JP2002010782A - ウイルス濃縮材料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】試料中のウイルスを吸着し、適当な液中に高濃
度で脱着させて検出を行うことができ、かつ正確な検出
結果を得ることができる手段を提供することにある。 【解決手段】表面にアミン化合物を固定化した材料から
なるウイルス濃縮材料。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、検体中のウイルス
の検査、診断に有用である、試料中のウイルスを濃縮す
るための材料に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来のウイルス検査・診断法としてウイ
ルス抗原あるいは抗ウイルス抗体の免疫学的測定が一般
的である。献血血液の検査場合、ウイルス感染から数週
間から数ヶ月間は、ウイルス量あるいは抗ウイルス抗体
量が少ないため、これらの免疫学的測定法では検出でき
ない場合がある。この検出不可能な期間はウインドウ・
ピリオド（空白期間）と呼ばれており、このような患者
が献血を行った場合、その献血液は十分な感染性を持つ
ことが多く、不特定多数の輸血患者・血液製剤利用患者
に危険をおよぼす可能性がある。したがって、ウインド
ウ・ピリオドをできる限り短縮するため、免疫学的測定
限界下のウイルスを高感度に検出できる技術の開発が急
務とされている。

【０００３】近年、ポリメラーゼチェインリアクション
法（以下ＰＣＲ法）に代表される、核酸増幅技術によ
り、極微量のウイルスでも検出できる可能性が開けてき
た。しかしながら、ＰＣＲ法などによっても極微量のウ
イルス検出は特殊な施設と高度な技術が必要とされ、一
般的な施設で簡便に実施することはきわめて困難であ
る。そこで、これらの問題解決のため、検体中のウイル
スを濃縮することが行われている。

【０００４】また、年間６００万にも及ぶ献血の検体を
一つづつ検査するには多大な労力と莫大な費用を要する
ことは容易に理解することができる。この場合、例え
ば、献血液を少量ずつ５０人分集めてスクリーニング検
査を行えば、単純計算で約５０分の１の労力と費用で済
むことになる。ところが、この場合でも一つの検体中に
存在する可能性のあるウィルスは薄められているから検
出漏れが生じる恐れがある。これを防ぐために試料中の
ウイルスを濃縮することが望まれる。

【０００５】従来、ウイルス濃縮技術として遠心を利用
する方法が知られているが、試料中のウイルスを何らか
の材料に吸着し濃縮に利用することは知られていない。
例えば、特開平4-342536号公報、特開平6-114250号公
報、特開平11-267199号公報などには、ウィルスによる
影響をなくすことを目的として、希薄なウィルス濃度の
溶液からウィルスを除去したり、溶液中のウイルスを不
活化する技術が記載されているに過ぎない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明の課題
は、試料中のウイルスを吸着し、適当な液中に高濃度で
脱着させて検出を行うことができ、かつ正確な検出結果
を得ることができる手段を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは研究の結
果、上記課題を解決する手段として、表面にアミン化合
物を固定化した材料からなるウイルス濃縮材料を開発す
るに到った。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のウイルス濃縮材料（以下、単に「本発明の材
料」ともいう）の形態は何ら限定されるものではなく、
例えば粒子状、多孔質膜状、フィルター状、繊維状、シ
ート状、チューブ状、板状などが挙げられる。その中
で、粒子状のものが好ましい。理由として、材料の一定
体積に対して表面積を多く取る事ができるためウイルス
の吸着が有利に行えること、検査時の操作性に優れる事
が挙げられる。

【０００９】本発明の材料が粒子状である場合、該粒子
をウイルスを含む試料液に添加するとウイルスが該粒子
の表面に存在するアミン化合物により粒子に結合する。
その結果、血漿や血清等の検体中のウイルスを高い効率
で濃縮するため、通常、カラムクロマト法ではなくバッ
チ法にて使用される。したがって、粒子の粒径は通常0.
08μｍ〜300μｍ、好ましくは0.1μｍ〜100μｍであ
る。粒径は均一である必要はないが均一であることとが
好ましい。特に、粒径が上記の範囲内であれば粒径が均
一でなくてもより好ましい結果が得易い。粒径が小さす
ぎると、血液または体液からウイルス濃縮用粒子を分離
する際の遠心分離の回転数や回転時間の増加を招き、装
置が大型になったり、高い時間的効率が得られず好まし
くない。また、磁気分離の場合、血液または体液からウ
イルス濃縮用粒子を分離する際の磁気分離性が劣り、分
離操作に長時間を要し、高い時間的効率が得られず好ま
しくない。また、粒径が大きすぎるとウイルスを捕獲す
る効率が低下し、ウイルス濃縮が十分に行えないことが
あるため好ましくない。また、粒子形状はまったく限定
されず、球状などの一定形状でもよいし、不定形の粒子
の集まりであってもよい。なお球状でない粒子の粒径は
各粒子の最長径と最短径との平均値をとるものとする。

【００１０】また、多孔質膜も好ましく使用する事がで
きる。その場合、孔径は適用対象によるが、通常、最大
孔径が０．１μｍ〜５０μｍの範囲にあることが好まし
い。膜の形状としては、平膜、中空糸膜、不織布、織布
などを例示できる。

【００１１】血漿や培養液などを対象とした場合は、最
大孔径が０．１μｍ〜５μｍ が好ましく、細胞などが
含まれる場合は、最大孔径が、５〜５０μｍが好まし
い。最大孔径が小さすぎると、全体に孔径が小さくなる
ため十分な濾過量が得られなくなるからである。また、
孔径が小さすぎるとサイズによっては捕捉されるウイル
スもある。本発明の多孔質膜の透水量は、１０ mL/min/
m²/mmHg 以上、好ましくは１００ mL/min/m²/mmHg 以上
であることが、濾過圧を低くできるため好ましい。

【００１２】また、多孔質膜が不織布状である場合、多
孔質膜を形成するフィラメントは、モノフィラメントで
あってもマルチフィラメントであってもよいが、平均直
径が１００μｍ以下、好ましくは、５０μｍ以下である
と、膜の表面積が大きくなり吸着部位が増加するため好
ましい。多孔質膜の空孔部の割合（空孔率）は、２０％
以上、好ましくは５０％以上であり、実用的には５０〜
９０％の範囲である。

【００１３】本発明の材料の材質は、特に限定されず、
セルロ−スやその誘導体などの天然高分子、あるいはポ
リオレフィン、ポリアミド、ポリイミド、ポリウレタ
ン、ポリエステル、ポリサルホン、ポリアクリルニトリ
ルなどの高分子材料を例示できるが、好ましくは、寸法
安定性に優れ水に対して低膨潤性の材料、たとえばポリ
プロピレンやポリフッ化ビニリデンなどにより基材膜が
構成されており、表面処理により親水性フィルタ−に改
質されているものが好ましい。

【００１４】また、本発明のウイルス濃縮材料が、多孔
質膜である場合においては、孔を閉塞せず十分な透過性
能を維持できるように、水に非膨潤性（膨潤率が２０％
以下）であり、ガラス転移点が２９０Ｋ以下の柔軟な高
分子により表面改質されていることが好ましい。そのよ
うな重合体として、メトキシエチルアクリレ−トに代表
されるアルコキシアルキルアクリレ−ト類の単量体を主
な構成成分とする重合体や共重合体を例示することがで
きる。

【００１５】本発明のウイルス濃縮材料は、水不溶性の
材料であれば特に限定されず、そのような材料の表面に
存在するアミン化合物から構成されている。

【００１６】本発明において「アミン化合物」とは、１
級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基、第４級アン
モニウム基、並びにイミノ基（−ＮＨ−及び＝ＮＨ）
（これらの基はそれ自体カチオンとして存在するか、そ
れ自体カチオンとして存在しないが中性付近（約ｐＨ６
〜８）においてプロトンの結合により容易にカチオンを
形成するので、以下、「カチオン性基」ともいう。）を
含有する化合物、特に好ましくはイミノ基を有する化合
物を意味する。上記のカチオン性基の存在形態は多様で
あって何ら制限されず、例えば化合物中にアミジノ基、
イミジノ基、ヒドラジノ基、ピリジル基等の状態で存在
してもよい。

【００１７】本発明においてアミン化合物は、医療診断
薬用途に使用した場合、水や緩衝液、血液、体液中に溶
出するとＰＣＲ法などの核酸増幅法を阻害することがあ
るため、粒子に化学的に結合されている必要がある。そ
の存在量は、粒子１ｇ当り平均で１×１０^-10mol以上で
あり、代表的には１×１０^-10〜１×１０^-2molであり、
好ましくは１×１０^-9〜１×１０^-3molであり、より好
ましくは１×１０^-8〜１×１０^-3molである。アミン化
合物の存在量が少な過ぎるとウイルス濃縮能力が不十分
である。本発明の作用、効果の観点からは、アミン化合
物の存在量の上限は特に限定されないが、製造技術的に
は１×１０^-2molを超える量で存在せしめることは通常
困難なことが多い。

【００１８】ウイルス濃縮材料は、例えば（１）重合性
アミン化合物を（必要に応じて他のコマオノマーととも
に）重合する方法、（２）アミン化合物を基材材料に結
合させる方法などにより製造することができる。

【００１９】（１）重合性アミン化合物を重合する方法 この方法に使用することのできる重合性アミン化合物と
しては、例えば２−（ジメチルアミノ）エチル（メタ）
アクリレート、２−（ジエチルアミノ）エチル（メタ）
アクリレート、２−（ジメチルアミノ）プロピル（メ
タ）アクリレート、３−（ジメチルアミノ）プロピル
（メタ）アクリレート等のアミノアルキル（メタ）アク
リル酸エステル類及びこれらの塩化メチレン、硫酸ジメ
チル、硫酸ジエチル等による４級塩；２−（ジメチルア
ミノエトキシ）エチル（メタ）アクリレート、２−（ジ
エチルアミノエトキシ）エチル（メタ）アクリレート、
３−（ジメチルアミノエトキシ）プロピル（メタ）アク
リレート等のアミノアルコキシアルキル（メタ）アクリ
ル酸エステル類及びこれらの塩化メチレン、硫酸ジメチ
ル、硫酸ジエチル等による４級塩；Ｎ−（２−ジメチル
アミノエチル）（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（２−ジ
エチルアミノエチル）（メタ）アクリルアミド、Ｎ−
（２−ジメチルアミノプロピル）（メタ）アクリルアミ
ド、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）（メタ）アク
リルアミド等のＮ−アミノアルキル基含有（メタ）アク
リルアミド類及びこれらの塩化メチレン、硫酸ジメチ
ル、硫酸ジエチル等による４級塩等が挙げられる。なか
でも、２−（ジメチルアミノ）エチル（メタ）アクリレ
ート、Ｎ−（２−ジメチルアミノエチル）（メタ）アク
リルアミド、及びこれらの塩化メチレンによる４級塩が
好ましい。これらは、１種単独であるいは２種以上を組
み合わせて使用することができる。

【００２０】重合性アミン化合物と共重合するモノマー
としては、下記に示すような架橋性モノマーならびに非
架橋性かつ非イオン性モノマーを挙げることができる。

【００２１】架橋性モノマーとしては、ジビニルベンゼ
ン、ジビニルビフェニル、エチレングリコールジ（メ
タ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）ア
クリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリ
レート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレ
ート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、
ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリ
プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラ
プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、１,４
−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１,６−ヘ
キサンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチル
グリコールジ（メタ）アクリレート、２，２'−ビス
〔４−（メタ）アクリロイルオキシプロピオキシフェニ
ル〕プロパン、２，２'−ビス〔４−（メタ）アクリロ
イルオキシジエトキジフェニル〕プロパン、グリセリン
トリ（メタ）アクリレート、トリメチロールブロパント
リ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ
（メタ）アクリレート等のジビニル系モノマー、トリビ
ニル系モノマー及びテトラビニル系モノマーが挙げられ
る。なかでも、ジビニルベンゼン、エチレングリコール
ジメタクリレートおよびトリメチロールプロパントリメ
タクリレートが好ましい。これらは１種単独であるいは
２種以上を組み合わせて使用することができる。

【００２２】共重合可能な非架橋性かつ非イオン性モノ
マーは、重合性アミン化合物あるいは架橋性モノマーの
いずれかと共重合可能であって、非架橋性かつ非イオン
性のモノマーである。

【００２３】このようなモノマーとして、スチレン、α
−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、ハロゲン化ス
チレン等の芳香族ビニル単量体；アクリロニトリル等の
不飽和ニトリル；メチルアクリレート、メチルメタクリ
レート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、
ブチルアクリレート、ブチルメタクリレート、シクロヘ
キシルメタクリレート、２−エチルヘキシルアクリレー
ト、２−エチルヘキシルメタクリレート、ラウリルアク
リレート、ラウリルメタクリレート、グリシジルアクリ
レート、グリシジルメタクリレート、２−ヒドロキシエ
チルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレー
ト等のアクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステ
ル；ブタジエン、イソプレン等のジオレフィン；酢酸ビ
ニル等のカルボン酸ビニルエステル；塩化ビニル、塩化
ビニリデン等のハロゲン化ビニリデン等を挙げることが
できる。なかでも、スチレン、α−メチルスチレン、ア
クリロニトリル、メチルメタクリレート、ブチルメタク
リレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、シクロ
ヘキシルメタクリレートが好ましい。これらのモノマー
は、１種単独であるいは２種以上を組み合わせて使用す
ることができる。

【００２４】上記重合性アミン化合物を含むモノマー成
分は水系分散媒中で重合開始剤の存在下、乳化重合、懸
濁重合、分散重合などにより重合される。

【００２５】重合開始剤としては、過硫酸塩類、あるい
は過酸化水素−塩化第一鉄、クメンヒドロペルオキシド
−アスコルビン酸ナトリウム等のレドックス系の水溶性
重合開始剤、ベンゾイルペルオキシド、ラウロイルペル
オキシド、ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノ
エート、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）
２塩基酸塩、アゾビスイソブチロニトリル、ビス（３，
５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイドなど
の油溶性重合開始剤が例示される。また、必要に応じて
界面活性剤、分散安定剤などを使用することもできる。

【００２６】（２）アミン化合物を基材材料に結合させ
る方法 粒子表面にカルボキシル基、ヒドロキシル基、エポキシ
基、アミノ基、アミド基、アルデヒド基、カルボキシル
基、酸クロライド基など官能基を有するモノマーを共重
合やシード重合法などで重合させることにより導入し、
次にそれら官能基を反応点としてアミン化合物を反応さ
せることにより、材料表面に導入することができる。上
記の官能基を有するモノマーの例として、アクリル酸、
メタクリル酸、クロトン酸、イタコン酸フマル酸、マレ
イン酸、ハイドロキシエチルメタアクリレート、２−ハ
イドロキシエチルアクリレート、２−ハイドロキシエチ
ルメタクリレート、グリシジルメタアクリレート、グリ
シジルアクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミ
ド、Ｎ−メチロールメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピ
ルアクリルアミドを挙げる事ができる。

【００２７】上記のようにして粒子表面に導入された官
能基と反応させるアミン化合物としては、例えば、生物
試料由来の、プトレッシン、カダベリン、スペルミジ
ン、スペルミン、1,3-ジアミノプロパン、カルジン、ホ
モスペルミン、3-アミノプロピルカダベリン、ノルスペ
ルミン、テルモスペルミン、カルドペンタミン等のポリ
アミンおよびそれらの重合生成物、ヒストンおよびプロ
タミンに分類される塩基性タンパク質とそれらの重合
体、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、ポリエチレ
ンイミン、ポリプロピレンイミンなどのポリアルキルア
ミン、ポリアルキルイミンなどに分類されるポリアミン
化合物、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン
などのポリアミノ酸類、その他ポリジエチルアミノエチ
ルメタクリレート、ポリジメチルアミノエチルメタクリ
レート、ポリビニルピリジン４級化物、ポリブレン、キ
トサン、グリコールキトサン、メチルグリコールキトサ
ン、ポリジアリルジメチルアンモニウム等の合成、天
然、半合成（発酵、遺伝子組み替えを含む）高分子、エ
チレンジアミン、トリメチレンジアミン、テトラメチレ
ンジアミン、ペンタメチレンジアミン、ヘキサメチレン
ジアミン等のジアミン類；3-アミノプロピルトリエトキ
シシランなどのシランカップリング剤等が挙げられる。
また、前述のアミン化合物を有するモノマーを共重合し
たポリマーなどを挙げることができる。

【００２８】本発明のウィルス濃縮材料は、内部または
表面に磁性体を含有することもできる。但し、この磁性
体は該材料の内部のみに含有され、表面に露出していな
いことが好ましい。本発明ウイルス濃縮材料を粒子形状
とした場合に特に磁性体を含有させる利点が得られる。
即ち、該粒子に磁気を作用させて収集することが可能と
なり、遠心分離等による操作が不要で検査時間を短縮す
ることが可能となるほか、検査・診断の自動化への対応
も容易となる。このような磁性体としては、例えば四三
酸化鉄（Ｆｅ₃Ｏ₄）、γ−重三二酸化鉄（γ−Ｆｅ
₂Ｏ₃）等の各種フェライト、鉄、マンガン、コバルト、
クロムなどの金属またはこれら金属の合金などを用いる
ことができる。

【００２９】磁性体の含有量は、ウイルス濃縮材料全体
に対し10重量％以上、特に20〜100重量％であることが
好ましい。この量が少なすぎると、粒子形状とした場合
の該ウイルス濃縮用粒子に、良好な磁気分離性が得られ
ず、その結果、後述するウイルスの分離・濃縮方法にお
いて、血液または体液等の検体からウイルス濃縮用粒子
を分離するために相当に長い時間を要するので、高い時
間的効率が得られないことがあり、好ましくない。

【００３０】磁性体をウイルス濃縮材料に含有させるに
は、 （ａ）上記（１）の方法により重合を行う際に、モノマ
ーを含む重合成分に磁性体を混合して重合を行う。 （ｂ）高分子を構成するモノマーを含む重合成分を通常
の高分子粒子水分散体を得る方法で重合し、高分子粒子
水分散体を得る。この粒子表面に磁性体層を形成する。 （ｃ）高分子を実質的に水不溶で水より沸点の低い溶媒
に溶解し、磁性体をこの溶液に分散する。これを適当な
乳化剤ないしは分散剤を用いて水に分散させ、溶媒を蒸
留により除去する。

【００３１】また磁性体の表面露出を防ぐために上記の
（ａ）、（ｂ）または（ｃ）で得られた高分子水分散体
をシードとしてモノマーを添加して重合し、粒子表面に
高分子層を形成する事も可能である。（ｂ）及び（ｃ）
の方法により磁性体を導入したポリマー粒子の表面にア
ミン化合物を結合させるには、前述の（２）の方法を行
えばよい。

【００３２】本発明のウイルス濃縮材料が粒子状で懸濁
液として使用する場合、その分散媒に乳化剤、分散剤、
未反応モノマー、水溶性ポリマー、重合開始剤の分解物
などを含んでいる場合がある。これらの物質は、核酸増
幅検査段階において反応阻害物となる可能性が高いた
め、例えばAdv.Colloid Interface Sci.,81,77〜165(19
99)などに示される方法によりウイルス濃縮用粒子の分
散媒から除去することが好ましい。後述するアミン化合
物の定量に滴定を採用する場合には、最終的に混床型イ
オン交換樹脂などを用いてウイルス濃縮用粒子を精製す
ることが好ましい。

【００３３】［有用性］本発明のウイルス濃縮材料は、
例えば血液や体液等の検体中のウイルスを吸着、除去す
ること、吸着した後、該材料から適当な液中に脱着させ
て濃縮することなどの利用することができる。該材料に
より分離・濃縮されたウイルスは核酸抽出・検査・診
断、特に核酸増幅を伴う検査・診断に好適に用いられ
る。

【００３４】また、本発明のウイルス濃縮材料が粒子状
である場合、試料中のウイルス外皮蛋白の検出にも使用
することができる。具体的には、該粒子を試料と混合
し、吸着されたウイルス外皮蛋白を標識抗体で検出する
方法をあげることができる。この方法では、標識抗体の
種類を変えることにより各種のウイルス外皮蛋白を検出
することができる。

【００３５】

【実施例】以下、本発明の実施例について説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。な
お、「部」は特記しない限り重量部を意味する。 Ｉ．［ウイルス濃縮材料の形態が粒子状である場合の実
施例、及び比較例］ 以下の実施例において、得られたウイルス濃縮材料に存
在するアミン化合物の量および粒径は、下記の方法で測
定した。

【００３６】・アミン化合物の存在量： 電導度滴定法：ウイルス濃縮材料を遠心分離あるいは
磁気分離により純水で２回洗浄し、粒子１gあたり混床
型イオン交換樹脂５ｇを添加し、混合後１時間攪拌した
後、混床型イオン交換樹脂を濾去した。この混床型イオ
ン交換樹脂による精製を２回繰り返した。得られた精製
粒子のカチオン性基を硫酸規定液を滴定液として滴定し
アミン化合物含有量とした。この方法は下記実施例１〜
６に適用した。 非水滴定法：上記と同様にウイルス濃縮材料を精製
後、乾燥しクロロホルムに溶解し、クロロホルムに不溶
分を濾去した後、過塩素酸／酢酸溶液の規定液を用いて
滴定しアミン化合物量を定量した。この方法は下記実施
例７〜１０に適用した。

【００３７】実施例１ 油性磁性流体「マーポマグナＦＶ−５５」［松本油脂製
薬（株）製］にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた
後、これを乾燥することにより、親油化処理された表面
を有するフェライト系の超常磁性体粒子（粒子径：０．
０１μｍ）を得た。ついで、超常磁性体粒子４０部にシ
クロヘキシルメタクリレート９０部、トリメチルアミノ
エチルメタクリレートの塩化物１０部およびビス（３，
５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド（重
合開始剤）３部を添加し、この系を混合攪拌することに
より超常磁性体を均一に分散させてモノマー組成物を調
製した。

【００３８】一方、ポリビニルアルコール１０部、およ
びポリエチレンオキシドノニルフェニルエーテル０．１
部を水１０００部に溶解して水分散体を調製した。得ら
れた水性媒体（水相）中に上記のモノマー組成物を添加
し、超音波分散機で分散処理することにより平均粒子径
が１μｍの油滴（油相）が水性媒体に分散されてなる懸
濁液（油滴分散体）を調製した。次に、得られた懸濁液
を容量２リットルの攪拌機付き三つ口フラスコに仕込
み、この系を７５℃に昇温し、窒素雰囲気下において攪
拌しながら５時間にわたり油滴中のモノマーを重合（懸
濁重合）させることにより、本発明のウイルス濃縮材料
を製造した。

【００３９】実施例２ 実施例１において油性磁性流体「マーポマグナＦＶ−５
５」［松本油脂製薬（株）製］を「フェリコロイドHC5
0」［タイホー工業（株）製］に代えた以外は実施例１
と同様にして、本発明のウイルス濃縮材料を製造した。

【００４０】実施例３ 実施例１において重合開始剤をビス（３，５，５−トリ
メチルヘキサノイル）パーオキサイドからベンゾイルペ
ルオキシドに代えた以外は実施例１と同様にして、本発
明のウイルス濃縮材料を製造した

【００４１】実施例４ 実施例１においてトリメチルアミノエチルメタクリレー
トの塩化物１０部をジメチルアミノエチルメタクリレー
ト１０部に代えた以外は実施例１と同様にして、本発明
のウイルス濃縮材料を製造した。

【００４２】実施例５ 実施例１においてシクロヘキシルメタクリレートの使用
量を１００部とし、トリメチルアミノエチルメタクリレ
ートの塩化物を使用せず、ビス（３，５，５−トリメチ
ルヘキサノイル）パーオキサイド（重合開始剤）３部の
代りに２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）２
塩基酸塩５部を使用した以外は実施例１と同様にして、
本発明のウイルス濃縮材料を製造した。

【００４３】実施例６ 実施例１において分散処理に超音波微分散機を使用せ
ず、高速剪断ミルタイプのホモジナイザーを使用するこ
とにより平均粒子径が４μｍの油滴（油相）が水性媒体
に分散されてなる懸濁液（油滴分散体）を調製した以外
は実施例１と同様にして、本発明のウイルス濃縮材料を
製造した。

【００４４】実施例７ （１）実施例１においてシクロヘキシルメタクリレート
の使用量を９５部とし、トリメチルアミノエチルメタク
リレートの塩化物１０部の代わりにメタクリル酸５部を
使用した以外は実施例１と同様にして磁性ポリマー粒子
を製造した。 （２）上記（１）で得られた磁性ポリマー粒子を５ｍM
水酸化ナトリウム水溶液に分散し、８０℃で１２時間処
理してカルボキシ変性磁性ポリマー粒子とした。 （３）得られたカルボキシ変性磁性ポリマー粒子１ｇ
（乾燥重量）を２０ｍLの１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝溶液
（ｐＨ６）に添加し、ポリエチレンイミン（数平均分子
量７万）の３０％水溶液０．１ｍLおよびカルボジイミ
ド試薬であるＥＤＣ・塩酸塩（１−エチル−３（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロライ
ド）０．２ｇを添加し、２０℃で２時間反応させ、本発
明のウイルス濃縮材料を得た。

【００４５】実施例８ （１）実施例７（２）と同様にして得られたカルボキシ
変性磁性ポリマー粒子１ｇ（乾燥重量）を２０ｍLの１
０ｍＭ ＭＥＳ緩衝溶液に添加し、ポリ−Ｌ−リジン臭
化水素物（数平均分子量３０万）の１％水溶液１ｍLお
よび水溶性カルボジイミド試薬であるＥＤＣ・塩酸塩
（１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミドヒドロクロライド）０．２ｇを添加し、２０
℃で２時間反応させ、ポリ−Ｌ−リジン固定磁性粒子か
らなる本発明のウイルス濃縮材料を得た。

【００４６】実施例９ （１）実施例７（２）と同様にして得られたカルボキシ
変性磁性ポリマー粒子１ｇ（乾燥重量）を２０ｍLの１
０ｍＭ ＭＥＳ緩衝溶液に添加し、ポリアリルアミン
（ＰＡＡ；数平均分子量１０万）の１％水溶液１ｍLお
よび水溶性カルボジイミド試薬であるＥＤＣ・塩酸塩
（１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミドヒドロクロライド）０．２ｇを添加し、２０
℃で２時間反応させ、ポリアリルアミン固定磁性粒子か
らなる本発明のウイルス濃縮材料を得た

【００４７】実施例１０ （１）実施例１においてシクロヘキシルメタクリレート
の使用量を９０部に変え、トリメチルアミノエチルメタ
クリレートの塩化物の代わりにグリシジルメタクリレー
ト１０部を用いた以外は実施例１と同様にしてグリシジ
ル変性磁性粒子を得た。 （２）得られたグリシジル変性磁性粒子１ｇ（乾燥重
量）を１％のピリジンを含有する蒸留水２０ｍLに懸濁
し、ポリエチレンイミン（数平均分子量７万）の３０％
水溶液０．１ｍLを添加し、６０℃で２４時間反応さ
せ、ポリエチレンイミン固定磁性粒子からなる本発明の
ウイルス濃縮材料を得た。

【００４８】

【表１】

【００４９】ウイルスの濃縮及びＰＣＲ試験結果 （１）実施例１〜１０で得られた粒子の水分散体を精製
後、生理食塩水で固形分濃度５重量％に調整した。 （２）ＨＢＶを１０⁵コピー／mL含有するヒト血漿を、
ウイルスＤＮＡ陰性血漿を用いて段階的に希釈し、 Ｈ
ＢＶを１０⁴〜１０¹コピー／mLで含有する試料を調製し
た。この試料５ｍＬに上記（１）で調製した粒子懸濁液
（５重量％）100μＬを加え、室温で１０分間回転撹拌
し、ウイルス吸着処理を行った。

【００５０】ウイルス吸着処理後、磁気分離スタンドに
セットし、粒子と上清を分離し、上清を捨て、 Tris-HC
l緩衝液(pH7.4)を加え、100μLの粒子分散液を調製し
た。この粒子分散液から、DNA抽出キット（和光純薬工
業株式会社）を用いて、付属の調製法に従い核酸を抽出
した。比較例１として、 ＨＢＶを１０⁴〜１０¹コピー
／mＬで含有する血漿検体100μＬから、DNA抽出キット
を用いて核酸を抽出した。得られた抽出物をPCR法によ
り、３５回の増幅過程によりDNAを増幅した。PCRのプラ
イマー配列は、Hiroaki Okamoto, Igaku no ayumi, (19
92),162(9),544-549.に従った。得られたPCRの増幅産物
を3%アガロースを用いて電気泳動を行い、エチジウムブ
ロマイド染色によりDNAを可視化しポラロイド（登録商
標）写真に撮影した。得られた目的DNAの量をバンドの
蛍光強度から、-,+,++,+++の４段階で判定した。結果を
表２〜１２に示す。

【００５１】

【表２】 （実施例１）

【００５２】

【表３】 （実施例2）

【００５３】

【表４】 （実施例3）

【００５４】

【表５】 （実施例４）

【００５５】

【表６】 （実施例５）

【００５６】

【表７】 （実施例６）

【００５７】

【表８】 （実施例７）

【００５８】

【表９】 （実施例８）

【００５９】

【表１０】 （実施例９）

【００６０】

【表１１】 （実施例１０）

【００６１】

【表１２】 （比較例１）

【００６２】本発明の粒子を用いずに実施した比較例１
（表１２）の実験からは、ウイルス核酸の検出には1×1
0^２ copies/mL以上のウイルス濃度が必要であり、1×10
^１ copies/mL以下の検体からはウイルスを検出すること
は出来なかった。一方、本発明の粒子を用いて、検体を
５０倍濃縮して実施した実施例１〜１０（表２〜１１）
の実験の結果、少なくとも1×10^１ copies/mL以上のウ
イルス濃度の検体からウイルス核酸が検出でき、本発明
の粒子は、高感度のウイルス検出において有効であっ
た。

【００６３】実施例１１ 実施例７のウィルス濃縮用粒子の水分散体を精製後、生
理食塩水で固形分濃度５％に調整したもの１００μＬを
濃度既知のＨＢｓＡｇ陽性検体の希釈サンプル画１００
μＬに添加し、チューブミキサーで１５分間撹拌した。
撹拌後、磁気分離スタンドにて粒子を分離し、上清を除
去し続いてトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）ｐＨ７．５
で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ＨＢｓ抗体（特殊免疫
研究所製）を１００μＬを添加して反応させ、ＴＢＳで
洗浄し、基質液１００μＬを添加して発色反応を３０分
間行い硫酸を添加して反応を停止させ、各々吸光度を測
定した。結果を表１３に示す。

【００６４】

【表１３】

【００６５】II．［ウイルス濃縮材料が多孔質膜状であ
る場合の実施例及び比較例］ 以下の実施例における特性は、以下の条件あるいは方法
で測定した。 １．透水量： ２５℃±２℃で測定した値である。 ２．空孔率： 下式（Ａ）により算出した。 空孔率（％）＝空孔部の体積／（空孔部の体積＋フィル
ター実績部の体積）×１００

【００６６】３．膜の最大孔径： ＡＳＴＭ−Ｆ３１６
を参考にしてバブルポイント法により求めた値である。
最大孔径は、製膜後の膜全体に均一に存在する孔の最大
孔径を表わす値であり、ピンホ−ルや製膜後に作られた
該最大孔径より大きな孔などは含まれない。 ４．フラメント直径： 走査型電子顕微鏡で観察したフ
ィラメントの長径と短径の平均値のことであり、異形フ
ィラメントであっても多孔質フィラメントであっても同
様である。

【００６７】５．ウイルスの定量： プラ−ク（溶菌
班）法により行った。すなわち、検体を宿主細胞もしく
は宿主細菌と接触させてたのち、ウイルスに感染するこ
とにより生成するプラ−ク（溶菌班）数を測定すること
により求めた。ウイルス捕捉率は、下式（Ｂ）により算
出した。 ウイルス捕捉率（％）＝（１−生存ウイルス数）／原液
中のウイルス数×１００ ウイルス捕捉率が高いほどウイルス濃縮能力が高いとい
える。本発明ではウイルス捕捉率９５％以上を充分なウ
イルス濃縮能力を有する材料と判断した。

【００６８】実施例１２ メルトフローインデックスが３０及び０．３の二種のポ
リプロピレンの混合物（混合重量比１００：４０）１０
０部当り、３２０部の流動パラフィン（数平均分子量３
２４）及び０．３部の結晶核形成剤としての１，３，
２，４−ビス（ｐ−エチルベンジリデン）ソルビトール
を二軸型押出機により溶融混練しペレット化した。この
ペレットを上記押出機を用いて１５０〜２００℃で溶融
し、スリット幅０．６ｍｍのＴダイスより空気中に押し
出して、Ｔダイス直下に置かれた冷却液相のガイドロー
ラーの回転によってポリエチレングリコ−ルよりなる冷
却固化液中に導き冷却固化した後、１，１，２−トリク
ロロ−１，２，２−トリフルオロエタンに浸漬して流動
パラフィンの抽出を行なった。続いて、１３５℃の空気
中で２分間熱処理し、最大孔径０．５μｍ、空孔率５８
％、膜厚８０μｍのポリプロピレンフィルタ−を得た。

【００６９】このようにして得られたポリプロピレンフ
ィルタ−に、アルゴンプラズマ（１００Ｗ、０．１Ｔｏ
ｒｒ、１５秒間）を照射した後、２−メトキシエチルア
クリレ−トガス（１．０ Ｔｏｒｒ）に３分間、次にグ
リシジルアクリレ−トガス（０．７Ｔｏｒｒ)に３分間
接触させて表面グラフト重合を行い、表面に反応性官能
基を有する親水性多孔質膜を得た。続いて、１ｗｔ％の
ポリエチレンイミン（分子量１８００）と１．０ｗｔ％
のピリジンを含む水溶液に、６０℃、１８時間浸漬する
ことにより膜表面にポリエチレンイミンを固定化した。
得られた膜は、水及び塩化メチレン／メタノ−ル共沸溶
媒で良く洗浄した後、試料とした。

【００７０】ポリプロピレン膜の表面に導入されたポリ
（２−メトキシエチルアクリレ−ト）とグリシジル基に
結合したポリエチレンイミンは、ＩＲスペクトル（ＡＴ
Ｒ法）により確認した。ＥＳＣＡで求めた窒素／炭素比
は０．０６であった。また、過塩素酸滴定により求めた
アミンの量は、３．３×１０^-4mol／ｇであった。該膜
の空孔率は５５％、透水量３９０mL/min/m²/mmHg、最大
孔径０．５２μｍであった。

【００７１】この膜を、ニュ−クリポア製スウインロッ
クフィルタ−ホルダ−（直径２５ｍｍ）にセットし、ヘ
ルペスウイルス type Ｉ H.F. 株を約１０⁴ (PFU/mL)と
なるように添加したＰＢＳバッファ−（ｐＨ７．３５〜
ｐＨ７．６）、及び人新鮮血より採取した血漿を、各々
１０ｍＬ濾過してウイルス捕捉率を測定したところ、Ｐ
ＢＳバッファ−中で９９．９％以上、人血漿中で９８％
であった。また、φＸ１７４（バクテリオファ−ジ）に
ついても同様に試験を行った結果、人血漿中で９９％、
水中で９８％以上の捕捉率を示した。

【００７２】実施例１３ グリシジルアクリレ−トのかわりにグリシジルメタクリ
レ−トを使用した他は、実施例１２と同様で、ポリフッ
化ビニリデンフィルター（ミリポア社製）にポリエチレ
ンイミン（分子量７０，０００）を固定化したフィルタ
−を作製した。この膜のＥＳＣＡで求めた窒素／炭素比
は０．０８、過塩素酸滴定により求めたアミンの量は、
４．８×１０^-4mol／ｇであった。この膜の空孔率は６
１％、透水量３８０mL/min/m²/mmHg、最大孔径０．５０
μｍであった。

【００７３】この膜を、ニュ−クリポア製スウインロッ
クフィルタ−ホルダ−（直径２５ｍｍ）にセットし、ヘ
ルペスウイルス type Ｉ H.F. 株を約１０⁴ (PFU/mL)含
むＰＢＳバッファ−（ｐＨ７．３５〜ｐＨ７．６）と人
新鮮血より採取した血漿を、各々１０ｍＬ濾過し、ウイ
ルス捕捉率を測定したところ、ＰＢＳバッファ−中で９
９％以上、人血漿中で９９％であった。また、φＸ１７
４（バクテリオファ−ジ）についても同様に試験を行っ
た結果、人血漿中で９８％，水中で９９％以上の捕捉率
を示した。

【００７４】実施例１４ 実施例１２と同様の方法で作製したポリプロピレンフィ
ルターに、アルゴンプラズマ（１００Ｗ、０．２Ｔｏｒ
ｒ、２０秒間）を照射した後、グリシジルアクリレ−ト
ガス（０．７Ｔｏｒｒ)を３分間接触させて表面グラフ
ト重合を行い、表面に反応性官能基を有する親水性多孔
質膜を得た。続いて、１ｗｔ％のポリエチレンイミン
（分子量７０，０００）と０．５ｗｔ％のピリジンを含
む水溶液に、６０℃、１８時間浸漬することにより膜表
面にポリエチレンイミンを固定化した。得られた膜は、
水及び塩化メチレン／メタノ−ル共沸溶媒で良く洗浄し
た後、試料とした。

【００７５】この空孔率は５７％、透水量３５２mL/min
/m²/mmHg、最大孔径０．４９μｍであった。この膜のＥ
ＳＣＡで求めた窒素／炭素比は０．０７、過塩素酸滴定
により求めたアミンの量は、４．４×１０^-4 mol／ｇで
あった。この膜を、ニュ−クリポア製スウインロックフ
ィルタ−ホルダ−（直径２５ｍｍ）にセットし、実施例
１２と同様にヘルペスウイルス type Ｉ H.F. 株の捕捉
率を測定したところ、ＰＢＳバッファ−中で９９％以
上、人血漿中で ９８％であった。また、φＸ１７４
（バクテリオファ−ジ）についても同様に試験を行った
結果、人血漿中で９８％，水中で９９％以上の捕捉率を
示した。

【００７６】実施例１５ 実施例１２と同様の方法で作製したポリプロピレンフィ
ルターに、ポリエチレンイミンのかわりにイミノビスプ
ロピルアミンを固定化した膜を得た。この空孔率は５６
％、透水量３４８mL/min/m²/mmHg、最大孔径０．４９μ
ｍであった。この膜のＥＳＣＡで求めた窒素／炭素比は
０．０３、過塩素酸滴定により求めたアミンの量は、
２．４×１０^-4 mol／ｇであった。この膜を、ニュ−ク
リポア製スウインロックフィルタ−ホルダ−（直径２５
ｍｍ）にセットし、実施例１と同様にヘルペスウイルス
type Ｉ H.F. 株の除去率を測定したところ、ＰＢＳバ
ッファ−中で９９．９％以上、人血漿中で ９９．６％
であった。また、φＸ１７４（バクテリオファ−ジ）に
ついても同様に試験を行った結果、人血漿中で９８％，
水中で９９％以上の捕捉率を示した。

【００７７】実施例１６ ポリプロピレン製不織布（東燃（株）製タピルス）に、
実施例１２と同様にしてポリエチレンイミン（分子量１
２００）を固定化した膜を得た。このフィルタ−をフィ
ルタ−ホルダ−（直径４７ｍｍ）に３０枚積層してセッ
トし、実施例１と同様にヘルペスウイルス type Ｉ H.
F. 株を用いてウイルス捕捉率を測定したところ、ＰＢ
Ｓバッファ−中で９９％以上、人血漿中で９８％であっ
た。また、φＸ１７４（バクテリオファ−ジ）について
も同様に試験を行った結果、人血漿中で９９％、水中で
９９％以上の捕捉率を示した。

【００７８】実施例１７ ポリウレタン製多孔質フィルタ−（東洋ポリマ−（株）
製ルビセル）に、実施例１２と同様の方法でにしてポリ
エチレンイミンを固定化したフィルタ−を得た。過塩素
酸滴定により求めたアミンの量は、１．６×１０^-4 mol
／ｇであった。該膜の空孔率は８２％、透水量１．１×
１０⁴ mL/min/m²/mmHg 、最大孔径１８μｍであった。

【００７９】このフィルタ−を、フィルタ−ホルダ−
（直径４７ｍｍ）に２０枚積層し、ヘルペスウイルス t
ype Ｉ H.F. 株を約１０4 (PFU/mL)含むＰＢＳバッファ
−（ｐＨ７．３５〜ｐＨ７．６）と人血液を、各々３０
ｍＬ濾過し、ウイルス捕捉率を測定したところ、ＰＢＳ
バッファ−中で９９％以上、人血漿中で９８％であっ
た。また、φＸ１７４（バクテリオファ−ジ）について
も同様に試験を行った結果、人血漿中で９８％，水中で
９８％以上の捕捉率を示した。

【００８０】比較例２ 実施例１２で基材として用いたポリプロピレンフィルタ
−に、実施例１と同様の方法で、２−メトキシエチルア
クリレ−トとグリシジルアクリレ−トを表面グラフト重
合させた膜を作製した。該膜の空孔率は５９％、透水量
４３４mL/min/m ²/mmHg 、最大孔径０．５μｍであっ
た。実施例１２と同様の方法でウイルス捕捉試験を行っ
た。該フィルタ−は、ＰＢＳバッファ−中、血漿中のど
ちらにおいても、ヘルペスウイルス、φＸ１７４の各捕
捉率は５０％以下であり、濃縮することができなかっ
た。

【００８１】比較例３ 実施例１２で基材として用いたポリプロピレンフィルタ
−に、実施例１２と同様の方法で、平均分子量１２００
のポリエチレンイミンを６０℃、１時間反応させて、膜
表面に固定化した。この膜の空孔率は５７％、透水量３
６５mL/min/m²/mmHg、最大孔径０．５０μｍであった。
この膜のＥＳＣＡで求めた窒素／炭素比は０．００４、
過塩素酸滴定により求めたアミンの量は、０．７×１０
^-4 mol／ｇであった。

【００８２】実施例１２と同様にしてウイルス除去率を
測定したところ、ヘルペスウイルスでは、ＰＢＳバッフ
ァ−中で９９．９％以上、人血漿中で５４％、また、φ
Ｘ１７４（バクテリオファ−ジ）では、人血漿中で５０
％以下、水中で９９．９％以上の除去率を示した。水中
ではウイルスを除去できるものの、種々の蛋白質を含む
血漿中ではウイルスを捕捉、濃縮することができなかっ
た。

【００８３】比較例４ 実施例１２で基材として用いたポリプロピレンフィルタ
−に、アルゴンプラズマ（１００Ｗ、０．１Ｔｏｒｒ、
１５秒間）を照射した後、２−メトキシエチルアクリレ
−ト（０．８Ｔｏｒｒ）を３分間、４−ビニルピリジン
（０．８Ｔｏｒｒ）で２分間接触させて表面グラフト重
合を行なった後、０．１モルのベンジルクロライドを含
むメタノ−ル中で５５℃で３時間、４級化反応を行なう
ことにより、ピリジニウム構造を表面に有する空孔率５
７％，透水量１０⁴ mL/min/m²/mmHg、最大孔径０．４８
μｍの膜を得た。

【００８４】該フィルタ−のウイルス除去率を実施例１
２と同様の方法で測定したところ、ＰＢＳバッファ−中
では、ヘルペスウイルス及びφＸ１７４を９８％以上捕
捉することができたが、人血漿中ではどちらのウイルス
の捕捉率も５０％以下であった。

【００８５】

【発明の効果】本発明のウイルス濃縮材料は、ウイルス
の認識・分離（除去）・濃縮などに使用することができ
るため、食品工業、発酵工業、医薬品工業を初めとした
産業界で広く実用可能な材料である。また、血漿などの
蛋白質成分を含む溶液中でもウイルスを認識できるた
め、医療や生活現場におけるウイルス汚染やウイルス感
染の防止、治療、診断などに有効である。

【００８６】本発明のウイルス濃縮材料が粒子状である
場合、遠心分離や磁気を作用させる簡便な手段により、
同時に多数の検体を簡便に濃縮処理することのができ、
しかも得られた濃縮ウイルスを含む試料は核酸増幅の処
理に悪影響を及ぼさない。この粒子を利用するウイルス
濃縮方法は、極く微量のウイルスを含む検体からウイル
スを効率良く短時間で濃縮することができ、その結果ウ
イルスをより高精度で検出することができる。

【００８７】また、本発明のウィルス濃縮用粒子は検体
よりウィルスを吸着した後、免疫化学的測定に供するこ
ともできる。また、多孔質膜として用いた場合、取り扱
いが容易であり、しかもウイルスに対して選択的な相互
作用を有し、簡便で処理速度に優れている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 佐藤 功栄 茨城県猿島郡総和町大字下大野字高谷2965 −37 (72)発明者 田中 建志 東京都世田谷区用賀３−15−14−107 Ｆターム(参考） 2G045 BA13 BA20 BB03 CA26 CB21 FA36 FB15 HA06 4B065 AA95X BC42 BC46 BD14 BD18 BD39 BD40 BD41 CA44 CA46

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】表面にアミン化合物を固定化した材料から
   なるウイルス濃縮材料。
2. 【請求項２】前記アミン化合物が、１級アミノ基、２級
   アミノ基、３級アミノ基；第４級アンモニウム基、イミ
   ノ基、アミジノ基、イミジノ基、ヒドラジノ基、及び含
   窒素環式基からなる群から選ばれる基を含有する化合物
   である、請求項１に記載のウイルス濃縮材料。