JP4148640B2

JP4148640B2 - アスパラギン酸の製造法

Info

Publication number: JP4148640B2
Application number: JP2000289354A
Authority: JP
Inventors: 文興下山; 彰川上; 信三安田
Original assignee: Nippon Shokubai Co Ltd
Current assignee: Nippon Shokubai Co Ltd
Priority date: 2000-09-22
Filing date: 2000-09-22
Publication date: 2008-09-10
Anticipated expiration: 2020-09-22
Also published as: JP2002095490A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−アスパラギン酸の製造方法に関し、特に酵素法によるＬ−アスパラギン酸の製造方法における原料液の処理方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−アスパラギン酸の製造方法として、フマル酸とアンモニウムイオン、特にフマル酸アンモニウムをＬ−アスパラギン酸に転換する酵素系、特にアスパルターゼを用いる方法が知られている。この方法においては、フマル酸とアンモニウムイオン又はフマル酸アンモニウムをＬ−アスパラギン酸に転換する酵素、例えばアスパルターゼを固定化し、この固定化酵素を充填した反応器に、フマル酸とアンモニウムイオン、又はフマル酸アンモニウムを含有する原料液を通液することにより、フマル酸とアンモニウムイオン、又はフマル酸アンモニウムをＬ−アスパラギン酸に転換せしめ、Ｌ−アスパラギン酸（アンモニウム塩）を含有する反応液からＬ−アスパラギン酸を析出分離する。
【０００３】
なお、上記の方法においては、反応器から流出した反応液には、アンモニウム塩の形でＬ−アスパラギン酸が含有されており、反応液にフマル酸を添加して酸性化することによりＬ−アスパラギン酸を析出−分離し、分離した後のフマル酸含有液にアンモニアを添加して中和することにより、フマル酸アンモニウムを含有する液を調製し、これを原料液として再循環利用する方法が用いられる。
上記のごとき方法において、工業的に有利にＬ−アスパラギン酸を製造するには、寿命の長い固定化酵素を使用することが重要であるが、固定化酵素自体の寿命は長いにも拘らず、固定化酵素表面及び、反応器内での目詰り等により、長期間にわたる高転化率での運転が困難となる場合がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、固定化酵素表面および、反応器内における目詰り等の問題点を解消し、Ｌ−アスパラギン酸生成反応を長期間にわたって高転化率で維持するための原料液の処理方法を提供しようとするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、フマル酸とアンモニウムイオン又はフマル酸アンモニウムを含有する原料液を、固定化酵素に接触させる前に、所定の孔径のフィルターで濾過することにより解決できることを見出した。
【０００６】
従って本発明は、フマル酸とアンモニウムイオン又はフマル酸アンモニウムからＬ−アスパラギン酸を生成することができる酵素系を含有する固定化酵素に、フマル酸とアンモニウムイオン、又はフマル酸アンモニウムを含有する原料液を接触させることによりＬ−アスパラギン酸を生成せしめる工程を含むＬ−アスパラギン酸の製造方法において、前記原料液を、前記固定化酵素に接触させる前に、０．１μｍ〜２００μｍの孔径を有するフィルターに通す工程を含むことを特徴とするＬ−アスパラギン酸の製造法を提供する。
好ましくは、前記フィルターの孔径は０．３μｍ〜１００μｍである。
さらに好ましくは、前記フィルターの孔径は０．５μｍ〜１０μｍである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の方法において用いる固定化酵素のための酵素の由来としては、微生物が好ましく、例えば、大腸菌、シュードモナス、シトロバクター等が挙げられる。例えば、大腸菌（Escherichia coli) Ｋ−１２株（ＩＦＯ３３０１）、シュードモナス・フルオレセンス (Pseudomonas fluorescens)（ＩＦＯ３０８１）などが挙げられるが、これらに限定されず、アスパルターゼを産生することが知られている種々の微生物を用いることができ、アスパルターゼの由来の選択は、本発明を特徴付けるものではない。
【０００８】
さらに、上記のごとく、生来的にアスパルターゼ生産能を有する微生物に限らず、それらの微生物からクローニングされた、アスパルターゼをコードするＤＮＡを遺伝子工学的に導入した組換え微生物であってもよい。固定化するための酵素としては、上記のごとき微生物菌体自体でもよく、あるいはアスパルターゼを含有する菌体を破砕したもの、菌体からの酵素抽出物、種々の程度まで精製した粗精製酵素、または純粋な酵素であることができる。しかしながら、固定化酵素の製造コスト等の観点から、培養菌体それ自体を用いるのが好ましい。
【０００９】
固定化の担体としては、セルロース、アルギン酸、カラギーナン、マンナンゲルなどの天然系高分子、あるいは、イオン交換樹脂やポリビニルアルコール、ポリアクリルアミドなどの適当な合成高分子を常法により用いることができる。これらの中でも、特に、球状のスチレンジビニルベンゼン共重合体イオン交換樹脂を担体として用い、次の一般式（Ｉ）
【００１０】
【化１】

（式中、Ｙは直接結合であるか、又は次式
【００１１】
【化２】

により表される２価基であり、Ｒ₁及びＲ₂は相互に独立に水素原子又は有機残基であり、
【００１２】
【化３】

は陰イオンを表し、そしてｎは１００〜５０００の数である）
により表されるポリマーと菌体あるいは菌体処理物を混合し球状スチレンジビニルベンゼン共重合体イオン交換樹脂表面に被覆することにより前記担体に固定化したものを用いることができる。
【００１３】
前記式（Ｉ）において、Ｒ₁又はＲ₂で表される有機残基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基などの炭素数１０個以下のアルキル基が挙げられ、特にメチル基が好ましい。さらに、ハロゲンやヒドロキシル基等の置換基を有する有機残基を使用することができ、例えば、４−クロロ−２−ジメチルペンチル基、３−エチル−２，５−ジクロロヘプチル基、２−ヒドロキシ−３，５−ジメチルノニル基など、好ましくは３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル基を用いることができる。また、陰イオンとしては、例えば、Ｆ^-，Ｃｌ^-，Ｂｒ^-，Ｉ^-等のハロゲンイオンが挙げられる。
【００１４】
この方法で固定化して作成した固定化アスパルターゼは圧力損失が少なく、拡散層も薄いので拡散抵抗が小さく、高ＳＶでの反応に使用することができる。
本発明に用いられる原料溶液は、例えばフマル酸アンモニウム塩溶液、すなわちフマル酸をアンモニアにより中和した塩水溶液である。中和に用いるアンモニアの使用量は特に限定されないが、基質液中のフマル酸に対して、好ましくは１．８〜２．８倍モル、より好ましくは２．０〜２．４倍モルの範囲である。基質液のpHは特に限定されないが、２５℃の温度条件下で、好ましくは６〜１１、より好ましくは７〜１０、最も好ましくは７．５〜９．５の範囲にする。
【００１５】
反応の際のフマル酸濃度は通常５〜２５重量％の範囲が好ましいが、生産性と得られるＬ−アスパラギン酸の純度、フマル酸塩の溶解度を考慮すると特に１２〜２５重量％の範囲で反応させるのが効果的である。
また基質媒体にはさらに、塩化マンガン、硫酸マンガンなどのマンガン塩、又は塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムなどのマグネシウム塩、コバルト塩などの２価金属塩を添加することが望ましく、好ましくは０．１〜５０mM、より好ましくは１〜１０mMの濃度で添加することが望ましい。
【００１６】
本発明の原料溶液は、水に新たにフマル酸を混合したスラリーに所定のアンモニアを添加して調製することができるが、この原料溶液は主として運転初期において用いられる。本発明の普通の態様によれば、固定化酵素を通過した反応液は、反応により生成したＬ−アスパラギン酸、並びに未反応のかなりの量のアンモニウムイオン及び少量の未反応のフマル酸を含有しており、この反応液にフマル酸を加えて酸性化することによりＬ−アスパラギン酸を析出せしめてこれを採取し、フマル酸を多量に含有する母液にアンモニアを添加することによりpHを調製し、これを原料液として再循環使用する。
【００１７】
本発明の特徴は、上記のごとき固定化酵素に上記のごとき原料液を接触させるに先立って、前記原料液を孔径０．１μｍ〜２００μｍのフィルターにより濾過する工程を有することである。この場合、フィルターの孔径が２００μｍより大きい場合には本発明の効果が得られず、またフィルターの孔径が０．１μｍより小さい場合には反応系全体の圧力損失が増大し、実用的見知から好ましくない。フィルターの孔径は好ましくは０．３μｍ〜１００μｍであり、さらに好ましくは０．５μｍ〜１０μｍである。このようなフィルターとしては、材質・形状・濾過方式等は特に限定されないが、カートリッジ形のものを使用することが好ましい。
【００１８】
本発明によれば、原料溶液の再循環使用連続反応法において、フィルターを使用しない場合には、通液（反応）開始後、原料液を固定化酵素に注入するためのポンプの吐出圧力が上昇し、反応開始より３０日で反応を中止した。この間、フマル酸からＬ−アスパラギン酸への転化率はおよそ９９％に維持された。他方、孔径４００μｍフィルターを設置して８日間反応を行った場合、吐出圧力の上昇が見られたので、この時点で孔径１０μｍのフィルターを設置したところ、吐出圧力の上昇は一旦停止したがその後徐々に上昇し、反応開始より７３日で運転を停止した。この場合の、転化率は反応初期は９９％であったが、反応開始より７３日目には９４．７％まで低下した。従って、孔径４００μｍのフィルターを使用したのでは、本発明の効果は得られなかった。
【００１９】
これに対して、孔径１０μｍのフィルターを反応の最初から使用したところ、吐出圧力はほとんど上昇せず、３８６日後までにわずかに上昇したのみである。しかしながら、転化率は９６％に低下したので反応を停止した。他方、孔径０．５μｍのフィルターを反応の最初から使用した場合、３８６日後にもポンプの吐出圧力はほとんど上昇せず、また転化率は９９％に維持された。従って、この条件下では３８６日間を超えて、さらに長期の転化率９８％以上での反応の継続が可能であることが明らかである。
【００２０】
以上の通り、本発明によれば、原料溶液を、固定化酵素に接触させる前に所定の孔径を有するフィルターにより濾過することにより、反応継続時間（運転継続時間）が劇的に延長される。この原理は必ずしも明らかではないが、フィルターの有無及びフィルターの孔径がポンプの吐出圧力上昇および反応の転化率に影響することから、例えばフマル酸とアンモニウムイオンとからＬ−アスパラギン酸の生成の反応の間の原料液中に微粒子が存在または発生し、所定のフィルターが存在しない場合はこの微粒子が固定化酵素表面および反応器内に目詰りを生じさせポンプ吐出圧の上昇および転化率の低下を招くのではないかと推定される。
【００２１】
フィルターの設置場所は、原料液槽と反応器との間であればどこに設置してもかまわないが、ポンプの長期安定運転を考慮して、ポンプ出口側に設置するのが好ましい。
また、上記の結果から、フィルターの孔径が２００μｍ以下であれば、本発明の効果は得られると推定される。さらに、フィルターの孔径が１００μｍ以下であれば、本発明の効果は一層発揮され、１０μｍ以下が最も好ましいと推定される。そして、フィルターの孔径が小さいことによる装置コストの上昇を考慮すればフィルターの孔径は０．５μｍ〜１０μｍが最適であると考えられる。
【００２２】
【実施例】
次に、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。
参考例１．固定化酵素の調製
大腸菌（E. coli ) ＩＦＯ３３０１由来の、アスパルターゼをコードするＤＮＡにより形質転換した大腸菌株ＰＵ_aspＥ２（この作製方法については、特願平１０−２７８５７１参照のこと）を、ＬＢ培地（ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ、蒸留水１Ｌ、１２１℃にて１５分間オートクレーブ殺菌）にアンピシリン１００ppm を含む培地３mlを入れた試験管１０本に接種して３７℃で８時間培養後、同組成の培地にＩＰＴＧを１mMを添加した培地１００mlを入れた坂口フラスコ１０本にそれぞれ１本ずつ接種し、３０℃で一夜振盪培養した。この培養液から、菌体を遠心分離によって回収した。この菌体のアスパルターゼ活性を測定したところ１．０５moles Ｌ−アスパラギン酸生成／hr／ｇ菌体であった。
【００２３】
ＰＡＳ−８８０（日東紡績製）をアルカリでpH７．０付近にしたもの７０ｇ及び脱イオン水２３０ｇをよく混合し、先に回収した菌体を均一に分散させた。６Ｌのナス型フラスコにイオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ−９４ＳＣ１型オルガノ社製、平均粒径０．５mm）３００mlと０．５インチのテフロン球２００個を入れ、ここに先に得た菌体分散液の１／６を入れ、３０℃で回転させながらエバポレーターで１時間乾燥し、菌体をイオン交換樹脂に被覆させた。この操作を６回行った後、テフロン球を除去してビーズ状の固定化アスパルターゼを得た。この固定化アスパルターゼの活性は３５００Ｕであった。（１Ｕ＝１μmoles Ｌ−アスパラギン酸生成／min ／ml固定化酵素）
【００２４】
実施例１．
参考例１に記載したのと同様にして調製した固定化酵素５００mLを、内径２８．２mmのカラムに充填して密封系とし、１８重量％のフマル酸アンモニウムを含有する水溶液（pH８．６）をポンプにより５Ｌ／時（ＳＶ１０）の速度で固定化酵素を充填したカラムに圧送した。実験目的に応じてポンプとカラムとの間にフィルターを設置し、又は設置しなかった。カラム入口の温度は２０℃とした。
【００２５】
実験１
フィルターを設置しなかった。
実験２
通液当初４００μｍのフィルターを使用し、通液開始より８日目に孔径１０μｍのフィルターを設置した。
実験３
通液当初から孔径１０μｍのフィルターを設置した。
実験４
通液当初から孔径０．５μｍのフィルターを設置した。
結果は、次の表１に示す通りであった。
【００２６】
【表１】

【００２７】
以上の通り、孔径１０μｍ又は０．５μｍのフィルターを通液開始当初から使用した場合、充填した固定化酵素を非常に長期間にわたり使用することができた。

Claims

フマル酸とアンモニウムイオン又はフマル酸アンモニウムからＬ−アスパラギン酸を生成することができる酵素系を含有する固定化酵素を充填した反応器に、フマル酸とアンモニウムイオン、又はフマル酸アンモニウムを含有する原料液を通過させることによりＬ−アスパラギン酸を生成せしめる工程を含むＬ−アスパラギン酸の製造方法において、前記原料液を、前記固体触媒に接触させる前に、0.1μｍ〜200μｍの孔径を有するフィルターに通すことにより微粒子を除去して前記反応容器の目詰まりを防止することを特徴とするＬ−アスパラギン酸の製造方法。