JP2002095490A - アスパラギン酸の製造法 - Google Patents
アスパラギン酸の製造法Info
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- JP2002095490A JP2002095490A JP2000289354A JP2000289354A JP2002095490A JP 2002095490 A JP2002095490 A JP 2002095490A JP 2000289354 A JP2000289354 A JP 2000289354A JP 2000289354 A JP2000289354 A JP 2000289354A JP 2002095490 A JP2002095490 A JP 2002095490A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 アスパルターゼを含む固定化酵素を用いてフ
マル酸とアンモニウムイオンとからＬ−アスパラギン酸
を製造する方法において、長期間連続して高転化率で反
応させることができる原料液の調製方法の提供。 【解決手段】 フマル酸及びアンモニウムイオンを含有
する原料液を、固定化酵素を充填した反応器への通液の
前に孔径０．１μｍ〜２００μｍのフィルターに通す。
これにより、固定化酵素を１年以上にわたって使用する
ことができる。
マル酸とアンモニウムイオンとからＬ−アスパラギン酸
を製造する方法において、長期間連続して高転化率で反
応させることができる原料液の調製方法の提供。 【解決手段】 フマル酸及びアンモニウムイオンを含有
する原料液を、固定化酵素を充填した反応器への通液の
前に孔径０．１μｍ〜２００μｍのフィルターに通す。
これにより、固定化酵素を１年以上にわたって使用する
ことができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｌ−アスパラギン
酸の製造方法に関し、特に酵素法によるＬ−アスパラギ
ン酸の製造方法における原料液の処理方法に関する。
酸の製造方法に関し、特に酵素法によるＬ−アスパラギ
ン酸の製造方法における原料液の処理方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｌ−アスパラギン酸の製造方法として、
フマル酸とアンモニウムイオン、特にフマル酸アンモニ
ウムをＬ−アスパラギン酸に転換する酵素系、特にアス
パルターゼを用いる方法が知られている。この方法にお
いては、フマル酸とアンモニウムイオン又はフマル酸ア
ンモニウムをＬ−アスパラギン酸に転換する酵素、例え
ばアスパルターゼを固定化し、この固定化酵素を充填し
た反応器に、フマル酸とアンモニウムイオン、又はフマ
ル酸アンモニウムを含有する原料液を通液することによ
り、フマル酸とアンモニウムイオン、又はフマル酸アン
モニウムをＬ−アスパラギン酸に転換せしめ、Ｌ−アス
パラギン酸（アンモニウム塩）を含有する反応液からＬ
−アスパラギン酸を析出分離する。
フマル酸とアンモニウムイオン、特にフマル酸アンモニ
ウムをＬ−アスパラギン酸に転換する酵素系、特にアス
パルターゼを用いる方法が知られている。この方法にお
いては、フマル酸とアンモニウムイオン又はフマル酸ア
ンモニウムをＬ−アスパラギン酸に転換する酵素、例え
ばアスパルターゼを固定化し、この固定化酵素を充填し
た反応器に、フマル酸とアンモニウムイオン、又はフマ
ル酸アンモニウムを含有する原料液を通液することによ
り、フマル酸とアンモニウムイオン、又はフマル酸アン
モニウムをＬ−アスパラギン酸に転換せしめ、Ｌ−アス
パラギン酸（アンモニウム塩）を含有する反応液からＬ
−アスパラギン酸を析出分離する。
【０００３】なお、上記の方法においては、反応器から
流出した反応液には、アンモニウム塩の形でＬ−アスパ
ラギン酸が含有されており、反応液にフマル酸を添加し
て酸性化することによりＬ−アスパラギン酸を析出−分
離し、分離した後のフマル酸含有液にアンモニアを添加
して中和することにより、フマル酸アンモニウムを含有
する液を調製し、これを原料液として再循環利用する方
法が用いられる。上記のごとき方法において、工業的に
有利にＬ−アスパラギン酸を製造するには、寿命の長い
固定化酵素を使用することが重要であるが、固定化酵素
自体の寿命は長いにも拘らず、固定化酵素表面及び、反
応器内での目詰り等により、長期間にわたる高転化率で
の運転が困難となる場合がある。
流出した反応液には、アンモニウム塩の形でＬ−アスパ
ラギン酸が含有されており、反応液にフマル酸を添加し
て酸性化することによりＬ−アスパラギン酸を析出−分
離し、分離した後のフマル酸含有液にアンモニアを添加
して中和することにより、フマル酸アンモニウムを含有
する液を調製し、これを原料液として再循環利用する方
法が用いられる。上記のごとき方法において、工業的に
有利にＬ−アスパラギン酸を製造するには、寿命の長い
固定化酵素を使用することが重要であるが、固定化酵素
自体の寿命は長いにも拘らず、固定化酵素表面及び、反
応器内での目詰り等により、長期間にわたる高転化率で
の運転が困難となる場合がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、固定
化酵素表面および、反応器内における目詰り等の問題点
を解消し、Ｌ−アスパラギン酸生成反応を長期間にわた
って高転化率で維持するための原料液の処理方法を提供
しようとするものである。
化酵素表面および、反応器内における目詰り等の問題点
を解消し、Ｌ−アスパラギン酸生成反応を長期間にわた
って高転化率で維持するための原料液の処理方法を提供
しようとするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決すべく種々検討した結果、フマル酸とアンモニ
ウムイオン又はフマル酸アンモニウムを含有する原料液
を、固定化酵素に接触させる前に、所定の孔径のフィル
ターで濾過することにより解決できることを見出した。
題を解決すべく種々検討した結果、フマル酸とアンモニ
ウムイオン又はフマル酸アンモニウムを含有する原料液
を、固定化酵素に接触させる前に、所定の孔径のフィル
ターで濾過することにより解決できることを見出した。
【０００６】従って本発明は、フマル酸とアンモニウム
イオン又はフマル酸アンモニウムからＬ−アスパラギン
酸を生成することができる酵素系を含有する固定化酵素
に、フマル酸とアンモニウムイオン、又はフマル酸アン
モニウムを含有する原料液を接触させることによりＬ−
アスパラギン酸を生成せしめる工程を含むＬ−アスパラ
ギン酸の製造方法において、前記原料液を、前記固定化
酵素に接触させる前に、０．１μｍ〜２００μｍの孔径
を有するフィルターに通す工程を含むことを特徴とする
Ｌ−アスパラギン酸の製造法を提供する。好ましくは、
前記フィルターの孔径は０．３μｍ〜１００μｍであ
る。さらに好ましくは、前記フィルターの孔径は０．５
μｍ〜１０μｍである。
イオン又はフマル酸アンモニウムからＬ−アスパラギン
酸を生成することができる酵素系を含有する固定化酵素
に、フマル酸とアンモニウムイオン、又はフマル酸アン
モニウムを含有する原料液を接触させることによりＬ−
アスパラギン酸を生成せしめる工程を含むＬ−アスパラ
ギン酸の製造方法において、前記原料液を、前記固定化
酵素に接触させる前に、０．１μｍ〜２００μｍの孔径
を有するフィルターに通す工程を含むことを特徴とする
Ｌ−アスパラギン酸の製造法を提供する。好ましくは、
前記フィルターの孔径は０．３μｍ〜１００μｍであ
る。さらに好ましくは、前記フィルターの孔径は０．５
μｍ〜１０μｍである。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明の方法において用いる固定
化酵素のための酵素の由来としては、微生物が好まし
く、例えば、大腸菌、シュードモナス、シトロバクター
等が挙げられる。例えば、大腸菌（Escherichia coli)
Ｋ−１２株（ＩＦＯ３３０１）、シュードモナス・フル
オレセンス (Pseudomonas fluorescens)（ＩＦＯ３０８
１）などが挙げられるが、これらに限定されず、アスパ
ルターゼを産生することが知られている種々の微生物を
用いることができ、アスパルターゼの由来の選択は、本
発明を特徴付けるものではない。
化酵素のための酵素の由来としては、微生物が好まし
く、例えば、大腸菌、シュードモナス、シトロバクター
等が挙げられる。例えば、大腸菌（Escherichia coli)
Ｋ−１２株（ＩＦＯ３３０１）、シュードモナス・フル
オレセンス (Pseudomonas fluorescens)（ＩＦＯ３０８
１）などが挙げられるが、これらに限定されず、アスパ
ルターゼを産生することが知られている種々の微生物を
用いることができ、アスパルターゼの由来の選択は、本
発明を特徴付けるものではない。
【０００８】さらに、上記のごとく、生来的にアスパル
ターゼ生産能を有する微生物に限らず、それらの微生物
からクローニングされた、アスパルターゼをコードする
ＤＮＡを遺伝子工学的に導入した組換え微生物であって
もよい。固定化するための酵素としては、上記のごとき
微生物菌体自体でもよく、あるいはアスパルターゼを含
有する菌体を破砕したもの、菌体からの酵素抽出物、種
々の程度まで精製した粗精製酵素、または純粋な酵素で
あることができる。しかしながら、固定化酵素の製造コ
スト等の観点から、培養菌体それ自体を用いるのが好ま
しい。
ターゼ生産能を有する微生物に限らず、それらの微生物
からクローニングされた、アスパルターゼをコードする
ＤＮＡを遺伝子工学的に導入した組換え微生物であって
もよい。固定化するための酵素としては、上記のごとき
微生物菌体自体でもよく、あるいはアスパルターゼを含
有する菌体を破砕したもの、菌体からの酵素抽出物、種
々の程度まで精製した粗精製酵素、または純粋な酵素で
あることができる。しかしながら、固定化酵素の製造コ
スト等の観点から、培養菌体それ自体を用いるのが好ま
しい。
【０００９】固定化の担体としては、セルロース、アル
ギン酸、カラギーナン、マンナンゲルなどの天然系高分
子、あるいは、イオン交換樹脂やポリビニルアルコー
ル、ポリアクリルアミドなどの適当な合成高分子を常法
により用いることができる。これらの中でも、特に、球
状のスチレンジビニルベンゼン共重合体イオン交換樹脂
を担体として用い、次の一般式（Ｉ）
ギン酸、カラギーナン、マンナンゲルなどの天然系高分
子、あるいは、イオン交換樹脂やポリビニルアルコー
ル、ポリアクリルアミドなどの適当な合成高分子を常法
により用いることができる。これらの中でも、特に、球
状のスチレンジビニルベンゼン共重合体イオン交換樹脂
を担体として用い、次の一般式（Ｉ）
【００１０】
【化１】 （式中、Ｙは直接結合であるか、又は次式
【００１１】
【化２】 により表される２価基であり、Ｒ1 及びＲ2 は相互に独
立に水素原子又は有機残基であり、
立に水素原子又は有機残基であり、
【００１２】
【化３】 は陰イオンを表し、そしてｎは１００〜５０００の数で
ある）により表されるポリマーと菌体あるいは菌体処理
物を混合し球状スチレンジビニルベンゼン共重合体イオ
ン交換樹脂表面に被覆することにより前記担体に固定化
したものを用いることができる。
ある）により表されるポリマーと菌体あるいは菌体処理
物を混合し球状スチレンジビニルベンゼン共重合体イオ
ン交換樹脂表面に被覆することにより前記担体に固定化
したものを用いることができる。
【００１３】前記式（Ｉ）において、Ｒ1 又はＲ2 で表
される有機残基としては、例えば、メチル基、エチル
基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、
イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基などの炭素数１０個
以下のアルキル基が挙げられ、特にメチル基が好まし
い。さらに、ハロゲンやヒドロキシル基等の置換基を有
する有機残基を使用することができ、例えば、４−クロ
ロ−２−ジメチルペンチル基、３−エチル−２，５−ジ
クロロヘプチル基、２−ヒドロキシ−３，５−ジメチル
ノニル基など、好ましくは３−クロロ−２−ヒドロキシ
プロピル基を用いることができる。また、陰イオンとし
ては、例えば、Ｆ- ，Ｃｌ- ，Ｂｒ- ，Ｉ-等のハロゲ
ンイオンが挙げられる。
される有機残基としては、例えば、メチル基、エチル
基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、
イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基などの炭素数１０個
以下のアルキル基が挙げられ、特にメチル基が好まし
い。さらに、ハロゲンやヒドロキシル基等の置換基を有
する有機残基を使用することができ、例えば、４−クロ
ロ−２−ジメチルペンチル基、３−エチル−２，５−ジ
クロロヘプチル基、２−ヒドロキシ−３，５−ジメチル
ノニル基など、好ましくは３−クロロ−２−ヒドロキシ
プロピル基を用いることができる。また、陰イオンとし
ては、例えば、Ｆ- ，Ｃｌ- ，Ｂｒ- ，Ｉ-等のハロゲ
ンイオンが挙げられる。
【００１４】この方法で固定化して作成した固定化アス
パルターゼは圧力損失が少なく、拡散層も薄いので拡散
抵抗が小さく、高ＳＶでの反応に使用することができ
る。本発明に用いられる原料溶液は、例えばフマル酸ア
ンモニウム塩溶液、すなわちフマル酸をアンモニアによ
り中和した塩水溶液である。中和に用いるアンモニアの
使用量は特に限定されないが、基質液中のフマル酸に対
して、好ましくは１．８〜２．８倍モル、より好ましく
は２．０〜２．４倍モルの範囲である。基質液のpHは特
に限定されないが、２５℃の温度条件下で、好ましくは
６〜１１、より好ましくは７〜１０、最も好ましくは
７．５〜９．５の範囲にする。
パルターゼは圧力損失が少なく、拡散層も薄いので拡散
抵抗が小さく、高ＳＶでの反応に使用することができ
る。本発明に用いられる原料溶液は、例えばフマル酸ア
ンモニウム塩溶液、すなわちフマル酸をアンモニアによ
り中和した塩水溶液である。中和に用いるアンモニアの
使用量は特に限定されないが、基質液中のフマル酸に対
して、好ましくは１．８〜２．８倍モル、より好ましく
は２．０〜２．４倍モルの範囲である。基質液のpHは特
に限定されないが、２５℃の温度条件下で、好ましくは
６〜１１、より好ましくは７〜１０、最も好ましくは
７．５〜９．５の範囲にする。
【００１５】反応の際のフマル酸濃度は通常５〜２５重
量％の範囲が好ましいが、生産性と得られるＬ−アスパ
ラギン酸の純度、フマル酸塩の溶解度を考慮すると特に
１２〜２５重量％の範囲で反応させるのが効果的であ
る。また基質媒体にはさらに、塩化マンガン、硫酸マン
ガンなどのマンガン塩、又は塩化マグネシウム、硫酸マ
グネシウムなどのマグネシウム塩、コバルト塩などの２
価金属塩を添加することが望ましく、好ましくは０．１
〜５０mM、より好ましくは１〜１０mMの濃度で添加する
ことが望ましい。
量％の範囲が好ましいが、生産性と得られるＬ−アスパ
ラギン酸の純度、フマル酸塩の溶解度を考慮すると特に
１２〜２５重量％の範囲で反応させるのが効果的であ
る。また基質媒体にはさらに、塩化マンガン、硫酸マン
ガンなどのマンガン塩、又は塩化マグネシウム、硫酸マ
グネシウムなどのマグネシウム塩、コバルト塩などの２
価金属塩を添加することが望ましく、好ましくは０．１
〜５０mM、より好ましくは１〜１０mMの濃度で添加する
ことが望ましい。
【００１６】本発明の原料溶液は、水に新たにフマル酸
を混合したスラリーに所定のアンモニアを添加して調製
することができるが、この原料溶液は主として運転初期
において用いられる。本発明の普通の態様によれば、固
定化酵素を通過した反応液は、反応により生成したＬ−
アスパラギン酸、並びに未反応のかなりの量のアンモニ
ウムイオン及び少量の未反応のフマル酸を含有してお
り、この反応液にフマル酸を加えて酸性化することによ
りＬ−アスパラギン酸を析出せしめてこれを採取し、フ
マル酸を多量に含有する母液にアンモニアを添加するこ
とによりpHを調製し、これを原料液として再循環使用す
る。
を混合したスラリーに所定のアンモニアを添加して調製
することができるが、この原料溶液は主として運転初期
において用いられる。本発明の普通の態様によれば、固
定化酵素を通過した反応液は、反応により生成したＬ−
アスパラギン酸、並びに未反応のかなりの量のアンモニ
ウムイオン及び少量の未反応のフマル酸を含有してお
り、この反応液にフマル酸を加えて酸性化することによ
りＬ−アスパラギン酸を析出せしめてこれを採取し、フ
マル酸を多量に含有する母液にアンモニアを添加するこ
とによりpHを調製し、これを原料液として再循環使用す
る。
【００１７】本発明の特徴は、上記のごとき固定化酵素
に上記のごとき原料液を接触させるに先立って、前記原
料液を孔径０．１μｍ〜２００μｍのフィルターにより
濾過する工程を有することである。この場合、フィルタ
ーの孔径が２００μｍより大きい場合には本発明の効果
が得られず、またフィルターの孔径が０．１μｍより小
さい場合には反応系全体の圧力損失が増大し、実用的見
知から好ましくない。フィルターの孔径は好ましくは
０．３μｍ〜１００μｍであり、さらに好ましくは０．
５μｍ〜１０μｍである。このようなフィルターとして
は、材質・形状・濾過方式等は特に限定されないが、カ
ートリッジ形のものを使用することが好ましい。
に上記のごとき原料液を接触させるに先立って、前記原
料液を孔径０．１μｍ〜２００μｍのフィルターにより
濾過する工程を有することである。この場合、フィルタ
ーの孔径が２００μｍより大きい場合には本発明の効果
が得られず、またフィルターの孔径が０．１μｍより小
さい場合には反応系全体の圧力損失が増大し、実用的見
知から好ましくない。フィルターの孔径は好ましくは
０．３μｍ〜１００μｍであり、さらに好ましくは０．
５μｍ〜１０μｍである。このようなフィルターとして
は、材質・形状・濾過方式等は特に限定されないが、カ
ートリッジ形のものを使用することが好ましい。
【００１８】本発明によれば、原料溶液の再循環使用連
続反応法において、フィルターを使用しない場合には、
通液（反応）開始後、原料液を固定化酵素に注入するた
めのポンプの吐出圧力が上昇し、反応開始より３０日で
反応を中止した。この間、フマル酸からＬ−アスパラギ
ン酸への転化率はおよそ９９％に維持された。他方、孔
径４００μｍフィルターを設置して８日間反応を行った
場合、吐出圧力の上昇が見られたので、この時点で孔径
１０μｍのフィルターを設置したところ、吐出圧力の上
昇は一旦停止したがその後徐々に上昇し、反応開始より
７３日で運転を停止した。この場合の、転化率は反応初
期は９９％であったが、反応開始より７３日目には９
４．７％まで低下した。従って、孔径４００μｍのフィ
ルターを使用したのでは、本発明の効果は得られなかっ
た。
続反応法において、フィルターを使用しない場合には、
通液（反応）開始後、原料液を固定化酵素に注入するた
めのポンプの吐出圧力が上昇し、反応開始より３０日で
反応を中止した。この間、フマル酸からＬ−アスパラギ
ン酸への転化率はおよそ９９％に維持された。他方、孔
径４００μｍフィルターを設置して８日間反応を行った
場合、吐出圧力の上昇が見られたので、この時点で孔径
１０μｍのフィルターを設置したところ、吐出圧力の上
昇は一旦停止したがその後徐々に上昇し、反応開始より
７３日で運転を停止した。この場合の、転化率は反応初
期は９９％であったが、反応開始より７３日目には９
４．７％まで低下した。従って、孔径４００μｍのフィ
ルターを使用したのでは、本発明の効果は得られなかっ
た。
【００１９】これに対して、孔径１０μｍのフィルター
を反応の最初から使用したところ、吐出圧力はほとんど
上昇せず、３８６日後までにわずかに上昇したのみであ
る。しかしながら、転化率は９６％に低下したので反応
を停止した。他方、孔径０．５μｍのフィルターを反応
の最初から使用した場合、３８６日後にもポンプの吐出
圧力はほとんど上昇せず、また転化率は９９％に維持さ
れた。従って、この条件下では３８６日間を超えて、さ
らに長期の転化率９８％以上での反応の継続が可能であ
ることが明らかである。
を反応の最初から使用したところ、吐出圧力はほとんど
上昇せず、３８６日後までにわずかに上昇したのみであ
る。しかしながら、転化率は９６％に低下したので反応
を停止した。他方、孔径０．５μｍのフィルターを反応
の最初から使用した場合、３８６日後にもポンプの吐出
圧力はほとんど上昇せず、また転化率は９９％に維持さ
れた。従って、この条件下では３８６日間を超えて、さ
らに長期の転化率９８％以上での反応の継続が可能であ
ることが明らかである。
【００２０】以上の通り、本発明によれば、原料溶液
を、固定化酵素に接触させる前に所定の孔径を有するフ
ィルターにより濾過することにより、反応継続時間（運
転継続時間）が劇的に延長される。この原理は必ずしも
明らかではないが、フィルターの有無及びフィルターの
孔径がポンプの吐出圧力上昇および反応の転化率に影響
することから、例えばフマル酸とアンモニウムイオンと
からＬ−アスパラギン酸の生成の反応の間の原料液中に
微粒子が存在または発生し、所定のフィルターが存在し
ない場合はこの微粒子が固定化酵素表面および反応器内
に目詰りを生じさせポンプ吐出圧の上昇および転化率の
低下を招くのではないかと推定される。
を、固定化酵素に接触させる前に所定の孔径を有するフ
ィルターにより濾過することにより、反応継続時間（運
転継続時間）が劇的に延長される。この原理は必ずしも
明らかではないが、フィルターの有無及びフィルターの
孔径がポンプの吐出圧力上昇および反応の転化率に影響
することから、例えばフマル酸とアンモニウムイオンと
からＬ−アスパラギン酸の生成の反応の間の原料液中に
微粒子が存在または発生し、所定のフィルターが存在し
ない場合はこの微粒子が固定化酵素表面および反応器内
に目詰りを生じさせポンプ吐出圧の上昇および転化率の
低下を招くのではないかと推定される。
【００２１】フィルターの設置場所は、原料液槽と反応
器との間であればどこに設置してもかまわないが、ポン
プの長期安定運転を考慮して、ポンプ出口側に設置する
のが好ましい。また、上記の結果から、フィルターの孔
径が２００μｍ以下であれば、本発明の効果は得られる
と推定される。さらに、フィルターの孔径が１００μｍ
以下であれば、本発明の効果は一層発揮され、１０μｍ
以下が最も好ましいと推定される。そして、フィルター
の孔径が小さいことによる装置コストの上昇を考慮すれ
ばフィルターの孔径は０．５μｍ〜１０μｍが最適であ
ると考えられる。
器との間であればどこに設置してもかまわないが、ポン
プの長期安定運転を考慮して、ポンプ出口側に設置する
のが好ましい。また、上記の結果から、フィルターの孔
径が２００μｍ以下であれば、本発明の効果は得られる
と推定される。さらに、フィルターの孔径が１００μｍ
以下であれば、本発明の効果は一層発揮され、１０μｍ
以下が最も好ましいと推定される。そして、フィルター
の孔径が小さいことによる装置コストの上昇を考慮すれ
ばフィルターの孔径は０．５μｍ〜１０μｍが最適であ
ると考えられる。
【００２２】
【実施例】次に、実施例により、本発明をさらに具体的
に説明する。参考例１ ．固定化酵素の調製 大腸菌（E. coli ) ＩＦＯ３３０１由来の、アスパルタ
ーゼをコードするＤＮＡにより形質転換した大腸菌株Ｐ
Ｕasp Ｅ２（この作製方法については、特願平１０−２
７８５７１参照のこと）を、ＬＢ培地（ポリペプトン１
０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、蒸留水１
Ｌ、１２１℃にて１５分間オートクレーブ殺菌）にアン
ピシリン１００ppm を含む培地３mlを入れた試験管１０
本に接種して３７℃で８時間培養後、同組成の培地にＩ
ＰＴＧを１mMを添加した培地１００mlを入れた坂口フラ
スコ１０本にそれぞれ１本ずつ接種し、３０℃で一夜振
盪培養した。この培養液から、菌体を遠心分離によって
回収した。この菌体のアスパルターゼ活性を測定したと
ころ１．０５moles Ｌ−アスパラギン酸生成／hr／ｇ菌
体であった。
に説明する。参考例１ ．固定化酵素の調製 大腸菌（E. coli ) ＩＦＯ３３０１由来の、アスパルタ
ーゼをコードするＤＮＡにより形質転換した大腸菌株Ｐ
Ｕasp Ｅ２（この作製方法については、特願平１０−２
７８５７１参照のこと）を、ＬＢ培地（ポリペプトン１
０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、蒸留水１
Ｌ、１２１℃にて１５分間オートクレーブ殺菌）にアン
ピシリン１００ppm を含む培地３mlを入れた試験管１０
本に接種して３７℃で８時間培養後、同組成の培地にＩ
ＰＴＧを１mMを添加した培地１００mlを入れた坂口フラ
スコ１０本にそれぞれ１本ずつ接種し、３０℃で一夜振
盪培養した。この培養液から、菌体を遠心分離によって
回収した。この菌体のアスパルターゼ活性を測定したと
ころ１．０５moles Ｌ−アスパラギン酸生成／hr／ｇ菌
体であった。
【００２３】ＰＡＳ−８８０（日東紡績製）をアルカリ
でpH７．０付近にしたもの７０ｇ及び脱イオン水２３０
ｇをよく混合し、先に回収した菌体を均一に分散させ
た。６Ｌのナス型フラスコにイオン交換樹脂（アンバー
ライトＩＲＡ−９４ＳＣ１型オルガノ社製、平均粒径
０．５mm）３００mlと０．５インチのテフロン（登録商
標）球２００個を入れ、ここに先に得た菌体分散液の１
／６を入れ、３０℃で回転させながらエバポレーターで
１時間乾燥し、菌体をイオン交換樹脂に被覆させた。こ
の操作を６回行った後、テフロン球を除去してビーズ状
の固定化アスパルターゼを得た。この固定化アスパルタ
ーゼの活性は３５００Ｕであった。（１Ｕ＝１μmoles
Ｌ−アスパラギン酸生成／min ／ml固定化酵素）
でpH７．０付近にしたもの７０ｇ及び脱イオン水２３０
ｇをよく混合し、先に回収した菌体を均一に分散させ
た。６Ｌのナス型フラスコにイオン交換樹脂（アンバー
ライトＩＲＡ−９４ＳＣ１型オルガノ社製、平均粒径
０．５mm）３００mlと０．５インチのテフロン（登録商
標）球２００個を入れ、ここに先に得た菌体分散液の１
／６を入れ、３０℃で回転させながらエバポレーターで
１時間乾燥し、菌体をイオン交換樹脂に被覆させた。こ
の操作を６回行った後、テフロン球を除去してビーズ状
の固定化アスパルターゼを得た。この固定化アスパルタ
ーゼの活性は３５００Ｕであった。（１Ｕ＝１μmoles
Ｌ−アスパラギン酸生成／min ／ml固定化酵素）
【００２４】実施例１．参考例１に記載したのと同様に
して調製した固定化酵素５００mLを、内径２８．２mmの
カラムに充填して密封系とし、１８重量％のフマル酸ア
ンモニウムを含有する水溶液（pH８．６）をポンプによ
り５Ｌ／時（ＳＶ１０）の速度で固定化酵素を充填した
カラムに圧送した。実験目的に応じてポンプとカラムと
の間にフィルターを設置し、又は設置しなかった。カラ
ム入口の温度は２０℃とした。
して調製した固定化酵素５００mLを、内径２８．２mmの
カラムに充填して密封系とし、１８重量％のフマル酸ア
ンモニウムを含有する水溶液（pH８．６）をポンプによ
り５Ｌ／時（ＳＶ１０）の速度で固定化酵素を充填した
カラムに圧送した。実験目的に応じてポンプとカラムと
の間にフィルターを設置し、又は設置しなかった。カラ
ム入口の温度は２０℃とした。
【００２５】実験１ フィルターを設置しなかった。実験２ 通液当初４００μｍのフィルターを使用し、通液開始よ
り８日目に孔径１０μｍのフィルターを設置した。実験３ 通液当初から孔径１０μｍのフィルターを設置した。実験４ 通液当初から孔径０．５μｍのフィルターを設置した。
結果は、次の表１に示す通りであった。
り８日目に孔径１０μｍのフィルターを設置した。実験３ 通液当初から孔径１０μｍのフィルターを設置した。実験４ 通液当初から孔径０．５μｍのフィルターを設置した。
結果は、次の表１に示す通りであった。
【００２６】
【表１】
【００２７】以上の通り、孔径１０μｍ又は０．５μｍ
のフィルターを通液開始当初から使用した場合、充填し
た固定化酵素を非常に長期間にわたり使用することがで
きた。
のフィルターを通液開始当初から使用した場合、充填し
た固定化酵素を非常に長期間にわたり使用することがで
きた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 安田 信三 茨城県つくば市観音台１丁目25番地12 株 式会社日本触媒内 Ｆターム(参考） 4B033 NA22 NB38 NC04 ND02 4B064 AE17 CA21 CA32 CC03 CC04 CD01 CD07 DA16
Claims (1)
- 【請求項１】 フマル酸とアンモニウムイオン又はフマ
ル酸アンモニウムからＬ−アスパラギン酸を生成するこ
とができる酵素系を含有する固定化酵素に、フマル酸と
アンモニウムイオン、又はフマル酸アンモニウムを含有
する原料液を接触させることによりＬ−アスパラギン酸
を生成せしめる工程を含むＬ−アスパラギン酸の製造方
法において、前記原料液を、前記固定化酵素に接触させ
る前に、０．１μｍ〜２００μｍの孔径を有するフィル
ターに通す工程を含むことを特徴とするＬ−アスパラギ
ン酸の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000289354A JP4148640B2 (ja) | 2000-09-22 | 2000-09-22 | アスパラギン酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000289354A JP4148640B2 (ja) | 2000-09-22 | 2000-09-22 | アスパラギン酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002095490A true JP2002095490A (ja) | 2002-04-02 |
| JP4148640B2 JP4148640B2 (ja) | 2008-09-10 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000289354A Expired - Fee Related JP4148640B2 (ja) | 2000-09-22 | 2000-09-22 | アスパラギン酸の製造法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4148640B2 (ja) |
-
2000
- 2000-09-22 JP JP2000289354A patent/JP4148640B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4148640B2 (ja) | 2008-09-10 |
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| JPS6225353B2 (ja) | ||
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