JP2002000262A - 芳香族化合物分解活性細菌及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ビスフェノールＡ及びスチルベン骨格を持つ
芳香族化合物を分解することができる微生物を提供する
ことを目的とする。 【解決手段】 土壌、活性汚泥等の分離源をビスフェノ
ールＡを単一炭素源とする培地で培養しそれから増殖し
てきた微生物より、Sphingomonas属に属し新種の細菌で
あるSphingomonas sp. AO-1 株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７７
９４）が単離された。この細菌はビスフェノールＡやス
チルベン骨格を持つ芳香族化合物を効率良く分解するこ
とができ、環境浄化に利用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規微生物とそれを利
用した環境浄化方法に関する。更に詳細には、ビスフェ
ノールＡ及びスチルベン骨格を持つ芳香族化合物の少な
くとも１種の芳香族化合物を分解することができる細
菌、及びその細菌をビスフェノールＡやスチルベン骨格
を持つ芳香族化合物を含有する土壌、水質又はその他の
廃棄物に作用させて芳香族化合物を分解する環境浄化に
利用し得る芳香族化合物の分解方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、プラスチック等の樹脂製品の工業
的利用の増加にともない、次世代に及ぼす催奇形性等の
深刻な影響が懸念されるビスフェノールＡ等の環境ホル
モン様作用を持つ物質の環境への流出による水質汚染が
問題となっている。例えばビスフェノールＡはプラスチ
ック製品や飲料缶などから溶出し、0.228ppbという低濃
度でもマウス受精卵初期胚の細胞分裂に影響を与える(1
999.06.17毎日新聞)。また、ビスフェノールＡを混ぜた
エサを妊娠マウスに1週間与え、生まれた子供を調べた
ところ、2ppbの群では精巣上体の萎縮、20ppbの群では
精子の生産能力が落ちていた(1998.5.27毎日新聞)。ビ
スフェノールＡがプラスティック容器から熱湯により溶
出するということで学校給食のポリカーボネート製食器
が一掃された。建設省の河川調査によると256地点のう
ち147地点で環境ホルモンが検出され、日本の河川が広
範囲に汚染されていることが明らかになっている。その
うち河川中のビスフェノールＡの最高濃度は1.4ppbであ
ったという(1998.10.26毎日新聞)。同省では今後環境ホ
ルモンを減少させる処理施設の建設を検討するとしてい
る(1999.06.23毎日新聞)。また、廃棄物の採取処分場の
中に滲みだしてくる水の中に、最高17.2ppmという高濃
度のビスフェノールＡが含まれ、処分場の廃プラスチッ
ク製品の一部からこれらの物質が溶けだしている(1998.
5.31神戸新聞)。環境ホルモンの中には農薬の一部も含
まれており、その汚染源は農地やゴルフ場といわれてい
る。このような広く水系や土壌中に拡散した汚染物質の
除去には、微生物による分解が最も実用的可能性が高い
と考えられているが（地球がよみがえる、シーエムシ
ー）、いまのところフィールドレベルでの汚染除去技術
は確立されていない。

【０００３】公知のビスフェノールＡ分解菌としては、
未同定のMV1株(Applied and Environmental Microbiolo
gy、 58: 1823-1831、 1992)と Pseudomonus paucimobi
lisFJ-4 株(後に、Sphingomonas paucimobilis と変更)
(Japanese Journal of Water Treatment Biology、 31
203-212、 1995)の2株のみ知られている。MV1株は後期
条件でビスフェノールＡを分解すると、4-ヒドロキシア
セトフェノンが蓄積し、これが1.5mM以上になると増殖
できなくなる欠点があった。また、分解副生成物として
難分解性の4-ヒドロキシ-3-メチル アセトフェノンや4-
ヒドロキシ-3-メチル 安息香酸、更に 2、2 ービス (4-
ヒドロキシ-3-メチルフェニル) ー 1ー プロパノール
が生成して培地中に蓄積する(Applied and Environment
al Microbiology、 58: 1823-1831、 1992)。一方、FJ4
株は、飽和濃度のビスフェノールＡ(約1.5mM)は分解で
きず、初期濃度として最大で1mM のビスフェノールＡを
培養液中で分解する程度であった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】以上より生物的浄化に
用いる微生物には十分なビスフェノールＡ等の分解活性
を持ち得るだけでなく、中間代謝物を残留させることな
くビスフェノールＡ等の芳香族化合物を完全に分解・除
去する微生物の取得が望まれている。更に、環境中では
原生動物による捕食や他の微生物との競合等の影響によ
って、散布した分解微生物の密度は抑制されて、必用な
処理能力を発揮できない場合が多い。また、仮に目的物
質を分解できる能力のある微生物を環境中に導入して
も、水中に含まれる他の有機溶媒等の影響により、目的
物質の分解活性が発揮されずに、導入した微生物が死滅
してしまう可能性もあるため、有機溶媒耐性等の付加価
値の高い菌が求められている。以上より、自然界から高
い活性をもった微生物を分離するだけでなく、遺伝子工
学を駆使して高い分解活性や環境への定着性を持った微
生物への育種が行われている。しかし、現在、特定の微
生物、特に遺伝子組換え微生物を環境中に放出すること
による生態系への影響が懸念されているため、滅菌され
た菌体により目的物を分解することができれば、微生物
の活用の範囲が広くなる。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、ビスフェノー
ルＡやスチルベン骨格を持つ芳香族化合物を、従来から
知られている微生物よりも効率よく分解することができ
る新規微生物、及び該微生物を使用してのビスフェノー
ルＡやスチルベン骨格を持つ芳香族化合物の分解方法を
提供するものである。本発明者らは、上記の課題を解決
すべく種々検討した結果、従来知られている微生物より
も非常に高いビスフェノールＡやスチルベン骨格を持つ
芳香族化合物の分解能を有する、既存のいずれの種にも
属さない新規な微生物を単離することに成功し、本発明
を完成させた。従って本発明は、ビスフェノールＡ及び
スチルベン骨格を持つ芳香族化合物の少なくとも１種の
芳香族化合物を分解することができ、Sphingomonas属に
属し、既存のいずれの種にも属さない新種の細菌であ
る。 この細菌は、より具体的には、次の性質： 形態 : 桿菌 グラム染色性 : − 胞子 : − 運動性 : ＋ 酸素に対する態度: 好気性 オキシダーゼ : ＋ カタラーゼ : ＋ ＯＦ : − 集落の色調 : 黄色系 を有する。代表的な株は、Sphingomonas sp. AO-1 株
（ＦＥＲＭ P-17794）である。スチルベン骨格を持つ芳
香族化合物としては、例えばtrans-スチルベン、スチル
ベン染料（クリソフェニンＧなど）等の化合物が挙げら
れる。更に本発明は、上記細菌を、ビスフェノールＡ及
びスチルベン骨格を持つ芳香族化合物から選ばれる芳香
族化合物に作用させることを特徴とする芳香族化合物の
分解方法を提供する。更に本発明は、ビスフェノールＡ
及びスチルベン骨格を持つ芳香族化合物の少なくとも１
種の芳香族化合物を含有する土壌、水質又はその他の廃
棄物中の芳香族化合物の分解方法であって、該土壌、水
質又はその他の廃棄物に、上記細菌の培養物又は菌体を
付着させた保持担体を添加することを特徴とする芳香族
化合物の分解方法を提供する。この培養物は、生菌体で
も、又は滅菌処理した培養物でもよく、滅菌処理として
は、例えば紫外線照射や濾過滅菌が挙げられる。

【０００６】

【発明の実施の形態】発明の代表的な菌株であるSphing
omonas sp. AO-1 株は、以下のような集積培養法を用い
て分離することができる。例えば、土壌、活性汚泥等の
分離源をビスフェノールＡを単一炭素源として20μg/mL
含有する培地中で培養し、増殖してきた培養液を更にビ
スフェノールＡを60μg/mL含有する培地中で培養し、さ
らにビスフェノールＡを100μg/mL含有する培地中で培
養する。その後、ビスフェノールＡを単一炭素源として
100μg/mL含有する寒天培地にて、分解能を有する微生
物を選択する。上記のようにして分離したSphingomonas
sp. AO-1 株は、次のような菌学的性質を有する。 形態 : 桿菌 グラム染色性 : − 胞子 : − 運動性 : ＋ 酸素に対する態度: 好気性 オキシダーゼ : ＋ カタラーゼ : ＋ ＯＦ : − 集落の色調 : 黄色系

【０００７】AO-1 株はさらに次の性質を有する。 嫌気下での生育 : − カタラーゼ : ＋ オキシダーゼ : ＋ 硝酸塩の還元 : ＋ V-P反応 : − V-P brothのpH : 6.91 カゼインの分解 : − ゼラチンの分解 : ＋ エスクリンの分解: − 澱粉の分解 : − DNAの分解 : − 尿素の分解 : − チロシンの分解 : − アルギニンの分解: − Tween20の分解 : − Tween80の分解 : − クエン酸の利用 : ＋ インドールの生成: − 硫化水素の生成 : − NaCl存在下で の生育 : 2%: − 5%: − 7%: − 生育pH : 5.5-8.5 生育温度(℃) : 10-40 0.01%リゾチウム 存在下での生育 : −

【０００８】AO-1株は下記の糖からの酸の生成の有無は
次の通りである。 グルコース : ＋ アラビノース : ＋ フルクトース : − ガラクトース : ＋ マルトース : ＋ ラクトース : − シュークロース: ＋ キシロース : ＋ トレハロース : ＋ グリセロール : − マンニトール : − セロビオース : ＋ リボース : − サリシン : − ソルビトール : − ソルボース : − マンノース : − メリビオース : − ラムノース : ＋ ラフィノース : − イノシトール : − アドニトール : − グルコースから のガスの生成 : −

【０００９】この菌株はSphingomonas sp.AO-1株と命名
され、平成12年3月23日に工業技術院生命工学工業技術
研究所にＦＥＲＭ Ｐ-17794として寄託されている。本
発明の細菌をビスフェノールＡやスチルベン骨格を持つ
芳香族化合物に作用させることにより、該化合物を分解
させることができる。本発明では、該化合物を含有する
土壌、水質又はその他の廃棄物に、本発明の細菌の培養
物又は菌体を付着させた保持担体を添加することによ
り、該化合物を分解することができる。細菌の培養物と
しては、本発明の細菌を培養して得られる培養液それ自
体、又は培養液から分離した培養菌体、あるいは培養液
中の細菌又は分離された培養菌体を死滅させたもの、等
が用いられる。培養液から培養菌体を製造する方法は、
通常の遠心分離等により菌体を分離し、凍結菌体もしく
は乾燥菌体にすることもできる。この場合、菌体を乾燥
するためには、例えば凍結乾燥、噴霧乾燥等を用いるこ
とができる。また、環境への影響を抑える場合は、滅菌
処理した培養物を用いることができる。滅菌処理方法と
しては、濾過滅菌、紫外線照射、エチレンオキサイド処
理、放射線照射等がある。本発明はまた、菌体を付着さ
せた保持担体を該土壌、水質又はその他の廃棄物に接種
し、増殖させることにより、処理対象物中の該化合物を
分解させることができる。保持担体としては木炭等の多
孔質の担体が好ましい。土壌、水質又はその他の廃棄物
等の処理対象物に、本発明の培養物を添加する場合、処
理対象物に対して１０⁴〜１０¹⁰個／ｇの生菌体もしく
は死菌体が添加される量に相当する量の培養物を添加す
るのが好ましい。本発明の細菌を土壌等の固体又は水質
に含有されるビスフェノールＡやスチルベン骨格を持つ
芳香族化合物に作用させる方法としては、処理対象物に
本発明の培養物あるいは菌体を付着させた保持担体を添
加・混合すればよい。

【００１０】本発明の細菌を培養するには、該細菌が増
殖することができる任意の培地を用いることができる。
培地は、炭素源として、例えばグルコース、シュクロー
ス等を含有し、有機窒素源として酵母エキスペプトン、
肉エキス等、又は無機窒素源としてアンモニウム塩、硝
酸塩等を含有することができる。更に、カリウムイオ
ン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウ
ムイオン等の陽イオン及び塩素イオン、硫酸イオン、リ
ン酸イオン等の陰イオンとから成る無機塩類を含有する
ことができる。炭素源の濃度は、その種類により異なる
が０．１〜１％程度であり、窒素源の濃度はその種類に
より異なるが０．０１〜１％程度である。また、無機塩
類の濃度は、種類により異なるが０．００１〜０．１％
程度である。培養は好気的液体培養によるのが好まし
く、好気的条件は通気、撹拌、通気と撹拌、振とう等の
常用の手段による。唯一の炭素源としてビスフェノール
Ａやスチルベン骨格を持つ芳香族化合物を用いてもよ
い。培地中のビスフェノールＡやスチルベン骨格を持つ
芳香族化合物の添加量は１ppm〜１０００ppm程度が好ま
しい。

【００１１】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく
具体的に説明する。 実施例１AO-1株の単離と同定 １)AO-1株の単離 本発明の微生物の単離は、以下の通り行った。茨城県内
の畑土、河川底泥より採取したサンプル約１００mlをビ
ニール袋に入れ、冷蔵庫に保管して一両日中に実験に供
試した。BSM培地（1リットル中に1.0g K₂HPO₄、1.0g (N
H₄)₂SO₄、0.2gMgSO₄ 7H₂O、0.01g FeCl₃、0.05g NaCl、
0.05g CaCl₂）にビスフェノールＡを単一炭素源として2
0μg/mL添加した培地に、先の汚泥を１ｇ添加し、30℃
で約7日間培養した。目視により培地の懸濁が認められ
た増殖してきた培養液を、更にビスフェノールＡを60μ
g/mL含有するBSM培地中で培養し、同様にしてさらにビ
スフェノールＡを100μg/mL含有するBSM培地中で培養し
た。その後、ビスフェノールＡを単一炭素源として100
μg/mL含有し、1.5％の寒天を加えたBSM平板寒天培地上
に塗沫後、30℃で3-7日間培養し、出現した約100種類の
コロニーを単離した。

【００１２】約100種類のコロニーそれぞれについて、
ビスフェノールＡの分解活性を以下の方法で測定した。
直径18cmの試験管に入れたビスフェノールＡ100μg/mL
を含むBSM培地7mlに、単離時の寒天培地からコロニーを
白金耳にて釣菌して接種した。これを30℃で3〜7日間培
養後、以下の方法で培地中のビスフェノールAの定量を
行った。高速液体クロマトグラフィー（Waters社製Alli
ance2690）を用いて、以下の条件でビスフェノールＡの
定量をした。カラム：関東化学(株)のMightysil RP18 G
P150-4.6(5μm)、溶出液：70%アセトニトリル水溶液、
カラム槽温度：40℃。検出器は、フォトダイオードアレ
イを用い、217nmの吸光度で定量した。その結果、単離
したコロニー約100種類のうち、最も分解速度の速い菌
株を選別し、AO-1株と命名した。 ２)AO-1株の同定 i)文献（改訂版 微生物の分類と同定（下）長谷川武治
著、学会出版センター、1985）に従い、AO-1株の形態学
的観察および生理学的性質の調査を行った結果を以下に
示す。 形態 : 桿菌 グラム染色性 : − 胞子 : − 運動性 : ＋ 酸素に対する態度: 好気性 オキシダーゼ : ＋ カタラーゼ : ＋ ＯＦ : − 集落の色調 : 黄色系

【００１３】更に以下の結果が得られた。 嫌気下での生育 : − カタラーゼ : ＋ オキシダーゼ : ＋ 硝酸塩の還元 : ＋ V-P 反応 : − V-P broth のpH : 6.91 カゼインの分解 : − ゼラチンの分解 : ＋ エスクリンの分解: − 澱粉の分解 : − DNA の分解 : − 尿素の分解 : − チロシンの分解 : − アルギニンの分解: − Tween20 の分解 : − Tween80 の分解 : − クエン酸の利用 : ＋ インドールの生成: − 硫化水素の生成 : − NaCl存在下で の生育 2%: − 5%: − 7%: − 生育pH : 5.5-8.5 生育温度(℃) : 10-40 0.01%リゾチウム 存在下での生育 : −

【００１４】また、AO-1株は下記の糖からの酸の生成の
有無は次の通りであった。 グルコース : ＋ アラビノース : ＋ フルクトース : − ガラクトース : ＋ マルトース : ＋ ラクトース : − シュークロース: ＋ キシロース : ＋ トレハロース : ＋ グリセロール : − マンニトール : − セロビオース : ＋ リボース : − サリシン : − ソルビトール : − ソルボース : − マンノース : − メリビオース : − ラムノース : ＋ ラフィノース : − イノシトール : − アドニトール : − グルコースか らのガスの生成: −

【００１５】ii)以上の結果に基づき文献（N.R.Krieg a
nd J.G.Holt、“Bergey's Manualof Systermatic Bacte
riology”Vol.1（1984）Williams ans Wilkins及び、J.
G.Holt、N.R.Krieg、P.H.A.Senath、J.T.Staley and S.
T.Williams、“Bergey'sManual of Detaminative Bacte
riology”Ninth edition（1994）Williams ans Wilkin
s）を参考に同定を行った結果、単離されたAO-1株はFla
vobacterium属菌（現在は、Sphingomonas属菌）である
可能性が示唆された。同定をさらに進めるために、本発
明の微生物について16S rRNA遺伝子全長約1.5kbのほぼ9
5％の領域の配列を決定した。配列は、配列表の配列番
号１に示す。この配列を公知の微生物の配列と比較し、
ＮＪ（近隣接合）法で系統樹を作成したところ、図１に
示すとおり最も近縁の菌はSphingomonas chlorophenoli
caあるいはSphingomonas herbicidovoransと考えられ
た。そこで、AO-1株と近縁と考えられた Sphingomonas
chlorophenolica ATCC 33790 、Sphingomonas herbici
dovorans DSM11019 について、それぞれハイブリダイ
ゼーションを行った。結果は以下の表１に示したとお
り、相同性はどの組み合わせでも30%以下であった。従
って、AO-1株はSphingomonas chlorophenolicaにもSphi
ngomonas herbicidovorans にも属さない新種のSphingo
monas属菌であることが明らかになった。以後は、Sphin
gomonas sp. AO-1株とする。

【００１６】

【表１】

【００１７】実施例２BSM培地中でのSphingomonas sp. AO-1株および類縁菌の
ビスフェノールＡ分解活性 MYPG寒天培地(1リットル中に3.0g マルト抽出物、 3.0g
酵母抽出物、 5.0gポリペプチド、 10g グルコース、
15g 寒天、 pH 7.0)上のSphingomonas sp. AO-1株、Sph
ingomonas chlorophenolica ATCC 33790 株、 Sphingom
onas herbicidovorans DSM11019 株のコロニーを釣菌
し、直径18mmの試験管中のMYPG培地7mlに植菌した。こ
れを30℃・100rpmで17時間振とう培養した後、菌体を30
00rpm・10分間の遠心分離で回収し、50mM リン酸緩衝液
(pH 7.2)で2回洗浄し、生理食塩水に懸濁し、菌体懸濁
液とした。この菌体懸濁液を300ml三角フラスコ中のビ
スフェノールＡ 100μg/mLとグルコース 0.1%を含有す
るBSM培地（1リットル中に1.0g K₂HPO₄、1.0g (NH₄)₂SO
₄、0.2g MgSO₄ 7H₂O、0.01g FeCl₃、0.05g NaCl、0.05g
CaCl₂）100mlに600nmの吸光度が0.05になるように混合
した。

【００１８】30℃で60 時間振とう培養し、12時間毎に
1.5mlをサンプリングし、培地中のビスフェノールAの定
量を、菌体を高速遠心(15000rpm 5分)で除去したのち、
高速液体クロマトグラフィー（Waters 社製 Alliance26
90）を用いて、以下の条件で行った。カラム：関東化学
(株)のMightysil RP18 GP150-4.6 (5μm)、溶出液：70%
アセトニトリル水溶液、カラム槽温度：40℃。検出器
は、フォトダイオードアレイを用い、217nmの吸光度を
用いて定量した。結果は図２に示したとおり、Sphingom
onas chlorophenolica ATCC 33790およびSphingomonas
herbicidovorans DSM11019には、ビスフェノールＡの分
解活性はほとんど認められなかったが、Sphingomonas s
p. AO-1 株は、約48時間後にはビスフェノールＡを完全
に分解する能力を有していた。

【００１９】実施例３MYPG培地中でのSphingomonas sp. AO-1 株および類縁菌
のビスフェノールＡ分解活性 実施例２では、菌体懸濁液をビスフェノールＡおよびグ
ルコースを含有するBSM培地100mlに懸濁した。しかし、
上記培地では菌体の増殖が遅いため、より栄養が豊富な
MYPG培地を用いて、実施例２と同様の実験を行った。す
なわち、実施例２と同様にして前培養した培養液から菌
体懸濁液を作成し、ビスフェノールＡ100μg/mLを含有
するMYPG培地100mlに600nmの吸光度が0.05になるように
混合し、30℃で36時間振とう培養し、適宜サンプリング
した。ビスフェノールＡの定量方法は実施例２と同様で
ある。結果は図３に示したとおり、実施例２と同様にSp
hingomonas chlorophenolicaATCC 33790およびSphingom
onas herbicidovorans DSM11019には、ビスフェノール
Ａの分解活性は認められなかったが、Sphingomonas sp.
AO-1 株は、約12時間後には完全に分解する能力を有し
ていた。

【００２０】実施例4BSM培地へ添加する糖類の種類及び添加量がSphingomona
s sp. AO-1 株のビスフェノールＡ分解活性に及ぼす影響 本実施例では、BSM培地へ添加する糖類の種類及び添加
量がSphingomonas sp.AO-1 株のビスフェノールＡ分解
活性に及ぼす影響を調査した。前培養、菌体懸濁液の作
製、ビスフェノールＡの定量の条件は実施例２と同様で
ある。菌体懸濁液をビスフェノールＡ 100μg/mLと以下
の糖類を含有するBSM培地100mlに600nmの吸光度が0.05
になるように混合した。混合した糖類の種類と濃度は
(1)グルコース 0.01%, (2)グルコース 0.1%, (3)グルコ
ース 1.0% (4)シュークロース 0.1%, (5)シュークロー
ス 1.0%, (6)デキストリン 0.1%, (7)マルトース 0.1%
である。30℃で44時間振とう培養し、一定時間毎に1.5m
lをサンプリングし、培地中のビスフェノールAの定量
を、実施例２と同様に行った。結果は図４および図５に
示したとおり、いずれの糖類を添加しても、ビスフェノ
ールＡの分解促進効果が認められた。その中でも(2)グ
ルコース 0.1%, (3)グルコース 1.0% を添加した場合、
最も早く分解し、培養23時間後には6-8μg/mLにまで分
解され、培養44時間後にはビスフェノールＡは完全に検
出されなくなった。

【００２１】実施例５培養温度がSphingomonas sp. AO-1 株の増殖に及ぼす影
響 MYPG寒天培地上のSphingomonas sp. AO-1株のコロニー
を釣菌し、直径18mmの試験管中のMYPG培地7mlに植菌し
た。これを30℃・100rpmで17時間振とう培養した後、菌
体を3000rpm・10分間の遠心分離で回収し、50mM リン酸
緩衝液(pH 7.2)で2回洗浄した。この菌体懸濁液(2〜3×
10⁹cfu/ml) 20μlを直径18mmの試験潅注のMYPG培地7ml
に添加した。これを5℃から45℃まで5℃刻みの温度で静
置培養し、3日後、5日後、7日後の600nmの吸光度を測定
した。その結果、培地のみの吸光度は0.076、菌体混合
直後の吸光度は0.096であった。培養温度、培養日数お
よび吸光度の関係を図６に示した。最も速い増殖を示し
た温度は30℃であり、40℃以上ではほとんど増殖しなか
った。また5℃でもほとんど増殖しなかった。

【００２２】実施例６培地ｐＨがSphingomonas sp. AO-1 株の増殖に及ぼす影
響 MYPG寒天培地上のSphingomonas sp. AO-1株のコロニー
を釣菌し、直径18mmの試験管中のMYPG培地7mlに植菌し
た。これを30℃・100rpmで17時間振とう培養した後、菌
体を3000rpm・10分間の遠心分離で回収し、50mM リン酸
緩衝液(pH 7.2)で2回洗浄した。この菌体懸濁液(2〜3×
10⁹cfu/ml) 20μlを直径18mmの試験管に入れた３〜１１
に１刻みのpHに調整したMYPG培地7mlに添加した。これ
を30℃で7時間振とう培養し、600nmの吸光度を測定し
た。なお、結果に示す吸光度は、それぞれの培地で、培
養後の培地の吸光度から植菌前の培地の吸光度を減じた
値を示した。その結果、図７に示すとおり、培地のｐＨ
が6から８、特に７の時に本菌の増殖速度は最も速かっ
た。一方、ｐＨが３，４，１０，１１の場合ははほとん
ど増殖しなかった。

【００２３】実施例７Sphingomonas sp. AO-1 株の各種培地の資化性 MYPG寒天培地上のSphingomonas sp. AO-1株のコロニー
を釣菌し、基本培地(0.05% 酵母抽出物、0.5% NaCl、0.
03% K₂HPO₄)に以下に示す資化性試験に供試する糖・ア
ルコール・有機酸・アミノ酸類0.2% を加えた培地7mlに
植菌した。供試物質は、アラビノス、フルクトース、グ
ルコース、ラクトース、マルトース、シュークロース、
マンニトール、ソルビトール、イノシトール、メタノー
ル、エリスリトール、マレイン酸塩、コハク酸塩、グル
コン酸塩、酒石酸塩、DL-アラニン、L-ヒスチジン、L-
バリン、ベタイン、グリシン、L-アルギニン、L-トリプ
トファンである。30℃で72時間振とう培養後、BTB（ブ
ルーチモルブルー）を加え、青から黄色あるいは緑色に
変色したものを、微生物が酸を分泌したものとし、資化
性があると判断した。結果は以下の表２に示すとおりで
ある。

【００２４】

【表２】

【００２５】実施例８Sphingomonas sp. AO-1 株によるビスフェノールＡの菌
体表面への物理的吸着と菌体内への取り込み 上記実施例２および３において、培養液中のビスフェノ
ールＡは減少することが明らかになったが、実際にビス
フェノールＡが分解されているのか、単に菌体表面へ吸
着しているだけなのかを調べておく必要がある。また、
本菌が増殖中にビスフェノールＡが菌体内に取り込まれ
ている可能性がある。これらについて調べておく必要が
あるので、以下の実験を行った。前培養、菌体懸濁液の
作製は実施例２と同様に行った。菌体懸濁液（菌密度は
2x10¹⁰cfu/ml）をビスフェノールＡ 100μg/mLとグルコ
ース 0.1%を含有するBSM培地100mlに、600nmの吸光度が
0.05になるように混合した。菌体懸濁液を、100℃ 10分
処理し、滅菌菌液を作製し、菌体懸濁液と同量を上記BS
M培地100mlに混合した。また、BSM培地より栄養を多く
含むビスフェノールＡ 100μg/mLを含有するMYPG培地10
0mlでも同様に菌体懸濁液と滅菌菌液を用いて実験を行
った。混合後の両培地を30℃で60時間振とう培養する過
程で、3-12時間毎に1.5mlの培地をサンプリングした。
試験例２と同様にして、菌体を遠心分離(15000rpm 10mi
n)で取り除き、培地中のビスフェノールA量を定量し
た。一方、菌体中のビスフェノールＡ量を定量するため
に、遠心分離で得られた菌体のペレットを50mMリン酸緩
衝液(pH 7.2)で2回洗浄した後、1mlのトルエンで抽出
し、完全に溶媒を飛ばした後、水1.5mlに懸濁し、菌体
抽出液とし、ビスフェノールA量を定量した。結果を図
８（BSM培地）および図９（MYPG培地）に示す。いずれ
の場合も、煮沸滅菌した菌体を培養液中に入れても培養
液中のビスフェノールＡの量は全く低減しなかった。ま
た、菌体抽出液からはビスフェノールＡが全く検出され
なかった。したがって、本実験系で菌体表面への物理的
吸着への吸着は極めて少ないこと、ビスフェノールＡは
菌体内にほとんど取り込まれていないことが示唆され
た。従って、試験例２や３で、培養液中のビスフェノー
ルＡ量が減少しているのは、ビスフェノールＡが分解さ
れていることが示唆された。

【００２６】実施例９Sphingomonas sp. AO-1株の有機溶媒耐性 ビスフェノールＡを含有する水質を微生物処理する場
合、対象となる水質には通常他の有機溶媒も含まれてい
る。そこで、本菌の有機溶媒耐性を調査した。本菌の平
板培地上のコロニーを白金耳で釣菌し、直径90mmのガラ
スシャーレ内で固化させたMYPG寒天培地(成分は上述,
1.5%寒天)上に画線した。30℃で24時間培養し、本菌を
増殖させた後、シャーレ中に、n-ヘキサン、シクロヘキ
サン、p-キシレン、o-キシレン、トルエン、n-ヘプタノ
ールをそれぞれ約20ml分注し、増殖した菌体に完全に上
層し、30℃ 19時間保温した。シャーレ中の有機溶媒を
捨て、表面を風乾してから、処理菌体を白金耳を用いて
新たなMYPG寒天培地に移植し、30℃で24時間培養し、増
殖の有無により処理菌体の生死を判定した。結果は以下
の表３に示したとおり、本菌はn-ヘキサン、シクロヘキ
サンには耐性を有することが明らかになった。

【００２７】

【表３】

【００２８】実施例１０ビスフェノールＡによる分解酵素の誘導 本菌をビスフェノールＡ等の有害物質の分解に用いる場
合、分解酵素は常に分泌されている（構成的）のか、あ
るいはビスフェノールＡのような物質があることを認識
してから分泌されてくるのか（誘導的）を調査しておく
ことにより、より有効な活用方法を探ることができる。
そこで、以下の実験を行った。MYPG寒天培地上のSphing
omonas sp. AO-1株のコロニーを釣菌し、直径18mmの試
験管中の(1)MYPG培地および(2)MYPG培地に100μg/mL の
ビスフェノールＡを入れた培地7mlに植菌し、30℃・100
rpmで17時間振とうして前培養した。菌体を3000rpm・10
分間の遠心分離で回収し、50mM リン酸緩衝液(pH 7.2)
で2回洗浄し、生理食塩水に懸濁し、菌体懸濁液とし
た。(1)と(2)の菌体懸濁液を300ml三角フラスコ中のビ
スフェノールＡ 100μg/mLとグルコース 0.1%を含有す
るBSM培地100mlに600nmの吸光度が0.05になるように混
合した。30℃で36 時間振とう培養し、12時間毎に1.5ml
をサンプリングし、培地中のビスフェノールAの定量
を、試験例２と同様に行った。結果は図１０に示したと
おり、前培養の培養液中にビスフェノールＡを添加する
ことにより、その後の分解活性を向上させることができ
ることが明らかになった。

【００２９】実施例１１Sphingomonas sp. AO-1 株培養濾液のビスフェノールＡ
分解活性 Sphingomonas sp. AO-1 株を培養し、濾過滅菌した液中
のビスフェノールＡ分解活性を調査した。MYPG寒天培地
上のSphingomonas sp. AO-1株のコロニーを釣菌し、直
径18mmの試験管中のMYPG培地7mlに植菌した。これを30
℃・100rpmで17時間振とう培養した。遠心分離（15000r
pm 10min)および濾過滅菌フィルターにより、培養濾液
を得た。本培養濾液5mlにビスフェノールＡを濃度が100
μg/mLとなるように添加し、25℃から50℃まで、5℃刻
みで168時間保温した。約1.5mlの液を適宜サンプリング
し、実施例２と同様にして液中のビスフェノールＡの定
量を行った。結果は図１1に示したとおり、Sphingomona
s sp. AO-1 株の培養濾液にもビスフェノールＡの分解
活性があり、その活性は45℃の場合が最も高いことが明
らかになった。ただし、分解活性は生菌が増殖している
場合よりも遅いことが明らかになった。

【００３０】実施例１２Sphingomonas sp. AO-1 株培養濾液の凍結処理後のビス
フェノールＡ分解活性 Sphingomonas sp. AO-1 株を培養し、濾過滅菌した液を
凍結処理した後のビスフェノールＡ分解活性を調査し
た。試験例１１と同様にして培養濾液を得た。これを4
℃で48時間冷蔵保存および-80℃で48時間冷凍保存し
た。本保存液5mlにビスフェノールＡを濃度が100μg/mL
となるよう添加し、40℃で120時間保温した。保温中に
約1.5mlの液を適宜サンプリングし、試験例２と同様に
してビスフェノールＡの定量を行った。結果は図１３に
示したとおり、培養濾液を冷蔵しても冷凍しても処理前
の培養濾液とほぼ同等のビスフェノールＡの分解活性が
あった。

【００３１】実施例１３Sphingomonas sp. AO-1 株の走査型電子顕微鏡写真 以下の方法により、Sphingomonas sp. AO-1 株の走査電
子顕微鏡写真を撮影した。MYPG寒天培地上のSphingomon
as sp. AO-1株のコロニーを釣菌し、直径18mmの試験管
中のMYPG培地7mlに植菌した。これを30℃・100rpmで17
時間振とう培養し、遠心操作（15000rpm, 10min)によ
り、菌体を回収した。2%グルタルアルデヒド 0.01M カ
コジル酸緩衝液(NaCl0.15M) で 1 時間固定し、カコジ
ル酸緩衝液で洗浄後、2%オスミウム酸 0.01M カコジル
酸緩衝液(NaCl0.15M)で1 時間固定した。蒸留水で洗浄
後、50％エタノールから少しずつエノタール濃度を上
げ、最終的に100％エタノールで処理した。tertブチル
アルコール溶液中で凍結乾燥処理を行い、日本電子株式
会社製の走査電子顕微鏡JSM-5600LVにて、高真空モー
ド、加速電圧10kVで観察した。得られた走査型電子顕微
鏡写真は図１４に示した。

【００３２】

【発明の効果】本発明によれば、ビスフェノールＡやス
チルベン骨格を持つ芳香族化合物を、従来から知られて
いる微生物よりも効率よく分解することができる新規微
生物が提供され、この微生物を使用してビスフェノール
Ａやスチルベン骨格を持つ芳香族化合物を効率良く分解
することができ、環境浄化に利用することができる。

【００３３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> SUMITOMO FORESTRY CO., LTD. <120> Bacterium Having Aromatic Compound Decomposition Activity and Use Thereof <130> DA-02945 <160> 1 <210> 1 <211> 1439 <212> RNA <213> Sphingomonas sp. AO-1 <400> 1 atcctggctc agaacgaacg ctggcggcat gcctaataca tgcaagtcga acgagacctt 60 cgggtctagt ggcgcacggg tgcgtaacgc gtgggaatct acccttgggt tcggaataac 120 gtcgggaaac tgacgctaat accggatgat gacgaaagtc caaagattta tcgcccaggg 180 atgagcccgc gtaggattag ctagttggtg gggtaaaggc tcaccaaggc tacgatcctt 240 agctggtctg agaggatgat cagccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg 300 gaggcagcag tagggaatat tggacaatgg gggcaaccct gatccagcaa tgccgcgtga 360 gtgatgaagg ccttagggtt gtaaagctct tttacccgag atgataatga cagtatcggg 420 agaataagct ccggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggaggg agctagcgtt 480 gttcggaatt actgggcgta aagcgcacgt aggcggcgat ttaagtcaga ggtgaaagcc 540 cggggctcaa ccccggaact gcctttgaga ctggattgct agaatcttgg agaggcgggt 600 ggaattccga gtgtagaggt gaaattcgta gatattcgga agaacaccag tggcgaaggc 660 ggcccgctgg acaagtattg acgctgaggt gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga 720 taccctggta gtccacgccg taaacgatga taactagctg ctggggcaca tggtgtttca 780 gtggcgcagc taacgcatta agttatccgc ctggggagta cggtcgcaag attaaaactc 840 aaaggaattg acgggggcct gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc 900 gcagaacctt accaacgttt gacatcccta tcgcggatcg tggagacact ttccttcagt 960 tcggctggat aggtgacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1020 gttaagtccc gcaacgagcg caaccctcgc ctttagttgc catcatttag ttgggtactc 1080 taaaggaacc gccggtgata agccggagga aggtggggat gacgtcaagt cctcatggcc 1140 cttacgcgtt gggctacaca cgtgctacaa tggcgactac agtgggcagc cactccgcga 1200 ggaggagcta atctccaaaa gtcgtctcag ttcggatcgt tctctgcaac tcgagagcgt 1260 gaaggcggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccaggcct 1320 tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt tggattcact cgaaggcgtt gagctaaccc 1380 gcaaggaggc aggcgaccac agtgggttta gcgactgggg tgaagtcgta acaaggtaa 1439

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、Sphingomonas sp. AO-1 株の16S rRNA
遺伝子全長約1.5 kbのほぼ95％の領域の配列を公知の微
生物の配列と比較し、ＮＪ（近隣接合）法で作製した系
統樹を示す。

【図２】図２は、Sphingomonas sp. AO-1 株、Sphingom
onas chlorophenolica ATCC 33790株およびSphingomona
s herbicidovorans DSM11019株によるBSM培地中のビス
フェノールＡ濃度に及ぼす影響を示す。

【図３】図３は、Sphingomonas sp. AO-1 株、Sphingom
onas chlorophenolica ATCC 33790株およびSphingomona
s herbicidovorans DSM11019株によるMYPG培地中のビス
フェノールＡ濃度に及ぼす影響を示す。

【図４】図４は、BSM培地中のグルコース濃度がSphingo
monas sp. AO-1 株による培地中ビスフェノールＡ濃度
の低減に及ぼす影響を示す。

【図５】図５は、BSM培地中のサッカロース、マルトー
ス、または、デキストリン濃度がSphingomonas sp. AO-
1 株による培地中ビスフェノールＡ濃度の低減に及ぼす
影響を示す。

【図６】図６は、培養温度がMYPG培地中でのSphingomon
as sp. AO-1 株の増殖に及ぼす影響を示す。

【図７】図７は、培地pHがMYPG培地中でのSphingomonas
sp. AO-1 株の増殖に及ぼす影響を示す。

【図８】図８は、Sphingomonas sp. AO-1 株の菌体懸濁
液および滅菌菌液の添加がBSM培地中および菌体抽出液
中のビスフェノールＡ濃度に及ぼす影響を示す。

【図９】図９は、Sphingomonas sp. AO-1 株の菌体懸濁
液および滅菌菌液の添加がMYPG培地中および菌体抽出液
中のビスフェノールＡ濃度に及ぼす影響を示す。

【図１０】図１０は、前培養時の培地へのビスフェノー
ルＡ添加がSphingomonas sp. AO-1 株によるBSM培地中
のビスフェノールＡ濃度の低減に及ぼす影響を示す。

【図１１】図１１は、保温温度がSphingomonas sp. AO-
1 株の培養濾液によるビスフェノールＡ濃度低減に及ぼ
す影響を示す。

【図１２】図１２は、Sphingomonas sp. AO-1 株の培養
濾液の冷蔵及び冷凍処理がビスフェノールＡ濃度低減に
及ぼす影響を示す。

【図１３】図１３は、Sphingomonas sp. AO-1 株の走査
電子顕微鏡像をしめす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｆ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｄ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 大石 亜希子 大阪府大阪市中央区北浜４丁目７番28号 住友林業株式会社内 Ｆターム(参考） 4B065 AA01X AC12 BA22 CA56 4D040 DD03 DD11 DD12

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ビスフェノールＡ及びスチルベン骨格を
   持つ芳香族化合物の少なくとも１種の芳香族化合物を分
   解することができ、Sphingomonas属に属し、既存のいず
   れの種にも属さない新種の細菌。
2. 【請求項２】 次の性質： 形態 : 桿菌 グラム染色性 : − 胞子 : − 運動性 : ＋ 酸素に対する態度: 好気性 オキシダーゼ : ＋ カタラーゼ : ＋ ＯＦ : − 集落の色調 : 黄色系 を有する請求項１の細菌。
3. 【請求項３】 細菌がSphingomonas sp. AO-1 株（ＦＥ
   ＲＭ Ｐ−１７７９４）である、請求項１又は２の細
   菌。
4. 【請求項４】 請求項１から３のいずれかの細菌を、ビ
   スフェノールＡ及びスチルベン骨格を持つ芳香族化合物
   から選ばれる芳香族化合物に作用させることを特徴とす
   る芳香族化合物の分解方法。
5. 【請求項５】 ビスフェノールＡ及びスチルベン骨格を
   持つ芳香族化合物の少なくとも１種の芳香族化合物を含
   有する土壌、水質又はその他の廃棄物中の芳香族化合物
   の分解方法であって、該土壌、水質又はその他の廃棄物
   に、請求項１から３のいずれかの細菌の培養物又は菌体
   を付着させた保持担体を添加することを特徴とする芳香
   族化合物の分解方法。
6. 【請求項６】 培養物が生菌体である請求項５の分解方
   法。
7. 【請求項７】 培養物が滅菌処理した培養物である請求
   項５又は６のいずれかの分解方法。