JP3527248B2 - 骨代謝活性のスクリーニングに対するｂｍｐタンパク質受容体複合体の使用とｉｉ型ｂｍｐ受容体およびｉ型ｂｍｐ受容体によって同時トランスフェクションした細胞 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、骨の形成および分化の分野に関係する。特
に、本発明は新規骨形態形成タンパク質II型受容体を、
骨形態形成Ｉ型受容体と一緒に使用して骨代謝活性のス
クリーニングを行うことに関係する。さらに、本発明は
この受容体をコードするDNAと１型の骨形態形成タンパ
ク質をコードするDNAとによって同時トランスフェクシ
ョンした細胞に関する。

背景技術 ヒトおよび他の温血動物はいくつかの骨に関連した病
気に罹る可能性を有する。そのような病気には、骨折か
らヒトを衰弱させる骨粗鬆症等の病気が含まれる。健康
なヒトの骨成長は一般に正常に進行し、また骨折治癒は
病理学的介入を必要としない。しかし、ある種の場合に
おいては骨が弱まって骨折治癒が正常に行われないと考
えられる。例えば、高齢者あるいは副腎皮質ホルモン
（例：移植患者）による治療を受けている患者の場合、
治癒の進行が遅くなると思われる。骨粗鬆症は、骨の硬
組織の損失が新規硬組織の発生に対して不釣り合いな状
態となる容態をいう。骨粗鬆症を骨量の減少、あるいは
骨組織の萎縮として一般に定義することができ、髄質お
よび骨空間が広がり、線維結合が減少し、緻密質が脆弱
になる。骨関連疾患の他の例としては、変形性関節症が
ある。これは、関節表面での骨の新生と同様に関節軟骨
の変質および摩耗によって特徴づけられる可動関節の疾
患である。

そのような骨に関係した疾患に有効な種々の治療法が
ある一方で、最善の結果が得られるような治療法は知ら
れていない。骨に関係した疾患の治療を受ける患者が直
面する問題点の一つは、骨代謝および骨関連疾患に対し
て完全な理解がなされていないということである。その
ような理解の鍵となることは、骨成長に関与する成分の
各々を同定し、かつ分類することである。骨形態形成タ
ンパク質（BMP）が骨の形成および発達に何らかの役割
を担うことが報告されている（J.M.Wozney,Molec.Repro
duct.and Develop.,32:160−167（1992））。

さらに、BMPの役割は骨のみに限定されるものではな
いと考えられる。他の組織、例えば脳、腎臓、重層扁平
上皮、および毛包においても高濃度で検出されるという
知見（N.A.Wall,M.Blessing,C.V.E.Wright,and B.L.M.H
ogan,J.Cell.Biol.,120:493−502（1993）;E.Ozkaynk,
P.N.J.Schnegelsberg,D.F.Jin,G.M.Clifford,F.D.Warre
n,E.A.Drier and H.Oppermann,J.Biol.Chem.,267:25220
−25227（1992）;K.M.Lyons,C.M.Jones,and B.L.M.Hoga
n,Trends in Genetics,7:408−412（1991）;V.Drozdof
f,N.A.Wall,and W.J.Pledger,Proceedings of the Nati
onal.Academy of Science,U.S.A.,91:5528−5532（199
4））は、成長および分化においてそれらが特別な役割
を担うことが示唆されている。このことを支持すること
については、BMPは神経細胞の分化を促進させること、
また毛包形成に悪影響をあたえるという知見が得られて
いる（K.Basler,T.Edlund,T.M.Jessell,and T.Yamada,C
ell,73:687−702（1993）;V.M.Paralkar,B.S.Weeks,Y.
M.Yu,H.K.Kleinman,and A.H.Reddi,J.Cell.Biol.,119:1
721−1728（1992）;M.Blessing,L.B.Nanney,L.E.King,
C.M.Jones,and B.L.Hogan,Genes Dev.,7:204−215（199
3））。

BMPは、BMP感受性細胞の細胞質膜上に発現された特異
的BMPレセプターに結合することによって、その生物的
効果が細胞に対してイニシエートされる。レセプターは
タンパク質であり、通常は細胞膜をまたがっており、細
胞外からのリガンドに結合する。そのような結合が信号
を細胞の内側へ送ることによって細胞の機能に変化が生
ずる。この場合、リガンドはタンパク質BMPであり、ま
た信号は細胞分化を引き起こす。

BMPレセプターは特異的にBMPに結合する能力を有する
ので、精製BMPレセプター組成物は、診断および治療に
用いるためにBMPレセプターに対する抗体を産生するこ
とと同様に、BMPの診断アッセイに有用である。さら
に、精製BMPレセプター組成物は、BMPに結合またはBMP
をスカベンジするために、治療の場で直接使用されても
よく、それによって骨および他の組織にあるBMPの活性
を制御する手段が与えられる。BMP受容体の構造的かつ
生物学的特性、組織成長／形成刺激中にBMPの種々の細
胞数に応じてBMPによって演じられる役割、または治
療、診断あるいはアッセイにおいて効果的に使用できる
ように、BMP受容体の精製組成物が求められている。し
かし、そのような組成物は組み換えDNA技術を用いて受
容体をコード化する遺伝子のクローニングおよび発現に
よって実質的な量が得られるだけである。生化学分析ま
たはBMPをコード化するほ乳類遺伝子のクローニンイン
グおよび発現に使用するためにBMP受容体を精製しよう
としても、受容体タンパク質またはmRNAの適当な源がな
いことが妨げとなっている。本発明に先だって、いくつ
かの細胞系統が高濃度の高親和性BMP受容体を発現する
ことが知られている。この高親和性BMP受容体は、タン
パク質をシークエンシングするために受容体を精製する
こと、また直接発現クローニングのために遺伝子ライブ
ラリーを構築することを妨げる。BMP受容体配列が容易
に得られることが生化学的分析およびスクリーニング実
験での使用のために、高濃度の組み換えBMP受容体を持
つ細胞系統の発生を可能とするであろう。

BMPはTGF−βスーパーファミリーに属する。TGF−β
スーパーファミリーの他のメンバーとしては、TGF−
β、アクチビン、インヒビン、ミュラー管抑制物質、お
よび生長・分化因子（GDF）が挙げられる。予想通り、T
GF−βファミリーを構成する種々の物質は類似の構造的
特性を共有する。TGF−βリガンド・スパーファミリー
の受容体は一般に２つのサブ・グループ、Ｉ型およびII
型のいずれかに分類される。Ｉ型受容体およびII型受容
体のいずれもアミノ酸配列の特徴にもとづいて分類され
る。これらＩ型受容体およびII型受容体の両方とも相対
的に小さな細胞外リガンド結合ドメイン、トランスメン
ブラン領域、および細胞内タンパク質キナーゼ・ドメイ
ンを有する。この細胞内タンパク質キナーゼ・ドメイン
はセリン／キナーゼ活性を持つものと考えられている。
（Lin and Moustakas,Cellular and Molecular Biology
40:337−349（1994）,L.S.Mathews,Endocrine Review
s,15:310−325（1994）;L.Attisano,J.L.Wrana,F.Lopez
−Casillas,and J.Massague,Biochimica et Biophysica
Acta,1222:71−80（1994））。

今日までクローン化されたＩ型受容体は、異なるファ
ミリーに属するもので、キナーゼ・ドメインは相関性お
よび共通性が高く、＞85％配列相同性を示す（B.B.Koen
ig et al.,Molecular and Cellular Biology,14:5961−
5974（1994））。Ｉ受容体の細胞近接領域は、トランス
メンブラン領域からのSGSGSGモチーフ35〜40アミノ酸に
よって特徴づけられるもので、さらにこれら受容体のカ
ルボキシ末端は非常に短い（B.B.Koening et al.,Molec
ular and Cellular Biology,14:5961−5974（1994）;L.
Attisano,J.L.Wrana,F.Lopez−Casillas,and J.Massagu
e,Biochimica et Biophysica Acta,1222:71−80（199
4））。Ｉ型受容体の細胞外ドメインは、“システイン
・ボックス”と呼ばれ、かつトランスメンブラン領域の
25〜30アミノ酸のなかに位置したシステイン残基からな
る特徴的なクラスタしと、“上流システイン・ボック
ス”と呼ばれ、かつ推定信号配列の後に位置したシステ
イン残基からなる他のクラスタとを含む（B.B.Koening
et al.,Molecular and Cellular Biology,14:5961−597
4（1994）;L.Attsano,et al.,Biochimica et Biophysic
a Acta,1222:71−80（1994））。

Ｉ型受容体と比較して、II型受容体のキナーゼ・ドメ
インでは互いに他のものと離れた関係にあるだけであ
る。Ｉ型受容体に見いだされたSGSGSGモチーフは、II型
受容体では見いだされない。また、Ｉ型受容体の“上流
システイン・ボックス”は、II型受容体には存在しな
い。さらに、アクチビンII型受容体のすべたが細胞内膜
近接領域にプロリン・リッチの配列を含む一方で、すべ
てのII型受容体に共通の特徴的な配列モチーフが存在し
ない（L.S.Mathews,Endocrine Reviews、15:310−325
（1994））。II型受容体のカルボキシ末端の長さは、顕
著に変わるものであり、BMP II型受容体でもっとも長い
カルボキシ末端、AF−４（M.Estevez,L.Attisano,J.L.W
rana,P.S.Albert,J.Massague,and D.L.Riddle,Nature,3
65:644−49（1993））が発見されている。このAF−４
は、線虫C.elegansからクローン化したものである。II
型受容体の細胞外ドメインは、トランスメンブラン・領
域近傍の単一システイン・ボックスを備える。システイ
ン・ボックスの存在とは別に、TGF−β、アクチビン、
およびBMPに対するII型受容体の細胞外ドメインの間
に、わずかな配列の類似性がある。

TGF−βリガンド・スーパーファミリーの一員による
情報伝達は、同一細胞の表面上にＩ型およびII型受容体
の両方を必要とする（L.S.Mathews.Endocrine Reviews,
15:310−325（1994）;L.Attisano,J.L.Wrana,F.Lopez−
Casillas,and J.Massague,Biochimica et Biophysica A
cta,1222,71−80（1994））。BMPは、TGF−βリガンド
・スーパーファミリーのメンバーであって、ファミリー
のメンバー間において構造的類似性の度合いが高い。そ
のため、これらの受容体は構造的に、かつ機能的にTGF
−βおよびアクチビン受容体に関連すると期待される。
TGF−βおよびアクチビン受容体システムのように（J.M
aassague,L.Attisano,and J.L.Wrana,Trends in Cell B
iology,4:172−178（1994））、Ｉ型BMP受容体およびII
型BMP受容体は細胞または組織内でBMP信号を変換するの
に必要となろう。したがって、すでにクローン化された
Ｉ型受容体に加えてほ乳類動物II型BMP受容体キナーゼ
・タンパク質が求められている。

BMP、すなわち骨形態形成タンパク質受容体キナーゼ
−Ｉ（Bone Morphogenetic Protein Receptor Kinase−
Ｉ、以下“BRK−1"と呼ぶ）（参照:U.S.S.N.08/158,73
5,J.S.Cook,et al.;and B.B.Koening et al.Molecular
and Cellular Biology,14:5961−5974（1994））、ALK
−２、およびALK−６に関して３種類の異なるほ乳類動
物Ｉ型受容体が報告されている。BRK−１は、ALK−３の
マウス相同体であり、ALK−６と同様にBMP−４に結合
し、AK−２はBMP−７に結合する（参照:P.ten Dijike,
H.Yamashitaa,T.K Sampath,A.H.Reddi,M.Estevez,D.L.R
iddle,H.Ichijo,C.−H.Heldin,and K.Miyazono,J.Biolo
gical Chemistry,269:16985−116988（1994））。ま
た、ALK−６がニワトリ受容体骨形態形成タンパク質受
容体キナーゼ−２（以下、“BRK−2"と呼ぶ）（またはB
RK−１と呼ぶ）（参照:S.Smitomo,T.saito,and T.Nohn
o,DNA Sequence,3:297−302（1993））。BRK−１のラッ
トの相同体もまた、BMPR−I aとしてクローン化されて
いる（K.Takeda,S.Oida,H.Ichijo,T.limura,Y.Marnoka,
T.Amagasa and S.Sasaki,Biochemical and Biophysical
Resarch Communications,204:203−209（1994））。

同時係属出願のRosenbaumおよびNohnoのU.S.S.N.08/3
34,179（1994年11月４日出願）では、新規のほ乳類動物
BMP II型受容体（“BRK−3"と呼ぶ）が開示され、かつ
クレームされている。BRK−３受容体のクローニングに
先だって、BMP−２およびBMP−４のDAF−４と呼ばれる
唯一のII型受容体を線虫C.elegansらクローン化した
（M.Estevez,L.Attisano,J.L.Wrana,P.S.ALbert,J.Mass
ague,aand D.L.Riddle,Nature,365:644−９（199
3））。線虫とほ乳類との間には進化のレベルでは大き
な隔たりがあるので、DAD−4 cDNAを用いてほ乳類のDAD
−４相同体をクローン化するのは可能ではないとされて
きた。このことは、BMPについてのほ乳類II型受容体のD
NA配列が実質的にDAF−４から分岐していること、さら
にBMPについてほ乳類動物のII型受容体をクローン化す
るのが必要であることを意味している。

同時係属出願のBMP受容体キナーゼ・タンパク質BRK−
３は、Ｉ型BMP受容体との複合体形成を可能とするほ乳
類II型受容体を提供する。以下に詳細に説明するこの複
合体は、高い親和性でもってBMPに結合することが可能
であり、このことからBMP受容体親和性を持つ化合物を
同定するのに好適である。本発明の複合体は、応答能を
持つことによってBMPに対するほ乳類Ｉ型受容体と共同
してBMPに対する応答を情報伝達する高親和性複合体の
形成も可能とする。したがって、線虫II型受容体とほ乳
類Ｉ型受容体とから構成される受容体複合体よりもほ乳
類BMP受容体複合体はBMP受容体と相互作用する新規化合
物の同定によりいっそう関係するもので、ヒトおよび他
のほ乳類動物の治療薬として用いることができよう。

本発明の目的 本発明の目的は、BMP受容体キナーゼ・タンパク質複
合体に結合することが可能な化合物を同定する方法を提
供することである。

本発明の別の目的は、試料中のBMP受容体キナーゼ・
タンパク質複合体に対する結合能を持つ化合物の量を決
定する方法を提供することである。

本発明の別の目邸は、II型BMP受容体キナーゼ・タン
パク質をコード化する組み換え発現ベクターとBMP受容
体キナーゼ・タンパク質複合体を含むＩ型BMP受容体キ
ナーゼ・タンパク質をコード化する組み換え発現ベクタ
ーと含む宿主細胞を提供することである。

本発明の別の目的は、試験化合物がBMP受容体タンパ
ク質複合体への結合に対する信号を作るかどうかを決定
する方法を提供することである。

要約 本発明は、化合物がBMP受容体キナーゼ・タンパク質
複合体に結合することが可能であるかどうかを判断する
方法に関し、該方法は、化合物を含有する試料を複合体
に取り入れて、該複合体に化合物を結合させる工程を有
し、さらに複合体はＩ型BMP受容体キナーゼ・タンパク
質とBMP受容体キナーゼ・タンパク質BRK−３とからな
る。

本発明は、さらに臨床試料に含まれるBMP受容体リガ
ンドの濃度を決定する方法に関し、該方法は、BMP受容
体キナーゼ・タンパク質複合体にリガンドを含む試料を
取り入れて、リガンドをBMP受容体キナーゼ・タンパク
質に結合させる工程を有し、さらに、BMP受容体キナー
ゼ・タンパク質複合体は、Ｉ型BMP受容体キナーゼ・タ
ンパク質とBMP受容体キナーゼ・タンパク質BRK−３とか
らなる。

本発明は、さらにBMP受容体キナーゼ・タンパク質BRK
−３をコードするDNA配列を含む発現ベクターと、Ｉ型B
MP受容体キナーゼ・タンパク質をコードするDNA配列を
含む発現ベクターとによって同時トランスフェクション
した宿主細胞に関する。

本発明は、さらに可溶性Ｉ型BMP受容体キナーゼ・タ
ンパク質をコードするDNA配列を含む発現ベクターと、
可溶性BMP受容体キナーゼ・タンパク質BRK−３をコード
するDNA配列を含む発現ベクターとによって同時トラン
スフェクションした宿主細胞に関する。

本発明は、さらに不完全なＩ型BMP受容体キナーゼ・
タンパク質をコードするDNA配列を含む発現ベクター
と、不完全なBMP受容体キナーゼ・タンパク質BRK−３を
コードするDNA配列を含む発現ベクターとによって同時
トランスフェクションした宿主細胞に関する。

本発明はさらに試験化合物がBMP受容体タンパク質複
合体への結合に対する信号を生ずるかどうかを判断する
方法に関するもので、この方法は、（ａ）BMP容体キナ
ーゼ・タンパク質BRK−３をコードするDNA配列とＩ型BM
P受容体キナーゼ・タンパク質をコードするDNA配列とに
よってトランスフェクションしているBMP受容体タンパ
ク質複合体発現細胞を32Pによって標識する工程と、
（ｂ）（ｉ）試験化合物存在下での上記細胞の第１の組
の培養と、（ii）試験化合物不存在下での上記細胞の第
２の組の培養とを行う工程と（ｃ）工程（ｂ）によって
生じたリン酸化タンパク質をオートラジオグラフィーを
介して定量する工程と、（ｄ）工程（ｃ）によって定量
された上記細胞の第１の組の前記リン酸化タンパク質の
量を、工程（ｃ）によって定量された細胞の第２の組の
リン酸化タンパク質の量と比較する工程とを有する。

図面の簡単な説明 図１は、ｔ−BRK−３のPCR増幅で使用される変質オリ
ゴヌクレオチド・プライマーのDNA配列を示す図であ
る。塩基であるアデニン、チミン、シトシン、およびグ
アニンをそれぞれＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧで表す。Ｎとい
う文字はその部位にＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧの等量混合物
が存在することを示す。プライマーは、TGF−βII型受
容体の配列由来である（H.Y.Lin,X.F.Wang,E.Ng−Eato
n,R.A.Weinberg,and H.F.Lodish,Cell,68:775−785（19
92））。

図２は、ｔ−BRK−３の一過性ほ乳類発現に使用され
るpJT 4−hBRK3Tの構成を示す。CMVは、サイトメガロウ
イルス初期プロモータ／エンハンサー、Ｒは、ヒトＴ−
細胞白血病ウイルス−１の長い末端繰り返し由来の“R"
因子、SPは、SV40ウィルス由来イントロン・スプライシ
ング部位、T3は、T3バクテリオファージ由来のプロモー
タ領域、T7は、T7バクテリオファージ由来のプロモータ
領域、polyAは、メッセージのポリアデニレーションを
指示するSV40ウィルス由来の領域、Ampは、大腸菌（E.c
oli）の淘汰に使うアンピシリン抵抗遺伝子である。

図３は、BRK−１の一過性ほ乳類発現に使用されるpJT
4−J159Fの構成を示す。略語は図２のものと同じであ
る。

図４は、BRK−２の一過性ほ乳類発現に使用されるpJT
3−BRK 2の構成を示す。略語は図２のものと同じであ
る。

図５は、C.elegans受容体DAF−４の一過性ほ乳類発現
に使用されるpJT 4−Daf 4の構成を示す。略語は図２の
ものと同じである。

図６は、Ｉ型受容体BRK−１およびBRK2の存在または
不在下でCOS−７細胞において発現されたｔ−BRK−３に
対する［¹²⁵I］−BMP−４の全細胞結合を示す。棒は［
¹²⁵I］−BMP−４の特異的結合を示すもので、細胞数に
標準化している。左から右に、NIH3T3胚線維芽細胞；ベ
クターPJT−４単独（“mock"と表す）でトランスフェク
ションしたCOS−７細胞;BRK−１単独、BRK−１プラス10
または20μｇのｔ−BRK−２、BRK−２単独、BRK−２プ
ラス10または20μｇのｔ−BRK−３、およびｔ−BRK−３
単独（20μｇ）でトランスフェクションしたCOS−７細
胞である。

図７は、Ｉ型BRK−１およびBRK−２の存在または不在
下におけるtBRK−３によりトランスフェクションしたCO
S−１細胞に対する［¹²⁵I］−BMP−４の架橋形成反応を
示す。分子量の基準を左側に示す。右側の表示は
［¹²⁵I］−BMP−４と架橋したｔ−BRK−３、BRK−１、
およびBRK−２の予測分子量に移動するバンドを示す。
左から右へ、各レーンはBRK−１単独;BRK−１プラス２
μg/mlのｔ−BRK−3 BRK−１プラス４μg/mlのｔ−BRK
−3;BRK−２単独;BRK−２プラス２μg/mlのｔ−BRK−3;
BRK−２プラス４μg/mlのｔ−BRK−3;2μg/mlのｔ−BRK
−３単独；および４μg/mlのｔ−BRK単独でトランスフ
ェクションしたCOS−１細胞を示す。DNA混合物の容量は
4mlである。この図では、“BRK−３^＊”はｔ−BRK−３
である。

図８は、tBRK−３と、COS−１細胞で発現し、かつＩ
型受容体BRK−１またはBRK−２の存在または不在下で［
¹²⁵I］−BMP−４の架橋したC.elegans II型受容体DAF−
４との免疫沈降を示す。分子量の基準を左側に示す。ま
た、右側に示す領域は、［¹²⁵I］−BMP−４に架橋したD
AF−４、ｔ−BRK−３、BRK−１、またはBRK−２の予測
分子量で移動委する標識タンパク質バンドを示す。II型
受容体の存在または不在下でBRK−１によってトランス
フェクションしたCOS−１細胞に対しては抗血清1379を
用い、またII型受容体の存在または不在下でBRK−２に
よってトランスフェクションしたCOS−１細胞に対して
は抗血清1380を用いた。他のものすべてについて、抗血
清は括弧内に表示した。左から右へ、NIH3T3胚線維芽細
胞（1379）、つづいてBRK−１単独、BRK−１プラスDAF
−４、BRK−１プラスｔ−BRK−３、BRK−２単独、BRK−
２プラスDAF−４、BRK−２プラスｔ−BRK−３である。
これにつづいて、NIH3T3細胞（1380）、DAD−４単独で
トランスフェクションしたCOS−１細胞（1379）、およ
びｔ−BRK−３単独でトランスフェクションしたCOS−１
細胞（1380）である。図中、“BRK−３＊”はｔ−BRK−
３である。

図９は、BRK−２およびｔ−BRK−３でトランスフェク
ションし、かつ示したような非標識拮抗剤の存在または
不在下において210pMの［¹²⁵I］−BMP−４に架橋したCO
S−１細胞の免疫沈降を示す。抗血清1380を用いた。左
側の重複レーンは非標識拮抗剤が添加されていない状態
を示し、つづいて（左から右へ）10nMのBMP4、10nMのBM
P−２、10nMのBMP−２、10nMのDR−BRMP−２、および50
nMのTGF−β１を添加した場合を示す。図中、“BRK−３
^＊”はｔ−BRK−３である。

図10は、マウスBRK−３の一時的ほ乳類発現に使用さ
れるpJT6−mBRK−3Lの構成を示す。略語は図２のものと
同じである。

図11は、マウスBRK−３の一時的ほ乳類発現に使用さ
れるpJT6−mBRK−3Sの構成を示す。この構成では、未翻
訳３′領域のほとんどが取り除かれている。略語は図２
のものと同じである。

図12は、Ｉ型受容体BRK−２の存在または不在下でCOS
−１細胞において発現されたマウスBRK−３に対する［
¹²⁵I］−BMP−４の全細胞結合を示す。棒は［¹²⁵I］−B
MP−４の特異的結合を示すもので、細胞数に標準化して
いる。マウスBRK−３に用いた構成はpJT6−mBRK−3Lお
よびpJT6−mBRK−3Sであり、BRK−２については、構成
はpJT3−BRK−２である。両構成ともマウスBRK−３の完
全なコード領域が含まれる。pJT6−mBRK−3Sでは、３′
未翻訳領域のＡ−Ｔリッチ領域が欠失している。左から
右に、ベクターPJT−６単独（“mock"と表す）;pJT3−B
RK−２独；構成pJT6−mBRK−3S単独;pJT6−mBRK−3L単
独;pJT3−BRK−２プラスpJT6−BRK−3S;およびpJT3−BR
K−２プラスpJT6−BRK−3Lによってでトランスフェクシ
ョンしたCOS−１細胞を表す。

図13は、Ｉ型BMP受容体の存在および非存在下におけ
るｍ−BRK−３に対する［¹²⁵I］−BMP−４の架橋形成を
示す。COS−１細胞を、構成pJT6−mBRK−3Sを用いてBRK
−３に対するcDNA、および（または）BRK−１（pJT 4−
J159Fを用いる）またはBRK−２（pJT3−BRK−２を用い
る）に対するcDNAによってトランスフェクションさせ
る。つぎに、［¹²⁵I］−BMP−４と結合させ、ジスクシ
ニミヂル基質に架橋し、SDSゲル電気泳動にかける。分
子量基準の位置は左側に示す。左から右に、BRK−１単
独、BRK−１プラスｍ−BRK−３、ｍ−BRK−３単独、BRK
−２プラスｍ−BRK−３、BRK−２単独、およびベクター
単独でトランスフェクションしたCOS 1細胞を示す。BRK
−１、BRK−２、およびBRK−３によって識別されたバン
ドを右側に示す。

図14は、Ｉ型BMP受容体の存在または不在下における
ｍ−BRK3の免疫沈降を示す。COS−１細胞を、pJT6−mBR
K−3Sを用いたｍ−BRK−３のcDNAを用いて、および（ま
たは）BRK−１（pJT 4−J159Fを用いる）またはBRK−２
（pJT3−BRK−２を用いる）に対するcDNAによってトラ
ンスフェクションさせる。つぎに、［¹²⁵I］−BMP−４
と結合させ、ジスクシニミヂル基質に架橋し、BRK−１
およびBRK−２に対する抗体でもって免疫沈降させ、さ
らにSDSゲル電気泳動にかける。用いた抗血清をレーン
の下に示す。すなわち、PI、免疫前血清;1379、BRK−１
に対するcDNAによってトランスフェクションした細胞;1
380、BRK−２に対するcDNAによってトランスフェクショ
ンした細胞である。分子量基準の位置は左側に示す。左
から右に、BRK−１プラスｍ−BRK−３（免疫前血清）;B
RK−１単独、BRK−１プラスｍ−BRK−3;m−BRK−３単
独、BRK−２プラスｍ−BRK−３、BRK−２単独；および
ベクター単独でトランスフェクションしたCOS−１細胞
を示す。BRK−1 BRK−２プラスｍ−BRK−３（免疫前血
清）によってトランスフェクションしたCOS 1細胞であ
る。

図15は、pHK1040のインサートのマップを示す。この
構成は、BLUESCRIPT II SK（−）におけるヒトBRK−３
の完全なコード領域を含む。

記述 本発明は、化合物がBMP受容体親和性を持つかどうか
を決定する方法の必要性に応えるものである。本発明の
方法は、試験化合物を含む試料をBMP受容体キナーゼ・
タンパク質複合体に取り入れ、試験化合物をBMP受容体
キナーゼ・タンパク質複合体に結合させることが含まれ
る。また、受容体複合体にはBMP I型受容体キナーゼ・
タンパク質と、本明細書では“BRK−3"と呼ぶこととす
るBMP II型受容体キナーゼ・タンパク質とが含まれてい
る。また、本発明は、BMP受容体キナーゼ・タンパク質B
RK−３をコードするDNA配列を含む発現ベクターと、Ｉ
型BMP容体キナーゼ・タンパク質をコードするDNA配列を
含む発現ベクターとで同時トランスフェクションする宿
主細胞の必要性に応えるものである。さらに、本発明が
提供することは臨床試料に含まれるBMP受容体リガンド
の濃度を決定させる方法を提供することである。この方
法は、リガンド含有試料をBMP受容体キナーゼ・タンパ
ク質複合体に添加し、該受容体複合体にリガンドを結合
させるステップを有する。ここで、受容体複合体は、Ｉ
型BMP受容体キナーゼ・タンパク質とBMP容体キナーゼ・
タンパク質BRK−３とからなる。本発明は、可溶性Ｉ型B
MP受容体キナーゼ・タンパク質をコードするDNA配列を
含む発現ベクターと、可溶性BMP容体キナーゼ・タンパ
ク質BRK−３をコードするDNA配列を含む発現ベクターと
で同時トランスフェクションする宿主細胞の必要性に応
えるものである。さらに、本発明は、不完全なBMP受容
体キナーゼ・タンパク質BRK−３をコードするDNA配列を
含む発現ベクターと、不完全なＩ型BMP受容体キナーゼ
・タンパク質をコードするDNA配列を含む発現ベクター
とで同時トランスフェクションする宿主細胞の必要性に
応えるものである。

ここで用いるように、“ヒトBMP受容体キナーゼ・タ
ンパク質−3"または“ｈ−BRK−3"は、アミノ酸配列配
列識別番号２を持つタンパク質、同様に配列識別番号２
に実質的に類似したアミノ酸を持つタンパク質を意味す
る。このタンパク質はBMP分子（限定されるものではな
いが、BMP−２、DR−BMP−２、BMP−４、および／また
はBMP−７を含む）への結合、あるいは細胞に結合するB
MP分子によって引き起こされた生物学的信号の変換、あ
るいはｈ−BRK−３タンパク質またはｈ−BRK−３もしく
はｍ−BRK−３（以下を見よ）のタンパク質配列由来ペ
プチドに対して生じた抗体との交差反応、あるいはＩ型
BMP受容体との複合体形成、あるいはｈ−BRK−３または
Ｉ型BMP受容体のいずれか一方に特異的な抗体を用いた
際のI BMP受容体との同時免疫沈降いう点で生物学的活
性を有する。

ここで用いるように、“先端を切った（truncated）
ヒトBMP受容体キナーゼ・タンパク質”または“ｔ−BRK
−3"は、配列識別番号４のアミノ酸配列またはBRK−３
に関する上記ペプチドを持つ配列を意味する。

ここで用いられるように、“マウスBMP受容体キナー
ゼ・タンパク質”または“ｍ−BRK−3"は、アミノ酸配
列配列識別番号８またはBRK−３についての上記特性を
持つ配列を有するタンパク質を意味する。

ここで用いられるように、“BMP受容体キナーゼ・タ
ンパク質BRK−3"または“BRK−3"は、受容体タンパク質
ｈ−BRK−３、ｔ−BRK−３、およびｍ−BRK−３（およ
びそれらの可溶性および不完全なフラグメント）、さら
にｈ−BRK−３、ｔ−BRK−３、およびｍ−BRK−３（お
よびそれらの可溶性および不完全なフラグメント）に実
質的に類似したBMP受容体キナーゼ・タンパク質に対し
て、個々に、かつ総称して言及するものである。そのよ
うな受容体タンパク質、該タンパク質をコードするDNA
配列、および該DNAを含む組み換え発現ベクターは、Ros
enbaumおよびNohnoの米国特許一連番号08/334,179（199
4年11月３日出願）に開示、かつクレームされている。

ここで用いられるように、“Ｉ型BMP受容体キナー
ゼ”は、BMP−２、BMP−４、および（または）他の既知
のBMPに結合することが可能なタンパク質であり、もち
ろん限定されるものではないが、システイン・ボックス
および上流システイン・ボックス、SGSGSGモチーフを含
GSドメインと呼ばれる細胞外リガンド結合ドメイン、細
胞内膜近接領域において、TGF−βスーパーファミリー
の他のリガントに対する他のＩ型受容体に対して約85％
を上回る類似性を持つ細胞内キナーゼ・ドメイン、およ
び（または）相対的に短いカルボキシ末端を含むＩ型受
容体の配列特性を持つ。ここで用いられるように、“Ｉ
型BMP受容体キナーゼ”は、文献、例えばB.B.Koening e
t al.Molecular and Cellular Biology,14:5961−5974
（1994）;L.Attisano,et al.,Biochimaica et Biophysi
ca Acta,1222:71−80（1994）;J/Massague,L.Attisano,
and J.L.Wrana,Trends in Cell Biology,4:172−178（1
994）；およびten Dijke,et al.,J.Biological Chemist
ry,269:16985−16988（1994）に記載されているような
Ｉ型BMP受容体の特性を持つ受容体タンパク質も含まれ
る。

Ｉ型BMP受容体の例として、もちろん限定されるもの
ではないが、BRK−１（B.B.Koenig et al.,Molecular a
nd Cellular Biology,14:5961−5974（1994）、そのラ
ット同族体でBMPR−I a（K.Takeda,S.Oida,H.Ichijo,T.
Iimura,Y.Maruoka,T.Amagasa,and S.Sasaki,Biochem,Bi
ophys.Res.Communica.,204:203−209（1994））;BRK−
２、BRK−１とも呼ばれる（S.sumitomo,T.Saito,and T.
Nohno,DNA sequence,3:297−302（1993）、またALK−６
のニワトリ同族体と想定される（P.ten Dijke,H.Yamash
ita,H.Ichijo,P.Franzen,M.Laiho,K.Miyazono,and C−
H.H.−C.Heldin,Science,264:101−104（1994）;ALK−
２、BMP−７に対する受容体として示されている（ten D
ijke et al.,J.Biological Chemistry,269:16985−1698
8（1994））;BMP−２およびBMP−４に結合し、中胚葉の
誘導に関与するツメガエル（Xenopus）Ｉ型BMP受容体
（J.M.Graff,R.S.Thies,J.J.Song,A.J.Celeste,and D.
A.Melton,Cell,79:169−179（1994））；およびデカペ
ンタ遮断性ペプチドを結合し、BMP−２およびBMP−４の
ショウジョウバエ（Drosophila）同族体であるショウジ
ョウバエ由来Ｉ型受容体である。これらのショウジョウ
バエ受容体は、25D 1、25D 2、および43E呼ばれる（T.X
ie,A.L.Finelli,and R.W.Padgett,Science,263:1756−1
759（1994）,A.Penton,Y.Chen,K.Staehling−Hampton,
J.L.Wrana,L.Attisano,J.Szidonya,J.A.Cassill,J.Mass
ague,and F.M.Hoffmann,Cell,78:239−250（1994）；お
よびT.J.Brummel,V.Twombly,G.Marques,J.L.Wrana,S.J.
Newfeld,L.Attisano,J.Massaque,M.B,O'Connor,and W.
M.Gelbart,Cell,78:251−261（1994））。本発明に好適
なＩ型BMP受容体は、もちろん限定されるものではない
が、配列識別番号１（BRK−１）、配列識別番号16（可
溶性BRK−１）、配列識別番号20（不完全BRK−１）、配
列識別番号14（BRK−２）、配列識別番号18（可溶性BRK
−２）、および配列識別番号22（不完全BRK−２）と実
質的に類似するアミノ酸配列を持つポリペプチドであ
る。

ここで用いられるように、BMPに対する結合能を有す
るBRK−1,BRK−2,またはBRK−３の細胞外領域に対応す
るアミノ酸配列を“可溶性フラグメント”と呼ぶ。可溶
性フラグメントとしては、BMP結合に必要とされない受
容体の領域が除去されている切断タンパク質（truncate
d proteins）が含まれる。BRK−３に対するそのような
可溶性タンパク質の例として、限定されるものではない
が、配列識別番号６、配列識別番号10、配列識別番号12
のアミノ酸残基１〜150、配列識別番号８のアミノ酸残
基１〜150、または配列識別番号に実質的に類似したア
ミノ酸配列、または配列識別番号５、配列識別番号９、
配列識別番号１の核酸残基409〜858に実質的に類似した
核酸残基によってコード化されたポリペプチド、または
配列識別番号７の核酸残基17〜466が挙げられる。

BRK−１に対する可溶性フラグメントの例としては、
限定されるものではないが、配列識別番号16、配列識別
番号12のアミノ酸残基１〜152に実質的に類似したアミ
ノ酸配列、配列識別番号15に実質的に類似した核酸残基
によってコード化されるポリペプチド、または配列識別
番号11の11〜466に実質的に類似した核酸残基によって
コード化されるポリペプチドが挙げられる。

BRK−２に対する可溶性タンパク質の例としては、配
列識別番号18に実質的に類似したアミノ酸配列を持つポ
リペプチド、配列識別番号14のアミノ酸残基１〜126、
配列識別番号17に実質的に類似した核酸残基によってコ
ード化されたポリペプチド、または配列識別番号13の35
5〜732に実質的に類似した核酸残基によってコード化さ
れたポリペプチドが挙げられる。

ここで用いられるように、“不完全な受容体キナーゼ
・フラグメント”は、完全な長さの受容体に類似した細
胞外、膜貫通、および細胞内隣接膜領域に対応するアミ
ノ酸配列に言及するものである。このアミノ酸配列は、
細胞外キナーゼ・ドメインの欠失による情報伝達を行う
ことができない。BRK−３に対するそのような不完全受
容体フラグメントの例としては、限定されるものではな
いが、配列識別番号24に実質的に類似したアミノ酸配
列、、配列識別番号26、配列識別番号２のアミノ酸１〜
200、配列識別番号８のアミノ酸１〜200を持つポリペプ
チド、配列識別番号23に実質的に類似した核酸残基、配
列識別番号25に実質的に類似した核酸残基によってコー
ド化したポリペプチド、配列識別番号１の409〜1008に
実質的に類似した核酸残基によってコード化するポリペ
プチド、または配列識別番号７の17〜616に実質的に類
似した核酸残基によってコード化するポリペプチドが挙
げられる。

BRK−１に対する不完全な受容体の例としては、限定
されるものではないが、配列識別番号20に実質的に類似
したアミノ酸配列、配列識別番号12のアミノ酸残基１〜
231を持つポリペプチド、配列識別番号19に実質的に類
似した核酸残基によってコード化されたポリペプチド、
または配列識別番号11の11〜703に実質的に類似した核
酸残基によってコード化されたポリペプチドが挙げられ
る。

BRK−２に対する不完全な受容体のフラグメントの例
として、限定されるものではないが、配列識別番号22、
配列識別番号14のアミノ酸残基１〜201に実質的に類似
しているアミノ酸残基を持つポリペプチド、配列識別番
号21に実質的に類似した核酸残基によってコード化され
たポリペプチド、または配列識別番号13の355〜957に実
質的に類似した核酸配列残基によってコード化されたポ
リペプチドが挙げられる。

ここで用いられるように、“BMP受容体キナーゼ・タ
ンパク質複合体”は、Ｉ型BMP受容体とBMP受容体キナー
ゼ・タンパク質BRK−３との組み合わせを意味する。Ｉ
型およびBRK−３受容体の組み合わせは、限定されるも
のではないが、溶解した状態のＩ型およびBRK−３受容
体の組み合わせ（例えば、可溶性フラグメントとし
て）、固相支持体に結合した受容体の組み合わせ（例え
ば、可溶性フラグメントとして）、またはトランスフェ
クションした細胞の細胞膜内における受容体の組み合わ
せ（例えば、完全な長さまたは不完全なフラグメント）
が挙げられる。

ここで用いられるように、“桁除去（digit−remove
d）BMP−2"および“DR−BMP−2"は、BMP−２タンパク質
のフラグメントを意味するもので、このフラグメントは
成熟BMP−２のアミノ末端が軽いトリプシン消化によっ
て除去されている（B.B.Koening et al.,Molecular and
Cellular Biology,14:5961−5974（1994））。

ここで用いられるように、本発明の受容体タンパク質
または該タンパク質をコード化するDNA配列に関連して
“単離した（isolated）”は、タンパク質またはDNA配
列が自然に生ずる複合体細胞環境から該タンパク質また
はDNA配列を除去することを意味し、また該タンパク質
は適当な調節配列を操作可能なようにして結合した場合
に自然に発現することがない細胞内の前記DNAから発現
可能である。

ここで用いられるように、ユーザがアミノ酸または核
酸配列のいずれか一方を定義する際に用られる“実質的
に類似（substantially similar）”とは、特定の対象
配列、例えば突然変異誘起によって変えられた配列、一
つ以上の置換、欠失、または付加による参照配列からの
変異を意味するものであって、正味の効果としてはBRK
−３タンパク質の生物学的活性を保持することである。
あるいは、DNA列が遺伝子コードのなかの縮重の結果と
して参照アミノ酸配列に実質的に類似したアミノ酸配列
をコード化するとした場合、核酸配列および類似体はこ
こに開示される特定のDNA配列に対して”実質的に類
似”するものである。さらに、“実質的に類似”とは、
BRK−３タンパク質またはBRK−３のタンパク質配列由来
のペプチドに対して産生した抗体と受容体タンパク質が
反応することを意味する。

ここで用いられるように、“生物学的に活性”とは、
特定の分子が検出可能な量からなるBMP−２またはBMP−
４に対する結合能を持つようにここで開示される本発明
の実施態様に対して十分なアミノ酸配列相同性を共有す
ること、例えば雑種受容体構成を意味する。好ましく
は、本発明の範囲に含まれる生物学的活性を有するBRK
−３受容体複合体は、受容体タンパク質キナーゼ複合体
がナノモルまたは準ナノモルの親和性（Kdは10^-9Mにほ
ぼ等しい）でもって［¹²⁵I］−BMP−４に対する結合能
を持つ。好ましくは、親和性は約１×10^-12Mないし１×
10^-9Mであり、Kdの値が10^-12M未満であるおうな結合部
位の部分を持つ。

ここで用いられるように、“操作可能に結合（operab
ly linked）”は、直線状DNA配列の部分は同一直線状DN
A配列の他の部分の活性を影響を及ぼすことを意味す
る。例えば、単一ペプチド（分泌リーダー）のDNAは、
あるポリペプチドの分泌に関係する前駆体として発現す
る場合、該ポリペプチドに操作可能に結合する。プロモ
ータは、あるコード配列の転写を制御するものである場
合、該コード配列に操作可能に結合する。または、リボ
ソーム結合部位は、翻訳を許すように位置する場合、コ
ード配列に操作可能に結合する。いっぺんに、操作可能
に結合は、分泌リーダーの場合、切れ目なく連続したも
の（contiguous）、またリーディング・フレームにおい
て切れ目なく連続したものである。

ここで用いられるように、“ATCC"は米国メリーラン
ド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（Americaion Type Culture Collection）を
意味する。

ここで“骨形態形成タンパク質2"または“BMP−2"はA
TCC No.40345に含まれるDNA配列によってコード化され
るペプチドを意味する（ATCC/NIHREPOSITORY CATALOGUE
OF HUMAN AND MOUSE DNA PROBES AND LIBRARIES,6版、
1992の57頁を見よ。以下、この文献を“ATCC レポジト
リ・カタログ”とする）。BMP−２の単離は、Wang,Wozn
eyおよびRosenの米国特許第5,013,649号（1991年５月７
日発行）、Wang,WozneyおよびRosenの米国特許第5,166,
058号（1992年11月24日発行）、HammondsおよびMasonの
米国特許第5,168,050号（1992年12月１日発行）に開示
しれており、本願ではこれらの文献を援用する。

ここで用いられているように、“骨形態形成タンパク
質4"または“BRK−4"は、ATCCNo.40342（"ATCC レポジ
トリ・カタログ”を見よ）を含むDNA配列によってコー
ド化されたペプチドを意味する。BMP−４の単離は、Wan
g,WozneyおよびRosenの米国特許第5,013,649号（1991年
５月７日発行）に開示されており、本願ではこの文献を
援用する。

ここで用いられているように、“骨形態形成タンパク
質7"または“BRK−7"は、ATCCNo.68020およびATCC68182
（“ATCCレポジトリ・カタログ”を見よ）を含むDNA配
列によってコード化されたペプチドを意味し、ATCC6818
2のなかのcDNAはBMP−７タンパク質をコード化に必要な
核酸配列すべてを含むものであるとクレームされてい
る。BMP−７の単離は、Rosenらの米国特許第5,141,905
号（1992年８月25日発行）に開示されており、本願では
この文献を援用する。

ここで用いられるように、“DNA配列”は、別々のフ
ラグメントの形状で、あるいはより一層大きなDNA構成
の一構成要素としてあるDNAポリマーに対して言及する
ものであり、実質的に純粋な形状で、すなわち内因性物
質によるコンタミがなく、また該配列およびその構成核
酸配列の同定、操作、および回収を可能とする程度の量
または濃度で、標準的な生化学的方法、例えばクローニ
ング・ベクターを用いることによって、少なくとも一度
は単離されたDNA由来のものである。そのような配列
は、好ましくは真核細胞の遺伝子に典型的に存在する内
部非翻訳配列（イントロン）によって妨害されないオー
プン・リーディング・フレームの形状で提供される。関
連配列を含むゲノムDNAも用いることが可能である。非
翻訳DNAの配列はオープン・リーディング・フレームか
ら５′または３′側に存在してもよく、コード領域の操
作または発現を妨害するものである。この発明によって
提供されるタンパク質をコード化するDNA配列は、cDNA
フラグメントおよび短いオリゴヌクレオチド・リンカ
ー、あるいは一連のオリゴヌクレオチドから組み立てる
ことができ、それによって組み換え転写ユニットにおい
て発現する。

ここで用いられるように、“組み換え体”は、イン・
ビトロで操作され、かつ宿主組織に導入されるDNA配列
である。

ここで用いられるように、“微生物の（microbia
l）”は、細菌、菌類（例、酵母）、または昆虫の発現
系によって作られた組み換え体タンパク質に言及するも
のである。

ここで用いられるように、“組み換え体発現ベクタ
ー”は所望のタンパク質（例えば、BRK−３）をコード
化するDNAを発現するのに用いられるDNA構成に言及する
ものであり、さらにそのDNAは、（１）遺伝子発現にお
いて調節的な役割を担う遺伝子成分、例えばプロモータ
およびエンヘンサー、（２）mRNAに転写され、かつタン
パク質に翻訳される構造配列またはコード配列、さらに
（３）適当な転写および翻訳開始および終了配列からな
るアセンブリを持つ転写サブユニットを含む。当業者に
既知の方法を用いることによって、本発明の組み換え発
現ベクターを構成することができる。本発明において適
用可能なベクターとしては、限定されるものではない
が、ほ乳類動物の細胞については、pJT4（後述する）、
pcDNA−１（Invitrogen,San Diego,Ca）およびpsV−SPO
RT 1（Gibco−BRL,Gaithersburg,MD）、昆虫の細胞につ
いては、pBLueBac IIIまたはpBlueBacHisバキュロウィ
ルス（Invitrogen,San Diego,CA）；さらに細菌細胞に
ついては、pET−３（Novagen,Madison,WI）である。本
発明のBRK−３受容体タンパク質キナーゼをコードするD
NA配列は、調節因子に操作可能に結合したベクターに存
在することができる。

本発明は、BMP受容体キナーゼ・タンパク質BRK−３を
コードするDNA配列を含む発現ベクターとＩ型BMP受容体
キナーゼ・タンパク質をコードするDNA配列を含む発現
ベクターとの宿主細胞同時トランスフェクションに関す
る。一実施態様によれば、BRK−３タンパク質の発現ベ
クターは、ｈ−BRK−３受容体タンパク質をコードするD
NA配列、またはその可溶性あるいは不完全なフラグメン
トを含む（DNAはゲノムDNAまたはcDNAである）。好まし
くは、ｈ−BRK−３タンパク質は核酸配列識別番号１に
よって好ましくはコードされ、その可溶性フラグメント
は配列識別番号５によって好ましくはコードされ、さら
に不完全なフラグメントは配列識別番号23によって好ま
しくはコードされる。他の実施態様では、BRK−３タン
パク質の発現ベクターは、ｔ−BRK−３タンパク質をコ
ードするDNA配列を含む（DNA配列はゲノムDNAまたはcDN
Aである）。好ましくは、DNA配列は配列識別番号３であ
る。他の実施態様では、BRK−３タンパク質の発現ベク
ターは、ｍ−BRK−３ンパク質、またはその可溶性ある
いは不完全なフラグメントである（DNA配列はゲノムDNA
またはcDNAである）。好ましくは、ｍ−BRK−３タンパ
ク質はDNA配列の配列識別番号７によってコードされ、
可溶性フラグメントはDNA配列の配列識別番号９によっ
てコードされ、さらに不完全なフラグメントはDNA配列
の配列識別番号25によってコードされる。

本発明の好ましい実施態様では、本発明の宿主細胞は
プラスミド構成pJT6−mBRK−3Lと、プラスミド構成pJT4
−J159F［BRK−１］あるいはプラスミド構成pJT3−BRK
−２［BRK−２］とによって同時トランスフェクション
するので、mBRK−３とBRK−１、あるいはｍ−BRK−３と
BRK−２との同時トランスフェクションが起こる。他の
好ましい実施態様では、本発明の宿主細胞は、プラスミ
ド構成pJT6−mBRK−3Sとプラスミド構成pJT4−J159F［B
RK−１］またはプラスミド構成pJT3−BRK−２［BRK−
２］とによって同時トランスフェクションするので、mB
RK−３とBRK−１、あるいはｍ−BRK−３とBRK−２との
同時トランスフェクションが起こる。他の好ましい実施
態様によれば、ほ乳類宿主細胞は、プラスミド構成pJT4
−hBRK3Tとプラスミド構成pJT6−J159F［BRK−１］また
はプラスミド構成pJT3−BRK−２［BRK−２］とによって
同時トランスフェクションするので、ｔ−BRK−３とBRK
−１、あるいはｔ−BRK−３とBRK−２との同時トランス
フェクションが起こる。組み換え分子によるトランスフ
ェクションは当業者に既知の方法を用いて行うことがで
きる。

ここで用いられるように、“宿主細胞”は本明細書に
記載された組み換え体発現ベクターを含む細胞を意味す
る。宿主細胞は、組み換え体発現ベクターのなかで、ま
たは組み換え体ウイルス・ベクターによって感染される
ことによって、安定にトランスフェクション、あるいは
一過性にトランスフェクションしてもよい。宿主細胞と
いては、原核細胞、例えば大腸菌（Escherichia col
i）、酵母（Saccharomyces cerevisiae）のような真菌
系統、sf−９およびsf−21等の昆虫由来半永久的細胞系
統、およびチャイニーズ・ハムスター卵巣（CHO）およ
びSV40によってトランスフェクションしたアフリカ緑サ
ル腎臓細胞（COS）のような半永久的動物細胞系統が挙
げられる。

一実施態様では、本発明はBMP受容体キナーゼ・タン
パク質に結合することが可能な化合物を同定するのに好
適な方法に関する。他の実施態様では、本発明は臨床試
料中のBMP受容体リガンド（例えば、BMP−２、BRK−
４、またはBMP−７、またはいままで同定された他のBMP
受容体リガンド）濃度を決定するのに好適な方法に関す
る。これらの方法のいずれも、予測リガンドまたは既知
のリガンドを含む試料をBMP受容体キナーゼ・タンパク
質複合体に取り込む。この図様態複合体はＩ型BMP受容
体キナーゼ・タンパク質およびBMP受容体キナーゼ・タ
ンパク質BRK−３からなる。好ましくは、BRK−３受容体
キナーゼ・タンパク質はアミノ酸配列の配列識別番号２
を持つｈ−BRK−３、またはアミノ酸配列配列識別番号
６を持つその可溶性タンパク質、またはアミノ酸配列識
別番号24を持つその不完全なフラグメントである。ま
た、好ましくは受容体タンパク質ｍ−BRK−３はアミノ
酸配列識別番号８を有するものであり、またはアミノ酸
配列識別番号10を持つものであり、あるいはアミノ酸配
列識別番号26を持つ不完全なフラグメントである。ま
た、好ましくは受容体タンパク質ｔ−BRK−３はアミノ
酸配列識別番号４を持つ。

例えば、試料中のBMP濃度は放射線受容体アッセイに
よって決定することができる。このアッセイでは試料中
の未標識PMPは、BRK−３受容体複合体に対する結合にお
いて標識トレーサーBMPと競合する。試料中のBMP量が増
加すると、BRK−３とＩ型受容体とを含む受容体タンパ
ク質複合体に結合することが可能である標識BMPの量が
減少する。未標識BMPの既知濃度によって調製した標準
曲線と比較することによって、試料中のBMP濃度の正確
な定量が可能となる。トレーサーBMPの標識は、好まし
くは［¹²⁵I］Nalによるヨード化によって行われる。Ｉ
型BMP受容体キナーゼも外膜中で発現する安定の細胞系
統として、可溶性Ｉ型受容体フラグ面を有する溶液中の
可溶性フラグメントとして、あるいは固相に共有結合し
たＩ型受容体と一緒に使われる固相に共有結合した可溶
性フラグメントとして提供される。アッセイを実行する
ために、試料由来の未標識BMPおよび標識トレーサーBMP
は、平衡に達するまで受容体への結合について競合す
る。つぎに、受容体−BMP複合体を遊離リガンドから単
離する。単離方法としては、洗浄（粘着性細胞系統の場
合）、急速なろ過または遠心（非粘着性細胞系統または
固相に結合した受容体）、あるいは抗体、ポリエチレン
・グリコール、または他の析出剤によって受容体−リガ
ンド複合体を沈殿させ、つづいてろ過または遠心する
（可溶性受容体の場合）ことが挙げられる。つぎに、複
合体中の標識BMPの量を、一般にガンマ線計数によって
定量し、既知の標準値と比較する。これらの方法は他の
受容体を用いた文献に記載されている（M.Williams,Me
d.Res.Rev.,11:147−184（1991）;M.Higuchi and B.B.A
ggarwal,Anal.Biochem.,204:53−58（1992）;M.J.Cain,
R.K.Garlick and P.M.Sweetman,J.Cardiovasc.Pharm.,1
7:S150−S252（1991）；各文献を本明細書で援用す
る）。また、これらの方法は容易に本発明のBRK−3/BMP
系に適用される。そのような放射線受容体アッセイは臨
床試料中に含まれるBMPの定量を必要とする診断目的に
用いることができる。

本発明の方法は、Ｉ型BMP受容体キナーゼ・タンパク
質と複合体を形成するBRK−３、あるいは相同な受容体
タンパク質への結合能を持つ化合物を同定するスループ
ットの高いスクリーニングにも有効である。そのような
方法では、BRK−3/I型複合体に対する化合物のより一層
高い親和性が得られれば、複合体への結合に対してトレ
ーサーとの競合がより一層効率的となり、さらに受容体
−リガンド複合体の計数が低くなる。この場合、同一濃
度範囲で一連の化合物を比較し、もっとも高い親和性で
もって受容体結合するかどうかを比較する。

本発明は、既知のリガンドあるいは予測したリガンド
が本発明のDNA分子によってコード化された受容体に結
合、および（または）該受容体を活性化することができ
るかを決定するのに有益である。前記DNA配列が本明細
書に記述した細胞系統にトランスフェクションすること
は、単離DNA分子によってコード化された受容体複合体
に結合および（または）活性化するリガンドの能力につ
いてのアッセイ系を提供する。本明細書で記述したよう
な組み換え体細胞系統は、放射活性、分光学的、または
他の試薬によって標識される既知の、あるいは候補の薬
剤またはリガンド間での競合結合アッセイにおいて生細
胞培養として有益である。トランスフェクションした細
胞から単離した受容体を含む膜試料もまた競合結合アッ
セイに用いる。受容体のリガンド結合ドメイン由来の可
溶性受容体もまた薬物候補の高スループット・スクリー
ニングに用いることができる。細胞内情報伝達の機能性
アッセイは、受容体機能の活性化において結合親和性お
よび有効性のアッセイとして作用することができる。さ
らに、組み換え細胞系統はレポーター遺伝子を含むもの
として修飾してもよい。このレポーター遺伝子は、受容
体がレポーター遺伝子をスイッチ・オンすることによっ
て信号が送られるように、レスポンス因子に操作可能に
結合する。そのような系は、受容体アゴニストの同定を
目的とした高スループット・スクリーニングで特に有用
である。これらの組み換え体細胞系統は、“薬物発見系
（drug discovery systems"を構成し、薬物開発にとっ
て可能性のある天然または合成化合物の同定に有用であ
る。そのような同定された化合物を、さらに修飾して、
あるいはそのまま直接に治療用化合物として用いること
によって単離DNA分子によってコード化された受容体の
本来の機能を活性化あるいは阻害することができよう。

本発明の可溶性受容体タンパク質複合体は、投与を腹
腔内、筋肉内、静脈内、または皮下注射、移植、または
経皮モード等による方法を用いて臨床セッティングに投
与することができる。そのような投与は、BMP活性の治
療上の変更を与えるものと期待される。

本発明に開示された配列識別番号３および配列識別番
号１の核酸配列は、それぞれｔ−BRK−３およびｈ−BRK
−３をコードするDNAの配列を表すもので、これらはヒ
ト皮膚線維芽細胞から単離される。また、配列識別番号
７はマウスMIH3T3細胞由来のｍ−BRK−３受容体タンパ
ク質をコードするDNA配列を表す。これらの配列を用い
て、ラット、ウサギ、ショウジョウバエ（Drosophila）
およびアフリカツメガエル（Xenopus）等の他の種からB
RK−３のcDNAを容易に得ることができよう。これらの配
列は、マウスや上記した他の種由来で、かつＩ型受容体
との複合体にBMPを結合させることが可能な他のII型BMP
受容体に対するcDNAを得ることにも容易に用いることが
できる。これらのcDNA配列はBRK−３のゲノムDNAを単離
することに容易に用いることができる。このことは、受
容体遺伝子発現を制御する調節因子の分析を可能とする
もので、治療上のインターベンションや病気の診断に新
たな機会を提供するものとなろう。上記の核酸配列は、
正常な組織および病気の状態にある組織におけるBRK−
３受容体の分布を決定することにも有用であり、これに
よってイン・ビボにおける物理的役割の評価が可能とな
る。

本発明は、さらに試験化合物がBMP受容体タンパク質
複合体への結合に対する信号を生成するかどうかを決定
する方法に関する。そのような方法では、タンパク質リ
ン酸化アッセイにおいてBMP受容体タンパク質複合体を
使用する。タンパク質リン酸化アッセイは、当業者に一
般的に知られているものである。Hardie,D.G.,"Protein
Phosporylation A Practical Approach",IRL Press:Ox
ford,New York,Tokyo,（1993）を本願では援用する。こ
の文献は、リン酸化アッセイの概要を提供するものであ
る。試験化合物がBMP受容体タンパク質複合体への結合
に対する信号を生成するかどうかを決定する方法は、
（ａ）BMP受容体キナーゼ・タンパク質BRK−３をコード
するDNA配列とＩ型BMP受容体キナーゼ・タンパク質をコ
ードするDNA配列とによってトランスフェクションして
いるBMP受容体タンパク質複合体発現細胞を32Pによって
標識する工程と、（ｂ）（ｉ）試験化合物存在下での前
記細胞の第１の組の培養と、（ii）試験化合物不存在下
での細胞の第２の組の培養とを行う工程と、（ｃ）工程
（ｂ）によって生じたリン酸化タンパク質をオートラジ
オグラフィーを介して定量する工程と、（ｄ）工程
（ｃ）によって定量された細胞の第１の組のリン酸化タ
ンパク質の量を、前記工程（ｃ）によって定量された細
胞の第２の組の前記リン酸化タンパク質の量と比較する
工程とを有する。

本発明の好ましい実施態様を説明することを目的とし
て、以下の非限定的な実施例を詳細に議論する。

実施例１ PCRフラグメントの生成 TGF−βタイプIIレセプタに関連したタイプIIレセプ
タのPCRフラグメントを生成するために、図１に示すプ
ライマをTGF−βタイプIIレセプタのキナーゼ・ドメイ
ンから設計する。PCRの第１ラウンドでは、キナーゼ・
ドメインII由来のTSK−１とキナーゼ・ドメインVIII由
来のTS−２とをプライマとする。テンプレートDNAは、
月齢９ヶ月の男子から得たヒト皮膚線維芽細胞から単離
したmRNAから調製したcDNAからなる。PCR反応は、約0.2
μｇのテンプレートDNA、15μＭのプライマTSK−１およ
びTSK−２、各々が0.2mM濃度である全４種類のデオキシ
ヌクレオチドのストック、15μＭのThermus thermophil
us由来DNAポリメラーゼ（以下、Tthポリメラーゼ）（東
洋紡、大阪、日本）、さらにTthポリメラーゼ用反応溶
液（東洋紡、大阪、日本）を含む全容量50μｌ中で行
う。最初の溶解時間（94℃、１分間）後、以下のような
温度周期を35回繰り返す。すなわち、一周期は、92℃、
４秒間の溶解、48℃、40秒間のアニーリング、および75
℃、90秒間のエクステンションからなる。35周期を繰り
返した後、さらに75℃、５分間で反応させることによっ
てエクテンションを完了する。

いくつかのバンドを増幅した。このなかのいくつか
は、TGF−βタイプIIレセプターにたいして相同のタイ
プIIレセプターの予測された配列の長さに一致する470
塩基対（bp）の領域にある。したがって、この範囲の大
きさの断片を、製造元の取扱説明書にもとづいてQIAEX
（Quiagen,Chatsworth,CA;DNA断片ゲル精製用キット、
活性シリカ球体および緩衝体を含む）を用いてアガロー
ス・ゲルから回収する。つぎに、容量20μｌのTE溶液
（10mM Tris、pH 8.0、1mMのEDTA）に再懸濁した。

TBF−βタイプIIレセプターに関係しないcDNAから増
幅された断片によるバックグラウンドを抑えるために、
第２ラウンドのPCRは、第１ラウンドで増幅された470bp
内に位置したTGF−βタイプIIレセプタの保存領域にも
とづく“ネストされた（nested）”プライマーを用いて
実行される。ネストされたプライマーは、TGF−βタイ
プIIレセプターのキナーゼ・ドメインから誘導されたAV
R−５、およびキナーゼ・ドメインVIBから誘導されたTS
K−４である。鋳型は、第１ラウンドのPCRから単離され
たPCR断片の既知量（0.5μｌ）からなる。これをプライ
マーAVR−５（５μｌ）およびTSK−４（15μＭ）、４種
類のデオキシヌクレオチド（それぞれ0.2M）、1.5単位
のTthDNAポリメラーゼ、およびTthDNAポリメラーゼ用反
応緩衝液からなる全容量が50μｌの溶液に加えた。PCRn
o第１ラウンドについて記載したようにして、温度周期
プログラムを正確に実行した。PCR反応産物のアガロー
ス・ゲル電気泳動によって、予想したように300bpの範
囲内にあるバンドの増幅が観察された。この断片をQIAE
Xを用いて単離する。

第2PCR反応のPCR産物をサブクローン化するために、
精製した断片をポリヌクレオチド・キナーゼを用いてリ
ン酸化し、事前にSma Iで切断してあるクローニング・
ベクターpGEM72f（＋）（Promega,Madison,WI）に連結
させた後、脱リン酸化した。連結混合物を用いて大腸菌
（E.coli）XL1−Blue（Stratagene,La Jolla,CA）を形
質転換した。形質転換混合物をイソプロピル−β−Ｄ−
チオガラクトシド（IPTG）および５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ga
l）を含む寒天上で平板培養した。青色を欠いたコロニ
ーを得ることができた。このことは挿入片の存在を示し
ている。これらのコロニーを選択してプラスミドDNAを
調製した。候補プラスミドのうち、HAK7−１、HSK7−
２、およびHSK7−４と呼ばれる３種類のプラスミドが予
想された大きさ（300bp）の挿入片を有することがわか
った。挿入片の塩基配列決定を行うと、HSK7−２の300b
p挿入片は、新規キナーゼの一部をコードするという知
見が得られた。この新規キナーゼは、TGF−βレセプタ
ー・スーパーファミリの新規メンバーと予想される。し
たがって、HSK7−2PCR断片を完全な長さのレセプター・
クローンを単離するためのプローブとして用いる。

実施例２ ヒトｔ−BRK−3cDNAの単離 HSK7−２の300bp挿入片に対応するcDNAを配置するた
めに、PCR断片を単離するために用いられる同一mRNAか
ら、cDNAライブラリーを構築する。このことは、スーパ
ースクリプト・チョイス・システム（SUPERSCRIPT Choi
ce System）（Life Technologies,Gaithersburg MD;cDN
A合成用キットで、プライマー、アダプター、スーパス
クリプトIIRNアーゼＨ−逆転写酵素（Life Technologie
s,Gaithersburg MD;モロニー白血病ウイルス由来逆転写
酵素の修飾形）、ヌクレオチド、緩衝液、およびゲル濾
過カラムが含まれる）を用い、180単位のRNアーゼ（タ
カラ、京都、日本）を第１の鎖合成に添加する以外は製
造元の取扱説明書にもとづいて達成される。鋳型は月齢
９ヶ月の男子から得たヒト皮膚線維芽細胞由来のmRNA
（４μｇ）である。第１および第２鎖合成後、合計４μ
ｇのcDNAが得られる。つづいて、内部Not IおよびSal I
部位を持つEcoR Iアダプタ（キットに付属）を添加す
る。つぎに、EcoR I−適合cDNAをリン酸化し、つづいて
キットに付属のゲル濾過カラムを用いて、製造元の取扱
説明書にもとづいてサイズによる分画を行う。

大きさによって分画されたcDNAをファージλgt10のEc
oR I部位に結合させ、ギガパックII（GIGAPACK II）ゴ
ールド・パッケージング・エクストラクト（Stratagen
e,La Jolla,CA;λファージにcDNAライブラリーを効率よ
く構築する制限マイナス・インビトロ・パッケージング
・エクストラクト）を用い、かつ製造元の取扱説明書に
もとづいてインビトロでパッケージングする。

ライブラリを10枚のハイボンド（HYBOND）ナイロン・
メンブレン（Amersham,Arlington Heights,IL;ナイロン
・メンブレンは核酸の固定に最適化されている）で、１
×10⁵プラーク／フィルタの密度でもってスクリーング
する。HSK7−２から得たインサートをマルチプライム
（MULTIPRIME）DNAラベリング・システム（Amersham,Ar
lingtonHeights,IL;DNAのランダム・プライマー・ラベ
リング用キットで、クレノーDNAポリメラーゼ、プライ
マー、および緩衝液を含む）を用いて、製造元の取扱説
明書にもとづいて行う。50％ホルムアルデヒド、6xSSPE
（1xSSPE＝0.14M NaCl、8mMりん酸ナトリウム、0.08mM
EDTA、pH7.7）、5xDenhardt's溶液（1xDenhardt's溶液
＝0.02％フィコール400、0.02ポリビニルピロリドン、
0.02％BSA）、0.5％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、
および100μg/ml変性サケ精子からなる溶液中、42℃、1
2時間、DNA標識プローブをライブラリ・フィルタにハイ
ブリダイズさせる。ブロットを2XSSPE、0.1％SDS中、室
温（それぞれ15分間）で３回洗浄し、続いて42℃で１時
間洗浄した。

スクリーニングを３回行った後、３つの独立したクロ
ーンが得られた。これらのクローンのうち、HSK723と命
名された一つクローンがHSK7−２インサートと同様の配
列をコードすることがわかった。このクローンの完全な
DNA配列を得た。このクローン由来のcDNAをｔ−BRK−３
と呼ぶ。

実施例３ ｔ−BRK−３シークエンス解析 このｔ−BRK−３クローンのDNAシークエンスを配列識
別番号３に示す。また、ｔ−BRK−３の推論されたタン
パク質シークエンスを配列識別番号４に示す。クローン
HSK723由来のｔ−BRK−３オープン・リーディング・フ
レームは、少なくとも583個のアミノ酸からなるタンパ
ク質をコードする。HSK723 cDNAの３′領域のフレーム
内に位置する停止コドンは認められず、このクローンは
３′末端が不完全であることを示している。したがっ
て、ｔ−BRK−３と呼ぶ。

配列識別番号４に示すｔ−BRK−３の推論されたタン
パク質シークエンスを、標準Needleman−Wunschアルゴ
リズム（S.B.Needleman and C.D.Wunsch,J.Mol.Biol.4
8:4335−453（1990））を用いて、1994年８月15日付ジ
ーンバンク・リリース（GenBank Release）84.0にある
翻訳されたタンパク質シークエンスのすべてについてサ
ーチした結果、新規のシークエンスであることがわかっ
た。

予測されたタンパク質シークエンスの解析によって、
TGF−βタイプIIスーパファミリ・メンバー・トランス
メンブラン・セリン／スレオニン・キナーゼであること
が明らかになった。予測された単一トランスメンブレン
領域は、配列識別番号４の残基151−172を包囲する。３
つの潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位が予測された細胞
外ドメインのアミノ酸残基55,110,および126に存在す
る。配列識別番号４アミノ酸残基116−123は、“システ
イン・ボックス”と呼ばれるシステイン残基からなるク
ラスタが含まれる。このクラスタは、TGB−βスーパー
ファミリのリガンドに対する受容体としての特徴を有す
る。ｔ−BRK−３のシスティン・ボックスは、BMP−２お
よびBMP−４に対するDAF−４タイプIIレセプタのシステ
イン・ボックスと８個のアミノ酸残基のうち６個が一致
する。しかし、細胞外ドメインのDAF−４に対するｔ−B
RK−３の全体的な配列同一性はたったの7.1％である。

ｔ−BRK−３の予測された細胞質内領域のアミノ酸200
−504（配列識別番号４）はすべての共通配列を含むも
ので、該共通配列はセリン／スレオニン残基に対する予
測された特異性を持つプロティンキナーゼを特徴づける
ものである（S.K.Hanks,A.M.Quinn,and T.Hunter,Scien
ce,241:42−52（1988））。

実施例４ ｔ−BRK−3,BRK−1,BRK−2,およびDAD−４のための発現
ベクターの構成 哺乳類動物細胞内でｔ−BKR−３を発現させるため
に、一時的発現を意図してそれをベクターpJT4内にサブ
クローン化する。COS細胞内での一時的発現に最適化さ
れたpJT4ベクターは、非常に効率的なメッセージの転写
を行わせるサイトメガロウイルスの初期プロモータおよ
びエンハンサー；発現レベルをよりいっそう高めるヒト
Ｔ−細胞白血病ウイルス−１の長い末端反復由来の"R"
因子；メッセージの安定性を強化すると考えられている
SV40由来のイントロン・スプライシング部位；多重クロ
ーニング部位；ほとんどの真核mRNAに必要とされるpoly
A尾部をメッセージに加えるように命令するSV40由来ポ
リアデニル化シグナル；およびSV40ラージＴ抗原を含む
細胞、例えばCD細胞にプラスミドを複製し、かつ非常に
多くのコピー数とするSV40複製開始点を含む。また、細
菌内でベクターの操作および増幅を行うために、ベクタ
ーはE.coliの複製開始点およびアンピシリン耐性遺伝子
を有するものとする。pJT4への切断ヒトBRK−3cDNAの挿
入は以下のように行う。

キナーゼ・ドメインの３′領域に停止コドンが認めら
れないので、PCRを実施して停止コドンを挿入してタン
パク質の翻訳を可能とする。したがって、PCRプライマ
ーは配列識別番号３のヌクレオチド2028の後に２つの停
止コドンを挿入するように設計され、配列識別番号４の
イソロイシン540の後でキナーゼを終結させる。このこ
とは、アクチビンII型レセプターの長さに一致するよう
に選択される（L.S.Mathews and W.V.Vale,Cell,65:973
−982（1991））。したがって、キナーゼ・ドメインの
適当な折りたたみに十分でなければならない。停止コド
ンの後にKpn I部位が続く。プライマーの完全な配列
（配列識別番号３のヌクレオチド2013−2028の逆転相補
部分を含む）は、５′ACG CGG TAC CTC ACT AAA TTT TT
G GCA CAC GC ３′である。第２のプライマーは、Alf
III部位（配列識別番号３のヌクレオチド1618−1637）
の領域にあるｔ−BRK−３配列に正確に一致するように
設計され、５′GTA GAC ATG TAT GCT GTT GG3′配列を
有する。反応のためのテンプレートは実施例２に記載し
たクローンHSK723であり、BLUESCRIPT II SK（＋）（St
tratagene,La Jolla,CA;pUC19来の2.96bpコロニー産生
ファージミド）内のｔ−BRK−３に対するcDNAを含む。

PCRは、アンプリタク（AMPLITAQ）DNAポリメラーゼを
有する遺伝子増幅PCRット（GENE AMP PCR Kit）（Perki
n Elmer,Norwalk,CT;ポリメラーゼ鎖反応を用いたDNA増
幅に必要な材料を含むキットであり、AMPLITAQ、Thermu
saquaticus由来DNAポリメラーゼの組換え修飾形態、ヌ
クレオチド、および緩衝液を含む）を用いて、製造元の
取扱説明書にもとづいて、遺伝子増幅（GENE AMP）PCR
システム9600サーモサイクラー（Perkin Elmer,Norwal
k,CT）を使用して実行する。95℃で５分間、最初の溶解
を行い、つづいて95℃、１分間の熱変性、50℃、１分間
のアニーリング、および72℃、１分間の伸長からなるプ
ログラムを20回繰り返す。

予想サイズが400bpである増幅されたバンドをアガロ
ース・ゲルから単離し、Afl IIIおよびKpn Iによって消
化する。一方、ｔ−BRK−３のcDNAをEco R VおよびAfl
IIIによって消化し、さらにベクターpJT4をEco R Vおよ
びKpn Iによって消化する。これら単離された３種類の
断片を一段階で結合し、図２に示すpJT4−hBRK3Tを構成
する。PCRの実施中にエラーが生じていないことを確か
めるために、Afl IIIから３′末端のKpn I部位にかけた
領域を、タク・ダイ・デオキシ（TAQ DYE DEOXY）ター
ミネータ・サイクル・シークエンシング・キット（Appl
ied Biosystems,Foster,CA;ジデオキシ・ターミネータ
・メソッドを用いて自動DNA列決定を行うための材料と
して、AMPLITAW、ヌクレオチド混合物、色素標識ジデオ
キシヌクレオシド・ターミネータ、および緩衝液）およ
びアプライド・バイオシステムズ373A自動DNA配列決定
装置（Applied Biosystems Model 373A Automated DNA
Sequencer）を用いて配列決定した。

ｔ−BRK−３とＩ型BNPレセプタとの同時発現の効果を
判断するために、ｔ−BRK−3 cDNAをBRK−１のcDNAまた
はBRK−２のcDNAとともに同時発現させる必要がある。
マウスBRK−１に対するDNA配列を配列識別番号11に示
す。マウスBRK−１に対する演繹されたアミノ酸配列を
配列識別番号12に示す。ニワトリBRK−２に対するDNA配
列を配列識別番号13に示す。また、ニワトリBRK−２に
対する演繹されたアミノ酸配列を配列識別番号14に示
す。

BRK−１を哺乳類動物細胞で発現させるために、プラ
スミドpJT4−J159Fを用いる。このプラスミドの構成
は、1993年11月24日にクーク（Cook）によって出願され
たU.S.S.N 08/158,755と、B.B.コーニング（Koeing）ら
の文献:Molecular and Cellelar Biology 14:5961−597
4（1994）に開示されており、すなわちATCC 69457であ
る。簡潔に言うと、BLUESCRIPT SK（−）にサブクロー
ン化されたBRK−1 cDNAを制限酵素Alf IIIで直線化し、
DNAポリメラーゼＩクレノウ・フラグメントを用いて張
り出した末端の割れ目を防ぐ。つぎに、直線化されたプ
ラスミドをNot Iで消化することによって、プラスミド
からインサートが遊離される。このインサートをNot I
およびEcoR V部位でpJT4発現ベクターにサブクローン化
する。クレノウ反応によって生じた平滑末端は、同様に
平滑末端であるEcoR V部位と適合し、ライゲーションに
よってEcoR V部位が除去される。構成pJT4−J159Fを図
３に示す。

哺乳類細胞でBRK−２を発現させるために、そのcDNA
をベクターpJT3にサブクローン化する。このベクター
は、この実施例で記載されたpJT4と以下の点を除いて同
一である。すなわち、多重クローニング部位の配向は逆
であり、該多重クローニング部位の５′末端に別のNot
I部位が存在している点が異なる。、ベクターpRC CMV
（Invitrogen,San Diego,CA;哺乳類細胞発現ベクター）
で当初得られたBRK−２のcDNA（S.Sumitomo,et al.,DNA
Sequence,3:297−302（1993））を、Kpn IおよびXho I
による消化によって切断する。それをKpn IおよびXho I
部位でpJT3にサブクローン化する。これによってBRK−
２の５′末端にKpn I部位が再生され、一方Xho Iおよび
Sal I部位が破壊される。生じた構成をpJT3−BRK−２と
し、それを図４に示す。

Caenorhabditis elegans（M.Estevez,L.Attisan,J.L.
Wrana,P.S.Albert,J.Massague,and D.L.Riddle,Nature,
365:644−９（1993））由来のII型BMPレセプターである
DAF−４を哺乳類細胞で発現させるために、cDNAをBLUES
CRIPT II内に獲得し、以下のようにしてpJT4内にサブク
ローン化する。daf−4 cDNAを含む2.4kbフラグメントDr
a IおよびApa Iによる消化によって切断する。このフラ
グメントをSma IおよびApa I部位でサブクローン化す
る。これによってApa I部位が再生され、一方Dra Iおよ
びSma I部位が破壊される。生じた構成をpJT4−Daf4と
し、それを図５に示す。

ｍ−BRK−３の哺乳類細胞での発現は、後述の実施例1
0を見よ。

実施例５ 哺乳類でのｔ−BRK−3,BRK−1,BRK−2,およびDAF−４の
発現 エレクトロポレーションを利用してCOS−７細胞（ATC
C CRL 1651）内で、あるいはDEAEデキストラン（Pharma
cia Biotech,Piscataway,NJ）を利用してCOS−１細胞
（ATCC CRL 1650）内で、pJT4−hBRK3Tを用いた哺乳類
細胞でのBRK−３の一時的発現を実施する。

COS−７細胞を、10％ウシ胎児血清（Hyclone,Logan,U
tah）、非必須アミノ酸（GIBO,Gaithersburg,MD）、お
よびグルタミンを添加したダルベッコ修正イーグル（Du
lbecco's Modified Eagle:DME）高グルコース培養液中
で増殖させ、トリプシン処理を施すことによってプレー
トから細胞を遊離させる。遊離したCOS−７細胞を卓上
遠心器でペレット状にした後、新鮮な培養液に6.25×10
⁶細胞/mlで再懸濁する。細胞懸濁液（５×10⁶細胞、0.8
ml）をバイオラッド・ジーン・パルサー（BioRad GENE
PUSER）エレクトロポレーション・システム（BioRad,He
rcules,CA）のキュベットに移す。興味あるレセプターD
NA（pJT4−J159FおよびpJT3−BRK2の場合は10μｇおよ
び／またはpJT4−hBRK3T）が含まれる精製プラスミドを
キュベットに添加し、細胞をキャパシタンス25μFd、か
つ4.0kV/cmでエレクトロポレーションにかける。つぎ
に、細胞をプレーティング（12穴プレートでは１穴あた
り400,000細胞、また100mlプレートでは５×10⁶細胞）
して回復させる。24時間後、新鮮培養液を供給する。48
時間経過後、細胞に対するBMP−４結合を試験すること
が可能となる。

COS−１細胞におけるBMPレセプターの一時的発現を調
べるために、10％ウシ胎児血清（Hyclone,Logan,Uta
h）、非必須アミノ酸、およびグルタミンを添加したDME
高グルコース培養液の入った100mlプレートで増殖させ
て約50％ないし80％の集密度とし、トリプシン処理を施
すことによってプレートから細胞を遊離させる。細胞を
37℃血清未添加DME培養液で２回洗浄し、その後各100ml
プレートに対して4mlのDNA混合物を添加する。このDNA
混合物は、DEM、10％Nu−血清（Collaborative Biomeic
al Products,Bedford,MA）、400μg/ml DEAE−デキスト
ラン（Pharmacia,Piscataway,NJ）、0.1mMクロロキン
（Sigma,St.Louis,MO）、および興味あるcDNAを含むも
ので、ｔ−BRK−３に対しては16μｇのpJT4−hBRK3T、B
RK−１に対しては８μｇのpJT4−J159F、BRK−２に対し
ては８μｇのpJT3−BRK2、DAF−４に対しては4.16μｇ
のpJT4−Daf4とする。つぎに、細胞をDNA混合物ととも
に37℃で３時間インキュベートする。この溶液を吸引
し、細胞を4mlのDMSO溶液に懸濁する。このDMSO溶液
は、カルシウムまたはマグネシウムを含まない10％ジメ
チルスルホン酸（DMSO）含有ダルベッコ（Dulbecco's）
リン酸緩衝食塩水（PBS;Life Technologies,Gaithersbu
rg,MD）である。２分後、DMSO溶液を吸引し、細胞を上
記した増殖用の培養液で洗浄し、つづいてプレートに新
鮮培養液を再び注ぐ。形質移入24時間が経過した後に全
細胞結合またはクロスリンクを行うので、形質移入され
た細胞を12穴プレートに分ける。48ないし68時間後、細
胞は結合分析に対して適当な状態となる。

実施例６ 放射標識BMP−４リガンドの産生 ［¹²⁵I］−BMP−４を、ヨードビーズ（IODOBEADS）（Pi
erce,Rockford,IL;非孔質ポリスチレン・ビーズ上にク
ロラミン−Ｔが固定化されている）を用いて調製する。
氷上で凍結乾燥BMP−４（２μｇ）を50μｌの10mM酢酸
に取り、450μｌのりん酸緩衝食塩水（PBS）（Sigma,S
t.Louis,MO）を加える。チューブに500μキューリの¹²⁵
I（Amersham,Arlington Heights,IL）（2200Ci/mmol）
を５μｌ、さらに１個のヨードビーズを加える。たまに
振りながら10分間にわたって氷上でインキュベートする
ことによって反応させる。反応の停止はヨードビーズか
ら反応物を取り除くことによって行う。未反応の¹²⁵Iを
除去するために、混合物をPD−10ゲルろ過カラム（Phar
macia,Piscataway,NJ）に加える。このカラムは、事前
に10mM酢酸、0.1M NaCl、および0.25％ゲラチンで飽和
されている。生ずる標識タンパク質は、トリクロロ酢酸
によってその95％を上回る沈殿が可能である。このこと
は、すべての¹²⁵Iがタンパク質に結合したものであり、
一般に特異的活性が4,000ないし9,000Ci/mmolである。

一方、クロラミン−Ｔ方法（C.A.Frolik、L.M.Wakefi
eld、D.M.Smith、およびM.B.Sporn,J.Biol.Chem.,259:1
0995−1100（1984））によってBMP−４に¹²⁵Iを標識す
る。BMT−４（２μｇ）を、５μｌの30％アセトニトリ
ル、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）、さらに５μｌの1.
5Mリン酸ナトリウム、pH7.4が加えられた溶液に添加す
る。担体なしの¹²⁵I（1mCi、９μｌ）を、２μｌのクロ
ラミンＴ溶液（100μg/ml）とともに加える。さらに、
２分および３分の時点で２μｌのクロラミンＴ溶液（10
0μg/ml）を追加する。4.5分後、10μｌの50mM Ｎ−ア
セチル・チロシン、100μｌの60mMヨウ化カリウム、さ
らに100lの11M尿素、1M酢酸を添加することによって反
応を停止させる。3.5分間のインキュベーション後、4mM
HCl、75mM NaCl、1mg/ml牛血清アルブミン（BSA）が注
入されたPD−10ゲルろ過カラム（Pharmacia,Piscatawa
y,NJ）を用いて、未反応のヨウ素を取り除く。得られた
標識タンパク質はトリクロロ酢酸によってその95％上回
る沈殿が可能であり、すべての¹²⁵Iがタンパク質に結合
していることを示す。さらに、得られた標識タンパク質
は一般に特異的活性が3000−8000Ci/mmolである。

実施例７ ｔ−BRK−３に対するBMP−４の結合の特徴 ｔ−BRK−３に対するBMP−４の結合は、細胞全体に対
する標識BMP−4n結合と、受容体に対する標識BMP−４の
共有架橋結合によって示すことができる。これらの２つ
の方法について以下詳細に説明する。

a.細胞全体に対する結合 実施例５に記載したようにして、COS−７またはCOS−
１細胞をpJT−４−hBRK3Tによって形質移入する。形質
移入後、細胞を12穴（ウエル）プレートに播種し、48時
間ないし68時間の時点で結合実験を行う。その際、細胞
を結合バッファ（50mM HEPES、pH7.4、128mM NaCl、5mM
KCl、5mM MgSO₄、1.2mM CaCl₂、2mg/ml BSA）で１度
洗い、つづいて４℃、30〜60分、ゆっくり攪拌しながら
同一バッファで平衡にする。つぎに、バッファを吸引
し、各ウエルに対して500μｌの結合バッファ（４℃）
を加える。この結合バッファは、アッセイに応じて、［
¹²⁵I］−BMP−４トレーサ（100〜400pM）と同様に、種
々の濃度の未標識BMP−２、BMP−４、または他の未標識
リガンドを含む。非特異的結合を決定するために、BMP
−４を最終濃度が10〜50nMになるようにして結合バッフ
ァに加える。インキュベーションの間、リガンドのデグ
ラデーションを防ぐために、プロテアーゼ阻害剤反応混
液も添加し、最終濃度が10μg/mlロイペプチン、50μg/
mlアンチパイン、100μg/mlベンズアミド、100μg/ml大
豆トリプシン阻害剤、10μg/mlベスタチン、10μg/mlペ
プスタチン、および300μＭフェニルメチルスルホニル
フルオリド（PMSF）となるようにする。つづいて４℃、
４時間、ゆっくり攪拌しながら同一バッファで平衡にす
る。インキュベーション終了後、バッファを吸引し、1m
lの洗浄バッファ（50mM HEPES、pH7.4、128mM NaCl、5
mM KCl、5mM MgSO₄、1.2mM CaCl₂、0.5mg/ml BSA）で細
胞をすすぐ。最終洗浄液を吸引した後、200μｌの溶解
バッファ（10mM TrisCl、pH7.4、1mM EDTA、１％（V/
V）TritonX−100）を各ウエルに添加し、室温で15〜30
分間する。溶解した細胞を新しいチューブに移し、パッ
カード・モデル5005コブラ・ガンマ・カウンタ（Packar
d Model 5005 COBRA Gamma Counter;Packard Instrumen
ts,Meriden,CT）でもって計数する。

結果を図６に示す。この図ではNIH3T3細胞（ATTCC CR
L 1658）に対する［¹²⁵I］−BMP−４の特異的結合が示
されており、BMP−４の顕著なエンドジーニアスな結合
と、BRK−１およびBRK−２が存在および非存在下におけ
るｔ−BRK−３のcDNAによって形質移入されたCOS 7細胞
に対する結合が示されている。ｔ−BRK−３は、単独で
発現した場合に［¹²⁵I］−BMP−４に結合することがで
きる（最も右側）。この結果はBRK−１およびBRK−２が
単独で発現した際の結合の場合と同濃度で行われる。［
¹²⁵I］−BMP−４の結合はｔ−BRK−３がBRK−１ととも
に発現することによって増加し、さらにBRK−２がｔ−B
RK−２とともに発現することによってよりいっそう増加
する。

b.共有架橋結合 二官能価架橋結合剤であるジスクシニミジルグルタレー
ト（DSG）（Pierce,Rockford,IL）を用い、２つのタン
パク質にあるリジン残基上で遊離アミノ基と反応させる
ことによって放射線標識リガンドをその受容体に共有架
橋結合させた。架橋形成後、細胞タンパク質をゲル電気
泳動によって分離し、さら放射性のバンドを可視化す
る。標識バンドは、放射線標識リガンドによって選択的
に“タグ”がつけられた受容体を表す。この方法では、
実施例５に記載したようにして、細胞はBRK−３および
（または）BRK−１またはBRK−２のcDNAによって形質移
入され、つづいて12穴プレートに播種される。形質移入
後、48〜68時間で細胞を洗い、平衡化し、［¹²⁵I］−BM
P−４とともにインキュベートし、さらに未標識のリガ
ンドを計数する。この計数は、全細胞結合について検討
したこの実施例に記載したようにして行う。リガンドと
の４時間にわたるインキュベーションを終了した後、細
胞を２ないし３回にわたって４℃で2mlの結合バッファ
によって洗う。この結合バッファは、すでに述べたもの
とBSAが添加されていないこと以外は同一の組成を有す
る。つぎに、各ウエルに対してBSAを含まない1mlの結合
バッファを添加し、新たに調製したDSGを添加して最終
濃度を135μＭにする。優しくかき回してDSGを混合した
後、プレートを優しく振りながら４℃で正確に15分間イ
ンキュベートする。現時点で培養液を吸引し、細胞を3m
lの分離バッファ（10mMTris塩基、0.25Mスクロース、1m
M EDTA、0.3mM PMSF）またはPBSによって洗浄する。つ
ぎに、溶解バッファ（50μＬ）を各ウエルに加え、４℃
で30〜40分間振とうすることによって細胞を溶解させ
る。試料の一部（20μｌ）を新しい管に移し、５μｌの
5X試料装填バッファ（0.25MTrisCl、pH6.8、10％ SDS、
0.5M DっＴ、0.5％ブロモフェノールブルー、50％グリ
セロール;Five Prime Three Prime,Boulder,COから購
入）を添加する。試料を５分間沸騰させ、さらに遠心
（13,000xg,5分）する。上清を7.5％SDS−ポリアクリル
アミド・ゲル（Intergrated Separation System,Natic
k,MA）上に装填し、電気泳動にかけた。ゲルを、0.12％
クーマシー・ブルーR250、５％メタノール、7.5％酢酸
で染色し、５％メタノール、7.5％酢酸で脱染し、さら
にその後乾燥させる。乾燥したゲル上の放射能を視覚化
し、さらにホスホリマジャー（PHOSPHORIMAGER;Molecul
ar Devices,Sunnyvale,CA,安定燐光物質スクリーンを用
いた放射線定量装置）で定量するか、あるいはコダック
（Kodak）Ｘ−OMAT ARオートラジオグラフィ・フィル
ムを用いたオートラジオグラフィにかける。結果を図７
に示す。ｔ−BRK−３が単独でCOS−１細胞内で発現され
た場合、架橋したバンドは認められない。BRK−１単独
の発現は、分子量78kDで架橋したバンドが得れられ、BR
k−１の予測分子量プラスBMP−４のモノマー分子量に一
致する。ｔ−BRK−３とBRK−１とが同時発現することに
よって、94kDの新たに架橋したバンドと同様に、BRK−
１のものと同一サイズのバンドが出現し、ｔ−BRK−３
の予測分子量プラス架橋したBMP−４のモノマー分子量
に一致する。同様に、BRK−２単独の発現は75kDで単独
の架橋結合バンドが生じ、BRK−２の予測分子量プラス
架橋BMP−４モノマーに一致する。ｔ−BRK−３とBRK−
２との同時発現は、94kDの新たに架橋したバンドと同様
に、BRK−２単独で認められるものに一致する架橋バン
ドを生じ、tBRK−３の予測分子量プラス架橋BMP−４モ
ノマー分子量に一致する。したがって、同時発現したタ
イプＩのBMP受容体が存在する場合のみにｔ−BRK−３に
対する［¹²⁵I］−BMP−４の架橋が観察される。

実施例８ Ｉ型BMP受容体との複合体形成の実証 TGF−β受容体ファミリーを構成する受容体はＩ型お
よびII型の受容体が含まれる複合体を形成することが知
られている（L.Attisano,J.L.Wrana,F.Lopez−Casilla
s,and J.Massague,J.Biochem Biophys.Acta,122.72−80
（1994））。II型BMP受容体ｔ−BRK−３がＩ型BMP受容
体BRK−１およびBRK−２と複合体を形成することが可能
であることを示すために、実施例５に記載したように、
COS 1細胞に対してｔ−BRK−３およびBRK−１、または
ｔ−BRK−３およびBRK−２のcDNAによって同時に形質移
入を行う。受容体を［¹²⁵I］−BMP−４に架橋結合さ
せ、つぎにＩ型受容体BRK−１およびBRK−２に特異的な
抗体で免疫沈降にかける。Ｉ受容体に特異的な抗体が［
¹²⁵I］−BMP−４に架橋したＩ型受容体のみならず、［
¹²⁵I］−BMP−４に架橋したBRK−３も沈降させるとする
と、このことはＩ型およびII型の受容体が同様のリガン
ド結合特異性を持つと予想した通り、２つの受容体は複
合体を形成しなければならないことを示す。

Ｉ型受容体BRK−１およびBRK−２に特異的な抗体は、
抗原としてペプチドLNTRVGTKRYMAPEVLDESLNKNC（B.B.Ko
ening,et al.,Molec.Cell.Biol.,14:5961−5974（199
4））を用いて産生される。このペプチドは、細胞内キ
ナーゼ・ドメインのBRK−１アミノ酸配列にもとづいて
いる。すなわち、配列識別番号12のアミノ酸398−420
で、Ｃ末端にシステインが添加されており、ペプチドの
共役を許す。BRK−１のキナーゼ・ドメインのアミノ酸
配列をRafタンパク質のキナーゼ・ドメインと比較する
と、このBRK−１の領域が高特異的抗体を産生するのに
用いられるRafキナーゼの一領域に一致する（W.Kolch
E.Weissinger,H.Mischak,J.Troppmair,S.D.Showalter,
P.Lloyd,G.Heidecker,and U.R.Rapp,Oncogene 5:713−7
20（1990））。このペプチドを、標準的な方法により、
キーホール・リムペット・ヘモシアニンと共役させ、そ
れを用いて３匹のニュー・ジーランド・ホワイト・ラビ
ット（Hazleton Washington,Vienna,VA）を免疫する。
得られた抗血清を、抗体捕獲ELISAを用いて、プラスチ
ックを覆う元のペプチドに対する認識能について評価す
る。抗血清をそれぞれ1378,1279,および1280と呼ぶこと
にする。これらを抗体は、この実施例で詳細に述べる方
法（B.B.Koening,et al.,Mol.Cell.Biol.,14:5961−597
4（1994））を用いて、BRK−１のcDNAで形質移入された
COS−７細胞からBRK−１を免疫沈降させることが示され
る。BRK−２の配列はこの領域でBRK−１の配列とほとん
ど等しいので、それらの抗体を同様にBRK−２を免疫沈
降させる能力についてその後試験し、そのかっかこの目
的にとって有効であることがわかった。抗体1379はBRK
−１の免疫沈降に関して優れた結果を示した。また、抗
体1380はBRK−２の免疫沈降について好ましい結果を示
した。

免疫沈降方法では、実施例５に記載したようなｔ−BR
K−３および／またはBRK 1,BRK−２、またはDAF−４のc
DNAによってCOS−７またはCOS−１細胞をトランスフェ
クションさせ、100mmディッシュにプレーティングす
る。つぎに、［¹²⁵I］−BMP−４および非標識リガンド
とのインキュベーションは500μｌのかわりに全体で4ml
として実行する点以外は、実施例７と同様にして
［¹²⁵I］−BMP−４と架橋させる。したがって、他の容
量もそれにともなって増加する。架橋形成後、細胞を氷
冷PBSで３回洗い、さらに1mlのRIPバッファ（20mMTrisC
l、pH8.0、100mM NaCl、1mM Na2EDTA、0.5％ノニデント
Ｐ−40、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、10mMヨウ
化ナトリウム、および１％牛血清アルブミン）で10分間
濯ぐ。ライセートをマイクロ遠心器を用いて13,000rp
m、10分間、４℃で遠心する。上清を新しいチューブに
移し、SDS中0.1％とする。ライセートに含まれるいっさ
いの抗体を取り除き、50μｌのパンソールビン（PANSOR
BIN）（Calbiochem,La Jolla,CA;黄色ブドウ球菌（Stap
hylococcus aureus）の10％溶液を加える。４℃で30分
間インキュベートした後、ライセートを上記したように
して遠心し、上清を再び新しいチューブに移す。

第一次の抗体、すなわちｔ−BRK−３およびBRK−１に
よって細胞がトランスフェクションする場合は第一次抗
体1379を、ｔ−BRK−３およびBRK−２によって細胞がト
ランスフェクションする場合は第一次抗体1380を、最終
希釈が1:100となるようにしてチューブに加え、一夜４
℃または氷上２時間インキュベートする。抗原：第一次
抗体の複合体を沈殿させるために、25〜50μｌのPANSOR
BINを添加し、氷上で30分間インキュベートする。マイ
クロ遠心器によって13,000rpm、10分間遠心することに
よってペレット状にするとともに、上清を捨てる。この
ペレットを0.1％SDS含有RIPバッファで２回洗い、つづ
いてTNENバッファ（20mM Tris、pH8.0、100mM NaCl、1m
M EDTA、0.5％ NP−40）で一回洗う。ペレットを25μｌ
の1x試料添加バッファで再懸濁する（あるいはペレット
をTNENバッファで２回洗ってもよく、同様な結果が得ら
れる）。この試料を５分間沸騰させた後、５分間遠心
し、さらに試料を7.5％SDS−ポリアクリルアミド・ゲル
上に載せてゲル電気泳動にかける。

この実験の結果を図８に示す。この図ではBRK−１ま
たはBRK−２の存在下または不在下でｔ−BRK−３によっ
てトランスフェクションしたCOS−１細胞における免疫
沈降を結果が示されている。ｔ−BRK−３のみでトラン
スフェクションし、［¹²⁵I］−BMP−４に架橋し、さら
に抗体1380で免疫沈降した細胞は、ｔ−BRK−３がこの
抗体と交差反応しないことから予想されるように、免疫
沈降物中に放射能が検出されない。BRK−１でトランス
フェクションし、架橋し、さらに抗体1379で免疫沈降し
た細胞では、一本の標識バンドが78kDのところで認めら
れ、BRK−１の予想分子量プラスBRK−４の架橋モノマー
に一致する。BRK−１およびｔ−BRK−３で同時にトラン
スフェクションした細胞の免疫沈降によってBRK−１単
独と同様のバンドが生じるとともに、さらに94kDのとこ
ろにも標識バンドが認められ、これはｔ−BRK−３の予
想分子量プラス架橋BRK−４モノマーと一致する（120kD
ところにも弱いバンドが認められる）。それらの細胞で
BRK−１に対する抗体はBRK−１のみならずｔ−BRK−３
も沈殿させるという事実は、BRK−１とｔ−BRK−３の間
で複合体が形成されることを示している。同様に、BRK
−２でトランスフェクションし、［¹²⁵I］−BMP−４に
架橋し、さらに抗体1380で免疫沈降した細胞は、75kDの
ところで標識バンドが認められ、これはBRK−２の予想
分子量プラス架橋BRK 4モノマーと一致する。BRK−２お
よびｔ−BRK−３で同時にトランスフェクションした細
胞の免疫沈降によって、BRK−２単独で認められものと
同様のバンドが得られるとともに、94kDのところで強く
標識されたバンドが認められ、これはBRK−３予想分子
量プラス架橋BRK−４モノマーと一致する。BRK−１およ
びｔ−BRK−３よって同時にトランスフェクションした
細胞において、このバンドはよりいっそう大きな標識バ
ンドとともに移動する（また、120kDで弱いバンドが認
められる）。それらの細胞でBRK−２に対する抗体はBRK
−２のみならずｔ−BRK−３も沈殿させるという事実
は、BRK−２とｔ−BRK−２との間で複合体が形成される
ことを示している。したがって、II型BMPレセプターで
予想されたように、ｔ−BRK−３は２つの異なるＩ型BMP
レセプターを有する複合体を形成する。

第２の免疫沈降実験を実施してBMP−２、BMP−４、お
よびTGF−β１に対するｔ−BRK−３レセプター複合体の
リガンド特異性を試験する。また、“桁除去（digit−r
emoved）"BMP−２（DR−BMP−２）と呼ばれるBMP−２誘
導体も試験する。このDR−BMP−２はBMP−２を穏やかに
トリプシン消化してアミノ末端を取り除いたものであ
り、細胞全体に対する非特異的結合が顕著に抑えられて
いる（B.B.Koening,et al.,Molec.Cell.Biol.,14:5961
−5974（1994））。

実施例５に記載されたようにしてBRK−２およびｔ−B
RK−３のcDNAでCOS−１細胞を同時にトランスフェクシ
ョンし、［¹²⁵I］−BMP−４で架橋し、さらに過剰の未
標識リガンド（10nM BMP−４、10nM BMP−２、10nM DR
−BMP−２、または50nM TGF−β１）を［¹²⁵I］−BMP−
４と同時にインキュベーションに加えること以外はこの
実施例で記載したようにして抗体1380による免疫沈降に
かけてる。得られた結果を図９に示す。拮抗する未標識
のリガンドが存在しない場合、２本の標識バンドが75kD
および94kDのところで身と得られ、それぞれ図８に示す
ように、架橋したBRK−２およびBRK−３に一致する。し
かし、過剰の未標識BMP−４、BMP−２、またはDR−BMP2
が存在する場合、こららのバンドは完全に廃止されるこ
とから、それらのリガンドが効果的に［¹²⁵I］−BMP−
４と拮抗して複合体に結合することが示され、それらの
リガンドはBRK−２およびBRK−３レセプター複合体に対
する特異的結合を示す。しかし、50nM TGF−β１の存在
は標識バンドに対して何ら効果を示さないことから、TG
F−β１は［¹²⁵I］−BMP−４と同一の部位に結合しない
ことが示される。このことは、BRK−2/t−BRK−３複合
体は特異的にBMP−２およびBMP−４に結合し、TGF−β
には結合しないことを示す。

実施例９ マウスBRK−３の単離 BRK−３のマウス相同体全体を単離するために、NIH3T
3マウス胎仔線維芽細胞（ATCC CRL 1658）からcDNAライ
ブラリーを構築する。全RNA分離キット（Total RNA Sep
arator Kit;Clontech,Palo Alto,CA）を用いて細胞から
全RNA（1.26mg）を単離する。また、mRNA分離キット（m
RNA Separator Kit;Clontech,Palo Alto,CA）を用いて
その全RNA（1mg）からmRNA（81μｇ）を単離する。mRNA
（４μｇ）の一定分量を使用して、cDNA合成およびプラ
スミド・クローニング用スーパー・スクリプト・プラス
ミド・システム（SUPER SCRIPT Plasmid System for cD
NA Synthesis and Plasmid Cloning;Life Technologie
s,Gaithersburg,MD）を用い、かつ製造元の取扱説明書
に従ってcDNAライブラリーを作る。得られたライブラリ
ーは約4.9×10⁵個の一次コロニーを含むもので、これら
のコロニーをそれぞれが5000個のコロニーを持つ98個の
プールに分ける。

サザンブロットでライブラリの初回スクリーニングを
行う。QIGENカラム（Qiagen,Chatsworth,CA）を用いて9
8プールの各々からプラスミドを生成する。各プールのD
NA（５μｇ）をMlu Iで消化し、cDNAインサートを離
し、さらに１％アガロース・ゲル上で流す。ゲルを0.6M
NaCl、0.4M NaOHで30分間にわたって変性させ、つづい
て1.5M NaCl、0.5MTris、pH7.5で中和する。つぎに、DN
Aを一晩かけてハイボンド・ナイロン・メンブレン（HYB
OND Nylon memberane;Amersham,Arlington Heights,I
L）に移す。この際、10xSSCをトランスファ・バッファ
として用いる（1XSSC＝0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナ
トリウム、pH7.0）。

ヒトｔ−BRK−３をEcoR VおよびAfl IIIで切断し、1.
5kbフラグメントを得る。PRIME−ITDNランダム・プライ
マー・ラベリング・キット（Stratagene,La Jolla,CA;D
NAのランダム・プライマー標識用キットで、クレノウDN
Aポリメラーゼ、プライマー、およびバッファを含む）
を使用し、かつ特異的活性が3000Ci/mmolであるα
［³²P］−dCTP（NEN Research Products,Boston,MA）を
用いて、上記フラグメントをランダムに標識する。標識
プローブをハイブリダイゼーション・バッファ（Sigma,
St.Louis,MO）中で18時間、42℃、サザンブロットにハ
イブリダイズさせる。このハイブリダイゼーション・バ
ッファは50％脱イオン化ホルムアミド、5XSSPE（1XSSPE
＝0.14M NaCl、8mMリン酸ナトリウム、0.08mM EDTA、pH
7.7）、1XDenhardt's溶液、および100μg/mlの変性サケ
精巣DNAからなる。ブロットを、0.25XSSPE、0.5％ドデ
シル硫酸ナトリウム（SDS）でもって２回、各回とも42
℃、15分間洗浄し、次に２回、各回とも65℃、20分間洗
浄する。つぎにブロットをコダックＸ−OMAT ARオート
ラジオグラフィ・フィルムに18時間、−80℃で露光す
る。フィルムを現像すると、約2.5kbの標識バンドの存
在によって判定される５つの陽性プールが認められる。

第２次のスクリーニングでは、プレートを５つの陽性
プール（5000コロニー／プール）由来の大腸菌（E.col
i）株で画線する。このプレート上にHYBONDナイロン・
メンブレンを置いて、細菌のコロニーをフィルターに移
す。つぎに、コロニーを37℃、２〜３時間で回収する。
フイルターを10％SDSに３時間浸し、つぎに1.5M NaCl、
0.5M NaOHに５分間移し、1.5M NaCl、1.5M Tris、pH7.5
で５分間中和し、さらに2XSSCで洗浄する。タンパク質
を取り除くために、ブロットを0.1M Tris、pH7.6、10mM
EDTA、0.15M NaCl、0.02％ SDS中で50μg/mlのプロテ
ィナーゼＫ（Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN）
とともに、55℃、１時間振とうする。ヒトBRK−３フラ
グメント（EcoR V−Afl III）を標識し、ブロットを第
１次スクリーニングとまったく同様にしてハイブリダイ
ズさせ、洗浄し、さらにオートラジオグラフィにかけ
る。

第３次のスクリーニングを行うために、オートラジオ
グラフィ上の標識スポットに対応するコロニーをプレー
ト上に画線する。第３次スクリーニングは上記第２次ス
クリーニングについてまったく同様にして行う。その結
果、４種類の陽性クローンを単離した。一つのクローン
はpSPORT1/N89−５であり、もっとも大きなインサート
を有しており、このインサートのサイズは2.9kbであ
る。

４種類の陽性クローンのインサートの配列を、TAQ DY
E DEOXYターミネータ・サイクル・シークエンシング・
キトおよびアプライド・バイオシステムズ・モデル373A
自動DNAシークエンサーを用いて決定した。４種類の配
列を比較してみると、そのうちの３種類が３′末端で相
同であり、また４種類すべてが５′末端でヒトBRK−３
のコード領域に合った。

配列に関する情報をさらに得るために、pSPORT1/N89
−５由来のインサートをEcoR IおよびSca Iで消化して
得られた1.4kbフラグメントをEcoR IおよびHinC II部位
でBLUESCRIPT II SK（−）にサブクローン化する。ま
た、pSPORT1/N89 5をEcoR IおよびEcoR Vで消化して得
られた2.1kbインサートを同一部位で同一ベクターにサ
ブクローン化する。最後に、プラスミドをSca IおよびN
ot Iで消化し、Hinc IIおよびNot I部位で同一ベクター
にサブクローン化する。これら３通りの構成に対して配
列決定を行い、pSPORT1/N89−５の完全配列が得られ
た。

コード領域の５′末端のミッシング600塩基対をcDNA
末端急速増幅用５′レース・システム（５′RACE Syste
m for Rapid Amplification of cDNA Ends;Life techno
logies,Gaithersburg,MD）を用いてクローン化する。ア
ンチセンス・プライマーをpSPORT1/N89−５の既知配列
に対応させて消化し、５′CTG TGT GAA GAT AAG CCA GT
C 3′の配列を有するものとする（配列識別番号７の逆
相補体）。１μｇのNIH3T3mRNAからcDNAの第一鎖合成を
行った後、末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェ
ラーゼを用い、かつ製造元の取扱説明書にもとづいて新
たに合成したcDNAにポリＣテールをつける。キットとと
もに提供されるアンカー・プライマー（Anchor Prime
r）とともに上記プライマーを用いてBRK−3 cDNAの５′
末端を増幅し、５′（CUA）4 GGC CAC GCG TCG ACT AGT
ACG GGI IGG GII GGG IIG 3′（配列中、Ｉ＝イノシ
ン、Ｕ＝ウラシル）。AMPLITAQ DNAポリメラーゼととも
にGENE−AMP PCRキットを用いてPCRを行う。95℃、５分
間で最初の溶解を行った後、以下のプログラムを35回繰
り返した。すなわち、このプログラムは、95℃、１分間
の溶解、55℃、１分間のアニーリング。および72℃、２
分間の伸張からなる。最終回の後、反応を72℃、５分間
にわたって保つことによって伸張を完了させる。非特異
的なプライマー結合から生ずるバックグラウンドを少な
くするために、再びpSPORT1/N89−５由来インサートの
既知配列から誘導したネスト化プライマー５′CAA GAT
CTT ACC CAA TCA CTT G3′（配列識別番号７の逆相補
体）を、PCRの第１ラウンドで用いた同一アンカー・プ
ライマーとともに用いてPCR第２ラウンドを行う。

大きさが600〜1000bpの範囲内である第2PCR反応の増
幅産物をEcl XIおよびSal Iで消化し、Ecl XIおよびSal
I部位でBLUESCRIPT II SK（−）にサブクローン化す
る。インサートの配列決定を行ったところ、ヒトｔ−BR
K−３のコード領域に合う追加の600bpが得られる。

R6−8B2、R6−11−１、およびR6−11−２と呼ばれる
三種類の異なるクローンは同一結果で配列決定される。

マウスBRK−３の完全なクローンを作るために、Sal I
部位をクローンR6−11−１の５′末端に以下のようにし
て最初に置く。R6−11−１のヌクレオチド１〜20が続く
Sal I部位を含むプライマーを合成する。すなわち、こ
のプライマーの配列は５′CAC ACG CGT CGA CCA TGA CT
T CCT CGC TGC ATC G3′である。これを、M13リバース
・プライマー、５′ACC AGC TAT GAC CAT G3′とともに
用いて、クローンR6−11−１由来プラスミドDNAをテン
プレートとして用いるDNAフラグメントの増幅を行う。A
MPLITAQ DNAポリメラーゼとともにGEN−AMP PCRキット
を用いてPCRを行った。最初の溶解は95℃、五分間行
い、つづいて以下のプログラムを35回繰り返した。すな
わち、このプログラムは、95℃、１分間の溶解、55℃、
１分間のアニーリング、および72℃、２分間の伸張から
なる。最終回の後、反応を72℃、５分間にわたって保つ
ことによって伸張を完了させる。R6−11−１から増幅し
たフラグメントを、pSPORT1/N89−５（230ng）からのイ
ンサートとともに、以下のようにしてBLUESCRIPT II SK
（−）にサブクローン化する。R6−11−１由来インサー
トをEcl XIおよびPst Iで消化する。また、ベクターBLU
ESCRIPT II SK（−）をSal IおよびPst Iで消化する。T
4DNAリガーゼを用いるスリー・ウエイ・リゲージョン
（３時間、25℃）でもって結３種類のフラグメントを結
合させ、バイオラッド・ジーン・バルサー（BIO−RAD G
ene PULSER;BIO−RAD,Hercules,CA）を用い、かつ製造
元の取扱説明書にもとづいたエレクトロコンピテントな
大腸菌（E.coli）DH5−ａ株の形質転換に利用する。陽
性コロニーを選択してpBLUESCRIPT−mBRK3と命名する。
PCRによって増幅されたインサートの５′部分の配列決
定によれば、クローンR6−11−１のものと同一の配列が
示される。このことは、増幅中において何ら突然変異が
引き起こされていないことを示している。

ほ乳類での発現について、mBRK−３をほ乳類発現ベク
ターpJT6にサブクローン化する。このベクターはpJT3の
誘導体で実施例４に記載されており、マルチプル・クロ
ーニング部位の５′部位でNot Iが欠失しており、さら
にマルチプル・クローニング部位のPst I制限部位とBam
H I制限部位との間にスペーサが挿入されている。サブ
クローニングを遂行するために、Not IおよびSal Iを用
いてBLUESCRIPT−mBRK3からｍ−BRK−３を切除してNot
IおよびSal I部位でPJT6に挿入しpJT6−mBRK 3を得る。

しかし、pSPORT1/N89−５にあるpJT6−mBRK−３の
３′末端およびオリジナルcDNAの再配列決定を行った結
果、３′末端に変化したリーディング・フレームがあ
り、停止コドンが実際に３′からPst I部位に位置する
ことを示している。よって、PJT6−mBRK3は停止コドン
を含まない。したがって、２つの新規構成を以下のよう
に調製する。

第一に、pJT6−mBRK3をSpe I（配列認識番号７の位置
2306の部位）およびNot I（pJT6のマルチプル・クロー
ニング部位）で消化し、インサートの３′末端を除去す
る。NIH−3T3ライブラリのスクリーニング中に単離され
たもっとも長いクローンpSPORT1/N89−５もまたSpe Iお
よびNot Iによって消化する。pSPORT1/N89−５から遊離
した1.2kbフラグメントをSpe I/Not I消化pJT6−mBRK3
にサブクローン化することによって、両部位が再生され
る。この構成はpJT6−mBRK−3Lと呼ばれ、かつpSPORT1/
N89−５クローンの３′末端全体を含む。この構成のマ
ップを図10に示す。

クローンの３′末端は非翻訳領域３′から停止コドン
に403ヌクレオチドを有する。この領域はＡ−Ｔがたい
へん多く含まれており、発現レベルを減少させるのかも
しれない。この領域を取り除いて、第２の構成を調製す
る。pSPORT1/N89−５プラスミドをHind III（配列識別
番号７のヌクレオチド3168にある部位、３′から停止コ
ドンまでの21塩基）。直線状になったプラスミドをDNA
ポリメラーゼのクレノウ・フラグメント（Boehringer M
annheim,Indianapolis,IN）によって処理し、突出部分
を埋め、つぎにSpe Iで切断することによってインサー
トの３′末端で863bpフラグメントを遊離させる。同時
に、pJT6−mBRK3をNot Iで消化する。直線化プラスミド
をクレノウ・フラグメントで処理し、つぎにSpe Iで消
化することによって、インサートの３′末端を遊離させ
る。Not I/Spe I消化pJT6−mBRK3を、Hind III/Spe Iに
よってpSPORT1/N89−５から遊離したフラグメントに結
合する。得られた構成をpJT6−mBRK3Sとし、図11に示
す。

構成pJT6−mBRK−3Sもまた、ｍ−BRK−３の部分cDNA
クローン、pSPORT1/N89−５、および該cDNAの５′末端
を含む構成であるクローン６−11−１から直接構成され
る。これは、クローンR6−11−１をSal IおよびEcl XI
で消化し、pSPORT1/N89−５をEcl XIおよびHind IIIで
消化し、さらにBLUESCRIPT II SK（−）をSal IおよびH
ind IIIで消化することによって達成される。つぎに、
これらのフラグメントをスリー・ウエイ・リゲーション
に供することによってBLUESCRIPT IIベクター内にｍ−B
RK−3 cDNAの完全なものが得られる。Sal IおよびNot I
を用いて完全なcDNAをこの構成から切り出し、つぎにpJ
T6ベクターのSal IおよびNot I部位にサブクローン化す
る。得られたプラスミドは、上記実施例に記載したpT6
−mBRK3Sと同様に、BRK−３についてまったく同じcDNA
を有する。しかし、cDNAの３′末端に追加のベクター配
列が保持される、BLUESCRIPT II SK（−）のマルチプル
・クローニング部位のHind III部位とNot I部位との間
にある領域が含まれる。

実施例10 マウスBRK−３の配列分析 pJT6−mBRK3L由来の完全な長さのマウスBRK−３イン
サートのDNA配列を配列識別番号７に示し、推測される
タンパク質配列を配列識別番号８に示す。マウスBRK−
３の推測されるアミノ酸配列を、標準Needleman−Wunsc
hアルゴリズム（S.B.Needleman and C.D.Wunsch,J.Mol.
Biol.,48:443−453（1970））を用いてGenBankリリース
84.0、1994年８月15日付の翻訳されたすべてのタンパク
質配列に対して検索する。それはユニーク配列として見
出される。それは1038アミノ酸からなるタンパク質をコ
ード化する。ｔ−BRK−３によってコード化された領域
（配列識別番号４のアミノ酸１〜582;配列識別番号８の
アミノ酸１〜582）についてマウスBRK−３を不完全なヒ
ト受容体と比較すると、これら２つの受容体間において
98％の配列が同じである。ｔ−BRK−３と同様に、ｍ−B
RK−３はアミノ酸151〜172を包囲する予測トランスメン
ブレン領域を含む。ｔ−BRK−３あるように、細胞内ド
メインはセリン／スレオニン残基について予測された特
異性を持つプロティン・キナーゼ・ドメインを特徴づけ
るコンセンサス配列のすべてを含む（S.K.Hanks,A.M.Qu
inn,and T.Hunter,Science,241:42−52（1988））。キ
ナーゼ・ドメインにつづいて非常に長いカルボキシ末端
（534アミノ酸）を有する。実際、このカルボキシ末端
の存在によって、BRK−３の細胞内ドメイン（866アミノ
酸）はTGB−β受容体ファミリーの他のいかなる受容体
のものよりもかなり長い。それは、本発明以前ではTGF
−βファミリーのなかでもっとも長いとされてきたDAF
−４の細胞内ドメイン（490アミノ酸）よりも約２倍長
い。

実施例11 ｍ−BRK−３に対する［¹²⁵I］−BMP−４の結合 ｍ−BRK−３に対して［¹²⁵I］−BMP−４が特異的に結
合することを実証するために、COS−１細胞を、pJT 6−
mBRK−3SおよびpJT 6−mBRK−3Lの構成を用いて実施例
５に記載されたようにトランスフェクションする。ま
た、構成pJT 3−BRK−２を用いて、Ｉ型受容体BRK−２
のcDNAによっても該細胞を同時トランスフェクションす
る。これによって、Ｉ型BMP受容体の存在が［¹²⁵I］−B
MP−４の結合に影響を及ぼすかどうかを判断する。細胞
全体に対する［¹²⁵I］−BMP−４の結合は実施例７に記
載したようにして実行される。

図12に結果を示す。この結果は所定の数の細胞に対す
る［¹²⁵I］−BMP−４の特異的結合を示す。試験した２
種類の構成のいずれかを用いてマウスBRK−３単独で細
胞をトランスフェクションする場合、［¹²⁵I］−BMP−
４の特異的結合は偽トランスフェクション細胞で認めら
れる結合の程度よりも４〜７倍増加する。BRK−２単独
のトランスフェクションでは、結合はマウスBRK−３単
独で認められる結合の程度と同様に増加する。細胞をマ
ウスBRK−３と同様にBRK−２で同時トランスフェクショ
ンした場合、結合は偽トランスフェクション細胞で認め
られる結合の程度よりも９〜11倍さらに増加し、ｔ−BR
K−３とBRK−２との組み合わせによる結果と一致する
（実施例７の図６）。

ｍ−BRK−３が［¹²⁵I］−BMP−４に結合するという実
証として、さらに架橋実験を実施する。COS−１細胞
を、実施例５に記載しているように、pJT 6−mBRK−3S
を用いてｍ−BRK−３のcDNA、および／またはBRK−１の
cDNA（pJT 4−J159F使用）またはBRK−２（pJT3−BRK−
２を使用）によってトランスフェクションする。トラン
スフェクションした細胞を［¹²⁵I］−BMP−４とインキ
ュベーションし、さらにジスクシニミジルグルタレート
よりはむしろジスクシニミジルスベレート（DSS）を架
橋剤として用いること以外は実施例７に記載したように
して架橋する。そのような実験の結果を図13に示す。ｍ
−BRK−３単独でトランスフェクションした細胞は架橋
したバンドを示さず、ｔ−BRK−３で得られた結果と一
致する（図７）。BRK−１のcDNAのみでトランスフェク
ションした細胞は見かけの分子量81kDのところで泳動す
る単一種を示し、BRK−１の予測分子量に架橋BRK−４モ
ノマーを加えたものと一致する。BRK−１のcDNAとBRK−
３のcDNAとでトランスフェクションした細胞では、標識
バンドが３本観察される。そのうちの一本はBRK 1単独
の場合で観察されるバンド（81kD）と一致し、一方他の
バンドは見かけの分子量が159kDおよび128kDで泳動す
る。このうち、大きいほうのバンドは、m BRK−３の予
測分子量プラス架橋BRK−４モノマーと一致する。注目
すべきことは、BRK−１によって識別される架橋バンド
の強度が、BRK−１単独の場合に比べて顕著に増加され
ていることである。

同様に、BRK−２のcDNA単独によるトランスフェクシ
ョンは、見かけ分子量78kDで泳動する架橋バンドを生じ
させる。このバンドは、BRK−２の予測分子量プラス架
橋BRK−４モノマーと一致する。BRK−２のcDNAとBRK−
３のcDNAとでトランスフェクションした細胞内で、159k
Dおよび128kDで観察される架橋バンドに加え、BRK−２
によって識別される78kD種が観察され、BRK−１および
ｍ−BRK−３のcDNAによってトランスフェクションした
細胞に認められる分子量の大きいバンドと同時泳動す
る。BRK−１の場合と同様に、BRK−２によて識別される
バンドへの架橋の強度は、BRK−２単独の場合と比較し
て顕著に増加する。最後にベクター単独でトランスフェ
クションした細胞では標識バンドは認められない。

免疫沈降実験を実施することによって、ｍ−BRK−３
がＩ型BMP受容体と複合体を形成する能力を示す。COS−
１細胞を、実施例５に記載しているように、構成pJT 6
−mBRK−3Sを用いてｍ−BRK−３のcDNAによって、およ
び／またはBRK−１（pJT4−J159Fを用いる）またはBRK
−２（pJT3−BRK−２を用いる）のcDNAによってトラン
スフェクションさせる。トランスフェクションした細胞
を［¹²⁵I］−BMP−４とともにインキュベーションし、
架橋させ、さらに適当なＩ型受容体に対する抗体または
免疫前の血清による免疫沈降にかける。この際、ジスク
シニミジルグルタレートのかわりにDSSを架橋剤として
用いること以外は実施例８の記載に従って行う。本実験
の結果を図14に示す。BRK−１のcDNA単独でトランスフ
ェクションした細胞は、BRK−１に対する抗体で沈降
し、見かけ分子量81kDで泳動する。BRK−１のcDNAとｍ
−BRK−３のcDNAとでトランスフェクションした細胞で
は、BRK−１に対する抗体で強度の高まった81kDのバン
ドが沈降する。しかし、それに加えて見かけ分子量159k
Dで泳動するバンドが観察され、ｍ−BRK−３の予測分子
量プラス架橋BMP−４モノマーと一致する。同様に、BRK
−２単独でトランスフェクションした細胞では、BRK−
２に対する抗体で見かけ分子量78kDで泳動する標識種が
沈降する。BRK−２のcDNAとｍ−BRK−３のcDNAとでトラ
ンスフェクションし、BRK−２で沈降させた細胞では、B
RK−２によって識別される強度が増大した78kDのバンド
が再び観察される。また、標識種は159kDで認められ、
ｍ−BRK−３に一致し、BRK−１のcDNAとｍ−BRK−３のc
DNAとでトランスフェクションした細胞に認められるよ
いいっそう高分子量のバンドと同時泳動する。BRK−２
のcDNAとｍ−BRK−３のcDNAとでトランスフェクション
した細胞では、94kDで別の標識バンドが認められる。対
照として、BRK−１およびｍ−BRK−３のcDNA、またはBR
K−２およびｍ−BRK−３のcDNAで細胞をトランスフェク
ションさせ、つぎに免疫前の血清で免疫沈降にかける
（もっとも左側のレーンともっとも右側のレーン）。そ
の結果、標識されたバンドは認められない。

この実験によれば、mBRK−３がＩ型BMP受容体BRK−１
またはBRK−２と同時発現すること、およびＩ型受容体
を沈降させる抗体はｍ−BRK−３も沈降させることが明
らかである。したがって、哺乳類II型BMP受容体で予想
されたように、ｍ−BRK−３はそれらの哺乳類Ｉ型BMP受
容体のいずれかと複合体を形成することができる。この
ことは、上記実施理恵８に記載したｔ−BRK−３で得ら
れた結果と一致する。

実施例12 ヒトBRK−３のcDNA全長の単離 実施例２に記載したクローンHSK723はフレーム内（in
−frame）停止コドンを持たないので、このcDNAの末端
に追加の配列３′を獲得する必要がある。したがって、
実施例１で調製したヒト包皮線維芽細胞ライブラリー
を、実施例２の記載通りの標識およびスクリーニング条
件下でHSK7−2PCRフラグメントによって再スクリーニン
グする。これによって、BLUESCRIPT II SK（−）にサブ
クローン化されたヒトBRK−３配列（全体で3355塩基
対）がさらに含まれる長いクローンが単離でき、該クロ
ーンをpHSK1030と呼ぶ。pHSK1030由来インサートを配列
決定すると、982アミノ酸からなるコード領域が示され
るけれども、該インサートにはフレーム内停止コドンが
含まれないことがわかる。

コード領域の残りの部分を以下のようにしてPCRによ
るクローニングを行う。２つの先行プライマーをクロー
ンpHSK1030のプラス鎖から得る。これらのプライマーの
配列は以下の通りである。すなわち、プライマーPRK3−
１の配列は、５′CCTGTCACATAATAGGCGTGTGCC−３′（配
列識別番号１のヌクレオチド1998〜2021と同一）であ
り、またプライマーPRK−２の配列は、５′CGCGGATCCAT
CATACTGACAGCATCG 3′（配列識別番号１のヌクレオチド
2078〜2095が続くBamH I部位を取り込む）である。さら
に２つのプライマーをλgt10のマイナス鎖から得る。こ
れらのプライマーは、G10F1、５′GCTGGGTAGTCCCCACCTT
T3′とG10F2,5′GAGCAAGTTCAGCCTGGT3′である。実施例
１で調製したヒト線維芽細胞cDNAライブラリーをPCRの
テンプレートとして用いる。このライブラリー（0.3μ
ｇ）をPRK3−１およびG10F1プライマー（各々１μ
Ｍ）、Tthポリメラーゼ（1.2ユニット）、全４種類ので
沖思慕ヌクレオチド（各々200μＭ）、Tthポリメラーゼ
用バッファ、および水とともに全体が50μｌとなるよう
にしてインキュベーションする。PCRサイクルの条件は
以下の通りとする。すなわち、最初の溶解を94℃で２分
間行い、その後続けて、94℃、1.5分間の溶解、52℃、
２分間のアニーリング、および72℃、３分間の伸展を20
サイクル繰り返す。20サイクルを完了後、試料をさらに
72℃、８分間保ち、伸展が完全になされるようにする。

特異性を増大させ、かつバックグラウンドを少なくす
るために、ネスト化PCR第２ラウンドを実行する。イン
キュベーション混合物はこの実施例の第１ラウンドにつ
いての記載と同様であるけれども、（１）第1PCR反応の
一定分量（0.5μｌ）をテンプレートとして用いるこ
と、（２）RPK3−１およびG10F1のかわりにPRK3−２お
よびG10F2プライマーを用いることが異なる。PCRを実行
するための条件は、この実施例でPCRの第１ラウンドに
ついて記載したことを同一である。

PCRの第２ラウンドによって、1.6kbフラグメントの増
幅が得られ、該フラグメントはQIAEXによってアガロー
ス・ゲルから単離される。このフラグメントをEcoR Iお
よびBamH Iによって消化し、さらにEcoR IおよびBamH I
部位でBLUESCRIPT II SK（−）にサブクローン化する。
得られた構成pHSK723−3Uの配列が決定され、フレーム
内停止コドンを持つBRK−３の残存コード領域をコード
化することがわかる。

ヒトBRK−３全体をアセンブルするため、pHSK1030お
よびpHSK1040由来のインサートをベクターBLUESCRIPT I
I SK（−）のユニークStu I部位（配列識別番号１のヌ
クレオチド3219に位置）に結合させる。これによって完
全なヒトBRK−２のコード配列が含まれる完全な構成pHS
K1040が得られる。pHSK1040を図15に示す。ヒトBRK−３
のDNA配列を配列識別番号１に示し、またヒトBRK−３の
推論されたアミノ酸配列を配列識別番号２に示す。

ヒトBRK−３（配列識別番号２）のアミノ酸配列をｍ
−BRK−３（配列識別番号８）と比較してみると、96.7
％が同一であることがわかる。

実施例13 BMP受容体アゴニストおよびアンタゴニストを同定する
リガンド結合アッセイにおけるBRK−３の使用 BRK−３と相互作用するリガンドの同定は、リガンド
とBRK−３との相互作用を測定するように設計されたア
ッセイを用いることによって達成できる。大量の試料を
扱うように適合された受容体結合アッセイの一例を以下
のようにして実施する。

COS−１細胞を、12穴培養皿で細胞増殖を行うこと以
外は上記実施例11に記載したようにして、構成pJT6−mB
RK−3Lを用いてｍ−BRK−３のcDNAによってトランスフ
ェクションする。トランスフェクション後48〜68時間
で、細胞を1.0mlの結合バッファ（50mM HEPES、pH7.4、
128mM NaCl、5mM KCl、5mM MgSO₄、1.2mMCaCl₂、2mg/ml
BSA）で一度洗浄し、つぎに同一バッファで４℃、60
分間、穏やかに振とうしながら平衡させる。平衡化後、
バッファを吸引し、各ウエルに４℃の［¹²⁵I］−BMP−
４トレーサー（100〜400pM）含有結合バッファ500μｌ
を、種々の濃度の非標識試験化合物（すなわち、推定上
のリガンド）の存在または不在下で、各ウエルに添加
し、４℃、４時間にわたって穏やかに振とうする。非特
異的結合およびBMP受容体複合体からの完全な置換を判
断するために、BMP−２を最終濃度10nMで加えることに
よって、最終的に濃度が10μg/mlロイペプチン、10μg/
mlアンチペイン、50μg/mlアプロチニン、100μg/mlベ
ンズアミジン、100μg/ml大豆トリプシン阻害剤、10μg
/mlベスタチン、10μg/mlペプスタチン、および300μＭ
フェニルメチルスルフォニルフルオライド（PMSF）とす
る。インキュベーション時間終了後、バッファを吸引
し、細胞を1mlの洗浄液（50mM HEPES、pH7.4、128mM Na
Cl、5mM KCl、5mM MgSO₄、1.2mM CaCl₂、0.5mg/ml BS
A）で４回濯ぐ。最終洗浄液を吸引後、200μｌの溶解バ
ッファ（10mM TrisCl、pH7.4、1mM EDTA、１％（v/
v）ToritonX−100）を各ウエルに添加し、室温で15〜30
分間インキュベーションする。つぎに、溶解した細胞を
新しいチューブに移し、パッカード・モデル5005COBRA
ガンマ・カウンター（Packard Instruments,Meriden,C
T）で計数する。

ｍ−BMP−４受容体と相互作用する化合物について、
ｍ−BRK−３を発現する細胞内で［¹²⁵I］−BMP−４トレ
ーサーによる該受容体への結合との競合を観察した結
果、新規化合物が不在の状態でトレーサーがインキュベ
ーションされた場合に観察される結合と比較して該試験
化合物存在下での［¹²⁵I］−BMP−４トレーサーの結合
は少ない。試験した試験化合物の濃度がもっとも高いと
ころで［¹²⁵I］−BMP−４トレーサーの減少は≧30％に
至る。このことは、試験化合物はｍ−BRK−３に結合す
ることを示している。

この実施例の方法にもとづいて同様の結果が他の、本
発明の関連BRK−３タンパク質受容体を用いた場合に観
察される。

実施例14 BMP受容体アゴニストおよびアンタゴニストを同定する
ためのリガンド結合アッセイにおけるｍ−BRK−３およ
びBRK−２の使用 Ｉ型BMPと複合体を形成したBRK−３と相互作用するリ
ガンドの同定は、リガンドとこのBMP複合体との相互作
用を測定するように設計されたアッセイを用いることに
よって達成できる。ｍ−BRK−3/BRK−２複合体を用い、
かつ大量の試料を扱うように適合された受容体結合アッ
セイの一例を以下のようにして実施する。

12穴培養皿で細胞増殖を行うこと以外は上記実施例11
に記載したようにして、構成pJT6−mBRK−3Lを用いてｍ
−BRK−３のcDNAによって、また構成pJT3−BRK−２を用
いてBRK−２のcDNAによって、COS−１細胞をトランスフ
ェクションする。細胞をトランスフェクションするのに
用いられたDNA混合物は、２μg/mlのpJT3−BRK−２およ
び４μg/mlのpJT6−mBRK−3Lを含む。トランスフェクシ
ョン後48〜68時間で、細胞を1mlの結合バッファ（50mM
HEPES、pH7.4、128mM NaCl、5mM KCl、5mM MgSO₄、1.2m
M CaCl₂、2mg/ml BSAで一度洗浄し、つぎに同一バッフ
ァで４℃、60分間、穏やかに振とうしながら平衡させ
る。平衡化後、バッファを吸引し、各ウエルに４℃の［
¹²⁵I］−BMP−４トレーサー（100〜400pM）含有結合バ
ッファ500μｌを、種々の濃度の試験化合物（すなわ
ち、推定上のリガンド）の存在または不在下で、各ウエ
ルに添加し、４℃、４時間にわたって穏やかに振とうす
る。非特異的結合およびBMP受容体複合体からの完全な
置換を判断するために、BMP−２を最終濃度10nMで加え
る。リガンドの減衰を阻止するために、プロテアーゼ阻
害剤カクテルも添加することによって、最終的に濃度が
10μg/mlロイペプチン、10μg/mlアンチペイン、50μg/
mlアプロチニン、100μg/mlベンズアミジン、100μg/ml
大豆トリプシン阻害剤、10μg/mlベスタチン、10μg/ml
ペプスタチン、および300μＭフェニルメチルスルフォ
ニルフルオライド（PMSF）とする。インキュベーション
時間終了時、バッファを吸引し、細胞を1mlの洗浄液（5
0mM HEPES、pH7.4、128mM NaCl、5mM KCl、5mM MgSO₄、
1.2mM CaCl₂、0.5mg/ml BSA）で４回濯ぐ。最終洗浄液
を吸引後、200μｌの溶解バッファ（10mM TrisCl、pH
7.4、1mM EDTA、１％（v/v）ToritonX−100）を各ウエ
ルに添加し、室温で15〜30分間インキュベーションす
る。つぎに、溶解した細胞を新しいチューブに移し、パ
ッカード・モデル5005COBRAガンマ・カウンター（Packa
rd Instruments,Meriden,CT）で計数する。

ｍ−BMP−3/BRK−２受容体複合体と相互作用する試験
化合物について、［¹²⁵I］−BMP−４トレーサーによる
該受容体複合体への結合との競合を観察した結果、新規
化合物が不在の状態でトレーサーがインキュベーション
された場合に観察される結合と比較して該試験化合物存
在下での［¹²⁵I］−BMP−４トレーサーの結合は少な
い。ｍ−BRK−3/BRK−２受容体複合体に試験した試験化
合物の濃度がもっとも高いところで［¹²⁵I］−BMP−４
トレーサーの減少は≧30％に至る。このことは、試験化
合物はｍ−BRK−3/BRK−２受容体複合体に結合すること
を示している。

この実施例の方法にもとづいて同様の結果が他の、本
発明の関連BRK−３タンパク質受容体複合体、またはそ
の相同体をBRK−２または他のＩ型受容体を用いた場合
に観察される。

実施例15 BMP受容体アゴニストおよびアンタゴニストを同定する
ための情報伝達アッセイにおけるｍ−BRK−３およびBRK
−２の使用 Ｉ型受容体と複合体を形成したBRK−３との相互作用
に対する信号を送るリガンドの同定は、リガンドと受容
体複合体との結合後、受容体タンパク質キナーゼ・ドメ
インの活性を測定するように設計されたアッセイを用い
ることによって達成される。mBRK−3/BRK−２複合体を
発現する細胞のＩ型BRK−２受容体に対する抗体によっ
て免疫沈降するタンパク質のリン酸化反応における変化
を測定するin vivoリン酸化アッセイは、以下のように
実施する。

COS 1細胞のトランスフェクションを、構成pJT6−mBR
K−3Sを用いてｍ−BRK−３のcDNAによって、および構成
pJT3−BRK−２を用いてBRK−２によって、細胞をT175フ
ラスコ（Falcon）で増殖させる以外は実施例11の記載通
りに実施する。細胞をトランスフェクションさせるのに
用いられたDNA混合物は、２μg/mlのpJT3−BRK−２と４
μg/mlのpJT6−mBRK−3Sとを含む。トランスフェクショ
ン後24時間、細胞を100mm組織培養皿にプレーティング
し、少なくとも５時間、プレートに付着させる。その
後、培養液を１％牛胎仔血清（HyClone,Logan,UT）、お
よび2mM Ｌ−グルタミン、0.1mM MEM非必須アミノ酸溶
液を含むDMEM（Life Technologies,Inc.,Gaithersburg,
MD）に変更し、この低濃度血清培養液でさらに12〜18時
間培養する。血清飢餓細胞をリン酸塩を含まず、一方で
2mM Ｌ−グルタミン、0.1mM MEM非必須アミノ酸溶液、
および25mM HEPESバッファ、pH7.4が足されたダルベッ
コ修飾イーグル培養液（Dulbecco's modified Eagle's
medium）（DMEM;Life Technologies,Inc.,Gaithersbur
g,MDを一組織培養皿あたり10mlで、３回洗浄する。一培
養皿あたり3mlのリン酸塩非含有補足DMEMと、一培養皿
あたり0.8〜1.0ミリ・キューリの［³²P］オルトリン酸
（DuPont New England Nuclear,Wilmington,DE）を細胞
に添加し、さらに37℃で95％空気/5％CO₂、３時間の条
件でインキュベーションを行う。インキュベーション
後、細胞を適当な濃度のリガンド刺激剤、例えばBMP−
４で37℃、５分間処理する。処理された細胞を、一培養
皿あたり10mlの４℃、50mM Tris緩衝塩溶液（Sigma,S
t.Louis,MO）で３回洗浄し、一培養皿あたり1mlのP RIP
バッファ（20mM Tris pH8.0、100mM塩化ナトリウム、1m
Mジソジウム・エチレンジアミンテトラ酢酸、0.5％ Non
idet P−40、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、10mM
ヨウ化ナトリウム、１％牛血清アルブミン、50mMフッ化
ナトリウム、30mMテトラソジウムピロホスフェート、25
0mMオルトバナジン酸ナトリウム、1mMフェニルメチルス
ルホニルフルオライド（すべての試薬の製造元:Sigma,S
t.Louis,MO）。ライセートを遠心10,000xg、10分間で分
画し、ドデシル硫酸ナトリウム（Sigma,St.Louis,MO）
を10％ストック溶液から添加して最終濃度を0.1％とす
る（絵あれたバッファをＰ−RIPSと呼ぶ。すなわち、0.
1％ドデシル硫酸ナトリウムが懸濁されたＰ−PIP）。10
0μｌのPANSORBIN（S.aureus細胞の10％溶液；パンソル
ビン（Pansorbin）:Calbiochem,La Jolla,CA）を添加
し、チューブを氷上で30分間インキュベートする。PANS
ORBINを遠心（1000xg、３分間）によって除去し、新し
いチューブに移す。この際、このチューブには、ペプチ
ドARPRYSIGLEQDETYPPCに対して産生されたBRK−２抗体
を本アッセイで使用すること以外は上記実施例８の記載
４通りに、1:100希釈のウサギ抗BRK−２ポリクローン抗
血清が含まれている。また、上記の実施例８に記載した
ように、上記ペプチドは細胞内膜近接領域のBRK−２の
アミノ酸配列にもとづいており、配列識別番号14のアミ
ノ酸155〜172が含まれ、またＣ末端にシステインが加え
られていることによってペプチドの接合が可能である。
４℃で一晩インキュベーションした後、50μｌのパンソ
ルビンを添加し、さらに40℃、30分間インキュベートす
る。パンソルビン結合複合体を1000xg、３分間の遠心に
よりペレット化し、さらに該ペレットをＰ−RISバッフ
ァで３回洗浄し、またＰ−TNENバッファ（20mM TrispH
8.0、100mM塩化ナトリウム、1mMエチレンジアミンエト
ラ酢酸、0.5％ Nonidet P−40、50mMフッ化ナトリウ
ム、30mMテトラリン酸ソーダ、250mMオルトバナジン酸
ナトリウム、および1mMフェニルメチルスルホニルフッ
化物）で１回洗浄する。つぎに一本のチューブあたり20
mlのSDS−PAGE試料バッファ（5 Prime−3 prime,Boulde
r,CO:50mMTrispH6.8、２％ドデシル硫酸ナトリウム、0.
1Mジチオスレイトル、0.1％ブロモフェノールブルー、1
0％グリセロール）に再懸濁し、95℃、５分間加熱し、
さらに遠心（10,000Xg、３分間）してペレット化する。
上清を7.5％、12.5％、または15％SDS−ポリアクリルア
ミド・ゲル（Integrated Separation Systems,Natick,M
A）上で電気泳動する。このとき、一ゲルあたり35ミリ
アンペアの電流とし、また電気泳動バッファは25mMTris
pH8.5、192mMグリシン、および0.1％ドデシル硫酸ナト
リウム（Integrated Separation Systems,Natick,M
A）。ゲルを40％メタノール10％酢酸溶液で固定し、乾
燥させ、さらに−80℃でオートラジオグラフィーにかけ
るか、あるいはPhosphorImager分析（Molecular Dynami
cs,Sunnyvale,CA）にかける。

BRK−2/BRK−３受容体複合体のアゴニストである試験
化合物は、タンパク質の［³²P］による標識が増加する
ことによって判定されるように、BRK−２受容体に対す
る抗体によって免疫沈降されたタンパク質のリン酸化の
増加を引き起こす。アンタゴニスト活性を試験するため
に、試験化合物を一定の濃度のBMP−４または他のBMP受
容体アゴニストの存在下で添加する。BRK−2/BRK−３受
容体複合体のアゴニストである試験化合物は、一定の濃
度のBMP−４または他のBMP受容体アゴニストのみで細胞
を刺激した後に観察されるものと比較して、BRK−２免
疫沈降物に存在するタンパク質の標識の減少を引き起こ
すであろう。

BRK−３、ｔ−BRK−３、およびｍ−BRK−３の寄託 pJT4−J159F（発現ベクターpJT4内にサブクローン化
された配列識別番号11）によって形質転換された大腸菌
（E.coli）は、1993年10月７日にATCCによって寄託さ
れ、ATCC指名番号第69457号が割り当てられた。

pJT4−hBRK3T（発現ベクターpJT4内にサブクローン化
された配列識別番号３）によって形質転換された大腸菌
（E.coli）は、1994年８月16日にATCCによって寄託さ
れ、ATCC指名番号第69676号が割り当てられた。

pJT6−mBRK−3S（発現ベクターpJT6内にサブクローン
化された配列識別番号７）によって形質転換された大腸
菌（E.coli）は、1994年９月28日にATCCによって寄託さ
れ、ATCC指名番号第69694号が割り当てられた。

pJT6−mBRK−3L（発現ベクターpJT6内にサブクローン
化された配列識別番号７）によって形質転換された大腸
菌（E.coli）は、1994年９月28日にATCCによって寄託さ
れ、ATCC指名番号第69695号が割り当てられた。

pHSK1040（BLUESCRIPT II SK（−）内にサブクローン
化された配列識別番号１）によって形質転換された大腸
菌（E.coli）は、1994年10月12日にATCCによって寄託さ
れ、ATCC指名番号第69703号が割り当てられた。

当業者に理解されるように、DNAおよびアミノ酸シー
クエンシング法ではしばしばエラーが生ずる。その結
果、寄託した材料にコード化された配列を本明細書に援
用するとともに、本発明の記載に見出された配列のいず
れかに生じた誤りを管理するものとする。さらに、本明
細書の記載から出願人の研究を再現する当業者は、日常
的な技術によって配列決定に何らかの誤りを発見するこ
とが可能である。ATCC第69457号、ATCC第69676号、ATCC
第69694号、ATCC第69695号、およびATCC第69703号は、
寄託した材料が本発明の実施に不可欠のものであること
を認めるものではない。

本明細書で指摘したすべての文献を本明細書では援用
する。

本明細書に記載した実施例および実施態様は説明する
ことのみを目的としたものであって、それらの範囲内で
当業者が考えつく種々の変更または修飾は、本出願の思
想および範囲、さらには添付したクレームの範囲に含ま
れる。

配列リスト （１）概要 （ｉ）出願人：ローゼンバウム、ジャン エス（ROSE
NBAUM,JAN S.） （ii）発明の名称：骨代謝活性のスクリーニングに対
するBMPタンパク質受容体複合体の使用とII型BMP受容体
およびＩ型BMP受容体によって同時トランスフェクショ
ンした細胞 （iii）配列の数:26 （iv）連絡先： （Ａ）宛先：ザ・プロクター・アンド・ギャンブル
・カンパニー （Ｂ）街路:11810イースト・マイアミ・リバー・ロ
ード （Ｃ）都市：ロス （Ｄ）州：オハイオ （Ｅ）国：米国 （Ｆ）郵便番号:45061 （ｖ）コンピュータ読み取り可能な形態： （Ａ）媒体の形態：フロッピー・ディスク （Ｂ）コンピュータ:IBMパーソナル・コンピュータ
互換性 （Ｃ）オペレーティング・システム:PC−DOS/MS−D
OS （Ｄ）ソフトウエア：パテントイン（PatentIn）リ
リース＃10、バージョン＃1.25 （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （viii）弁護士／代理人情報： （Ａ）氏名：コルスタンジェ、ブラーム、ジェー
（CORSTANJE,BRAHM J.）（Ｂ）登録番号:34,804 （Ｃ）証明書／明細書番号：ケース5474R （ix）電気通信情報： （Ａ）電話:513−627−2858 （Ｂ）ファックス:513−627−0260 （２）配列識別番号１に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:3601塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖状態：二重鎖 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子種:cDNA （ix）特徴： （Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置:409..3525 （xi）配列の記載：配列識別番号1: （２）配列識別番号２に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:1038アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子種：タンパク質 （xi）配列の記載：配列識別番号2: （２）配列識別番号３に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:2156塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖状態：二重鎖 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子種:cDNA （ix）特徴： （Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置:409..2154 （xi）配列の記載：配列識別番号3: （２）配列識別番号４に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:582アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子種：タンパク質 （xi）配列の記載：配列識別番号4: （２）配列識別番号５に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:471塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖状態：二重鎖 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子種:cDNA （ix）特徴： （Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置:19..471 （xi）配列の記載：配列識別番号5: （２）配列識別番号６に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:150アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子種：タンパク質 （xi）配列の記載：配列識別番号6: （２）配列識別番号７に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:3508塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖状態：二重鎖 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子種:cDNA （ix）特徴： （Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置:17..3133 （xi）配列の記載：配列識別番号7: （２）配列識別番号８に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:1038アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子種：タンパク質 （xi）配列の記載：配列識別番号8: （２）配列識別番号９に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:469塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖状態：二重鎖 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子種:cDNA （ix）特徴： （Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置:17..469 （xi）配列の記載：配列識別番号9: （２）配列識別番号10に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:150アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子種：タンパク質 （xi）配列の記載：配列識別番号10: （２）配列識別番号11に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:2402塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖状態：二重鎖 （Ｄ）形態：線状 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置：ジョイン（11..1609） （xi）配列の記載：配列識別番号11: （２）配列識別番号12に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:532アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子種：タンパク質 （xi）配列の記載：配列識別番号12: （２）配列識別番号13に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:2252塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖状態：二重鎖 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子種:cDNA （ix）特徴： （Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置:355..1863 （xi）配列の記載：配列識別番号13: （２）配列識別番号14に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:502アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子種：タンパク質 （xi）配列の記載：配列識別番号14: （２）配列識別番号15に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:469塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖状態：二重鎖 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子種:cDNA （ix）特徴： （Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置:11..469 （xi）配列の記載：配列識別番号15: （２）配列識別番号16に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:152アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子種：タンパク質 （xi）配列の記載：配列識別番号16: （２）配列識別番号17に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:391塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖状態：二重鎖 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子種:cDNA （ix）特徴： （Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置:11..391 （xi）配列の記載：配列識別番号17: （２）配列識別番号18に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:126アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子種：タンパク質 （xi）配列の記載：配列識別番号18: （２）配列識別番号19に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:706塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖状態：二重鎖 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子種:cDNA （ix）特徴： （Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置:11..706 （xi）配列の記載：配列識別番号19: （２）配列識別番号20に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:231アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子種：タンパク質 （xi）配列の記載：配列識別番号20: （２）配列識別番号21に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:616塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖状態：二重鎖 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子種:cDNA （ix）特徴： （Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置:11..616 （xi）配列の記載：配列識別番号21: （２）配列識別番号22に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:201アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子種：タンパク質 （xi）配列の記載：配列識別番号22: （２）配列識別番号23に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:613塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖状態：二重鎖 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子種:cDNA （ix）特徴： （Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置:11..613 （xi）配列の記載：配列識別番号23: （２）配列識別番号24に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:200アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子種：タンパク質 （xi）配列の記載：配列識別番号24: （２）配列識別番号25に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:613塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖状態：二重鎖 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子種:cDNA （ix）特徴： （Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置:11..613 （xi）配列の記載：配列識別番号25: （２）配列識別番号26に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:200アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子種：タンパク質 （xi）配列の記載：配列識別番号26:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．，1995年 ８月，ｖｏｌ．92，ｐ 7632−7636 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，1995年 ９月，ｖｏｌ．270，ｎｏ. ３，ｐ22522−22526 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌ ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，1995年 ７月，ｖｏｌ．15，ｎｏ．７，ｐ3479− 3486 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/53 - 33/577 C12N 5/10 C12N 15/09 ZNA C12P 21/02 C12N 5/10 C12R 1:91

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】化合物がBMP受容体キナーゼ・タンパク質
   複合体に結合することが可能であるかどうかを判断する
   方法であって、 前記化合物を含有する試料を前記複合体に取り入れて、
   前記複合体に前記化合物を結合させる工程を有し、さら
   に、 前記複合体は、Ｉ型BMP受容体キナーゼ・タンパク質
   と、配列識別番号２または該配列識別番号２の可溶性フ
   ラグメント、配列識別番号４または該配列識別番号４の
   可溶性フラグメント、及び配列識別番号８または該配列
   識別番号８の可溶性フラグメントから選択されるアミノ
   酸配列を有するBMP受容体キナーゼ・タンパク質BRK−３
   とからなることを特徴とする方法。
2. 【請求項２】BMP受容体キナーゼ・タンパク質BRK−３は
   配列識別番号４のアミノ酸配列を有することを特徴とす
   る請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】前記Ｉ型BMP受容体キナーゼ・タンパク質
   は配列識別番号12または配列識別番号14のアミノ酸配列
   を有することを特徴とする請求項１または２に記載の方
   法。
4. 【請求項４】前記Ｉ型BMP受容体キナーゼ・タンパク質
   は配列識別番号14のアミノ酸配列を有することを特徴と
   する請求項１または２に記載の方法。
5. 【請求項５】BMP受容体キナーゼ・タンパク質BRK−３を
   コードするDNA配列を含む発現ベクターと、Ｉ型BMP受容
   体キナーゼ・タンパク質をコードするDNA配列を含む発
   現ベクターとによって同時トランスフェクションされた
   宿主細胞であって、前記BMP受容体キナーゼ・タンパク
   質BRK−３をコードするDNA配列は、配列識別番号１、配
   列識別番号３、配列識別番号５、配列識別番号７、及び
   配列識別番号９から選択されることを特徴とする宿主細
   胞。
6. 【請求項６】前記Ｉ型BMP受容体キナーゼ・タンパク質
   をコードするDNA配列は、配列識別番号11または配列識
   別番号13であることを特徴とする請求項５に記載の宿主
   細胞。
7. 【請求項７】前記BMP受容体キナーゼ・タンパク質BRK−
   ３をコードするDNA配列は配列識別番号３であることを
   特徴とする請求項５または請求項６に記載の宿主細胞。
8. 【請求項８】臨床試料に含まれるBMP受容体リガンドの
   濃度を決定する方法であって、 a.前記リガンドを含む臨床試料をBMP受容体キナーゼ・
   タンパク質複合体および標識BMPと混合する工程と、 b.前記試料存在下、前記複合体に前記標識BMPを結合さ
   せる工程と、 c.既知の濃度のBMPリガンドによって用意した標準曲線
   と比較する工程とを有し、さらに、 BMP受容体キナーゼ・タンパク質複合体は、Ｉ型BMP受容
   体キナーゼ・タンパク質と、配列識別番号２または該配
   列識別番号２の可溶性フラグメント、配列識別番号４ま
   たは該配列識別番号４の可溶性フラグメント、及び配列
   識別番号８または該配列識別番号８の可溶性フラグメン
   トから選択されるアミノ酸配列を有するBMP受容体キナ
   ーゼ・タンパク質BRK−３とからなることを特徴とする
   方法。
9. 【請求項９】前記Ｉ型BMP受容体キナーゼ・タンパク質
   は、配列識別番号12、配列識別番号14、配列識別番号1
   6、または配列識別番号18のアミノ酸配列を有すること
   を特徴とする請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】試験化合物がBMP受容体タンパク質複合
    体への結合に対する信号を生ずるかどうかを判断する方
    法であって、 （ａ） BMP受容体キナーゼ・タンパク質BRK−３をコー
    ドするDNA配列とＩ型BMP受容体キナーゼ・タンパク質を
    コードするDNA配列とによってトランスフェクションさ
    れたBMP受容体タンパク質複合体発現細胞を32Pによって
    標識する工程と、ここで、前記BMP受容体キナーゼ・タ
    ンパク質BRK−３をコードするDNA配列は、配列識別番号
    １、配列識別番号３、配列識別番号５、配列識別番号
    ７、及び配列識別番号９から選択される、 （ｂ）（ｉ） 前記試験化合物存在下での前記細胞の第
    １の組の培養と、 （ii） 前記試験化合物不存在下での前記細胞の第２の
    組の培養とを行う工程と、 （ｃ） 前記工程（ｂ）によって生じたリン酸化タンパ
    ク質をオートラジオグラフィーを介して定量する工程
    と、 （ｄ） 前記工程（ｃ）によって定量された前記細胞の
    第１の組の前記リン酸化タンパク質の量を、前記工程
    （ｃ）によって定量された前記細胞の第２の組の前記リ
    ン酸化タンパク質の量と比較する工程とを有することを
    特徴とする方法。
11. 【請求項１１】試験化合物がBMP受容体タンパク質複合
    体への結合に対する信号を生ずるかどうかを判断する方
    法であって、 （ａ） BMP受容体キナーゼ・タンパク質BRK−３をコー
    ドするDNA配列とＩ型BMP受容体キナーゼ・タンパク質を
    コードするDNA配列とによってトランスフェクションさ
    れたBMP受容体タンパク質複合体発現細胞を³²Pによって
    標識する工程と、ここで、前記BMP受容体キナーゼ・タ
    ンパク質BRK−３は、配列識別番号２または該配列識別
    番号２の可溶性フラグメント、配列識別番号４または該
    配列識別番号４の可溶性フラグメント、及び配列識別番
    号８または該配列識別番号８の可溶性フラグメントから
    選択されるアミノ酸配列を有する、 （ｂ）（ｉ） 前記試験化合物存在下での前記細胞の第
    １の組の培養と、 （ii） 前記試験化合物不存在下での前記細胞の第２の
    組の培養とを行う工程と、 （ｃ） 前記工程（ｂ）によって生じたリン酸化タンパ
    ク質をオートラジオグラフィーを介して定量する工程
    と、 （ｄ） 前記工程（ｃ）によって定量された前記細胞の
    第１の組の前記リン酸化タンパク質の量を、前記工程
    （ｃ）によって定量された前記細胞の第２の組の前記リ
    ン酸化タンパク質の量と比較する工程とを有することを
    特徴とする方法。