WO2010119583A1 - ポリマー－核酸複合体、並びにこれを用いた腫瘍細胞等のイメージング方法及び癌の治療用医薬組成物 - Google Patents

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WO2010119583A1
WO2010119583A1 PCT/JP2009/068155 JP2009068155W WO2010119583A1 WO 2010119583 A1 WO2010119583 A1 WO 2010119583A1 JP 2009068155 W JP2009068155 W JP 2009068155W WO 2010119583 A1 WO2010119583 A1 WO 2010119583A1
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polymer
peptide
nucleic acid
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片山佳樹
姜貞勲
戸井田力
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国立大学法人九州大学
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    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a gene carrier for tumor cell-specific gene expression, an imaging method for tumor cells, and a pharmaceutical composition for treating cancer.
  • a hydrophilic polymer carrying a cationic peptide was used to form a complex with pDNA. Transcription of pDNA is suppressed by steric hindrance in the complex state.
  • the cationic peptide supported on the hydrophilic polymer has a substrate sequence that selectively responds to signal transduction enzymes (hereinafter referred to as STPs) activated in diseased cells. As the peptide charge (cation) decreases, the pDNA dissociates from the complex.
  • STPs signal transduction enzymes
  • This targeting strategy is referred to as intracellular signal responsive drug and gene delivery system (D-RECS), and the target gene is expressed in cells in response to certain STPs, specifically protein kinase A and caspase-3.
  • a cationic polymer comprising a peptide portion that becomes a substrate for an enzyme that is specifically expressed in tumor cells and has a cationic property, and a hydrophilic polymer portion.
  • the enzyme include protein kinase C ⁇ .
  • Examples of the peptide include those containing a basic amino acid residue, and examples of the basic amino acid include lysine and / or arginine. Furthermore, as said peptide, what the amino acid sequence contains the amino acid sequence shown, for example by FKKQGSFAKKKK (sequence number 1) is mentioned preferably.
  • Examples of the cationic polymer of the present invention include those obtained by binding a plurality of the peptides to the hydrophilic polymer. Here, examples of the bond include graft bonds.
  • Examples of the cationic polymer of the present invention include those having a structure represented by the following general formula (I). [In the formula (I), R represents a peptide serving as a substrate for an enzyme expressed specifically in tumor cells and having a cationic property.
  • n and n each represent a value (%) of each monomer unit, m represents a value of 50 to 99, and n represents a value of 1 to 50. However, the value of (m + n) is 100.
  • the notation “/” indicates that the arrangement order of each monomer unit is arbitrary.
  • R represents a peptide serving as a substrate for an enzyme expressed specifically in tumor cells and having a cationic property.
  • x, y, and z are values indicating the abundance ratio (%) of each monomer unit, x represents a value of 50 to 99, y represents a value of 0 to 49, and z represents a value of 1 to 50. To express. However, the value of (y + z) is 1 to 50, and the value of (x + y + z) is 100.
  • a polymer-nucleic acid complex comprising the cationic polymer according to (1) above and a nucleic acid. Examples of the complex of the present invention include those in which the cationic polymer and the nucleic acid are bound by electrostatic interaction.
  • examples of the nucleic acid include at least one selected from the group consisting of DNA, RNA, PNA, and siRNA.
  • a device for imaging a tumor cell or tumor tissue comprising the complex according to (2) above.
  • examples of the nucleic acid contained in the complex include DNA encoding GFP or luciferase or a derivative thereof.
  • a method for imaging a tumor cell or tumor tissue comprising administering the complex according to (2) above to a subject or adding the complex to a test cell or test tissue.
  • examples of the nucleic acid contained in the complex include DNA encoding GFP or luciferase or a derivative thereof.
  • a pharmaceutical composition for treating cancer comprising the complex according to (2) above.
  • examples of the nucleic acid contained in the complex include DNA encoding a protein having antitumor activity.
  • a method for treating cancer comprising administering the complex according to (2) to a subject.
  • examples of the nucleic acid contained in the complex include DNA encoding a protein having antitumor activity.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of complex formation between a hydrophilic polymer carrying a cationic substrate peptide and plasmid DNA, reduction of positive charge due to phosphorylation of the substrate peptide to protein kinase, and dissociation of the complex thereby.
  • the chemical structures (amino acid sequences; SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively) of protein kinase C ⁇ (PKC ⁇ ) -responsive polymer 1 and negative control polymer 2 are shown below.
  • FIG. 2 (a) shows the expression of GFP in B16 skin cancer cells 24 hours after the microinjection of the complex. Red and green are Texas Red and GFP, respectively. Scale bar: 10 ⁇ m.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of complex formation between a hydrophilic polymer carrying a cationic substrate peptide and plasmid DNA, reduction of positive charge due to phosphorylation of the substrate peptide to protein kinase, and dissociation of the complex thereby.
  • FIG. 2 (b) shows the expression of luciferase in B16 skin cancer cells 24 hours after the introduction of the complex [ratio of positive charge / negative charge (C / A)]. Error bars show the standard deviation for three experiments. **: P ⁇ 0.01.
  • FIG. 2 (c) shows luciferase activity in normal subcutaneous tissue and B16 tumor-bearing mice 24 hours after local administration of polymers 1 and 2 and their respective conjugates (C / A ratio 2.0).
  • FIG. The number of mice whose luciferase expression was confirmed in all mice is shown below. Arrows and circles indicate the administration site of the complex and cancer tissue in cancer-bearing mice, respectively.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of the phosphorylation reaction of peptide 1 by extracts of cancer cells, cancer tissues, and normal tissues.
  • the phosphorylation rate was calculated from the results of matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF / MS). Error bars are standard deviations relative to the average of three experiments.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of a toxicity experiment on the cells of the synthesized polymer. The cells were cultured for 24 hours on 48-well dishes in the presence or absence of polymer (0-30 ⁇ g / mL) and Lipofectamine 2000 (10 ⁇ g / mL).
  • FIG. 5A is a diagram showing a change in relative scattering intensity with respect to polyplex dispersion after the start of the enzyme reaction of PKC ⁇ .
  • FIG. 5 (b) is a diagram showing the results of tracking the phosphorylation reaction of a peptide by a coupled-enzyme assay after complex formation. The enzyme reaction was started by adding ATP to the mixed solution of the complex and PKC ⁇ , and the time was 0 minute. The charge (C / A) ratio of the composite was 2.0.
  • FIG. 7 (a) shows the results of GFP expression in HuH-7 cells 24 hours after microinjection of the complex. The red and green colors are due to Texas Red and GFP, respectively. Scale bar: 10 ⁇ m.
  • FIG. 7 (c) shows the results of luciferase expression in HuH-7 cells 24 hours after introduction of the complex (C / A ratio 2.0). Error bars show the standard deviation for three experiments. Inhibitor: Ro31-7549; **: P ⁇ 0.05.
  • FIG. 8 shows the results of luciferase expression (C / A ratio 1.0 and 2.0) in B16 skin cancer cells 24 hours after introduction of the complex or Lipofectamine 2000 (10 ⁇ g / mL) and pDNA, respectively.
  • FIG. Error bars show the standard deviation for three experiments. Inhibitor: Ro31-7549; *: P ⁇ 0.05; **: P ⁇ 0.01.
  • FIG. 8 shows the results of luciferase expression (C / A ratio 1.0 and 2.0) in B16 skin cancer cells 24 hours after introduction of the complex or Lipofectamine 2000 (10 ⁇ g / mL) and pDNA, respectively.
  • FIG. Error bars show the standard deviation for three experiments. Inhibitor
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of Western blotting of extracts of normal skin and B16 cancer tissue.
  • pPKC ⁇ represents active PKC ⁇ in which serine 657 residue is phosphorylated. From the results of Western blotting, the level of active PKC ⁇ was higher in B16 skin cancer tissue than in normal skin tissue. Therefore, B16 melanoma tumor-bearing mice were used as model mice.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of Western blotting of extracts of normal skin and B16 cancer tissue.
  • pPKC ⁇ represents active PKC ⁇ in which serine 657 residue is phosphorylated. From the results of Western blotting, the level of active PKC ⁇ was higher in B16 skin cancer tissue than in normal skin tissue. Therefore, B16 melanoma tumor-bearing mice were used as model mice.
  • FIG. 11 is a diagram showing the result of confirming the presence or absence of disintegration due to the phosphorylation reaction of a complex prepared using each cationic polymer (LPEI (S), LPEI (A)) by dynamic light scattering measurement.
  • FIG. 12 shows luciferase gene expression levels when complexes prepared using each cationic polymer (LPEI (S), LPEI (A), PPC (S)) were transfected into HepG2 human liver cancer cells. It is a figure which shows the result of luciferase activity).
  • FIG. 12A is a diagram showing the results of measuring the gene expression level of the complex prepared using LPEI (S) and LPEI (A) for each of various N / P ratios.
  • FIG. 12 (B) is a diagram showing the results of comparing the gene expression levels of the complex prepared using PPC (S) and the complex prepared using LPEI (S) and LPEI (A). is there.
  • FIG. 12C is a diagram showing the results of measuring the gene expression level of the complex prepared using LPEI (S) and LPEI (A) over time.
  • FIG. 13 shows luciferase gene expression levels when complexes prepared using each cationic polymer (PPC (S), PPC (A)) were transfected into HepG2 human liver cancer cells and B16 skin cancer cells. It is a figure which shows the result of luciferase activity).
  • FIG. 13 (A) shows the results when transfected into HepG2 human liver cancer cells.
  • FIG. 13 (B) shows the results when B16 skin cancer cells were transfected.
  • An object of the present invention is to develop a gene delivery system that selectively responds to disease cell-specific STPs (signal transduction enzymes activated in disease cells) and has cell permeability. (See FIG.
  • the present inventor selected protein kinase C ⁇ (PKC ⁇ ) that is abnormally expressed in almost all cancer types and not expressed in normal tissues as a target marker for cancer cells.
  • PKC ⁇ protein kinase C ⁇
  • it is considered to be very difficult to search for a substrate peptide having excellent selectivity and sensitivity for a certain kinase.
  • PKC protein kinase C
  • the inventor creates a library having 1,700 or more candidate peptides based on a computer program (scan site), from which a peptide having an amino acid sequence of H-FKKQGSFAKKKK-NH 2 (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 1)
  • peptide 1) shows the best selectivity and sensitivity for PKC ⁇ (see FIG. 1).
  • the present inventor examined the reactivity of the substrate peptide to PKC ⁇ in cancer cells using various cancer cell lines, and all the cancer cell line extracts used showed high phosphorylation rates. On the other hand, in the presence of a PKC ⁇ selective inhibitor, the phosphorylation reaction was substantially suppressed. From these results, it was shown that peptide 1 has specificity for PKC ⁇ .
  • Peptide 1 is a selective and sensitive substrate for cancer cells and tissues.
  • the present inventor has obtained a hydrophilic polymer separately from peptide 1 and a negative control peptide (in which serine (Ser), which is a phosphorylation site in peptide 1 is substituted with alanine (Ala); hereinafter, peptide 2).
  • Cationic polymers 1 and 2 produced by being supported (bonded) to each other were synthesized.
  • complexes of cationic polymers 1 and 2 and plasmid DNA (pDNA) were prepared at various positive / negative charge (C / A) charge ratios.
  • the average particle size of the composite was not more than a certain size (200 nm or less) regardless of the C / A ratio.
  • the zeta potential value of the complex increased with increasing C / A ratio.
  • the cationic polymer did not show any cytotoxicity.
  • the complex showed a sharp decrease in scattered light intensity, and this decrease coincided with the decrease in absorbance at 340 nm (A 340 ) (meaning consumption of ATP) over time.
  • a 340 meaning consumption of ATP
  • changes in scattered light intensity and A340 could not be confirmed.
  • a tumor-bearing mouse model prepared by administering B16 skin cancer cells into the mouse skin a complex of polymers 1 and 2 and a pDNA encoding luciferase (C / A ratio 2.0) was used as a tumor-bearing mouse and normal After direct administration to the intradermal tissue, gene expression was evaluated with a bioluminescence imager (see FIG. 2 (c)).
  • luciferase activity could not be confirmed from all mice, but when administered to tumor-bearing mice, luciferase activity was confirmed from more than half of cancer tissues (6/9). (See FIG. 2 (c)).
  • the complex prepared using Polymer 2 luciferase activity could not be confirmed even when administered to normal subcutaneous tissue or to tumor-bearing mice, and gene expression was completely suppressed.
  • the level of active PKC ⁇ was higher in B16 skin cancer tissue than in normal skin tissue. From these results, it was clarified that the complex prepared using Polymer 1 is capable of cancer cell-selective gene expression in response to PKC ⁇ activity in cancer cells.
  • the present invention has found a gene delivery system that applies protein kinase activity for tumor cell-specific gene expression. In gene therapy for cancer aimed at killing tumor cells, expression of foreign genes in normal cells should be avoided as much as possible, but this system is extremely useful in that it can realize tumor cell selective and safe gene therapy.
  • the system can be fused with techniques such as receptor-mediated gene delivery and improvement of pDNA promoter, which are generally used as a disease site targeting method, and further enhance selectivity and safety. It can also be increased.
  • Cationic Polymer-Nucleic Acid Complex (1) Cationic Polymer of the present invention is a substrate for an enzyme that is specifically expressed in tumor cells and has a cationic peptide portion, a hydrophilic polymer portion, Is included.
  • the peptide part is a peptide comprising an amino acid sequence serving as a substrate for an enzyme that is specifically expressed in tumor cells and an amino acid residue that imparts a cationic property.
  • the amino acid sequence serving as a substrate for the enzyme and a cationic property may have an amino acid sequence that serves as a linker that binds to an amino acid residue that imparts, and a sequence that serves as a linker for binding to the skeleton of the hydrophilic polymer portion.
  • protein kinase C ⁇ (PKC ⁇ ) is preferably mentioned as an enzyme that is specifically expressed in tumor cells.
  • the amino acid residue imparting cationicity include those contained in basic amino acid residues, specifically, lysine, arginine and histidine. Among them, lysine and arginine are preferable.
  • the amino acid sequence that serves as a substrate for the enzyme specifically expressed in tumor cells is preferably one that is selectively recognized by the target enzyme (PKC ⁇ ) and is phosphorylated at or near the recognition site. .
  • PLC ⁇ target enzyme
  • part or all of the cations of the whole peptide (and thus the whole cationic polymer) may be neutralized by the action (phosphorylation) of the target enzyme.
  • the length of the peptide is not particularly limited, but is preferably about 10 to 50 amino acid residues, more preferably 10 to 30 amino acid residues, and still more preferably 10 to 20 amino acid residues.
  • the amino acid sequence of the peptide is not particularly limited, but is preferably a peptide including the amino acid sequence represented by FKKQGSFAKKKK (SEQ ID NO: 1) in one-letter code of amino acid, and consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Peptides are more preferred because of their high selectivity and sensitivity to PKC ⁇ .
  • the peptide lacks one or several amino acids (for example, about 1 to 5, preferably about 1 to 3, more preferably about 1 to 2) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a peptide comprising an amino acid sequence that has been deleted, substituted or added, and comprising an amino acid sequence that serves as a substrate for an enzyme (particularly PKC ⁇ ) specifically expressed in tumor cells and an amino acid residue that imparts cationic properties is also preferred.
  • the serine residue (S) is a particularly important amino acid for being specifically and selectively recognized by PKC ⁇ , and therefore the object of deletion or substitution described above. It is preferably not a residue.
  • the peptide can be appropriately prepared so as to have a target amino acid sequence by various conventionally known automatic peptide synthesizers.
  • the hydrophilic polymer portion is responsible for the skeleton structure of the cationic polymer of the present invention, and may be any hydrophilic (water-soluble) polymer, and is not particularly limited, but has exceptional physiological activity in vivo. Those not present or those having biocompatibility are preferred. Moreover, since the aspect which uses the said peptide part couple
  • the hydrophilic polymer may be a homopolymer or a copolymer, and in the case of a copolymer, it may be a block copolymer or a random copolymer, and is not limited.
  • the hydrophilic polymer when the peptide is bound to an insoluble substance, it is designed so that the polymer as a whole becomes hydrophilic by using a monomer component capable of forming a hydrophilic polymer. May be.
  • a cationic polymer of this invention What has a structure shown by the following general formula (I) is mentioned preferably.
  • R represents a peptide that becomes a substrate for an enzyme expressed specifically in tumor cells and has a cationic property, and the description of the peptide is as described above.
  • the complex of the present invention represented by the above formula (I) those having a structure represented by the following general formula (I ′) are more preferable.
  • m and n are values indicating the abundance (%) of each monomer unit in the polymer molecule, and m is 50 to 99 (preferably 60 to 99, more preferably 70 to 99, more preferably 80 to 99), and n is 1 to 50 (preferably 1 to 40, more preferably 1 to 30, and further preferably 1 to 20). Represents a value.
  • R represents a peptide that is a substrate for an enzyme expressed specifically in tumor cells and has a cationic property, and the description of the peptide is as described above.
  • the complex of the present invention represented by the above formula (II) one having a structure represented by the following general formula (II ′) is more preferable.
  • x, y and z are values indicating the proportion (%) of each monomer unit in the polymer molecule, and x is 50 to 99 ( Preferably, it represents a value of 60 to 99, more preferably 70 to 99, y represents a value of 0 to 49 (preferably 1 to 30, more preferably 1 to 20), and z represents a value of 1 to 50 (preferably It represents a value of 1 to 40, more preferably 1 to 30).
  • the value of (y + z) is 1 to 50 (preferably 1 to 40, more preferably 1 to 30), and the value of (x + y + z) is 100.
  • the monomer units represented by the abundance ratios of y and z may be arbitrarily arranged in any order (randomly connected in any order) You may). However, all the monomer units are linked in a straight chain. Similarly, the arrangement order of the monomer unit represented by the abundance ratio of x and the block unit composed of two types of monomer units represented by the abundance ratio of (y + z) may be arbitrary. Can be connected in any order.) However, the monomer unit and the block unit are all linked linearly.
  • hydrophilic polymer and the cationic polymer of the present invention in which the peptide moiety is bound to the polymer a conventionally known synthesis method such as the method described in Examples (Examples 1 and 3) described later is used. Can be appropriately prepared. Specifically, when an acrylic acid-methacrylic acid copolymer is used as the hydrophilic polymer, methacrylic acid is amidated at the N-terminus of the peptide to form N-peptide methacrylic acid, and acrylic acid amide is used. A method of synthesizing the cationic polymer of the present invention by copolymerization is preferred. The outline of this synthesis method is shown in the following scheme.
  • nucleic acid used in the present invention is not particularly limited as long as it exhibits anionic property as a whole, and examples thereof include DNA, RNA, PNA (peptide nucleic acid), plasmid DNA, antisense oligo DNA and siRNA and the like are preferred, but DNA, particularly plasmid DNA is preferred.
  • other high molecular weight or low molecular weight “anionic substances” can be used together with or in place of the nucleic acid as necessary. Specifically, it may be any substance that exhibits anionicity as a whole (including those having a negative charge), such as various physiologically active proteins such as fluorescent proteins (GFP, etc.) and enzymes, peptides, peptide hormones, or molecules.
  • the complex of the present invention is a polymer-nucleic acid complex containing a cationic polymer and a nucleic acid.
  • the mode of using a high molecular weight or low molecular weight “anionic substance” together with or in place of a nucleic acid as a combination with a cationic polymer is the same as in the case of a nucleic acid. Can be provided (and so on).
  • the form of conjugation in the complex of the present invention is not limited, but is preferably one in which a cationic polymer and a nucleic acid are bound by electrostatic interaction. Since the cationic polymer of the present invention has a cationic peptide portion, it can form a strong ion complex due to electrostatic interaction with a nucleic acid or the like and can be used as a stable complex.
  • the complex of the present invention has a cationic property due to a specific negative charge imparted to the peptide moiety by the action (phosphorylation) of an enzyme (PKC ⁇ ) corresponding to a specific signal response in tumor cells and tumor tissues. Lost or reduced.
  • the present invention is to administer the above-mentioned cationic polymer-nucleic acid complex to a subject (cancer patient or healthy person), or to a test cell or test tissue (such as collected from a subject).
  • DNA encoding various proteins used in fluorescent imaging techniques such as various fluorescent proteins can be used as the nucleic acid used in the complex, preferably GFP (green fluorescent protein) or luciferase or its DNA encoding a derivative.
  • GFP green fluorescent protein
  • luciferase DNA encoding a derivative.
  • the specific imaging apparatus is not particularly limited, and apparatuses conventionally used in the fluorescence imaging technology can be used in appropriate combination.
  • the present invention can provide a pharmaceutical composition for treating cancer comprising the cationic polymer-nucleic acid complex described above.
  • DNA encoding various proteins having known antitumor activity can be used as the nucleic acid used in the complex.
  • the pharmaceutical composition of the present invention adversely affects other normal cells. No (that is, without side effects), the therapeutic effect of cancer can be exerted. Therefore, in this invention, the therapeutic method of cancer including administering the cationic polymer-nucleic acid complex mentioned above to a test subject (cancer patient) can also be provided.
  • the administration form to the patient may be oral administration or parenteral administration (intravenous injection), and is not limited.
  • the dosage and the like are the patient's age, weight, sex, It can be set as appropriate in consideration of various circumstances such as a disease state.
  • use of the cationic polymer-nucleic acid complex mentioned above for manufacturing the medicine for cancer treatment can also be provided.
  • the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
  • the developing solvent used was acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid and ultrapure water, and the flow rate was 3.0 mL / min.
  • the purified peptide was lyophilized to give a white solid. It was confirmed by MALDI TOF-MS (PerSeptive Biosystems) that it was the target product.
  • the cell extract was prepared by the following procedure. Various cells (1 ⁇ 10 7 cells) were homogenized with 0.2 mL of buffer solution [250 mM sucrose, Complete TM protease inhibitor cocktail (without EDTA) (20 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing Roche)]. did.
  • mice After sonication for 10 seconds and centrifugation at 5,000 ⁇ g for 15 minutes at 4 ° C., the supernatant was used for peptide phosphorylation.
  • Normal and cancer tissue extracts were prepared by the following procedure. Tissue removed from mice was homogenized with 1 mL of buffer solution [250 mM sucrose, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing Complete TM protease inhibitor cocktail (no EDTA) (Roche)], 900 ⁇ g, 4 ° C. And centrifuged for 10 minutes, and the supernatant was discarded. The precipitate was added with 1 mL of the above buffer solution, centrifuged and washed.
  • ammonium persulfate (2.6 mg, 11.4 ⁇ mol) and tetramethylene-ethylenediamine (3.4 ⁇ l, 22.6 ⁇ mol) were added for polymerization.
  • the solution was put in a dialysis membrane (fraction molecular weight 50,000), dialyzed with pure water, and then freeze-dried to obtain a white target polymer.
  • the hydrophilic polymer to which the peptide 1 is bound is prepared as a cationic polymer 1 (sometimes simply referred to as polymer 1), and the hydrophilic polymer to which the peptide 2 is bound is converted to a cationic polymer. 2 (sometimes simply referred to as Polymer 2).
  • the structure of the polymer 1 is a structure represented by the following formula.
  • the structure in which peptide 2 is bonded instead of peptide 1 is the structure of polymer 2.
  • m 94.5 [Polymer 1], 93.5 [Polymer 2]
  • n 5.5 [Polymer 1], 6.5 [Polymer 2].
  • m and n are values indicating the abundance (%) of each monomer unit in the polymer (polymer 1 and polymer 2) molecule, respectively.
  • the notation “/” indicates that the arrangement order of each monomer unit is arbitrary.
  • the introduction rate (mol%) of peptide in polymer 1 and polymer 2 was calculated from the results of elemental analysis.
  • the molecular weights of Polymer 1 and Polymer 2 were calculated from gel filtration chromatography (GPC). GPC analysis is two columns (TSKgel G5000PW XL, TSKG6000PW XL) was carried out in Shimadzu GPC system equipped with. GPC measurement and molecular weight were determined using 0.5 M acetate buffer (pH 4.1) containing 0.1 M NaNO 3 as a developing solvent, a flow rate of 0.45 mL / min, and polyethylene oxide as a standard substance. These results are shown in Table 1 below. 4). Plasmid DNA PCMV-luc plasmid DNA (pDNA) encoding firefly luciferase and having a CMV promoter is described in “T.
  • pDNA Plasmid DNA PCMV-luc plasmid DNA
  • the obtained complex aqueous solution was diluted with a buffer solution and used for each experiment. 6).
  • Measurement of zeta potential and particle size of complex The zeta potential and particle size of the complex were measured using Zetasizer (Malvern Instruments, UK). The measurement was performed using a He / Ne laser at a detection angle of 173 degrees and a temperature of 25 ° C.
  • the final concentration of pDNA was adjusted to 5 ⁇ g / mL with 10 mM Tris-HCl buffer solution (pH 7.5).
  • the complex aqueous solution was diluted in the following measurement solution (15 ⁇ L); 25.6 nM peptide, 1 mM MgCl 2 , 0.5 mM CaCl 2 , 100 ⁇ M ATP, 2.0 mg / mL DAG, 2.5 ⁇ g / mL PS, 1 ng / mL PKC ⁇ , 10 mM HEPES (pH 7.3).
  • the reaction was started by adding PKC ⁇ at 25 ° C. The result is shown in FIG. 2. Tracking of the phosphorylation reaction of the complex by the coupled enzyme assay The phosphorylation reaction of the side chain peptide during the formation of the complex was tracked by the coupled enzyme assay.
  • the complex solution was diluted to the following measurement solution (100 [mu] L); 32 .mu.M peptide, 1mM phosphoenolepyruvate, nicotinamide adenine dinucleotide ( NADH), 1U / ⁇ L lactate dehydrogenase (LDH), 4U / ⁇ L pyruvate kinase, 1mM MgCl 2, 0.5mM CaCl 2, 100 ⁇ M ATP, 2.0mg / mL DAG, 2.5 ⁇ g / mL PS, 1ng / mL PKC ⁇ , 10mM HEPES (pH7.3).
  • the reaction was started by adding PKC ⁇ at 25 ° C.
  • Cytotoxicity evaluation includes 4- [3- (2-methoxy-4-nitrophenyl) -2- (4-nitrophenyl) -2H-5-tetrazolio] -1,3-benzen disulphonate sodium salt The test was performed using WST-1 cell counting kit (DOJINDO Laboratories, Kumamoto, Japan).
  • HuH-7 liver cancer cells and B16 skin cancer cells were cultured in a 48-well petri dish, and Polymer 1 and Polymer 2 (0 to 30 ⁇ g / mL) and Lipofectamine 2000 (10 ⁇ g / mL) as a transfection reagent were added, and 24 Incubated for hours. The medium in each well was replaced with a fresh medium containing WST-1, and the absorbance at 440 nm was measured after incubation for 3 hours. The cell viability (%) was calculated from the absorbance of untreated cells (control cells) and treated cells. The results are shown in FIG. 4). Microinjection experiment HuH-7 liver cancer cells and B16 skin cancer cells were cultured in a 6-well petri dish for 24 hours.
  • a complex of Lipofectamine 2000 (10 ⁇ g / mL) and pDNA (2.5 ⁇ g / mL) was also transfected into B16 skin cancer cells. After incubation at 37 ° C. for 6 hours, the medium was changed to DMEM medium containing penicillin (100 U / mL), streptomycin (100 ⁇ g / mL), ampotericin B (0.25 ⁇ g / mL), 10% FBS (serum), and further incubated for 24 hours. did. The cells were detached and the cells were lysed with 200 ⁇ L of lysis buffer (100 mM Tris-HCl, pH 7.2, 0.05% Triton-X 100, 2 mM EDTA).
  • lysis buffer 100 mM Tris-HCl, pH 7.2, 0.05% Triton-X 100, 2 mM EDTA.
  • the sample was centrifuged at 10,000 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C., and the supernatant was collected. 10 ⁇ L of the obtained supernatant and 40 ⁇ L of luciferin substrate were mixed, and chemiluminescence was measured with MiniLumant LB 9506 (EG & G Berthold, Wildbad, Germany), and indicated by relative luminescent units (RLU) / mg total. The results are shown in FIG. 7 (c) and FIG. 6).
  • Western blotting The cell extract was prepared by the following method.
  • TM protease inhibitor cocktail (without EDTA) (Roche) was added, and the mixture was allowed to stand on ice for 15 minutes to prepare a cell extract.
  • the cell extract is centrifuged to remove insoluble substances, and immunoblotting is performed using an anti-PKC ⁇ antibody (Cell Signaling), an anti-phosphorylated PKC ⁇ antibody (Ser657) (UPSTATE), and an anti-actin antibody (Santa Cruz Biotechnology).
  • the protein was visualized by chemiluminescence.
  • Preparation of extracts of normal skin tissue and B16 skin cancer tissue was performed by the following method. Each tissue was removed from the mouse and homogenized with 1 mL of buffer solution [20 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing Complete TM protease inhibitor cocktail (no EDTA) (Roche)]. After sonication for 10 seconds and centrifugation at 5,000 ⁇ g for 15 minutes at 4 ° C., the supernatant was used for peptide phosphorylation. Normal and cancer tissue extracts were prepared by the following procedure.
  • Tissue removed from mice was homogenized with 1 mL of buffer solution [250 mM sucrose, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing Complete TM protease inhibitor cocktail (no EDTA) (Roche)], 900 ⁇ g, 4 ° C. And centrifuged for 10 minutes, and the supernatant was discarded. The precipitate was added with 1 mL of the above buffer solution, centrifuged and washed. 1 mL of buffer solution was newly added, sonicated for 30 seconds, centrifuged at 5,000 ⁇ g, 4 ° C. for 15 minutes, and the supernatant was used for Western blotting. The results are shown in FIG. 7).
  • mice were anesthetized and 300 ⁇ L of 15 mg / mL D-luciferin Ringer's solution was administered intraperitoneally.
  • Chemiluminescence was detected with a cooled C4742-98-26G02 CCD camera (Hamamatsu Photonics Systems), and contrast and brightness were analyzed with Adobe Photoshop 6.0 software. The light emission time for chemiluminescence was 10 minutes.
  • the cells were lysed with 1 mL of lysis buffer (100 mM Tris-HCl, pH 7.2, 0.05% Triton-X 100, 2 mM EDTA).
  • lysis buffer 100 mM Tris-HCl, pH 7.2, 0.05% Triton-X 100, 2 mM EDTA.
  • the sample was centrifuged at 10,000 ⁇ g for 10 minutes at 14 ° C., and the supernatant was collected.
  • 10 ⁇ L of the obtained supernatant and 40 ⁇ L of luciferin substrate were mixed, and chemiluminescence was measured with MiniLumant LB 9506 (EG & G Berthold, Wildbad, Germany), and indicated by relative luminescent units (RLU) / mg total.
  • RLU relative luminescent units
  • the developing solvent used was acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid and ultrapure water, and the flow rate was 3.0 mL / min.
  • the purified peptide was lyophilized to give a white solid. It was confirmed by MALDI TOF-MS (PerSeptive Biosystems) that it was the target product.
  • the azide peptide derived from peptide 1 was designated as peptide 1 ′
  • the azide peptide derived from peptide 2 was designated as peptide 2 ′.
  • LPEI (S) and LPE (A) were synthesized according to the following scheme (for specific description, see the following items (2) and (3)).
  • 5-chloro- 1-pentyne [718 mg, 7.0 mmol (Tokyo Chemical Industry)]
  • LPEI (A) yellow-brown solid LPEI-Peptide
  • S yellow-brown solid LPEI-Peptide
  • S yellow-brown solid LPEI-Peptide
  • S yellow-brown solid LPEI-Peptide
  • S yellow-brown solid LPEI-Peptide
  • S yellow-brown solid LPEI-Peptide
  • S yellow-brown solid LPEI-Peptide
  • S yellow-brown solid LPEI-Peptide
  • the peptide modification rate of each cationic polymer was calculated by determining the amount of primary amine derived from the supported peptide by the TNBS method.
  • the peptide modification rate (Peptide content) and molecular weight of each cationic polymer are shown in Table 3 below.
  • S The decay behavior of the complex by phosphorylation reaction was evaluated by the change over time in the scattering intensity value during dynamic light scattering measurement. Since the light is scattered when the complex is formed, the scattering intensity value is high. However, when the complex breaks down, it cannot be scattered and the scattering intensity value decreases.
  • the prepared complex aqueous solution was converted into a phosphorylation reaction solution [final concentrations of 0.2 mM ATP, 1 mM MgCl 2 , 0.5 mM CaCl 2 , 2 mg / mL diacylglycerol, 100 ⁇ g / mL phosphatidylserine 10 mM HEPES-NaOH buffer. Solution (containing pH 7.3)] was made up to 49 ⁇ L. Thereafter, 1 ⁇ L of commercially available PKC ⁇ (Sigma-Aldrich, 110 mg / mL) was added, and measurement of the scattering intensity value was started immediately after the addition. The measurement was performed with Zeta-Sizer (Malvern, UK).
  • PPC (S) is a polymer carrying peptide 1 having a structure represented by the following formula.
  • PPC (A) a polymer carrying peptide 2 instead of peptide 1 is designated as PPC (A).
  • Example 1 can be referred to for the preparation method of PPC (S) and PPC (A).
  • M and n are values indicating the abundance (%) of each monomer unit in the polymer (PPC (S) and PPC (A) molecules, respectively. This means that the arrangement order of units is arbitrary.
  • (1) Materials and Methods HepG2 human liver cancer cells were cultured in a 48-well petri dish for 2 days at an initial density of 25,000 cells / well.
  • LPEI (S) is used as a PKC ⁇ responsive polymer
  • LPEI (A) is a PKC ⁇ non-responsive polymer (negative control) carrying a peptide in which a serine residue at the phosphorylation site is substituted with an alanine residue. used.
  • the above-described pCMV-luc plasmid DNA was used as the pDNA.
  • Opti-MEM solution in D-MEM medium [containing penicillin (100 U / mL), streptomycin (100 ⁇ g / mL), amphotericin B (0.25 ⁇ g / L), 10% FBS (serum)].
  • D-MEM medium containing penicillin (100 U / mL), streptomycin (100 ⁇ g / mL), amphotericin B (0.25 ⁇ g / L), 10% FBS (serum)].
  • the LPEI (S) complex dramatically improved the gene expression level in response to PKC ⁇ activity.
  • the PKC ⁇ responsiveness of the PPC (S) complex was prepared using approximately PPC (A) from the results of PPC (S) and PPC (A) shown in FIGS. 13 (A) and (B).
  • the PKC ⁇ responsiveness of the LPEI (S) complex is 10 times that of the complex, but the results of LPEI (S) and LPEI (A) in FIG. It was shown to be about 145 times, and it was confirmed that the LPEI (S) complex dramatically improved the function of PKC ⁇ responsiveness. Furthermore, according to the results of FIG.
  • a cationic polymer that can be used as a gene carrier for tumor cell-specific gene expression, and a polymer-nucleic acid complex containing the polymer and a nucleic acid of a target gene can be provided.
  • the polymer-nucleic acid complex of the present invention is extremely practical in the field of cancer treatment or prevention in that it can be conveniently and effectively used for imaging of tumor cells or tumor tissue and cancer treatment (gene therapy). It is expensive.
  • SEQ ID NO: 1 Synthetic peptide
  • SEQ ID NO: 2 Synthetic peptide

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Abstract

　本発明は、腫瘍細胞特異的に目的遺伝子を発現させるための遺伝子キャリアや、それを用いた腫瘍細胞又は腫瘍組織のイメージング方法、及び癌の治療用医薬組成物を提供する。本発明の遺伝子キャリアとしてのカチオン性ポリマーは、腫瘍細胞特異的に発現する酵素の基質となり且つカチオン性を有するペプチド部分と、親水性ポリマー部分とを含むことを特徴とするものである。

Description

ポリマー−核酸複合体、並びにこれを用いた腫瘍細胞等のイメージング方法及び癌の治療用医薬組成物
　本発明は、腫瘍細胞特異的な遺伝子発現のための遺伝子キャリア、腫瘍細胞等のイメージング方法、及び癌の治療用医薬組成物等に関する。
　安全かつ効率よい遺伝子治療を目指した遺伝子キャリアの開発は、最近２０年間、幅広く研究されてきた。現在、疾病に特異的な遺伝子を発現させる手法は遺伝子治療において最も重要な課題の一つである。これは、癌および炎症性疾患の治療に対して用いる細胞を死滅させる薬理活性の強い治療用遺伝子においては、特に重要である。これらの観点から、以下のような二つの戦略、すなわち、疾病細胞特異的なリガンド分子を利用するアクティブターゲッティング法と、疾病細胞特異的プロモーターを搭載したプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を利用する手法とが開発された。
　これに対し、上記の戦略とは全く異なる新しい疾病細胞特異的な遺伝子ターゲッティングの戦略として、近年、疾病細胞内に存在するシグナル伝達経路の異常を認識する遺伝子転写制御システムが開発された。このシステムでは、カチオン性ペプチドを担持した親水性ポリマーが、ｐＤＮＡとの複合体の形成に用いられた。ｐＤＮＡの転写は複合体の状態では立体障害によって抑制される。一方、親水性ポリマーに担持されたカチオン性ペプチドは、疾病細胞内で活性化されているシグナル伝達酵素（以下ＳＴＰｓ）に選択的に応答する基質配列を有するものであり、ＳＴＰｓに応答して当該ペプチドの荷電（カチオン）が減少すると、ｐＤＮＡは複合体から解離される。このターゲッティング戦略は、細胞内シグナル応答型薬物及び遺伝子デリバリーシステム（Ｄ−ＲＥＣＳ）と称され、ある特定のＳＴＰｓ、具体的にはプロテインキナーゼＡ及びカスパーゼ３に応答して細胞内で目的の遺伝子を発現させることに成功している（特開２００３−３３１７８号公報参照）。
　しかしながら、プロテインキナーゼＡ及びカスパーゼ３は細胞内での活性が低く、細胞内での目的遺伝子の発現のためには、これらＳＴＰｓを活性化させる刺激剤を使用する必要があり、実用的ではなかった。さらに、複合体の表面電荷が中性であったため、低い導入効率も問題であり、導入効率を向上するために、複合体を不活性化したウイルス殻（エンベロープ）へ封入することも必要であり、複雑な工程が必要であった。
　ところで、癌の治療及び予防においては、腫瘍細胞の存在位置及び大きさ等を他の正常細胞と明確に区別して確認（イメージング）することが非常に重要であり、また、実際に遺伝子治療を行う場合も他の正常細胞にはなるべく影響を与えずに腫瘍細胞特異的に治療効果を発揮させることが、患者への負担軽減等の点で望ましい。
　このような状況下において、腫瘍細胞特異的に目的遺伝子を発現させるための遺伝子キャリアや、それを用いた腫瘍細胞又は腫瘍組織のイメージング方法、及び癌の治療用医薬組成物の開発が望まれていた。
　本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、カチオン性ポリマー、ポリマー−核酸複合体、腫瘍細胞又は腫瘍組織のイメージング方法、及び癌の治療用医薬組成物などを提供するものである。
（１）腫瘍細胞特異的に発現する酵素の基質となり且つカチオン性を有するペプチド部分と、親水性ポリマー部分とを含む、カチオン性ポリマー。
　本発明のカチオン性ポリマーにおいて、前記酵素としては、例えばプロテインキナーゼＣαが挙げられる。また、前記ペプチドとしては、例えば塩基性アミノ酸残基を含むものが挙げられ、当該塩基性アミノ酸としては、例えばリジン及び／又はアルギニンが挙げられる。さらに、前記ペプチドとしては、そのアミノ酸配列が、例えばＦＫＫＱＧＳＦＡＫＫＫ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列を含むものが好ましく挙げられる。
　本発明のカチオン性ポリマーは、例えば、前記親水性ポリマーに前記ペプチドが複数結合したものが挙げられる。ここで、当該結合としては、例えばグラフト結合が挙げられる。
　本発明のカチオン性ポリマーとしては、例えば、下記一般式（Ｉ）で示される構造を有するものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
〔式（Ｉ）中、Ｒは、腫瘍細胞特異的に発現する酵素の基質となり且つカチオン性を有するペプチドを表す。ｍ及びｎはそれぞれ各モノマー単位の存在割合（％）を示す値であり、ｍは５０~９９の値を表し、ｎは１~５０の値を表す。但し、（ｍ＋ｎ）の値は１００である。「／」の表記は、各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕
　また、本発明のカチオン性ポリマーとしては、例えば、下記一般式（ＩＩ）で示される構造を有するものが挙げられる。
〔式（ＩＩ）中、Ｒは、腫瘍細胞特異的に発現する酵素の基質となり且つカチオン性を有するペプチドを表す。ｘ、ｙ及びｚはそれぞれ各モノマー単位の存在割合（％）を示す値であり、ｘは５０~９９の値を表し、ｙは０~４９の値を表し、ｚは１~５０の値を表す。但し、（ｙ＋ｚ）の値は１~５０であり、（ｘ＋ｙ＋ｚ）の値は１００である。〕
（２）上記（１）に記載のカチオン性ポリマーと核酸とを含む、ポリマー−核酸複合体。
　本発明の複合体としては、例えば、前記カチオン性ポリマーと前記核酸とが静電的相互作用により結合したものが挙げられる。
　本発明の複合体において、前記核酸としては、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ及びｓｉＲＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
（３）上記（２）に記載の複合体を含む、腫瘍細胞又は腫瘍組織のイメージング用デバイス。
　本発明のデバイスにおいて、前記複合体に含まれる核酸としては、例えばＧＦＰ若しくはルシフェラーゼ又はその誘導体をコードするＤＮＡが挙げられる。
（４）上記（２）に記載の複合体を、被験者に投与する又は被験細胞若しくは被験組織に添加することを含む、腫瘍細胞又は腫瘍組織のイメージング方法。
　本発明のイメージング方法において、前記複合体に含まれる核酸としては、例えばＧＦＰ若しくはルシフェラーゼ又はその誘導体をコードするＤＮＡが挙げられる。
（５）上記（２）に記載の複合体を含む、癌の治療用医薬組成物。
　本発明の医薬組成物において、前記複合体に含まれる核酸としては、例えば抗腫瘍活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
（６）上記（２）に記載の複合体を被験者に投与することを含む、癌の治療方法。
　本発明の治療方法において、前記複合体に含まれる核酸としては、例えば抗腫瘍活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
　図１は、カチオン性基質ペプチドを担持した親水性ポリマーとプラスミドＤＮＡとの複合体形成および基質ペプチドがプロテインキナーゼにリン酸化されることによる正電荷減少とそれによる複合体の解離の模式図である。プロテインキナーゼＣα（ＰＫＣα）応答型ポリマー１とネガティブコントロールとなるポリマー２の化学構造（アミノ酸配列；それぞれ配列番号１及び配列番号２）は下に示した。
　図２（ａ）は、複合体のマイクロインジェクションから２４時間後、Ｂ１６皮膚がん細胞でのＧＦＰの発現を示す図である。赤および緑色はそれぞれテキサスレッドとＧＦＰ。スケールバー：１０μｍ。図２（ｂ）は、複合体［正電荷／負電荷（Ｃ／Ａ）比］の導入から２４時間後、Ｂ１６皮膚がん細胞でのルシフェラーゼの発現を示す図である。エラーバーは三度の実験に対する標準偏差を示したものである。＊＊：Ｐ＜０．０１。図２（ｃ）は、ポリマー１と２、それぞれの複合体（Ｃ／Ａ比２．０）を局所投与してから２４時間後の正常皮下組織およびＢ１６担がんマウスでのルシフェラーゼ活性を示したイメージを示す図である。総マウスに対してルシフェラーゼ発現が確認できたマウスの個体数は下に示した。矢印および丸印はそれぞれ複合体の投与部位と担がんマウスでのがん組織を示している。
　図３は、がん細胞、がん組織、および正常組織の抽出液によるペプチド１のリン酸化反応の結果を示す図である。リン酸化率はマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）の結果より算出した。エラーバーは三度行った実験の平均に対する標準偏差である。
　図４は、合成したポリマーの細胞に対する毒性実験の結果を示す図である。細胞はポリマー（０から３０μｇ／ｍＬ）およびリポフェクタミン２０００（１０μｇ／ｍＬ）の存在下あるいは非存在下で、４８穴シャーレ上で２４時間培養した。Ｃ／Ａ比２．０でのポリマー濃度は１０μｇ／ｍＬ以下である。細胞生存率（％）は非処理のコントロール細胞に対する処理した細胞の吸光度で標準化したものである。エラーバーは三度行った実験の平均に対する標準偏差である。
　図５（ａ）は、ＰＫＣαの酵素反応開始後、ポリプレックス分散に対する相対散乱強度の変化を示す図である。図５（ｂ）は、複合体形成後、カップルド−エンザイムアッセイによるペプチドのリン酸化反応の追跡の結果を示す図である。酵素反応は複合体とＰＫＣαとの混合液にＡＴＰ添加することで開始し、その時を０分とした。複合体の電荷（Ｃ／Ａ）比は２．０とした。
　図６は、マイクロインジェクションしたＢ１６メラノーマ細胞でのＧＦＰ強度（ｎ＝８）の測定結果を示す図である。ＧＦＰ強度はＧＦＰ発現に対するＡｄｏｂｅ　Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ　６．０ソフトウェアの分析によって得た。阻害剤：Ｒｏ３１−７５４９；ＮＳ：有意でない；＊：Ｐ＜０．００１。
　図７（ａ）は、複合体のマイクロインジェクションから２４時間後、ＨｕＨ−７細胞でのＧＦＰ発現の結果を示す図である。赤と緑の色はそれぞれテキサスレッドとＧＦＰによるものである。スケールバー：１０μｍ。図７（ｂ）は、マイクロインジェクションしたＨｕＨ−７細胞でのＧＦＰ強度（ｎ＝８）の測定結果を示す図である。ＧＦＰ強度は、ＧＦＰ発現に対するＡｄｏｂｅ　Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ　６．０ソフトウェアの分析によって得られた。阻害剤：Ｒｏ３１−７５４９；＊：Ｐ＜０．０００５。図７（ｃ）は、複合体（Ｃ／Ａ比２．０）の導入から２４時間後、ＨｕＨ−７細胞でのルシフェラーゼ発現の結果を示す図である。エラーバーは三度の実験に対する標準偏差を示したものである。阻害剤：Ｒｏ３１−７５４９；＊＊：Ｐ＜０．０５。
　図８は、複合体またはリポフェクタミン２０００（１０μｇ／ｍＬ）とｐＤＮＡ、それぞれの導入から２４時間後、Ｂ１６皮膚がん細胞でのルシフェラーゼ発現（Ｃ／Ａ比１．０および２．０）の結果を示す図である。エラーバーは三度の実験に対する標準偏差を示したものである。阻害剤：Ｒｏ３１−７５４９；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１。
　図９は、複合体の導入から２４時間後、皮膚およびＢ１６皮膚がん組織でのルシフェラーゼ活性（Ｃ／Ａ比２．０）の測定結果を示す図である。エラーバーは二度の実験に対する標準偏差を示したものである。＊：Ｐ＜０．０５。
　図１０は、正常皮膚およびＢ１６がん組織の抽出物のウエスタンブロッティングの結果を示す図である。ｐＰＫＣαはセリン６５７残基がリン酸化された活性型ＰＫＣαを示したものである。ウエスタンブロッティングの結果から活性型ＰＫＣαのレベルは正常皮膚組織よりＢ１６皮膚がん組織で高かった。したがって、Ｂ１６メラノーマ担癌マウスをモデルマウスとして用いた。
　図１１は、各カチオン性ポリマー（ＬＰＥＩ（Ｓ）、ＬＰＥＩ（Ａ））を用いて調製した複合体のリン酸化反応による崩壊の有無を、動的光散乱測定により確認した結果を示す図である。
　図１２は、各カチオン性ポリマー（ＬＰＥＩ（Ｓ）、ＬＰＥＩ（Ａ）、ＰＰＣ（Ｓ））を用いて調製した複合体を、ＨｅｐＧ２ヒト肝臓癌細胞にトランスフェクションしたときの、ルシフェラーゼ遺伝子発現レベル（ルシフェラーゼ活性）の結果を示す図である。図１２（Ａ）は、ＬＰＥＩ（Ｓ）及びＬＰＥＩ（Ａ）を用いて調製した複合体の遺伝子発現レベルについて、各種Ｎ／Ｐ比ごとに測定した結果を示す図である。図１２（Ｂ）は、ＰＰＣ（Ｓ）を用いて調製された複合体と、ＬＰＥＩ（Ｓ）及びＬＰＥＩ（Ａ）を用いて調製した複合体との遺伝子発現レベルを比較した結果を示す図である。図１２（Ｃ）は、ＬＰＥＩ（Ｓ）及びＬＰＥＩ（Ａ）を用いて調製した複合体の遺伝子発現レベルを、経時的に測定した結果を示す図である。
　図１３は、各カチオン性ポリマー（ＰＰＣ（Ｓ）、ＰＰＣ（Ａ））を用いて調製した複合体を、ＨｅｐＧ２ヒト肝臓癌細胞及びＢ１６皮膚癌細胞にトランスフェクションしたときの、ルシフェラーゼ遺伝子発現レベル（ルシフェラーゼ活性）の結果を示す図である。図１３（Ａ）は、ＨｅｐＧ２ヒト肝臓癌細胞にトランスフェクションしたときの結果を示す図である。図１３（Ｂ）は、Ｂ１６皮膚癌細胞にトランスフェクションしたときの結果を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
　なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２００９−１０１３９１号明細書（２００９年４月１７日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．本発明の概要
　本発明の目的は、疾病細胞特異的なＳＴＰｓ（疾病細胞内で活性化されているシグナル伝達酵素）に選択的に応答し、かつ、細胞透過能を持つ遺伝子送達システムを開発することである（図１参照）。本発明者は、ほとんど全ての癌種で異常発現し、正常組織では発現していないプロテインキナーゼＣα（ＰＫＣα）を癌細胞の標的マーカーとして選択した。一般的に、あるキナーゼに対して、優れた選択性と感度を持つ基質ペプチドの探索は、非常に難しいと考えられている。特に、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）ファミリーには多数のアイソザイムが存在するため、ＰＫＣα選択的基質の探索は極めて困難であった。本発明者は、コンピュータプログラム（スキャンサイト）に基づき、１，７００以上もの候補ペプチドを持つライブラリーを作製し、その中からＨ−ＦＫＫＱＧＳＦＡＫＫＫ−ＮＨ２（配列番号１）というアミノ酸配列を有するペプチド（以下、ペプチド１）がＰＫＣαに対する最良の選択性と感度を示すことを見出した（図１参照）。
　本発明者は、種々の癌細胞株を用いて癌細胞内のＰＫＣαに対する基質ペプチドの反応性を調べたところ、使用したすべての癌細胞株の抽出液は高いリン酸化率を示した。一方、ＰＫＣα選択的阻害剤の存在下では、リン酸化反応はほぼ抑制された。これらの結果から、ペプチド１はＰＫＣαに対する特異性を有していることが示された。さらに、移植した癌組織より作製した抽出液からも高いリン酸化率が得られたが、正常組織の抽出液によるリン酸化率は極めて低かった。これらの結果から、ペプチド１は癌細胞および組織に対する選択的かつ高感度な基質であることが示された。
　本発明者は、ペプチド１と、ネガティブコントロールペプチド（ペプチド１中のリン酸化部位であるセリン（Ｓｅｒ）をアラニン（Ａｌａ）に置換したもの；以下、ペプチド２）とを、それぞれ別に、親水性ポリマーに担持（結合）させて生成したカチオン性ポリマー１及び２を合成した。次いで、種々の正電荷／負電荷（Ｃ／Ａ）のチャージ比で、カチオン性ポリマー１及び２と、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）との複合体を調製した。複合体の平均粒径はＣ／Ａ比によらず一定サイズ以下（２００ｎｍ以下）であった。複合体のゼータ電位値はＣ／Ａ比の増加に伴い増加した。また、上記カチオン性ポリマーは、細胞毒性を全く示さなかった。
　次に、本発明者は、上記複合体中のペプチドがリン酸化されることで、ｐＤＮＡが解離できるかを、散乱光強度の変化を追跡することで確認したところ、ポリマー１を用いて調製した複合体では散乱光強度の急激な減少がみられ、この減少は、３４０ｎｍ（Ａ３４０）の吸光度の減少（ＡＴＰの消費を意味する）と経時的に一致した。一方、ポリマー２を用いて調製した複合体では散乱光強度とＡ３４０の変化は確認できなかった。これらの結果から、ペプチド１がリン酸化されることで、ポリマー１の正味の正電荷が減少（＋５から＋３）し、複合体中のポリマー１とｐＤＮＡとの静電相互作用が弱体化して、ｐＤＮＡが解離することが示された。
　次に、本発明者は、細胞内に存在するＰＫＣαに応答してｐＤＮＡが解離されるのか、さらに、解離されたｐＤＮＡによって遺伝子発現は起こるのかを確認するため、ポリマー１及び２とＧＦＰをコードするｐＤＮＡとの複合体を、ＰＫｃαが過剰発現されているＢ１６皮膚癌細胞へ直接マイクロインジェクションしたところ、ポリマー２を用いて調製した複合体の場合は、ＧＦＰの発現はＣ／Ａ比２．０で完全に抑えられた。一方、ポリマー１を用いて調製した複合体の場合は、複合体からはＧＦＰの発現が観察できた（図２（ａ）参照）。さらに、ＰＫＣα選択的阻害剤の存在下では、ポリマー１を用いて調製した複合体でも遺伝子発現は抑制された（図２（ａ）参照）。これらの結果は、細胞内ＰＫＣαによる酵素反応が引き金となり、ポリマー１を用いて調製した複合体の遺伝子発現が活性化されたことを示している。この結果は、ＨｕＨ−７（ヒト由来肝臓癌）細胞を用いた実験でも同様に確認できた。
　さらに、上記複合体のトランスフェクション能を確認するため、ルシフェラーゼをコードするｐＤＮＡを用いて実験を行ったところ、トランスフェクション実験においても上記マイクロインジェクション実験と類似の結果が得られた（図２（ｂ）参照）。すなわち、ポリマー１を用いて調製した複合体（Ｃ／Ａ比２．０）の方が、ポリマー２を用いて調製した複合体より高いルシフェラーゼ発現量を示した（図２（ｂ）参照）。したがって、高い正のゼータ電位を持つ複合体は膜透過が可能であることが確認された。
　次に、本発明者は、動物モデル（ｉｎ　ｖｉｖｏ）での評価も行った。Ｂ１６皮膚癌細胞をマウス皮内に投与して作製した担癌マウスモデルを用い、ポリマー１及び２とルシフェラーゼをコードするｐＤＮＡとの複合体（Ｃ／Ａ比２．０）を担癌マウスおよび正常皮内組織へ直接投与した後、生体用発光イメージャーにより遺伝子発現を評価した（図２（ｃ）参照）。ポリマー１を用いて調製した複合体を正常皮下組織へ投与すると全てのマウスからルシフェラーゼ活性は確認できなかったが、担癌マウスへ投与すると半数以上の癌組織（６／９）からルシフェラーゼ活性が確認できた（図２（ｃ）参照）。一方、ポリマー２を用いて調製した複合体の場合は、正常皮下組織へ投与しても、担癌マウスへ投与しても、ルシフェラーゼ活性は確認できず、遺伝子発現が完全に抑えられた。また、活性型ＰＫＣαのレベルは正常皮膚組織よりＢ１６皮膚癌組織で高かった。これらの結果から、ポリマー１を用いて調製した複合体は、癌細胞内のＰＫＣα活性に応答し、癌細胞選択的な遺伝子発現が可能であることが明らかとなった。
　以上の通り、本発明は、腫瘍細胞特異的な遺伝子発現のためにプロテインキナーゼ活性を応用した遺伝子デリバリーシステムを見出した。腫瘍細胞の死滅を目的とする癌の遺伝子治療では、正常細胞での外来遺伝子の発現は極力避けるべきであるが、当該システムは、腫瘍細胞選択的かつ安全な遺伝子治療が実現できる点で、極めて有用なものである。また、当該システムは、従来一般的に、疾病部位ターゲッティング法としてよく利用されるレセプター介在型遺伝子送達や、ｐＤＮＡプロモーターの改良などの技術との融合が可能であり、さらに一層選択性及び安全性を高めることもできる。
２．カチオン性ポリマー−核酸複合体
（１）カチオン性ポリマー
　本発明のカチオン性ポリマーは、前述した通り、腫瘍細胞特異的に発現する酵素の基質となり且つカチオン性を有するペプチド部分と、親水性ポリマー部分とを含むものである。
　上記ペプチド部分は、腫瘍細胞特異的に発現する酵素の基質となるアミノ酸配列、及びカチオン性を与えるアミノ酸残基を含有してなるペプチドであり、その他、当該酵素の基質となるアミノ酸配列とカチオン性を与えるアミノ酸残基とを結合させるリンカーとなるアミノ酸配列や、親水性ポリマー部分の骨格に結合するためのリンカーとなる配列を有してもよい。ここで、腫瘍細胞特異的に発現する酵素としては、プロテインキナーゼＣα（ＰＫＣα）が好ましく挙げられる。また、カチオン性を与えるアミノ酸残基としては、例えば、塩基性アミノ酸残基に含まれるもの、具体的にはリジン、アルギニン及びヒスチジンが挙げられ、中でもリジン及びアルギニンが好ましい。さらに、腫瘍細胞特異的に発現する酵素の基質となるアミノ酸配列としては、標的とする酵素（ＰＫＣα）により選択的に認識されるものであり、認識箇所又はその近傍においてリン酸化されるものが好ましい。結果として、標的とする酵素の作用（リン酸化）により、ペプチド全体（ひいてはカチオン性ポリマー全体）のカチオンの一部又は全部が中和されることになればよい。
　上記ペプチドの長さは、特に限定はされないが、例えば、１０~５０アミノ酸残基程度が好ましく、より好ましくは１０~３０アミノ酸残基、さらに好ましくは１０~２０アミノ酸残基である。
　上記ペプチドとしては、そのアミノ酸配列は、特に限定はされないが、アミノ酸の一文字表記で、ＦＫＫＱＧＳＦＡＫＫＫ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列を含むペプチドが好ましく、当該配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドが、ＰＫＣαに対する選択性及び感度が高く、より好ましい。また、上記ペプチドとしては、当該配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば１~５個程度、好ましくは１~３個程度、より好ましくは１~２個程度）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むものであって、腫瘍細胞特異的に発現する酵素（特にＰＫＣα）の基質となるアミノ酸配列及びカチオン性を与えるアミノ酸残基を含有してなるペプチドも好ましく挙げられる。ここで、当該配列番号１で示されるアミノ酸配列中、セリン残基（Ｓ）は、ＰＫＣαにより特異的かつ選択的に認識されるために特に重要なアミノ酸であるため、上記欠失又は置換の対象残基ではないことが好ましい。
　上記ペプチドは、従来公知の各種自動ペプチド合成装置等により、目的のアミノ酸配列を有するように適宜調製することができる。
　上記親水性ポリマー部分は、本発明のカチオン性ポリマーの骨格構造を担うものであり、親水性（水溶性）のポリマーであればよく、特に制限はされないが、生体内において格別の生理活性を持っていないものや、生体親和性を有するものが好ましい。また、当該親水性ポリマーは、前述したペプチド部分を結合（好ましくはグラフト結合）させて使用する態様が好ましいため、当該ペプチドを結合することができる何らかの官能基を有するものが好ましい。当該親水性ポリマーとしては、具体的には、例えば、アクリル酸系ポリマーやメタクリル酸系ポリマーが好ましく例示できるが、限定はされず、後述する核酸等の長さや分子量又は細胞への親和性などを考慮して適宜選択することができる。また、当該親水性ポリマーは、ホモポリマーでもコポリマーでもよいし、コポリマーの場合はブロックコポリマーでもランダムコポリマーでもよく、限定はされない。なお、当該親水性ポリマーにおいて、不溶性の物質に前記ペプチドが結合されている場合には、親水性の高分子を形成できるモノマー成分を使用することにより、ポリマー全体として親水性となるように設計してもよい。
　本発明のカチオン性ポリマーとしては、限定はされないが、下記一般式（Ｉ）で示される構造を有するものが好ましく挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
　上記式（Ｉ）中、Ｒは、腫瘍細胞特異的に発現する酵素の基質となり且つカチオン性を有するペプチドを表すが、当該ペプチドの説明については前述した通りである。ここで、上記式（Ｉ）で示される本発明の複合体としては、下記一般式（Ｉ’）で示される構造を有するものがさらに好ましいものとして挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　また、上記式（Ｉ）及び式（Ｉ’）中、ｍ及びｎは、それぞれ、ポリマー分子中に占める各モノマー単位の存在割合（％）を示す値であり、ｍは５０~９９（好ましくは６０~９９、より好ましくは７０~９９、さらに好ましくは８０~９９）の値を表し、ｎは１~５０（好ましくは１~４０、より好ましくは１~３０、さらに好ましくは１~２０）の値を表す。但し、（ｍ＋ｎ）の値は１００である。
　さらに、上記式（Ｉ）及び式（Ｉ’）中、「／」の表記は、その左右に示された各モノマー単位の配列順序が任意であることを意味する。例えば、Ａ及びＢというモノマー単位から構成され、［−（Ａ）ｍ—／—（Ｂ）ｎ−］と表記されている場合は、ｍ％のＡとｎ％のＢとからなる各モノマー単位が、ランダムにどのような並び順で連結していてもよいことを意味する。但し、すべてのＡ及びＢは、直鎖状に連結しているものである。
　また、本発明のカチオン性ポリマーとしては、限定はされないが、下記一般式（ＩＩ）で示される構造を有するものも好ましく挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
　上記式（ＩＩ）中、Ｒは、腫瘍細胞特異的に発現する酵素の基質となり且つカチオン性を有するペプチドを表すが、当該ペプチドの説明については前述した通りである。ここで、上記式（ＩＩ）で示される本発明の複合体としては、下記一般式（ＩＩ’）で示される構造を有するものがさらに好ましいものとして挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
　また、上記式（ＩＩ）及び式（ＩＩ’）中、ｘ、ｙ及びｚは、それぞれ、ポリマー分子中に占める各モノマー単位の存在割合（％）を示す値であり、ｘは５０~９９（好ましくは６０~９９、より好ましくは７０~９９）の値を表し、ｙは０~４９（好ましくは１~３０、より好ましくは１~２０）の値を表し、ｚは１~５０（好ましくは１~４０、より好ましくは１~３０）の値を表す。但し、（ｙ＋ｚ）の値は１~５０（好ましくは１~４０、より好ましくは１~３０）であり、（ｘ＋ｙ＋ｚ）の値は１００である。
　さらに、上記式（ＩＩ）及び式（ＩＩ’）中、ｙ及びｚの存在割合で示された各モノマー単位は、互いに配列順序が任意であってもよい（ランダムにどのような並び順で連結していてもよい）。但し、当該各モノマー単位は、すべて直鎖状に連結しているものである。また同様に、ｘの存在割合で示されたモノマー単位と、（ｙ＋ｚ）の存在割合で示された２種のモノマー単位からなるブロック単位とは、互いに配列順序が任意であってもよい（ランダムにどのような並び順で連結していてもよい）。但し、当該モノマー単位とブロック単位とは、すべて直鎖状に連結しているものである。
　上記親水性ポリマー、及び当該ポリマーに上記ペプチド部分を結合させた本発明のカチオン性ポリマーは、例えば後述する実施例（実施例１や実施例３）に示す方法など、従来公知の合成方法を用いて適宜調製することができる。
　具体的には、上記親水性ポリマーとしてアクリル酸−メタクリル酸共重合体を用いる場合は、上記ペプチドのＮ末端でメタクリル酸をアミド化し、Ｎ−ペプチドメタクリル酸としたものと、アクリル酸アミドとを共重合して、本発明のカチオン性ポリマーを合成する方法が好ましく挙げられる。この合成方法の概要を、以下のスキームに示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
（２）核酸
　本発明で用いられる核酸としては、全体としてアニオン性を示すものであればよく、限定はされず、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴＤＮＡ及びｓｉＲＮＡ等が好ましく挙げられるが、ＤＮＡ、特にプラスミドＤＮＡが好ましい。
　なお、本発明においては、必要に応じ、上記核酸と共に、又は上記核酸に代えて、他の高分子量又は低分子量の「アニオン性物質」を用いることもできる。具体的には、全体としてアニオン性を示す物質（マイナス電荷を搭載したものも含む）であればよく、蛍光タンパク質（ＧＦＰ等）や酵素等の各種生理活性タンパク質や、ペプチド、ペプチドホルモン、あるいは分子内に荷電性官能基を有する低分子物質（水溶性化合物）等を適宜同様に用いることもできる。
（３）カチオン性ポリマー−核酸複合体
　本発明の複合体は、前述した通り、カチオン性ポリマーと核酸とを含む、ポリマー−核酸複合体である。なお、本発明においては、前述したように、カチオン性ポリマーとの組合せとして、核酸と共に又は核酸の代わりに、高分子量又は低分子量の「アニオン性物質」を用いる態様も、核酸の場合と同様に提供され得る（以下同様）。
　本発明の複合体における複合化の態様としては、限定はされないが、カチオン性ポリマーと核酸とが静電的相互作用により結合したものが好ましい。
　本発明のカチオン性ポリマーは、カチオン性のペプチド部分を有するものであるため、核酸等と、静電相互作用による強固なイオンコンプレックスを形成して、安定な複合体として使用することができる。本発明の複合体は、腫瘍細胞や腫瘍組織における特定のシグナル応答に対応した酵素（ＰＫＣα）の作用（リン酸化）により、特異的にペプチド部分にマイナス電荷が付与されることで、カチオン性を喪失又は低減する。これにより、イオンコンプレックスの構造が崩壊し、核酸等が開放され得る。イオンコンプレックスを形成していた際には、例えば、遺伝子の転写に必要なタンパク質が当該核酸に接近できず遺伝子の転写発現が抑制されていたが、上記のように核酸等が開放されることにより、遺伝子の転写に必要なタンパク質が当該核酸に接近できるようになり、遺伝子の転写が活性化される。この機能を利用することにより、本発明のカチオン性ポリマー−核酸複合体は、以下に述べる各種用途に用いることができる。
３．腫瘍細胞又は腫瘍組織のイメージング方法
　本発明は、前述したカチオン性ポリマー−核酸複合体を、被験者（癌患者若しくは健常者）に投与する、又は被験細胞若しくは被験組織（被験者から採取したもの等）に添加することを含む、腫瘍細胞又は腫瘍組織のイメージング方法を提供することができる。
　本発明のイメージング方法においては、上記複合体に用いる核酸として、各種蛍光タンパク質など蛍光イメージング技術において用いられる各種タンパク質をコードするＤＮＡを用いることができ、好ましくはＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）若しくはルシフェラーゼ又はその誘導体をコードするＤＮＡである。なお、具体的なイメージング装置については、特に限定はされず、従来蛍光イメージング技術において汎用されている装置等を適宜組合せて用いることができる。
　なお、本発明においては、前述したカチオン性ポリマー−核酸複合体を含む、腫瘍細胞又は腫瘍組織のイメージング用デバイス又はキットを提供することもできる。
４．癌の治療用医薬組成物
　本発明は、前述したカチオン性ポリマー−核酸複合体を含む、癌の治療用医薬組成物を提供することができる。
　本発明の医薬組成物においては、上記複合体に用いる核酸として、公知の抗腫瘍活性を有する各種タンパク質をコードするＤＮＡを用いることができる。
　上記複合体は、前述した通り、腫瘍細胞及び腫瘍組織に対して極めて特異的かつ選択的に核酸を送達することができるため、本発明の医薬組成物は、他の正常細胞に悪影響を与えることなく（すなわち副作用を伴うことなく）、癌の治療効果を発揮することができる。
　従って、本発明においては、前述したカチオン性ポリマー−核酸複合体を被験者（癌患者）に投与することを含む、癌の治療方法も提供することができる。当該治療方法においては、患者への投与形態は、経口投与であっても非経口投与（静注）であってもよく限定はされず、また投与量等は、患者の年齢、体重、性別、病態等の各種事情を考慮し、適宜設定することができる。さらに本発明においては、癌治療用の薬剤を製造するための、前述したカチオン性ポリマー−核酸複合体の使用も提供することができる。
　以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜癌細胞特異的な遺伝子発現のための遺伝子キャリア等の調製＞
１．ペプチドの合成
　ペプチドおよびペプチドマクロモノマーを、ＡＰＥＸ　３９６　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＣｈｅｍＴｃｈ社，アメリカ）を用い、Ｆｍｏｃ法にて合成した。具体的には、下記のペプチド１及びペプチド２を合成した（いずれもアミノ酸の一文字表記で示した；図１参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
　得られた粗ペプチドはエレクトロスプレーイオン化質量分析装置を搭載した逆相液体クロマトグラフィー［Ｗａｔｅｒｓ　Ａｌｌｉａｎｃｅ　ＨＰＬＣ　ｓｙｓｔｅｍにＭｉｃｒｏｍａｓｓ　Ｐｌａｔｆｏｒｍ　ＩＩを接続、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ　ＬＵＮＡ　Ｃ１８カラム（２．１　ｘ　５０ｍｍ）］を用いて精製した。展開溶媒は０．１％のトリフルオロ酢酸を含んだアセトニトリル、超純水を用い、流速を３．０ｍＬ／ｍｉｎとした。精製したペプチドを凍結乾燥し、白色固体を得た。ＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ−ＭＳ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）にて目的物であることを確認した。
２．細胞、組織抽出物によるペプチドのリン酸化反応
　細胞抽出物の調製は以下の手順で行った。種々の細胞（１　ｘ　１０７個）を０．２ｍＬの緩衝溶液［２５０ｍＭ　スクロース、ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＥＤＴＡなし）（Ｒｏｃｈｅ社）を含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）］で均質化した。１０秒間超音波処理し、５，０００　ｘ　ｇ、４℃で１５分間遠心した後、上清をペプチドのリン酸化反応に使用した。正常および癌組織の抽出物の調製は以下の手順で行った。マウスから取出した組織を１ｍＬの緩衝溶液［２５０ｍＭ　スクロース、ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＥＤＴＡなし）（Ｒｏｃｈｅ社）を含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）］で均質化し、９００　ｘ　ｇ、４℃で１０分間遠心した後、上清を捨てた。沈殿物を１ｍＬの上記緩衝溶液加え、遠心し洗浄した。新たに１ｍＬの緩衝溶液を添加し、３０秒間超音波処理し、５，０００　ｘ　ｇ、４℃で１５分間遠心した後、上清をペプチドのリン酸化反応に使用した。抽出物中のタンパク質濃度はＢｉｏ−Ｒａｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｄｙｅ　ｒｅａｇｅｎｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）をおよび、標準サンプルとしてウシ血清アルブミンを用い決定した。リン酸化反応は以下の条件で行った。３０μＭ　ペプチド、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００μＭ　ＡＴＰ、２００μｇ／ｍＬタンパク質（抽出物中）、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、総体積３０μＬに混合後、３７℃で６０分間インキュベートした。リン酸化率はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳの結果から算出した。マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）の測定は、“Ｊ．−Ｈ．Ｋａｎｇ　ｅｔ　ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，２００７，ｖｏｌ．１８，ｐ．１０６−１１２．”に記載の方法に従い行った。この結果を、図３に示した。
３．ペプチド結合型親水性ポリマー（カチオン性ポリマー）の合成
　当該ポリマーの合成は、次のように行った。アクリアミド（２７．３ｍｇ，３８５μｍｏｌ）と基質ペプチド（８．０ｍｇ，５．９μｍｏｌ）とを純水に溶解し、窒素ガスの存在下で５分間バブリングした。これに、過硫酸アンモニウム（２．６ｍｇ，１１．４μｍｏｌ）とテトラメチレン−エチレンジアミン（３．４μｌ，２２．６μｍｏｌ）を添加して重合した。溶液を透析膜（分画分子量５０，０００）に入れ、純水で透析を行った後、凍結乾燥して白色の目的ポリマーを得た。具体的には、前記ペプチド１を結合させた親水性ポリマーを、カチオン性ポリマー１（単にポリマー１と言うことがある）として調製し、前記ペプチド２を結合させた親水性ポリマーを、カチオン性ポリマー２（単にポリマー２と言うことがある）として調製した。
　ここで、ポリマー１の構造は、下記式で示される構造である。同様に、下記式で示される構造において、ペプチド１に代えてペプチド２を結合させた構造がポリマー２の構造である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
　上記式中、ｍ＝９４．５［ポリマー１］，９３．５［ポリマー２］、ｎ＝５．５［ポリマー１］，６．５［ポリマー２］であった。なお、ｍ及びｎは、それぞれ、ポリマー（ポリマー１及びポリマー２）分子中に占める各モノマー単位の存在割合（％）を示す値である。また、「／」の表記は、各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。
　ポリマー１及びポリマー２におけるペプチドの導入率（ｍｏｌ％）は元素分析の結果から算出した。ポリマー１及びポリマー２の分子量はゲルろ過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）から算出した。ＧＰＣ分析は２本のカラム（ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ５０００ＰＷＸＬ，ＴＳＫＧ６０００ＰＷＸＬ）を搭載したＳｈｉｍａｄｚｕ　ＧＰＣ　ｓｙｓｔｅｍにて行った。０．１Ｍ　ＮａＮＯ３を含んだ０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．１）を展開溶媒、流速０．４５ｍＬ／ｍｉｎ、ポリエチレンオキシドを標準物質としてＧＰＣ測定および分子量を決定した。これらの結果を以下の表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
 ４．プラスミドＤＮＡ
　ホタルルシフェラーゼをコードし、ＣＭＶプロモーターを持つｐＣＭＶ−ｌｕｃプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を、“Ｔ．Ｋａｗａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，２００６，ｖｏｌ．１１１，ｐ．３８２−３８９．”に記載の方法に従って調製した。また、ＧＦＰをコードし、ＣＭＶ　プロモーターを持つｐＥＧＦＰ−Ｃ１　ｐＤＮＡは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｒｉｅｓ社から購入した。
５．カチオン性ポリマーとｐＤＮＡとの複合体の調製
　当該複合体は、超純水中で様々な電荷比（Ｃ／Ａ＝０．５，１．０，２．０）（５０μｇ　ｐＤＮＡ／ｍＬ）になるようにポリマー（ポリマー１及びポリマー２）水溶液と、ｐＤＮＡ（ｐＣＭＶ−ｌｕｃあるいはｐＥＧＦＰ−Ｃ１）水溶液とを混合し、室温で１５分間静置することで調製した。得られた複合体水溶液を緩衝溶液で希釈し、それぞれの実験に用いた。
６．複合体のゼータ電位、粒子径の測定
　複合体のゼータ電位、粒子径の測定は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、ＵＫ）を用いて行った。測定はＨｅ／Ｎｅレーザーを用い、検出角度１７３度、温度２５℃とした。ｐＤＮＡの最終濃度は１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．５）で５μｇ／ｍＬに調製した。これらの結果を以下の表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
＜癌細胞で異常亢進しているプロテインキナーゼＣαの利用＞
１．プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）αに応答した複合体の崩壊挙動の追跡
　ＰＫＣαによるリン酸化に応答した複合体（実施例１の５．項で調製した複合体；以下同様）の崩壊はＺｅｔａｓｉｚｅｒの散乱光強度を追跡することで確認した。複合体水溶液を以下の測定溶液に希釈した（１５μＬ）；２５．６ｎＭ　ペプチド、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ　ＣａＣｌ２、１００μＭ　ＡＴＰ、２．０ｍｇ／ｍＬ　ＤＡＧ、２．５μｇ／ｍＬ　ＰＳ、１ｎｇ／ｍＬ　ＰＫＣα、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）。反応は２５℃でＰＫＣα添加することで開始した。この結果を、図５（ａ）に示した。
２．カップルドエンザイムアッセイによる複合体のリン酸化反応の追跡
　複合体形成時の側鎖ペプチドのリン酸化反応の追跡はカップルドエンザイムアッセイにて行った。複合体水溶液を以下の測定溶液に希釈した（１００μＬ）；３２μＭ　ペプチド、１ｍＭ　ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｅｐｙｒｕｖａｔｅ、ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ　ａｄｅｎｉｎｅ　ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＮＡＤＨ）、１Ｕ／μＬ　ｌａｃｔａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤＨ）、４Ｕ／μＬ　ｐｙｒｕｖａｔｅ　ｋｉｎａｓｅ、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ　ＣａＣｌ２、１００μＭ　ＡＴＰ、２．０ｍｇ／ｍＬ　ＤＡＧ、２．５μｇ／ｍＬ　ＰＳ、１ｎｇ／ｍＬ　ＰＫＣα、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）。反応は２５℃でＰＫＣα添加することで開始した。ＮＡＤＨの消費量はＳＰＲ−８　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ　ペルチエ（Ｓｈｉｍａｚｄｕ社）を搭載した可視／紫外域スペクトロメーター（ＵＶ−２５５０，Ｓｈｉｍａｚｄｕ社、日本）にて３４０ｎｍの吸光度変化から算出した。この結果を、図５（ｂ）に示した。
３．ポリマーの細胞毒性評価
　細胞毒性の評価は４−［３−（２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−５−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｏ］−１，３−ｂｅｎｚｅｎｅ　ｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを含むＷＳＴ−１　ｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｋｉｔ（ＤＯＪＩＮＤＯ　Ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ社、熊本、日本）を用いて行った。ＨｕＨ−７　肝臓癌細胞およびＢ１６皮膚癌細胞を４８穴シャーレに培養し、ポリマー１及びポリマー２（０~３０μｇ／ｍＬ）、並びにトランスフェクション試薬としてのリポフェクタミン２０００（１０μｇ／ｍＬ）を添加し、２４時間インキュベートした。それぞれのウェルの培地を、ＷＳＴ−１を含んだ新しい培地に交換し、３時間インキュベート後、４４０ｎｍの吸光度を測定した。細胞生存率（％）は未処理の細胞（コントロール細胞）と処理した細胞の吸光度から算出した。この結果を、図４に示した。
４．マイクロインジェクション実験
　ＨｕＨ−７　肝臓癌細胞およびＢ１６皮膚癌細胞を６穴シャーレに２４時間培養した。これらの培養細胞に、０．５μｍ±０．２μｍのインジェクションピペットを搭載したマイクロインジェクション装置ＣＥＬＬＩＮＪＥＣＴＯＲ　ＣＩ−２０００（Ｆｕｊｉｔｓｕ社、日本）を用いて、複合体の細胞内への導入実験を行った。Ｐｉ＝３０−５０ｈＰａ、Ｐｃ＝８ｈＰａで、複合体を細胞質へ導入した。複合体水溶液をＴＥ緩衝液（ｐＤＮＡ：１００ｎｇ／μＬ）で希釈し、テキサスレッド修飾したデキストラン（１ｍｇ／ｍＬ）と混合した。導入２４時間後、ＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡で観察した。阻害剤実験は、マイクロインジェクションする６時間前に１μＭ　Ｒｏ３１−７５４９を含んだ培地で処理して行った。ＧＦＰ強度の測定は、それぞれのグループから８個の細胞を選択した。ＧＦＰ強度の算出は０から２５５の範囲でＡｄｏｂｅ　Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ　６．０　ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて行った。この結果を、図６、図７（ａ）及び図７（ｂ）に示した。
５．複合体の細胞へのトランスフェクション
　ＨｕＨ−７　肝臓癌細胞およびＢ１６皮膚癌細胞を６穴シャーレに２４時間培養した。２４時間後、複合体のＯｐｔｉ−ＭＥＭ溶液（Ｇｉｂｃｏ社）（Ｃ／Ａ＝１．０，２．０；ｐＤＮＡ　２．５μｇ／ｍＬ）５００μＬを添加した。また、同様の条件で阻害剤Ｒｏ３１−７５４９を添加したサンプルも行った。さらに、リポフェクタミン２０００（１０μｇ／ｍＬ）とｐＤＮＡ（２．５μｇ／ｍＬ）の複合体もＢ１６皮膚癌細胞にトランスフェクションした。３７℃で６時間インキュベート後、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、アンポテリシンＢ（０．２５μｇ／ｍＬ）、１０％　ＦＢＳ（血清）を含むＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間インキュベートした。細胞を剥離し、２００μＬの溶解緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２，０．０５％　トリトン−Ｘ　１００、２ｍＭ　ＥＤＴＡ）で細胞を溶解した。サンプルを１０，０００　ｘ　ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を回収した。得られた上清１０μＬと４０μＬのルシフェリン基質を混合し、化学発光をＭｉｎｉＬｕｍａｎｔ　ＬＢ　９５０６（ＥＧ　＆　Ｇ　Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社、Ｗｉｌｄｂａｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定し、ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｕｎｉｔｓ（ＲＬＵ）／ｍｇ　ｔｏｔａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎで示した。この結果を、図７（ｃ）及び図８に示した。
６．ウエスタンブロティング
　細胞抽出液の調製は以下の手法で行った。細胞（５　ｘ　１０６個）に溶解緩衝液［２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、１％　Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０ｍＭ　ＮａＦ、０．２ｍＭ　Ｎａ３ＶＯ４、ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＥＤＴＡなし）（Ｒｏｃｈｅ社）］を添加し、氷上で１５分間静置することで細胞抽出液を調製した。細胞抽出液を遠心し不溶性物質を取除き、抗ＰＫＣα抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、抗リン酸化ＰＫＣα抗体（Ｓｅｒ６５７）（ＵＰＳＴＡＴＥ社）、抗アクチン抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いてイミュノブロティングを行い、化学発光にてタンパク質を可視化した。正常皮膚組織およびＢ１６皮膚癌組織の抽出液の調製は以下の手法で行った。それぞれの組織をマウスから取出し、１ｍＬの緩衝溶液［ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＥＤＴＡなし）（Ｒｏｃｈｅ社）を含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）］で均質化した。１０秒間超音波処理し、５，０００　ｘ　ｇ、４℃で１５分間遠心した後、上清をペプチドのリン酸化反応に使用した。正常および癌組織の抽出物の調製は以下の手順で行った。マウスから取出した組織を１ｍＬの緩衝溶液［２５０ｍＭ　スクロース、ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＥＤＴＡなし）（Ｒｏｃｈｅ社）を含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）］で均質化し、９００　ｘ　ｇ、４℃で１０分間遠心した後、上清を捨てた。沈殿物を１ｍＬの上記緩衝溶液加え、遠心し洗浄した。新たに１ｍＬの緩衝溶液を添加し、３０秒間超音波処理し、５，０００　ｘ　ｇ、４℃で１５分間遠心した後、上清をウエスタンブロティングに使用した。この結果を、図１０に示した。
７．動物実験
　動物実験は九州大学の動物実験ガイドラインを遵守し行った。本実施例ではオス、５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。１００μＬのＨａｎｋ’ｓ　ｂａｌａｎｃｅｄ　ｓａｌｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇｉｂｃｏ社）にＢ１６皮膚癌細胞１　ｘ　１０７個を懸濁し、皮膚組織に移植した。癌組織は約８ｍｍまで成長させて使用した。複合体水溶液を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．５）（ｐＤＮＡ　１．０μｇ／ｍＬ）に希釈した。この複合体溶液（１００μＬ）をＢ１６皮膚癌組織、正常組織に局所投与した。２４時間後、マウスに麻酔をかけ、１５ｍｇ／ｍＬ　Ｄ−ルシフェリンのリンゲル溶液３００μＬを腹腔投与した。化学発光を冷却Ｃ４７４２−９８−２６Ｇ０２　ＣＣＤ　カメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ　Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）で検出し、コントラストおよび明度をＡｄｏｂｅ　Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ　６．０　ｓｏｆｔｗａｒｅで分析した。なお化学発光の収光時間は１０分間とした。
　化学発光を検出後、癌細胞を移植したマウス３匹（Ｃ／Ａ＝２．０）のルシフェラーゼ活性を測定した；ポリマー１を導入した担癌マウスの場合、ルシフェラーゼ発現が確認されたものを用いた。マウスを安楽死させ、皮膚および癌組織を取出した。次に、１ｍＬの溶解緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２，０．０５％　トリトン−Ｘ　１００、２ｍＭ　ＥＤＴＡ）で細胞を溶解した。サンプルを１０，０００　ｘ　ｇ、１４℃で１０分間遠心し、上清を回収した。得られた上清１０μＬと４０μＬのルシフェリン基質を混合し、化学発光をＭｉｎｉＬｕｍａｎｔ　ＬＢ　９５０６（ＥＧ　＆　Ｇ　Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社、Ｗｉｌｄｂａｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定し、ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｕｎｉｔｓ（ＲＬＵ）／ｍｇ　ｔｏｔａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎで示した。この結果を、図９に示した。
＜遺伝子発現活性の向上およびプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）α応答性の向上を目的とした基質ペプチド担持型直鎖ポリエチレンイミンの開発＞
１．ＰＫＣαの基質ペプチドを担持した直鎖型ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）（カチオン性ポリマー）の合成
（１）アジド化ペプチドの合成
　実施例１の１．項と同様にして、下記のペプチド１及びペプチド２（いずれもアミノ酸の一文字表記で示す）を、ＡＰＥＸ　３９６　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＣｈｅｍＴｃｈ社，アメリカ）を用い、Ｆｍｏｃ法にて合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
　得られた各ペプチドのＮ末のフェニルアラニンのＦｍｏｃ基を脱保護した後、３−アジドプロピオン酸（未精製）と縮合させて、アジド化ペプチドを合成した。なお、３−アジドプロピオン酸は、予め、３−ブロモプロピオン酸（東京化成工業）とアジ化ナトリウム（和光純薬工業）とを反応させて得ておいた。
　上記合成後の各アジド化ペプチドは、エレクトロスプレーイオン化質量分析装置を搭載した逆相液体クロマトグラフィー［Ｗａｔｅｒｓ　Ａｌｌｉａｎｃｅ　ＨＰＬＣ　ｓｙｓｔｅｍにＭｉｃｒｏｍａｓｓ　Ｐｌａｔｆｏｒｍ　ＩＩを接続、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ　ＬＵＮＡ　Ｃ１８　カラム（２．１　ｘ　５０ｍｍ）］を用いて精製した。展開溶媒は０．１％のトリフルオロ酢酸を含んだアセトニトリル、超純水を用い、流速を３．０ｍＬ／ｍｉｎとした。精製したペプチドを凍結乾燥し、白色固体を得た。ＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ−ＭＳ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）にて目的物であることを確認した。ペプチド１由来のアジド化ペプチドを、ペプチド１’とし、ペプチド２由来のアジド化ペプチドを、ペプチド２’とした。
　これらペプチド１’及びペプチド２’を用いて、下記スキームに従い、ＬＰＥＩ（Ｓ）及びＬＰＥ（Ａ）を合成した（具体的な説明は、以下の（２）項及び（３）項を参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
（２）ＬＰＥＩ−Ｐｅｎｔｙｎｅの合成
　窒素置換した二口フラスコに直鎖状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）［Ｍｗ＝２５，０００，３０１ｍｇ，二級アミン７．０ｍｍｏｌ，（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｃ．）］、５−クロロ−１−ペンチン［７１８ｍｇ，７．０ｍｍｏｌ（東京化成工業）］、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）［３２０ｍｇ，２．１ｍｍｏｌ（東京化成工業）］、無水ピリジン［１．１ｇ，１４ｍｍｏｌ（和光純薬工業）］、無水ＤＭＳＯ［３０ｍＬ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）］を加えた。この反応溶液を、窒素雰囲気下、５０℃で、２４時間撹拌した。反応後、溶媒を減圧留去し、メタノールに再溶解した。分画分子量３，５００の透析膜を用いて、メタノール及び０．０５Ｎ　ＨＣｌに対して計７日間透析し、精製した。その後、凍結乾燥を行い、黄褐色で固体の化合物（ＬＰＥＩ−Ｐｅｎｔｙｎｅ）を得た。
　得られたＬＰＥＩ−Ｐｅｎｔｙｎｅ中のアルキンの導入率は、１３Ｃ−ＮＭＲの結果より算出した。その結果、主鎖の二級アミン（１００ｍｏｌ％）に対し、アルキンの導入率は２０．４ｍｏｌ％（＝ｐ）であった。
（３）ＬＰＥＩ−Ｐｅｐｔｉｄｅの合成
　ＬＰＥＩ−Ｐｅｎｔｙｎｅ［４．４ｍｇ，アルキン　９．６μｍｏｌ］、ペプチド１’［５ｍｇ，４．７μｍｏｌ］、硫酸銅（ＩＩ）五水和物［２．４ｍｇ，９．４μｍｏｌ（和光純薬工業）］、アスコルビン酸ナトリウム［３７．２ｍｇ，１８８μｍｏｌ（和光純薬工業）］を、超純水／エタノール（＝１／１）１０２６μＬに溶解し、室温で２４時間撹拌して反応させた。反応後、０．１Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０，和光純薬工業）を２ｍＬ添加し、室温で２時間撹拌して更に反応させた。反応溶液を分画分子量３，５００の透析膜に入れ、超純水に対して３日間、０．０５Ｎ　ＨＣｌに対して１日間透析し、精製した。その後、凍結乾燥により、カチオン性ポリマーとして、黄褐色で固体のＬＰＥＩ−Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＬＰＥＩ（Ｓ））を得た。
　上記合成方法において、ペプチド１’に代えてペプチド２’を用いた以外は同様にし、カチオン性ポリマーとして、黄褐色で固体のＬＰＥＩ−Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＬＰＥＩ（Ａ）を得た。
　得られたＬＰＥＩ（Ｓ）及びＬＰＥＩ（Ａ）は、上記スキーム中の構造式において、ｘ＝７９．６、ｙ＝１４．３［ＬＰＥＩ（Ｓ）］，１３．２［ＬＰＥＩ（Ａ）］、ｚ＝６．１［ＬＰＥＩ（Ｓ）］，７．２［ＬＰＥＩ（Ａ）］であった。なお、ｘ、ｙ及びｚは、それぞれ、ポリマー（ＬＰＥＩ（Ｓ）及びＬＰＥＩ（Ａ））分子中に占める各モノマー単位の存在割合（％）を示す値である。
　各カチオン性ポリマー（ＬＰＥＩ（Ｓ）及びＬＰＥＩ（Ａ））のペプチドの修飾率は、担持されたペプチド由来の１級アミン量をＴＮＢＳ法にて決定することで算出した。各カチオン性ポリマーのペプチド修飾率（Ｐｅｐｔｉｄｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ）及び分子量を下記表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
 ２．ＬＰＥＩ（Ｓ）のリン酸化反応による複合体の崩壊の確認
　リン酸化反応による複合体の崩壊挙動は、動的光散乱測定時の散乱強度値の経時変化により評価した。複合体を形成していると光が散乱されるため、散乱強度値は高いが、複合体が崩壊してしまうと散乱することができなくなり、散乱強度値は下がるという原理である。
（１）材料及び方法
　Ｎ／Ｐ比（カチオン性ポリマー中のアミノ基濃度／ｐＤＮＡのリン酸基濃度）が１０となるように、ＬＰＥＩ（Ｓ）及びＬＰＥＩ（Ａ）とｐＤＮＡとを超純水中で混合し、室温で２０分静置することで、カチオン性ポリマーとｐＤＮＡとの複合体を調製した。ここで、ｐＤＮＡとしては、実施例１と同様に、ホタルルシフェラーゼをコードし、ＣＭＶプロモーターを持つｐＣＭＶ−ｌｕｃプラスミドＤＮＡを、“Ｔ．Ｋａｗａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｒｅｌｅａｓｅ，２００６，ｖｏｌ．１１１，ｐ．３８２−３８９．”に記載の方法に従って調製したものを用いた。
　調製後の複合体水溶液を、リン酸化反応溶液［最終濃度として、０．２ｍＭ　ＡＴＰ、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ　ＣａＣｌ２、２ｍｇ／ｍＬ　ジアシルグリセロール、１００μｇ／ｍＬ　フォスファチジルセリン　１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ　緩衝液（ｐＨ７．３）を含む］にて４９μＬにメスアップした。その後、市販のＰＫＣα（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，１１０ｍｇ／ｍＬ）を１μＬ添加し、添加直後より散乱強度値の測定を開始した。測定はＺｅｔａ−Ｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）にて行った。測定温度は２５°Ｃとした。その結果を図１１に示した。
（２）結果
　図１１に示すように、ＰＫＣα非応答型であるＬＰＥＩ（Ａ）を用いて調製した複合体（ＬＰＥＩ（Ａ）複合体）の場合は、散乱強度の減少が全く確認されないのに対し、ＰＫＣα応答型であるＬＰＥＩ（Ｓ）を用いて調製した複合体（ＬＰＥＩ（Ｓ）複合体）の場合は、ＰＫＣα添加直後から散乱強度の急激な減少が確認された。以上の結果から、ＬＰＥＩ（Ｓ）複合体は、ＰＫＣαによるリン酸化反応により崩壊することが示された。
３．トランスフェクション実験
　細胞へのトランスフェクションにおける最適な複合体調製条件の探索のため、種々のＮ／Ｐ比（カチオン性ポリマー中のアミノ基濃度／ｐＤＮＡのリン酸基濃度）で調製した複合体を、細胞にトランスフェクションした。
　なお、ＬＰＥＩ（Ｓ）複合体のトランスフェクション効率及びＰＫＣα応答性の比較のため、他のカチオン性ポリマーであるＰＰＣ（Ｓ）を用いて調製した複合体（ＰＰＣ（Ｓ）複合体）を比較対象とした。ここで、ＰＰＣ（Ｓ）は、下記式で示される構造を有する、ペプチド１が担持されたポリマーである。同様に、ＰＰＣ（Ｓ）において、ペプチド１に代えてペプチド２が担持されたポリマーをＰＰＣ（Ａ）とする。ＰＰＣ（Ｓ）及びＰＰＣ（Ａ）の調製方法は、実施例１を参照できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
　上記式中、ｍ＝９６．２［ＰＰＣ（Ｓ）］，９７．０［ＰＰＣ（Ａ）］、ｎ＝３．８［ＰＰＣ（Ｓ）］，３．０［ＰＰＣ（Ａ）］であった。なお、ｍ及びｎは、それぞれ、ポリマー（ＰＰＣ（Ｓ）及びＰＰＣ（Ａ）分子中に占める各モノマー単位の存在割合（％）を示す値である。また、「／」の表記は、各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。
（１）材料及び方法
　ＨｅｐＧ２ヒト肝臓癌細胞を、２５，０００細胞／ｗｅｌｌの初密度で、４８穴シャーレで２日間培養した。培養後、各カチオン性ポリマーを用いて調製した複合体（ＬＰＥＩ（Ｓ）複合体及びＬＰＥＩ（Ａ）複合体）を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ溶液（Ｇｉｂｃｏ社）（Ｎ／Ｐ比＝７．５，１０，２０、ｐＤＮＡ　０．５μｇ／ｗｅｌｌ）５００μＬを添加した。ここで、ＬＰＥＩ（Ｓ）はＰＫＣα応答型ポリマーとして使用し、ＬＰＥＩ（Ａ）はリン酸化部位であるセリン残基をアラニン残基に置換したペプチドを担持したＰＫＣα非応答型ポリマー（ネガティブコントロール）として使用した。また、ｐＤＮＡとしては、前述したｐＣＭＶ−ｌｕｃプラスミドＤＮＡを用いた。
　Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ溶液の添加から４時間後、Ｄ−ＭＥＭ培地［ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、アンポテリシンＢ（０．２５μｇ／Ｌ）、１０％　ＦＢＳ（血清）を含む］に交換した。所定の期間（１~３日後）で、１００μＬの溶解緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０５％トリトン−Ｘ　１００、２ｍＭ　ＥＤＴＡ）で細胞を溶解した。得られた細胞溶解液１０μＬと、４０μＬのルシフェリン基質（プロメガ社）とを混合し、化学発光をＭｉｎｉＬｕｍａｎｔ　ＬＢ　９５０６（ＥＧ＆Ｇ　Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社、Ｗｉｌｄｂａｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定し、ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｕｎｉｔｓ（ＲＬＵ）／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎで示した。比較対象であるＰＰＣ（Ｓ）とｐＤＮＡとの複合体は、Ｎ／Ｐ比＝２で調製し、ＬＰＥＩ（Ｓ）と同様の手法によりトランスフェクション等をした。
（２）結果
　図１２（Ａ）の結果より、Ｎ／Ｐ比＝１０のとき、ＰＫＣα応答型であるＬＰＥＩ（Ｓ）複合体の遺伝子発現活性及びＰＫＣα応答性［ＬＰＥＩ（Ｓ）の遺伝子発現レベル／ＬＰＥＩ（Ａ）の遺伝子発現レベル］が最適であることが示された。
　図１２（Ｂ）では、ＰＰＣ（Ｓ）複合体と、ＬＰＥＩ（Ｓ）複合体及びＬＰＥＩ（Ａ）複合体（Ｎ／Ｐ比＝１０）とについて、遺伝子発現レベルを比較した結果を示した。図１２（Ｂ）のＰＰＣ（Ｓ）とＬＰＥＩ（Ｓ）との結果から、ＬＰＥＩ（Ｓ）複合体の遺伝子の発現レベルは、ＰＰＣ（Ｓ）複合体の遺伝子発現レベルのおよそ１，０００倍以上であり、ＬＰＥＩ（Ｓ）複合体はＰＫＣα活性に応答する遺伝子発現レベルを飛躍的に向上させることが確認された。また、ＰＰＣ（Ｓ）複合体のＰＫＣα応答性は、図１３（Ａ），（Ｂ）に示したＰＰＣ（Ｓ）とＰＰＣ（Ａ）との結果から、およそＰＰＣ（Ａ）を用いて調製した複合体の１０倍であるのに対し、ＬＰＥＩ（Ｓ）複合体のＰＫＣα応答性は、図１２（Ｂ）のＬＰＥＩ（Ｓ）とＬＰＥＩ（Ａ）との結果から、ＬＰＥＩ（Ａ）複合体の約１４５倍であることが示され、ＬＰＥＩ（Ｓ）複合体はＰＫＣα応答性についても飛躍的に機能向上させることが確認された。
　さらに、図１２（Ｃ）の結果によると、ＬＰＥＩ（Ａ）複合体をＨｅｐＧ２ヒト肝臓癌細胞にトランスフェクションした場合、遺伝子発現レベルはトランスフェクション後３日間において上昇が見られなかったが、ＬＰＥＩ（Ｓ）複合体が、ＨｅｐＧ２ヒト肝臓癌細胞内のＰＫＣαによるリン酸化反応により崩壊し、これにより遺伝子発現が活性化されることが示された。
　以上に述べた結果は、例えば、本発明の複合体を動物に利用した際に、正常細胞における長期間の遺伝子発現の抑制（すなわち薬理遺伝子等を導入した際の正常細胞に対する副作用の低減）を達成する上で、極めて重要な特性である。
　本発明によれば、腫瘍細胞特異的な遺伝子発現のための遺伝子キャリアとして用い得るカチオン性ポリマー、当該ポリマーと目的遺伝子の核酸とを含むポリマー−核酸複合体を提供することができる。
　本発明のポリマー−核酸複合体は、腫瘍細胞又は腫瘍組織のイメージングや癌の治療（遺伝子治療）に簡便かつ有効に用い得るものである点で、癌の治療又は予防分野において、極めて実用性の高いものである。
　配列番号１：合成ペプチド
　配列番号２：合成ペプチド

Claims (20)

  1. 腫瘍細胞特異的に発現する酵素の基質となり且つカチオン性を有するペプチド部分と、親水性ポリマー部分とを含む、カチオン性ポリマー。
  2. 前記酵素がプロテインキナーゼＣαである、請求項１記載のポリマー。
  3. 前記ペプチドが塩基性アミノ酸残基を含むものである、請求項１又は２記載のポリマー。
  4. 前記塩基性アミノ酸がリジン及び／又はアルギニンである、請求項３記載のポリマー。
  5. 前記親水性ポリマーに前記ペプチドが複数結合したものである、請求項１~４のいずれか１項に記載のポリマー。
  6. 前記結合がグラフト結合である、請求項５記載のポリマー。
  7. 前記ペプチドのアミノ酸配列が、ＦＫＫＱＧＳＦＡＫＫＫ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列を含むものである、請求項１~６のいずれか１項に記載のポリマー。
  8. 下記一般式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
    〔式（Ｉ）中、Ｒは、腫瘍細胞特異的に発現する酵素の基質となり且つカチオン性を有するペプチドを表す。ｍ及びｎはそれぞれ各モノマー単位の存在割合（％）を示す値であり、ｍは５０~９９の値を表し、ｎは１~５０の値を表す。但し、（ｍ＋ｎ）の値は１００である。「／」の表記は、各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕
    で示される構造を有するものである、請求項１記載のポリマー。
  9. 下記一般式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
    〔式（ＩＩ）中、Ｒは、腫瘍細胞特異的に発現する酵素の基質となり且つカチオン性を有するペプチドを表す。ｘ、ｙ及びｚはそれぞれ各モノマー単位の存在割合（％）を示す値であり、ｘは５０~９９の値を表し、ｙは０~４９の値を表し、ｚは１~５０の値を表す。但し、（ｙ＋ｚ）の値は１~５０であり、（ｘ＋ｙ＋ｚ）の値は１００である。〕
    で示される構造を有するものである、請求項１記載のポリマー。
  10. 請求項１~９のいずれか１項に記載のカチオン性ポリマーと核酸とを含む、ポリマー−核酸複合体。
  11. 前記カチオン性ポリマーと前記核酸とが静電的相互作用により結合したものである、請求項１０記載の複合体。
  12. 前記核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ及びｓｉＲＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１０又は１１記載の複合体。
  13. 請求項１０~１２のいずれか１項に記載の複合体を含む、腫瘍細胞又は腫瘍組織のイメージング用デバイス。
  14. 前記複合体に含まれる核酸が、ＧＦＰ若しくはルシフェラーゼ又はその誘導体をコードするＤＮＡである、請求項１３記載のデバイス。
  15. 請求項１０~１２のいずれか１項に記載の複合体を、被験者に投与する又は被験細胞若しくは被験組織に添加することを含む、腫瘍細胞又は腫瘍組織のイメージング方法。
  16. 前記複合体に含まれる核酸が、ＧＦＰ若しくはルシフェラーゼ又はその誘導体をコードするＤＮＡである、請求項１５記載の方法。
  17. 請求項１０~１２のいずれか１項に記載の複合体を含む、癌の治療用医薬組成物。
  18. 前記複合体に含まれる核酸が、抗腫瘍活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、請求項１７記載の組成物。
  19. 請求項１０~１２のいずれか１項に記載の複合体を被験者に投与することを含む、癌の治療方法。
  20. 前記複合体に含まれる核酸が、抗腫瘍活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、請求項１９記載の方法。
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