JP2002095489A

JP2002095489A - Ｌ−アスパラギン酸の製造方法

Info

Publication number: JP2002095489A
Application number: JP2000287565A
Authority: JP
Inventors: Akira Kawakami; 彰川上; Fumioki Shimoyama; 文興下山; Masaharu Mukoyama; 正治向山; Shinzo Yasuda; 信三安田
Original assignee: Nippon Shokubai Co Ltd
Current assignee: Nippon Shokubai Co Ltd
Priority date: 2000-09-21
Filing date: 2000-09-21
Publication date: 2002-04-02

Abstract

(57)【要約】【課題】原料液を固定化酵素に接触させることによっ
てＬ−アスパラギン酸を製造する方法において、原料液
のpHの許容範囲を拡大する方法の提供。【解決手段】固定化酵素を充填した反応器に原料液を
接触させることによりＬ−アスパラギン酸を生成せしめ
る工程を含むＬ−アスパラギン酸の製造方法において、
原料からＬ−アスパラギン酸への９８％の転化率を得る
のに必要な固定化酵素の最少量（最少固定化酵素量）に
比べて１．１倍以上の量の固定化酵素を使用することを
特徴とするＬ−アスパラギン酸の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｌ−アスパラギン
酸の改良された製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ−アスパラギン酸の製造方法として、
酵素的方法、例えばフマル酸又はマレイン酸とアンモニ
ウムイオンとから、酵素反応によりＬ−アスパラギン酸
を生成せしめる方法が知られている。

【０００３】Ｌ−アスパラギン酸の酵素的製造方法の典
型的な例として、フマル酸とアンモニウムイオン、特に
フマル酸アンモニウムをＬ−アスパラギン酸に転換する
酵素系、特にアスパルターゼを用いる方法が知られてい
る。この方法においては、フマル酸とアンモニウムイオ
ン又はフマル酸アンモニウムをＬ−アスパラギン酸に転
換する酵素、例えばアスパルターゼを固定化し、この固
定化酵素を充填した反応器に、フマル酸とアンモニウム
イオン、又はフマル酸アンモニウムを含有する原料液を
通液することにより、フマル酸とアンモニウムイオン、
又はフマル酸アンモニウムをＬ−アスパラギン酸に転換
せしめ、Ｌ−アスパラギン酸（アンモニウム塩）を含有
する反応液からＬ−アスパラギン酸を析出分離する。

【０００４】なお、上記の方法においては、反応器から
流出した反応液には、アンモニウム塩の形でＬ−アスパ
ラギン酸が含有されており、反応液にフマル酸を添加し
て酸性化することによりＬ−アスパラギン酸を析出−分
離し、分離した後のフマル酸含有液にアンモニアを添加
して中和することにより、フマル酸アンモニウムを含有
する液を調製し、これを原料液として再循環利用する方
法が用いられる。

【０００５】上記の方法において、フマル酸等の原料を
Ｌ−アスパラギン酸に転換する酵素の活性はpH値により
非常に影響を受ける。例えば、Journol of Solid-Phase
Biochemistry, Vol.3, No.4 (1978) （文献１）によれ
ば、大腸菌のアスパルターゼを固定化して用いて、フマ
ル酸をＬ−アスパラギン酸に転換する酵素反応の活性は
pH８．６附近において最高であり、このpH値からわずか
に塩基性側又は酸性側にシフトすることにより、活性は
急激に低下する（２５８頁Ｆｉｇ．８を参照のこと）。

【０００６】従って、このような状況下で、工業的に有
利にＬ−アスパラギン酸を製造するには、原料溶液のpH
を精密に制御する必要があり、そのために高価な設備を
必要とする。他方、原料液のpHコントロールが不十分な
場合、原料であるフマル酸からＬ−アスパラギン酸への
転化率が低下し、製造コストが上昇することになる。従
って、原料溶液の許容されるpH範囲を広くすることが望
まれる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、原料
液を固定化酵素に接触させることにより原料をＬ−アス
パラギン酸に転換する工程を含むＬ−アスパラギン酸の
製造方法において、原料液の許容されるpH範囲を拡大す
ることにより、原料液の精密なpHコントロールを必要と
しないでＬ−アスパラギン酸を製造することができる方
法を提供しようとするものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の課題
を解決すべく種々検討した結果、原料をほぼ完全にＬ−
アスパラギン酸に転化するために必要な最少の固定化酵
素量に比べて多くの固定化酵素を使用することにより、
原料液の許容されるpH域を大巾に拡大することができる
ことを見出し、本発明を完成した。

【０００９】従って、本発明は、固定化酵素に原料液を
接触させることによりＬ−アスパラギン酸を生成せしめ
る工程を含むＬ−アスパラギン酸の製造方法において、
原料からＬ−アスパラギン酸への９８％の転化率を得る
のに必要な固定化酵素の最少量（最少固定化酵素量）に
比べて１．１倍以上の量の固定化酵素を使用することを
特徴とする方法を提供する。

【００１０】前記のＬ−アスパラギン酸の製造方法は、
典型的にはフマル酸とアンモニウムイオン又はフマル酸
アンモニウムをＬ−アスパラギン酸に変換することがで
きる酵素系を含有する固定化酵素に、フマル酸とアンモ
ニウムイオン又はフマル酸アンモニウムを含有する原料
液を接触させることによりＬ−アスパラギン酸を生成せ
しめる工程を含む方法である。好ましくは、最少固定化
酵素量に比べて１．１倍以上１０倍以下の量の固定化酵
素を使用する。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明の方法において用いる固定
化酵素のための酵素の由来としては、微生物が好まし
く、例えば、大腸菌、シュードモナス、シトロバクター
等が挙げられる。例えば、大腸菌（Escherichia coli)
Ｋ−１２株（ＩＦＯ３３０１）、シュードモナス・フル
オレセンス (Pseudomonas fluorescens)（ＩＦＯ３０８
１）などが挙げられるが、これらに限定されず、アスパ
ルターゼを産生することが知られている種々の微生物を
用いることができ、アスパルターゼの由来の選択は、本
発明を特徴付けるものではない。

【００１２】さらに、上記のごとく、生来的にアスパル
ターゼ生産能を有する微生物に限らず、それらの微生物
からクローニングされた、アスパルターゼをコードする
ＤＮＡを遺伝子工学的に導入した組換え微生物であって
もよい。固定化するための酵素としては、上記のごとき
微生物菌体自体でもよく、あるいはアスパルターゼを含
有する菌体を破砕したもの、菌体からの酵素抽出物、種
々の程度まで精製した粗精製酵素、または純粋な酵素で
あることができる。しかしながら、固定化酵素の製造コ
スト等の観点から、培養菌体それ自体を用いるのが好ま
しい。

【００１３】固定化の担体としては、セルロース、アル
ギン酸、カラギーナン、マンナンゲルなどの天然系高分
子、あるいは、イオン交換樹脂やポリビニルアルコー
ル、ポリアクリルアミドなどの適当な合成高分子を常法
により用いることができる。これらの中でも、特に、球
状のスチレンジビニルベンゼン共重合体イオン交換樹脂
を担体として用い、次の一般式（Ｉ）

【００１４】

【化１】

【００１５】（式中、Ｙは直接結合であるか、又は次式

【化２】

【００１６】により表される２価基であり、Ｒ₁及びＲ
₂は相互に独立に水素原子又は有機残基であり、

【化３】は陰イオンを表し、そしてｎは１００〜５０００の数で
ある）により表されるポリマーと菌体あるいは菌体処理
物を混合し球状スチレンジビニルベンゼン共重合体イオ
ン交換樹脂表面に被覆することにより前記担体に固定化
したものを用いることができる。

【００１７】前記式（Ｉ）において、Ｒ₁又はＲ₂で表
される有機残基としては、例えば、メチル基、エチル
基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、
イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基などの炭素数１０個
以下のアルキル基が挙げられ、特にメチル基が好まし
い。さらに、ハロゲンやヒドロキシル基等の置換基を有
する有機残基を使用することができ、例えば、４−クロ
ロ−２−ジメチルペンチル基、３−エチル−２，５−ジ
クロロヘプチル基、２−ヒドロキシ−３，５−ジメチル
ノニル基など、好ましくは３−クロロ−２−ヒドロキシ
プロピル基を用いることができる。また、陰イオンとし
ては、例えば、Ｆ^-，Ｃｌ^-，Ｂｒ^-，Ｉ^-等のハロゲ
ンイオンが挙げられる。

【００１８】この方法で固定化して作成した固定化アス
パルターゼは圧力損失が少なく、拡散層も薄いので拡散
抵抗が小さく、高ＳＶでの反応に使用することができ
る。本発明に用いられる原料溶液は、例えばフマル酸ア
ンモニウム塩溶液、すなわちフマル酸をアンモニアによ
り中和した塩水溶液である。中和に用いるアンモニアの
使用量は特に限定されないが、基質液中のフマル酸に対
して、好ましくは１．８〜２．８倍モル、より好ましく
は２．０〜２．４倍モルの範囲である。基質液のpHは特
に限定されないが、２５℃の温度条件下で、好ましくは
６〜１１、より好ましくは７〜１０、最も好ましくは
７．５〜９．５の範囲にする。

【００１９】反応の際のフマル酸濃度は通常５〜２５重
量％の範囲が好ましいが、生産性と得られるＬ−アスパ
ラギン酸の純度、フマル酸塩の溶解度を考慮すると特に
１２〜２５重量％の範囲で反応させるのが効果的であ
る。また基質媒体にはさらに、塩化マンガン、硫酸マン
ガンなどのマンガン塩、又は塩化マグネシウム、硫酸マ
グネシウムなどのマグネシウム塩、コバルト塩などの２
価金属塩を添加することが望ましく、好ましくは０．１
〜５０mM、より好ましくは１〜１０mMの濃度で添加する
ことが望ましい。

【００２０】本発明の原料液は、水に新たにフマル酸を
混合したスラリーに所定のアンモニアを添加して調製す
ることができるが、この原料溶液は主として運転初期に
おいて用いられる。本発明の普通の態様によれば、固定
化酵素を通過した反応液は、反応により生成したＬ−ア
スパラギン酸、並びに未反応のかなりの量のアンモニウ
ムイオン及び少量の未反応のフマル酸を含有しており、
この反応液にフマル酸を加えて酸性化することによりＬ
−アスパラギン酸を析出せしめてこれを採取し、フマル
酸を多量に含有する母液にアンモニアを添加することに
よりpHを調製し、これを原料液として再循環使用する。

【００２１】本発明は、固定化酵素に原料液を接触させ
ることによりＬ−アスパラギン酸を生成せしめる工程を
含むＬ−アスパラギン酸の製造方法において、原料例え
ばフマル酸からＬ−アスパラギン酸への９８％の転化率
を得るのに必要な固定化酵素の最少量（最少固定化酵素
量）に比べて１．１倍以上の量の固定化酵素を用いるこ
とを特徴としている。

【００２２】最少固定化酵素量は次のようにして得るこ
とができる。まず、固定化酵素の至適pHを決定する。こ
のためには、いかなるpHにおいても９８％の転化率が達
成されないような少量の固定化酵素を用い、それに、一
定濃度の原料（例えばフマル酸アンモニウム）を含有す
る種々のpHの原料液を、一定の流速により通液し、固定
化酵素から出た反応液のフマル酸の減少量を測定する。
この様な条件下で反応を行って、原料溶液のpH値と転化
率との関係をグラフ化すれば、例えば図１において中空
三角形で示すような折線が得られる。この例において
は、至適pHが８．６であることがわかる。

【００２３】次に、このようにして決定した至適pHにお
ける最少固定化酵素量を実験的に決定する。一般に、転
化率は、固定化酵素に対する原料液の流速に依存する。
すなわち、流速を速くすれば転化率は低下し、流速を遅
くすれば転化率は上昇する。従って、最少固定化酵素量
は、あらかじめ定めた所定の流速について決定される。

【００２４】例えば、固定化酵素の容器として所定の内
径を有するカラムに至適pHを有する原料液を一定の流速
〔液量／時間〕により流し、そのカラムに充填する固定
化酵素の量を変えて、カラムから流出する反応液のフマ
ル酸の減少量を測定し、さらに転化率を算出する。上記
のごとき一定条件下で、カラム中に充填された固定化酵
素の量を変えれば、固定化酵素が非常に少ない場合に
は、転化率は９８％に達しない。しかし、固定化酵素の
量を段階的に増加すれば、ある量においてはじめて転化
率が９８％に達する。この時の固定化酵素量が最少固定
化酵素量である。

【００２５】最少固定化酵素量において、原料液のpHを
変えて通液し、原料液のpHと転化率との関係をグラフ化
すれば、例えば図１の黒正方形記号で示した折線グラフ
のごとく、至適pHにおいてのみ転化率が９８％に達し、
至適pHからずれるに従って転化率は低下する。

【００２６】図１は、所定の条件下で、カラムに充填し
た固定化酵素の高さを、５０cm（中空三角印）、５５cm
（黒正方形）、６０cm（黒ヒシ形）、及び７０cm（黒
丸）として示し、原料液のpH値と転化率との関係をグラ
フ化したものである。この条件下で、固定化酵素を５５
cmの高さに充填した場合がほぼ最少固定化酵素量であ
る。６０cm（最少固定化酵素量に対して約１．１倍）に
おいて転化率９８％を得るためのpH値の許容範囲は拡大
しており、７０cm（最少固定化酵素量に対して約１．４
倍）においては、転化率９８％を得るのに許容されるpH
範囲におよそ８．２〜９．０に拡大している。

【００２７】なお、固定酵素の充填高さ７０cm（最少固
定化酵素量に対して約１．４倍）における、原料液のpH
と転化率との関係を具体的に示したのが図２における黒
丸で示した曲線であり、引用文献１のＦｉｇ．８に示す
データを示したのがpH８．６０にピークを有する曲線で
あり、最小固定化酵素量に対して約１．４倍の固定化酵
素を充填した場合にpH許容範囲が非常に広いことがわか
る。

【００２８】以上の結果から、最少固定化酵素量に対し
て約１．１倍以上の量の固定化酵素を用いれば、原料液
のpH許容範囲を拡大するという本発明の効果が得られる
ことは明らかである。従って、最少固定化酵素量に対し
て、固定化酵素の量を１．２倍、１．５倍、２倍などと
増加させることにより、９８％の転化率を得るために許
容されるpH範囲はますます拡大することが明らかであ
る。しかしながら、固定化酵素の製造コストや、反応容
器が大きくなることによる設備コスト等を考慮すれば、
最少固定化酵素量に対して、１０倍以下、好ましくは５
倍以下、さらに好ましくは２倍以下の固定化酵素を使用
するのが好ましい。

【００２９】

【実施例】次に、実施例により、本発明をさらに具体的
に説明する。参考例１．固定化酵素の調製大腸菌（E. coli ) ＩＦＯ３３０１由来の、アスパルタ
ーゼをコードするＤＮＡにより形質転換した大腸菌株Ｐ
Ｕ_aspＥ２（この作製方法については、特願平１０−２
７８５７１参照のこと）を、ＬＢ培地（ポリペプトン１
０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ、蒸留水１
Ｌ、１２１℃にて１５分間オートクレーブ殺菌）にアン
ピシリン１００ppm を含む培地３mlを入れた試験管１０
本に接種して３７℃で８時間培養後、同組成の培地にＩ
ＰＴＧを１mMを添加した培地１００mlを入れた坂口フラ
スコ１０本にそれぞれ１本ずつ接種し、３０℃で一夜振
盪培養した。この培養液から、菌体を遠心分離によって
回収した。この菌体のアスパルターゼ活性を測定したと
ころ１．０５moles Ｌ−アスパラギン酸生成／hr／ｇ菌
体であった。

【００３０】ＰＡＳ−８８０（日東紡績製）をアルカリ
でpH７．０付近にしたもの７０ｇ及び脱イオン水２３０
ｇをよく混合し、先に回収した菌体を均一に分散させ
た。６Ｌのナス型フラスコにイオン交換樹脂（アンバー
ライトＩＲＡ−９４ＳＣ１型オルガノ社製、平均粒径
０．５mm）３００mlと０．５インチのテフロン（登録商
標）球２００個を入れ、ここに先に得た菌体分散液の１
／６を入れ、３０℃で回転させながらエバポレーターで
１時間乾燥し、菌体をイオン交換樹脂に被覆させた。こ
の操作を６回行った後、テフロン球を除去してビーズ状
の固定化アスパルターゼを得た。この固定化アスパルタ
ーゼの活性は３５００Ｕであった。（１Ｕ＝１μmoles
Ｌ−アスパラギン酸生成／min ／ml固定化酵素）

【００３１】実施例１．参考例１に記載したのと同様に
して調製した固定化酵素（活性値約１０００Ｕ）を、内
径２８．２mmのカラムに充填して密封系とし、１８重量
％のフマル酸アンモニウムを含有する水溶液（pH８．１
〜９．２）をポンプにより５Ｌ／時の速度で固定化酵素
を充填（高さ５０cm，５５cm，６０cm又は７０cm）した
カラムに圧送した。カラム入口の温度は２０℃とした。
出口温度は約３３℃であった。結果を図１及び図２に示
す。この結果から、所与の条件下で、転化率９８％を得
るために必要な固定化酵素の量に対して、より多くの固
定化酵素を使用することにより、pHの許容範囲が拡大す
ることが明らかである。

【００３２】実施例２．参考例１に記載したのと同様に
して調製した固定化酵素（活性値約３０００Ｕ）を、内
径２８．２mmのカラムに充填して密封系とし、１８重量
％のフマル酸アンモニウムを含有する水溶液（pH７．７
〜９．５）をポンプにより１０Ｌ／時の速度で固定化酵
素を充填（高さ４０cm，４５cm，５０cm，６０cm，７０
cm又は８０cm）したカラムに圧送した。カラム入口の温
度は２０℃とした。出口温度は約３３℃であった。結果
を図３及び図４に示す。この結果から、所与の条件下
で、転化率９８％を得るために必要な固定化酵素の量に
対して、より多くの固定化酵素を使用することにより、
pHの許容範囲が拡大することが明らかである。

【００３３】実施例２は、実施例１の場合に比較して比
活性が約３倍高い固定化酵素を使用し、流速を１０Ｌ／
時として反応を行ったものである。図３から明らかな通
り、９８％の転化率を得るのに必要な最小酵素量は４５
cmであった。図４から明らかな通り、酵素量を１６０cm
として種々のpH値は有する基質溶液を反応させたとこ
ろ、非常に広いpH範囲にわたって高い転化率が得られ
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、種々のpHを有する原料溶液を、一定速
度（５Ｌ／時）で流し、固定化酵素量（カラム中の固定
化酵素の高さ）を変えた場合の、pH値と転化率との関係
を示すグラフである（実施例１）。

【図２】図２は、図１における固定化酵素量７０cmでの
原料溶液のpHと転化率との関係をプロットした折線グラ
フであり、曲線は、引用文献１に示すpHと相対活性との
関連を記載したものである（実施例１）。

【図３】図３は、種々のpHを有する原料溶液を、一定速
度（１０Ｌ／時）で流し、固定化酵素量（カラム中の固
定化酵素の高さ）を変えた場合の、pH値と転化率との関
係を示すグラフである（実施例２）。

【図４】図４は、図３における固定化酵素量１６０cmで
の原料溶液のpHと転化率との関係をプロットした折線グ
ラフであり、曲線は、引用文献１に示すpHと相対活性と
の関連を記載したものである（実施例２）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者向山正治茨城県つくば市観音台１丁目25番地12 株式会社日本触媒内 (72)発明者安田信三茨城県つくば市観音台１丁目25番地12 株式会社日本触媒内Ｆターム(参考） 4B064 AE17 CA22 CA35 CA38 CB30 CC07 CC10 CC15 CD12 DA16

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】固定化酵素に原料液を接触させることに
よりＬ−アスパラギン酸を生成せしめる工程を含むＬ−
アスパラギン酸の製造方法において、原料からＬ−アス
パラギン酸への９８％の転化率を得るのに必要な固定化
酵素の最少量（最少固定化酵素量）に比べて１．１倍以
上の量の固定化酵素を使用することを特徴とするＬ−ア
スパラギン酸の製造方法。
【請求項２】前記のＬ−アスパラギン酸の製造方法
が、フマル酸とアンモニウムイオン又はフマル酸アンモ
ニウムをＬ−アスパラギン酸に変換することができる酵
素系を含有する固定化酵素に、フマル酸とアンモニウム
イオン又はフマル酸アンモニウムを含有する原料液を接
触させることによりＬ−アスパラギン酸を生成せしめる
工程を含む方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】最少固定化酵素量に比べて１．１倍以上
１０倍以下の量の固定化酵素を使用する、請求項１又は
２に記載の方法。