JPH10510047A - 骨代謝活性のスクリーニングに対するｂｍｐタンパク質受容体複合体の使用とｉｉ型ｂｍｐ受容体およびｉ型ｂｍｐ受容体によって同時トランスフェクションした細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、化合物がBMP 受容体キナーゼ・タンパク質複合体に結合することが可能であるかどうかを判断する方法に関し、該方法は、化合物を含有する試料を複合体に取り入れて、該複合体に化合物を結合させる工程を有し、さらに複合体はＩ型BMP 受容体キナーゼ・タンパク質とBMP 受容体キナーゼ・タンパク質BRK-3 とからなる。本発明は、さらに臨床試料に含まれるBMP 受容体リガンドの濃度を決定する方法に関し、該方法は、BMP 受容体キナーゼ・タンパク質複合体にリガンドを含む試料を取り入れて、リガンドをBMP 受容体キナーゼ・タンパク質に結合させる工程を有し、さらに、BMP 受容体キナーゼ・タンパク質複合体は、ＩBMP 受容体キナーゼ・タンパク質とBMP 受容体キナーゼ・タンパク質BRK-3 とからなる。本発明は、さらにBMP 受容体キナーゼ・タンパク質BRK-3 をコードするDNA 配列を含む発現ベクターと、Ｉ型BMP 受容体キナーゼ・タンパク質をコードするDNA 配列を含む発現ベクターとによって同時トランスフェクションした宿主細胞に関する。本発明は、さらに可溶性Ｉ型BMP 受容体キナーゼ・タンパク質をコードするDNA 配列を含む発現ベクターと、可溶性BMP 受容体キナーゼ・タンパク質BRK-3 をコードするDNA 配列を含む発現ベクターとによって同時トランスフェクションした宿主細胞に関する。本発明は、さらに試験化合物がBMP 受容体タンパク質複合体と結合するやいなや信号を生ずるかどうかを判断する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 骨代謝活性のスクリーニングに対するBMP タンパク質受容体複合体の使用と II型BMP 受容体およびＩ型BMP 受容体によって 同時トランスフェクションした細胞 技術分野 本発明は、骨の形成および分化の分野に関係する。特に、本発明は新規骨形態 形成タンパク質II型受容体を、骨形態形成Ｉ型受容体と一緒に使用して骨代謝活 性のスクリーニングを行うことに関係する。さらに、本発明はこの受容体をコー ドするDNA と１型の骨形態形成タンパク質をコードするDNA とによって同時トラ ンスフェクションした細胞に関する。 背景技術 ヒトおよび他の温血動物はいくつかの骨に関連した病気に罹る可能性を有する 。そのような病気には、骨折からヒトを衰弱させる骨粗鬆症等の病気が含まれる 。健康なヒトの骨成長は一般に正常に進行し、また骨折治癒は薬理学的介入を必 要としない。しかし、ある種の場合においては骨が弱まって骨折治癒が正常に行 われないと考えられる。例えば、高齢者あるいは副腎皮質ホルモン（例：移植患 者）による治療を受けている患者の場合、治癒の進行が遅くなると思われる。骨 粗鬆症は、骨の硬組織の損失が新規硬組織の発生に対して不釣り合いな状態とな る容態をいう。骨粗鬆症を骨量の減少、あるいは骨組織の萎縮として一般に定義 することができ、髄質および骨空間が広がり、線維結合が減少し、緻密質が脆弱 になる。骨関連疾患の他の例としては、変形性関節症がある。これは、関節表面 での骨の新生と同様に関節軟骨の変質および摩耗によって特徴づけられる可動関 節の疾患である。 そのような骨に関係した疾患に有効な種々の治療法がある一方で、最善の結果 が得られるような治療法は知られていない。骨に関係した疾患の治療を受ける患 者が直面する問題点の一つは、骨代謝および骨関連疾患に対して完全な理解がな されていないということである。そのような理解の鍵となることは、骨成長に関 与する成分の各々を同定し、かつ分類することである。骨形態形成タンパク質（ BMP）が骨の形成および発達に何らかの役割を担うことが報告されている(J.M．W ozney，Molec．Reproduct．and Develop.，32: 160-167(1992))。 さらに、BMP の役割は骨のみに限定されるものではないと考えられる。他の組 織、例えば脳、腎臓、重層扁平上皮、および毛包においても高濃度で検出される という知見（N.A．Wall，M．Blessing，C.V.E．Wright，and B.L.M．Hogan，J． Cell．Biol.，120: 493-502(1993); E．Ozkaynk，P.N.J．Schnegelsberg，D.F． Jin，G.M．Clifford，F.D．Warren，E.A．Drier and H．Oppermann，J．Biol．C hem.，267: 25220-25227(1992); K.M．Lyons，C.M．Jones，and B.L.M．Hogan， Trends in Genetics，7: 408-412(1991); V．Drozdoff，N.A．Wall，and W.J．P ledger，Proceedings of the National．Academy of Sciences，U.S.A.，91: 55 28-5532(1994)）は、成長および分化においてそれらが特別な役割を担うことが 示唆されている。このことを支持することについては、BMP は神経細胞の分化を 促進させること、また毛包形成に悪影響をあたえるという知見が得られている(K ．Basler，T．Edlund，T.M．Jessell，and T．Yamada，Cell，73: 687-702(1993 ); V.M．Paralkar，B.S．Weeks，Y.M．Yu，H.K．Kleinman，and A.H．Reddi，J ．Cell．Biol.，119: 1721-1728(1992); M．Blessing，L.B．Nanney，L.E．King ，C.M．Jones，and B.L．Hogan，Genes Dev.，7: 204-215(1993))。 BMP は、BMP 感受性細胞の細胞質膜上に発現された特異的BMP レセプターに結 合することによって、その生物的効果が細胞に対してイニシエートされる。レセ プターはタンパク質であり、通常は細胞膜をまたがっており、細胞外からのリガ ンドに結合する。そのような結合が信号を細胞の内側へ送ることによって細胞の 機能に変化が生ずる。この場合、リガンドはタンパク質BMP であり、また信号は 細胞分化を引き起こす。 BMP レセプターは特異的にBMP に結合する能力を有するので、精製BMP レセプ ター組成物は、診断および治療に用いるためにBMP レセプターに対する抗体を産 生することと同様に、BMP の診断アッセイに有用である。さらに、精製BMP レセ プター組成物は、BMP に結合またはBMP をスカベンジするために、治療の場で直 接使用されてもよく、それによって骨および他の組織にあるBMP の活性を制御す る手段が与えられる。BMP 受容体の構造的かつ生物学的特性、組織成長／形成刺 激中にBMP の種々の細胞数に応じてBMP によって演じられる役割、または治療、 診断あるいアッセイにおいて効果的に使用できるように、BMP 受容体の精製組成 物が求められている。しかし、そのような組成物は組み換えDNA 技術を用いて受 容体をコード化する遺伝子のクローニングおよび発現によって実質的な量が得ら れるだけである。生化学分析またはBMP をコード化するほ乳類遺伝子のクローニ ンイングおよび発現に使用するためにBMP 受容体を精製しようとしても、受容体 タンパク質またはmRNAの適当な源がないことが妨げとなっている。本発明に先だ って、いくつかの細胞系統が高濃度の高親和性BMP 受容体を発現することが知ら れている。この高親和性BMP 受容体は、タンパク質をシークエンシングするため に受容体を精製すること、また直接発現クローニングのために遺伝子ライブラリ ーを構築することを妨げる。BMP 受容体配列が容易に得られることが生化学的分 析およびスクリーニング実験での使用のために、高濃度の組み換えBMP 受容体を 持つ細胞系統の発生を可能とするであろう。 BMP はTGF-βスーパーファミリーに属する。TGF-βスーパーファミリーの他の メンバーとしては、TGF-β、アクチビン、インヒビン、ミュラー管抑制物質、お よび生長・分化因子（GDF）が挙げられる。予想通り、TGF-βファミリーを構成 する種々の物質は類似の構造的特性を共有する。TGF-βリガンド・スパーファミ リーの受容体は一般に２つのサブ・グループ、Ｉ型およびII型のいずれかに分類 される。Ｉ型受容体およびII型受容体のいずれもアミノ酸配列の特徴にもとづい て分類される。これらＩ型受容体およびII型受容体の両方とも相対的に小さな細 胞外リガンド結合ドメイン、トランスメンブラン領域、および細胞内タンパク質 キナーゼ・ドメインを有する。この細胞内タンパク質キナーゼ・ドメインはセリ ン／キナーゼ活性を持つものと考えられている(Lin and Moustakas，Cellular a nd Molecular Biology 40: 337-349(1994)，L.S．Mathews，Endocrine Reviews，15: 310-325(1994); L．Attisano，J.L．Wrana，F．Lopez-Casillas， and J．Massague，Biochimica et Biophysica Acta，1222：71-80(1994))。 今日までクローン化されたＩ型受容体は、異なるファミリーに属するもので、 キナーゼ・ドメインは相関性および共通性が高く、>85％配列相同性を示す（B.B ．Koenig et al.，Molecular and Cellular Biology，14: 5961-5974(1994)）。 Ｉ受容体の細胞近接領域は、トランスメンブラン領域からのSGSGSGモチーフ35〜 40アミノ酸によって特徴づけられるもので、さらにこれら受容体のカルボキシ末 端は非常に短い（B.B．Koening et al.，Molecular and Cellular Biology，14: 5961-5974(1994); L．Attisano，J．L．Wrana，F．Lopez-Casillas，and J．Ma ssague，Biochimica et Biophysica Acta，1222:71-80(1994)）。Ｉ型受容体の 細胞外ドメインは、“システイン・ボックス”と呼ばれ、かつトランスメンブラ ン領域の25〜30アミノ酸のなかに位置したシステイン残基からなる特徴的なクラ スタしと、“上流システイン・ボックス”と呼ばれ、かつ推定信号配列の後に位 置したシステイン残基からなる他のクラスタとを含む（B.B．Koening，et al.， Molecular and Cellular Biology，14: 5961-5974(1994); L．Attsano，et al. ，Biochimica et Biophysica Acta，1222: 71-80(1994)）。 Ｉ型受容体と比較して、II型受容体のキナーゼ・ドメインでは互いに他のもの と離れた関係にあるだけである。Ｉ型受容体に見いだされたSGSGSGモチーフは、 II型受容体では見いだされない。また、Ｉ型受容体の“上流システイン・ボック ス”は、II型受容体には存在しない。さらに、アクチビンII型受容体のすべたが 細胞内膜近接領域にプロリン・リッチの配列を含む一方で、すべてのII型受容体 に共通の特徴的な配列モチーフが存在しない(L.S．Mathews，Endocrine Reviews ，15: 310-325(1994))。II型受容体のカルボキシ末端の長さは、顕著に変わるも のであり、BMPIＩ型受容体でもっとも長いカルボキシ末端、AF−４（M．Estevez ，L．Attisano，J.L.Wrana，P.S．Albert，J．Massague，and D.L．Riddle，Nat ure，365: 644-49（1993））が発見されている。このAF-4は、線虫C.elegans か らクローン化したものである。II型受容体の細胞外ドメインは、トランスメンブ ラン・領域近傍の単一システイン・ボックスを備える。シス テイン・ボックスの存在とは別に、TGF-β、アクチビン、およびBMP に対するII 型受容体の細胞外ドメインの間に、わずかな配列の類似性がある。 TGF-βリガンド・スーパーファミリーの一員による情報伝達は、同一細胞の表 面上にＩ型およびII型受容体の両方を必要とする（L.S．Mathews．Endocrine Re views，15: 310-325(1994); L．Attisano，J.L．Wrana，F．Lopez-Casillas，an d J．Massague，Biochimica et Biophysica Acta，1222，71-80(1994)）。 BMP は、TGF-βリガンド・スーパーファミリーのメンバーであって、ファミリー のメンバー間において構造的類似性の度合いが高い。そのため、これらの受容体 は構造的に、かつ機能的にTGF-βおよびアクチビン受容体に関連すると期待され る。TGF-βおよびアクチビン受容体システムのように（J．Maassague，L．Attis ano，and J．L．Wrana，Trends in Cell Biology，4: 172-178(1994)）、Ｉ型BM P 受容体およびII型BMP 受容体は細胞または組織内でBMP 信号を変換するのに必 要となろう。したがって、すでにクローン化されたＩ型受容体に加えてほ乳類動 物II型BMP 受容体キナーゼ・タンパク質が求められている。 BMP、すなわち骨形態形成タンパク質受容体キナーゼ−Ｉ(Bone Morphogenetic Protein Receptor Kinase-I 、以下“BRK−１”と呼ぶ)(参照：U.S.S.N．08/15 8,735，J.S．Cook，et al.; and B.B．Koening et al．Molecular and Cellular Biology．14: 5961-5974(1994))、ALK-2、およびALK-6 に関して３種類の異な るほ乳類動物Ｉ型受容体が報告されている。BRK-1 は、ALK-3 のマウス相同体で あり、ALK-6 と同様にBMP-4 に結合し、AK-2 はBMP-7 に結合する（参照：P．te n Dijike，H．Yamashitaa，T.K Sampath，A.H．Reddi，M．Estevez，D.L．Riddl e，H．Ichijo，C.-H．Heldin，and K．Miyazono，J．Biological Chemistry，26 9: 16985-116988(1994)）。また、ALK-6 がニワトリ受容体骨形態形成タンパク 質受容体キナーゼ-2(以下、“BRK-2”と呼ぶ)(またBRK-1 と呼ぶ)(参照：S．Smi tomo，T．saito，and T．Nohno，DNA Sequence，3: 297-302(1993))。BRK −１ のラットの相同体もまた、BMPR-Ia としてクローン化されている(K．Takeda，S ．Oida，H．Ichijo，T．limura，Y．Marnoka，T．Amagasa and S．Sasaki，Bioc hemical and Biophysical Resarch Communications，204: 203-209(1994))。 同時係属出願のRosenbaum およびNohno のU．S．S．N．08/334,179（1994年11 月４日出願）では、新規のほ乳類動物BMPII 型受容体（“BRK-3”と呼ぶ）が開 示され、かつクレームされている。BRK-3 受容体のクローニングに先だって、BM P-2 およびBMP-4 のDAF-4 と呼ばれる唯一のII型受容体を線虫C.elegansらクロ ーン化した（M．Estevez，L．Attisano，J.L．Wrana，P.S．ALbert，J．Massagu e，aand D.L．Riddle，Nature，365: 644-9(1993)）。線虫とほ乳類との間には 進化のレベルでは大きな隔たりがあるので、DAD-4 cDNAを用いてほ乳類のDAD-4 相同体をクローン化するのは可能ではないとされてきた。このことは、BMP につ いてのほ乳類II型受容体のDNA 配列が実質的にDAF-4 から分岐していること、さ らにBMP についてほ乳類動物のII型受容体をクローン化するのが必要であること を意味している。 同時係属出願のBMP 受容体キナーゼ・タンパク質BRK-3 は、Ｉ型BMP 受容体と の複合体形成を可能とするほ乳類II型受容体を提供する。以下に詳細に説明する この複合体は、高い親和性でもってBMP に結合することが可能であり、このこと からBMP 受容体親和性を持つ化合物を同定するのに好適である。本発明の複合体 は、応答能を持つことによってBMP に対するほ乳類Ｉ型受容体と共同してBMP に 対する応答を情報伝達する高親和性複合体の形成も可能とする。したがって、線 虫II型受容体とほ乳類Ｉ型受容体とから構成される受容体複合体よりもほ乳類BM P 受容体複合体はBMP 受容体と相互作用する新規化合物の同定によりいっそう関 係するもので、ヒトおよび他のほ乳類動物の治療薬として用いることができよう 。 本発明の目的 本発明の目的は、BMP 受容体キナーゼ・タンパク質複合体に結合することが可 能な化合物を同定する方法を提供することである。 本発明の別の目的は、試料中のBMP 受容体キナーゼ・タンパク質複合体に対す る結合能を持つ化合物の量を決定する方法を提供することである。 本発明の別の目邸は、II型BMP 受容体キナーゼ・タンパク質をコード化する組 み換え発現ベクターとBMP 受容体キナーゼ・タンパク質複合体を含むＩ型BMP 受 容体キナーゼ・タンパク質をコード化する組み換え発現ベクターと含む宿主細胞 を提供することである。 本発明の別の目的は、試験化合物がBMP 受容体タンパク質複合体への結合に対 する信号を作るかどうかを決定する方法を提供することである。 要約 本発明は、化合物がBMP 受容体キナーゼ・タンパク質複合体に結合することが 可能であるかどうかを判断する方法に関し、該方法は、化合物を含有する試料を 複合体に取り入れて、該複合体に化合物を結合させる工程を有し、さらに複合体 はＩ型BMP 受容体キナーゼ・タンパク質とBMP 受容体キナーゼ・タンパク質BRK- 3 とからなる。 本発明は、さらに臨床試料に含まれるBMP 受容体リガンドの濃度を決定する方 法に関し、該方法は、BMP 受容体キナーゼ・タンパク質複合体にリガンドを含む 試料を取り入れて、リガンドをBMP 受容体キナーゼ・タンパク質に結合させる工 程を有し、さらに、BMP 受容体キナーゼ・タンパク質複合体は、Ｉ型BMP 受容体 キナーゼ・タンパク質とBMP 受容体キナーゼ・タンパク質BRK-3 とからなる。 本発明は、さらにBMP 受容体キナーゼ・タンパク質BRK-3 をコードするDNA 配 列を含む発現ベクターと、Ｉ型BMP 受容体キナーゼ・タンパク質をコードするDN A 配列を含む発現ベクターとによって同時トランスフェクションした宿主細胞に 関する。 本発明は、さらに可溶性Ｉ型BMP 受容体キナーゼ・タンパク質をコードするDN A 配列を含む発現ベクターと、可溶性BMP 受容体キナーゼ・タンパク質BRK-3 を コードするDNA 配列を含む発現ベクターとによって同時トランスフェクションし た宿主細胞に関する。 本発明は、さらに不完全なＩ型BMP 受容体キナーゼ・タンパク質をコードする DNA 配列を含む発現ベクターと、不完全なBMP 受容体キナーゼ・タンパク質BRK- 3 をコードするDNA 配列を含む発現ベクターとによって同時トランスフェク ションした宿主細胞に関する。 本発明はさらに試験化合物がBMP 受容体タンパク質複合体と結合するやいなや 信号を生ずるかどうかを判断する方法に関するもので、この方法は、(a)BMP容体 キナーゼ・タンパク質BRK-3 をコードするDNA 配列とＩ型BMP 受容体キナーゼ・ タンパク質をコードするDNA 配列とによってトランスフェクションしているBMP 受容体タンパク質複合体発現細胞を³²P によって標識する工程と、(b)(i)試験化 合物存在下での上記細胞の第１の組の培養と、(ii)試験化合物不存在下での上記 細胞の第２の組の培養とを行う工程と(c)工程(b)によって生じたリン酸化タンパ ク質をオートラジオグラフィーを介して定量する工程と、(d)工程(c)によって定 量された上記細胞の第１の組の前記リン酸化タンパク質の量を、工程(c)によっ て定量された細胞の第２の組のリン酸化タンパク質の量と比較する工程とを有す る。 図面の簡単な説明 図１は、t-BRK-3 のPCR 増幅で使用される変質オリゴヌクレオチド・プライマ ーのDNA 配列を示す図である。塩基であるアデニン、チミン、シトシン、および グアニンをそれぞれＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧで表す。Ｎという文字はその部位にＡ 、Ｔ、Ｃ、およびＧの等量混合物が存在することを示す。プライマーは、TGF-β II型受容体の配列由来である（H.Y．Lin，X.F．Wang，E．Ng-Eaton，R.A．Weinb erg，and H.F．Lodish，Cell，68: 775-785(1992)）。 図２は、t-BRK-3 の一過性ほ乳類発現に使用されるpJT 4-hBRK3Tの構成を示す 。CMV は、サイトメガロウイルス初期プロモータ／エンハンサー、Ｒは、ヒトT- 細胞白血病ウイルス−１の長い末端繰り返し由来の“Ｒ”因子、SPは、SV40ウィ ルス由来イントロン・スプライシング部位、T3は、T3バクテリオファージ由来の プロモータ領域、T7は、T7バクテリオファージ由来のプロモータ領域、polyA は 、メッセージのポリアデニレーションを指示するSV40ウィルス由来の領域、Amp は、大腸菌（E.coli）の淘汰に使うアンピシリン抵抗遺伝子である。 図３は、BRK-1 の一過性ほ乳類発現に使用されるpJT 4-J159F の構成を示す。 略語は図２のものと同じである。 図４は、BRK-2 の一過性ほ乳類発現に使用されるpJT3−BRK 2 の構成を示す。 略語は図２のものと同じである。 図５は、C．elegans 受容体DAF-4 の一過性ほ乳類発現に使用されるpJT 4-Daf ４の構成を示す。略語は図２のものと同じである。 図６は、Ｉ型受容体BRK-1 およびBRK2の存在または不在下でCOS-7 細胞におい て発現されたt-BRK-3 に対する[¹²⁵I]-BMP-4 の全細胞結合を示す。棒は[¹²⁵I]- BMP-4 の特異的結合を示すもので、細胞数に標準化している。左から右に、NIH3 T3胚線維芽細胞； ベクターPJT-4 単独（“mock”と表す）でトランスフェクシ ョンしたCOS-7 細胞； BRK-1 単独、BRK-1 プラス10または20μgのt-BRK-2、BR K-2 単独、BRK-2 プラス10または20μg のt-BRK-3、およびt-BRK-3 単独（20μg ）でトランスフェクションしたCOS-7 細胞である。 図７は、Ｉ型BRK-1 およびBRK-2 の存在または不在下におけるtBRK-3によりト ランスフェクションしたCOS-1 細胞に対する[¹²⁵I]-BMP-4 の架橋形成反応を示 す。分子量の基準を左側に示す。右側の表示は[¹²⁵I]-BMP-4 と架橋したt-BRK-3 、BRK-1、およびBRK-2 の予測分子量に移動するバンドを示す。左から右へ、各 レーンはBRK-1 単独；BRK-1 プラス２μg／mlのt-BRK-3 BRK-1 プラス４μg ／m lのt-BRK-3 ；BRK-2 単独；BRK-2 プラス２μg ／mlのt-BRK-3 ；BRK-2プラス４ μg ／mlのt-BRK-3 ；２μg ／mlのt-BRK-3 単独；および４μg ／mlのt-BRK 単 独でトランスフェクションしたCOS-1 細胞を示す。DNA 混合物の容量は４mlであ る。この図では、“BRK-3^*”はt-BRK-3 である。 図８は、tBRK-3と、COS-1 細胞で発現し、かつＩ型受容体BRK-1 またはBRK-2 の存在または不在下で[¹²⁵I]-BMP-4 に架橋したC．elegansIＩ型受容体DAF-4 と の免疫沈降を示す。分子量の基準を左側に示す。また、右側に示す領域は、[¹²⁵ I]-BMP-4に架橋したDAF-4、t-BRK-3、BRK-1、またはBRK-2 の予測分子量で移動 委する標識タンパク質バンドを示す。II型受容体の存在または不在下でBRK-1 に よってトランスフェクションしたCOS-1 細胞に対しては抗血清1379を用い、また II型受容体の存在または不在下でBRK-2 によってトランスフェクションしたCOS- 1 細胞に対しては抗血清1380を用いた。他のものすべてについて、抗 血清は括弧内に表示した。左から右へ、NIH3T3胚線維芽細胞(1379)、つづいてBR K-1 単独、BRK-1 プラスDAF-4、BRK-1 プラスt-BRK-3、BRK-2 単独、BRK-2プラ スDAF-4、BRK-2 プラスt-BRK-3 である。これにつづいて、NIH3T3細胞(1380)、D AD-4 単独でトランスフェクションしたCOS-1 細胞(1379)、およびt-BRK-3 単独 でトランスフェクションしたCOS-1 細胞（1380）である。図中、“BRK-3^*”はt- BRK-3 である。 図９は、BRK-2 およびt-BRK-3 でトランスフェクションし、かつ示したような 非標識拮抗剤の存在または不在下において210pM の[¹²⁵I]-BMP-4 に架橋したCOS -1 細胞の免疫沈降を示す。抗血清1380を用いた。左側の重複レーンは非標識拮 抗剤が添加されていない状態を示し、つづいて（左から右へ）10nMのBMP4、10nM のBMP-2、10nMのBMP-2、10nMのDR-BRMP-2、および50nMのTGF-β１を添加した場 合を示す。図中、“BRK-3^*”はt-BRK-3 である。 図10は、マウスBRK-3 の一時的ほ乳類発現に使用されるpJT6-mBRK-3Lの構成を 示す。略語は図２のものと同じである。 図11は、マウスBRK-3 の一時的ほ乳類発現に使用されるpJT6-mBRK-3Sの構成を 示す。この構成では、未翻訳３′領域のほとんどが取り除かれている。略語は図 ２のものと同じである。 図12は、Ｉ型受容体BRK-2 の存在または不在下でCOS-1 細胞において発現され たマウスBRK-3 に対する[¹²⁵I]-BMP-4 の全細胞結合を示す。棒は[¹²⁵I]-BMP-4 の特異的結合を示すもので、細胞数に標準化している。マウスBRK-3 に用いた構 成はpJT6-mBRK-3LおよびpJT6-mBRK-3Sであり、BRK-2 については、構成はpJT3− BRK-2 である。両構成ともマウスBRK-3 の完全なコード領域が含まれる。pJT6-m BRK-3Sでは、３′未翻訳領域のA-T リッチ領域が欠失している。左から右に、ベ クターPJT-6 単独(“mock”と表す);pJT3−BRK-2 独；構成pJT6-mBRK-3S単独；p JT6-mBRK-3L単独；pJT3-BRK-2 プラスpJT6-BRK-3S ；およびpJT3−BRK-2 プラス pJT6-BRK-3L によってでトランスフェクションしたCOS-1 細胞を表す。 図13は、Ｉ型BMP 受容体の存在および非存在下におけるm-BRK-3 に対する[¹²⁵ I]-BMP-4 の架橋形成を示す。COS-1 細胞を、構成pJT6-mBRK-3Sを用いて BRK-3 に対するcDNA、および（または）BRK-1（pJT 4-J159F を用いる）またはB RK-2（pJT3−BRK-2 を用いる）に対するcDNAによってトランスフェクションさせ る。つぎに、[¹²⁵I]-BMP-4 と結合させ、ジスクシニミヂル基質に架橋し、SDSゲ ル電気泳動にかける。分子量基準の位置は左側に示す。左から右に、BRK-1 単独 、BRK-1 プラスm −BRK-3、m-BRK-3 単独、BRK-2 プラスm-BRK-3、BRK-2単独、 およびベクター単独でトランスフェクションしたCOS 1細胞を示す。BRK-1、BRK- 2、およびBRK-3 によって識別されたバンドを右側に示す。 図14は、Ｉ型BMP 受容体の存在または不在下におけるm-BRK3の免疫沈降を示す 。COS-1 細胞を、pJT6-mBRK-3Sを用いたm-BRK-3 のcDNAを用いて、および（また は）BRK-1（pJT 4-J159F を用いる）またはBRK-2（pJT3-BRK-2 を用いる）に対 するcDNAによってトランスフェクションさせる。つぎに、[¹²⁵I]-BMP-4 と結合 させ、ジスクシニミヂル基質に架橋し、BRK-1 およびBRK-2 に対する抗体でもっ て免疫沈降させ、さらにSDSゲル電気泳動にかける。用いた抗血清をレーンの下 に示す。すなわち、PI、免疫前血清；1379、BRK-1 に対するcDNAによってトラン スフェクションした細胞；1380、BRK-2に対するcDNAによってトランスフェクシ ョンした細胞である。分子量基準の位置は左側に示す。左から右に、BRK-1プラ スm-BRK-3(免疫前血清);BRK-1 単独、BRK-1 プラスm-BRK-3 ；m-BRK-3 単独、BR K-2プラスm-BRK-3、BRK-2 単独；およびベクター単独でトランスフェクションし たCOS-1 細胞を示す。BRK-1 BRK-2 プラスm-BRK-3（免疫前血清）によってトラ ンスフェクションしたCOS 1細胞である。 図15は、pHK1040 のインサートのマップを示す。この構成は、BLUESCRIPT II SK(-)におけるヒトBRK-3 の完全なコード領域を含む。 記述 本発明は、化合物がBMP 受容体親和性を持つかどうかを決定する方法の必要性 に応えるものである。本発明の方法は、試験化合物を含む試料をBMP 受容体キナ ーゼ・タンパク質複合体に取り入れ、試験化合物をBMP 受容体キナーゼ・タンパ ク質複合体に結合させることが含まれる。また、受容体複合体にはBMPI型受容 体キナーゼ・タンパク質と、本明細書では“BRK-3”と呼ぶこととするBMPII 型 受容体キナーゼ・タンパク質とが含まれている。また、本発明は、BMP 受容体キ ナーゼ・タンパク質BRK-3 をコードするDNA 配列を含む発現ベクターと、Ｉ型BM P 容体キナーゼ・タンパク質をコードするDNA 配列を含む発現ベクターとで同時 トランスフェクションする宿主細胞の必要性に応えるものである。さらに、本発 明が提供することは臨床試料に含まれるBMP 受容体リガンドの濃度を決定させる 方法を提供することである。この方法は、リガンド含有試料をBMP 受容体キナー ゼ・タンパク質複合体に添加し、該受容体複合体にリガンドを結合させるステッ プを有する。ここで、受容体複合体は、Ｉ型BMP 受容体キナーゼ・タンパク質と BMP 容体キナーゼ・タンパク質BRK-3 とからなる。本発明は、可溶性Ｉ型BMP 受 容体キナーゼ・タンパク質をコードするDNA 配列を含む発現ベクターと、可溶性 BMP 容体キナーゼ・タンパク質BRK-3 をコードするDNA 配列を含む発現ベクター とで同時トランスフェクションする宿主細胞の必要性に応えるものである。さら に、本発明は、不完全なBMP 受容体キナーゼ・タンパク質BRK-3 をコードするDN A 配列を含む発現ベクターと、不完全なＩ型BMP 受容体キナーゼ・タンパク質を コードするDNA 配列を含む発現ベクターとで同時トランスフェクションする宿主 細胞の必要性に応えるものである。 ここで用いるように、“ヒトBMP 受容体キナーゼ・タンパク質-3”または“h- BRK-3”は、アミノ酸配列配列識別番号２を持つタンパク質、同様に配列識別番 号２に実質的に類似したアミノ酸を持つタンパク質を意味する。このタンパク質 はBMP 分子（限定されるものではないが、BMP-2、DR−BMP-2、BMP-4、および／ またはBMP-7 を含む）への結合、あるいは細胞に結合するBMP 分子によって引き 起こされた生物学的信号の変換、あるいはh-BRK-3 タンパク質またはhBRK-3 も しくはm-BRK-3（以下を見よ）のタンパク質配列由来ペプチドに対して生じた抗 体との交差反応、あるいはＩ型BMP 受容体との複合体形成、あるいはh-BRK-3 ま たはＩ型BMP 受容体のいずれか一方に特異的な抗体を用いた際のI BMP 受容体と の同時免疫沈降いう点で生物学的活性を有する。 ここで用いるように、“先端を切った(truncated)ヒトBMP 受容体キナーゼ・ タンパク質”または“t-BRK-3”は、配列識別番号４のアミノ酸配列または BRK-3 に関する上記ペプチドを持つ配列を意味する。 ここで用いられるように、“マウスBMP 受容体キナーゼ・タンパク質”または “m-BRK-3”は、アミノ酸配列配列識別番号８またはBRK-3 についての上記特性 を持つ配列を有するタンパク質を意味する。 ここで用いられるように、“BMP 受容体キナーゼ・タンパク質BRK-3”または “BRK-3”は、受容体タンパク質h-BRK-3、t-BRK-3、およびm-BRK-3(およびそれ らの可溶性および不完全なフラグメント)、さらにh-BRK-3、t-BRK-3、およびm-B RK-3（およびそれらの可溶性および不完全なフラグメント）に実質的に類似した BMP 受容体キナーゼ・タンパク質に対して、個々に、かつ総称して言及するもの である。そのような受容体タンパク質、該タンパク質をコードするDNA 配列、お よび該DNA を含む組み換え発現ベクターは、Rosenbaum およびNohno の米国特許 一連番号08／334，179（1994年11月３日出願）に開示、かつクレームされている 。 ここで用いられるように、“Ｉ型BMP 受容体キナーゼ”は、BMP-2、BMP-4、お よび（または）他の既知のBMP に結合することが可能なタンパク質であり、もち ろん限定されるものではないが、システイン・ボックスおよび上流システイン・ ボックス、SGSGSGモチーフを含GSドメインと呼ばれる細胞外リガンド結合ドメイ ン、細胞内膜近接領域において、TGF-βスーパーファミリーの他のリガントに対 する他のＩ型受容体に対して約85％を上回る類似性を持つ細胞内キナーゼ・ドメ イン、および（または）相対的に短いカルボキシ末端を含むＩ型受容体の配列特 性を持つ。ここで用いられるように、“Ｉ型BMP 受容体キナーゼ”は、文献、例 えばB.B.Koening et al．Molecular and Cellular Biology，14: 5961-5974(199 4); L．Attisano，et al.，Biochimica et Biophysica Acta，1222: 71-80(1994 ); J/ Massague，L．Attisano，and J．L．Wrana，Trends in Cell Biology，4: 172-178(1994); およびten Dijke，et al.，J．Biological Chemistry，269: 1 6985-16988(1994)に記載されているようなＩ型BMP 受容体の特性を持つ受容体タ ンパク質も含まれる。 Ｉ型BMP 受容体の例として、もちろん限定されるものではないが、BRK-1（B.B ．Koenig et al.，Molecular and Cellular Biology，14: 5961-5974 (1994)、そのラット同族体でBMPR−Ia(K．Takeda，S．Oida，H．Ichijo，T．Iim ura，Y．Maruoka，T．Amagasa,and S．Sasaki，Biochem，Biophys．Res．Commun ica.，204: 203-209(1994));BRK-2、BRK −１とも呼ばれる（S．sumitomo，T．S aito，and T．Nohno，DNA sequence，3: 297-302(1993)、またALK-6 のニワトリ 同族体と想定される（P．ten Dijke，H．Yamashita，H．Ichijo，P．Franzen，M ．Laiho，K．Miyazono，and C-H．H．-C．Heldin，Science，264: 101-104(1994 ); ALK-2、BMP-7 に対する受容体として示されている(ten Dijke et al.，J．Bi ological Chemistry，269: 16985-16988(1994)); BMP-2 およびBMP-4 に結合し 、中胚葉の誘導に関与するツメガエル（Xenopus）Ｉ型BMP 受容体(J.M．Graff， R.S．Thies，J.J．Song，A.J．Celeste，and D.A．Melton，Cell，79: 169-179( 1994));およびデカペンタ遮断性ペプチドを結合し、BMP-2 およびBMP ４のショ ウジョウバエ（Drosophila）同族体であるショウジョウバエ由来Ｉ型受容体であ る。これらのショウジョウバエ受容体は、25D 1、25D 2，および43E 呼ばれる(T ．Xie，A．L．Finelli，and R．W．Padgett，Science，263: 1756-1759(1994)， A．Penton，Y．Chen，K．Staehling-Hampton，J．L．Wrana，L．Attisano，J．S zidonya，J．A．Cassill，J．Massague，and F．M．Hoffmann，Cell，78: 239-2 50(1994); およびT．J．Brummel，V．Twombly，G．Marques，J．L．Wrana，S．J ．Newfeld，L．Attisano，J．Massaque，M．B，O'Connor，and W．M．Gelbart， Cell，78: 251-261(1994))。本発明に好適なＩ型BMP 受容体は、もちろん限定さ れるものではないが、配列識別番号１(BRK-1)、配列識別番号16(可溶性BRK-1)、 配列識別番号20(不完全BRK-1)、配列識別番号14(BRK-2)、配列識別番号18(可溶 性BRK-2)、および配列識別番号22（不完全BRK-2）と実質的に類似するアミノ酸 配列を持つポリペプチドである。 ここで用いられるように、BMP に対する結合能を有するBRK-1，BRK-2，または BRK-3 の細胞外領域に対応するアミノ酸配列を“可溶性フラグメント”と呼ぶ。 可溶性フラグメントとしては、BMP 結合に必要とされない受容体の領域が除去さ れている切断タンパク質（truncated proteins）が含まれる。BRK-3 に対するそ のような可溶性タンパク質の例として、限定されるものではないが、配列識 別番号６、配列識別番号10、配列識別番号12のアミノ酸残基１〜150、配列識別 番号８のアミノ酸残基１〜150、または配列識別番号に実質的に類似したアミノ 酸配列、または配列識別番号５、配列識別番号９、配列識別番号１の核酸残基40 9 〜858 に実質的に類似した核酸残基によってコード化されたポリペプチド、ま たは配列識別番号７の核酸残基17〜466 が挙げられる。 BRK-1 に対する可溶性フラグメントの例としては、限定されるものではないが 、配列識別番号16、配列識別番号12のアミノ酸残基１〜152 に実質的に類似した アミノ酸配列、配列識別番号15に実質的に類似した核酸残基によってコード化さ れるポリペプチド、または配列識別番号11の11〜466 に実質的に類似した核酸残 基によってコード化されるポリペプチドが挙げられる。 BRK-2 に対する可溶性タンパク質の例としては、配列識別番号18に実質的に類 似したアミノ酸配列を持つポリペプチド、配列識別番号14のアミノ酸残基１〜12 6、配列識別番号17に実質的に類似した核酸残基によってコード化されたポリペ プチド、または配列識別番号13の355 〜732 に実質的に類似した核酸残基によっ てコード化されたポリペプチドが挙げられる。 ここで用いられるように、“不完全な受容体キナーゼ・フラグメント”は、完 全な長さの受容体に類似した細胞外、膜貫通、および細胞内隣接膜領域に対応す るアミノ酸配列に言及するものである。このアミノ酸配列は、細胞外キナーゼ・ ドメインの欠失による情報伝達を行うことができない。BRK-3 に対するそのよう な不完全受容体フラグメントの例としては、限定されるものではないが、配列識 別番号24に実質的に類似したアミノ酸配列、、配列識別番号26、配列識別番号２ のアミノ酸１〜200、配列識別番号８のアミノ酸１〜200 を持つポリペプチド、 配列識別番号23に実質的に類似した核酸残基、配列識別番号25に実質的に類似し た核酸残基によってコード化したポリペプチド、配列識別番号１の409 〜1008に 実質的に類似した核酸残基によってコード化するポリペプチド、または配列識別 番号７の17〜616 に実質的に類似した核酸残基によってコード化するポリペプチ ドが挙げられる。 BRK-1 に対する不完全な受容体の例としては、限定されるものではないが、配 列識別番号20に実質的に類似したアミノ酸配列、配列識別番号12のアミノ酸残基 １〜231 を持つポリペプチド、配列識別番号19に実質的に類似した核酸残基によ ってコード化されたポリペプチド、または配列識別番号11の11〜703 に実質的に 類似した核酸残基によってコード化されたポリペプチドが挙げられる。 BRK-2 に対する不完全な受容体のフラグメントの例として、限定されるもので はないが、配列識別番号22、配列識別番号14のアミノ酸残基１〜201 に実質的に 類似しているアミノ酸残基を持つポリペプチド、配列識別番号21に実質的に類似 した核酸残基によってコード化されたポリペプチド、または配列識別番号13の35 5 〜957 に実質的に類似した核酸配列残基によってコード化されたポリペプチド が挙げられれる。 ここで用いられるように、“BMP 受容体キナーゼ・タンパク質複合体”は、Ｉ 型BMP 受容体とBMP 受容体キナーゼ・タンパク質BRK-3 との組み合わせを意味す る。Ｉ型およびBRK-3 受容体の組み合わせは、限定されるものではないが、溶解 した状態のＩ型およびBRK-3 受容体の組み合わせ(例えば、可溶性フラグメント として)、固相支持体に結合した受容体の組み合わせ(例えば、可溶性フラグメン トとして)、またはトランスフェクションした細胞の細胞膜内における受容体の 組み合わせ（例えば、完全な長さまたは不完全なフラグメント）が挙げられる。 ここで用いられるように、“桁除去（digit-removed）BMP-2”および“DR-BMP -2”は、BMP-2 タンパク質のフラグメントを意味するもので、このフラグメント は成熟BMP-2 のアミノ末端が軽いトリプシン消化によって除去されている（B.B ．Koening et al.，Molecular and Cellular Biology，14: 5961-5974(1994)） 。 ここで用いられるように、本発明の受容体タンパク質または該タンパク質をコ ード化するDNA 配列に関連して“単離した（isolated）”は、タンパク質または DNA 配列が自然に生ずる複合体細胞環境から該タンパク質またはDNA 配列を除去 することを意味し、また該タンパク質は適当な調節配列に操作可能なようにして 結合した場合に自然に発現することがない細胞内の前記DNA から発現可能である 。 ここで用いられるように、ユーザがアミノ酸または核酸配列のいずれか一方を 定義する際に用られる“実質的に類似(substantially similar)”とは、特定の 対象配列、例えば突然変異誘起によって変えられた配列、一つ以上の置換、欠失 、または付加による参照配列からの変異を意味するものであって、正味の効果と してはBRK-3 タンパク質の生物学的活性を保持することである。あるいは、DNA 列が遺伝子コードのなかの縮重の結果として参照アミノ酸配列に実質的に類似し たアミノ酸配列をコード化するとした場合、核酸配列および類似体はここに開示 される特定のDNA 配列に対して”実質的に類似”するものである。さらに、“実 質的に類似”とは、BRK-3 タンパク質またはBRK-3 のタンパク質配列由来のペプ チドに対して産生した抗体と受容体タンパク質が反応することを意味する。 ここで用いられるように、“生物学的に活性”とは、特定の分子が検出可能な 量からなるBMP-2 またはBMP-4 に対する結合能を持つようにここで開示される本 発明の実施態様に対して十分なアミノ酸配列相同性を共有すること、例えば雑種 受容体構成を意味する。好ましくは、本発明の範囲に含まれる生物学的活性を有 するBRK-3 受容体複合体は、受容体タンパク質キナーゼ複合体がナノモルまたは 準ナノモルの親和性（Kdは10^-9M にほぼ等しい）でもって[¹²⁵I]-BMP-4 に対す る結合能を持つ。好ましくは、親和性は約１×10^-12Mないし１×10^-9M であり、 Kdの値が10^-12M未満であるおうな結合部位の部分を持つ。 ここで用いられるように、“操作可能に結合(operably linked)”は、直線状D NA 配列の部分は同一直線状DNA 配列の他の部分の活性を影響を及ぼすことを意 味する。例えば、単一ペプチド（分泌リーダー）のDNA は、あるポリペプチドの 分泌に関係する前駆体として発現する場合、該ポリペプチドに操作可能に結合す る。プロモータは、あるコード配列の転写を制御するものである場合、該コード 配列に操作可能に結合する。または、リボソーム結合部位は、翻訳を許すように 位置する場合、コード配列に操作可能に結合する。いっぺんに、操作可能に結合 は、分泌リーダーの場合、切れ目なく連続したもの（contiguous）、またリーデ ィング・フレームにおいて切れ目なく連続したものである。 ここで用いられるように、“ATCC”は米国メリーランド州ロックビルのアメリ カン・タイプ・カルチャー・コレクション（Americaion Type Culture Collecti on）を意味する。 ここで“骨形態形成タンパク質２”または“BMP-2”はATCC No．40345に含ま れるDNA 配列によってコード化されるペプチドを意味する(ATCC／NIHREPOSITORY CATALOGUE OF HUMAN AND MOUSE DNA PROBES AND LIBRARIES，６版、1992の57頁 を見よ。以下、この文献を“ATCC レポジトリ・カタログ”とする)。BMP-2 の 単離は、Wang，WozneyおよびRosen の米国特許第5,013,649号(1991年５月７日発 行)、Wang，WozneyおよびRosen の米国特許第5,166,058 号(1992年11月24日発行 )、HammondsおよびMason の米国特許第5,168,050 号（1992年12月１日発行）に 開示しれており、本願ではこれらの文献を援用する。 ここで用いられているように、“骨形態形成タンパク質４”または“BRK-4” は、ATCCNo．40342("ATCC レポジトリ・カタログ”を見よ）を含むDNA 配列に よってコード化されたペプチドを意味する。BMP-4 の単離は、Wang，Wozneyおよ びRosen の米国特許第5,013,649 号（1991年５月７日発行）に開示されており、 本願ではこの文献を援用する。 ここで用いられているように、“骨形態形成タンパク質７”または“BRK-7” は、ATCCNo．68020 およびATCC68182(“ATCCレポジトリ・カタログ”を見よ)を 含むDNA 配列によってコード化されたペプチドを意味し、ATCC68182 のなかのcD NAは BMP-7タンパク質をコード化に必要な核酸配列すべてを含むものであるとク レームされている。BMP-7 の単離は、Rosen らの米国特許第5,141,905 号（1992 年８月25日発行）に開示されており、本願ではこの文献を援用する。 ここで用いられるように、“DNA 配列”は、別々のフラグメントの形状で、あ るいはより一層大きなDNA 構成の一構成要素としてあるDNA ポリマーに対して言 及するものであり、実質的に純粋な形状で、すなわち内因性物質によるコンタミ がなく、また該配列およびその構成核酸配列の同定、操作、および回収を可能と する程度の量または濃度で、標準的な生化学的方法、例えばクローニング・ベク ターを用いることによって、少なくとも一度は単離されたDNA 由来のものである 。そのような配列は、好ましくは真核細胞の遺伝子に典型的に存在する内部非 翻訳配列（イントロン）によって妨害されないオープン・リーディング・フレー ムの形状で提供される。関連配列を含むゲノムDNA も用いることが可能である。 非翻訳DNA の配列はオープン・リーディング・フレームから５′または３′側に 存在してもよく、コード領域の操作または発現を妨害するものである。この発明 によって提供されるタンパク質をコード化するDNA 配列は、cDNAフラグメントお よび短いオリゴヌクレオチド・リンカー、あるいは一連のオリゴヌクレオチドか ら組み立てることができ、それによって組み換え転写ユニットにおいて発現する 。 ここで用いられるように、“組み換え体”は、イン・ビトロで操作され、かつ 宿主組織に導入されるDNA 配列である。 ここで用いられるように、“微生物の(microbial)”は、細菌、菌類（例、酵 母）、または昆虫の発現系によって作られた組み換え体タンパク質に言及するも のである。 ここで用いられるように、“組み換え体発現ベクター”は所望のタンパク質（ 例えば、BRK-3）をコード化するDNA を発現するのに用いられるDNA 構成に言及 するものであり、さらにそのDNA は、（１）遺伝子発現において調節的な役割を 担う遺伝子成分、例えばプロモータおよびエンヘンサー、（２）mRNAに転写され 、かつタンパク質に翻訳される構造配列またはコード配列、さらに（３）適当な 転写および翻訳開始および終了配列からなるアセンブリを持つ転写サブユニット を含む。当業者に既知の方法を用いることによって、本発明の組み換え発現ベク ターを構成することができる。本発明において適用可能なベクターとしては、限 定されるものではないが、ほ乳類動物の細胞については、pJT4（後述する）、pc DNA-1（Invitrogen，San Diego，Ca）およびpsV-SPORT１（Gibco-BRL，Gaithers burg，MD）、昆虫の細胞については、pBLueBac III またはpBlueBacHis バキュ ロウィルス(Invitrogen，San Diego，CA); さらに細菌細胞については、pET-3（ Novagen，Madison，WI）である。本発明のBRK-3 受容体タンパク質キナーゼをコ ードするDNA 配列は、調節因子に操作可能に結合したベクターに存在することが できる。 本発明は、BMP 受容体キナーゼ・タンパク質BRK-3 をコードするDNA 配列を含 む発現ベクターとＩ型BMP 受容体キナーゼ・タンパク質をコードするDNA 配列を 含む発現ベクターとの宿主細胞同時トランスフェクションに関する。一実施態様 によれば、BRK-3 タンパク質の発現ベクターは、h-BRK-3 受容体タンパク質をコ ードするDNA 配列、またはその可溶性あるいは不完全なフラグメントを含む（DN A はゲノムDNA またはcDNAである）。好ましくは、h-BRK-3 タンパク質は核酸配 列識別番号１によって好ましくはコードされ、その可溶性フラグメントは配列識 別番号５によって好ましくはコードされ、さらに不完全なフラグメントは配列識 別番号２３によって好ましくはコードされる。他の実施態様では、BRK-3 タンパ ク質の発現ベクターは、t-BRK-3 タンパク質をコードするDNA 配列を含む（DNA 配列はゲノムDNA またはcDNAである）。好ましくは、DNA 配列は配列識別番号３ である。他の実施態様では、BRK-3 タンパク質の発現ベクターは、m-BRK-3 ンパ ク質、またはその可溶性あるいは不完全なフラグメントである（DNA 配列はゲノ ムDNA またはcDNAである）。好ましくは、m-BRK-3 タンパク質はDNA 配列の配列 識別番号７によってコードされ、可溶性フラグメントはDNA 配列の配列識別番号 ９によってコードされ、さらに不完全なフラグメントはDNA 配列の配列識別番号 25によってコードされる。 本発明の好ましい実施態様では、本発明の宿主細胞はプラスミド構成pJT6-mBR K-3Lと、プラスミド構成pJT4-J159F[BRK-1]あるいはプラスミド構成pJT3-BRK-2[ BRK-2]とによって同時トランスフェクションするので、mBRK-3とBRK-1、あるい はm-BRK-3 とBRK-2 との同時トランスフェクションが起こる。他の好ましい実施 態様では、本発明の宿主細胞は、プラスミド構成pJT6-mBRK-3Sとプラスミド構成 pJT4-J159F[BRK-1]またはプラスミド構成pJT3-BRK-2[BRK-2]とによって同時トラ ンスフェクションするので、mBRK-3とBRK-1、あるいはm-BRK-3 とBRK-2 との同 時トランスフェクションが起こる。他の好ましい実施態様によれば、ほ乳類宿主 細胞は、プラスミド構成pJT4-hBRK3T とプラスミド構成pJT6-J159F[BRK-1]また はプラスミド構成pJT3-BRK-2[BRK-2]とによって同時トランスフェクションする ので、t-BRK-3 とBRK-1、あるいはt-BRK-3 とBRK-2 との同時トランスフェクシ ョンが起こる。組み換え分子によるトランスフェクションは当業者に既知の方法 を用いて行うことができる。 ここで用いられるように、“宿主細胞”は本明細書に記載された組み換え体発 現ベクターを含む細胞を意味する。宿主細胞は、組み換え体発現ベクターのなか で、または組み換え体ウイルス・ベクターによって感染されることによって、安 定にトランスフェクション、あるいは一過性にトランスフェクションしてもよい 。宿主細胞といては、原核細胞、例えば大腸菌（Escherichia coli）、酵母（Sa ccharomyces cerevisiae）のような真菌系統、sf-9およびsf-21等の昆虫由来半 永久的細胞系統、およびチャイニーズ・ハムスター卵巣（CHO）およびSV40によ ってトランスフェクションしたアフリカ緑サル腎臓細胞（COS）のような半永久 的動物細胞系統が挙げられる。 一実施態様では、本発明はBMP 受容体キナーゼ・タンパク質に結合することが 可能な化合物を同定するのに好適な方法に関する。他の実施態様では、本発明は 臨床試料中のBMP 受容体リガンド（例えば、BMP-2、BRK-4、またはBMP-7、また はいままで同定された他のBMP 受容体リガンド）濃度を決定するのに好適な方法 に関する。これらの方法のいずれも、予測リガントまたは既知のリガンドを含む 試料をBMP 受容体キナーゼ・タンパク質複合体に取り込む。この図様態複合体は Ｉ型BMP 受容体キナーゼ・タンパク質およびBMP 受容体キナーゼ・タンパク質BR K-3 からなる。好ましくは、BRK-3 受容体キナーゼ・タンパク質はアミノ酸配列 の配列識別番号２を持つh-BRK-3、またはアミノ酸配列配列識別番号６を持つそ の可溶性タンパク質、またはアミノ酸配列識別番号２４を持つその不完全なフラ グメントである。また、好ましくは受容体タンパク質m-BRK-３はアミノ酸配列識 別番号８を有するものであり、またはアミノ酸配列識別番号10を持つものであり 、あるいはアミノ酸配列識別番号26を持つ不完全なフラグメントである。また、 好ましくは受容体タンパク質t-BRK-3 はアミノ酸配列識別番号４を持つ。 例えば、試料中のBMP 濃度は放射線受容体アッセイによって決定することがで きる。このアッセイでは試料中の未標識PMP は、BRK-3 受容体複合体に対する結 合において標識トレーサーBMP と競合する。試料中のＢＭＰ量が増加すると、BR K-3 とＩ型受容体とを含む受容体タンパク質複合体に結合することが可能である 標識BMP の量が減少する。未標識BMP の既知濃度によって調製した標準曲線と比 較することによって、試料中のBMP 濃度の正確な定量が可能となる。トレー サーBMP の標識は、好ましくは[¹²⁵I]Nalによるヨード化によって行われる。Ｉ 型BMP 受容体キナーゼも外膜中で発現する安定の細胞系統として、可溶性Ｉ型受 容体フラグ面を有する溶液中の可溶性フラグメントとして、あるいは固相に共有 結合したＩ型受容体と一緒に使われる固相に共有結合した可溶性フラグメントと して提供される。アッセイを実行するために、試料由来の未標識BMP および標識 トレーサーBMP は、平衡に達するまで受容体への結合について競合する。つぎに 、受容体-BMP複合体を遊離リガンドから単離する。単離方法としては、洗浄（粘 着性細胞系統の場合）、急速なろ過または遠心（非粘着性細胞系統または固相に 結合した受容体）、あるいは抗体、ポリエチレン・グリコール、または他の析出 剤によって受容体−リガンド複合体を沈殿させ、つづいてろ過または遠心する（ 可溶性受容体の場合）ことが挙げられる。つぎに、複合体中の標識BMP の量を、 一般にガンマ線計数によって定量し、既知の標準値と比較する。これらの方法は 他の受容体を用いた文献に記載されている(M．Williams，Med．Res．Rev.，11: 147-184(1991); M．Higuchi and B.B．Aggarwal，Anal．Biochem.，204: 53-58( 1992); M.J．Cain，R.K．Garlick and P.M．Sweetman，J．Cardiovasc．Pharm. ，17: S150-S252(1991);各文献を本明細書で援用する)。また、これらの方法は 容易に本発明のBRK-3 ／BMP 系に適用される。そのような放射線受容体アッセイ は臨床試料中に含まれるBMP の定量を必要とする診断目的に用いることができる 。 本発明の方法は、Ｉ型BMP 受容体キナーゼ・タンパク質と複合体を形成するBR K-3、あるいは相同な受容体タンパク質への結合能を持つ化合物を同定するスル ープットの高いスクリーニングにも有効である。そのような方法では、BRK-3／ Ｉ型複合体に対する化合物のより一層高い親和性が得られれば、複合体への結合 に対してトレーサーとの競合がより一層効率的となり、さらに受容体−リガンド 複合体の計数が低くなる。この場合、同一濃度範囲で一連の化合物を比較し、も っとも高い親和性でもって受容体結合するかどうかを比較する。 本発明は、既知のリガンドあるいは予測したリガンドが本発明のDNA 分子によ ってコード化された受容体に結合、および（または）該受容体を活性化すること ができるかを決定するのに有益である。前記DNA 配列が本明細書に記述した細 胞系統にトランスフェクションすることは、単離DNA 分子によってコード化され た受容体複合体に結合および（または）活性化するリガンドの能力についてのア ッセイ系を提供する。本明細書で記述したような組み換え体細胞系統は、放射活 性、分光学的、または他の試薬によって標識される既知の、あるいは候補の薬剤 またはリガンド間での競合結合アッセイにおいて生細胞培養として有益である。 トランスフェクションした細胞から単離した受容体を含む膜試料もまた競合結合 アッセイに用いる。受容体のリガンド結合ドメイン由来の可溶性受容体もまた薬 物候補の高スループット・スクリーニングに用いることができる。細胞内情報伝 達の機能的アッセイは、受容体機能の活性化において結合親和性および有効性の アッセイとして作用することができる。さらに、組み換え細胞系統はレポーター 遺伝子を含むものとして修飾してもよい。このレポーター遺伝子は、受容体がレ ポーター遺伝子をスイッチ・オンすることによって信号が送られるように、レス ポンス因子に操作可能に結合する。そのような系は、受容体アゴニストの同定を 目的とした高スループット・スクリーニングで特に有用である。これらの組み換 え体細胞系統は、“薬物発見系（drug discovery systems”を構成し、薬物開発 にとって可能性のある天然または合成化合物の同定に有用である。そのような同 定された化合物を、さらに修飾して、あるいはそのまま直接に治療用化合物とし て用いることによって単離ＤＮＡ分子によってコード化された受容体の本来の機 能を活性化あるいは阻害することができよう。 本発明の可溶性受容体タンパク質複合体は、投与を腹腔内、筋肉内、静脈内、 または皮下注射、移植、または経皮モード等による方法を用いて臨床セッティン グに投与することができる。そのような投与は、BMP 活性の治療上の変更を与え るものと期待される。 本発明に開示された配列識別番号３および配列識別番号１の核酸配列は、それ ぞれt-BRK-3 およびh-BRK-3 をコードするＤＮＡの配列を表すもので、これらは ヒト皮膚線維芽細胞から単離される。また、配列識別番号７はマウスMIH3T3細胞 由来のm-BRK-3 受容体タンパク質をコードするDNA 配列を表す。これらの配列を 用いて、ラット、ウサギ、ショウジョウバエ（Drosophila）およびアフリカツメ ガエル（Xenopus）等の他の種からBRK-3 のｃＤＮＡを容易に得ることができよ う。これらの配列は、マウスや上記した他の種由来で、かつＩ型受容体との複合 体にBMP を結合させることが可能な他のII型BMP 受容体に対するcDNAを得ること にも容易に用いることができる。これらのcDNA配列はBRK-3 のゲノムDNA を単離 することに容易に用いることができる。このことは、受容体遺伝子発現を制御す る調節因子の分析を可能とするもので、治療上のインターベンションや病気の診 断に新たな機会を提供するものとなろう。上記の核酸配列は、正常な組織および 病気の状態にある組織におけるBRK-3 受容体の分布を決定することにも有用であ り、これによってイン・ビボにおける物理的役割の評価が可能となる。 本発明は、さらに試験化合物がBMP 受容体タンパク質複合体への結合に対する 信号を生成するかどうかを決定する方法に関する。そのような方法では、タンパ ク質リン酸化アッセイにおいてBMP 受容体タンパク質複合体を使用する。タンパ ク質リン酸化アッセイは、当業者に一般的に知られているものである。Hardie， D.G.，”Protein Phosporylation A Practical Approach”，IRL Press: Oxford ，New York，Tokyo，(1993)を本願では援用する。この文献は、リン酸化アッセ イの概要を提供するものである。試験化合物がBMP 受容体タンパク質複合体への 結合に対する信号を生成するかどうかを決定する方法は、(a)BMP受容体キナーゼ ・タンパク質BRK-3 をコードするDNA 配列とI 型BMP 受容体キナーゼ・タンパク 質をコードするDNA 配列とによってトランスフェクションしているBMP 受容体タ ンパク質複合体発現細胞を32P によって標識する工程と、(b)(i)試験化合物存在 下での前記細胞の第１の組の培養と、(ii)試験化合物不存在下での細胞の第２の 組の培養とを行う工程と、(c)工程(b)によって生じたリン酸化タンパク質をオー トラジオグラフィーを介して定量する工程と、(d)工程(c)によって定量された細 胞の第１の組のリン酸化タンパク質の量を、前記工程(c)によって定量された細 胞の第２の組の前記リン酸化タンパク質の量と比較する工程とを有する。 本発明の好ましい実施態様を説明することを目的として、以下の非限定的な実 施例を詳細に議論する。 実施例１ PCR フラグメントの生成 TGF-βタイプIIレセプタに関連したタイプIIレセプタのPCR フラグメントを生 成するために、図１に示すプライマをTGF-βタイプIIレセプタのキナーゼ・ドメ インから設計する。PCR の第１ラウンドでは、キナーゼ・ドメインII由来のTSK- 1 とキナーゼ・ドメインVIII由来のTS-2とをプライマとする。テンプレートDNA は、月齢９ヶ月の男子から得たヒト皮膚線維芽細胞から単離したmRNAから調製し たcDNAからなる。PCR 反応は、約0.2 μg のテンプレートDNA、15μM のプライ マTSK-1 およびTSK-2、各々が0.2mM 濃度である全４種類のデオキシヌクレオチ ドのストック、15μM のThermus thermophilus由来DNA ポリメラーゼ(以下、Tth ポリメラーゼ)(東洋紡、大阪、日本)、さらにTth ポリメラーゼ用反応溶液（東 洋紡、大阪、日本）を含む全容量50μl 中で行う。最初の溶解時間（94℃、１分 間）後、以下のような温度周期を35回繰り返す。すなわち、一周期は、92℃、40 秒間の溶解、48℃、40秒間のアニーリング、および75℃、90秒間のエクステンシ ョンからなる。35周期を繰り返した後、さらに75℃、５分間で反応させることに よってエクテンションを完了する。 いくつかのバンドを増幅した。このなかのいくつかは、TGF-βタイプIIレセプ ターにたいして相同のタイプIIレセプターの予測された配列の長さに一致する47 0 塩基対（bp）の領域にある。したがって、この範囲の大きさの断片を、製造元 の取扱説明書にもとづいてQIAEX（Quiagen，Chatsworth，CA; DNA断片ゲル精製 用キット、活性シリカ球体および緩衝液を含む）を用いてアガロース・ゲルから 回収する。つぎに、容量20μl のTE溶液（10mM Tris、pH 8.0、1mM のEDTA） に再懸濁した。 TBF-βタイプIIレセプターに関係しないcDNAから増幅された断片によるバック グラウンドを抑えるために、第２ラウンドのPCR は、第１ラウンドで増幅された 470bp 内に位置したTGF-βタイプIIレセプタの保存領域にもとづく“ネストされ た（nested）”プライマーを用いて実行される。ネストされたプライマーは、TG F-βタイプIIレセプターのキナーゼ・ドメインから誘導されたAVR-5、および キナーゼ・ドメインVIB から誘導されたTSK-4 である。鋳型は、第１ラウンドの PCR から単離されたPCR 断片の既知量（0.5 μl）からなる。これをプライマーA VR-5（５μl）およびTSK-4(15μM)、4種類のデオキシヌクレオチド（それぞれ0. 2M）、1.5 単位のTthDNAポリメラーゼ、およびTthDNAポリメラーゼ用反応緩衝液 からなる全容量が50μl の溶液に加えた。PCRno 第１ラウンドについて記載した ようにして、温度周期プログラムを正確に実行した。PCR 反応産物のアガロース ・ゲル電気泳動によって、予想したように300bp の範囲内にあるバンドの増幅が 観察された。この断片をQIAEX を用いて単離する。 第２PCR 反応のPCR 産物をサブクローン化するために、精製した断片をポリヌ クレオチド・キナーゼを用いてリン酸化し、事前にSmaIで切断してあるクローニ ング・ベクターpGEM72f(+)（Promega，Madison，WI）に連結させた後、脱リン酸 化した。連結混合物を用いて大腸菌（E.coli）XL1-Blue（Stratagene，La Jolla ，CA）を形質転換した。形質転換混合物をイソプロピル- β-D- チオガラクトシ ド（IPTG）および5-ブロモ-4- クロロ-3- インドリル- β-D- ガラクトシド（X- gal）を含む寒天上で平板培養した。青色を欠いたコロニーを得ることができた 。このことは挿入片の存在を示している。これらのコロニーを選択してプラスミ ドDNA を調製した。候補プラスミドのうち、HAK7-1．HSK7-2、およびHSK7-4と呼 ばれる３種類のプラスミドが予想された大きさ（300bp）の挿入片を有すること がわかった。挿入片の塩基配列決定を行うと、HSK7-2の300bp 挿入片は、新規キ ナーゼの一部をコードするという知見が得られた。この新規キナーゼは、TGF-β レセプター・スーパーファミリの新規メンバーと予想される。したがって、HSK7 -2PCR 断片を完全な長さのレセプター・クローンを単離するためのプローブとし て用いる。 実施例２ ヒトt-BRK-3 cDNAの単離 HSK7-2の300bp 挿入片に対応するcDNAを配置するために、PCR 断片を単離する ために用いられる同一mRNAから、cDNAライブラリーを構築する。このことは、 スーパースクリプト・チョイス・システム（SUPERSCRIPT Choice System）（Lif e Technologies，Gaithersburg MD; cDNA合成用キットで、プライマー、アダプ ター、スーパスクリプトIIRNアーゼH-逆転写酵素（Life Technologies，Gaither sburg MD;モロニー白血病ウイルス由来逆転写酵素の修飾形）、ヌクレオチド、 緩衝液、およびゲル濾過カラムが含まれる）を用い、180 単位のRNアーゼ（タカ ラ、京都、日本）を第１の鎖合成に添加する以外は製造元の取扱説明書にもとづ いて達成される。鋳型は月齢９ヶ月の男子から得たヒト皮膚線維芽細胞由来のmR NA（４μg）である。第１および第２鎖合成後、合計４μg のcDNAが得られる。 つづいて、内部NotIおよびSalI部位を持つEcoRI アダプタ（キットに付属）を添 加する。つぎに、EcoRI-適合cDNAをリン酸化し、つづいてキットに付属のゲル濾 過カラムを用いて、製造元の取扱説明書にもとづいてサイズによる分画を行う。 大きさによって分画されたcDNAをファージλgt10のEcoRI 部位に結合させ、ギ ガパックII（GIGAPACKII）ゴールド・パッケージング・エクストラクト(Stratag ene，La Jolla，CA; λファージにcDNAライブラリーを効率よく構築する制限マ イナス・インビトロ・パッケージング・エクストラクト)を用い、かつ製造元の 取扱説明書にもとづいてインビトロでパッケージングする。 ライブラリを10枚のハイボンド（HYBOND）ナイロン・メンブレン（Amersham， Arlington Heights，IL; ナイロン・メンブレンは核酸の固定に最適化されてい る）で、１×10⁵プラーク／フィルタの密度でもってスクリーングする。HSK7-2 から得たインサートをマルチプライム(MULTIPRIME)DNAラベリング・システム(Am ersham,ArlingtonHeights,IL; DNA のランダム・プライマー・ラベリング用キ ットで、クレノーDNA ポリメラーゼ、プライマー、および緩衝液を含む)を用い て、製造元の取扱説明書にもとづいて行う。50% ホルムアルデヒド、6xSSPE(1xS SPE＝0.14M NaCl、8mM りん酸ナトリウム、0.08mM EDTA、pH7.7)、5xDenhardt' s溶液(1 xDenhardt's 溶液＝0.02％フィコール400、0.02％ポリビニルピロリド ン、0.02％BSA)、0.5%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、および100μg ／ml変性サ ケ精子からなる溶液中、42℃、12時間、DNA 標識プローブをライブラリ・フィル タにハイブリダイズさせる。ブロットを２XSSPE、0.1 ％SDS 中、室温（それぞれ15分間）で３回洗浄し、続いて42℃で１時間洗浄した。 スクリーニングを３回行った後、３つの独立したクローンが得られた。これら のクローンのうち、HSK723と命名された一つクローンがHSK7-2インサートと同様 の配列をコードすることがわかった。このクローンの完全なDNA 配列を得た。こ のクローン由来のcDNAをt-BRK-3 と呼ぶ。 実施例３ t-BRK-3 シークエンス解析 このt-BRK-3 クローンのDNA シークエンスを配列識別番号３に示す。また、t- BRK-3 の推論されたタンパク質シークエンスを配列識別番号４に示す。クローン HSK723由来のt-BRK-3 オープン・リーディング・フレームは、少なくとも583 個 のアミノ酸からなるタンパク質をコードする。HSK723 cDNA の３′領域のフレー ム内に位置する停止コドンは認められず、このクローンは３′末端が不完全であ ることを示している。したがって、t-BRK-3 と呼ぶ。 配列識別番号４に示すt-BRK-3 の推論されたタンパク質シークエンスを、標準 Needleman-Wunschアルゴリズム（S.B．Needleman and C.D．Wunsch，J.Mol.Biol ．48: 4335-453（1990））を用いて、1994年8 月15日付ジーンバンク・リリース （GenBank Release）84.0にある翻訳されたタンパク質シークエンスのすべてに ついてサーチした結果、新規のシークエンスであることがわかった。 予測されたタンパク質シークエンスの解析によって、TGF-βタイプIIスーパフ ァミリ・メンバー・トランスメンブラン・セリン／スレオニン・キナーゼである ことが明らかになった。予測された単一トランスメンブレン領域は、配列識別番 号４の残基151-172 を包囲する。３つの潜在的N-結合グリコシル化部位が予測さ れた細胞外ドメインのアミノ酸残基55,110，および126 に存在する。配列識別番 号４アミノ酸残基116-123 は、“システイン・ボックス”と呼ばれるシステイン 残基からなるクラスタが含まれる。このクラスタは、TGB-βスーパーファミリの リガンドに対する受容体としての特徴を有する。t-BRK-3 のシスティ ン・ボックスは、BMP-2 およびBMP-4 に対するDAF-4 タイプIIレセプタのシステ イン・ボックスと８個のアミノ酸残基のうち６個が一致する。しかし、細胞外ド メインのDAF-4 に対するt-BRK-3 の全体的な配列同一性はたったの7.1%である。 t-BRK-3 の予測された細胞質内領域のアミノ酸200-504（配列識別番号４）は すべての共通配列を含むもので、該共通配列はセリン／スレオニン残基に対する 予測された特異性を持つプロティンキナーゼを特徴づけるものである(S．K．Han ks，A．M．Quinn，and T．Hunter，Science，241: 42-52(1988))。 実施例４ t-BRK-3 ，BRK-1，BRK-2，およびDAD-4 のための発現ベクターの構成 哺乳類動物細胞内でt-BKR-3 を発現させるために、一時的発現を意図してそれ をベクターpJT4内にサブクローン化する。COS 細胞内での一時的発現に最適化さ れたpJT4ベクターは、非常に効率的なメッセージの転写を行わせるサイトメガロ ウイルスの初期プロモータおよびエンハンサー；発現レベルをよりいっそう高め るヒトT-細胞白血病ウイルス-1の長い末端反復由来の"R"因子；メッセージの安 定性を強化すると考えられているSV40由来のイントロン・スプライシング部位； 多重クローニング部位； ほとんどの真核mRNAに必要とされるpolyA 尾部をメッ セージに加えるように命令するSV40由来ポリアデニル化シグナル；およびSV40ラ ージＴ抗原を含む細胞、例えばCD細胞にプラスミドを複製し、かつ非常に多くの コピー数とするSV40複製開始点を含む。また、細菌内でベクターの操作および増 幅を行うために、ベクターはE.coliの複製開始点およびアンピシリン耐性遺伝子 を有するものとする。pJT4への切断ヒトBRK-3cDNA の挿入は以下のように行う。 キナーゼ・ドメインの３′領域に停止コドンが認められないので、PCR を実施 して停止コドンを挿入してタンパク質の翻訳を可能とする。したがって、PCR プ ライマーは配列識別番号３のヌクレオチド2028の後に２つの停止コドンを 挿入するように設計され、配列識別番号４のイソロイシン540 の後でキナーゼを 終結させる。このことは、アクチビンII型レセプターの長さに一致するように選 択される（L．S．Mathews and W．V．Vale，Cell，65: 973-982(1991)）。した がって、キナーゼ・ドメインの適当な折りたたみに十分でなければならない。停 止コドンの後にKpnI部位が続く。プライマーの完全な配列（配列識別番号３のヌ クレオチド2013-2028の逆転相補部分を含む）は、５′ACG CGG TAC CTC ACT AAA TTT TTG GCA CAC GC ３′である。第２のプライマーは、Alf III 部位（配列 識別番号３のヌクレオチド1618-1637）の領域にあるt-BRK-3 配列に正確に一致 するように設計され、５′GTA GAC ATG TAT GCT GTT GG３′配列を有する。反応 のためのテンプレートは実施例２に記載したクローンHSK723であり、BLUESCRIPT II SK（+）(Sttratagene，La Jolla，CA； pUC19来の2.96bpコロニー産生ファ ージミド)内のt-BRK-3 に対するcDNAを含む。 PCR は、アンプリタク（AMPLITAQ）DNA ポリメラーゼを有する遺伝子増幅PCR ット(GENE AMP PCR Kit)(Perkin Elmer，Norwalk，CT; ポリメラーゼ鎖反応を 用いたDNA 増幅に必要な材料を含むキットであり、AMPLITAQ、Thermusaquaticus 由来DNA ポリメラーゼの組換え修飾形態、ヌクレオチド、および緩衝液を含む) を用いて、製造元の取扱説明書にもとづいて、遺伝子増幅（GENE AMP）PCR シス テム9600サーモサイクラー（Perkin Elmer，Norwalk，CT）を使用して実行する 。95℃で５分間、最初の溶解を行い、つづいて95℃、１分間の熱変性、50℃、１ 分間のアニーリング、および72℃、１分間の伸長からなるプログラムを20回繰り 返す。 予想サイズが400bp である増幅されたバンドをアガロース・ゲルから単離し、 Af1 III およびKpn I によって消化する。一方、t-BRK-3 のcDNAをEco RVおよび Af1 III によって消化し、さらにベクターpJT4をEco RVおよびKpnIによって消化 する。これら単離された３種類の断片を一段階で結合し、図２に示すpJT4-hBRK3 T を構成する。PCR の実施中にエラーが生じていないことを確かめるために、Af 1 III から３′末端のKpn I 部位にかけた領域を、タク・ダイ・デオキシ（TAQ DYE DEOXY）ターミネータ・サイクル・シークエンシング・キット （Applied Biosystems，Foster，CA; ジデオキシ・ターミネータ・メソッドを用 いて自動DNA 列決定を行うための材料として、AMPLITAQ、ヌクレオチド混合物、 色素標識ジデオキシヌクレオシド・ターミネータ、および緩衝液）およびアプラ イド・バイオシステムズ373A自動DNA 配列決定装置（Applied Biosystems Model 373A Automated DNA Sequencer）を用いて配列決定した。 t-BRK-3 とI 型BNP レセプタとの同時発現の効果を判断するために、t-BRK-3 cDNAをBRK-1 のcDNAまたはBRK-2 のcDNAとともに同時発現させる必要がある。マ ウスBRK-1 に対するDNA 配列を配列識別番号11に示す。マウスBRK-1 に対する演 繹されたアミノ酸配列を配列識別番号12に示す。ニワトリBRK-2 に対するDNA 配 列を配列識別番号13に示す。また、ニワトリBRK-2 に対する演繹されたアミノ酸 配列を配列識別番号14に示す。 BRK-1 を哺乳類動物細胞で発現させるために、プラスミドpJT4-J159Fを用いる 。このプラスミドの構成は、1993年11月24日にクーク（Cook）によって出願され たU.S.S.N 08/158,755と、B.B.コーニング（Koeing）らの文献：Molecular and Cellelar Biology 14: 5961-5974（1994）に開示されており、すなわちATCC 694 57である。簡潔に言うと、BLUESCRIPT SK（-）にサブクローン化されたBRK-1 cD NAを制限酵素AlfIIIで直線化し、DNA ポリメラーゼI クレノウ・フラグメントを 用いて張り出した末端の割れ目を防ぐ。つぎに、直線化されたプラスミドをNotI で消化することによって、プラスミドからインサートが遊離される。このインサ ートをNot I および EcoRV 部位でpJT4発現ベクターにサブクローン化する。ク レノウ反応によって生じた平滑末端は、同様に平滑末端であるEcoRV 部位と適合 し、ライゲーションによってEcoRV 部位が除去される。構成pJT4-J159Fを図３に 示す。 哺乳類細胞でBRK-2 を発現させるために、そのcDNAをベクターpJT3にサブクロ ーン化する。このベクターは、この実施例で記載されたpJT4と以下の点を除いて 同一である。すなわち、多重クローニング部位の配向は逆であり、該多重クロー ニング部位の５′末端に別のNotI部位が存在している点が異なる。、ベクターpR C CMV（Invitrogen，San Diego，CA; 哺乳類細胞発現ベクター）で当初得られ たBRK-2のcDNA(S．Sumitomo，et al.，DNA Sequence，3: 297-302(1993)) を、Kpn I およびXho I による消化によって切断する。それをKpn I およびXho I 部位でpJT3にサブクローン化する。これによってBRK-2 の５′末端にKpn I 部 位が再生され、一方Xho I およびSal I 部位が破壊される。生じた構成をpJT3-B RK-2とし、それを図４に示す。 Caenorhabditis elegans（M．Estevez，L．Attisan，J.L．Wrana，P.S．Alber t，J．Massague，and D.L．Riddle，Nature，365: 644-9(1993)）由来のII型BMP レセプターであるDAF-4 を哺乳類細胞で発現させるために、cDNAをBLUESCRIPT II 内に獲得し、以下のようにしてpJT4内にサブクローン化する。daf-4 cDNAを 含む2.4kb フラグメントをDra I およびApa I による消化によって切断する。こ のフラグメントをSma I およびApa I 部位でサブクローン化する。これによって Apa I 部位が再生され、一方Dra I および Sma I部位が破壊される。生じた構成 をpJT4-Daf4 とし、それを図５に示す。 m-BRK-3 の哺乳類細胞での発現は、後述の実施例10を見よ。 実施例５ 哺乳類でのt-BRK-3，BRK-1，BRK-2，およびDAF-4 の発現 エレクトロポレーションを利用してCOS-7 細胞（ATCC CRL 1651）内で、ある いはDEAEデキストラン（Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ）を利用してCOS-1 細胞(ATCC CRL 1650)内で、pJT4-hBRK3T を用いた哺乳類細胞でのBRK-3の一時 的発現を実施する。 COS-7 細胞を、10％ウシ胎児血清（Hyclone，Logan，Utah）、非必須アミノ酸 （GIBO，Gaithersburg，MD）、およびグルタミンを添加したダルベッコ修正イー グル（Dulbecco's Modified Eagle: DME）高グルコース培養液中で増殖させ、ト リプシン処理を施すことによってプレートから細胞を遊離させる。遊離したCOS- 7 細胞を卓上遠心器でペレット状にした後、新鮮な培養液に6.25×10⁶細胞／ml で再懸濁する。細胞懸濁液(5×10⁶細胞、0.8ml)をバイオラッド・ジーン・パル サー（BioRad GENE PUSER）エレクトロポレーション・システム（BioRad，Hercu les，CA）のキュベットに移す。興味あるレセプターDNA （pJT4-J159FおよびpJT3-BRK2 の場合は10μg および／またはpJT4-hBRK3T）が 含まれる精製プラスミドをキュベットに添加し、細胞をキャパシタンス25μFd、 かつ4.0kV/cmでエレクトロポレーションにかける。つぎに、細胞をプレーティン グ（12穴プレートでは１穴あたり400,000 細胞、また100ml プレートでは５×10⁶ 細胞）して回復させる。24時間後、新鮮培養液を供給する。48時間経過後、細 胞に対するBMP-4 結合を試験することが可能となる。 COS-1 細胞におけるBMP レセプターの一時的発現を調べるために、10％ウシ胎 児血清（Hyclone，Logan，Utah）、非必須アミノ酸、およびグルタミンを添加し たDME 高グルコース培養液の入った100ml プレートで増殖させて約50％ないし80 ％の集密度とし、トリプシン処理を施すことによってプレートから細胞を遊離さ せる。細胞を37℃血清未添加DME 培養液で2 回洗浄し、その後各100ml プレート に対して4ml のDNA 混合物を添加する。このDNA 混合物は、DME、10％Nu- 血清( Collaborative Biomeical Products，Bedford，MA)、400μg/ml DEAE-デキスト ラン(Pharmacia，Piscataway，NJ)、0.1mMクロロキン（Sigma，St．Louis，MO） 、および興味あるcDNAを含むもので、t-BRK-3 に対しては16μg のpJT4-hBRK3T 、BRK-1に対しては８μg のpJT4-J159F、BRK-2 に対しては８μg のpJT3-BRK2、 DAF-4 に対しては4.16μg のpJT4-Daf4 とする。つぎに、細胞をDNA 混合物とと もに37℃で3 時間インキュベートする。この溶液を吸引し、細胞を4ml のDMSO溶 液に懸濁する。このDMSO溶液は、カルシウムまたはマグネシウムを含まない10％ ジメチルスルホン酸（DMSO）含有ダルベッコ（Dulbecco's）リン酸緩衝食塩水（ PBS; Life Technologies，Gaithersburg，MD）である。２分後、DMSO溶液を吸引 し、細胞を上記した増殖用の培養液で洗浄し、つづいてプレートに新鮮培養液を 再び注ぐ。形質移入24時間が経過した後に全細胞結合またはクロスリンクを行う ので、形質移入された細胞を12穴プレートに分ける。48ないし68時間後、細胞は 結合分析に対して適当な状態となる。 実施例６ 放射標識BMP-4 リガンドの産生 [¹²⁵I]-BMP-4を、ヨードビーズ(IODOBEADS)(Pierce，Rockford，IL; 非孔質ポ リスチレン・ビーズ上にクロラミン-Tが固定化されている)を用いて調製する。 氷上で凍結乾燥BMP-4（2μg）を50μl の10mM酢酸に取り、450 μl のりん酸緩 衝食塩水(PBS)(Sigma，St．Louis，MO)を加える。チューブに500 μキューリの^{1 25} I(Amersham，Arlington Heights，IL)(2200Ci/mmol)を5 μl、さらに１個のヨ ードビーズを加える。たまに振りながら10分間にわたって氷上でインキュベート することによって反応させる。反応の停止はヨードビーズから反応物を取り除く ことによって行う。未反応の¹²⁵Iを除去するために、混合物をPD-10 ゲルろ過カ ラム（Pharmacia，Piscataway，NJ）に加える。このカラムは、事前に10mM酢酸 、0.1M NaCl、および0.25％ゲラチンで飽和されている。生ずる標識タンパク質 は、トリクロロ酢酸によってその95％を上回る沈殿が可能である。このことは、 すべての¹²⁵Iがタンパク質に結合したものであり、一般に特異的活性が4,000 な いし9,000Ci/mmolである。 一方、クロラミン-T方法（C.A.Frolik、L.M．Wakefield、D.M．Smith、および M.B．Sporn，J.Biol.Chem.，259: 10995-1100(1984)）によってBMP-4に¹²⁵Iを標 識する。BMT-4(２μg)を、５μl の30％アセトニトリル、0.1 ％トリフルオロ酢 酸(TFA)、さらに５μl の1.5Mリン酸ナトリウム、pH7.4 が加えられた溶液に添 加する。担体なしの¹²⁵I（１mCi、９μl）を、２μl のクロラミンT 溶液（100 μg ／ml）とともに加える。さらに、２分および３分の時点で２μl のクロラミ ンT 溶液（100 μg ／ml）を追加する。4.5 分後、10μl の50mM N-アセチル・ チロシン、100 μl の60mM ヨウ化カリウム、さらに100 l の11M尿素、1M酢酸 を添加することによって反応を停止させる。３．５分間のインキュベーション後 、4mM HCl、75mM NaCl、１mg／ml牛血清アルブミン（BSA）が注入されたPD-10 ゲルろ過カラム（Pharmacia，Piscataway，NJ）を用いて、未反応のヨウ素を取 り除く。得られた標識タンパク質はトリクロロ酢酸によってその95％上回る沈殿 が可能であり、すべての¹²⁵Iがタンパク質に結合していることを示す。 さらに、得られた標識タンパク質は一般に特異的活性が3000−8000Ci／mmolであ る。 実施例７ t-BRK-3 に対するBMP-4 の結合の特徴 t-BRK-3 に対するBMP-4 の結合は、細胞全体に対する標識BMP-4n結合と、受容 体に対する標識BMP-4 の共有架橋結合によって示すことができる。これらの２つ の方法について以下詳細に説明する。 a.細胞全体に対する結合 実施例５に記載したようにして、COS-7 またはCOS-1 細胞をpJT-4-hBRK3Tによ って形質移入する。形質移入後、細胞を12穴（ウエル）プレートに播種し、48時 間ないし68時間の時点で結合実験を行う。その際、細胞を結合バッファ（50mM H EPES、pH7.4、128mM NaCl、5mM KCl、5mM MgSO₄、1.2mM CaCl₂、２mg／ml BSA ）で１度洗い、つづいて４℃、30〜60分、ゆっくり攪拌しながら同一バッファで 平衡にする。つぎに、バッファを吸引し、各ウエルに対して500 μlの結合バッ ファ（４℃）を加える。この結合バッファは、アッセイに応じて、[¹²⁵I]-BMP-4 トレーサ（100 〜400pM）と同様に、種々の濃度の未標識BMP-2、BMP-4、または 他の未標識リガンドを含む。非特異的結合を決定するために、BMP-4 を最終濃度 が10〜50nMになるようにして結合バッファに加える。インキュベーションの間、 リガンドのデグラデーションを防ぐために、プロテアーゼ阻害剤反応混液も添加 し、最終濃度が10μg ／mlロイペプチン、50μg ／mlアンチパイン、100 μg ／ mlベンズアミド、100 μg ／ml大豆トリプシン阻害剤、10μg ／mlベスタチン、 10μg ／mlペプスタチン、および300 μM フェニルメチルスルホニルフルオリド （PMSF）となるようにする。つづいて４℃、４時間、ゆっくり攪拌しながら同一 バッファで平衡にする。インキュベーション終了時、バッファを吸引し、１mlの 洗浄バッファ（50mM HEPES、pH７．４、128mM NaCl、5mM KCl、5mM MgSO₄、1. 2mM CaCl₂、0.5mg ／ml BSA）で細胞をすすぐ。最終 洗浄液を吸引した後、200 μl の溶解バッファ（10mM TrisCl、pH7.4、1mM EDTA 、1%(V／V)TritonX-100）を各ウエルに添加し、室温で15〜30分間する。溶解し た細胞を新しいチューブに移し、パッカード・モデル5005コブラ・ガンマ・カウ ンタ（Packard Model 5005 COBRA Gamma Counter; Packard Instruments，Merid en，CT）でもって計数する。 結果を図６に示す。この図ではNIH3T3細胞（ATTCC CRL 1658）に対する[¹²⁵I] -BMP-4 の特異的結合が示されており、BMP-4 の顕著なエンドジーニアスな結合 と、BRK-1 およびBRK-2 が存在および非存在下におけるt-BRK-3 のcDNAによって 形質移入されたCOS 7 細胞に対する結合が示されている。t-BRK-3 は、単独で発 現した場合に[¹²⁵I]-BMP-4 に結合することができる(最も右側)。この結合はBRK -1 およびBRK-2 が単独で発現した際の結合の場合と同濃度で行われる。[¹²⁵I]- BMP-4の結合はt-BRK-3 がBRK-1 とともに発現することによって増加し、さらにB RK-2 がt-BRK-2 とともに発現することによってよりいっそう増加する。 b.共有架橋結合 二官能価架橋結合剤であるジスクシニミジルグルタレート(DSG)(Pierce，Rock ford，IL)を用い、２つのタンパク質にあるリジン残基上で遊離アミノ基と反応 させることによって放射線標識リガンドをその受容体に共有架橋結合させた。架 橋形成後、細胞タンパク質をゲル電気泳動によって分離し、さら放射性のバンド を可視化する。標識バンドは、放射線標識リガンドによって選択的に“タグ”が つけられた受容体を表す。この方法では、実施例５に記載したようにして、細胞 はBRK-3 および（または）BRK-1 またはBRK-2 のcDNAによって形質移入され、つ づいて12穴プレートに播種される。形質移入後、48〜68時間で細胞を洗い、平衡 化し、[¹²⁵I]-BMP-4 とともにインキュベートし、さらに未標識のリガンドを計 数する。この計数は、全細胞結合について検討したこの実施例に記載したように して行う。リガントとの４時間にわたるインキュベーションを終了した後、細胞 を２ないし３回にわたって４℃で２mlの結合バッファによって洗う。この結合バ ッファは、すでに述べたものとBSA が添加されていないこと以外は同一の組成を 有する。つぎに、各ウエルに対してBSA を含まない１mlの結合バッファ を添加し、新たに調製したDSG を添加して最終濃度を135 μM にする。優しくか き回してDSG を混合した後、プレートを優しく振りながら４℃で正確に15分間イ ンキュベートする。現時点で培養液を吸引し、細胞を３mlの分離バッファ（10mM Tris塩基、0.25M スクロース、1mM EDTA、0.3mM PMSF）またはPBS によって洗 浄する。つぎに、溶解バッファ（50μL）を各ウエルに加え、４℃で30〜40分間 振とうすることによって細胞を溶解させる。試料の一部（20μl）を新しい管に 移し、５μl の5X試料装填バッファ（0.25MTrisCl、pH6.8、10％ SDS、0.5M Dっ T、0.5 ％ ブロモフェノールブルー、50％ グリセロール； Five Prime Thre e Prime，Boulder，COから購入）を添加する。試料を５分間沸騰させ、さらに遠 心（13,000 x g，５分）する。上清を７．５％SDS −ポリアクリルアミド・ゲル （Intergrated Separation System，Natick，MA）上に装填し、電気泳動にかけ た。ゲルを、0.12％クーマシー・ブルーR250、５％メタノール、7.5 ％酢酸で染 色し、５％メタノール、7.5 ％酢酸で脱染し、さらにその後乾燥させる。乾燥し たゲル上の放射能を視覚化し、さらにホスホリマジャー（PHOSPHORIMAGER；Mole cular Devices，Sunnyvale，CA，安定燐光物質スクリーンを用いた放射線定量装 置）で定量するか、あるいはコダック（Kodak）X-OMAT ARオートラジオグラフ ィ・フィルムを用いたオートラジオグラフィにかける。結果を図７に示す。t-BR K-3 が単独でCOS-1 細胞内で発現された場合、架橋したバンドは認められない。 BRK-1 単独の発現は、分子量78kDで架橋したバンドが得れられ、BRk-1 の予測分 子量プラスBMP-4 のモノマー分子量に一致する。t-BRK-3 とBRK-1 とが同時発現 することによって、94kDの新たに架橋したバンドと同様に、BRK-1 のものと同一 サイズのバンドが出現し、t-BRK-3 の予測分子量プラス架橋したBMP-4 のモノマ ー分子量に一致する。同様に、BRK-2 単独の発現は75kDで単独の架橋結合バンド が生じ、BRK-2 の予測分子量プラス架橋BMP-4 モノマーに一致する。t-BRK-3 と BRK-2 との同時発現は、94kDの新たに架橋したバンドと同様に、BRK-2 単独で認 められるものに一致する架橋バンドを生じ、tBRK-3の予測分子量プラス架橋BMP- 4 モノマー分子量に一致する。したがって、同時発現したタイプI のBMP 受容体 が存在する場合のみにt-BRK-3 に対する[¹²⁵I]-BMP-4 の架橋が観察される。 実施例８ Ｉ型BMP 受容体との複合体形成の実証 TGF-β受容体フアミリーを構成する受容体はＩ型およびII型の受容体が含まれ る複合体を形成することが知られている（L.Attisano，J.L．Wrana，F．Lopez-C asillas，and J．Massague，J．Biochem Biophys．Acta，122．72-80(1994)）。 II型BMP 受容体t-BRK-3 がI 型BMP 受容体BRK-1 および BRK-2と複合体を形成す ることが可能であることを示すために、実施例５に記載したように、COS 1 細胞 に対してt-BRK-3 およびBRK-1、またはt-BRK-3 およびBRK-2 のcDNAによって同 時に形質移入を行う。受容体を[¹²⁵I]-BMP-4 に架橋結合させ、つぎにＩ型受容 体BRK-1 およびBRK-2 に特異的な抗体で免疫沈降にかける。Ｉ受容体に特異的な 抗体が[¹²⁵I]-BMP-4 に架橋したＩ型受容体のみならず、[¹²⁵I]-BMP-4に架橋し たBRK-3 も沈降させるとすると、このことはＩ型およびII型の受容体が同様のリ ガンド結合特異性を持つと予想した通り、２つの受容体は複合体を形成しなけれ ばならないことを示す。 Ｉ型受容体BRK-1 およびBRK-2 に特異的な抗体は、抗原としてペプチドLNTRVG TKRYMAPEVLDESLNKNC（B.B．Koening，et al.，Molec．Cell．Biol.，14: 5961-5 974(1994)）を用いて産生される。このペプチドは、細胞内キナーゼ・ドメイン のBRK-1 アミノ酸配列にもとづいている。すなわち、配列識別番号12のアミノ酸 398-420 で、C 末端にシステインが添加されており、ペプチドの共役を許す。BR K-1 のキナーゼ・ドメインのアミノ酸配列をRaf タンパク質のキナーゼ・ドメイ ンと比較すると、このBRK-1 の領域が高特異的抗体を産生するのに用いられるRa f キナーゼの一領域に一致する(W．Kolch E．Weissinger，H．Mischak，J．Trop pmair，S.D．Showalter，P．Lloyd，G．Heidecker，and U.R．Rapp，Oncogene 5 : 713-720(1990))。このペプチドを、標準的な方法により、キーホール・リムペ ット・ヘモシアニンと共役させ、それを用いて３匹のニュー・ジーランド・ホワ イト・ラビット（Hazleton Washington，Vienna，VA）を免疫する。得られた抗 血清を、抗体捕獲ELISA を用いて、プラスチックを覆う元のペプチドに対する認 識能について評価する。抗血清をそれぞれ1378，1279，および1280 と呼ぶことにする。これらを抗体は、この実施例で詳細に述べる方法（B.B．Koe ning，et al.，Mol．Cell．Biol.，14: 5961-5974(1994)）を用いて、BRK-1 のc DNAで形質移入されたCOS-7 細胞からBRK-1 を免疫沈降させることが示される。B RK-2 の配列はこの領域でBRK-1 の配列とほとんど等しいので、それらの抗体を 同様にBRK-2 を免疫沈降させる能力についてその後試験し、そのかっかこの目的 にとって有効であることがわかった。抗体1379はBRK-1 の免疫沈降に関して優れ た結果を示した。また、抗体1380はBRK-2 の免疫沈降について好ましい結果を示 した。 免疫沈降方法では、実施例５に記載したようなt-BRK-3 および／またはBRK 1 ，BRK-2、またはDAF-4 のcDNAによってCOS-7 またはCOS-1 細胞をトランスフェ クションさせ、100mm ディッシュにプレーティングする。つぎに、[¹²⁵I]-BMP-4 および非標識リガンドとのインキュベーションは500 μl のかわりに全体で４ml として実行する点以外は、実施例７と同様にして[¹²⁵I]-BMP-4 と架橋させる。 したがって、他の容量もそれにともなって増加する。架橋形成後、細胞を氷冷PB S で３回洗い、さらに１mlのRIP バッファ（20mMTrisCl、pH8.0、100mM NaCl、1 mM Na2EDTA、0.5 ％ノニデントP-40、0.5 ％デオキシコール酸ナトリウム、10mM ヨウ化ナトリウム、および１％ 牛血清アルブミン）で10分間濯ぐ。ライセー トをマイクロ遠心器を用いて13,000rpm、10分間、４℃ で遠心する。上清を新 しいチューブに移し、SDS 中0.1％とする。ライセートに含まれるいっさいの抗 体を取り除き、50μl のパンソールビン（PANSORBIN）(Calbiochem，La Jolla， CA;黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の10％溶液を加える。４℃で30分 間インキュベートした後、ライセートを上記したようにして遠心し、上清を再び 新しいチューブに移す。 第一次の抗体、すなわちt-BRK-3 およびBRK-1 によって細胞がトランスフェク ションする場合は第一次抗体1379を、t-BRK-3 およびBRK-2 によって細胞がトラ ンスフェクションする場合は第一次抗体1380を、最終希釈が１：100 となるよう にしてチューブに加え、一夜４℃または氷上２時間インキュベートする。抗原： 第一次抗体の複合体を沈殿させるために、25〜50μl のPANSORBIN を添加し、氷 上で30分間インキュベートする。マイクロ遠心器によって13，000rpm、10分間遠 心することによってペレット状にするとともに、上清を捨てる。このペレットを 0.1 ％SDS 含有RIP バッファで２回洗い、つづいてTNENバッファ（20mM Tris、 pH8.0、100mM NaCl、1mM EDTA、0.5 ％ NP-40）で一回洗う。ペレットを25μl の1x試料添加バッファで再懸濁する(あるいはペレットをTNENバッファで２回洗 ってもよく、同様な結果が得られる)。この試料を５分間沸騰させた後、５分間 遠心し、さらに試料を7.5 ％SDS-ポリアクリルアミド・ゲル上に載せてゲル電気 泳動にかける。 この実験の結果を図８に示す。この図ではBRK-1 またはBRK-2 の存在下または 不在下でt-BRK-3 によってトランスフェクションしたCOS-1 細胞における免疫沈 降を結果が示されている。t-BRK-3 のみでトランスフェクションし、[¹²⁵I]-BMP -4に架橋し、さらに抗体1380で免疫沈降した細胞は、t-BRK-3 がこの抗体と交差 反応しないことから予想されるように、免疫沈降物中に放射能が検出されない。 BRK-1 でトランスフェクションし、架橋し、さらに抗体1379で免疫沈降した細胞 では、一本の標識バンドが78kDのところで認められ、BRK-1 の予想分子量プラス BRK-4 の架橋モノマーに一致する。BRK-1 およびt-BRK-3 で同時にトランスフェ クションした細胞の免疫沈降によってBRK-1 単独と同様のバンドが生じるととも に、さらに94kDのところにも標識バンドが認められ、これはt-BRK-3 の予想分子 量プラス架橋BRK-4 モノマーと一致する(120kD ところにも弱いバンドが認めら れる)。それらの細胞でBRK-1 に対する抗体はBRK-1 のみならずt-BRK-3 も沈殿 させるという事実は、BRK-1 とt-BRK-3 の間で複合体が形成されることを示して いる。同様に、BRK-2 でトランスフェクションし、[¹²⁵I]-BMP-4に架橋し、さら に抗体1380で免疫沈降した細胞は、75kDのところで標識バンドが認められ、これ はBRK-2 の予想分子量プラス架橋BRK ４モノマーと一致する。BRK-2 およびt-BR K-3 で同時にトランスフェクションした細胞の免疫沈降によって、BRK-2 単独で 認められものと同様のバンドが得られるとともに、94kDのところで強く標識され たバンドが認められ、これはBRK-3 予想分子量プラス架橋BRK-4 モノマーと一致 する。BRK-1 およびt-BRK-3 よって同時にトランスフェクションした細胞におい て、このバンドはよりいっそう大きな標識バンドとともに移動する(また、120kD で弱いバンドが認められる)。それらの細胞でBRK-2 に 対する抗体はBRK-2 のみならずt-BRK-3 も沈殿させるという事実は、BRK-2 とt- BRK-3 との間で複合体が形成されることを示している。したがって、II型BMP レ セプターで予想されたように、t-BRK-3 は２つの異なるI 型BMP レセプターを有 する複合体を形成する。 第２の免疫沈降実験を実施してBMP-2、BMP-4、およびTGF-β１に対するt-BRK- 3 レセプター複合体のリガンド特異性を試験する。また、“桁除去(digit-remov ed)”BMP-2（DR-BMP-2）と呼ばれるBMP-2 誘導体も試験する。このDR-BMP-2はBM P-2 を穏やかにトリプシン消化してアミノ末端を取り除いたものであり、細胞全 体に対する非特異的結合が顕著に抑えられている（B.B．Koenig，et al.，Molec ．Cell．Biol.，14: 5961-5974(1994)）。 実施例５に記載されたようにしてBRK-2 およびt-BRK-3 のcDNAでCOS-1 細胞を 同時にトランスフェクションし、[¹²⁵I]-BMP-4で架橋し、さらに過剰の未標識リ ガンド（10nM BMP-4、10nM BMP-2、10nM DR−BMP-2、または50nM TGF-β１）を [¹²⁵I]-BMP-4 と同時にインキュベーションに加えること以外はこの実施例で記 載したようにして抗体1380による免疫沈降にかけてる。得られた結果を図９に示 す。拮抗する未標識のリガンドが存在しない場合、２本の標識バンドが75kDおよ び94kDのところで身と得られ、それぞれ図８に示すように、架橋したBRK-2 およ びBRK-3 に一致する。しかし、過剰の未標識BMP-4、BMP-2、またはDR-BMP２が存 在する場合、こららのバンドは完全に廃止されることから、それらのリガンドが 効果的に[¹²⁵I]-BMP-4 と拮抗して複合体に結合することが示され、それらのリ ガンドはBRK-2 およびBRK-3 レセプター複合体に対する特異的結合を示す。しか し、50nM TGF-β１の存在は標識バンドに対して何ら効果を示さないことから、 TGF-β１は[¹²⁵I]-BMP-4 と同一の部位に結合しないことが示される。このこと は、BRK-2 ／t-BRK-3 複合体は特異的にBMP-2 およびBMP-4 に結合し、TGF −β には結合しないことを示す。 実施例９ マウスBRK-3 の単離 BRK-3 のマウス相同体全体を単離するために、NIH3T3マウス胎仔線維芽細胞（ ATCC CRL 1658）からcDNAライブラリーを構築する。全RNA 分離キット（Total R NA Separator Kit ；Clontech，Palo Alto，CA）を用いて細胞から全RNA（1．26 mg）を単離する。また、mRNA分離キット（mRNA Separator Kit；Clontech，Palo Alto，CA）を用いてその全RNA（１mg）からmRNA（81μg）を単離する。mRNA（ ４μg）の一定分量を使用して、cDNA合成およびプラスミド・クローニング用ス ーパー・スクリプト・プラスミド・システム（SUPER SCRIPT Plasmid System fo r cDNA Synthesis and Plasmid Cloning; Life Technologies，Gaithersburg，M D）を用い、かつ製造元の取扱説明書に従ってcDNAライブラリーを作る。得られ たライブラリーは約4.9 ×10⁵個の一次コロニーを含むもので、これらのコロニ ーをそれぞれが5000個のコロニーを持つ98個のプールに分ける。 サザンブロットでライブラリの初回スクリーニングを行う。QIGEN カラム（Qi agen，Chatsworth，CA）を用いて98プールの各々からプラスミドを生成する。各 プールのDNA（約５μg）をMluIで消化し、cDNAインサートを離し、さらに１％ア ガロース・ゲル上で流す。ゲルを0.6M NaCl、0.4M NaOH で30分間にわたって変 性させ、つづいて1.5M NaCl、0.5MTris、pH7.5 で中和する。つぎに、DNA を一 晩かけてハイボンド・ナイロン・メンブレン（HYBOND Nylon memberane; Amersh am，Arlington Heights，IL）に移す。この際、10xSSCをトランスファ・バッフ ァとして用いる（1 XSSC＝0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0）。 ヒトt-BRK-3 をEcoRV およびAflIIIで切断し、1.5kb フラグメントを得る。PR IME-ITDNランダム・プライマー・ラベリング・キット（Stratagene，La Jolla， CA; DNA のランダム・プライマー標識用キットで、クレノウDNA ポリメラーゼ 、プライマー、およびバッファを含む）を使用し、かつ特異的活性が3000Ci／mm olであるα[³²P]-dCTP（NEN Research Products，Boston，MA）を 用いて、上記フラグメントをランダムに標識する。標識プローブをハイブリダイ ゼーション・バッファ（Sigma，St．Louis，MO）中で18時間、42℃、サザンブロ ットにハイブリダイズさせる。このハイブリダイゼーション・バッファは50％脱 イオン化ホルムアミド、5XSSPE(1XSSPE＝0.14M NaCl、８mM リン酸ナトリウム 、0.08mM EDTA、pH7.7)、1XDenhardt's溶液、および100 μg ／mlの変性サケ精 巣DNA からなる。ブロットを、0.25XSSPE、0.5 ％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS ）でもって２回、各回とも42℃、15分間洗浄し、次に２回、各回とも65℃、20分 間洗浄する。つぎにブロットをコダックX-OMAT AR オートラジオグラフィ・フィ ルムに18時間、-80 ℃で露光する。フィルムを現像すると、約2.5kbの標識バン ドの存在によって判定される５つの陽性プールが認められる。 第２次のスクリーニングでは、プレートを５つの陽性プール（5000コロニー／ プール）由来の大腸菌（E.coli）株で画線する。このプレート上にHYBONDナイロ ン・メンブレンを置いて、細菌のコロニーをフィルターに移す。つぎに、コロニ ーを37℃、２〜３時間で回収する。フイルターを10％SDS に３時間浸し、つぎに 1.5M NaCl、0.5M NaOH に５分間移し、1.5M NaCl、1.5M Tris、pH7.5 で５分間 中和し、さらに2XSSC で洗浄する。タンパク質を取り除くために、ブロットを0. 1M Tris、pH7.6、10mM EDTA、0.15M NaCl、0.02％ SDS中で50μg ／mlのプロテ ィナーゼK（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）とともに、55℃、１時間 振とうする。ヒトBRK-3 フラグメント（EcoRV-AflIII）を標識し、ブロットを第 １次スクリーニングとまったく同様にしてハイブリダイズさせ、洗浄し、さらに オートラジオグラフィにかける。 第３次のスクリーニングを行うために、オートラジオグラフィ上の標識スポッ トに対応するコロニーをプレート上に画線する。第３次スクリーニングは上記第 ２次スクリーニングについてまったく同様にして行う。その結果、４種類の陽性 クローンを単離した。一つのクローンはpSPORT 1 ／N89-5 であり、もっとも大 きなインサートを有しており、このインサートのサイズは2.9kb である。 ４種類の陽性クローンのインサートの配列を、TAQ DYE DEOXY ターミネータ・ サイクル・シークエンシング・キトおよびアプライド・バイオシステムズ・モデ ル373A自動DNA シークエンサーを用いて決定した。４種類の配列を比較してみる と、そのうちの３種類が３′末端で相同であり、また４種類すべてが５′末端で ヒトBRK-3 のコード領域に合った。 配列に関する情報をさらに得るために、pSPORT 1 ／N89-5 由来のインサート をEcoRI およびScaIで消化して得られた1.4kb フラグメントをEcoRI およびHinC II部位でBLUESCRIPT II SK(-)にサブクローン化する。また、pSPORT 1 ／N89 5 をEcoRI およびEcoRV で消化して得られた2.1kb インサートを同一部位で同一ベ クターにサブクローン化する。最後に、プラスミドをScaIおよびNotIで消化し、 HincIIおよびNotI部位で同一ベクターにサブクローン化する。これら３通りの構 成に対して配列決定を行い、pSPORT 1 ／N89-5 の完全配列が得られた。 コード領域の５′末端のミッシング600 塩基対をcDNA末端急速増幅用５′レー ス・システム（5’RACE System for Rapid Amplificaion of cDNA Ends; Life technologies，Gaithersburg，MD）を用いてクローン化する。アンチセンス・プ ライマーをpSPORT 1 ／N89-5 の既知配列に対応させて消化し、５′ CTG TGT G AA GAT AAG CCA GTC ３′の配列を有するものとする（配列識別番号７の逆相補 体）。１μg のNIH3T3mRNAからcDNAの第一鎖合成を行った後、末端デオキシヌク レオチジル・トランスフェラーゼを用い、かつ製造元の取扱説明書にもとづいて 新たに合成したcDNAにポリC テールをつける。キットとともに提供されるアンカ ー・プライマー（Anchor Primer）とともに上記プライマーを用いてBRK-3 cDNA の５′末端を増幅し、５′（CUA）４ GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GI I GGG IIG ３′（配列中、I ＝イノシン、U ＝ウラシル）。AMPLITAQ DNAポリ メラーゼとともにGENE-AMP PCRキットを用いてPCR を行う。95℃、５分間で最初 の溶解を行った後、以下のプログラムを35回繰り返した。すなわち、このプログ ラムは、95℃、１分間の溶解、55℃、１分間のアニーリング、および72℃、２分 間の伸張からなる。最終回の後、反応を72℃、５分間にわたって保つことによっ て伸張を完了させる。非特異的なプライマー結合から生ずるバックグラウンドを 少なくするために、再びpSPORT 1 ／N89-5 由来インサートの既知配列から誘導 したネスト化プライマー５′CAA GAT CTT ACC CAA TCA CTT G3'（配列識別番号 ７の逆相補体）を、PCR の第１ラウンドで用いた同一アンカー・プライマーとと もに用いてPCR 第２ラウンドを行う。 大きさが600 〜1000bpの範囲内である第２PCR 反応の増幅産物をEcl XIおよび Sal I で消化し、Ecl XIおよびSal I 部位でBLUESCRIPT II SK(-)にサブクロー ン化する。インサートの配列決定を行ったところ、ヒトt-BRK-3 のコード領域に 合う追加の600bp が得られる。 R6-8B2、R6-11-1、およびR6-11-2 と呼ばれる三種類の異なるクローンは同一 結果で配列決定される。 マウスBRK-3 の完全なクローンを作るために、Sal I 部位をクローンR6-11-1 の５′末端に以下のようにして最初に置く。R6-11-1 のヌクレオチド１〜20が続 くSal I 部位を含むプライマーを合成する。すなわち、このプライマーの配列は ５′CAC ACG CGT CGA CCA TGA CTT CCT CGC TGC ATC G3' である。これを、M13 リバース・プライマー、５′ACC AGC TAT GAC CAT G3' とともに用いて、クロー ンR6-11-1 由来プラスミドDNA をテンプレートとして用いるDNA フラグメントの 増幅を行う。AMPLITAQ DNA ポリメラーゼとともにGEN-AMP PCR キットを用いて PCR を行った。最初の溶解は95℃、五分間行い、つづいて以下のプログラムを35 回繰り返した。すなわち、このプログラムは、95℃、１分間の溶解、55℃、１分 間のアニーリング、および72℃、２分間の伸張からなる。最終回の後、反応を72 ℃、５分間にわたって保つことによって伸張を完了させる。R6-11-1 から増幅し たフラグメントを、pSPORT 1 ／5（230ng）からのインサートとともに、以下の ようにしてBLUESCRIPT II SK(-)にサブクローン化する。R6-11-1由来インサート をEcl XIおよびPst I で消化する。また、ベクターBLUESCRIPT II SK(-)をSal I およびPst I で消化する。T4DNA リガーゼを用いるスリー・ウエイ・リゲーシ ョン（３時間、25℃）でもって結３種類のフラグメントを結合させ、バイオラッ ド・ジーン・バルサー（BIO-RAD Gene PULSER;BIO-RAD，Hercules，CA）を用い 、かつ製造元の取扱説明書にもとづいたエレクトロコンピテントな大腸菌（E．c oli）DH5-a 株の形質転換に利用する。陽性コロニーを選択してpBLUESCRIPT-mBR K３と命名する。PCR によって増幅されたインサートの５′部分の配列決定によ れば、クローンR6-11-1 のものと同一の配列が示される。このことは、増幅中に おいて何ら突然変異が引き起こされていないこ とを示している。 ほ乳類での発現について、mBRK-3をほ乳類発現ベクターpJT6にサブクローン化 する。このベクターはpJT3の誘導体で実施例４に記載されており、マルチプル・ クローニング部位の５′部位でNotIが欠失しており、さらにマルチプル・クロー ニング部位のPst I 制限部位とBamHI 制限部位との間にスペーサが挿入されてい る。サブクローニングを遂行するために、NotIおよびSal I を用いてBLUESCRIPT -mBRK3からm-BRK-3 を切除してNotIおよびSal I 部位でPJT6に挿入しpJT6-mBRK 3 を得る。 しかし、pSPORT 1 ／N89-5 にあるpJT6-mBRK-3 の３′末端およびオリジナルc DNAの再配列決定を行った結果、３′末端に変化したリーディング・フレームが あり、停止コドンが実際に３′からPst I 部位に位置することを示している。よ って、PJT6-mBRK3は停止コドンを含まない。したがって、２つの新規構成を以下 のように調製する。 第一に、pJT6-mBRK3をSpeI（配列識別番号７の位置2306の部位）およびNotI（ pJT6のマルチプル・クローニング部位）で消化し、インサートの３′末端を除去 する。NIH-3T3 ライブラリのスクリーニング中に単離されたもっとも長いクロー ンpSPORT 1 ／N89-5もまたSpeIおよびNotIによって消化する。pSPORT 1 ／N89-5 から遊離した1.2kb フラグメントをSpeI／NotI消化pJT6-mBRK3にサブクローン 化することによって、両部位が再生される。この構成はpJT6-mBRK-3Lと呼ばれ、 かつpSPORT 1 ／N89-5 クローンの３′末端全体を含む。この構成のマップを図1 0に示す。 クローンの３′末端は非翻訳領域３′から停止コドンに403 ヌクレオチドを有 する。この領域はA-T がたいへん多く含まれており、発現レベルを減少させるの かもしれない。この領域を取り除いて、第２の構成を調製する。pSPORT 1 ／N89 -5 プラスミドをHind III（配列識別番号７のヌクレオチド3168にある部位、３ ′から停止コドンまでの21塩基）。直線状になったプラスミドをDNA ポリメラー ゼのクレノウ・フラグメント（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）によ って処理し、突出部分を埋め、つぎにSpeIで切断することによってインサートの ３′末端で863bp フラグメントを遊離させる。同時に、pJT6-mBRK3をNotIで 消化する。直線化プラスミドをクレノウ・フラグメントで処理し、つぎにSpeIで 消化することによって、インサートの３′末端を遊離させる。NotI／SpeI消化pJ T6-mBRK3を、Hind III／SpeIによってpSPORT 1 ／N89-5 から遊離したフラグメ ントに結合する。得られた構成をpJT6-mBRK3S とし、図11に示す。 構成pJT6-mBRK-3Sもまた、m-BRK-3 の部分cDNAクローン、pSPORT 1 ／N89-5、 および該cDNAの５′末端を含む構成であるクローン6-11-1から直接構成される。 これは、クローンR6-11-1 をSal I およびEcl XIで消化し、pSPORT 1 ／N89-5 をEcl XIおよびHind IIIで消化し、さらにBLUESCRIPT II SK(-)をSal I およびH ind IIIで消化することによって達成される。つぎに、これらのフラグメントを スリー・ウエイ・リゲーションに供することによってBLUESCRIPT II ベクター内 にm-BRK-3 cDNAの完全なものが得られる。Sal I およびNotIを用いて完全なcDNA をこの構成から切り出し、つぎにpJT6ベクターのSal I およびNotI部位にサブク ローン化する。得られたプラスミドは、上記実施例に記載したpT6-mBRK3Sと同様 に、BRK-3 についてまったく同じcDNAを有する。しかし、cDNAの３′末端に追加 のベクター配列が保持される、BLUESCRIPT II SK(-)のマルチプル・クローニン グ部位のHind III部位とNotI部位との間にある領域が含まれる。 実施例10 マウスBRK-3 の配列分析 pJT6-mBRK3L 由来の完全な長さのマウスBRK-3 インサートのDNA 配列を配列識 別番号７に示し、推測されるタンパク質配列を配列識別番号８に示す。マウスBR K-3 の推測されるアミノ酸配列を、標準Needleman-Wunschアルゴリズム（S.B．N eedleman and C.D．Wunsch，J．Mol．Biol.，48: 443-453（1970））を用いてGe nBank リリース84.0、1994年８月15日付の翻訳されたすべてのタンパク質配列に 対して検索する。それはユニーク配列として見出される。それは1038アミノ酸か らなるタンパク質をコード化する。t-BRK-3 によってコード化された領域（配列 識別番号４のアミノ酸１〜582 ；配列識別番号８のアミノ酸１〜582）について マウスBRK-3 を不完全なヒト受容体と比較すると、これら２つの受容体 間において98％の配列が同じである。t-BRK-3 と同様に、m-BRK-3 はアミノ酸15 1 〜172 を包囲する予測トランスメンブレン領域を含む。t-BRK-3 あるように、 細胞内ドメインはセリン／スレオニン残基について予測された特異性を持つプロ ティン・キナーゼ・ドメインを特徴づけるコンセンサス配列のすべてを含む（S. K．Hanks，A.M．Quinn，and T．Hunter，Science，241: 42-52(1988)）。キナ ーゼ・ドメインにつづいて非常に長いカルボキシ末端（534 アミノ酸）を有する 。実際、このカルボキシ末端の存在によって、BRK-3 の細胞内ドメイン（866 ア ミノ酸）はTGB-β受容体ファミリーの他のいかなる受容体のものよりもかなり長 い。それは、本発明以前ではTGF-βファミリーのなかでもっとも長いとされてき たDAF-4 の細胞内ドメイン（490 アミノ酸）よりも約２倍長い。 実施例11 m-BRK-3 に対する[¹²⁵I]-BMP-4 の結合 m-BRK-3 に対して[¹²⁵I]-BMP-4 が特異的に結合することを実証するために、C OS-1 細胞を、pJT 6-mBRK-3S およびpJT 6-mBRK-3L の構成を用いて実施例５に 記載されたようにトランスフェクションする。また、構成pJT ３−BRK-2 を用い て、Ｉ型受容体BRK-2 のcDNAによっても該細胞を同時トランスフェクションする 。これによって、Ｉ型BMP 受容体の存在が[¹²⁵I]-BMP-4 の結合に影響を及ぼす かどうかを判断する。細胞全体に対する[¹²⁵I]-BMP-4 の結合は実施例７に記載 したようにして実行される。 図12に結果を示す。この結果は所定の数の細胞に対する[¹²⁵I]-BMP-4 の特異 的結合を示す。試験した２種類の構成のいずれかを用いてマウスBRK-3 単独で細 胞をトランスフェクションする場合、[¹²⁵I]-BMP-4 の特異的結合は偽トランス フェクション細胞で認められる結合の程度よりも４〜７倍増加する。BRK-2 単独 のトランスフェクションでは、結合はマウスBRK-3 単独で認められる結合の程度 と同様に増加する。細胞をマウスBRK-3 と同様にBRK-2 で同時トランスフェクシ ョンした場合、結合は偽トランスフェクション細胞で認められる結合の程度より も９〜11倍さらに増加し、t-BRK-3 とBRK-2 との組み合わせによる結果と一致 する（実施例７の図６）。 m-BRK-3 が[¹²⁵I]-BMP-4 に結合するという実証として、さらに架橋実験を実 施する。COS-1 細胞を、実施例５に記載しているように、pJT 6-mBRK-3S を用い てm-BRK-3 のcDNA、および／またはBRK-1 のcDNA（pJT 4-J159F 使用）またはBR K-2（pJT3-BRK-2を使用）によってトランスフェクションする。トランスフェク ションした細胞を[¹²⁵I]-BMP-4 とインキュベーションし、さらにジスクシニミ ジルグルタレートよりはむしろジスクシニミジルスベレート（DSS）を架橋剤と して用いること以外は実施例７に記載したようにして架橋する。そのような実験 の結果を図13に示す。m-BRK-3 単独でトランスフェクションした細胞は架橋した バンドを示さず、t-BRK-3 で得られた結果と一致する（図７）。BRK-1 のcDNAの みでトランスフェクションした細胞は見かけの分子量81kDのところで泳動する単 一種を示し、BRK-1 の予測分子量に架橋BRK-4 モノマーを加えたものと一致する 。BRK-1 のcDNAとBRK-3 のcDNAとでトランスフェクションした細胞では、標識バ ンドが３本観察される。そのうちの一本はBRK １単独の場合で観察されるバンド （81kD）と一致し、一方他のバンドは見かけの分子量が159kD および128kD で泳 動する。このうち、大きいほうのバンドは、m BRK-3 の予測分子量プラス架橋BR K-4 モノマーと一致する。注目すべきことは、BRK-1 によって識別される架橋バ ンドの強度が、BRK-1 単独の場合に比べて顕著に増加されていることである。 同様に、BRK-2 のcDNA単独によるトランスフェクションは、見かけ分子量78kD で泳動する架橋バンドを生じさせる。このバンドは、BRK-2 の予測分子量プラス 架橋BRK-4 モノマーと一致する。BRK-2 のcDNAとBRK-3 のcDNAとでトランスフェ クションした細胞内で、159kD および128kD で観察される架橋バンドに加え、BR K-2 によって識別される78kD種が観察され、BRK-1 およびm-BRK-3 のcDNAによっ てトランスフェクションした細胞に認められる分子量の大きいバンドと同時泳動 する。BRK-1 の場合と同様に、BRK-2 によて識別されるバンドへの架橋の強度は 、BRK-2 単独の場合と比較して顕著に増加する。最後にベクター単独でトランス フェクションした細胞では標識バンドは認められない。 免疫沈降実験を実施することによって、m-BRK-3 がI 型BMP 受容体と複合体 を形成する能力を示す。COS-1 細胞を、実施例５に記載しているように、構成pJ T 6-mBRK-3S を用いてm-BRK-3 のcDNAによって、および／またはBRK-1（pJT4-J1 59Fを用いる）またはBRK-2（pJT3-BRK-2を用いる）のcDNAによってトランスフェ クションさせる。トランスフェクションした細胞を[¹²⁵I]-BMP-4 とともにイン キュベーションし、架橋させ、さらに適当なI 型受容体に対する抗体または免疫 前の血清による免疫沈降にかける。この際、ジスクシニミジルグルタレートのか わりにDSS を架橋剤として用いること以外は実施例８の記載に従って行う。本実 験の結果を図14に示す。BRK-1 のcDNA単独でトランスフェクションした細胞は、 BRK-1 に対する抗体で沈降し、見かけ分子量81kDで泳動する。BRK-1 のcDNAとm- BRK-3 のcDNAとでトランスフェクションした細胞では、BRK-1 に対する抗体で強 度の高まった81kDのバンドが沈降する。しかし、それに加えて見かけ分子量159k D で泳動するバンドが観察され、m-BRK-3 の予測分子量プラス架橋BMP-4 モノマ ーと一致する。同様に、BRK-2 単独でトランスフェクションした細胞では、BRK- 2 に対する抗体で見かけ分子量78kDで泳動する標識種が沈降する。BRK-2 のcDNA とm-BRK-3 のcDNAとでトランスフェクションし、BRK-2 で沈降させた細胞では、 BRK-2 によって識別される強度が増大した78kDのバンドが再び観察される。また 、標識種は159kD で認められ、m-BRK-3 に一致し、BRK-1 のcDNAとm-BRK-3 のcD NAとでトランスフェクションした細胞に認められるよいいっそう高分子量のバン ドと同時泳動する。BRK-2 のcDNAとm-BRK-3 のcDNAとでトランスフェクションし た細胞では、94kDで別の標識バンドが認められる。対照として、BRK-1 およびm- BRK-3 のcDNA、またはBRK-2 およびm-BRK-3 のcDNAで細胞をトランスフェクショ ンさせ、つぎに免疫前の血清で免疫沈降にかける(もっとも左側のレーンともっ とも右側のレーン)。その結果、標識されたバンドは認められない。 この実験によれば、mBRK-3がＩ型BMP 受容体BRK-1 またはBRK-2 と同時発現す ること、およびＩ型受容体を沈降させる抗体はm-BRK-3 も沈降させることが明ら かである。したがって、哺乳類II型BMP 受容体で予想されたように、m-BRK-3 は それらの哺乳類Ｉ型BMP 受容体のいずれかと複合体を形成することができる。こ のことは、上記実施理恵８に記載したt-BRK-3 で得られた結果と一致する。 実施例12 ヒトBRK-3 のcDNA全長の単離 実施例２に記載したクローンHSK723はフレーム内（in-frame）停止コドンを持 たないので、このcDNAの末端に追加の配列３′を獲得する必要がある。したがっ て、実施例１で調製したヒト包皮線維芽細胞ライブラリーを、実施例２の記載通 りの標識およびスクリーニング条件下でHSK7-2PCR フラグメントによって再スク リーニングする。これによって、BLUESCRIPT II SK(-)にサブクローン化された ヒトBRK-3 配列（全体で3355塩基対）がさらに含まれる長いクローンが単離でき 、該クローンをpHSK1030と呼ぶ。pHSK1030由来インサートを配列決定すると、98 2 アミノ酸からなるコード領域が示されるけれども、該インサートにはフレーム 内停止コドンが含まれないことがわかる。 コード領域の残りの部分を以下のようにしてPCRによるクローニングを行う。 ２つの先行プライマーをクローンpHSK1030のプラス鎖から得る。これらのプライ マーの配列は以下の通りである。すなわち、プライマーPRK3-1の配列は、５′CC TGTCACATAATAGGCGTGTGCC-3'(配列識別番号１のヌクレオチド1998〜2021と同一) であり、またプライマーPRK-2 の配列は、５′CGCGGATCCATCATACTGACAGCATCG３' (配列識別番号１のヌクレオチド2078〜2095が続くBamHI 部位を取り込む)である 。さらに２つのプライマーをλgt10のマイナス鎖から得る。これらのプライマー は、G10F1、５′GCTGGGTAGTCCCCACCTTT３′とG10F2，５′GAGCAAGTTCAGCCTGGT３ ′である。実施例１で調製したヒト線維芽細胞cDNAライブラリーをPCR のテンプ レートとして用いる。このライブラリー（0.3μg）をPRK3-1およびG10F1 プライ マー(各々１μM)、Tthポリメラーゼ(1.2 ユニット)、全４種類ので沖思慕ヌクレ オチド(各々200 μM)、Tthポリメラーゼ用バッファ、および水とともに全体が50 μl となるようにしてインキュベーションする。PCR サイクルの条件は以下の通 りとする。すなわち、最初の溶解を94℃で２分間行い、その後続けて、94℃、1. 5 分間の溶解、52℃、２分間のアニーリング、および72℃、３分間の伸展を20サ イクル繰り返す。20サイクルを完了後、試料をさらに72℃、８分間保ち、伸展が 完全 になされるようにする。 特異性を増大させ、かつバックグラウンドを少なくするために、ネスト化PCR 第２ラウンドを実行する。インキュベーション混合物はこの実施例の第１ラウン ドについての記載と同様であるけれども、（１）第１PCR 反応の一定分量（0.5 μl）をテンプレートとして用いること、（２）RPK3-1およびG10F1 のかわりにP RK3-2およびG10F2 プライマーを用いることが異なる。PCR を実行するための条 件は、この実施例でPCR の第１ラウンドについて記載したことを同一である。 PCR の第２ラウンドによって、1.6kb フラグメントの増幅が得られ、該フラグ メントはQIAEX によってアガロース・ゲルから単離される。このフラグメントを EcoRI およびBamHI によって消化し、さらにEcoRI およびBamHI 部位でBLUESCRI PT II SK(-)にサブクローン化する。得られた構成pHSK723-3Uの配列が決定され 、フレーム内停止コドンを持つBRK-3 の残存コード領域をコード化することがわ かる。 ヒトBRK-3 全体をアセンブルするため、pHSK1030およびpHSK1040由来のインサ ートをベクターBLUESCRIPT II SK(-)のユニークStuI部位（配列識別番号１のヌ クレオチド3219に位置）に結合させる。これによって完全なヒトBRK-2のコード 配列が含まれる完全な構成pHSK1040が得られる。pHSK1040を図15に示す。ヒトBR K-3 のDNA 配列を配列識別番号１に示し、またヒトBRK-3 の推論されたアミノ酸 配列を配列識別番号２に示す。 ヒトBRK-3（配列識別番号２）のアミノ酸配列をm-BRK-3（配列識別番号８）と 比較してみると、96.7％が同一であることがわかる。 実施例13 BMP 受容体アゴニストおよびアンタゴニストを同定する リガンド結合アッセイにおけるBRK-3 の使用 BRK-3 と相互作用するリガンドの同定は、リガンドとBRK-3 との相互作用を測 定するように設計されたアッセイを用いることによって達成できる。大量の試料 を扱うように適合された受容体結合アッセイの一例を以下のようにして実施す る。 COS-1 細胞を、12穴培養皿で細胞増殖を行うこと以外は上記実施例11に記載し たようにして、構成pJT6-mBRK-3Lを用いてm-BRK-3 のcDNAによってトランスフェ クションする。トランスフェクション後48〜68時間で、細胞を1.0ml の結合バッ ファ（50mM HEPES、pH7.4、128mM NaCl、5mM KCl、5mM MgSO₄、1.2mM CaCl₂、2m g ／ml BSA）で一度洗浄し、つぎに同一バッファで４℃、60分間、穏やかに振 とうしながら平衡させる。平衡化後、バッファを吸引し、各ウエルに４℃の[¹²⁵ I]-BMP-4 トレーサー（100 〜400pM）含有結合バッファ500 μlを、種々の濃度 の非標識試験化合物（すなわち、推定上のリガンド）の存在または不在下で、各 ウエルに添加し、４℃、４時間にわたって穏やかに振とうする。非特異的結合お よびBMP 受容体複合体からの完全な置換を判断するために、BMP-2 を最終濃度10 nMで加えることによって、最終的に濃度が10μg／mlロイペプチン、10μg ／ml アンチペイン、50μg ／mlアプロチニン、100 μg ／mlベンズアミジン、100 μ g ／ml大豆トリプシン阻害剤、10μg ／mlベスタチン、10μg ／mlペプスタチン 、および300 μM フェニルメチルスルフォニルフルオライド（PMSF）とする。イ ンキュベーション時間終了時、バッファを吸引し、細胞を１mlの洗浄液（50mM H EPES、pH7.4、128mM NaCl、5mM KCl、5mM MgSO₄、1.2mM CaCl₂、0.5mg／ml BSA ）で４回濯ぐ。最終洗浄液を吸引後、200 μlの溶解バッファ（10mM TrisCl、p H7.4、１mM EDTA、1%(v／v)ToritonX-100）を各ウエルに添加し、室温で15〜30 分間インキュベーションする。つぎに、溶解した細胞を新しいチューブに移し、 パッカード・モデル5005COBRA ガンマ・カウンター（Packard Instruments，Mer iden，CT）で計数する。 m-BMP-4 受容体と相互作用する化合物について、m-BRK-3 を発現する細胞内で [¹²⁵I]-BMP-4 トレーサーによる該受容体への結合との競合を観察した結果、新 規化合物が不在の状態でトレーサーがインキュベーションされた場合に観察され る結合と比較して該試験化合物存在下での[¹²⁵I]-BMP-4 トレーサーの結合は少 ない。試験した試験化合物の濃度がもっとも高いところで[¹²⁵I]-BMP-4 トレー サーの減少は≧30％に至る。このことは、試験化合物はm-BRK-3 に結合すること を示している。 この実施例の方法にもとづいて同様の結果が他の、本発明の関連BRK-3 タンパ ク質受容体を用いた場合に観察される。 実施例14 BMP 受容体アゴニストおよびアンタゴニストを同定するための リガンド結合アッセイにおけるm-BRK-3 およびBRK-2 の使用 Ｉ型BMP と複合体を形成したBRK-3 と相互作用するリガンドの同定は、リガン ドとこのBMP 複合体との相互作用を測定するように設計されたアッセイを用いる ことによって達成できる。m-BRK-3 ／BRK-2 複合体を用い、かつ大量の試料を扱 うように適合された受容体結合アッセイの一例を以下のようにして実施する。 12穴培養皿で細胞増殖を行うこと以外は上記実施例11に記載したようにして、 構成pJT6-mBRK-3Lを用いてm-BRK-3 のcDNAによって、また構成pJT3-BRK-2を用い てBRK-2 のcDNAによって、COS-1 細胞をトランスフェクションする。細胞をトラ ンスフェクションするのに用いられたDNA 混合物は、２μg ／mlのpJT3-BRK-2お よび４μg ／mlのpJT6-mBRK-3Lを含む。トランスフェクション後48〜68時間で、 細胞を１mlの結合バッファ（50mM HEPES、pH7.4、128mM NaCl、５mM KCl、５mM MgSO₄、1.2mM CaCl₂、２mg／ml BSAで一度洗浄し、つぎに同一バッファで４℃、 60分間、穏やかに振とうしながら平衡させる。平衡化後、バッファを吸引し、各 ウエルに４℃の[¹²⁵I]-BMP-4 トレーサー（100 〜400pM）含有結合バッファ500 μl を、種々の濃度の試験化合物（すなわち、推定上のリガンド）の存在または 不在下で、各ウエルに添加し、４℃、４時間にわたって穏やかに振とうする。非 特異的結合およびBMP 受容体複合体からの完全な置換を判断するために、BMP-2 を最終濃度10nMで加える。リガンドの減衰を阻止するために、プロテアーゼ阻害 剤カクテルも添加することによって、最終的に濃度が10μg ／mlロイペプチン、 10μg ／mlアンチペイン、50μg ／mlアプロチニン、100μg ／mlベンズアミジ ン、100 μg ／ml大豆トリプシン阻害剤、10μg ／mlベスタチン、10μg ／mlペ プスタチン、および300 μM フェニルメチルスルフォニルフルオライド（PMSF） とする。インキュベーション時間終了時、バッファを吸引し、細胞 を１mlの洗浄液（50mM HEPES、pH7.4、128mM NaCl、５mM KCl、５mM MgSO₄、1.2 mM CaCl₂、0.5mg ／ml BSA）で４回濯ぐ。最終洗浄液を吸引後、200 μlの溶解 バッファ（10mM TrisCl、pH7.4、１mM EDTA、１%(v ／v)ToritonX-100）を各 ウエルに添加し、室温で15〜30分間インキュベーションする。つぎに、溶解した 細胞を新しいチューブに移し、パッカード・モデル5005COBRA ガンマ・カウンタ ー（Packard Instruments，Meriden，CT）で計数する。 m-BMP-3 ／BRK-2 受容体複合体と相互作用する試験化合物について、[¹²⁵I]-B MP-4トレーサーによる該受容体複合体への結合との競合を観察した結果、新規化 合物が不在の状態でトレーサーがインキュベーションされた場合に観察される結 合と比較して該試験化合物存在下での[¹²⁵I]-BMP-4 トレーサーの結合は少ない 。m-BRK-3 ／BRK-2 受容体複合体に試験した試験化合物の濃度がもっとも高いと ころで[¹²⁵I]-BMP-4 トレーサーの減少は ≧30％に至る。このことは、試験化 合物はm-BRK-3 ／BRK-2 受容体複合体に結合することを示している。 この実施例の方法にもとづいて同様の結果が他の、本発明の関連BRK-3 タンパ ク質受容体複合体、またはその相同体をBRK-2 または他のI 型受容体を用いた場 合に観察される。 実施例15 BMP 受容体アゴニストおよびアンタゴニストを同定するための 情報伝達アッセイにおけるm-BRK-3 およびBRK-2 の使用 Ｉ型受容体と複合体を形成したBRK-3 と相互作用するやいなや信号を送るリガ ンドの同定は、リガンドと受容体複合体との結合後、受容体タンパク質キナーゼ ・ドメインの活性を測定するように設計されたアッセイを用いることによって達 成される。mBRK-3／BRK-2 複合体を発現する細胞のＩ型BRK-2 受容体に対する抗 体によって免疫沈降するタンパク質のリン酸化反応における変化を測定するin vivoリン酸化アッセイは、以下のように実施する。 COS１細胞のトランスフェクションを、構成pJT6-mBRK-3Sを用いてm-BRK-3 の cDNAによって、および構成pJT3-BRK-2を用いてBRK-2 によって、細胞をT175フラ スコ（Falcon）で増殖させる以外は実施例11の記載通りに実施する。細胞をトラ ンスフェクションさせるのに用いられたDNA 混合物は、２μg ／mlのpJT3-BRK-2 と４μg ／mlのpJT6-mBRK-3Sとを含む。トランスフェクション後24時間、細胞を 100mm 組織培養皿にプレーティングし、少なくとも５時間、プレートに付着させ る。その後、培養液を１％牛胎仔血清(HyClone，Logan，UT)、および２mM L - グルタミン、0.1mM MEM 非必須アミノ酸溶液を含むDMEM（Life Technologies，I nc.，Gaithersburg，MD）に変更し、この低濃度血清培養液でさらに12〜18時間 培養する。血清飢餓細胞をリン酸塩を含まず、一方で２mM L-グルタミン、0.1m M MEM 非必須アミノ酸溶液、および25mM HEPESバッファ、pH7.4 が足されたダル ベッコ修飾イーグル培養液（Dulbecco's modified Eagle's medium)(DMEM; Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD を一組織培養皿あたり10mlで、３回洗 浄する。一培養皿あたり３mlのリン酸塩非含有補足DMEMと、一培養皿あたり0.8 〜1.0 ミリ・キューリの［³²P］オルトリン酸（DuPont New England Nuclear，W ilmington，DE）を細胞に添加し、さらに37℃で95％空気／５％CO₂、３時間の条 件でインキュベーションを行う。インキュベーション後、細胞を適当な濃度のリ ガンド刺激剤、例えばBMP-4 で37℃、５分間処理する。処理された細胞を、一培 養皿あたり10mlの４℃、50mM Tris緩衝塩溶液（Sigma，St．Louis，MO）で３回 洗浄し、一培養皿あたり１mlのPRIP バッファ（20mM Tris pH8.0、100mM 塩化ナ トリウム、１mM ジソジウム・エチレンジアミンテトラ酢酸、0.5 ％ Nonidet P -40、0.5 ％ デオキシコール酸ナトリウム、10mM ヨウ化ナトリウム、１％牛 血清アルブミン、50mM フッ化ナトリウム、30mM テトラソジウムピロホスフェ ート、250mM オルトバナジン酸ナトリウム、１mM フェニルメチルスルホニル フルオライド（すべての試薬の製造元：Sigma，St．Louis，MO）。ライセートを 遠心10，000xg、10分間で分画し、ドデシル硫酸ナトリウム（Sigma，St．Louis ，MO）を10％ストック溶液から添加して最終濃度を0.1 ％とする(絵あれたバッ ファをP-RIPSと呼ぶ。すなわち、0.1 ％ドデシル硫酸ナトリウムが懸濁されたP- PIP)。100 μl のPANSORBIN（S．aureus細胞の10％溶液；パンソルビン(Pansorb in): Calbiochem，La Jolla，CA）を添加し、チューブ を氷上で30分間インキュベートする。PANSORBIN を遠心（1000xg、３分間）によ って除去し、新しいチューブに移す。この際、このチューブには、ペプチドARPR YSIGLEQDETYPPCに対して産生されたBRK-2 抗体を本アッセイで使用すること以外 は上記実施例８の記載４通りに、１：100 希釈のウサギ抗BRK-2 ポリクローン抗 血清が含まれている。また、上記の実施例８に記載したように、上記ペプチドは 細胞内膜近接領域のBRK-2 のアミノ酸配列にもとづいており、配列識別番号14の アミノ酸155 〜172 が含まれ、またC 末端にシステインが加えられていることに よってペプチドの接合が可能である。４℃で一晩インキュベーションした後、50 μl のパンソルビンを添加し、さらに40℃、30分間インキュベートする。パンソ ルビン結合複合体を1000xg、３分間の遠心によりペレット化し、さらに該ペレッ トをP-RIS バッファで３回洗浄し、またP-TNENバッファ（20mM TrispH8.0、100 mM 塩化ナトリウム、１mM エチレンジアミンエトラ酢酸、0.5 ％ Nonidet P-4 0、50mM フッ化ナトリウム、30mM テトラリン酸ソーダ、250mM オルトバナジ ン酸ナトリウム、および１mM フェニルメチルスルホニルフッ化物）で１回洗浄 する。つぎに一本のチューブあたり20mlのSDS −PAGE試料バッファ（5 Prime-3 prime，Boulder，Co: 50mMTrispH6.8、２％ドデシル硫酸ナトリウム、0.1M ジ チオスレイトル、0.1 ％ ブロモフェノールブルー、10％グリセロール）に再懸 濁し、95℃、５分間加熱し、さらに遠心（10，000Xg、３分間）してペレット化 する。上清を7.5%、12.5%、または15％SDS-ポリアクリルアミド・ゲル（Integra ted Separation Systems，Natick，MA）上で電気泳動する。このとき、一ゲルあ たり35ミリアンペアの電流とし、また電気泳動バッファは25mMTrispH8.5、192mM グリシン、および0.1 ％ ドデシル硫酸ナトリウム(Integrated Separation Sy stems，Natick，MA)。ゲルを40％メタノール10％酢酸溶液で固定し、乾燥させ、 さらに−80℃でオートラジオグラフィーにかけるか、あるいはPhosphorImager分 析（Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA）にかける。 BRK-2 ／BRK-3 受容体複合体のアゴニストである試験化合物は、タンパク質の ［³²P］による標識が増加することによって判定されるように、BRK-2 受容体に 対する抗体によって免疫沈降されたタンパク質のリン酸化の増加を引き起こす。 アンタゴニスト活性を試験するために、試験化合物を一定の濃度のBMP-4 または 他のBMP 受容体アゴニストの存在下で添加する。BRK-2 ／BRK-3 受容体複合体の アゴニストである試験化合物は、一定の濃度のBMP-4 または他のBMP 受容体アゴ ニストのみで細胞を刺激した後に観察されるものと比較して、BRK-2 免疫沈降物 に存在するタンパク質の標識の減少を引き起こすであろう。BRK-3 、t −BRK-3、およびm-BRK-3 の寄託 pJT4-J159F（発現ベクターpJT4内にサブクローン化された配列識別番号11）に よって形質転換された大腸菌（E.coli）は、1993年10月７日にATCCによって寄託 され、ATCC指名番号第69457 号が割り当てられた。 pJT4-hBRK3T（発現ベクターpJT4内にサブクローン化された配列識別番号３） によって形質転換された大腸菌（E.coli）は、1994年８月16日にATCCによって寄 託され、ATCC指名番号第69676 号が割り当てられた。 pJT6-mBRK-3S（発現ベクターpJT6内にサブクローン化された配列識別番号７） によって形質転換された大腸菌（E.coli）は、1994年９月28日にATCCによって寄 託され、ATCC指名番号第69694 号が割り当てられた。 pJT6-mBRK-3L（発現ベクターpJT6内にサブクローン化された配列識別番号７） によって形質転換された大腸菌（E.coli）は、1994年９月28日にATCCによって寄 託され、ATCC指名番号第69695 号が割り当てられた。 pHSK1040（BLUESCRIPT II SK(-)内にサブクローン化された配列識別番号１） によって形質転換された大腸菌（E.coli）は、1994年10月12日にATCCによって寄 託され、ATCC指名番号第69703 号が割り当てられた。 当業者に理解されるように、ＤＮＡおよびアミノ酸シークエンシング法ではし ばしばエラーが生ずる。その結果、寄託した材料にコード化された配列を本明細 書に援用するとともに、本発明の記載に見出された配列のいずれかに生じた誤り を管理するものとする。さらに、本明細書の記載から出願人の研究を再現する当 業者は、日常的な技術によって配列決定に何らかの誤りを発見することが可能で ある。ATCC第69457 号、ATCC第69676 号、ATCC第69694 号、ATCC第69695 号、お よびATCC第69703 号は、寄託した材料が本発明の実施に不可欠のものであること を認めるものではない。 本明細書で指摘したすべての文献を本明細書では援用する。 本明細書に記載した実施例および実施態様は説明することのみを目的としたも のであって、それらの範囲内で当業者が考えつく種々の変更または修飾は、本出 願の思想および範囲、さらには添付したクレームの範囲に含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．化合物がBMP 受容体キナーゼ・タンパク質複合体に結合することが可能であ るかどうかを判断する方法であって、 前記化合物を含有する試料を前記複合体に取り入れて、前記複合体に前記化合 物を結合させる工程を有し、さらに、 前記複合体はI 型BMP 受容体キナーゼ・タンパク質とBMP 受容体キナーゼ・タ ンパク質BRK-3 とからなることを特徴とする方法。 ２．請求項１に記載の方法であって、前記BMP 受容体キナーゼ・タンパク質BRK- 3 はアミノ酸配列： (a) 配列識別番号２または該配列識別番号２の可溶性フラグメント； (b) 配列識別番号４または該配列識別番号２の可溶性フラグメント；または (c) 配列識別番号８または該配列識別番号２の可溶性フラグメントを有するも のであり、好ましくは前記Ｉ型BMP 受容体キナーゼ・タンパク質は配列識別番号 12または配列識別番号14のアミノ酸配列を有し、さらに好ましくは、前記Ｉ型BM P 受容体キナーゼ・タンパク質は配列識別番号14のアミノ酸配列を持ち、好まし くはBMP 受容体キナーゼ・タンパク質BRK-3 は配列識別番号４のアミノ酸配列を 有することを特徴とする方法。 ３．BMP 受容体キナーゼ・タンパク質BRK-3 をコードするDNA 配列を含む発現ベ クターと、Ｉ型BMP 受容体キナーゼ・タンパク質をコードするDNA 配列を含む発 現ベクターとによって同時トランスフェクションしたことを特徴とする宿主細胞 。 ４．請求項４に記載の宿主細胞であって、前記BMP 受容体キナーゼ・タンパク質 BRK-3 をコードするDNA 配列は、配列識別番号１、配列識別番号３、配列識別番 号５、配列識別番号７、または配列識別番号９であることを特徴とする宿主細胞 。 ５．請求項３または請求項４に記載の宿主細胞であって、前記Ｉ型BMP 受容体キ ナーゼ・タンパク質をコードするDNA 配列は、配列識別番号11または配列識別番 号13であることを特徴とする宿主細胞。 ６．請求項３、請求項４、または請求項５に記載の宿主細胞であって、前記BMP 受容体キナーゼ・タンパク質BRK-3 をコードするDNA 配列は配列識別番号３であ り、また前記Ｉ型BMP 受容体キナーゼ・タンパク質をコードするDNA 配列は、配 列識別番号11または配列識別番号13であることを特徴とする宿主細胞。 ７．臨床試料に含まれるBMP 受容体リガンドの濃度を決定する方法であって、 a.前記リガンドを含む臨床試料をBMP 受容体キナーゼ・タンパク質複合体およ び標識BMP と混合する工程と、 b.前記試料存在下、前記複合体に前記標識BMP を結合させる工程と、 c.既知の濃度のBMP リガンドによって用意した標準曲線と比較する皇帝とを有 し、さらに、 BMP 受容体キナーゼ・タンパク質複合体は、Ｉ型BMP 受容体キナーゼ・タンパ ク質とBMP 受容体キナーゼ・タンパク質BRK-3 とからなることを特徴とする方法 。 ８．請求項７に記載の方法であって、前記BMP 受容体キナーゼ・タンパク質BRK- 3 は、アミノ酸配列： (a) 配列識別番号２または該配列識別番号２の可溶性フラグメント； (b) 配列識別番号４または該配列識別番号２の可溶性フラグメント；または (c) 配列識別番号８または該配列識別番号２の可溶性フラグメントを有するこ とを特徴とする方法。 ９．請求項７または８に記載の方法であって、前記Ｉ型BMP 受容体キナーゼ・タ ンパク質は、配列識別番号12、配列識別番号14、配列識別番号16、または配列識 別番号18のアミノ酸配列を有することを特徴とする方法。 １０．試験化合物がBMP 受容体タンパク質複合体と結合するやいなや信号を生ず るかどうかを判断する方法であって、 (a) BMP 受容体キナーゼ・タンパク質BRK-3 をコードするDNA 配列とＩ型BMP 受容体キナーゼ・タンパク質をコードするDNA 配列とによってトランスフェクシ ョンしているBMP 受容体タンパク質複合体発現細胞を³²P によって標識する工程 と、 (b)(i) 前記試験化合物存在下での前記細胞の第１の組の培養と、 (ii) 前記試験化合物不存在下での前記細胞の第２の組の培養とを行う工程 と、 (c) 前記工程(b)によって生じたリン酸化タンパク質をオートラジオグラフィ ーを介して定量する工程と、 (d) 前記工程(c) によって定量された前記細胞の第１の組の前記リン酸化タン パク質の量を、前記工程(c)によって定量された前記細胞の第２の組の前記リン 酸化タンパク質の量と比較する工程とを有することを特徴とする方法。