JP2002020318A - 温度応答性の薬物キャリヤー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 周囲条件下で薬物とキャリヤーの結合状態を
変化させることのできるキャリヤーの提供。 【解決手段】 コンプレックスを形成できる単位と疎水
性単位と温度応答性単位とからなるコポリマーのキャリ
ヤーであって、該キャリヤーが送達された部位で一定の
温度変化処理が施されることを前提とするキャリヤー。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、薬物を生物学的な
特定部位に送達するための合成ポリマーからなるキャリ
ヤーおよび薬物とポリマーとのコンプレックスに関す
る。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子治療は、疾患を治療もしくは緩解
するタンパク質を産生しうる遺伝子を患者の宿主細胞内
へ導入する療法と定義されるであろう。かような遺伝子
の送達を達成するには、選択的かつ高いトランスフェク
ション効率をもつ安全なベクターまたはキャリヤーが必
要である。しかし、現在、利用できるベクターは導入効
率、選択性、安全性において必ずしも満足できるもので
ない。

【０００３】一般的に、トランスフェクション効率が高
いことから、ウイルスベクターが最も広範に使用されて
いる。しかし、ウイルスベクターの使用にはそれらの病
原性や免疫原性に伴う短所がある。別の手段として、カ
チオン性リポソームやカチオン性ポリマー等の非ウイル
スベクターの開発研究がなされてきた（例えば、Felgne
r et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．84（1987）
7413−7417；Boussifet al.，同誌、92（1995）7297−7
301；Wetering et al.，J．Control．Release53（199
8）145−153）。

【０００４】非ウイルスベクターは、安全性等において
ウイルスベクターを凌駕する利点をもつが、トランスフ
ェクション効率においては、今まだ、ウイルスベクター
より劣った水準にある。一般的に、リポソーム／ＤＮＡ
コンプレックスおよびポリマー／ＤＮＡコンプレックス
はポリカチオン単位とＤＮＡのリン酸アニオンとの間の
イオン相互作用により形成されている。そして、これら
のコンプレックスはエンドサイトーシスにより細胞に取
込まれるものと推測されている。なお、カチオン性ポリ
マーの遺伝子キャリヤーは、リポソームに比べて次のよ
うな利点を有しうるものと解されている。

【０００５】（ｉ）相対的に小さなサイズと狭い分布の
コンプレックスが提供できる。

【０００６】（ｉｉ）ヌクレアーゼに対する高い安定性
を有する。

【０００７】（ｉｉｉ）共重合により親水性を多面的に
調整できる。

【０００８】さらに、このようなカチオン性ポリマーと
ＤＮＡとのコンプレックスは、イオン相互作用により形
成されており、リソソーム酵素によるＤＮＡの分解を防
ぐ。しかし、一般的にカチオン性ポリマーの遺伝子ベク
ターは、カチオン性リポソームよりも低いトランスフェ
クション効率を示す。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ポリ
マーベクターの長所を生かしつつ、細胞へのトランスフ
ェクション効率の高い薬物送達手段を提供することにあ
る。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ポリマー
を用いる遺伝子キャリヤーのトランスフェクション効率
を高める（すなわち、キャリヤーの細胞への効率的な取
り込みと、一旦、取り込まれた後は遺伝子を発現容易な
状態にする）には、効率のよい取り込みに要求される遺
伝子とキャリヤーの安定なコンプレックスを提供できる
一方、細胞内ではコンプレックスから遺伝子を遊離もし
くは解離し易いような、相反する機能を併せもつ系を設
計する必要があるものと、考えた。

【００１１】かような系として、一定の温度では核酸と
の安定なコンプレックスを形成できるが、別の温度では
コンプレックスを解離して核酸を遊離せしめるポリマー
の使用により、上記目的が達成できることを見出した。
また、このような系はポリマーの構成単位を選ぶことに
より単に核酸に適用できるだけでなく、薬物とポリマー
との間のイオン相互作用、疎水結合形成能等を介するコ
ンプレックスを形成できる限り、広範な薬物の送達系が
提供できることが理解できるであろう。 なお、ＤＮＡ
の送達のために温度応答性ポリマーの使用を提案する例
が、W．L．J．Hinrichs et al.,“Thermosensitive pol
ymers as carriers for DNA delivery"、J．Control．R
elease 60（1999）249−259に記載されているが、ここ
では温度応答性ポリマーの使用がコンプレックスのサイ
ズの調整に主として向けられているだけである。

【００１２】したがって、特定の生物学的環境下で薬物
とポリマーとの間のコンプレックスの形成または形成さ
れたコンプレックスの解離を調整する系は、ここに、本
発明者によって初めて提供されるのである。より具体的
には、本発明によれば、生物学的環境下で薬物とのコン
プレックスを形成できるかまたは形成したコンプレック
スを維持できるポリマーを含んでなる薬物の送達用キャ
リヤーであって、該ポリマーが温度応答性のコポリマー
であり、そして該キャリヤーが、送達された生物学的環
境下の特定温度もしくは特定温度域を分岐点として、薬
物とポリマーから形成されたコンプレックスを解離する
か、あるいは薬物とポリマーとの間でコンプレックスを
形成するために使用される、ことを特徴とするキャリヤ
ーが提供される。

【００１３】また、本発明によれば、特定のカチオン性
ポリマーとオリゴもしくはポリヌクレオチドとのコンプ
レックスも提供される。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明により提供される薬物のた
めのキャリヤーは、生物学的環境下で薬物とのコンプレ
ックスを形成できるかまたは形成したコンプレックスを
維持できるポリマーを含んでなる。本明細書にいう「生
物学的環境」とは、単もしくは多細胞、器官および組織
それら自体、ならびにそれらを包含する水性環境を意味
し、生体内および生体外のいずれをも包含する概念で使
用している。生体内は、ヒトを含む動物の体内のいずれ
の領域もしくは場所であってもよく、そして生体外は組
織や細胞培養物ならびに例えば、生理食塩水等に細胞や
組織が分散または保存されたもの等が包含される。

【００１５】「薬物とのコンプレックス」にいう薬物と
しては、オリゴもしくはポリヌクレオチド（ＤＮＡ、Ｒ
ＮＡを包含する）、それらの誘導体（例えば、フォスフ
ォロチオエート、フォスフォラミド、メチルフォスフォ
エート等）、ならびにオリゴもしくはポリペプチドおよ
びシュウドペプチド、リン脂質、さらにはペプチド−
（オリゴもしくはポリ）ヌクレオチド等を挙げることが
できる。これらの薬物を機能に基いて分類すると、各種
疾患の原因となる遺伝子（例えば、田辺功、山内豊明
「遺伝子の地図帳」西村書店（１９９８）に記載されて
いるような遺伝子や、その他ヒトゲノムプロジョクト等
を通じて解明されているかもしくは解明されつつある特
定の機能を有する遺伝子断片）やアンチセンスＤＮＡ、
さらには、それらに対応するＲＮＡ、リボザイムを挙げ
ることができる。これらの薬物（例えばＤＮＡ）は、本
発明の目的に沿うものである限り、その分子量に制限は
ないが通常６〜２００,０００Ｍｅｒ、好ましくは９〜
５０,０００Ｍｅｒのものを意図している。他方、ペプ
チド類としては抗生物質、ホルモン、サイトカイン、酵
素等を挙げることができる。

【００１６】このような薬物と本発明で用いるポリマー
との間で形成されるコンプレックスは、本発明の目的に
沿うものであれば、如何なる相互作用（例えば、疎水結
合、イオン結合、それらの両者）を介して形成されたも
のであってもよいが、好ましくは、主としてイオン相互
作用を介して形成されるものである。

【００１７】他方、かような薬物とコンプレックスを形
成できるポリマーは、薬物との間で上記コンプレックス
を形成するための部位すなわちイオン形成基（または荷
電しうる基、第一級、第二級もしくは第三級アミンの残
基、第四級アンモニウム塩またはカルボキシル基）およ
び／または疎水性基を有する部位または領域をポリマー
分子内に有し、かつ、温度応答性であることが必要であ
る。本明細書でいう「温度応答性」とは、当該ポリマー
を含有する溶液またはポリマーの可溶化された溶液もし
くは均質な分散液に温度を上げるか下げるかによって、
ある一定温度もしくは温度域において、可逆的に相転移
（すなわち、１相⇔２相）をもたらすようなポリマーを
意味する。上記の「温度域」は相転移が起こる温度が数
℃の幅をもっていてもよいことを意味する。本発明に従
えば、このようなポリマーは生物学的環境下で使用する
ことを意図しているので、約１０℃〜４５℃の範囲にあ
ることが好ましいが、これに限定されない。薬物がＤＮ
Ａの場合における相転移の概念図を図１に示す。相転移
は、限定されるものでないが、例えば水中でＤＮＡとポ
リマーが可溶化された状態（緩いコンプレックスの形
成）と相分離を起こす状態（強固なコンプレックスの形
成）との間を転移する現象である。

【００１８】このような性質を有するポリマーは、少な
くとも１種の、所謂、温度応答性モノマーに由来する反
復単位を含むコポリマーであることが必要である。温度
応答性のモノマーは、例えば次式（Ａ）で表わすことが
できる。

【００１９】

【化１３】

【００２０】上式中、Ｒ_aは水素原子またはメチル基で
あり、Ｔは、式 −ＮＨＣＯＣＨ(ＣＨ₃)₂、−ＯＣＨ₃
および

【００２１】

【化１４】

【００２２】からなる群より選ばれる基であり、ここ
で、Ｒ_a1およびＲ_a2は独立して、水素原子、Ｃ_1-6アル
キル基を表すか、あるいはＲ_{a 1}及びＲ_a2は、それらが結
合する窒素原子と一緒になってピロリドン環

【００２３】

【化１５】

【００２４】を形成することができるが、但し、Ｒ_a1お
よびＲ_a2は同時に水素原子とはならない。

【００２５】このような１種または２種以上の温度応答
性モノマー由来の反復単位を有する温度応答性ポリマー
は、本発明の目的に沿う限り、いかなる他の反復単位を
含んでいてもよいが、さらに、薬物とコンプレックスを
形成しうる部分もしくは領域を提供できる反復単位を含
むことが必要である。このような単位としては、水溶液
中で荷電しうる基、例えば、第一級アミン、第二級アミ
ンもしくは第三級アミンのアミン残基または第四級アン
モニウム基、また、逆に、カルボキシル基を有するか、
さらに場合によって疎水性基を有するものであることが
できる。限定されるものでないが、アミン残基を有する
単位を提供しうるモノマーとしては、次の式（Ｂ）で表
されるものを挙げることができる。

【００２６】

【化１６】

【００２７】上式中、Ｒ_bは水素原子またはメチル基で
あり、Ｂは、式 −ＣＯＯＲ_b1、−ＣＯＮＨＲ_b1、−Ｃ
ＯＮ(Ｒ_b1)₂、−ＣＨ₂ＮＨ₂および

【００２８】

【化１７】

【００２９】からなる群より選ばれる基であり、ここで
各Ｒ_b1は式

【００３０】

【化１８】

【００３１】を表し、ここでｎは１〜４の整数であり、
そしてＲ_b2およびＲ_b3は独立して水素原子、Ｃ_1-6アル
キル基である。

【００３２】さらに本発明で使用するポリマーは、薬物
とのコンプレックスの形成に関与してもよい、疎水性側
鎖を有する単位を含むことが好ましい。このような単位
は、ポリマー組成物の相転移温度を調整することもでき
る。限定されるものでないが、このような単位を誘導し
うるモノマーとしては、次の式（Ｄ）で表される疎水性
モノマーを挙げることができる。

【００３３】

【化１９】

【００３４】上式中、Ｒ_dは水素原子またはメチル基で
あり、Ｄは、式 −ＣＯＯＲ_d1、−ＣＯＮＨＲ_d1、−Ｃ
ＯＮ(Ｒ_d1)₂ および

【００３５】

【化２０】

【００３６】からなる群より選ばれる基であり、ここ
で、各Ｒ_d1はＣ_1-20アルキル基である。

【００３７】上記各モノマーを定義する際に用いたＣ
_1-6アルキルおよびＣ_1-20アルキルは、それぞれ、炭素
原子数が１〜６個および１〜２０個の直鎖または分枝ア
ルキルを意味し、限定されるものでないが、メチル、エ
チル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、
ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペ
ンチル、チオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプ
チル、オクチル、ウンデシル、オクタデシルおよびイコ
シルを挙げることができる。

【００３８】こうして定義される各モノマーの代表的な
ものとしては、式（Ａ）の温度応答性モノマーとしてＮ
−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルア
ミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−ビニルイ
ソブチルアミド、ビニルメチルエーテルおよびアクリロ
イルピロリドンを挙げることができ、式（Ｂ）で表され
る塩基性モノマーとして２−（ジメチルアミノ）エチル
メタクリレート、２−（ジメチルアミノ）エチルアクリ
レート、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］メタク
リルアミド、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］ア
クリルアミド、Ｎ，Ｎ−ビス−［２−（ジメチルアミ
ノ）エチル］メタクリルアミド、２−（ジエチルアミ
ノ）エチルメタクリレート、アリルアミン、２−アミノ
スチレンおよび４−アミノスチレンを挙げることがで
き、そして式（Ｄ）で表される疎水性モノマーとしてブ
チルメタクリレート、ブチルアクリレート、ｉｓｏ−ブ
チルメタクリレート、ヘキシルメタクリレート、オクチ
ルメタクリレート、Ｎ−ペンチルアクリルアミド、Ｎ−
ペンチルメタクリルアミドおよびＮ−オクチルメタクリ
ルアミドを挙げることができる。

【００３９】本発明で使用する温度応答性ポリマーの典
型的なものとしては、上記式（Ａ）、式（Ｂ）及び式
（Ｄ）で表されるモノマーのそれ自体既知の共重合法
（好ましくはランダン共重合法）によって製造できる。
こうして製造されるコポリマーは、次の一般式（Ｅ）で
表すことができる。

【００４０】

【化２１】

【００４１】上式中、Ｒ_a、Ｒ_b、Ｒ_d、Ｔ、ＢおよびＤ
は、それぞれ式（Ａ）、式（Ｂ）そよび式（Ｄ）につい
て定義したとおりであり、そして、ｘはｘが付された反
復単位の当該コポリマーにおけるモル分率が６０％以
上、例えば、６０〜９５％、好ましくは６０〜８５％と
なるような整数であり、ｙおよびｚは、それらの各反復
単位の当該コポリマーにおけるモル分率が、それぞれ２
％以上、例えば、ｙは２〜２０％、ｚは２〜２０％とな
るような整数であり、そして分子量は３,０００〜２０
０,０００である。

【００４２】一般式（Ｅ）で表されるコポリマーは、一
般的に、２重量％水溶液としたときの下限臨界溶液温度
（ＬＣＳＴ）が１０〜４５°に入るように各モノマー組
成が選ばれる。本明細書において、このＬＣＳＴは、当
該技術分野で普通に用いられている意味をもつものとし
て使用している。このようなコポリマーのＬＣＳＴは、
薬物（例えば、プラスミドＤＮＡ）とコポリマーとのコ
ンプレックスにおいて若干上昇する傾向があることが理
解されている。

【００４３】したがって、上記コポリマーと例えば、Ｄ
ＮＡとのコンプレックスは、生物学的環境下または緩衝
化された生理食塩水（ｐＨ５.０〜８.０）もしくは脱イ
オン水において、１０〜４５℃のいずれかの温度または
温度域で緩いコンプレックスが形成された相状態（また
は可溶化状態）と強固なコンプレックスが形成された相
状態（または凝集状態）との間の変動を起こすことがで
きる。上記式（Ｅ）で表されるコポリマーは、一般に１
０〜４５℃（薬物とのコンプレックスにあっては、約５
〜４５℃）にＬＣＳＴをもつので、例えば、コンプレッ
クスを水との組成物を対応するＬＣＳＴより高い温度か
ら低い温度に温度を低下させると、強固なコンプレック
ス状態から緩いコンプレックス状態に変化せしめること
ができる（図１参照）。本発明では、かような変化をコ
ンプレックスからの薬物の遊離もしくは解離と称してい
る。

【００４４】本発明に従えば、理論によって拘束される
ものでないが、例えば、強固なコンプレックス状態で薬
物を特定の生物学的環境下（例えば、標的細胞内）に送
達し、次いで、環境温度を変化させることにより、その
場で、緩いコンプレックス状態（コンプレックスからの
薬物の遊離または解離）をもたらすことができる。この
ような作用効果は、培養細胞のような生体外だけでなく
生体内の特定の器官、領域、細胞（もしくは細胞群）に
おいても達成できる。

【００４５】現に、所定の遺伝子を特定部位（例えば、
腫瘍細胞内）で発現させるために、該遺伝子と式（Ｅ）
とのコンプレックス（相転移温度が体温を下廻る）を調
製し、それらを培養細胞系に導入するか、あるいは直接
またはその他の方法で被験体の特定部位またはその周辺
に注入し細胞内に取り込ませた後、相転移温度以下の温
度に注入部を冷却すると、遺伝子の発現効率を高めうる
ことが確認できた。

【００４６】したがって、本発明に従えば、ヌクレオチ
ド（または核酸もしくは遺伝子）を生物学的な環境の特
定部位に送達するための薬物コンプレックスも提供され
る。

【００４７】

【実施例】以下、本発明をより具体的に説明し、また、
説明の煩雑させ避けるため、式（Ａ）の温度応答性モノ
マーとしてのＮ−イソプロピルアクリルアミド、式
（Ｂ）の塩基性モノマーとしての２−（ジメチルアミ
ノ）エチルメタクリレートおよび式（Ｄ）の疎水性モノ
マーとしてのブチルメタクリレートのランダム共重合に
よって得られるコポリマーの例を挙げるが、本発明がこ
れらに限定されることを意図するものではない。 材料：Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（以下、ＩＰＡ
Ａｍと略記する）は市販の製品をヘキサンで再結晶する
ことによって精製し、次いで室温で減圧下に乾燥したも
のを使用した。２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリ
レート（以下、ＤＭＡＥＭＡと略記する）およびブチル
メタクリルアミド（以下、ＢＭＡと略記する）は市販の
ものを減圧蒸留して精製したもの使用した。アゾビスイ
ソブチロニトリル（以下、ＡＩＢＮと略記する）は市販
のものをメタノールから再結晶して精製したものを使用
した。テトラヒドロフラン（以下、ＴＨＦと略記する）
は市販のものを蒸留して使用した。その他の試薬は、市
販の試薬等級のものを、さらなる精製することなく使用
した。 例１：ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＥＭＡ−ｃｏ−
ＢＭＡ）の製造 種々の組成をもつＩＰＡＡｍ、ＤＭＡＥＭＡおよびＢＭ
Ａよりなるモノマーから誘導されるコポリマーを、ラジ
カル開始剤としてＡＩＢＮを用いるラジカル共重合によ
り該モノマーから製造した。モノマー類とＡＩＢＮ
（０．２ｍＭ）をＴＨＦ３５ｍｌに溶解した。得られた
溶液を減圧下で凍結−融解を繰り返すことにより脱気
し、二方向活栓を用いて密封した。６０℃で１５時間重
合を行った。次いで、反応液を過剰量の石油エーテル中
に注ぎ込み、沈殿したポリマーを減圧下で乾燥した。乾
燥ポリマーを冷水に溶解し、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／
Ｐｏｒ３−ｍｅｍｂｒａｎｅ、分画分子量（ＭＷＣＯ）
＝３５００）を使用し、２４時間４℃で水に対して透析
して未反応のモノマー類を除去した。凍結乾燥して、白
色粉末としてポリマーを得た。コポリマーの分子量は、
４０℃において、塩化リチウム含有ジメチルホルムアミ
ド（１０ｍＭ）で溶離（速度１ｍｌ／分）するゲル浸透
クロマトグラフィー（ＧＰＣ、ＴＯＳＯＨ、ＳＣ−８０
２０、ポリスチレン標準）により決定した。 例２：コポリマーの物性 （２−１）コポリマー溶液の透過率の測定 各種温度におけるポリマー水溶液の光学透過率をＵＶ−
ＶＩＳスペクトルメーター（Ｖ−５３０、日本分光）を
用い５００ｎｍで測定した。試料セルはペルチェ効果セ
ルホルダー（ＥＨＣ−４７７、日本分光）を用いて一定
温度調節した。加熱速度は、０．１℃／分であった。ポ
リマー溶液のＬＣＳＴは、光学透過率が１％の低下を示
す温度として決定した。 （２−２）ｐＫａ測定 コポリマーのｐＫａ値は滴定によって決定した。コポリ
マーを０．９重量％の塩化ナトリウム溶液中に溶解さ
せ、０．１Ｍ ＨＣｌで酸性にした後、０．０５Ｍ Ｎ
ａＯＨで滴定した。 例３：電気泳動分析 各種ポリマーとプラスミドＤＮＡ（２μｇ）のコンプレ
ックスを総容量２００μｌのリン酸生理緩衝液（ＰＢ
Ｓ）中で作成した。コンプレックスの生成は３７℃、１
時間で行った。コンプレックス溶液３０μｌを０．６重
量％のアガロースゲル上で泳動させ（１００Ｖ）、臭化
エチジウム染色でバンドを可視化した。 例４：ｐＣＭＶ−ＬａｃＺの調製 ｐＣＭＶ−ＬａｃＺは J．Lindsay Whitton 博士（the
Scripps Research Institute，La Jolla，CA，U.S.
A．：例えば、J．Virol．69（1995）2684−2688参照）
から贈与された。このプラスミドを大腸菌（Escherichi
a coli）ＤＨ５α株で増幅し、カラムクロマトグラフィ
ー［Ｑｉａｇｅｎ（商標）Plasmid Mega Kit、 German
y］で精製した。プラスミドの純度はＯＤ₂₆₀／ＯＤ₂₈₀
（ここで、ＯＤは光学濃度である。）で測定した。この
比は１．８５〜１．９０であった。プラ スミド濃度は、等式 １ ＯＤ₂₆₀＝５０μｇ／ｍｌ（プラスミドＤＮＡ） を用いて決定した。 例５：トランスフェクション用細胞株 ＣＯＳ−１細胞（アフリカミドリザル腎由来培養細胞株
ＣＶ−１を、市販のＳＶ４０突然変異株のウイルスゲノ
ムで形質転換した細胞）を、１０％ＦＢＳ、ペニシリン
１００μ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００μｇ／
ｍｌを補足したＤＭＥＭ培地で給湿された５％ＣＯ₂雰
囲気のインキュベーター内で培養した。 例６：ＤＮＡの細胞のトランスフェクション ＣＯＳ−１細胞を４×１０⁵細胞／ｍｌの濃度で９６ウ
ェルの平底ミクロアッセイプレート（Falcon Co.，Bect
on Dickinson，Franklin Lakes，NＪ，U.S.A.）にウェ
ル当り１６０μｌずつ植種し、１５時間後にトランスフ
ェクション実験に供した。ｐＣＭＶ−ＬａｃＺ ４μｇ
は１００μｌのＲＰＭＩ−１６４０で希釈した。所定量
のコポリマー原液（５００〜２０００μｇ／ｍｌ）を３
００μｌのＲＰＭＩ−１６４０で希釈した。プラスミド
溶液１００μｌとポリマー溶液３００μｌを混合してコ
ンプレックス溶液を調製し、３７℃で１時間インキュベ
ーションを行った。コポリマーは、コポリマー／プラス
ミド重量比５〜１００で使用した。コンプレックス溶液
１００μｌを９６ウェルプレートに加え、３７℃で１時
間インキュベーションを行った。コンプレックス溶液を
除去した後、１０％ＦＢＳを含有する新鮮なＤＭＥＭ媒
地をプレートに加え、次いで、給湿された５％ＣＯ₂雰
囲気下、３７℃で４７時間培養した。トランスフェクシ
ョン効率を評価するために、トランスフェクトされた細
胞のＸ−ｇａｌ組織化学的染色を行って、β−ガラクト
シダーゼを発現した細胞数を測定した［K．Lim et a
l.，Biotechniques 7（1987）576−579参照］。

【００４８】９６ウェルプレート中の細胞を５分間室温
にてＰＢＳ中０．２５％グルタルアルデヒドで固定し、
ＰＢＳで２回洗浄した後、組織化学反応液（それぞれＰ
ＢＳ中、１ｍｇ／ｍｌ Ｘ−Ｇａｌ、５ｍＭフェロシア
ン化カリウム、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂）と共にインキュベ
ーションした。組織化学反応液での５時間インキュベー
ションした後、ウェル中の全てのブルーの細胞を顕微鏡
下で数えた。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、レポーター溶
解バッファー（Promega，U.S.A.）で採取した。トラン
スフェクトされた細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性は、
ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｏ
ＮＰＧ）を基質として使用して４１５ｎｍで分光光度計
で測定した（N．Rosenthal，Methods Enzymol．152（19
87）704−720参照）。トランスフェクション効率は１μ
ｇタンパク質当りのβ−ガラクトシダーゼ活性と定め
た。細胞溶解と一連のタンパク質標準溶液はウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）を用いて調製し、総タンパク質につ
いてアッセイした。ビシンコニン酸（bicinconnic aci
d）試薬を各試料に加え、３７℃で３０分インキュベー
ションした。自動マイクロタイタープレート分光光度計
により５４７ｎｍにおける吸光度を読み取り、総タンパ
ク質量を得た。統計解析はFisher's protectedleast si
gnificance difference testにより行った。 結果および検討： （１）製造されたポリマーおよび特性 下記表Ｉに示す各種モノマー比でポリマー（ＰＤＭＡＥ
Ｍ）コポリマー［Ｐ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＥＭ
Ａ）およびＰ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＥＭＡ−ｃｏ
−ＢＭＡ）］を得た。それらの分子量、収率、ＬＣＳＴ
および一部のｐＫａ値も表Ｉにまとめて記載する。ま
た、各ポリマーおよびコポリマーは、以後、特記しない
かぎり、ポリマー名の欄に命名した略称に従う。なお、
モノマー含量（またはモノマーの組成）は¹Ｈ−ＮＭＲ
の測定値から換算した。

【００４９】

【表１】

【００５０】なお、ＰＩＰＡＡｍは３２℃にＬＣＳＴを
示すことが公知であり（M. Heskins, J．Macromol．Sc
i．Chem．A2（1968）1441−1445）、熱応答性ヒドロゲ
ル（同前）、バイオコンジュゲート（M．Matukata et a
l.，Bioconjugate Chem．7（1996）96−101）やクロマ
トグラフィー系（H．Kanazawa et al.，Anal．Chem．68
（1996）100−105）で精力的に研究されている。

【００５１】これらのＬＣＳＴ値は、アミンモノマー単
位（ＤＭＡＥＭＡ）および疎水性モノマー単位（ＢＭ
Ａ）を組み入れることにより、それぞれ増大および低減
できることが、確認できた。

【００５２】これらのコポリマーが示す温度応答性の典
型例として、リン酸生理緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）
におけるＰ（ＩＰ−８ＤＡ−１１ＢＭ）溶液の温度変化
に伴う透過率の変化を図２に示す（四角がＤＮＡ不存在
下であり丸がＤＮＡ存在下である。）。サケＤＮＡの存
在下の透過率はサケＤＮＡの不存在下におけるコポリマ
ー溶液の透過率より低い。しかし、Ｐ（ＩＰ−８ＤＡ−
１１ＢＭ）溶液のＬＣＳＴはサケＤＮＡの存在下におけ
るＬＣＳＴと殆ど同じである。

【００５３】図３には３７℃［（ａ）および（ｂ）］な
らびに２０℃［（ｃ）および（ｄ）］におけるポリマー
とプラスミドコンプレックスのアガロースゲル電気泳動
の結果を示す。ＰＤＭＡＥＭホモポリマーが共存する場
合のプラスミドのバンドは、両温度で、ポリマー／プラ
スミドの重量比１〜４のすべてにおいてゲルの充填スロ
ットに完全に残存した。Ｐ（ＩＰ−９ＤＡ）は、コポリ
マー重量比が５から１００に高まるにつれてＤＮＡバン
ドを遅延させることを示した。この遅延はコポリマーと
のコンプレックスの形成に伴う分子量の増大やコンプレ
ックスの形成によりプラスミドＤＮＡにおけるリン酸イ
オンの減少に起因するものと考えられる。重量比が５以
上で、３７℃において、Ｐ（ＩＰ−８ＤＡ−１１ＢＭ）
と共存するプラスミドはゲルの充填スロット内に完全に
残存している（図３の（ａ）および（ｂ）、レーン１３
〜１７）。これに対し、２０℃では、重量比５、１５、
２０および３０のＰ（ＩＰ−８ＤＡ−１１ＢＭ）の共存
でも、対照プラスミドの位置に比較的明るいバンドが見
られる（図３の（ｃ）および（ｄ）、レーン１２〜１
５）。これは、２０℃において、コンプレックスからの
ＤＮＡの部分的解離が生じていることを示す。以上の結
果から、アミノ基（ＤＭＡＥＭＡ）および／または疎水
性基（ＢＭＡ）含量を調節することにより、重量比５、
１５、２０および３０においてコンプレックス形成／解
離の温度制御が達成できることが明らかになった。 （２）ポリマー・プラスミド コンプレックスの生体外
トランスフェクション 各種のポリマー・プラスミドＤＮＡコンプレックスを、
一定量のプラスミドと種々の量のコポリマーとから形成
した。

【００５４】図４〜６は、トランスフェクション効率を
ブルーに着色された細胞の数により示す。コンプレック
ス溶液をウェル中で１時間３７℃でインキュベートした
後、コンプレックス溶液を除去し、次いで、１０％ＦＢ
Ｓを含有する新鮮なＤＭＥＭ培地を加え、（ｉ）３７
℃、４７時間および（ｉｉ）３７℃、２０時間＋２０
℃、３時間＋３７℃、２４時間の２種の温度および期間
の条件下でインキュベーションを行った。

【００５５】ＰＤＭＡＥＭＡホモポリマーは効率のよい
遺伝子キャリヤーとして開発されてきており、このポリ
マーの低いｐＫａ値（７．４）が遺伝子の高いトランス
フェクション効率に寄与するものと考えられている（P.
V.D．Wetering et al.，Bioconjugate Chem．10（199
9）589−597）。

【００５６】上記条件（ｉ）では、対照としてのＰＤＭ
ＡＥＭＡのトランスフェクション効率は、重量比２で最
大値に達するまで、ポリマー／ＤＮＡ重量比の増大に伴
って増大した（図４）。この挙動は既に報告されている
結果（W.L.J．Hinrichs et al.，J．Control．Release
60（1999）249−259）と整合している。他方、条件（ｉ
ｉ）におけるトランスフェクション効率は、すべての重
量比において条件（ｉ）より低い（図４参照）。トラン
スフェクション効率は細胞分裂および／または細胞内タ
ンパク質合成プロセスに対して低いインキュベーション
温度（２０℃）の阻害作用により低下した可能性があ
る。Ｐ（ＩＰ−９ＤＡ）は５〜１００の重量比で両条件
下で極めて低いトランスフェクション効率を示した（図
５参照）。

【００５７】図６は、Ｐ（ＩＰ−８ＤＡ−１１ＢＭ）の
トランスフェクション効率を示す。このコポリマーを用
いると、相当な数のトランスフェクトされた細胞が観察
される。このことは、疎水性単位がトランスフェクショ
ンに本質的に寄与していることを示す。驚くべきこと
に、重量比３０におけるトランスフェクション効率は、
温度を低下することによって増大したのである。一般的
に、３７℃より低い温度はトランスフェクションにとっ
て不利である。現に、ＰＤＭＡＥＭホモポリマーのトラ
ンスフェクション効率は低温インキュベーションにより
低下したのである。すなわち、Ｐ（ＩＰ−８ＤＡ−１１
ＢＭ）により増大するトランスフェクション効率は、そ
のコポリマーのＬＣＳＴが２１℃であるために、低温で
コンプレックスの解離が生じているものと予測される。
こうして、本発明者らは、コンプレックスが送達された
部位の周囲温度を変化させることにより遺伝子の発現を
促進できることを見出したのである。

【００５８】図７にＰ（ＩＰ−８ＤＡ−１１ＢＭ）を用
いた場合の条件（ｉ）および（ｉｉ）におけるトランス
フェクションされた細胞の観察図に代わる顕微鏡写真を
示す。条件（ｉｉ）では、数多くのトランスフェクトさ
れた細胞（ブルー細胞）を認めることができる。 （３）細胞当りのβ−ガラクトシダーゼ活性の評価 各インキュベーション後のβ−ガラクトシダーゼ活性の
測定結果を図８および９に示す。トランスフェクション
を、次の （ｉ）３７℃での４７時間、 （ｉｉ）３７℃、２０時間＋２０℃、３時間＋３７℃、
２４時間 （ｉｉｉ）２０℃、３時間＋３７℃、４４時間 の温度およびインキュベーション時間からなる３種の条
件にて検討した。条件（ｉ）におけるＰＤＭＡＥＭホモ
ポリマーのβ−ガラクトシダーゼ活性は他の条件（ｉ
ｉ）および（ｉｉｉ）よりも高い（図８）。すべての条
件で、細胞の単位タンパク質量当りの発現活性は、ポリ
マー／ＤＮＡの比に依存しているということはなかっ
た。したがって、トランスフェクション効率はポリマー
／ＤＮＡ重量比１〜２の間のトランスフェクトされた細
胞数の増大により増大し、そしてトランスフェクション
効率は重量比２〜１０では細胞毒性または細胞死に起因
して低下するものと考えられる。

【００５９】他方、条件（ｉｉ）におけるＰ（ＩＰ−８
ＤＡ−１１ＢＭ）のβ−ガラクトシダーゼ活性は、広範
な重量比（２０〜１００）において他の条件よりも高
い。条件（ｉｉ）におけるβ−ガラクトシダーゼ活性は
重量比に大きく依存していた。このことは、トランスフ
ェクション効率の変化は、主として細胞当り発現レベル
により達成されるものであり、必ずしもトランスフェク
トされた細胞数または細胞の生存率にはよらないことを
意味する。

【００６０】さらに、条件（ｉｉｉ）における低いβ−
ガラクトシダーゼ活性に注目しなければならない。すな
わち、低温処理するタイミングがトランスフェクトされ
た細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の増大に重要
であろう。

【００６１】さらに種々のインキュベーションパターン
によるＰ（ＩＰ−８ＤＡ−１１ＢＭ）のトランスフェク
ション効率を重量比３０で評価した結果を図１０に示
す。温度を低下することによるトランスフェクションの
増大はパターン３で確認される。図１０において、ま
ず、注目すべきことは、本発明によれば遺伝子の発現が
インキュベーションパターンによって厳密に制御できる
ことである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明に従う薬物キャリヤーのＤＮＡコ
ンプレックスの形成と解離の概念図である。

【図２】図２はＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でのＰ（ＩＰ−
８ＤＡ−１１ＢＭ）の透過率の温度依存性を示すグラフ
である。（○）はサケＤＮＡの不存在下、（□）はサケ
ＤＮＡの存在下。

【図３】図３はポリマーとプラスミドのコンプレックス
を０．６％アガロースゲル電気泳動したときの泳動図に
代わる写真である。（ａ）および（ｂ）は３７℃におけ
る泳動図であり、その中で（ｂ）はコントラストを増強
した図である。（ｃ）および（ｄ）は２０℃における泳
動図であり、その中で（ｄ）はコントラストを増強した
図である。レーン１はプラスミドＤＮＡ（２μｇ）の
み、レーン２〜５はプラスミドＤＮＡ（２μｇ）と、そ
れぞれ２μｇ、４μｇ、６μｇおよび８μｇのＰＤＭＡ
ＥＭとの混合物、レーン６〜１１はプラスミドＤＮＡ
（２μｇ）と１０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、６０μ
ｇ、１２０μｇおよび２００μｇのＰ（ＩＰ−９ＤＡ）
との混合物、ならびにレーン１２〜１７はプラスミドＤ
ＮＡ（２μｇ）と１０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、６０
μｇ、１２０μｇおよび２００μｇのＰ（ＩＰ−８ＤＡ
−１１ＢＭ）との混合物について泳動したものである。
プラスミドＤＮＡは臭化エチジウムにより可視化してい
る。

【図４】図４はＰＤＭＡＥＭＡとプラスミドのコンプレ
ックスのトランスフェクション効率を表すグラフである
（ｎ＝３、ＩＳ．Ｄ．）。グラフ中、（○）３７℃４７
時間のインキュベーションを行ったものであり、（□）
は３７℃２時間＋２０℃３時間＋３７℃２４時間のイン
キュベーションを行ったものである（なお、後述の図５
および６においても、試行数およびインキュベーション
条件は同様の意味を有する。）。

【図５】図５はＰ（ＩＰ−９ＤＡ）とプラスミドのコン
プレックスのトランスフェクション効率を表すグラフで
ある。

【図６】図６はＰ（ＩＰ−８ＤＡ−１１ＢＭ）とプラス
ミドのコンプレックスのトランスフェクション効率を表
すグラフである。

【図７】図７はＰ（ＩＰ−８ＤＡ−１１ＢＭ）（×１０
０）のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現を示す図に代
わる細胞の写真である。（ａ）は３７℃４７時間のイン
キュベーションを行った場合の細胞染色写真であり、
（ｂ）は３７℃２０時間＋２０℃３時間＋３７℃２４時
間のインキュベーションを行った場合の写真である。

【図８】図８はＰＤＭＡＥＭＡとプラスミドのコンプレ
ックスのポリマー濃度変化によるβ−ガラクトシダーゼ
活性の変動を表すグラフである。（○）：３７℃４７時
間インキュベーション、（□）：２０℃３時間＋３７℃
４４時間のインキュベーション、（△）：３７℃２０時
間＋２０℃３時間＋３７℃２４時間のインユベーショ
ン。（ｎ＝３、ＩＳ．Ｄ．）

【図９】図９はＰ（ＩＰ−８ＤＡ−１１ＢＭ）とプラス
ミドのコンプレックスのポリマー濃度変化によるβ−ガ
ラクトシダーゼ活性の変動を表すグラフである。
（○）、（□）および（△）の表す意味は図８に同じ。
（ｎ＝３、ＩＳ．Ｄ．）

【図１０】図１０はＰ（ＩＰ−８ＤＡ−１１ＢＭ）のβ
−ガラクトシダーゼ活性についてのインキュベーション
時間および期間の影響を示すグラフである［ｐ〈０．０
１（＊）またはｐ〉０．００１（＊＊）］。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ ４Ｊ１００ Ｃ０８Ｆ 212/06 Ｃ０８Ｆ 212/06 212/14 212/14 216/18 216/18 220/12 220/12 220/34 220/34 220/56 220/56 220/60 220/60 226/02 226/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA20 GA30 HA17 4C057 BB02 CC01 MM06 MM09 4C076 AA95 CC42 EE13A EE25A FF02 FF31 FF68 4C084 AA13 NA13 NA14 ZB211 ZB212 ZB262 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA13 NA14 ZB21 ZB26 4J100 AB02R AB03R AB07Q AE03P AL03R AL04R AL08Q AM17P AM17R AM19P AM21Q AN03Q AN04P BA14P BA29Q BA31Q CA05 JA53

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生物学的環境下で薬物とのコンプレック
   スを形成できるかまたは形成したコンプレックスを維持
   できるポリマーを含んでなる薬物の送達用キャリヤーで
   あって、 該ポリマーが温度応答性のコポリマーであり、そして 該キャリヤーが、送達された生物学的環境下の特定温度
   もしくは特定温度域を分岐点として、薬物とポリマーか
   ら形成されたコンプレックスを解離するか、あるいは薬
   物とポリマーとの間でコンプレックスを形成するために
   使用される、ことを特徴とするキャリヤー。
2. 【請求項２】 温度応答性のコポリマーが、式（Ａ） 【化１】 （上式中、Ｒ_aは水素原子またはメチル基であり、Ｔ
   は、式 −ＮＨＣＯＣＨ(ＣＨ₃)₂、−ＯＣＨ₃ および 【化２】 からなる群より選ばれる基であり、ここで、Ｒ_a1および
   Ｒ_a2は独立して、水素原子、Ｃ_1-6アルキル基を表す
   か、あるいはＲ_{a 1}及びＲ_a2は、それらが結合する窒素原
   子と一緒になってピロリドン環を形成することができる
   が、但し、Ｒ_a1およびＲ_a2は同時に水素原子とはならな
   い）で表わされる少なくとも１種の温度応答性モノマー
   に由来する少なくとも１種の反復単位を含むものであ
   り、０.２重量％のポリマー濃度の水溶性としたときの
   下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）が１０℃〜４５℃である
   請求項１記載のキャリヤー。
3. 【請求項３】 温度応答性コポリマーが、式（Ｂ） 【化３】 （上式中、Ｒ_bは水素原子またはメチル基であり、Ｂ
   は、式 −ＣＯＯＲ_b1、−ＣＯＮＨＲ_b1、−ＣＯＮ(Ｒ
   _b1)₂、−ＣＨ₂ＮＨ₂および 【化４】 からなる群より選ばれる基であり、ここで各Ｒ_b1は式 【化５】 を表し、ここでｎは１〜４の整数であり、そしてＲ_b2お
   よびＲ_b3は独立して水素原子、Ｃ_1-6アルキル基であ
   る）で表される少なくとも１種の塩基性モノマーに由来
   する反復単位、並びに式（Ｄ） 【化６】 （上式中、Ｒ_dは水素原子またはメチル基であり、Ｄ
   は、式 −ＣＯＯＲ_d1、−ＣＯＮＨＲ_d1、−ＣＯＮ(Ｒ
   _d1)₂ および 【化７】 からなる群より選ばれる基であり、ここで、各Ｒ_d1はＣ
   _1-20アルキル基である）で表される少なくとも１種の疎
   水性モノマーに由来する反応単位を含んでなる請求項２
   記載のキャリヤー。
4. 【請求項４】 温度応答性コポリマーが、モル分率で、
   式（Ａ）で表される温度応答性モノマーに由来する反復
   単位を６０％以上含み、そして式（Ｂ）および式（Ｄ）
   で表されるモノマーに由来する反復単位を、それぞれ２
   ％以上含む請求項３記載のキャリヤー。
5. 【請求項５】 式（Ａ）で表される温度応答性モノマー
   がＮ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリ
   ルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−ビニ
   ルイソブチルアミド、ビニルメチルエーテルおよびアク
   リロイルピロリドンからなる群より選ばれ；式（Ｂ）で
   表される塩基性モノマーが２−（ジメチルアミノ）エチ
   ルメタクリレート、２−（ジメチルアミノ）エチルアク
   リレート、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］メタ
   クリルアミド、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］
   アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ビス−［２−（ジメチルアミ
   ノ）エチル］メタクリルアミド、２−（ジエチルアミ
   ノ）エチルメタクリレート、アリルアミン、２−アミノ
   スチレンおよび４−アミノスチレンからなる群より選ば
   れ；そして式（Ｄ）で表される疎水性モノマーがブチル
   メタクリレート、ブチルアクリレート、ｉｓｏ−ブチル
   メタクリレート、ヘキシルメタクリレート、オクチルメ
   タクリレート、Ｎ−ペンチルアクリルアミド、Ｎ−ペン
   チルメタクリルアミドおよびＮ−オクチルメタクリルア
   ミドからなる群より選ばれる請求項３または４記載のキ
   ャリヤー。
6. 【請求項６】 式（Ａ）で表される温度応答性モノマー
   がＮ−イソプロピルアクリルアミドであり、式（Ｂ）で
   表される塩基性モノマーが２−（ジメチルアミノ）エチ
   ルメタクリレートであり、そして式（Ｄ）で表される疎
   水性モノマーがブチルメタクリレートである請求項５記
   載のキャリヤー。
7. 【請求項７】 薬物がオリゴもしくはポリヌチレオチド
   またはそれらの誘導体である請求項１〜６のいずれかに
   記載のキャリヤー。
8. 【請求項８】 一般式（Ｅ） 【化８】 ［上式中、Ｒ_a、Ｒ_bおよびＲ_dは独立して水素原子また
   はメチル基であり；Ｔは、式 −ＮＨＣＯＣＨ(Ｃ
   Ｈ₃)₂、−ＯＣＨ₃ および 【化９】 からなる群より選ばれる基であり、ここで、Ｒ_a1および
   Ｒ_a2は独立して、水素原子、Ｃ_1-6アルキル基を表す
   か、あるいはＲ_{a 1}およびＲ_a2は、それらが結合する窒素
   原子と一緒になってピロリドン環を形成することができ
   るが、Ｒ_a1およびＲ_a2は同時に水素原子とはならない；
   Ｂは、式 −ＣＯＯＲ_b1、−ＣＯＮＨＲ_b1、−ＣＯＮ
   (Ｒ_b1)₂、−ＣＨ₂ＮＨ₂および 【化１０】 からなる群より選ばれる基であり、ここで、各Ｒ_b1は式 【化１１】 を表し、ここでｎは１〜４の整数であり、そしてＲ_b2お
   よびＲ_b3は独立して水素原子、Ｃ_1-6アルキル基であ
   る；そしてＤは、式 −ＣＯＯＲ_d1、−ＣＯＮＨＲ_d1、
   −ＣＯＮ(Ｒ_d1)₂ および 【化１２】 からなる群より選ばれる基であり、ここで、各Ｒ_d1はＣ
   _1-20アルキル基であり；ｘは、ｘが付された反復単位の
   当該コポリマーにおけるモル分率が６０％以上となるよ
   うな数であり、ｙおよびｚは独立して、それらの各反復
   単位の当該コポリマーにおけるモル分率が２％以上とな
   るような数である］で表され、かつ、０.２重量％水溶
   液としたときの下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）が１０℃
   〜４５℃であるコポリマーとオリゴもしくはポリヌクレ
   オチドまたはその誘導体である薬物との間で形成され
   た、該ヌクレオチドを生物学的な環境の特定部位に送達
   するための薬物コンプレックス。
9. 【請求項９】 該コポリマーと該ヌクレオチドとの間で
   形成されたコンプレックスを、該コンプレックスのＬＣ
   ＳＴを下廻る温度にさらすことで該コンプレックスを解
   離することができる請求項７記載のコンプレックス。