわち骨形態形成タ ンパク質受容体キナーゼ−１（本明細書では「ＢＲＫ−１」と称する）（Ｊ．Ｓ ．ＣｏｏｋらによるＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／１５８，７３５、１９９３年１１月 ２４日出願；およびＢ．Ｂ．Ｋｏｅｎｉｇ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４：５９６１−５９７４（１ ９９４）を参照のこと）、ＡＬＫ−２、およびＡＬＫ−６が報告されている。Ｂ ＲＫ−１は、ヒトＡＬＫ−３のマウス同族体であり、ＢＭＰＲ−ＩＡまたはＴＦ Ｒ−ＩＩとしても知られる（Ｐ．Ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ、Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ、 ａｎｄ Ｃ．−Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃ ｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８：１３９−１４５（１９９６）を参照のこと）；Ｂ ＲＫ−１のラット同族体もクローニングされている（Ｋ．Ｔａｋｅｄａ、Ｓ．Ｏ ｉｄａ、Ｈ．Ｉｃｈｉｊｏ、Ｔ．Ｉｉｍｕｒａ、Ｙ．Ｍａｒｎｏｋａ、Ｔ．Ａｍ ａｇａｓａ ａｎｄ Ｓ．Ｓａｓａｋｉ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂ ｉ ｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０ ４：２０３−２０９（１９９４））。ＢＲＫ−１は、親和性標識による測定で、 ＢＭＰ−７を結合するよりも効果的にＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４を結合し（Ｊ ．Ｍ．Ｇｒａｆｆ、Ｒ．Ｓ．Ｔｈｉｅｓ、Ｊ．Ｊ．Ｓｏｎｇ、Ａ．Ｊ．Ｃｅｌｅ ｓｔｅ、ａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｍｅｌｔｏｎ、Ｃｅｌｌ ７９：１６９−１７９（１ ９９４）；Ｂ．Ｂ．Ｋｏｅｎｉｇ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４：５９６１−５９７４（１９９４） ；Ａ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｒ．Ｓ．Ｔｈｉｅｓ、Ｎ．Ｙａｍａｊｉ、Ｊ．Ｊ．Ｓｏｎ ｇ、Ｊ．Ｍ．Ｗｏｚｎｅｙ Ｋ．Ｍｕｒａｋａｍｉ、ａｎｄ Ｎ．Ｕｅｎｏ、Ｐ ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏ ｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１０２５５−１０２５９（１９９４ ）；Ｐ．ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ、Ｈ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ、Ｔ．Ｋ．Ｓａｍｐａｔ ｈ、Ａ．Ｈ．Ｒｅｄｄｉ、Ｍ．Ｅｓｔｅｖｅｚ、Ｄ．Ｌ．Ｒｉｄｄｌｅ、Ｈ．Ｉ ｃｈｉｊｏ、Ｃ．−Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ、ａｎｄ Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ、Ｊ．Ｂ ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９：１６９８５−１６９８８（ １９９４））、一方ＧＤＦ−５は全く結合しないことが示されている（Ｈ．Ｎｉ ｓｈｉｔｏｈ、Ｈ．Ｉｃｈｉｊｏ、Ｍ．Ｋｉｍｕｒａ、Ｔ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ 、Ｆ．Ｍａｋｉｓｈｉｍａ、Ａ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ、Ｈ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ 、Ｓ．Ｅｎｏｍｏｔｏ、ａｎｄ Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃ ａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７１：２１３４５−２１３５２（１９９６））。 ＢＭＰＲ−ＩＢ（Ｐ．Ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ、Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ、ａｎｄ Ｃ ．−Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂ ｉｏｌｏｇｙ ８：１３９−１４５（１９９６）を参照のこと）としても知られ るＡＬＫ−６の結合特性は、ＡＬＫ−６はＧＤＦ−５の結合が可能であることは 除いて、ＢＲＫ−１の場合と同様である（Ｐ．ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ、Ｈ．Ｙａｍ ａｓｈｉｔａ、Ｔ．Ｋ．Ｓａｍｐａｔｈ、Ａ．Ｈ．Ｒｅｄｄｉ、Ｍ．Ｅｓｔｅｖ ｅｚ、Ｄ．Ｌ．Ｒｉｄｄｌｅ、Ｈ．Ｉｃｈｉｊｏ、Ｃ．−Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ、ａ ｎｄ Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９：１６９８５−１６９８８（１９９４）；Ｈ．Ｎｉｓｈｉｔｏｈ、Ｈ． Ｉｃｈｉｊ ｏ、Ｍ．Ｋｉｍｕｒａ、Ｔ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、Ｆ．Ｍａｋｉｓｈｉｍａ、Ａ ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ、Ｈ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ、Ｓ．Ｅｎｏｍｏｔｏ、ａｎｄ Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２ ７１：２１３４５−２１３５２（１９９６））。ＡＬＫ−６は、ニワトリの受容 体、骨形態形成タンパク質受容体キナーゼ２（本明細書では「ＢＲＫ−２」と称 する）（ＲＰＫ−１とも称する）のマウス同族体である（Ｓ．Ｓｕｍｉｔｏｍｏ 、Ｔ．Ｓａｉｔｏ、ａｎｄ Ｔ．Ｎｏｈｎｏ、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、３： ２９７−３０２（１９９３））。ＡＬＫ−２は、ＡｃｔＲＩ、Ｔｓｋ７Ｌ、また はＳＫＲ１としても知られ（Ｐ．Ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ、Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ、 ａｎｄ Ｃ．−Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃ ｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８：１３９−１４５（１９９６）；Ｋ．Ｍａｔｓｕｚ ａｋｉ、Ｊ．Ｘｕ、Ｆ．Ｗａｎｇ、Ｗ．Ｌ．Ｍｃｋｅｅｈａｎ、Ｌ．Ｋｒｕｍｍ ｅｎ、ａｎｄ Ｍ．Ｋａｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６８：１２７１９−１２７２３（１９９３）を参照のこと）、ＢＭＰ−７を結 合するが、ＢＭＰ−４またはＧＤＦ−５は結合しない（Ｋ．Ｍａｔｓｕｚａｋｉ 、Ｊ．Ｘｕ、Ｆ．Ｗａｎｇ、Ｗ．Ｌ．Ｍｃｋｅｅｈａｎ、Ｌ．Ｋｒｕｍｍｅｎ、 ａｎｄ Ｍ．Ｋａｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６８ ：１２７１９−１２７２３（１９９３）；Ｈ．Ｎｉｓｈｉｔｏｈ、Ｈ．Ｉｃｈｉ ｊｏ、Ｍ．Ｋｉｍｕｒａ、Ｔ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、Ｆ．Ｍａｋｉｓｈｉｍａ、 Ａ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ、Ｈ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ、Ｓ．Ｅｎｏｍｏｔｏ、ａｎ ｄ Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７１：２１３４５−２１３５２（１９９６）；Ｐ．ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ、Ｈ． Ｙａｍａｓｈｉｔａ、Ｔ．Ｋ．Ｓａｍｐａｔｈ、Ａ．Ｈ．Ｒｅｄｄｉ、Ｍ．Ｅｓ ｔｅｖｅｚ、Ｄ．Ｌ．Ｒｉｄｄｌｅ、Ｈ．Ｉｃｈｉｊｏ、Ｃ．−Ｈ．Ｈｅｌｄｉ ｎ、ａｎｄ Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ ２６９：１６９８５−１６９８８（１９９４））。 タイプ１受容体とは対照的に、タイプ２受容体のキナーゼドメインは互いにほ んのわずかな関連があるだけである。タイプＩ受容体に見られるＳＧＳＧＳＧモ チーフは、タイプＩＩ受容体には見られない。さらに、タイプＩ受容体の「上流 システインボックス」はタイプＩＩ受容体には存在しない。さらに、全てのアク チビンタイプＩＩ受容体は細胞内の膜近傍領域にプロリンに富んだモチーフを含 むが、全てのタイプＩＩ受容体に共通する特徴的な配列モチーフは存在しない（ Ｌ．Ｓ．Ｍａｔｈｅｗｓ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１５：３１０ −３２５（１９９４））。タイプＩＩ受容体のカルボキシ末端の長さはかなり変 化に富んでおり、知られているもっとも長いカルボキシ末端は、Ｃ．ｅｌｅｇａ ｎｓからクローニングされた線虫のＢＭＰタイプＩＩ受容体ＤＡＦ−４中や（Ｍ ．Ｅｓｔｅｖｅｚ、Ｌ．Ａｔｔｉｓａｎｏ、Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ、Ｐ．Ｓ．Ａｌ ｂｅｒｔ、Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、ａｎｄ Ｄ．Ｌ．Ｒｉｄｄｌｅ，Ｎａｔｕｒ ｅ，３６５：６４４−４９（１９９３））、本明細書中で取り入れる、Ｒｏｓｅ ｎｂａｕｍおよびＮｏｈｎｏによる米国特許出願第０８／３３４，１７９号で記 述された、ＢＭＰ−ＲＩＩとしても知られている哺乳類ＢＭＰ特異的タイプＩＩ 受容体ＢＲＫ−３中で見い出されている（Ｂ．Ｌ．Ｒｏｓｅｎｚｗｅｉｇ，Ｔ． Ｉｍａｍｕｒａ、Ｔ．Ｏｋａｄａｍｅ、Ｇ．Ｎ．Ｃｏｘ、Ｈ．Ｙａｍａｓｈｉｔ ａ、Ｐ．Ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ、Ｃ．−Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ、ａｎｄ Ｋ．Ｍｉｙａ ｚｏｎｏ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａ ｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．、９２：７６３２−７６３６ （１９９５）；Ｔ．Ｎｏｈｎｏ、Ｔ．Ｉｓｈｉｋａｗａ、Ｔ．Ｓａｉｔｏ、Ｋ． Ｈｏｓｏｋａｗａ、Ｓ．Ｎｏｊｉ、Ｄ．Ｈ．Ｗｏｌｓｉｎｇ、ａｎｄ Ｊ．Ｓ． Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７０ ：２２５２２−２２５２６（１９９５）．、Ｆ．Ｌｉｕ、Ｆ．Ｖｅｎｔｕｒａ、 Ｊ．Ｄｏｏｄｙ、ａｎｄ Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１５：３４７９−３４８６（１９９５） ）。タイプＩＩ受容体の細胞外ドメインは、膜貫通領域の近くに位置する１個の システインボックスを含む。システインボックスの存在を除いて、ＴＧＦ−β、 アクチビンおよびＢＭＰｓのタイプＩＩ受容体の細胞外ドメイン間には、配列の 類似性はほとんどない。 ＴＧＦ−βリガンドスーパーファミリーの構成員によるシグナル伝達には、同 一細胞表面上にタイプＩおよびタイプＩＩ受容体の両方が存在することが必要で ある（Ｌ．Ｓ．Ｍａｔｈｅｗｓ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１５： ３１０−３２５（１９９４）；Ｌ．Ａｔｔｉｓａｎｏ、Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ、Ｆ ．Ｌｏｐｅｚ−Ｃａｓｉｌｌａｓ、ａｎｄ Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｂｉｏｃｈ ｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１２２２：７１−８０（ １９９４）；Ｐ．Ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ、Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ、ａｎｄ Ｃ．− Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ ｌｏｇｙ ８：１３９−１４５（１９９６）、Ｈ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ、Ｐ．Ｔ ｅｎ Ｄｉｊｋｅ、Ｃ．−Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ、ａｎｄ Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ、 Ｂｏｎｅ １９：５６９−５７４（１９９６）、Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｆ．Ｗ ｅｉｓ−Ｇａｒｃｉａ、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖｅｙｓ ２７：４１−６４（１ ９９６））。ＴＧＦ−β受容体系およびアクチビン受容体系で示されたことと同 様に（総説（Ｔ．Ｂｒａｎｄ ａｎｄ Ｍ．Ｄ．Ｓｈｎｅｉｄｅｒ、Ｃｉｒｃｕ ｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７８：１７３−１７９（１９９６）；Ｐ．Ｔ ｅｎ Ｄｉｊｋｅ、Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ、ａｎｄ Ｃ．−Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ、 Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８：１３ ９−１４５（１９９６）を参照のこと）、ＢＭＰｓは、タイプＩ受容体（Ｂ．Ｂ ．Ｋｏｅｎｉｇ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａ ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４：５９６１−５９７４（１９９４）；Ｐ．ｔｅｎ Ｄ ｉｊｋｅ、Ｈ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ、Ｔ．Ｋ．Ｓａｍｐａｔｈ、Ａ．Ｈ．Ｒｅｄ ｄｉ、Ｍ．Ｅｓｔｅｖｅｚ、Ｄ．Ｌ．Ｒｉｄｄｌｅ、Ｈ．Ｉｃｈｉｊｏ、Ｃ．− Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ、ａｎｄ Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９：１６９８５−１６９８８（１９９４））および タイプＩＩ受容体（Ｂ．Ｌ．Ｒｏｓｅｎｚｗｅｉｇ，Ｔ．Ｉｍａｍｕｒａ、Ｔ． Ｏｋａｄｏｍｅ、Ｇ．Ｎ．Ｃｏｘ、Ｈ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ、Ｐ．Ｔｅｎ Ｄｉ ｊｋｅ、Ｃ．−Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ、ａｎｄ Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ、Ｐｒｏｃｅ ｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃ ｉｅｎｃｅｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．、９２：７６３２−７６３６（１９９５）；Ｔ．Ｎ ｏｈｎｏ、Ｔ．Ｉｓｈｉｋａｗａ、Ｔ．Ｓａｉｔｏ、Ｋ．Ｈｏｓｏｋａｗａ、Ｓ ．Ｎｏｊｉ、Ｄ．Ｈ．Ｗｏｌｓｉｎｇ、ａｎｄ Ｊ．Ｓ．Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ、 Ｊ．Ｂｉｏｌ ｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７０：２２５２２−２２５２６（１９９ ５）、Ｆ．Ｌｉｕ、Ｆ．Ｖｅｎｔｕｒａ、Ｊ．Ｄｏｏｄｙ、ａｎｄ Ｊ．Ｍａｓ ｓａｇｕｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 、１５：３４７９−３４８６（１９９５）；Ａ．Ｌｅｔｓｏｕ、Ｋ．Ａｒｏｒａ 、Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ、Ｋ．Ｓｉｍｉｎ、Ｖ．Ｔｗｏｍｂｌｙ、Ｊ．Ｊａｍａｌ 、Ｋ．Ｓｔａｅｈｌｉｎｇ−Ｈａｍｐｔｏｎ、Ｆ．Ｍ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ、Ｗ． Ｍ．Ｇｅｌｂａｒｔ、Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、ａｎｄ Ｍ．Ｂ．Ｏ’Ｃｏｎｎｏ ｒ、Ｃｅｌｌ ８０：８９９−９０８（１９９５）；Ｅ．Ｒｕｂｅｒｔｅ、Ｔ． Ｍａｒｔｙ、Ｄ．Ｎｅｌｌｅｎ、Ｍ．Ａｆｆｏｌｔｅｒ、ａｎｄ Ｋ．Ｂａｓｌ ｅｒ、Ｃｅｌｌ ８０：８８９−８９７（１９９５）；Ｈ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ 、Ｐ．ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ、Ｄ．Ｈｕｙｌｅｂｒｏｅｃｋ、Ｔ．Ｋ．Ｓａｍｐａ ｔｈ、Ｍ．Ａｎｄｒｉｅｓ、Ｊ．Ｃ．Ｓｍｉｔｈ、Ｃ．−Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ、ａ ｎｄ Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３０：２１７ −２２６（１９９５））から成るヘテロメリックな受容体複合体に結合し、ＢＭ Ｐを介するシグナル伝達には、タイプＩおよびタイプＩＩ受容体の両方の存在が 必要である（Ｆ．Ｌｉｕ、Ｆ．Ｖｅｎｔｕｒａ、Ｊ．Ｄｏｏｄｙ、ａｎｄ Ｊ． Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ ｏｇｙ、１５：３４７９−３４８６（１９９５）；Ｂ．Ｌ．Ｒｏｓｅｎｚｗｅｉ ｇ，Ｔ．Ｉｍａｍｕｒａ、Ｔ．Ｏｋａｄｏｍｅ、Ｇ．Ｎ．Ｃｏｘ、Ｈ．Ｙａｍａ ｓｈｉｔａ、Ｐ．Ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ、Ｃ．−Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ、ａｎｄ Ｋ． Ｍｉｙａｚｏｎｏ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．、９２：７６３２− ７６３６（１９９５）；Ｅ．Ｒｕｂｅｒｔｅ、Ｔ．Ｍａｒｔｙ、Ｄ．Ｎｅｌｌｅ ｎ、Ｍ．Ａｆｆｏｌｔｅｒ、ａｎｄ Ｋ．Ｂａｓｌｅｒ、Ｃｅｌｌ ８０：８８ ９−８９７（１９９５）；Ｈ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ、Ｐ．ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ、 Ｄ．Ｈｕｙｌｅｂｒｏｅｃｋ、Ｔ．Ｋ．Ｓａｍｐａｔｈ、Ｍ．Ａｎｄｒｉｅｓ、 Ｊ．Ｃ．Ｓｍｉｔｈ、Ｃ．−Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ、ａｎｄ Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ 、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３０：２１７−２２６（１９９５）；Ｐ． Ａ．Ｈｏｏｄｌｅｓｓ、Ｔ．Ｈａｅｒｒｙ、Ｓ．Ａｂｄｏｌｌａｈ、Ｍ．Ｓｔａ ｐｌｅｔ ｏｎ、Ｍ．Ｂ．Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ、Ｌ．Ａｔｔｉｓａｎｏ、ａｎｄ Ｊ．Ｌ．Ｗ ｒａｎａ、Ｃｅｌｌ ８５：４８９−５００（１９９６））。 ＴＧＦ−βタイプＩ受容体（Ｌ．Ａｔｔｉｓａｎｏ、Ｊ．Ｃａｒｃａｍｏ、Ｆ ．Ｖｅｎｔｕｒａ、Ｆ．Ｍ．Ｂ．Ｗｅｉｓ、Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、ａｎｄ Ｊ ．Ｌ．Ｗｒａｎａ、Ｃｅｌｌ ７５：６７１−６８０（１９９３）；Ｒ．Ｅｂｎ ｅｒ、Ｒ．−Ｈ．Ｃｈｅｎ、Ｓ．Ｌａｗｌｅｒ、Ｔ．Ｚｉｏｎｃｈｅｃｋ、ａｎ ｄ Ｒ．Ｄｅｒｙｎｃｋ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：９００−９０２（１９９３ ）；Ｐ．Ｆｒａｎｚｅｎ、Ｐ．ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ、Ｈ．Ｉｃｈｉｊｏ、Ｈ．Ｙ ａｍａｓｈｉｔａ、Ｐ．Ｓｃｈｕｌｚ、Ｃ．−Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ、ａｎｄ Ｋ． Ｍｉｙａｚｏｎｏ、Ｃｅｌｌ ７５：６８１−６９２（１９９３））およびアク チビンタイプＩ受容体（Ｊ．Ｃａｒｃａｍｏ、Ｆ．Ｍ．Ｂ．Ｗｅｉｓ、Ｆ．Ｖｅ ｎｔｕｒａ、Ｒ．Ｗｉｅｓｅｒ、Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ、Ｌ．Ａｔｔｉｓａｎｏ、 ａｎｄ Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａ ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １４：３８１０−３８２１（１９９４）；Ｒ．Ｅｂｎｅｒ 、Ｒ．−Ｈ．Ｃｈｅｎ、Ｓ．Ｌａｗｌｅ、Ｔ．Ｚｉｏｎｃｈｅｃｋ、ａｎｄ Ｒ ．Ｄｅｒｙｎｃｋ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：９００−９０２（１９９３））と 異なり、ＢＭＰｓのタイプＩ受容体は、ＣＯＳ細胞で発現する場合、受容体自身 でリガンドを結合することができる（Ｊ．Ｍ．Ｇｒａｆｆ、Ｒ．Ｓ．Ｔｈｉｅｓ 、Ｊ．Ｊ．Ｓｏｎｇ、Ａ．Ｊ．Ｃｅｌｅｓｔｅ、ａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｍｅｌｔｏｎ 、Ｃｅｌｌ ７９：１６９−１７９（１９９４）；Ｂ．Ｂ．Ｋｏｅｎｉｇ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 １４：５９６１−５９７４（１９９４）；Ａ．Ｓｕｚｕｋｉ、Ｒ．Ｓ．Ｔｈｉｅ ｓ、Ｎ．Ｙａｍａｊｉ、Ｊ．Ｊ．Ｓｏｎｇ、Ｊ．Ｍ．Ｗｏｚｎｅｙ Ｋ．Ｍｕｒ ａｋａｍｉ、ａｎｄ Ｎ．Ｕｅｎｏ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．９ １：１０２５５−１０２５９（１９９４）；Ｐ．ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ，Ｈ．Ｙａ ｍａｓｈｉｔａ、Ｔ．Ｋ．Ｓａｍｐａｔｈ、Ａ．Ｈ．Ｒｅｄｄｉ、Ｍ．Ｅｓｔｅ ｖｅｚ、Ｄ．Ｌ．Ｒｉｄｄｌｅ、Ｈ．Ｉｃｈｉｊｏ、Ｃ．−Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ、 ａｎｄ Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ ２６９： １６９８５−１６９８８（１９９４））が、タイプＩ受容体に対する結合親和力 および／または架橋効率はタイプＩＩ受容体の存在によって高まる（Ａ．Ｌｅｔ ｓｏｕ、Ｋ．Ａｒｏｒａ、Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ、Ｋ．Ｓｉｍｉｎ、Ｖ．Ｔｗｏｍ ｂｌｙ、Ｊ．Ｊａｍａｌ、Ｋ．Ｓｔａｅｈｌｉｎｇ−Ｈａｍｐｔｏｎ、Ｆ．Ｍ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ、Ｗ．Ｍ．Ｇｅｌｂａｒｔ、Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、ａｎｄ Ｍ．Ｂ．Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ、Ｃｅｌｌ ８０：８９９−９０８（１９９５）；Ｆ ．Ｌｉｕ、Ｆ．Ｖｅｎｔｕｒａ、Ｊ．Ｄｏｏｄｙ、ａｎｄ Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕ ｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１５： ３４７９−３４８６（１９９５）；Ｔ．Ｎｏｈｎｏ、Ｔ．Ｉｓｈｉｋａｗａ、Ｔ ．Ｓａｉｔｏ、Ｋ．Ｈｏｓｏｋａｗａ、Ｓ．Ｎｏｊｉ、Ｄ．Ｈ．Ｗｏｌｓｉｎｇ 、ａｎｄ Ｊ．Ｓ．Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ ２７０：２２５２２−２２５２６（１９９５）；Ｂ．Ｌ．Ｒｏｓｅ ｎｚｗｅｉｇ，Ｔ．Ｉｍａｍｕｒａ、Ｔ．Ｏｋａｄｏｍｅ、Ｇ．Ｎ．Ｃｏｘ、Ｈ ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ、Ｐ．Ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ、Ｃ．−Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ、ａ ｎｄ Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔ ｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．、９２： ７６３２−７６３６（１９９５）；Ｈ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ、Ｐ．ｔｅｎ Ｄｉ ｊｋｅ、Ｄ．Ｈｕｙｌｅｂｒｏｅｃｋ、Ｔ．Ｋ．Ｓａｍｐａｔｈ、Ｍ．Ａｎｄｒ ｉｅｓ、Ｊ．Ｃ．Ｓｍｉｔｈ、Ｃ．−Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ、ａｎｄ Ｋ．Ｍｉｙａ ｚｏｎｏ、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３０：２１７−２２６（１９９５ ））。さらに、ＴＧＦ−β受容体系およびアクチビン受容体系とは対照的に、哺 乳類ＢＭＰタイプＩＩ受容体ＢＲＫ−３へのＢＭＰ−２またはＢＭＰ−４の架橋 は、タイプＩ受容体がない場合には検出されず、タイプＩＩ受容体のみをトラン スフェクションした細胞では、極めて低レベルの結合だけが全細胞レベルで検出 される（Ｔ．Ｎｏｈｎｏ、Ｔ．Ｉｓｈｉｋａｗａ、Ｔ．Ｓａｉｔｏ、Ｋ．Ｈｏｓ ｏｋａｗａ、Ｓ．Ｎｏｊｉ、Ｄ．Ｈ．Ｗｏｌｓｉｎｇ、ａｎｄ Ｊ．Ｓ．Ｒｏｓ ｅｎｂａｕｍ、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７０：２２ ５２２−２２５２６（１９９５））。同時に、これらのデータは、ＢＭＰｓは単 独でいずれのサブユニットにも結合することができるであろう一方、適切なヘテ ロメ リック受容体複合体が形成された場合にのみ高親和性の結合およびシグナル伝達 が得られることを意味しており、種々のタイプＩＩ受容体細胞質内ドメインの配 列の違いは、異なるタイプＩ：タイプＩＩ受容体サブユニットの組み合わせにリ ガンドが結合することにより独特のシグナル伝達受容体複合体が形成されること を示唆している。したがって、高親和性ＢＭＰ受容体複合体との相互作用を介し て作用する新規の細胞分化薬剤の同定用スクリーニングアッセイにおいてこれら の受容体複合体を用いる場合には、既に同定されたタイプＩ受容体およびタイプ ＩＩ受容体複合体に加えて、高親和性の哺乳類タイプＩ：タイプＩＩＢＭＰ受容 体複合体を同定する必要がある。 我々は今までに、本明細書中に引用により取り入れるＲｏｓｅｎｂａｕｍによ る米国特許出願第０８／４６２，４６７号で記述されている通り、ＢＭＰタイプ Ｉ受容体とシグナル伝達複合体を形成することのできるタイプＩＩＢＭＰ受容体 キナーゼタンパク質ＢＲＫ−３の使用について報告し、かつ我々は、ＢＲＫ−２ タイプＩ受容体はＢＲＫ−３と高親和性の複合体を形成するが、タイプＩ受容体 がＢＲＫ−１の場合には複合体を形成しないことも既に報告した（Ｔ．Ｎｏｈｎ ｏ、Ｔ．Ｉｓｈｉｋａｗａ、Ｔ．Ｓａｉｔｏ、Ｋ．Ｈｏｓｏｋａｗａ、Ｓ．Ｎｏ ｊｉ、Ｄ．Ｈ．Ｗｏｌｓｉｎｇ、ａｎｄ Ｊ．Ｓ．Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ、Ｊ．Ｂ ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７０：２２５２２−２２５２６（ １９９５））。このことは、ＢＲＫ−３以外のタイプＩＩ受容体がＢＭＰ−２お よびＢＭＰ−４リガンドに反応してＢＲＫ−１と複合体を形成している、別の哺 乳動物高親和性ＢＭＰ受容体複合体が存在することを示唆する。ショウジョウバ エ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒでは、２５Ｄ／Ｔｋｖ座 の産物は、哺乳類ＢＲＫ−１およびＢＲＫ−２のショウジョウバエ同族体で、哺 乳類ＢＭＰ−２と同様に、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４のショウジョウバエ同族 体、ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（Ｄｐｐ）遺伝子の産物を結合することが できる（Ｈ．Ｏｋａｎｏ、Ｓ．Ｙｏｓｈｉｋａｗａ、Ａ．Ｓｕｚｕｋｉ、Ｎ．Ｕ ｅｎｏ、Ｍ．Ｋａｉｚｕ、Ｍ．Ｏｋａｂｅ、Ｔ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｍ．Ｍａ ｔｓｕｍｏｔｏ、Ｋ．Ｓａｗａｍｏｔｏ、ａｎｄ Ｋ．Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ、Ｇ ｅｎｅ １４８：２０３−２０９（１９９４）；Ａ．Ｐｅｌｔｏｎ、Ｙ．Ｃｈ ｅｎ、Ｋ．Ｓｔａｅｈｌｉｎｇ−Ｈａｍｐｔｏｎ、Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ、Ｌ．Ａ ｔｔｉｓａｎｏ、Ｊ．Ｓｚｉｄｏｎｙａ、Ｊ．Ａ．Ｃａｓｓｉｌｌ、Ｊ．Ｍａｓ ｓａｇｕｅ、ａｎｄ Ｆ．Ｍ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ、Ｃｅｌｌ ７８：２３９−２ ５０（１９９４））。最初はアクチビンタイプＩＩ／タイプＩＩＢ受容体同族体 として同定された（Ｓ．Ｒ．Ｃｈｉｌｄｓ、Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ、Ｋ．Ａｒｏｒ ａ、Ｌ．Ａｔｔｉｓａｎｏ、Ｍ．Ｂ．Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ、ａｎｄ Ｊ．Ｍａｓｓ ａｇｕｅ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃｃ ａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０：９４７５−９４７ ９（１９９３））Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐｕｎｔ遺伝子産物は、Ｄｐｐがシグ ナル伝達するためにＴｋｖ受容体と協同することが必要であり、このことはＴｋ ｖとＰｕｎｔはＤｐｐリガンド存在下でシグナル伝達受容体複合体を形成するこ とを意味している（Ｄ．Ｎｅｌｌｅｎ、Ｒ．Ｂｕｒｋｅ、Ｇ．Ｓｔｒｕｈｌ、ａ ｎｄ Ｋ．Ｂａｓｌｅｒ、Ｃｅｌｌ ８５：３５７−３６８（１９９６）；Ｅ． Ｒｕｂｅｒｔｅ、Ｔ．Ｍａｒｔｙ、Ｄ．Ｎｅｌｌｅｎ、Ｍ．Ａｆｆｏｌｔｅｒ、 ａｎｄ Ｋ．Ｂａｓｌｅｒ、Ｃｅｌｌ ８０：８８９−８９７（１９９５）；Ａ ．Ｌｅｔｓｏｕ、Ｋ．Ａｒｏｒａ、Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ、Ｋ．Ｓｉｍｉｎ、Ｖ． Ｔｗｏｍｂｌｙ、Ｊ．Ｊａｍａｌ、Ｋ．Ｓｔａｅｈｌｉｎｇ−Ｈａｍｐｔｏｎ、 Ｆ．Ｍ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ、Ｗ．Ｍ．Ｇｅｌｂａｒｔ、Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、 ａｎｄ Ｍ．Ｂ．Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ、Ｃｅｌｌ ８０：８９９−９０８（１９９ ５））。哺乳類のアクチビンタイプＩＩ受容体は、高い親和性でＢＭＰ−７を結 合し、ＡＬＫ−２またはＢＲＫ−２タイプＩ受容体と協同してシグナル伝達する ことが報告されたが、ＢＲＫ−１がタイプＩ受容体である場合にはシグナルは発 生しないので、哺乳類ＡｃｔＲＩＩおよびＢＲＫ−１はシグナル伝達受容体複合 体を形成しないことが示唆される（Ｈ．Ｙａｍａｓｈｉｔ、Ｐ．ｔｅｎ Ｄｉｊ ｋｅ、Ｄ．Ｈｕｙｌｅｂｒｏｅｃｋ、Ｔ．Ｋ．Ｓａｍｐａｔｈ、Ｍ．Ａｎｄｒｉ ｅｓ、Ｊ．Ｃ．Ｓｍｉｔｈ、Ｃ．−Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ、ａｎｄ Ｋ．Ｍｉｙａｚ ｏｎｏ、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３０：２１７−２２６（１９９５） ）。 ＡｃｔＲＩＩＢ受容体には、スプライシングによる４個の異なる変異体、Ａｃ ｔＲＩＩＢ₁、ＡｃｔＲＩＩＢ₂、ＡｃｔＲＩＩＢ₃、およびＡｃｔＲＩＩＢ₄が存 在し、いずれもアクチビンリガンドを結合することができる（Ｌ．Ａｔｔｉｓａ ｎｏ、Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ、Ｓ．Ｃｈｅｉｆｅｔｚ、ａｎｄ Ｊ．Ｍａｓｓａｇ ｕｅ、Ｃｅｌｌ ６８：９７−１０８（１９９２））。我々は本明細書で、この タイプＩＩ受容体がＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４リガンドを結合してＢＭＰ−４ またはＢＭＰ−２リガンド存在下でＢＭＰタイプＩ受容体ＢＲＫ−１およびＢＲ Ｋ−２と複合体を形成するためには、ＡｃｔＲＩＩＢ₁およびＡｃｔＲＩＩＢ₂の 細胞外の膜近傍領域にのみ存在する８個のアミノ酸が絶対に必要であることを示 す。さらに我々は、ＢＲＫ−１＋ＡｃｔＲＩＩＢ₂複合体は、ＢＲＫ−１タイプ Ｉ受容体のみよりも高い親和力でＢＭＰ−４リガンドを結合することを示すが、 ＢＲＫ−２＋ＢＲＫ−３ＢＭＰ受容体複合体で観察されるのと同様に、ＢＲＫ− １＋ＡｃｔＲＩＩＢ₂複合体がＢＭＰ−４に対して高親和性複合体であることを 示しており（Ｔ．Ｎｏｈｎｏ、Ｔ．Ｉｓｈｉｋａｗａ、Ｔ．Ｓａｉｔｏ、Ｋ．Ｈ ｏｓｏｋａｗａ、Ｓ．Ｎｏｊｉ、Ｄ．Ｈ．Ｗｏｌｓｉｎｇ、ａｎｄ Ｊ．Ｓ．Ｒ ｏｓｅｎｂａｕｍ、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７０： ２２５２２−２２５２６（１９９５））、したがってＢＲＫ−１＋ＡｃｔＲＩＩ Ｂ₂複合体は異なる高親和性ＢＭＰ受容体複合体であることを示している。最後 に、我々は以下に詳述した通りに、ＢＲＫ−１＋ＡＣｔＲＩＩＢ₂複合体が、Ｂ ＭＰｓへの反応をシグナル伝達する能力を有することを示す。したがって、Ａｃ ｔＲＩＩＢ₂およびＡｃｔＲＩＩＢ₁を、哺乳類ＢＭＰタイプＩ受容体と協同して ＢＭＰタイプＩＩ受容体として用いて、このＢＭＰ受容体複合体と相互作用する 新規化合物を同定し、これらの新規化合物がヒトや他の哺乳類において治療薬と して有用なＢＭＰ受容体アゴニストまたはアンタゴニストとなるかどうかを決定 することができる。 本発明の目的 本発明の目的は、ＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質複合体と結合することので きる化合物を同定する方法を提供することである。 本発明の他の目的は、試料中のＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質複合体を結合 することができる化合物の量を測定する方法を提供することである。 本発明の目的はさらに、前記ＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質複合体を含む、 ＢＭＰタイプＩＩ受容体キナーゼタンパク質をコードする組換え発現ベクターと ＢＭＰタイプＩ受容体キナーゼタンパク質をコードする組換え発現ベクターとを 含む、宿主細胞を提供することである。 本発明目的はさらに、試験化合物が、ＢＭＰ受容体タンパク質複合体への結合 においてシグナルを発生するかどうかを測定する方法を提供することである。 概要 本発明は、化合物がＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質複合体に結合することが できるか否かを測定する方法に関するものであり、この方法には、ＢＭＰ受容体 キナーゼタンパク質複合体に化合物を含む試料を導入し、この化合物をＢＭＰ受 容体キナーゼタンパク質複合体に結合させることが含まれる。ここで、このＢＭ Ｐ受容体キナーゼタンパク質複合体は、ＢＭＰタイプＩ受容体キナーゼタンパク 質と、ＡｃｔＲＩＩＢ₁またはＡｃｔＲＩＩＢ₂の特徴である膜近傍領域の８個の アミノ酸を含むＢＭＰ／アクチビンタイプＩＩ受容体キナーゼタンパク質とから 成る。 本発明はさらに、臨床試料中のＢＭＰ受容体リガンドの濃度を測定する方法に 関するものであり、この方法には、ＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質複合体にリ ガンドを含む試料を導入し、リガンドをＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質複合体 に結合させることを含まれる。ここで、このＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質複 合体は、ＢＭＰタイプＩ受容体キナーゼタンパク質と、ＢＭＰ／アクチビンタイ プＩＩ受容体キナーゼタンパク質、ＡｃｔＲＩＩＢ₁またはＡｃｔＲＩＩＢ₂とか ら成る。 本発明はさらに、ＢＭＰ／アクチビンタイプＩＩ受容体キナーゼタンパク質Ａ ｃｔＲＩＩＢ₂をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターと、ＢＭＰタイプＩ 受容体キナーゼタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターとを、同 時トランスフェクションした宿主細胞に関するものである。 本発明はさらに、可溶性ＢＭＰタイプＩ受容体キナーゼタンパク質と可溶性Ｂ ＭＰ／アクチビンタイプＩＩ受容体キナーゼタンパク質ＡｃｔＲＩＩＢ₂とをコ ードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを同時トランスフェクションした宿主細 胞に関するものである。 本発明はさらに、試験化合物が、ＢＭＰ受容体タンパク質複合体への結合にお いてシグナルを発生するかを測定する方法に関するものであり、この方法には、 （ａ）β−ガラクトシダーゼ遺伝子とともに３ＴＰ−Ｌｕｘルシフェラーゼレポ ーター遺伝子（Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ，Ｌ．Ａｔｔｉｓａｎｏ，Ｊ．Ｃａｒｃａｍ ｏ，Ａ．Ｚｅｎｔｅｌｌａ，Ｊ．Ｄｏｏｄｙ，Ｍ．Ｌａｉｈｏ，Ｘ．−Ｆ．Ｗａ ｎｇ，ａｎｄ Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｃｅｌｌ ７１：１００３−１０１４（ １９９２））をＢＭＰ受容体タンパク質複合体発現細胞にトランスフェクション する工程（ここで、この細胞は、ＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質ＡｃｔＲＩＩ Ｂ₁またはＡｃｔＲＩＩＢ₂をコードするＤＮＡ配列と、ＢＭＰタイプＩ受容体キ ナーゼタンパク質をコードするＤＮＡ配列とで、トランスフェクションされてい る）；（ｂ）（ｉ）試験化合物の存在下で第１組の細胞を培養し、（ｉｉ）試験 化合物の非存在下で第２組の細胞を培養する工程；（ｃ）工程（ｂ）で生成した レポーター構築の刺激により得られるルシフェラーゼ酵素の活性化により生成し たルシフェラーゼ活性レベルを任意の光単位により定量する工程；および（ｄ） 工程（ｃ）で定量された第１組の細胞由来の任意の光単位の量を、工程（ｃ）で 定量された第２組の細胞由来の任意の光単位の量と比較する工程が含まれる。 発明の詳細な説明 本発明は、化合物がＢＭＰ受容体に対して親和性があるかどうかを測定する方 法の必要性に応えるものである。該方法には、試験化合物を含む試料をＢＭＰ受 容体キナーゼタンパク質複合体に導入し、その化合物をＢＭＰ受容体キナーゼタ ンパク質複合体に結合させることが含まれる。ここで、この受容体複合体は、Ｂ ＭＰタイプＩ受容体キナーゼタンパク質と、本明細書中で「ＡｃｔＲＩＩＢ₂」 と称するタンパク質の特徴である特異的な(anspecific)８個のアミノ酸の膜近傍 領域を有する、ＡｃｔＲＩＩＢと一般的に称するＢＭＰ／アクチビンタイプＩ Ｉ受容体キナーゼタンパク質とを含む。本発明はさらに、ＢＭＰ／アクチビンタ イプＩＩ受容体キナーゼタンパク質ＡｃｔＲＩＩＢ₂をコードするＤＮＡ配列を 含む発現ベクターと、ＢＭＰタイプＩ受容体キナーゼタンパク質をコードするＤ ＮＡ配列を含む発現ベクターとを、同時トランスフェクションした宿主細胞の必 要性に応えるものである。さらに、臨床試料中のＢＭＰ受容体リガンドの濃度を 測定する方法を提供し、該方法には、リガンドを含む試料をＢＭＰ受容体キナー ゼタンパク質複合体に導入し、リガンドを受容体複合体に結合させることが含ま れるが、この場合、この受容体複合体は、ＢＭＰタイプＩ受容体キナーゼタンパ ク質と、ＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質ＡｃｔＲＩＩＢ₂とから成る。本発明 はさらに、可溶性ＢＭＰ／アクチビンタイプＩＩ受容体キナーゼタンパク質Ａｃ ｔＲＩＩＢ₂をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターと、可溶性ＢＭＰタイ プＩ受容体キナーゼタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターとを 、同時トランスフェクションした宿主細胞の必要性に応えるものである。 本明細書中で用いる「マウスＡｃｔＲＩＩＢ₂」は、アミノ酸配列番号４を有 するタンパク質、および配列番号４に実質的に類似するアミノ酸配列を有するタ ンパク質を意味しており、これらのタンパク質は、ＢＭＰ分子（ＢＭＰ−２、Ｂ ＭＰ−４、および／またはＢＭＰ−７が含まれるが、これらに限定しない）に結 合すること、またはＢＭＰ分子が細胞に結合することによって開始される生物学 的シグナルを変換すること、またはＡｃｔＲＩＩＢ₂タンパク質もしくはＡｃｔ ＲＩＩＢ₂のタンパク質配列由来のペプチドに対して生じた抗体と交差反応する こと、またはＢＭＰタイプＩ受容体との複合体形成、またはＡｃｔＲＩＩＢ₂も しくはＢＭＰタイプＩ受容体のいずれかに特異的な抗体を使用した場合における ＢＭＰタイプＩ受容体と同時免疫沈降すること（ｃｏ−ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉ ｐｉｔａｔｉｎｇ）が可能であるという生物学的活性を有する。 本明細書中で用いる「マウスＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質」または「ｍ− ＢＲＫ−３」は、アミノ酸配列番号１２またはその配列と実質的に類似する配列 を有するタンパク質を意味する。さらにこの定義には、ＢＭＰ分子（ＢＭＰ−２ 、ＢＭＰ−４、および／またはＢＭＰ−７が含まれるが、これらに限定しない） に結合すること、またはＢＭＰ分子が細胞に結合することによって開始される生 物 学的シグナルを変換すること、またはＡｃｔＲＩＩＢ₂タンパク質もしくはＡｃ ｔＲＩＩＢ₂のタンパク質配列由来のペプチドに対して生じた抗体と交差反応す ること、またはＢＭＰタイプＩ受容体との複合体形成、またはＡｃｔＲＩＩＢ₂ もしくはＢＭＰタイプＩ受容体のいずれかに特異的な抗体を使用した場合におけ るＢＭＰタイプＩ受容体と同時免疫沈降することが可能であるという生物学的活 性を有する、同種のタンパク質が含まれる。 本明細書中で用いる「ＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質ＢＲＫ−３」または「 ＢＲＫ−３」は、受容体タンパク質ｈ−ＢＲＫ−３（配列番号１０）およびｍ− ＢＲＫ−３（ならびにこれらいずれもの可溶性フラグメントもしくは不完全なフ ラグメント）のことを、個々に、かつ総称して意味するものである。さらにこの 定義には、ＢＭＰ分子（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、および／またはＢＭＰ−７が 含まれるが、これらに限定しない）に結合すること、またはＢＭＰ分子が細胞に 結合することによって開始される生物学的シグナルを変換すること、またはＡｃ ｔＲＩＩＢ₂タンパク質もしくはＡｃｔＲＩＩＢ₂のタンパク質配列由来のペプチ ドに対して生じた抗体と交差反応すること、またはＢＭＰタイプＩ受容体との複 合体形成、またはＡｃｔＲＩＩＢ₂もしくはＢＭＰタイプＩ受容体のいずれかに 特異的な抗体を使用した場合におけるＢＭＰタイプＩ受容体と同時免疫沈降する ことが可能であるという生物学的活性を有する、同種のタンパク質が含まれる。 さらに、ｈ−ＢＲＫ−３およびｍ−ＢＲＫ−３（および上記の可溶性フラグメン トもしくは不完全なフラグメント）に実質的に類似するＢＭＰ受容体キナーゼタ ンパク質も含まれる。このような受容体タンパク質、これらのタンパク質をコー ドするＤＮＡ配列、および上記ＤＮＡを含む発現ベクターは、Ｒｏｓｅｎｂａｕ ｍにより米国特許出願第０８／４６２，４６７号に記述され権利主張がなされて おり、この内容を引用により本明細書中に取り入れる。 本明細書中で用いる「ＢＭＰタイプＩ受容体キナーゼ」は、ＢＭＰ−２、ＢＭ Ｐ−４、および／またはその他の既知のＢＭＰｓを結合することができるタンパ ク質であり、システインボックスおよび上流システインボックスを含む細胞外リ ガンド結合ドメイン、細胞内の膜近傍領域にあるＧＳドメインと呼ばれるＳＧＳ ＧＳＧモチーフ、ＴＧＦ−βスパーファミリー中の他のリガンドに対する他のタ イプＩ受容体と約８５％より高い類似性を有する細胞内キナーゼドメイン、およ び／または比較的短いカルボキシ末端を含むがこれらに限定されない、タイプＩ 受容体の配列の特徴を有する。さらに、本明細書中で用いる「ＢＭＰタイプＩ受 容体キナーゼ」には、Ｂ．Ｂ．Ｋｏｅｎｉｇ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４：５９６１−５９７４（ １９９４）；Ｌ．Ａｔｔｉｓａｎｏ、ｅｔ．ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅ ｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１２２２：７１−８０（１９９４）；Ｊ ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｌ．Ａｔｔｉｓａｎｏ、ａｎｄ Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ、Ｔ ｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４：１７２−１７８（１９９４ ）；およびｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ、ｅｔ．ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６９：１６９８５−１６９８８（１９９４）などの文献で 記述されている、ＢＭＰタイプＩ受容体の特徴を有する受容体タンパク質も含ま れる。 ＢＭＰタイプＩ受容体の例として、ＢＲＫ−１（Ｂ．Ｂ．Ｋｏｅｎｉｇ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 １４：５９６１−５９７４（１９９４））、そのラット同族体であるＢＭＰＲ− Ｉａ（Ｋ．Ｔａｋａｄａ、Ｓ．Ｏｉｄａ、Ｈ．Ｉｃｈｉｊｏ、Ｔ．Ｉｉｍｕｒａ 、Ｙ．Ｍａｒｕｏｋａ、Ｔ．Ａｍａｇａｓａ、ａｎｄ Ｓ．Ｓａｓａｋｉ、Ｂｉ ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎｉｃａ．、２０４：２０３ −２０９（１９９４））；ＰＲＫ−１とも称され（Ｓ．Ｓｕｍｉｔｏｍｏ、Ｔ． Ｓａｉｔｏ、ａｎｄ Ｔ．Ｎｏｈｎｏ、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、３：２９７ −３０２（１９９３））、ＡＬＫ−６のニワトリ同族体であると主張される（Ｐ ．ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ、Ｈ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ、Ｈ．Ｉｃｈｉｊｏ、Ｐ．Ｆｒ ａｎｚｅｎ、Ｍ．Ｌａｉｈｏ、Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ、ａｎｄ Ｃ．−Ｈ．Ｈｅ ｌｄｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６４：１０１−１０４（１９９４））ＢＲＫ−２ ；ＢＭＰ−７の受容体であることが示されたＡＬＫ−２（ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ ｅｔ．ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６９：１６ ９８５−１６９８８（１９９４））；ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４を結合し、中 胚葉誘導と関連のあるツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）ＢＭＰタイプＩ受容体（Ｊ ． Ｍ．Ｇｒａｆｆ、Ｒ．Ｓ．Ｔｈｉｅｓ、Ｊ．Ｊ．Ｓｏｎｇ、Ａ．Ｊ．Ｃｅｌｅｓ ｔｅ、ａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｍｅｌｔｏｎ、Ｃｅｌｌ、７９：１６９−１７９（１９ ９４））；およびＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４のショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏ ｐｈｉｌａ）同族体であるデカペンタ麻酔性（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ ）ペプチドを結合するショウジョウバエ由来のタイプＩ受容体が含まれるが、こ れらに限定されるものではない。これらのショウジョウバエ受容体は、２５Ｄ１ 、２５Ｄ２、および４３Ｅと呼ばれる（Ｔ．Ｘｉｅ、Ａ．Ｌ．Ｆｉｎｅｌｌｉ、 ａｎｄ Ｒ．Ｗ．Ｐａｄｇｅｔｔ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６３：１７５６−１７５ ９（１９９４）；Ａ．Ｐｅｎｔｏｎ、Ｙ．Ｃｈｅｎ、Ｋ．Ｓｔａｅｈｌｉｎｇ− Ｈａｍｐｔｏｎ、Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ、Ｌ．Ａｔｔｉｓｏｎｏ、Ｊ．Ｓｚｉｄｏ ｎｙａ、Ｊ．Ａ．Ｃａｓｓｉｌｌ、Ｊ．Ｍａｓｓｕｇｕｅ、ａｎｄ Ｆ．Ｍ．Ｈ ｏｆｆｍａｎｎ、Ｃｅｌｌ、７８：２３９−２５０（１９９４）；ａｎｄ Ｔ． Ｊ．Ｂｒｕｍｍｅｌ、Ｖ．Ｔｗｏｍｂｌｙ、Ｇ．Ｍａｒｑｅｓ、Ｊ．Ｌ．Ｗｒａ ｎａ、Ｓ．Ｊ．Ｎｅｗｆｉｅｌｄ、Ｌ．Ａｔｔｉｓａｎｏ、Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕ ｅ、Ｍ．Ｂ．Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ、ａｎｄ Ｗ．Ｍ．Ｇｅｌｂａｒｔ、Ｃｅｌｌ、 ７８：２５１−２６１（１９９４））。本発明に有用な好ましいＢＭＰタイプＩ 受容体には、配列番号１４（ＢＲＫ−１）、配列番号１６（ＢＲＫ−２）に実質 的に類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれるが、これらに限定さ れるものではない。 本明細書中で用いる「可溶性フラグメント」は、ＢＲＫ−１、ＢＲＫ−２また はＡｃｔＲＩＩＢ、好ましくはＡｃｔＲＩＩＢ₁またはＡｃｔＲＩＩＢ₂の細胞外 領域に相当するアミノ酸配列を意味し、ＢＭＰｓを結合することができる。可溶 性フラグメントには、予測される膜貫通領域の始点より前にある、受容体タンパ ク質の完全な細胞外ドメインが含まれる。 このようなＡｃｔＲＩＩＢ₂の可溶性フラグメントの例には、１〜１３４個の アミノ酸からなるアミノ酸配列を持つ配列番号４に実質的に類似するポリペプチ ドを含む。このようなＡｃｔＲＩＩＢ₂の可溶性フラグメントの例としては、配 列番号４と実質的に同等で１〜１３４個のアミノ酸の存在するアミノ酸配列を有 するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの例 から、相同性によってこれらの例の必須領域と非必須領域を決定することができ ることがわかる。 ＢＲＫ−１の可溶性フラグメントの例には、配列番号１４中の１〜１５３のア ミノ酸残基に実質的に類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれるが 、これらに限定されるものではない。 ＢＲＫ−２の可溶性フラグメントの例には、配列番号１６中の１〜１２６のア ミノ酸残基に実質的に類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれるが 、これらに限定されるものではない。 本明細書中で用いる「不完全な受容体キナーゼフラグメント」は、ＢＲＫ−１ 、ＢＲＫ−２、またはＡｃｔＲＩＩＢ、好ましくはＡｃｔＲＩＩＢ₁もしくはＡ ｃｔＲＩＩＢ₂の細胞外領域、膜貫通領域、および細胞内の膜近傍領域に相当す るアミノ酸配列を意味し、完全長の受容体と類似する方法でＢＭＰｓを結合する ことができるが、細胞内キナーゼドメイン（さもなければ、優性陰性受容体構築 体（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕ ｃｔ）として知られる）の欠失によってシグナル伝達を行うことができない。 このようなＡｃｔＲＩＩＢ₂の不完全な受容体フラグメントの例には、配列番 号４に実質的に類似するアミノ酸配列を有するポリペプチド（１〜１６１のアミ ノ酸が存在し、１６２〜１９１のアミノ酸が任意選択で存在するポリペプチド） 、配列番号２に実質的に類似するアミノ酸配列を有するポリペプチド（１〜１６ １のアミノ酸が存在し、１６２〜２１５のアミノ酸が任意選択で存在するポリペ プチド）が含まれるが、これらに限定されるものではない。 ＢＲＫ−１の不完全な受容体フラグメントの例には、配列番号１４に実質的に 類似するアミノ酸配列を有するポリペプチド（１〜１７７のアミノ酸が存在し、 １７８〜２２９のアミノ酸が任意選択で存在するポリペプチド）が含まれるが、 これらに限定されるものではない。 ＢＲＫ−２の不完全な受容体フラグメントの例には、配列番号１６に実質的に 類似するアミノ酸を有するポリペプチド（１〜１４９のアミノ酸が存在し、１５ ０〜１９９のアミノ酸が任意選択で存在するポリペプチド）が含まれるが、これ らに限定されるものではない。 本明細書中で用いる「ＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質複合体」は、ＢＭＰタ イプＩ受容体とＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質ＡｃｔＲＩＩＢ₂が組み合わさ れたものである。タイプＩおよびＡｃｔＲＩＩＢ₂受容体の組み合わせには、溶 液中でのタイプＩおよびＡｃｔＲＩＩＢ₂受容体（例えば可溶性フラグメントと して）の組み合わせ；固相支持体に結合された受容体（例えば可溶性フラグメン トとして）の組み合わせ；トランスフェクションした細胞の細胞膜内における受 容体（例えば完全長フラグメントまたは不完全なフラグメントとして）の組み合 わせが含まれるが、これらに限定されるものではない。 アミノ酸配列または核酸配列のいずれかを定義するのに用いられる場合の本明 細書中で用いる「実質的に類似する」とは、特定の対象配列、例えば突然変異誘 起によって変化した配列が、１つまたは複数の置換、欠失、または付加により対 照の配列とは異なっているが、その正味の効果はＡｃｔＲＩＩＢ₂タンパク質の 生物学的活性を保持していることを意味する。あるいは、遺伝子暗号の縮重の結 果、ＤＮＡ配列が対照のアミノ酸配列に実質的に類似するアミノ酸をコードして いるならば、その核酸配列およびアナログは本明細書中で開示された特異的なＤ ＮＡ配列に「実質的に類似」するものである。さらに、「実質的に類似する」と は、受容体タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＢ₂タンパク質またはＡｃｔＲＩＩＢ₂の タンパク質配列由来のペプチドに対して作製された抗体と反応する受容体タンパ ク質を意味する。 「同族体」とは、類似する機能を維持し、配列リストに列挙されているタンパ ク質と実質的に同じであるアミノ酸鎖を有するタンパク質である。しかしながら 、構造または機能を変化させない影響のない置換、例えばロイシンがイソロイシ ンになる疎水性アミノ酸から他の疎水性アミノ酸への置換、またはグルタミン酸 がアスパラギン酸になる酸性アミノ酸から他の酸性アミノ酸への置換は鎖内に生 じていてもよい。このようなタンパク質には、当該技術分野で理解されているよ うに、少なくとも９０％の相同性を有するすべてのタンパク質が含まれ、欠失お よび／または挿入またはそのフラグメントを有してもよい。例えば、ＤＮＡ配列 またはｃＤＮＡ配列から得られるペプチド配列に基づくとヒトタンパク質と９５ ％の相同性を有するラットタンパク質、および同様にして得られる、同じ機能と 類 似した相同性を有するウシタンパク質は、いずれも同族体と考えられる。このよ うに他の生物からクローニングされた相同のｃＤＮＡにより、相同のタンパク質 が得られる。 同様に、タンパク質は、アミノ酸配列のみに基づいて相同であるとみなしても よい。アミノ酸配列決定は実際的な限界により、例えばタンパク質の最初の５０ 個のアミノ酸を比較するによって、タンパク質が他のタンパク質と相同であるこ とを決定するであろう。したがって、相同タンパク質の最初の５０アミノ酸の鎖 中に５個の異なるアミノ酸がある場合は、９０％の相同性であるとされる。 さらに、ある種のタンパク質は、機能に重要で進化上保存された領域を有する ことが知られている。このような領域は、タンパク質相同性を与えうる。したが って、「同族体」という用語は、機能または構造の点から定義することができる 。この進化上の保存の証拠は、複合体を形成するタンパク質群に見られる。例え ば、ＴＧＦ−βスパーファミリーの構成員のタイプＩＩ受容体がある。ＣＯＳ細 胞で発現すると、このヒトタイプＩＩ受容体は、ＢＭＰ−４存在下でマウスＢＲ Ｋ−１またはニワトリＢＲＫ−２タイプＩＩ受容体のいずれとも異なるヘテロメ リックな複合体を形成することができる。今までに、マウスおよびヒトＢＭＰタ イプＩ受容体は、線虫のＤＡＦ−４タイプＩＩ受容体と複合体を形成すること（ Ｋｏｅｎｉｇ、Ｂ．Ｂ．、Ｃｏｏｋ、Ｊ．Ｓ．、Ｗｏｌｓｉｎｇ、Ｄ．Ｈ．、Ｔ ｉｎｇ、Ｊ．、Ｔｉｅｓｍａｎ、Ｊ．Ｐ．、Ｃｏｒｒｅａ、Ｐ．Ｅ．、Ｏｌｓｏ ｎ、Ｃ．Ａ．、Ｐｅｃｑｕｅｔ、Ａ．Ｌ．、Ｖｅｎｔｕｒａ．Ｆ．、Ｇｒａｎｔ 、Ｒ．Ａ．、Ｃｈｅｎ、Ｇ．−Ｘ．、Ｗｒａｎａ、Ｊ．、Ｌ．Ｍａｓｓａｇｕｅ 、Ｊ．、ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ、Ｊ．Ｓ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ ．、Ｖｏｌ．１４，ｐｐ．５９６１−５９７４（１９９４）；およびｔｅｎ Ｄ ｉｊｋｅ，Ｐ．、Ｙａｍａｓｈｉｔａ、Ｈ．、Ｓａｍｐａｔｈ、Ｔ．Ｋ．、Ｒｅ ｄｄｉ、Ａ．Ｈ．、Ｅｓｔｅｖｅｚ、Ｍ．、Ｒｉｄｄｌｅ、Ｄ．Ｌ．、Ｉｃｈｉ ｊｏ、Ｈ．、Ｈｅｌｄｉｎ、Ｃ．−Ｈ．、ａｎｄ Ｍｉｙａｚｏｎｏ、Ｋ．、Ｊ ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、Ｖｏｌ．２６９，ｐｐ．１６９８５−１６９８８（１ ９９４）を参照のこと）、マウスＢＭＰタイプＩ受容体ＢＭＰＲ−ＩＡ／ＴＦＲ ＩＩ／ＢＲＫ−１の優性陰性受容体構築体は、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕ ｓ）胚の腹面の割球中で発現された場合、背面−腹面のパターン形成（ｐａｔｔ ｅｒｉｎｇ）を変化させること（Ｓｕｚｕｋｉ，Ａ．、Ｔｈｉｅｓ、Ｒ．Ｓ．、 Ｙａｍａｊｉ、Ｎ．、Ｓｏｎｇ、Ｊ．Ｊ．、Ｗｏｒｚｎｅｙ、Ｊ．Ｍ．、Ｍｕｒ ａｋａｍｉ．、Ｋ．、ａｎｄ Ｕｅｎｏ、Ｎ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、Ｖｏｌ．９１，ｐｐ．１０２５５−１０２５９（１９ ９４）を参照のこと）、ニワトリＢＭＰに関連があるリガンドであるドルサリン −１（ｄｏｒｓａｌｉｎ−１）は、マウス骨髄間質細胞中でアルカリフォスファ ターゼ活性を誘導すること（Ｂａｓｌｅｒ、Ｋ．、Ｅｄｌｕｎｄ、Ｔ．、Ｊｅｓ ｓｅｌｌ、Ｔ．Ｍ．、ａｎｄ Ｙａｍａｄａ．Ｔ．Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌ．７３、ｐ ｐ．６８７−７０２（１９９３）を参照のこと）、およびショウジョウバエ（Ｄ ｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７同族体であるＤｐｐおよび６ ０Ａはラットにおいて異所性骨形成を誘導すること（Ｓａｍｐａｔｈ、Ｔ．Ｋ． 、Ｒａｓｈｋａ、Ｋ．Ｅ．、Ｄｏｃｔｏｒ、Ｊ．Ｓ．、Ｔｕｃｋｅｒ、Ｒ．Ｆ． 、ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎｎ、Ｆ．Ｍ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、Ｖｏｌ．９０，ｐｐ．６００４−６００８（１９９３）を参 照のこと）が示されている。このファミリーのタンパク質の間の配列の保存の程 度が高いならば、本明細書中で前述した、タイプＩ−タイプＩＩ受容体複合体の 異なる結合特性（Ｔ．Ｎｏｈｎｏ、Ｔ．Ｉｓｈｉｋａｗａ、Ｔ．Ｓａｉｔｏ、Ｋ ．Ｈｏｓｏｋａｗａ、Ｓ．Ｎｏｊｉ、Ｄ．Ｈ．Ｗｏｌｓｉｎｇ、ａｎｄ Ｊ．Ｓ ．Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７ ０：２２５２２−２２５２６（１９９５））が観察されたことは、タイプＩ受容 体の種差によるものであることは考えにくく、むしろ個々のタイプＩ：タイプＩ Ｉ受容体複合体の独特の性質によるものである。これらの相同なタンパク質は、 線虫類、ニワトリ、カエル、または哺乳類に由来するものであろろうと、すべて 本発明中に企図している。単に対立したまたは異種間の変化は、そのような変化 を区別するのに充分なほど重要でないと思われる。いずれの理論にも拘泥しない ならば、下記の異なる結合特性は、リガンド結合の際の受容体複合体の異なるシ グナル伝達能力をもっともよく反映しているようである（Ｃａｒｃａｍｏ、Ｊ． 、Ｗｅｉｓ、Ｆ．Ｍ．Ｂ．、Ｖｅｎｔｕｒａ、Ｆ．、Ｗｉｅｓｅｒ、Ｒ．、ｗｒ ａｎａ、 Ｊ．Ｌ．、Ａｔｔｉｓａｎｏ、Ｌ．、ａｎｄ Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｊ．、Ｍｏｌ ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１４，ｐｐ．３８１０−３８２１（１９９４ ）を参照のこと）。 当業者ならば、遺伝子暗号の縮重によって、異なるＤＮＡ配列から同じ転写物 、したがって同じペプチドが生成することを理解しているであろう。同じペプチ ドをコードするが、基となるＤＮＡとは異なるＤＮＡ配列を調製するある種の場 合には、 −−−シークエンスまたは合成を容易にすること、 −−−タンパク質の発現を増加させること、および −−−ある種の異種宿主はある種のコドンを他よりも好むこと を考慮に入れる。 これらの実際的な考察は周知であり、本発明の使用者に有益となる実施態様を 提供する。したがって、基となるＤＮＡ、または本明細書中の配列番号リストに 列挙されたＤＮＡ，または引用により取り入れるＤＮＡは、本発明における唯一 の実施形態または意図するＤＮＡではないことが明らかに企図されているもので ある。 本明細書中で用いる「生物学的活性」とは、特定の分子が、本明細書中で開示 された本発明の実施態様に対して充分なアミノ酸配列類似性を有し、検出可能な 量のＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−４を結合すること、または例えばハイブリッド 受容体構築体の成分としてＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−４の刺激を細胞に伝達す るができることを意味している。好ましくは、本発明の範囲に属する生物学的に 活性なＢＭＰタイプＩ受容体：ＡｃｔＲＩＩＢ₂受容体複合体は、ナノモルまた はナノモルより小さいの親和力（Ｋ_dは約１０^-9Ｍに等しい）で［¹²⁵Ｉ］−ＢＭ Ｐ−４を結合することができる受容体タンパク質キナーゼ複合体を意味する。そ の親和力は約１×１０^-10Ｍから１×１０^-9Ｍであって、結合部位では１０^-9Ｍ より低いＫ_dを示すことと比例することが好ましい。 本明細書中で用いる「シグナル」または「シグナル伝達」とは、小さな分子や ペプチドなどを含む分子の結合に関係することが好ましいある細胞外刺激によっ て生じる生物学的反応を意味し、この生物学的反応は機器の感度が十分で正確な パラメーターが測定されるならば検出可能である。シグナル伝達の例としては、 酵素のアゴニズムまたはアンタゴニズムや、生化学的カスケードの誘発または阻 害などがある。 本明細書中で用いる「操作可能に結合した」とは、直鎖ＤＮＡ配列の部分が、 同じ直鎖ＤＮＡ配列の他の部分の活性に影響を与えることができる状態をいう。 例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡがポリペプチドに関するＤ ＮＡに操作可能に結合されているのは、該シグナルペプチドのＤＮＡが該ポリペ プチドの分泌に関与する前駆体として発現する場合であり；プロモーターがコー ド配列に操作可能に結合されているのは、該プロモーターが該コード配列の転写 を制御する場合であり；またはリボソーム結合部位がコード配列に操作可能に結 合されているのは、該リボソーム結合部位が翻訳を可能とするように位置してい る場合である。一般に、操作可能に結合されるとは、近接していることを意味し 、分泌リーダーの場合にはリーディングフレーム中で近接していることを意味す る。当業者ならば、ＤＮＡを細胞にトランスフェクションするにせよ位置指定突 然変異を行うにせよＤＮＡの特定の使用またはその他の使用次第で、ＤＮＡ配列 がどのように用いられるかが決まったり、ＤＮＡ配列がどのように操作可能に結 合されるかが決まったりすることは、理解しているだろう。このことは、当業者 の決定能力範囲内である。 本明細書中で用いる「ＡＴＣＣ］は、米国メリーランド州ロックビルのアメリ カンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を意味する。 本明細書中で用いる「骨形態形成タンパク質２」または「ＢＭＰ−２」は、Ａ ＴＣＣ Ｎｏ．４０３４５に含まれるＤＮＡ配列によってコードされるペプチド を意味する（ＡＴＣＣ／ＮＩＨ ＲＥＰＯＳＩＴＯＲＹ ＣＡＴＡＬＯＧＵＥＯ Ｆ ＨＵＭＡＮ ＡＮＤ ＭＯＵＳＥ ＤＮＡ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＬＩＢ ＲＡＲＩＥＳ、６版、１９９２、５７ページを参照のこと。以下「ＡＴＣＣ／Ｎ ＩＨ レポジトリカタログ」とする）。ＢＭＰ−２の単離は、Ｗａｎｇ、Ｗｏｚ ｎｅｙおよびＲｏｓｅｎによる米国特許第５，０１３，６４９号（１９９１年５ 月７日発行）、Ｗａｎｇ、Ｗｏｒｚｎｅｙ、およびＲｏｓｅｎによる米国特許 第５，１６６，０５８号（１９９２年１１月２４日発行）、およびＨａｍｍｏｎ ｄｓおよびＭａｓｏｎによる米国特許第５，１６８，０５０号（１９９２年１２ 月１日発行）に開示されており、それぞれ内容を引用することにより本明細書中 に取り入れる。 本明細書中で用いる「骨形態形成タンパク質４」または「ＢＭＰ−４」は、Ａ ＴＣＣ Ｎｏ．４０３４２（ＡＴＣＣ／ＮＩＨ レポジトリカタログを参照のこ と）に含まれるＤＮＡ配列によってコードされるペプチドを意味する。ＢＭＰ− ４の単離は、Ｗａｎｇ、ＷｏｚｎｅｙおよびＲｏｓｅｎによる米国特許第５，０ １３，６４９号（１９９１年５月７日発行）に開示されており、その内容を引用 することにより本明細書中に取り入れる。 本明細書中で用いる「骨形態形成タンパク質７」または「ＢＭＰ−７」は、Ａ ＴＣＣ Ｎｏ．６８０２０およびＡＴＴ ６８１８２（ＡＴＣＣ／ＮＩＨ レポ ジトリカタログを参照のこと）に含まれるＤＮＡ配列によってコードされるペプ チドを意味し、ＡＴＣＣ ６８１８２の中のｃＤＮＡはＢＭＰ−７タンパク質を コードするのに必要な核酸配列の全てを含むものとして権利主張がなされている 。ＢＭＰ−７の単離は、Ｒｏｓｅｎ、ｅｔ．ａｌ．による米国特許第５，１４１ ，９０５号（１９９２年８月２５日発行）に開示されており、その内容を引用す ることにより本明細書中に取り入れる。 本明細書中で用いる「ＤＮＡ配列」は、分離したフラグメントの形態のＤＮＡ ポリマー、またはより大きなＤＮＡ構築物の構成要素としてのＤＮＡポリマーで あって、実質的に純粋な形態で、すなわち内因性物質を不純とせず、該配列およ びその構成核酸配列を同定し、操作し、および回収することを可能とする量また は濃度で、標準的な生化学的方法により、例えばクローニングベクターを用いて 、少なくとも一度は単離されたＤＮＡに由来するものを意味する。このような配 列は、真核細胞の遺伝子に一般的に存在する内部非翻訳配列（イントロン）によ って中断されていないオープン−ディングフレームの形態で提供されることが好 ましい。関連する配列を含むゲノムＤＮＡも用いることができる。非翻訳ＤＮＡ の配列は、オープン−ディングフレームから５’または３’側に存在することが でき、コード領域の操作または発現を妨害しない場所にある。本発明によって提 供 されるタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡフラグメントと短いオリ ゴヌクレオチドリンカーとから、または一連のオリゴヌクレオチドから組み立て て、組換え転写ユニットにおいて発現することができる合成遺伝子を提供するこ とができる。 本明細書中で用いる「組換え」とは、タンパク質が、インビトロで操作されて 宿主生物に導入されるＤＮＡ配列に由来することを意味する。このような生物は 、本来タンパク質を生産してもよいし、初めからタンパク質を生産する機構が欠 けていてもよい。宿主生物は、通常の状態でタンパク質を生産しないことが好ま しく、したがって「異種の（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）宿主」であることが好 ましい。 組換えタンパク質は、細菌、真菌（例えば酵母）、または昆虫の発現系によっ て作られる。 本明細書中で用いる「組換え体発現ベクター」は、所望のタンパク質（例えば 、ＡｃｔＲＩＩＢ₂）をコードするＤＮＡを発現するために使用されるＤＮＡ構 築物であって、１）プロモーターおよび／またはエンハンサーなど、遺伝子発現 で調節の役割を有する遺伝子要素、２）ｍＲＮＡに転写され、そしてタンパク質 に翻訳される、構造配列またはコード配列、ならびに３）適当な転写および翻訳 の開始配列および終止配列の集合体を含む転写サブユニットを含むＤＮＡ構築物 を意味する。当技術分野で周知の方法を用いて、本発明の組換え発現ベクターを 構築することができる。本発明において適用可能なベクターには、哺乳類動物の 細胞については、ｐＪＴ４またはｐＪＴ６（後述する）、ｐｃＤＮＡ−１（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カルフォルニア州サンディエゴ）およびｐＳＶ−ＳＰＯＲ Ｔ１（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）；昆 虫の細胞については、ｐＢｌｕｅＢａｃ ＩＩＩまたはｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ バキュロウイルスベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カルフォルニア州サンデ ィエゴ）；および細菌細胞については、（Ｎｏｖａｇｅｎ社、ウィスコンシン州 マディソン）が含まれるが、これらには限られない。本発明のＡｃｔＲＩＩＢ₂ タンパク質受容体キナーゼをコードするＤＮＡ配列は、調節要素に操作可能に結 合したベクター中に存在することができる。 本発明は、ＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質ＡｃｔＲＩＩＢ₂をコードするＤ ＮＡ配列を含む発現ベクターと、ＢＭＰタイプＩ受容体キナーゼタンパク質をコ ードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターとを、同時トランスフェクションした宿 主細胞に関するものである。１つの実施形態において、マウスＡｃｔＲＩＩＢ₂ タンパク質の発現ベクターは、マウスＡｃｔＲＩＩＢ₂受容体タンパク質をコー ドするＤＮＡ配列、またはその可溶性フラグメントもしくは不完全なフラグメン トを含む（ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであることができる）。マウ スＡｃｔＲＩＩＢ₂タンパク質は、核酸配列の配列番号３によってコードされる ことが好ましい。 本発明の好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞には、プラスミド構築 物ｐＪＴ６−ｍＡｃｔＲＩＩＢ₂およびプラスミド構築物ｐＪＴ４−Ｊ１５９Ｆ （ＢＲＫ−１用）またはプラスミド構築物ｐＪＴ３−ＢＲＫ−２（ＢＲＫ−２用 ）を同時トランスフェクションするので、それぞれｍＡｃｔＲＩＩＢ₂とＢＲＫ −１、またはｍＡｃｔＲＩＩＢ₂とＢＲＫ−２の同時発現がおこる。組換え分子 によるトランスフェクションは、当技術分野での周知方法を用いて行うことがで きる。 本明細書中で用いる「宿主細胞」とは、本明細書中に記載された組換え発現ベ クターを含む細胞を意味する。宿主細胞を、組換え発現プラスミド内で安定的に トランスフェクションさせてもよいし一過性トランスフェクションさせてもよく 、あるいは組換えウイルスベクターによって感染させてもよい。宿主細胞には、 大腸菌、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの真 菌系、Ｓｆ−９やＳｆ−２１などの昆虫由来の永久細胞系、およびチャイニーズ ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）やＳＶ４０によって形質転換されたアフリカミド リザル腎臓細胞（ＣＯＳ）などの永久的哺乳類細胞系が含まれるが、これらに限 定されない。 １つの実施形態において、本発明は、ＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質に結合 することのできる化合物を同定するのに有用な方法に関するものである。別の実 施形態において、本発明は臨床試料中のＢＭＰ受容体リガンド（例、ＢＭＰ−２ 、ＢＭＰ−４、またはＢＭＰ−７、または今までに既に同定された別のＢＭＰ受 容 体リガンド）の濃度を測定するのに有用な方法に関するものである。これらのい ずれの方法においても、推定リガンドまたは既知リガンドを含む試料をＢＭＰ受 容体キナーゼタンパク質複合体に引き合わせる。この場合、該受容体複合体は、 ＢＭＰタイプＩ受容体キナーゼタンパク質とＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質Ａ ｃｔＲＩＩＢ₂とから成る。ＡｃｔＲＩＩＢ₂受容体キナーゼタンパク質は、アミ ノ酸配列番号４のアミノ酸配列、またはその可溶性フラグメントもしくは不完全 なフラグメントを有するｍ−ＡｃｔＲＩＩＢ₂であることが好ましい。例えば、 試料中のＢＭＰ濃度は、放射性受容体アッセイによって測定することができ、こ のアッセイでは試料中の未標識ＢＭＰは、ＡｃｔＲＩＩＢ₂＋ＢＭＰタイプＩ受 容体複合体への結合に対して、標識トレーサー（ｔｒａｃｅｒ）ＢＭＰと競合す る。試料中のＢＭＰの量が増加すると、ＡｃｔＲＩＩＢ₂およびタイプＩ受容体 を含む受容体タンパク質複合体に結合できる標識ＢＭＰの量が減少する。未標識 ＢＭＰの既知濃度を用いて調製された標準曲線と比較することによって、試料中 のＢＭＰ濃度の正確な定量が可能となる。トレーサーＢＭＰの標識は、［¹²⁵Ｉ ］ＮａＩでヨウ化処理することにより行われることが好ましい。 ＡｃｔＲＩＩＢ₂は、ＢＭＰタイプＩ受容体キナーゼをも発現する安定した細 胞系の外膜で発現することができるし、あるいは可溶性タイプＩ受容体フラグメ ントと共に溶液中で可溶性フラグメントとして供給するか、固相支持体に共有結 合したタイプＩ受容体と共に固相支持体に共有結合した可溶性のフラグメントと して供給することができる。アッセイを行うために、試料由来の未標識ＢＭＰお よび標識されたトレーサーＢＭＰは、平衡に達するまで、受容体への結合におい て競合する。次いで、受容体−ＢＭＰ複合体を、例えば、洗浄することにより（ 付着細胞系の場合）、急速の濾過または遠心分離することにより（非付着細胞系 または固体支持体に結合された受容体の場合）、または抗体、ポリエチレングリ コール、もしくは他の沈殿剤によって受容体−リガンド複合体を沈殿させ、続い て濾過または遠心分離することにより（可溶性受容体の場合）、遊離リガンドか ら単離する。次いで、複合体中の標識ＢＭＰの量を典型的にはガンマ線計数によ って定量して、既知の標準値と比較する。これらの方法は、他の受容体を用いた 文献に記載されており（Ｍ．Ｗｉｌｌｉａｍ、Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．、１ １：１４７−１８４（１９９１）；Ｍ．Ｈｉｇｕｃｈｉ ａｎｄ Ｂ．Ｂ．Ａｇ ｇａｒｗａｌ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０４：５３−５８（１９９２） ；Ｍ．Ｊ．Ｃａｉｎ，Ｒ．Ｋ．Ｇａｒｌｉｃｋ ａｎｄ Ｐ．Ｍ．Ｓｗｅｅｔｍ ａｎ、Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍ．、１７：Ｓ１５０−Ｓ１５１（ １９９１）；各文献を引用により本明細書中に取り入れる）、本発明のＢＭＰタ イプＩ受容体：ＡｃｔＲＩＩＢ₂受容体／ＢＭＰ系に容易に適用される。このよ うな放射性受容体アッセイは、定量を必要とする臨床試料中のＢＭＰの定量用の 診断目的に用いることができる。 本発明の方法は、タイプＩ受容体キナーゼタンパク質と複合体を形成するＡｃ ｔＲＩＩＢ₂、あるいは相同な受容体タンパク質を結合することのできる化合物 を同定する高処理量スクリーニングにも有用である。この方法では、ＡｃｔＲＩ ＩＢ₂／タイプＩ複合体に対する化合物の親和性が高いほど、複合体への結合に 対してトレーサーとの競合がより効果的になり、受容体−リガンド複合体の計数 がより低くなる。この場合、同一濃度範囲内の一連の化合物について比較して、 どれが最も高い親和性で受容体に対して競合して結合するかを確かめる。 本発明は、既知の薬物または推定の薬物などのリガンドが、本発明のＤＮＡ分 子によってコードされた受容体に結合することができるかおよび／または該受容 体を活性化することができるかを測定するのに有用である。上記ＤＮＡ配列を、 本明細書に記述した細胞系にトランスフェクションして、単離されたＤＮＡ分子 によってコードされた受容体複合体に結合するおよび／または該受容体を活性化 するリガンドの能力のアッセイ系を提供する。本明細書に記述した組換え細胞系 は、既知の薬物または候補となる薬物と、受容体に結合し、放射活性試薬、分光 学的試薬、または他の試薬によって標識されるリガンドとの間の競合結合アッセ イ用の生細胞培養物として有用である。トランスフェクションした細胞から単離 された受容体を含む膜試料も、競合結合アッセイに有用である。受容体のリガン ド結合ドメイン由来の可溶性受容体も、候補薬剤の高処理量スクリーニングに用 いる。細胞内シグナル伝達の機能的アッセイは、受容体機能の活性化において結 合親和性および有効性のアッセイとしての役割をする。さらに、組換え体細胞系 を修飾してレポーター遺伝子を入れてもよく、このレポーター遺伝子は、受容体 によって送られたシグナルがレポーター遺伝子をスイッチオンするように、反応 要素に操作可能に結合する。このような系は、特にレポーターアゴニストの同定 を目的とした高処理量スクリーニングに有用である。これらの組換え体細胞系は 、「薬物発見系（ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）」を構築し、 薬物開発にとって可能性のある天然化合物または合成化合物の同定に有用である 。このような同定された化合物を、さらに修飾して、または直接治療用化合物と して用いて、単離されたＤＮＡ分子によってコードされた受容体の本来の機能を 活性化したり、阻害したりすることができよう。 本発明の可溶性受容体タンパク質複合体は、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下注 射、移植または経皮モードなどの投与方法を用いた臨床環境において、投与する ことができる。このような投与によってＢＭＰｓの活性を治療的に変化させるこ とが期待される。 配列番号３および配列番号７は、それぞれｍ−ＡｃｔＲＩＩＢ₂およびＡｃｔ ＲＩＩＢ₄受容体タンパク質をコードするＤＮＡ配列を表しており、マウスの毛 ／皮膚試料から単離された。これらの配列は、ヒト、ラット、ウサギ、ショウジ ョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）およびアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ）を含む（以下に限定されない）他の種から、ＡｃｔＲＩＩＢ₂またはＡｃｔＲ ＩＩＢ₄のｃＤＮＡを得るために容易に利用できる。 さらに本発明は、試験化合物がＢＭＰ受容体タンパク質複合体への結合でシグ ナルを発生するかどうかを測定する方法に関するものである。このような方法で は、転写レポーターアッセイにおいてＢＭＰ受容体タンパク質複合体を用いる。 試験化合物がＢＭＰ受容体タンパク質複合体への結合でシグナルを発生するかど うかを測定する方法は、（ａ）ＢＭＰ受容体タンパク質複合体発現細胞に３ＴＰ −Ｌｕｘルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ、Ｌ．Ａｔｔｉ ｓａｎｏ、Ｊ．Ｃａｒｃａｍｏ、Ａ．Ｚｅｎｔｅｌｌａ、Ｊ．Ｄｏｏｄｙ、Ｍ． Ｌａｉｈｏ、Ｘ．−Ｆ．Ｗａｎｇ、ａｎｄ Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｃｅｌｌ ７１：１００３−１０１４（１９９２））とβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をトラ ンスフェクションことと（この細胞には、ＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質Ａｃ ｔＲＩＩＢ₁またはＡｃｔＲＩＩＢ₂をコードするＤＮＡ配列とＢＭＰタイプＩ受 容体キナーゼタンパク質をコードするＤＮＡ配列がトランスフェクションされて いる）；（ｂ）（ｉ）試験化合物存在下で第１組の該細胞を培養することと、（ ｉｉ）試験化合物非存在下で第２組の該細胞を培養することと；（ｃ）工程（ｂ ）によって生成したレポーター構築物の刺激により得られたルシフェラーゼの活 性化によるルシフェラーゼ活性レベルを任意の光単位によって定量することと； および（ｄ）（ｃ）によって定量された第１組の任意光単位の量を工程（ｃ）に よって定量された第２組の任意光単位の量と比較することとを含む。 さらに、上記と同じアッセイ法をオートラジオグラフィーを用いて行う。試験 化合物がＢＭＰ受容体部分複合体の結合においてシグナルを発生するかどうかを 測定する方法は、（ａ）ＢＭＰ受容体タンパク質複合体発現細胞を³²Ｐで標識す ることと（この細胞には、ＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質ＡｃｔＲＩＩＢ₁ま たはＡｃｔＲＩＩＢ₂をコードするＤＮＡ配列と、ＢＭＰタイプＩ受容体キナー ゼタンパク質をコードするＤＮＡ配列がトランスフェクションされている）；（ ｂ）（ｉ）試験化合物の存在下で第１組の該細胞を培養することと、（ｉｉ）試 験化合物非存在下で細胞の第２組の該細胞を培養することと；（ｃ）工程（ｂ） によって生成したリン酸化タンパク質をオートラジオグラフィーより定量するこ とと；（ｄ）工程（ｃ）によって定量された細胞の第１組のリン酸化タンパク質 の量を、工程（ｃ）によって定量された細胞の第２組のリン酸化タンパク質の量 と比較することとを含むことが、当業者に明らかになるであろう。 本発明の好ましい実施形態を例示することを目的として、以下に非限定的な実 施例を詳細に述べる。実施例１ マウスＡｃｔＲＩＩＢ₂およびＢ₄の単離 知られた受容体型セリン／トレオニンキナーゼのキナーゼドメインＩＩ（ＪＴ ６５）およびキナーゼドメインＶＩＩＩ（ＪＴ６９）内に保持されているタンパ ク質配列由来の縮重プライマーＪＴ６５（配列番号１７）およびＪＴ６９（配列 番号１８）から、ＰＣＲプローブが生成される。このプローブは、ｐＢＬＵＥＳ ＣＲＩＰＴベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）内でサ ブクローン化されてｐＢＳ２−５４が得られ、ＮＩＨ３Ｔ３ライブラリーに対す るスクリーニングに使用された。このことは、本明細書で援用したＲｏｓｅｎｂ ａｕｍによる米国特許出願第０８／４６２，４６７号に既に記述されている。約 ２．３ｋｂのＡｃｔＲＩＩＢを含む、部分ＡｃｔＲＩＩＢクローン（３８−４− ２）を単離する。 完全長のＡｃｔＲＩＩＢのマウス同族体を単離するために、マウス毛／皮膚組 織（Ｅ８２種、剃毛後２日目のもの）からＣＤＮＡライブラリーを構築する。全 ＲＮＡは、全ＲＮＡ分離キット（Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｋ ｉｔ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いて細胞から単離す る。メッセンジャーＲＮＡ（６．３μｇ）は、ｍＲＮＡ分離キット（ｍＲＮＡＳ ｅｐａｒａｔｏｒ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を 用いて全ＲＮＡから単離する。ｍＲＮＡ（２μｇ）の一定量を用いて、ｃＤＮＡ 合成およびプラスミドクローニング用スーパースクリプトプラスミドシステム（ ＳＵＰＥＲ ＳＣＲＩＰＴ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用い、かつ製 造元の取扱説明書に従ってｃＤＮＡライブラリーを作る。得られたライブラリー は約５００，０００個のプライマーコロニーを含み、それぞれが７，０００個の コロニーを持つ７２個のプールに分けられる。 ＰＣＲによって、ライブラリーの初回スクリーニングを行う。鋳型として用い るプラスミドを、ＱＩＡＧＥＮカラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、 ＣＡ）を用いて７２個のプールそれぞれから精製する。既に記述された通りに（ Ｔｓｕｎｇ−Ｃｈｉｅｈ、Ｊ．Ｗｕ、Ｍ．Ｈ．Ｊｉｈ、Ｌ．Ｗａｎｇ、ａｎｄ Ｙ．−Ｊ．Ｙ．Ｗａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎ ｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３８：９−１５（１９９４））、全てのＡｃｔＲ ＩＩＢアイソフォームを増幅するために計画されたプライマーによるＰＣＲでポ シティブプールを同定する。これらのプライマーは本明細書で提供されたもので 、ＡｃｔＲＩＩＢＴＦ（配列番号１９）およびＡｃｔＲＩＩＢＴＲ（配列番号２ ０）とする。ＰＣＲ反応は、ＧＥＮＥ−ＡＭＰ ＰＣＲ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ Ａ ＭＰＬＩＴＡＱ ＤＮＡ Ｐｏｌｉｍｅｒａｓｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、 Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用 いて行った。９４℃、５分間で最初の溶解反応を行った後、以下のプログラムを ３０回繰り返した。すなわち、該プログラムは、９４℃で１分間の溶解、５５℃ で１分間のアニーリング、および７２℃で１分間の伸長からなる。 ２次スクリーニングでは、プレートを５つのポシティブプール（２、０００コ ロニー／プレート）由来の大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）株で画線する。このプレート 上にＨＹＢＯＮＤナイロン膜を置いて、細菌のコロニーをフィルターに移す。次 に、コロニーを３７℃で２〜３時間回復させる。フィルターを１０％ＳＤＳに３ 分間浸して、次に１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ ＮａＯＨに５分間トランスフ ァーし、１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５で５分間中和し 、さらに３ＸＳＳＣで洗浄する。次にタンパク質を除去するために、ブロットを 、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣ ｌ、０．０２％ＳＤＳ中で５０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Ｂｏｅｈｒｉｎ ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）と共に５５℃で １時間振盪する。ＮＩＨ３Ｔ３ライブラリー（クローン３８−４−２）から単離 されたマウスＡｃｔＲＩＩＢ 部分ｃＤＮＡをＭｌｕで切断し、２．３ｋｂのフ ラグメントを得る。このフラグメントを、ＰＲＩＭＥ−ＩＴ ＩＩランダムプラ イマーラベリングキット（ＰＲＩＭＥ−ＩＴ ＩＩ Ｒａｍｄｏｍ Ｐｒｉｍｅ ｒ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ；Ｓｔａｒａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ；ＤＮＡのランダムプライマー標識用キットで、クレノウＤＮＡポリメラーゼ、 プライマー、および緩衝液を含む）で、かつ特異活性３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌを 有するα−［³²Ｐ］−ｄＣＴＰ（ＮＥＮ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ 、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いて、ランダムに標識する。標識プローブをハイブ リダイゼーション緩衝液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉ、ＭＯ）中で４２℃で１ ８時間フィルターにハイブリダイズさせる。該緩衝液は、５０％脱イオン化ホル ムアミド、５ＸＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥ＝０．１４Ｍ ＮａＣｌ、８ｍＭリン酸 ナトリウム、０．０８ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．７）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ ｓ溶液、および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精巣ＤＮＡからなる。次にブ ロットを、０．２５×ＳＳＰＥ、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で ２５℃で１５分間にて２回、次に６５℃で３０分間にて２回洗浄する。次に、ブ ロットをコダックＸ−ＯＭＡＴ ＡＲオートラジオグラフィフィルムに−８０℃ で１８時間露光する。 オートラジオフラフィ上の標識スポットに対応するコロニーをプレート上に画 線して、上記の２次スクリーニングで述べた通りにして３次スクリーニングを行 う。３個のポシティブクローンが単離される。 ３個のポシティブクローン由来の挿入をＴＡＱ ＤＹＥ ＤＥＯＸＹ Ｔｅｒ ｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＫｉｔおよびＡｐｐｌｉ ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ３７３Ａ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｄ ＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて決定した。配列を比較してみると、クローン Ａ４６−３／ｐＳＰＯＲＴは、ＡｃｔＲＩＩＢ₄変異体の完全なコードを含む一 方、クローンＡ４９−８／ｐＳＰＯＲＴは、ＡｃｔＲＩＩＢ₂変異体と、コード 領域の最初から約５０塩基対がアラインしている（下記の実施例２を参照のこと ）。 実施例２ ＡｃｔＲＩＩＢ₂およびＡｃｔＲＩＩＢ₄の配列分析 約５０ｂｐまでのコード領域が欠失している、Ａ４９−８／ｐＳＰＯＲＴクロ ーンのＡｃｔＲＩＩＢ₂のＤＮＡ配列（以下の実施例３で記述した通りにしてｐ ＪＴ６発現ベクター内にアセンブルする）を配列番号３に示し、その推定される タンパク質配列を配列番号４に示す。この配列は、ＧＥＮＥＢＡＮＫにリストさ れている登録番号Ｍ８４１２９のマウスＡｃｔＲＩＩＢ₂配列と同一であり、公 表されているＡｃｔＲＩＩＢ配列のＡＴＧ（４４塩基）に始まる約９００塩基、 および３’末端配列（１４９０〜１７０８塩基）を有することがＣｅｌｌ ６８ ：９７−１０８（１９９２）に記述されている。ＡｃｔＲＩＩＢ₂については、 ＡＴＧ（４４塩基）から９００塩基までの配列と、３’末端の配列（１４６０〜 １７０８）を確定した。この配列データから、第１の挿入（ｂｐ４１３〜４３６ ）を含み、ＡｃｔＲＩＩＢ₂変異体であることが立証される。 ＡｃｔＲＩＩＢ₄変異体は、配列番号７に示されたＡ４６−３／ｐＳＰＯＲＴ のＤＮＡ配列および配列番号８に示されたタンパク質配列によって示唆される挿 入を含まない。ＡｃｔＲＩＩＢ₄については、単離されたクローンは完全長で、 さらに知られていない５’配列の約３００塩基からｂｐ４４のＡＴＧまでを含む 。 実施例３ ｍ−ＢＲＫ−３、ＢＲＫ−１、ＢＲＫ−２、ＡｃｔＲＩＩＢ₂およびＡｃｔＲＩ ＩＢ₄のための発現ベクターの構築 ｐＪＴ４発現ベクターについては、Ｒｏｓｅｎｂａｕｍによって米国特許出願 第０８／４６２，４６７号に既に記述されており、この明細書に援用した。この 発現ベクターは、ＣＯＳ細胞内で一過性発現するように最適化されており、非常 に効率的なメッセージの転写を行わせるサイトメガロウイルスの初期プロモータ ーとエンハンサー；発現レベルを一層高めるヒトＴ−細胞白血病ウイルス−１の 長鎖末端反復配列由来の「Ｒ」因子；メッセージの安定性を高めると考えられて いるＳＶ４０由来のイントロンスプライシング部位；マルチプルクローニングサ イト；ほとんどの真核ｍＲＮＡに必要とされるｐｏｌｙＡテイルをメッセージに 加えるよう命令するＳＶ４０由来ポリアデニル化シグナル；およびＳＶ４０ラー ジＴ抗原を含む細胞、例えばＣＯＳ細胞に非常に多くのコピー数でプラスミドを 複製させるＳＶ４０複製開始点を含む。さらに、細菌中でのベクターの操作およ び増幅のために、このベクターは大腸菌複製起点およびアンビシリン耐性遺伝子 を含んでいる。本明細書で記述した発現ベクターは、ｐＪＴ４発現ベクターの誘 導体で、以下に記述する。 哺乳動物で発現させるために、ｍ−ＡｃｔＲＩＩＢ₄を哺乳動物発現ベクター ｐＪＴ６にサブクローン化する。このベクターはｐＪＴ３の誘導体であり、ｐＪ ＴについてはＲｏｓｅｎｂａｕｍによって米国特許出願第０８／４６２，４６７ 号に記述されていて、この明細書で援用しており（実施例４を参照のこと）、マ ルチプルクローニングサイトの５’末端にあるＮｏｔＩが欠失しており、マルチ プルクローニングサイトのＰＳｔＩとＢａｍＨＩ制限部位の間にスペーサーが挿 入されている。サブクローニングを行うために、ｍ−ＡｃｔＲＩＩＢ₄ｃＤＮＡ をＮｏｔＩおよびＳａｌＩを用いてＡ４６−３／ｐＳＰＯＲＴから切り出し、次 にＮｏｔＩおよびＳａ１Ｉ部位でｐＪＴ６にサブクローンし、ｐＪＴ−Ａ４６Ｌ を構築した。 マウスＡｃｔＲＩＩＢ₂変異体の完全長のクローンをｐＪＴ６発現ベクター内 に組み込むために、以下の通りに最初にクローンＡ４６−３／ｐＳＰＯＲＴの５ ’末端にＳａｌＩ部位を入れる。ＳａｌＩ部位を含むプライマーが合成され、こ のＳａｌＩ部位にはＡ４６−３／ｐＳＰＯＲＴのコード配列の核酸１〜１５が続 く；このプライマーは、５’ＡＴＣ ＧＴＣ ＧＡＣ ＣＡＴ ＧＡＣ ＧＧＣ ＧＣＣ ＣＴＧ Ｇ３’（配列番号２１）の配列を含む。これは、リバースプ ライマー ５’ＧＧＧ ＣＧＧ ＡＧＧ ＣＣＣ ＣＧＧ ＧＴＣ ３’（配列 番号２２）と共に用いられて、Ａ４６−３／ｐＳＰＯＲＴクローンから得られた プラスミドＤＮＡを鋳型として用いてＤＮＡフラグメントを増幅する。ＰＣＲは 、アンプリタク（ＡＭＰＬＩＴＡＱ）ＤＮＡポリメラーゼを有する遺伝子増幅Ｐ ＣＲキット（ＧＥＮＥ−ＡＭＰ ＰＣＲ Ｋｉｔ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、 Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用 いて行う。９４℃で５分間の最初の溶解を行った後、以下のプログラムを３０回 繰り返した。すなわち、該プログラムは９４℃で１分間の溶解、５５℃で１分間 のアニーリング、７２℃で１分間の伸長からなる。最終回の後、反応を７２℃で ５分間保つことによって伸長を完了させる。Ａ４６−３／ｐＳＰＯＲＴから増幅 されたフラグメントを以下の通りにｐＪＴ６ベクターに挿入する。Ａ４６−３／ ｐＳＰＯＲＴから得られた増幅フラグメントをＳａｌＩおよびＡｐａＩで切断す る。Ａ４９−３／ｐＳＰＯＲＴから得られた挿入部分をＡｐａＩおよびＮｏｔＩ で切断する。ベクターｐＪＴ６をＳａｌＩおよびＮｏｔＩで切断する。この３個 のフラグメントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いるスリーウェイリゲーション（３ 時間、２５℃）で結合させ、ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ −ＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｒｅｓ、ＣＡ）を使用し、かつ製造元の取扱説明書に基づ いて、エレクトロコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５−ａ株に形質転 換する。ポシティブコロニーを選択してｐＪＴ６−Ａ４９と命名する。ＰＣＲに よって増幅された挿入の５’部分の配列決定によって、クローンＡ４６−３／ｐ ＳＰＯＲＴのものと同一の配列であることが示され、このことは、増幅中に突然 変異が引き起こされていないことを示している。 ｍＢＲＫ−３、ｍＢＲＫ−１、およびニワトリＢＲＫ−２のための発現プラス ミドの構築は、Ｒｏｓｅｎｂａｕｍによって米国特許出願第０８／４６２，４６ ７号で既に詳しく記述されており、この明細書で援用した。 タイプＩＢＭＰ受容体と共にｍＡｃｔＲＩＩＢ₂またはｍＡｃｔＲＩＩＢ₄を同時 発現する効果を測定するために、ｍＡｃｔＲＩＩＢ₂またはｍＡｃｔＲＩＩＢ₄の ｃＤＮＡを、ＢＲＫ−１のｃＤＮＡまたはＢＲＫ−２のｃＤＮＡと共に同時発現 することが必要である。マウスＢＲＫ−１のＤＮＡ配列は配列番号１３に示され ており、推定されるマウスＢＲＫ−１のアミノ酸配列は配列番号１４に示されて いる。ニワトリＢＲＫ−２のＤＮＡ配列は配列番号１５に示されており、推定さ れるニワトリＢＲＫ−２のタンパク質配列は配列番号１６に示されいる。この明 細書で援用した、Ｒｏｓｅｎｂａｕｍによる米国特許出願第０８／４６２，４６ ７号に詳しく記述されているｍＡｃｔＲＩＩＢ₂とｍ−ＢＲＫ−３との結合性お よびシグナル伝達性を比較するために、タイプＩ受容体とＢＲＫ−３を同時発現 させた後で得られたデータを、比較目的のために以下の実施例で示した。マウス ＢＲＫ−３のＤＮＡ配列は配列番号１１に示され、マウスＢＲＫ−３の推定アミ ノ酸配列は配列番号１２に示される。 実施例４ 哺乳類でのｍＡｃｔＲＩＩＢ₂、ｍＡｃｔＲＩＩＢ₄，ｍ−ＢＲＫ−３、ＢＲＫ− １、およびＢＲＫ−２の発現 前述した発現プラスミドを用いて哺乳類細胞内で受容体を一過性発現させる方 法は、ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）またはＲＩＢ／Ｌ−１７ 細胞内での結合および免疫沈降実験（実施例６〜８を参照のこと）（Ｊ．Ｌ．Ｗ ｒａｎａ、Ｌ．Ａｔｔｉｓａｎｏ、Ｊ．Ｃａｒｃａｍｏ、Ａ．Ｚｅｎｔｅｌｌａ 、Ｊ．Ｄｏｏｄｙ、Ｍ．Ｌａｉｈｏ、Ｘ．−Ｆ．Ｗａｎｇ、ａｎｄ Ｊ．Ｍａｓ ｓａｇｕｅ、Ｃｅｌｌ ７１：１００３−１０１４（１９９２））、またはＲＩ Ｂ／Ｌ−１７細胞内でのシグナル伝達アッセイ（実施例９）（Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎ ａ、 Ｌ．Ａｔｔｉｓａｎｏ、Ｊ．Ｃａｒｃａｍｏ、Ａ．Ｚｅｎｔｅｌｌａ、Ｊ．Ｄｏ ｏｄｙ、Ｍ．Ｌａｉｈｏ、Ｘ．−Ｆ．Ｗａｎｇ、ａｎｄ Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ 、Ｃｅｌｌ ７１：１００３−１０１４（１９９２））のために、ＤＥＡＥデキ ストラン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ ）を用いて行う。 ＢＭＰ受容体をＣＯＳ−１細胞で一過性発現させるために、１０％ウシ胎児血 清（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）、非必須アミノ酸、およびグルタ ミンを添加したＤＭＥ高グルコース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ 、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）の入ったＴ−１７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉ ｎｇ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で、細胞を７０％〜９０％の集密度（ｃｏｎ ｆｌｕｅｎｃｙ）で増殖させる。細胞を３７℃で無血清ＤＭＥ培地で２回洗浄し て、その後各Ｔ−１７５フラスコにＤＮＡ混合物１０ｍｌを添加する。このＤＮ Ａ混合物は、ＤＭＥ、１０％Ｎｕ−Ｓｅｒｕｍ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）、ＤＥＡＥ −デキストラン４００μｇ／ｍｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ 、ＮＪ）、クロロキン０．１ｍＭ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、お よび興味あるｃＤＮＡを含むもので、ｍＡｃｔＲＩＩＢ₂に対してはｐＪＴ６− ｍＡｃｔＲＩＩＢ₂を４０μｇ、ｍＡｃｔＲＩＩＢ₄に対してはｐＪＴ６−ｍＡｃ ｔＲＩＩＢ₄を４０μｇ、ｍＢＲＫ−３Ｓに対してはｐＪＴ６−ｍＢＲＫ−３Ｓ を４０μｇ、ＢＲＫ−１に対してはｐＪＴ４−Ｊ１５９Ｆを２０μｇ、ＢＲＫ− ２に対してはｐＪＴ３−ＢＲＫ２を２０μｇとする。単一の受容体だけのトラン スフェクションを必要とする実験計画の場合は、エンプティーな発現ベクターｐ ＪＴ６またはｐＪＴ４（詳細はＲｏｓｅｎｂａｕｍによって米国特許出願第０８ ／４６２，４６７号に記述されており、この明細書で援用した）を、対応する受 容体ｃＤＮＡと置換する。次に、細胞を３７℃でＤＮＡ混合物と３時間インキュ ベートする。この溶液を吸引し、カルシウムやマグネシウムを含まないＤｕｌｂ ｅｃｃｏの酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａ ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中で、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ） を含有する溶液とともに、細胞をインキュベートする。２分後、ＤＭＳＯ溶液を 吸引して、細胞を上記の増殖培地で洗浄し、つづいてプレートに新鮮な培地を再 び注ぐ。トランスフェクションした細胞を、トランスフェクションして２４時間 後に、全細胞結合用（実施例６）の１２穴プレートまたは親和標識および免疫沈 降用（実施例７）の１００ｍｍプレートに分ける。細胞はトランスフェクション して３６時間から７２時間後に、結合分析に対して適当な状態となる。 結合実験および親和標識／免疫沈降実験のために、ＲＩＢ／Ｌ−１７細胞内で 一時的にＢＭＰ受容体を発現させるために、ＤＭＥ−高グルコース培地の代わり にＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ ｇ、ＭＤ）を用いることを除いて、条件を上記で述べたＣＯＳ−１細胞用の条件 と同じにし、ＲＩＢ／Ｌ−１７細胞をＴ−１７５フラスコ中で、フラスコ当たり ５〜１０×１０⁶細胞で接種した後、２４時間トランスフェクションする。３Ｔ Ｐ−Ｌｕｘアッセイ用にＲＩＢ／Ｌ−１７細胞でＢＭＰ受容体を一過性発現させ るために、３ＴＰ−Ｌｕｘ受容体プラスミドを３０μｇ（Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ、 Ｌ．Ａｔｔｉｓａｎｏ、Ｊ．Ｃａｒｃａｍｏ、Ａ．Ｚｅｎｔｅｌｌａ、Ｊ．Ｄｏ ｏｄｙ、Ｍ．Ｌａｉｈｏ、Ｘ．−Ｆ．Ｗａｎｇ、ａｎｄ Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ 、Ｃｅｌｌ ７１：１００３−１０１４（１９９２））およびｐＣＭＶβ β− ガラクトシダーゼ発現プラスミド１５μｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌ ｔｏ、ＣＡ）をさらに受容体プラスミドに加えることを除いて、すぐ前で述べた 条件と同じ条件にする。単一の受容体だけのトランスフェクションを必要とする 実験計画の場合は、エンプティーな発現ベクターｐＪＴ６またはｐＪＴ４（詳細 はＲｏｓｅｎｂａｕｍによって米国特許出願第０８／４６２，４６７号に記述さ れており、この明細書で援用した）を、対応する受容体ｃＤＮＡと置換する。 実施例５ 標識ＢＭＰ−４リガンドの産生 以前に記述された通りに、ＣＨＯ細胞から組換え体ヒトＢＭＰ−２およびＢＭ Ｐ−４二量体を産生し、精製する（Ｂ．Ｂ．Ｋｏｅｎｉｇ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４：５９６１ −５９７４（１９９４））。［¹²⁵Ｉ］−ＢＭＰ−４は、ヨードビーズ（ＩＯＤ ＯＢＥＡＤＳ；Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ；非孔質ポリスチレンビ ーズにクロラミン−Ｔが固定化されている）を用いて調製する。氷上で、凍結乾 燥ＢＭＰ−４（２μｇ）を１０ｍＭ酢酸５０μｌに溶解し、リン酸緩衝食塩水（ Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）４５０μｌを加える。チューブに５０ｏ μＣｕｒｉｅの¹²⁵Ｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔ ｓ、ＩＬ）（２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を５μｌ加え、かつ一個のヨードビーズ を加える。時折振盪しながら氷上で１０分反応させる。次に、ヨードビーズから 反応物を除去することによって反応を停止させる。未反応の¹²⁵Ｉを除去するた めに、事前に１０ｍＭ酢酸、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２５％ゼラチンで平衡化 したＰＤ−１０ゲルろ過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、 ＮＪ）に混合物を添加する。生成した標識タンパク質は、トリクロロ酢酸によっ て９５％を上回る沈殿が可能で、このことは全¹²⁵Ｉがタンパク質に結合し、典 型的な特異的活性が４０００から９０００Ｃｉ／ｍｍｏｌであることを示す。 一方、ＢＭＰ−４はクロラミン−Ｔ法（Ｃ．Ａ．Ｆｒｏｌｉｋ、Ｌ．Ｍ．Ｗａ ｋｅｆｉｅｌｄ、Ｄ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ、ａｎｄ Ｍ．Ｂ．Ｓｐｏｒｎ、Ｊ．Ｂｉ ｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５９：１０９９５−１１０００（１９８４））によって１ ２⁵Ｉで標識される。ＢＭＰ−４（２μｇ）を、３０％アセトニトリル５μｌに 溶解し、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、さらに１．５Ｍリン酸ナトリウ ム、ｐＨ７．４を５μｌ添加する。担体なしの¹²⁵Ｉ（１ｍＣｉ、９μｌ）を、 クロラミンＴ溶液（１００μｇ／ｍｌ）２μｌと共に加える。さらにクロラミン Ｔ溶液２μｌを２分および３分の時点で添加する。４．５分後、５０ｍＭ Ｎ− アセチルチロシン１０μｌ、６０ｍＭヨウ化カリウム１００μｌ、および１Ｍ酢 酸中の１１Ｍ尿素１００μｌを添加して反応を停止させる。３．５分間のインキ ュベートの後、ＰＤ−１０ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔ ａｗａｙ、ＮＪ）にかけ、１０ｍＭ酢酸、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２５％ゼラ チンで溶出して未反応のヨードを除去する。得られた標識タンパク質はトリクロ ロ酢酸によって９５％を上回る沈殿が可能で、このことは全ての¹²⁵Ｉがタンパ ク質に結合し、典型的な特異活性３０００〜８０００Ｃｉ／ｍｍｏｌを有するこ とが示される。実施例６ ＢＭＰタイプＩ受容体存在下でのｍＡｃｔＲＩＩＢ₂に対するＢＭＰ−４の結合 の特徴 ＢＭＰタイプＩ受容体存在下でのｍＡｃｔＲＩＩＢ₂の対するＢＭＰ−４の結 合は、細胞全体に対する標識ＢＭＰ−４結合と、受容体に対する標識ＢＭＰ−４ の共有架橋結合（親和性標識）および免疫沈降によって示すことができる。これ ら２つの方法を、本実施例および以下の実施例７に詳しく記述する。細胞全体に対する競合結合分析： 実施例４に記載した通りに、ＣＯＳ−１細胞に、ｍＡｃｔＲＩＩＢ₂発現のた めにはｐＪＴ６−ｍＡｃｔＲＩＩＢ₂を、ｍＡＣＲＩＩＢ₄発現のためにはｐＪＴ ６−ｍＡＣＲＩＩＢ₄をトランスフェクションして、ＢＲＫ−１発現のためには ｐＪＴ−Ｊ１５９Ｆ存在下で、ＢＲＫ−２発現のためにはｐＪＴ３−ＢＲＫ２存 在下で行う。トランスフェクション後、細胞を１２穴プレートに播種し、２４時 間から３６時間の時点で結合実験を行う。その際、細胞を結合緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１２８ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＳＯ₄、１．２ｍＭ ＣａＣｌ₂、２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）で洗浄して、次に ４℃で３０分〜６０分間ゆっくり攪拌しながら同一緩衝液で平衡化する。次に緩 衝液を吸引し、各穴に対して５００μｌの結合緩衝液（４℃）を加える。アッセ イに応じて、この緩衝液は種々の濃度の未標識ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、または 他の未標識リガンドとともに［¹²⁵Ｉ］−ＢＭＰ−４トレーサー（１００〜４０ ０ｐＭ）を含む。非特異的結合を測定するために、ＢＭＰ−４を最終濃度が１０ から５０ｎＭになるようにして結合緩衝液に添加する。インキュベーション中の リガンドの分解を防ぐために、プロテアーゼ阻害剤混合液も添加し、最終濃度が ロイペプチン１０μｇ／ｍｌ、アンチパイン１０μｇ／ｍｌ、アプロチニン５０ μｇ／ｍｌ、ベンズアミド１００μｇ／ｍｌ、大豆トリプシン阻害剤１００μｇ ／ｍｌ、ベスタチン１０μｇ／ｍｌ、ペプスタチン１０μｇ／ｍｌ、およびフェ ニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）３００μＭとなるようにする。細 胞を４℃で４時間ゆっくりと攪拌する。インキュベーション終了時、緩衝液を吸 引して、細胞を１ｍｌの洗浄緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１２ ８ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＳＯ₄、１．２ｍＭ ＣａＣｌ₂、 ０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）で４回すすぐ。最終洗浄液を吸引後、２００μｌの ＲＩＰＳ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｂａｓｅ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍ Ｍ ＥＤＴＡ、０．５％ ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸、０．１％Ｓ ＤＳ、１０ｍＭ ＮａＩ、１％ＢＳＡ、ｐＨ８．０）を各穴に添加して、室温で １５〜３０分インキュベートする。次に、溶解した細胞を新しいチューブに移し 、Ｐａｃｋａｒｄ Ｍｏｄｅｌ ５００５ ＣＯＢＲＡ Ｇａｍｍａ Ｃｏｕｎ ｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）で 計数する。 ｍＡｃｔＲＩＩＢ₂存在下でｍＢＲＫ−１を発現している細胞に対して、ＢＲ Ｋ−１だけを発現している細胞における非標識ＢＭＰ−４の結合親和性を比較す る［¹²⁵Ｉ］ＢＭＰ−４競合実験の結果は、ＢＲＫ−１＋ＡｃｔＲＩＩＢ₂複合体 に対するＢＭＰ−４の親和性（ＩＣ₅₀＜５×１０^-10Ｍ）が、ＢＭＰ−１タイプ Ｉだけに対する親和性（ＩＣ₅₀＞１０^-9Ｍ）よりも高いことを示している。 このことは、ＢＲＫ−１だけを発現している細胞における競合曲線の位置に比べ て、ＢＲＫ−１＋ＡｃｔＲＩＩＢ₂を同時発現している細胞における競合曲線が 左に移動していることによって証明される。さらに３回実験を繰り返したところ 、ＢＲＫ−１だけを発現している細胞に対してＢＲＫ−１＋ＡｃｔＲＩＩＢ₂を 同時発現している細胞では、同様に左に移動した競合曲線が得られた。平均ＩＣ₅₀ はＢＲＫ−１＋ＡｃｔＲＩＩＢ₂を同時発現している細胞においては２．５９ ×１０^-10Ｍ（ＬｏｇＩＣ₅₀＝−９．５８６±０．０６２；Ｎ＝４）で、ＢＲＫ −１だけを発現している細胞においては２．３３×１０^-9Ｍ（ＬｏｇＩＣ₅₀＝− ８．６３３±０．０４４；Ｎ＝４）である。結合親和性の増加は、ＢＲＫ−３タ イプＩＩ受容体とともにＢＲＫ−２タイプＩ受容体を同時発現している細胞にお いても認められるが、ＢＲＫ−１＋ＢＲＫ−３受容体を発現している細胞では認 められていない（Ｔ．Ｎｏｈｎｏ、Ｔ．Ｉｓｈｉｋａｗａ、Ｔ．Ｓａｉｔｏ、Ｋ ．Ｈｏｓｏｋａｗａ、Ｓ．Ｎｏｊｉ、Ｄ．Ｈ．Ｗｏｌｓｉｎｇ、ａｎｄ Ｊ．Ｓ ．Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７ ０：２２５２２−２２５２６（１９９５））。これらのデータは、ＡｃｔＲＩＩ Ｂ₂タイプＩＩ受容体が、ＢＲＫ−１受容体存在下でＢＭＰ−４に対して高親和 性結合複合体を形成することのできるタイプＩＩ受容体を表しており、ＢＲＫ− １＋ＡｃｔＲＩＩＢ₂自体は新規高親和性ＢＭＰ受容体複合体を表していること を示す。 実施例７ タイプＩＢＭＰ受容体とともにｍＡｃｔＲＩＩＢ₂は複合体を形成するがｍＡｃ ｔＲＩＩＢ₄は複合体を形成しないことの示唆 ＴＧＦ−βファミリーの受容体は、タイプＩおよびタイプＩＩの受容体を含む 複合体を形成することが示されている（Ｌ．Ａｔｔｉｓａｎｏ、Ｊ．Ｌ．Ｗｒａ ｎａ、Ｆ．Ｌｏｐｅｚ−Ｃａｓｉｌｌａｓ、ａｎｄ Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｊ ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２２２：７１−８０（１９９ ４））。［¹²⁵Ｉ］ＢＭＰ−４結合、およびＢＭＰタイプＩ受容体ＢＲＫ−１ま たはＢＲＫ−２と複合体を形成するために、ＡｃｔＲＩＩＢ₂の細胞外における 膜近傍領域の８個のアミノ酸が必要で、一方ＡｃｔＲＩＩＢ₄の該アミノ酸は必 要ではないこと（Ｌ．Ａｔｔｉｓａｎｏ、Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ、Ｓ．Ｃｈｅｉｆ ｅｚ、ａｎｄ Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｃｅｌｌ ６８：９７−１０８（１９９ ２））を示すために、実施例４で説明した通りに、ＣＯＳ−１またはＲＩＢ／Ｌ −１７細胞に、タイプＩ受容体としてＢＲＫ−１またはＢＲＫ−２のいずれかと ともに、タイプＩＩ受容体としてｍＡｃｔＲＩＩＢ₂またはｍＡｃｔＲＩＩＢ₄Ｎ ｏＩのいずれかのｃＤＮＡを同時トランスフェクションして、前述した通りに１ ００ｍｍプレートに３×１０⁶細胞／プレートの密度で播種する（Ｂ．Ｂ．Ｋｏ ｅｎｉｇ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂ ｉｏｌｏｇｙ、１４：５９６１−５９６４（１９９４））。この受容体を［¹²⁵ Ｉ］−ＢＭＰ−４に架橋結合させて、次に以下に説明した通りに以前に記述した 方法（Ｔ．Ｎｏｈｎｏ、Ｔ．Ｉｓｈｉｋａｗａ、Ｔ．Ｓａｉｔｏ、Ｋ．Ｈｏｓｏ ｋａｗａ、Ｓ．Ｎｏｊｉ、Ｄ．Ｈ．Ｗｏｌｓｉｎｇ、ａｎｄ Ｊ．Ｓ．Ｒｏｓｅ ｎｂａｕｍ、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７０：２２５ ２２−２２５２６（１９９５）、Ｂ．Ｂ．Ｋｏｅｎｉｇ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４：５９６１− ５９６４（１９９４））で、タイプＩ受容体ＢＲＫ−１およびＢＲＫ−２に対し て特異的な抗体と共に免疫沈降させる。もし、タイプＩ受容体に特異的な抗体が 、［¹²⁵Ｉ］−ＢＭＰ−４を架橋結合したタイプＩ受容体だけでなく、［¹²⁵Ｉ］ −ＢＭＰ−４を架橋結合したｍＡｃｔＲＩＩＢ₂とも沈降を示すならば、この２ つの受容体は複合体を形成するに違いなく、タイプＩおよびタイプＩＩ受容体が 同じリガンド結合特異性を有すると期待される。 ＢＲＫ−１のウサギポリクローナル抗体＃１３５３は、以前に記述した通りに 細胞外ドメインを産生する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して作製され、生成され る（Ｂ．Ｂ．Ｋｏｅｎｉｇ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅ ｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４：５９６１−５９６４（１９９４））。Ｂ ＲＫ−２のウサギポリクローナル抗体ＪＭ＃２は、標準方法によってキーホール リンペットと結合させた細胞内の膜近傍ペプチドＡＲＰＲＹＳＩＧＬＥＱＤＥＴ ＹＩＰＰＣ（ＡＡ：１５５−１７２）に対して、３匹のニュージーランド白ウサ ギを免役して作製した（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｍｐａｎｙ 、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ ９４８０６−１９６５）。得られた抗血清について 、ＣＯＯＨシステインを介して抗体を捕獲させたＥＬＩＳＡ法によって、プラス チックに吸着した元のペプチドに対する認識能を評価する。これらの両抗体のた めに、抗血清は、Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ（Ａ）ＩｇＧ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏ ｎ Ｋｉｔ（製品番号＃４４６６７）を用いて、製品取扱説明書に記述されたよ うに、Ｐｉｅｒｅｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ Ｐｌｕｓ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚ ｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって精製されたＩｇＧとした。 ＢＲＫ−１とＡｃｔＲＩＩＢ₂の間に形成される複合体は２つの異なる実験で 詳しく示される。第１の実験は、ＣＯＳ−１細胞で観察されたレベルでは受容体 を発現しないＲＩＢ／Ｌ−１７細胞で実施される（Ｄ．Ｖｉｖｉｅｎ、Ｌ．Ａｔ ｔｉｓａｎｏ、Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ、ａｎｄ Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｊ．Ｂｉ ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７０：７１３４−７１４１（１９９ ５））。ＲＩＢ／Ｌ−１７細胞においては、ＣＯＳ−１細胞で以前に記述された 通りに（Ｔ．Ｎｏｈｎｏ、Ｔ．Ｉｓｈｉｋａｗａ、Ｔ．Ｓａｉｔｏ、Ｋ．Ｈｏｓ ｏｋａｗａ、Ｓ．Ｎｏｊｉ、Ｄ．Ｈ．Ｗｏｌｓｉｎｇ、ａｎｄ Ｊ．Ｓ．Ｒｏｓ ｅｎｂａｕｍ、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７０：２２ ５２２−２２５２６（１９９５））、ＢＲＫ−１またはＢＲＫ−２タイプＩ受容 体のいずれかとＢＲＫ−３タイプＩＩ受容体との間で複合体が形成される。以前 観察された通りに、ＢＲＫ−１免疫沈降物内では、ＢＲＫ−１バンドに対する親 和性標識の強度は、ＢＲＫ−１＋ＢＲＫ−３を同時発現している細胞のものと、 ＢＲＫ−１だけを発現している細胞で観察されたものでは変化がない。一方、Ｂ ＲＫ−２免疫沈降物内のＢＲＫ−２バンドは、ＢＲＫ−２だけを発現している細 胞で観察されるものに対して、ＢＲＫ−２＋ＢＲＫ−３を同時発現した細胞では かなり濃い。この標識強度の変化は、ＢＲＫ−３タイプＩＩ受容体との複合体中 にＢＲＫ−２が存在している場合、親和性または架橋結合能のいずれかが増加し ており、ＢＲＫ−１が存在している場合では増加しないことの反映と解釈される （Ｔ．Ｎｏｈｎｏ、Ｔ．Ｉｓｈｉｋａｗａ、Ｔ．Ｓａｉｔｏ、Ｋ．Ｈｏｓｏｋａ ｗａ、Ｓ．Ｎｏｊｉ、Ｄ．Ｈ．Ｗｏｌｓｉｎｇ、ａｎｄ Ｊ．Ｓ．Ｒｏｓｅｎｂ ａｕｍ、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７０：２２５２２ −２２５２６（１９９５））。ＲＩＢ／Ｌ−１７細胞において、これらの受容体 がＡｃｔＲＩＩＢ₂と共に同時発現している場合に、タイプＩ受容体の免疫沈降 物内で、ＢＲＫ−１タイプＩ受容体の標識強度が増加し、ＢＲＫ−２タイプＩ受 容体では増加しないことが観察される。さらに、ＡｃｔＲＩＩＢ₂の分子量に相 当するバンド（Ｌ．Ａｔｔｉｓａｎｏ、Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ、Ｓ．Ｃｈｅｉｆｅ ｚ、ａｎｄ Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｃｅｌｌ ６８：９７−１０８（１９９２ ））の親和性標識が、ＢＲＫ−１＋ＡｃｔＲＩＩＢ₂を同時発現している細胞の ＢＲＫ−１免疫沈降物内では観察されるが、ＢＲＫ−１受容体だけを発現してい る細胞のＢＲＫ−１免疫沈降物内では観察されない。このことは、これらの受容 体の両方を同時発現している細胞内では、ＢＲＫ−１がＡｃｔＲＩＩＢ₂と複合 体を形成することを示している。ＢＲＫ−２およびＡｃｔＲＩＩＢ₂を同時発現 している細胞内でのＢＲＫ−２免疫沈降物内では、ＡｃｔＲＩＩＢ₂の分子量 に相当するバンドの親和性標識が観察されないので、ＢＲＫ−２とＡｃｔＲＩＩ Ｂ₂の間では複合体形成が観察されない。さらに、ＡｃｔＲＩＩＢ₄の分子量に相 当するバンド（Ｌ．Ａｔｔｉｓａｎｏ、Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ、Ｓ．Ｃｈｅｉｆｅ ｚ、ａｎｄ Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｃｅｌｌ ６８：９７−１０８（１９９２ ））の親和性標識が、いずれかのタイプＩ受容体およびＡｃｔＲＩＩＢ₄を同時 発現している細胞のタイプＩ受容体免疫沈降物では観察されないことから、Ａｃ ｔＲＩＩＢ₄は［¹²⁵Ｉ］ＢＭＰ−４存在下ではＢＲＫ−１またはＢＲＫ−２のい ずれとも複合体を形成しないことが示唆される。 同様の実験をＣＯＳ−１細胞で実施して、ＲＩＢ／Ｌ−１７細胞での実験で用 いたのと同様の基準を使用し、ＢＲＫ−１およびＡｃｔＲＩＩＢ₂では複合体が 形成されるが、ＢＲＫ−１＋ＡｃｔＲＩＩＢ₄では形成されないことを示唆する 。さらに、ＣＯＳ−１細胞では、ＲＩＢ／Ｌ−１７細胞で観察されたよりも高い レベルで受容体が発現しており（Ｄ．Ｖｉｖｉｅｎ、Ｌ．Ａｔｔｉｓｏｎｏ、Ｊ ．Ｌ．Ｗｒａｎａ、ａｎｄ Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７０：７１３４−７１４１（１９９５））、ＢＲＫ− ２＋ＡｃｔＲＩＩＢ₂でも複合体形成が示される。これらのデータにより、Ａｃ ｔＲＩＩＢ₁およびＡｃｔＲＩＩＢ₂の細胞外の膜近傍領域の８個のアミノ酸の存 在が、ＢＭＰ−４のＡｃｔＲＩＩＢタイプＩＩ受容体への結合に不可欠であるこ とが確かめられる（Ｌ．Ａｔｔｉｓａｎｏ、Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ，Ｓ．Ｃｈｅｉ ｆｅｔｚ、ａｎｄ Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｃｅｌｌ ６８：９７−１０８（１ ９９２））。さらにこのデータは、ＢＲＫ−１とＢＲＫ−２のいずれも［¹²⁵Ｉ ］ＢＭＰ−４リガンドの存在下で競合してＡｃｔＲＩＩＢ₂と複合体形成し、か つＢＲＫ−２およびＡｃｔＲＩＩＢ₂の複合体形成には、ＢＲＫ−１およびＡｃ ｔＲＩＩＢ₂の複合体形成に必要なレベルよりも高いレベルの受容体発現が必要 であることが示される。 さらなる実験でＢＲＫ−２＋ＡｃｔＲＩＩＢ₂複合体もＢＭＰ−２を結合する ことができることが示される。この実験では、ＣＯＳ−１細胞にＢＲＫ−２およ びＡｃｔＲＩＩＢ₂を同時トランスフェクションして、以前に記述した通りに（ Ｂ．Ｂ．Ｋｏｅｎｉｇ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌ ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４：５９６１−５９６４（１９９４））［¹²⁵ Ｉ］ＢＭＰ−２で親和性標識する。［¹²⁵Ｉ］ＢＭＰ−４について上記に記述し た通りに、ＢＲＫ−２＋ＡｃｔＲＩＩＢ₂を同時発現した細胞では、ＢＲＫ−２ 免疫沈降物内にＡｃｔＲＩＩＢ₂の分子量に相当するバンドの親和性標識が観察 され、このことはＣＯＳ−１細胞内でこれらの受容体が過剰に発現している場合 、ＢＭＰ−２リガンドがＢＲＫ−２＋ＡｃｔＲＩＩＢ₂複合体に結合することが できることを示唆している。 実施例８ ＢＭＰ受容体アゴニストおよびアンタゴニストを同定するリガンド結合アッセイ におけるｍ−ＡｃｔＲＩＩＢ₂＋ＢＲＫ−１またはｍ−ＡｃｔＲＩＩＢ₂＋ＢＲＫ −２の使用 タイプＩＢＭＰ受容体と複合体を形成しているｍＡｃｔＲＩＩＢ₂と相互作用 するリガンドの同定は、このＢＭＰ受容体複合体とリガンドとの相互作用を測定 するよう設計されたアッセイを用いることによって達成できる。ｍ−ＡｃｔＲＩ ＩＢ₂＋ＢＲＫ−１またはｍＡｃｔＲＩＩＢ₂＋ＢＲＫ−２複合体を使用し、大量 の試料を扱うように適合された受容体結合アッセイは以下の通りに実施する。 ＣＯＳ−１細胞を、１２穴培養プレートまたは９６穴マイクロタイタープレー トで細胞増殖を行うこと以外は上記実施例４で記述した通りにして、ｍ−Ａｃｔ ＲＩＩＢ₂には構築物ｐＪＴ６−ｍＡｃｔＲＩＩＢ₂、ＢＲＫ−１にはＢＲＫ−１ 発現用構築物ｐＪＴ４−Ｊ１５９Ｆ、ＢＲＫ−２にはＢＲＫ−２発現用構築物ｐ ＪＴ３−ＢＲＫ−２を用いて、ｃＤＮＡをトランスフェクションする。細胞をト ランスフェクションするのに用いるＤＮＡ混合物は、受容体を実施例４に記載し た濃度で含んでいる。トランスフェクション後３６〜７２時間の時点で、細胞を 結合緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１２８ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍ Ｍ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＳＯ₄、１．２ｍＭ ＣａＣｌ₂、２ｍｇ／ｍｌ ＢＳ Ａ）で一回洗浄して、次に同緩衝液中で４℃で６０分ゆっくり振盪して、平衡化 する。平衡化後、緩衝液を吸引し、各穴に、種々の濃度の試験化合物（例、推定 リガンド）の存在下または非存在下で、［¹²⁵Ｉ］ＢＭＰ−４トレーサー（１０ ０〜４００ｐＭ）を含む４℃の結合緩衝液を添加し、４℃で４時間ゆっくり振盪 する。非特異的結合およびＢＭＰ受容体複合体からの完全な置換を測定するため に、ＢＭＰ−２を最終濃度１０ｎＭで添加する。リガンドの分解を防ぐために、 プロテアーゼ阻害剤混合液も加え、最終濃度がロイペプチン１０μｇ／ｍｌ、ア ンチパイン１０μｇ／ｍｌ、アプロチニン５０μｇ／ｍｌ、ベンズアミド１００ μｇ／ｍｌ、大豆トリプシン阻害剤１００μｇ／ｍｌ、ベスタチン１０μｇ／ｍ ｌ、ペプスタチン１０μｇ／ｍｌ、およびフェニルメチルスルホニルフルオリド （ＰＭＳＦ）３００μＭとなるようにする。インキュベーション終了時、緩衝液 を吸引して、細胞を洗浄緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１２８ｍ ＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＳＯ₄、１．２ｍＭ ＣａＣｌ₂、０５ ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）で４回すすぐ。最終洗浄液を吸引後、ＲＩＰＳ緩衝液（２ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｂａｓｅ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０． ５％ ＮＰ−４０、０．５％ デオキシコール酸、０．１％ ＳＤＳ、１０ｍＭ ＮａＩ、１％ＢＳＡ、ｐＨ８．０）を各穴に添加して、室温で１５〜３０分イ ンキュベートする。次に、溶解した細胞を新しいチューブに移し、Ｐａｃｋａｒ ｄ Ｍｏｄｅｌ ５００５ ＣＯＢＲＡ Ｇａｍｍａ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃ ｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）で計数する。 ｍＡＣｔＲＩＩＢ₂＋ＢＲＫ−１またはｍＡｃｔＲＩＩＢ₂＋ＢＲＫ−２受容体 複合体と相互反応する試験化合物は、受容体複合体への結合に対して［¹²⁵Ｉ］ ＢＭＰ−４トレーサーと競合することが観察され、新規試験化合物の非存在下で トレーサーをインキュベートした場合に観察される結合に比べて、試験化合物存 在下での［¹²⁵Ｉ］ＢＭＰ−４トレーサーの結合は少ない。試験したもっとも高 濃度の試験化合物では、［¹²⁵Ｉ］ＢＭＰ−４トレーサーの結合減少は３０％以 上であり、この試験化合物がｍＡｃｔＲＩＩＢ₂＋ＢＲＫ−１またはｍＡｃｔＲ ＩＩＢ₂＋ＢＲＫ−２受容体複合体に結合することが示される。 実施例９ タイプＩＢＭＰ受容体の複合体においてＢＭＰを介するシグナル伝達はｍＡｃｔ ＲＩＩＢ₂を通しておこり、ｍＡｃｔＲＩＩＢ₄を通じては起こらないという示唆 いくつかの研究室が今までに、ＲＩＢ／Ｌ−１７ミンク肺上皮細胞を用いて（ Ｌ．Ａｔｔｉｓａｎｏ、Ｊ．Ｃａｒｃａｍｏ、Ｆ．Ｖｅｎｔｕｒａ、Ｆ．Ｍ．Ｂ ．Ｗｅｉｓ、Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、ａｎｄ Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ、Ｃｅｌｌ ７５：６７１−６８０（１９９３）；Ｊ．Ｃａｒｃａｍｏ、Ｆ．Ｍ．Ｂ．Ｗｅｉ ｓ、Ｆ．Ｖｅｎｔｕｒａ、Ｒ．Ｗｉｅｓｅｒ、Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ、Ｌ．Ａｔｔ ｉｓａｎｏ、ａｎｄ Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃ ｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １４：３８１０−３８２１（１９９４））、 ｐ３ＴＰ−Ｌｕｘプロモーター構築物と共同して（Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ、Ｌ．Ａ ｔｔｉｓａｎｏ、Ｊ．Ｃａｒｃａｍｏ、Ａ．Ｚｅｎｔｅｌｌａ、Ｊ．Ｄｏｏｄｙ 、Ｍ．Ｌａｉｈｏ、Ｘ．−Ｆ．Ｗａｎｇ、ａｎｄ Ｊ．Ｍａａｓａｇｕｅ、Ｃｅ ｌｌ ７１：１００３−１０１４（１９９２））、ＴＧＦ−β（Ｌ．Ａｔｔｉｓ ａｎｏ、Ｊ．Ｃａｒｃａｍｏ、Ｆ．Ｖｅｎｔｕｒａ、Ｆ．Ｍ．Ｂ．Ｗｅｉｓ、Ｊ ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、ａｎｄ Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ、Ｃｅｌｌ ７５：６７１− ６８０（１９９３）；Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ、Ｌ．Ａｔｔｉｓａｎｏ、Ｊ．Ｃａｒ ｃａｍｏ、Ａ．Ｚｅｎｔｅｌｌａ、Ｊ．Ｄｏｏｄｙ、Ｍ．Ｌａｉｈｏ、Ｘ．−Ｆ ．Ｗａｎｇ、ａｎｄ Ｊ．Ｍａａｓａｇｕｅ、Ｃｅｌｌ ７１：１００３−１０ １４（１９９２））、アクチビン（Ｌ．Ａｔｔｉｓａｎｏ、Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ 、Ｅ．Ｍｏｎｔａｌｖｏ、ａｎｄ Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １６：１０６６−１０７３（１ ９９６）；Ｊ．Ｃａｒｃａｍｏ、Ｆ．Ｍ．Ｂ．Ｗｅｉｓ、Ｆ．Ｖｅｎｔｕｒａ、 Ｒ．Ｗｉｅｓｅｒ、Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ、Ｌ．Ａｔｔｉｓａｎｏ、ａｎｄ Ｊ． Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ ｏｇｙ １４：３８１０−３８２１（１９９４）；Ｓ．Ａ．Ｗｉｌｌｉｓ、Ｃ． Ｍ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ、Ｌ．Ｌｉ、ａｎｄ Ｌ．Ｓ．Ｍａｔｈｅｗｓ、Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １０：３６７−３７９（１９９６ ））およびＢＭＰ（Ｆ．Ｌｉｕ、Ｆ．Ｖｅｎｔｕｒａ、Ｊ．Ｄｏｏｄｙ、ａｎｄ Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂ ｉｏｌｏｇｙ、１５：３４７９−３４８６（１９９５）；Ｂ．Ｌ．Ｒｏｓｅｎｚ ｗｅｉｇ、Ｔ．Ｉｍａｍｕｒａ、Ｔ．Ｏｋａｄｏｍｅ、Ｇ．Ｎ．Ｃｏｘ、Ｈ．Ｙ ａｍａ ｓｈｉｔａ、Ｐ．Ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ、Ｃ．−Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ、ａｎｄ Ｋ． Ｍｉｙａｚｏｎｏ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．、９２：７６３２− ７６３６（１９９５）；Ｈ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ、Ｐ．ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ、Ｄ ．Ｈｕｙｌｅｂｒｏｅｃｋ、Ｔ．Ｋ．Ｓａｍｐａｔｈ、Ｍ．Ａｎｄｒｉｅｓ、Ｊ ．Ｃ．Ｓｍｉｔｈ、Ｃ．−Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ、ａｎｄ Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ、 Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３０：２１７−２２６（１９９５））受容体 複合体の測定について報告してきたので、我々もこのレポーター系を用いて、次 にＢＭＰ受容体アゴニストおよびアンタゴニストの同定に使用できるシグナル伝 達アッセイにおけるｍＡｃｔＲＩＩＢ₂＋ＢＲＫ−１の使用を報告した。 Ｒ−ＩＢ／Ｌ１７細胞に、実施例４に記述した通りに、種々のＢＭＰ受容体組 み合わせと、３ＴＰ−Ｌｕｘ受容体プラスミド（Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ、Ｌ．Ａｔ ｔｉｓａｎｏ、Ｊ．Ｃａｒｃａｍｏ、Ａ．Ｚｅｎｔｅｌｌａ、Ｊ．Ｄｏｏｄｙ、 Ｍ．Ｌａｉｈｏ、Ｘ．−Ｆ．Ｗａｎｇ、ａｎｄ Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｃｅｌ ｌ ７１：１００３−１０１４（１９９２））、およびＣＭＶプロモーター由来 のβ−ガラクトシダーゼレポーター構築物（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌ ｔｏ、ＣＡ）をトランスフェクションして、２４時間後に６穴標準組織培養プレ ート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に１穴当たり２×１０⁵細 胞で播種した。１０％ＦＢＳ−ＭＥＭ中で３から４時間細胞を回復させた後、増 殖培地を２から４時間かけて０．１％ＦＢＳ−ＭＥＭに代える。次に、細胞を集 める前にＢＭＰｓを０．１％ＦＢＳ−ＭＥＭ中で増加させた濃度で１８時間反応 させる。細胞を集め、Ｄｕａｌ Ｌｉｇｈｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｒｏｐｉｘ、Ｂ ｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて、製品取扱説明書の通りにルシフェラーゼをアッ セイする。穴から穴、アッセイからアッセイの差異を排除するために、レポート されたルシフェラーゼ活性の値を、同量のレポートされたβ−ガラクトシダーゼ の値（Ｄｕａｌ Ｌｉｇｈｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｒｏｐｉｘ、Ｂｅｎｆｏｒｄ、 ＭＡ）を用いて製品取扱説明書の通りに測定する）で規準化し、全てのデータを 任意のユニットで表す。 ＢＲＫ−１＋ＡｃｔＲＩＩＢ₂複合体ではシグナル伝達が達成されるが、ＢＲ Ｋ−１＋ＡｃｔＲＩＩＢ₄複合体では達成されないということは、３ＴＰ−Ｌｕ ｘレポーター系を使用した２つの異なる実験において示唆される。第１の実験で は、３ＴＰ−Ｌｕｘまたはβ−ガラクトシダーゼ レポーター遺伝子の存在下で 、タイプＩおよびタイプＩＩ受容体を個々にまたは共同して、ＲＩＢ／Ｌ−１７ 細胞内で発現させた。この実験によって、タイプＩおよびタイプＩＩ受容体のい ずれも、それ自身ではシグナル伝達ができないことが示され、この系でＢＲＫ− １、ＢＲＫ−２、およびＢＲＫ−３について以前に観察されたのと同様である（ Ｆ．Ｌｉｕ、Ｆ．Ｖｅｎｔｕｒａ、Ｊ．Ｄｏｏｄｙ、ａｎｄ Ｊ．Ｍａｓｓａｇ ｕｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１５ ：３４７９−３４８６（１９９５）；Ｂ．Ｌ．Ｒｏｓｅｎｚｗｅｉｇ、Ｔ．Ｉｍ ａｍｕｒａ、Ｔ．Ｏｋａｄｏｍｅ、Ｇ．Ｎ．Ｃｏｘ、Ｈ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ、 Ｐ．Ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ、Ｃ．−Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ、ａｎｄ Ｋ．Ｍｉｙａｚｏ ｎｏ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅ ｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ．、９２：７６３２−７６３６（１９ ９５）；Ｈ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ、Ｐ．ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ、Ｄ．Ｈｕｙｌｅｂ ｒｏｅｃｋ、Ｔ．Ｋ．Ｓａｍｐａｔｈ、Ｍ．Ａｎｄｒｉｅｓ、Ｊ．Ｃ．Ｓｍｉｔ ｈ、Ｃ．−Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ、ａｎｄ Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３０：２１７−２２６（１９９５））。しかし、以前の研究 では、ＡｃｔＲＩＩＢタイプＩＩ受容体存在下におけるこれらのタイプＩ受容体 を通したＢＭＰによるシグナル伝達については扱われておらず、本発明のデータ によって、ＢＲＫ−１＋ＡＣｔＲＩＩＢ₂複合体はＢＭＰ−４刺激による３ＴＰ −Ｌｕｘレポーター活性の増加を引き起こすが、ＢＲＫ−１＋ＡＣｔＲＩＩＢ₄ 複合体は引き起こさないことが示される。これらのデータにより初めて、ＢＲＫ −１＋ＡｃｔＲＩＩＢ₂がこのアッセイにおけるＢＭＰのためのシグナル伝達受 容体複合体を表すこと、およびＡｃｔＲＩＩＢ₃およびＡｃｔＲＩＩＢ₄アイソフ ォームには存在しない（Ｌ．Ａｔｔｉｓａｎｏ、Ｊ．Ｌ．Ｗｒａｎａ，Ｓ．Ｃｈ ｅｉｆｅｚ、ａｎｄ Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｃｅｌｌ ６８：９７−１０８（ １９９２））ＡｃｔＲＩＩＢ₁またはＡｃｔＲＩＩＢ₂の細胞外膜近傍領域内の８ 個のアミノ酸がこの活性に不可欠であることが示唆される。ここでの一濃度のＢ ＭＰ− ４では、ＢＲＫ−２＋ＡｃｔＲＩＩＢ₂はＢＲＫ−１＋ＡｃｔＲＩＩＢ₂で観察さ れるよりもこのアッセイにおいて刺激発生が低いことも興味深い。第２の実験で は、３ＴＰ−Ｌｕｘおよびβ−ガラクトシダーゼレポーター構築物のほかに、Ｂ ＲＫ−１＋ＡｃｔＲＩＩＢ₂あるいはＢＲＫ−１＋ＡｃｔＲＩＩＢ₄のいずれかを 同時発現したＲＩＢ細胞を用い、ＢＭＰ−４に対する完全な用量−作用曲線を比 較する。この実験で、ＢＲＫ−１＋ＡｃｔＲＩＩＢ₂複合体でのＢＭＰ−４に対 するＥＣ₅₀は６．４×１０^-11Ｍであるが、ＢＲＫ−１＋ＡｃｔＲＩＩＢ₄複合体 では無視可能な作用しか生じないことが示される。 ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４は両方ともＢＲＫ−１に結合するので（Ｂ．Ｂ． Ｋｏｅｎｉｇ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４：５９６１−５９６４（１９９４））、３ＴＰ−Ｌｕｘ レポーターアッセイにおいて、ＢＲＫ−１＋ＡｃｔＲＩＩＢ₂複合体を通してＢ ＭＰ−２がシグナル伝達を行うことができることを示す必要がある。このことは 第３の実験で示唆され、この第３の実験ではＢＭＰ−４のＥＣ₅₀は１．５×１０^-10 Ｍで、ＢＭＰ−２のＥＣ₅₀は２．８×１０^-10Ｍであることが示される。この 実験によってさらに、これらの２つのリガンドについて類似した最大作用（５倍 ）が示される。これらのデータから、ＢＲＫ−１＋ＡｃｔＲＩＩＢ₂複合体はＢ ＭＰ−２あるいはＢＭＰ−４のいずれかに対するシグナル伝達受容体複合体であ り、これらのＢＭＰリガンドは、この受容体複合体に類似した能力および効力を 表すことが示される。 実施例１０ ＢＭＰ受容体アゴニストおよびアンタゴニストの同定のためのシグナル伝達アッ セイにおけるｍＡｃｔＲＩＩＢ₂およびＢＲＫ−１の使用 ＢＲＫ−１＋ＡｃｔＲＩＩＢ₂受容体のアゴニストである試験化合物は、ＢＲ Ｋ−１およびＡｃｔＲＩＩＢ₂受容体を３ＴＰ−Ｌｕｘおよびβ−ガラクトシダ ーゼ レポーター遺伝子と組み合わせて同時トランスフェクションしたＲＩＢ細 胞において、レポーター活性を増加させ、このことは、上記の実施例９でＢＭＰ −２またはＢＭＰ−４について記述した通りに、ルシフェラーゼ酵素の活性化 によって生じたルシフェラーゼ活性のレベルは任意の光単位を介して定量され、 この任意の光単位はβ−ガラクトシダーゼ酵素の活性化によって生じた任意の光 単位によって基準化されている。この方法で、ＢＲＫ−１およびＡｃｔＲＩＩＢ₂ 受容体を３ＴＰ−Ｌｕｘおよびβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子と組み 合わせて同時トランスフェクションして発現しているＲＩＢ／Ｌ−１７細胞を、 上記の実施例４および９で述べた通りに作製し、種々の濃度の未知の薬剤に暴露 して、上記の実施例９でＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４について述べた通りに、ル シフェラーゼ酵素の活性化によって生じたルシフェラーゼ活性の適当な光単位に よって定量し、この光単位はβ−ガラクトシダーゼ酵素の活性化によって生じた 適当な光単位に基準化されている細胞評価を行う。３ＴＰ−Ｌｕｘおよびβ−ガ ラクトシダーゼ遺伝子と組み合わせて、ＢＲＫ−１＋ＡｃｔＲＩＩＢ₂受容体を 発現しているＲＩＢ／Ｌ−１７において活性を生じ、３ＴＰ−Ｌｕｘおよびβ− ガラクトシダーゼ遺伝子だけを発現するＲＩＢ／Ｌ−１７細胞においては活性を 生じない化合物は、ＢＲＫ−１＋ＡｃｔＲＩＩＢ₂受容体複合体のアゴニストと して作用すると言える。 アンタゴニスト活性を試験するために、試験化合物を、固定濃度のＢＭＰ−４ または他のＢＭＰ受容体アゴニストの存在下で、３ＴＰ−Ｌｕｘおよびβ−ガラ クトシダーゼ遺伝子と組み合わせてＢＲＫ−１＋ＡｃｔＲＩＩＢ₂受容体を発現 しているＲＩＢ／Ｌ−１７細胞に添加する。ＢＲＫ−１＋ＡｃｔＲＩＩＢ₂複合 体のアンタゴニストである試験化合物は、試験化合物がない場合にＢＭＰ−４ま たは他のＢＭＰ受容体アゴニストに暴露した細胞で観察される活性と比較した場 合、３ＴＰ−Ｌｕｘ構築物のレポーター活性を減少させるであろう。このことは 、実施例９でＢＭＰ−２またはＢＭＰ−４について記述した通りに、ルシフェラ ーゼ酵素の活性化によって生じるルシフェラーゼ活性のレベルが任意の光単位レ ベルによって定量され、この光単位はβ−ガラクトシダーゼの活性化によって生 じる任意の光単位で基準化されている。 この明細書で援用したＲｏｓｅｎｂａｕｍによる米国特許出願第０８／４６２ ，４６７号は、本明細書で援用したＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＮｏｈｎｏによる 米国特許出願第０８／３３４，１７９号（１９９４年１１月４日申請）の開示を 補 うために用いる。本明細書で上記に記述した全ての刊行物を、本明細書で援用す る。 本明細書で記述した実施例および実施形態は例示することのみを目的としてお り、それらに照らし合わされる種々の修飾または変更は当技術範囲で習熟された ものであり、本出願の趣旨および範囲、ならびに添付のクレームの範囲に含まれ るものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．化合物が、ＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質複合体に結合することが可能で あるかを測定する方法であって、該複合体は、 ａ）ＢＭＰと、 ｂ）ＢＲＫ−２（配列番号１６）もしくはＢＲＫ−１（配列番号１４）、ＢＲＫ −２の可溶性フラグメント、ＢＲＫ−１の可溶性フラグメント、ＢＲＫ−１の不 完全な受容体キナーゼフラグメント、またはＢＲＫ−２の不完全な受容体キナー ゼフラグメントから選択されたＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質と、 ｃ）配列番号２もしくは配列番号４の１２４〜１３１のアミノ酸を含むＡｃｔＲ ＩＩＢ受容体、その可溶性フラグメントまたはその不完全な受容体キナーゼフラ グメントから成り、 前記方法が、該化合物を含む試料を該複合体に導入して、該化合物を該複合体 に結合させることを含む方法。 ２．ＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質ＢＲＫ−１をコードするＤＮＡ配列である 配列番号１３、その可溶性フラグメントをコードするＤＮＡ配列、またはその不 完全な受容体キナーゼフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクター と、配列番号１または配列番号３から選択されたＡｃｔＲＩＩＢタンパク質をコ ードするＤＮＡ配列、その可溶性フラグメントをコードするＤＮＡ配列、または その不完全な受容体キナーゼフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベ クターとを同時トランスフェクションした細胞を用いて、ＢＭＰ結合を測定する 、請求項１に記載の方法。 ３．ＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質が、配列番号１４のアミノ酸配列を有する ＢＲＫ−１、ＢＲＫ−１の可溶性フラグメント、またはＢＲＫ−１の不完全な受 容体キナーゼフラグメントと、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＢＲＫ−２ 、ＢＲＫ−２の可溶性フラグメント、またはＢＲＫ−２の不完全な受容体キナー ゼフラグメントとから選択される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。 ４．ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列を有するＡｃｔＲ ＩＩＢ₁、配列番号４のアミノ酸配列を有するＡｃｔＲＩＩＢ₂、その可溶性フラ グメント、またはその不完全な受容体キナーゼフラグメントである、前記請求項 のいずれか１項に記載の方法。 ５．ＢＭＰがＢＭＰ−２またはＢＭＰ−４である、請求項１に記載の方法。 ６．ＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質ＢＲＫ−１をコードするＤＮＡ配列である 配列番号１３、その可溶性フラグメントをコードするＤＮＡ配列、またはその不 完全な受容体キナーゼフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクター と、配列番号１または配列番号３から選択されたＡｃｔＲＩＩＢタンパク質をコ ードするＤＮＡ配列、その可溶性フラグメントをコードするＤＮＡ配列、または その不完全受容体キナーゼフラグメントをコードするＤＮＡ配列とを含む発現ベ クターを同時トランスフェクションした宿主細胞であって、これらのタンパク質 またはフラグメントが前記請求項のいずれか１項に記載の方法において有用であ ることを特徴とする宿主細胞。 ７．ａ．リガンドを含む臨床試料をＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質複合体およ び標識ＢＭＰと共に組み合わせることと、 ｂ．試料存在下で標識ＢＭＰを複合体に結合させることと、 ｃ．既知濃度のＢＭＰリガンドを用いて作成した標準曲線と比較することとを 含む、臨床試料中のＢＭＰ受容体リガンドの濃度を測定する方法であって、 ＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質複合体が、ＢＲＫ−２（配列番号１６）もし くはＢＲＫ−１(配列番号１４)、ＢＲＫ−２の可溶性フラグメント、ＢＲＫ−１ の可溶性フラグメント、ＢＲＫ−１の不完全受容体キナーゼフラグメント、また はＢＲＫ−２の不完全受容体キナーゼフラグメントから選択されるＢＭＰ受容体 キナーゼタンパク質と、配列番号２または配列番号４の１２４〜１３１のアミノ 酸、その可溶性フラグメント、またはその不完全な受容体キナーゼフラグメント を含むＡｃｔＲＩＩＢ受容体とから成ることを特徴とする方法。 ８．ＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質ＢＲＫ−１をコードするＤＮＡ配列である 配列番号１３、その可溶性フラグメントをコードするＤＮＡ配列、またはその不 完全な受容体キナーゼフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクター と、配列番号１または配列番号３から選択されたＡｃｔＲＩＩＢタンパク質をコ ードするＤＮＡ配列、その可溶性フラグメントをコードするＤＮＡ配列、または その不完全受容体キナーゼフラグメントをコードするＤＮＡ配列とを含む発現ベ クターを同時トランスフェクションした細胞を用いて、ＢＭＰ結合を測定する、 前記請求項のいずれか１項に記載の方法。 ９．ＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質が、ＢＲＫ−２の可溶性フラグメントまた はＢＲＫ−１（配列番号１４）であるか、ＢＲＫ−１の可溶性フラグメントまた はＢＲＫ−２（配列番号１６）である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法 。 １０．試験化合物がＢＭＰ受容体タンパク質複合体への結合においてシグナルを 発生するかどうかを測定する方法であって、 （ａ）ＢＭＰ、ＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質ＢＲＫ−２（配列番号１５） もしくはＢＲＫ−１(配列番号１３)、または配列番号２もしくは配列番号４の１ ２４〜１３１のアミノ酸をコードしているＤＮＡを含むＡｃｔＲＩＩＢ受容体を コードしているＤＮＡをトランスフェクションしてあるＢＭＰ受容体タンパク質 複合体発現細胞を³²Ｐで標識する工程と、 （ｂ）(ｉ)試験化合物の存在下で第１組の該細胞の培養を行う工程と、 （ｉｉ）試験化合物の非存在下で第２組の該細胞の培養を行う工程と、 （ｃ）工程（ｂ）で得られたリン酸化タンパク質をオートラジオフラフィーに より定量する工程と、 （ｄ）工程（ｃ）によって定量された第１組の細胞のリン酸化タンパク質の量 を、工程（ｃ）によって定量された第２組のリン酸化タンパク質の量と比較する 工程と を含む方法。 １１．試験化合物がＢＭＰ受容体タンパク質複合体への結合においてシグナルを 発生するかどうかを測定する方法であって、 （ａ）ＢＭＰ、ＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質ＢＲＫ−２（配列番号１５） もしくはＢＲＫ−１(配列番号１３)、または配列番号２もしくは配列番号４の１ ２４〜１３１のアミノ酸をコードしているＤＮＡを含むＡｃｔＲＩＩＢをコード するＤＮＡ配列をトランスフェクションしてあるＢＭＰ受容体タンパク質複合体 発現細胞に、β−ガラクトシダーゼ遺伝子と共にルシフェラーゼレポーターをト ランスフェクションすることと、 （ｂ）(ｉ)試験化合物の存在下で第１組の該細胞の培養する工程と、 （ｉｉ）試験化合物の非存在下で第２組の該細胞の培養する工程と、 （ｃ）任意の光単位によって、工程（ｂ）で生成したレポーター構築体の刺激 により得られるルシフェラーゼ酵素の活性化により生じたルシフェラーゼ活性の レベルを定量する工程と、 （ｄ）工程（ｃ）で定量された第１組の細胞由来の任意の光単位の量を、工程 （ｃ）で定量された第２組の細胞由来の任意の光単位の量と比較する工程と を含む方法。