KR0135057B1 - 신규한 비스페놀 알칸-분해균주 및 이를 이용한 비스페놀 알칸의 미생물학적 처리 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 그람 음성의 호기성균이고, 막대모양의 운동성을 지니며 스핑고모나스(Sphingomonas) 종으로 분류된 신규한 KRC-K2 균주를 제공하고, 상기 균주가 여러 가지 비스페놀 알칸을 생분해 및 생전환시킬 수 있다는 데 기초하여 환경오염의 소지가 있는 비스페놀 알칸을 미생물학적으로 분해하는 방법 및 비스페놀 알칸으로부터 유용한 중간대사물질로 생전환시키는 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 비스페놀 알칸-분해균주 및 이를 이용한 비스페놀 알칸의 미생물학적 처리 방법

제1도는 pH 변화에 따른 스핑고모나스 KRC-K2(Sphingomonas KRC-K2) 균주의 성장 관계를 나타내는 그래프이다.

제2도는 비스페놀 알칸을 분해할 수 있는 스핑고모나스KRC-K2 균주의 성장곡선 및 이 균주에 의한 비스페놀 에이(BPA)의 분해곡선을 나타내는 그래프이다.

제3도는 성장시간 경과에 따른 BPA의 분해 및 중간 대사산물들의 생성을 나타내는 HPLC 프로파일(profile)이다.

제4도는 BPA 분해과정에서 형성된 중간대사산물의 에틸아세테이트 분획 및 그로부터 순수하게 분리된 물질의 HPLC 프로파일을 나타내는 그래프이다.

제5도는 순수하게 분리된 중간대사산물이 4-하이드록시아세토페논(4-hydroxyacetophenone : 4-HAP)임을 나타내는 GC-MSD 프로파일이다.

제6도는 BPA 가 4-HAP 로 전환됨을 보여주기 위해 휴지세포분석법(Resting Cell Assay ; RCA)를 이용한 HPLC 프로파일이다.

본 발명은 신규한 비스페놀 알칸-분해균주 및 상기 균주를 이용하여 비스페놀 알칸, 예를들어 비스페놀 에이(Bis-phenol A ; BPA)를 분해하거나, 그에 해당하는 대사산물로 전환시키는 방법에 관한 것이다.

비스페놀 에이와 같은 비스페놀 알칸은 전세계적으로 수많은 화학 공장에서 플라스틱등을 제조함에 사용되는데, 예를들어, 비스페놀 에이(이하BPA)의 매년 생산량은 930M 파운드 이상이다. 따라서 그 결과로 BPA를 함유한 상당량의 폐수가 다양한 제조공장에서 만들어진 후, 육지, 강, 하천 그리고 바다로 내보내어지고 있는데, 미합중국 환경보호청(US Envionmental Protection Agency ; EPA)에 보고된 표준환경 평가 절차에 따르면 BPA는 물고기와 무척추 동물에 독성을 지니는 것으로 되어있으므로 비스페놀 알칸이 환경으로 방출되는 위험을 최소화시키기 위한 계속적인 노력이 현재 진행되고 있다.

지금까지 비스페놀 알칸을 분해하는 균주로서 정확히 알려진 종은 없다. 다만, 1992년 로보스(Lobos)등에 의해 처음으로 이러한 균주가 보고되었는데[J. H. Lobos, T. K. Leib and Tan-Mun, S., Appl. Environ. Microbiol., 58, 1823-1831(1992)], 여기서 발표된 미생물은 슈도모나스(pseudomonas)나 CDC 그룹 Ve등과 유사하다고 보고되었을뿐 정확한 동정을 이루지 못하였으나 이 미생물을 이용한 비스페놀 알칸의 생 전환 방법에 대한 특허가 출원되었다.[미합중국 특허 제 5,118,878호]. 따라서 본 발명에서 사용된 미생물은 비스페놀 알칸을 이용할 수 있는 미생물로서 상기 균주에 이어 세계에서 두 번째로 발견된 것이다.

본 발명은 그람 음성의 호기성균이고, 막대모양의 운동성을 지니며 스핑고모나스(Sphigomonas)종으로 분류된 신규한 KRC-K2 균주를 제공하고, 상기 균주가 여러 가지 비스페놀 알칸을 생분해 및 생전환시킬 수 있다는 데 기초하여 환경오염의 소지가 있는 비스페놀 알칸을 미생물학적으로 분해하는 방법을 개발하거나, 비스페놀 알칸으로부터 유용한 물질로 생전환시키는 방법을 개발함을 목적으로 한다.

따라서, 본 발명은 환경에 유해한 비스페놀 알칸을 분해할 수 있는 신규의 미생물인 스핑고모나스 KRC-K2 균주를 제공함을 목적으로 한다.

본 발명 목적 균주의 수득과정에 대하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저 비스페놀 알칸을 분해하는 미생물을 선별하기 위하여 여천공단 내의 인근하천을 비롯한 여러 곳에서 토양 및 액체시료를 채취하였다. 이 시료들을 다시 플라스크에 모은 후 동량의 최소배지를 넣고 여기에 BPA를 0.2mM 되도록 첨가한 후, 30℃에서 120rpm의 속도로 회전진탕시키면서 배양하였다. 이때 사용된 최소배지의 조성은 다음과 같다.

그후 시간의 경과에 따라 첨가하는 BPA 의 농도는 높이고 시간 간격은 줄이면서 계속 배양하여 BPA 이용균주를 유도하였다(실시예 1 참조). 이렇게 약 3 내지 4 개월간의 유도기간을 거친 후, 0.5mM의 BPA를 함유한 평판최소배지(최소배지에 1.5%의 아가(agar) 첨가)에 시료를 스프레딩(spreading)하고 30℃에서 배양한 결과 다수의 콜로니를 얻을 수 있었는데 그들은 모두 같은 종으로 확인되었다. 이들을 계속적으로 계대배양(Subculture)한 후 단일 콜로니임을 확인함으로써 본 발명에 따른 비스페놀 알칸-분해균주를 순수하게 분리하였고, 이 균주를 KRC-K2 로 명명하였다.또한 HPLC 에 의한 분석으로 상기 균주에 의해 BPA 가 분해되며, 그 과정에서 4내지 6 가지의 대사산물이 형성됨도 확인할 수 있었다(제 3 도 참조).

이 KRC-K2 균주의 미생물학적 동정을 위하여 한국시약(주)에서 판매하는 API 키드를 이용하여 생화학 및 생리학적 특성을 조사하였으며, 그 결과를 하기 표 2 에 나타내었다.

상기 표에 나타낸 특성을 API 키트내에 있는 동정표상에 나타난 공지균주들의 특성과 비교한 결과, 본 발명에 따른 KRC-K2 균주는 스핑고모나스 파우시몰리스(S.paucimolis)와 가장 유사한 것으로 나타났으나(즉, API키트의 동정표를 사용했을 경우 테스트된 것이 모두 일치함), 본 발명에 따를 균주는 비스페놀 알칸을 분해할 수 있는 반면에 공지 균주인 스핑고모나스 파우시몰리스는 그러한 기능을 보유하고 있지 않은 점에서 차이가 있다.

그러나, 그람음성 및 호기성 박테리아에 속하는 다른 균주들에 비해 상기 공지균주와 가장 높은 유사성을 보이므로 본 발명에 따른 균주는 스핑고모나스 종에 속하는 종의 하나로서 비스페놀 알칸을 분해할 수 있는 신규한 균주인 것으로 판단하였으며, 이에따라 본 발명에서는 이균주를 스핑고모나스 KRC-K2 균주라 명명하고 1993 년 12 월 24 일자로 한국과학기술연구원 부설 유전 공학연구소 유전자은행에 KCTC 8549P의 수탁번호로 기탁하였다.

본 발명에 따른 스핑고모나스 KRC-K2 균주의 배양조건 실험결과, 본 균주는 10 내지 37℃, pH 4 내지 8.5 의 광범위한 온도 및 pH 범위에서 성장이 가능하며, 이 균주의 최적성장조건을 알아보기 위해 온도별(4, 10, 20, 25, 30, 37, 42, 55℃), pH별(5.5내지 9.0)로 배양시킨 결과 pH 6 내지 6.5, 25 내지 30℃의 온도에서 성장이 최적으로 이루어졌다. 따라서 스핑고모나스 KRC-K2 균주는 약산성 조건에서 더욱 잘 성장하는 것으로 보인다(실시예 2 참조).

본 발명에 따른 균주에는 비스페놀 알칸 분해능을 그대로 유지하는 스핑고모나스 KRC-K2 균주의 변이주도 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 변이주는 화학적 처리, X-선 조사, 유전공학적 방법등의 통상의 변이방법에 의해 유도된 것이 포함될 수 있다.

본 발명은 또한 스핑고모나스 KRC-K2 균주 (KCTC 8549P)를 이용하여 비스페놀 알칸화합물을 분해하거나, 이화합물을 유용한 생물질로 전환시키는 방법을 제공함을 목적으로 한다.

먼저 스핑고모나스 KRC-K2 균주의 성장과 BPA 분해의 상관관계를 알아보기 위하여 0.5mM의 BPA를 함유한 최소배지에 미리 배양해둔 균주현탁액을 접종하여 시간에 따른 균주의 성장정도와 BPA 분해 및 대사산물의 형성을 조사하였다. 이때 성장정도는 600nm 에서의 흡광도(A600)를 이용하여 측정하엿고, BPA 분해 및 대사산물의 형성은 HPLC 분석을 통하여 이루어졌는데, 조사 결과 0.5mM의 BPA 는 약 6 내지 7 시간 내에 완전히 분해됨을 알 수 있었고(제 2, 3 도 참조), BPA 분해시 4 내지 6 개의 중간 대사산물이 배지 밖에서 검출됨도 확인할 수 있었다(제3도 참조). 특히 0.8 ml/분의 유속에서 8 내지 9 분대에 나타나는 피크는 BPA 분해과정에서 크게 축적된 이후에 다시 이용됨도 또한 확인하였다(제 2, 3, 4 도 참조).

상기 중간대사산물들의 구조를 분석하기 위하여 HPLC 와 TLC(Thin Layer Chromatography)를 이용하여 순수분리하고(제4도 참조), GC-MSD를 이용하여 분석한 결과 8 내지 9 분대에 나왔던 산물은 4-하이드록시아세토페논(4-hydroxyacetophenone ; 4-HAP)인 것으로 밝혀졌다(제5도 참조). 즉, KRC-K2 균주는 페닐 환을 두개 지니는 BPA를 페닐 환을 하나 지니는 4-HAP를 경유하여 생분해하게 되므로,BPA를 분해 하는 과정에서 4-HAP를 계속적으로 축적하였다가 다시 이용하게 된다. 따라서 스핑고모나스 KRC-K2 균주는 비스페놀 알칸의 생분해 뿐 아니라 생전환에도 유용할 것으로 기대된다.

폐수종의 비스페놀 알칸 화합물을 처리하기 위해서는, 먼저 상기 설명한 바와 같이 하여 분리한 스핑고모나스 KRC-K2 균주를 적당한 배양조건 즉, pH4 내지 8.5, 4 내지 37℃ 의 온도, 100 내지 140 rpm, 바람직하게는 pH 6 내지 6.5, 25 내지 30 ℃ 의 온도, 120rpm 조건으로 회전진탕시킨 후 원심분리하여 균체를 수득한다. 수득한 균체를 다시 적당한 농도범위(약 0.1g/l)에 들어오도록 희석시킨 후, 이 용액으로 폐수를 처리하여 폐수종의 비스페놀 알칸 화합물이 균주에 의해 분해되도록 한다. 폐수 처리시 pH, 온도등의 조건은 스핑고모나스 KRC-K2 균주의 배양조건과 동일하게 조절한다.

본 발명에 사용된 균주는 방향족 환을 두 개 지니는 여러 가지의 비스페놀 알칸을 이용할 수 있고 이용가능한 화합물의 예는 다음과 같으며

상기 화합물들을 일반 구조식으로 표시하면 다음과 같다.

또는 최근에는 스핑고모나스종으로서 디페닐에테르와 할로겐화된 디페닐에테르 유도체들을 분해할 수 있는 신규한 균주가 보고되었으므로[Stefan Schmidt, et. al., Appl. Environ. Microbiol., 58, 2744-2750(1993); Stefan Schmidt, et. al., Appl. Environ. Microbiol., 59, 3931-3933(1993)], 본 발명에 사용된 균주 스핑고모나스 KRC-K2 또는 여기서 파생된 여러 변이균주들도 이러한 능력을 지니게 될 것으로 기대된다.

또한, 본 발명자들은 KRC-K2 균주에 의한 효율적인 생전환 방법을 모색하기 위하여 휴지세포분석법(Resting Cell Assay ; RCA)을 새로이 개발하였다. 본 발명에서의 RCA란 스핑고모나스 KRC-K2 균주를 배양하여 600nm에서의 흡광도가 1.5 내지 2.0 되도록 균체의 농도를 조절한 후, 비스페놀 알칸을 첨가하여 HPLC 분석으로 산물들을 추적하는 방법이다. RCA 실시후 시간에 따른 HPLC 프로파일을 살펴본 결과, 0.5mM 이 되도록 BPA를 첨가했을 때, 약 1 시간 후에 대부분의 BPA 가 4-HAP 로 전환됨을 확인 할 수 있었다. 따라서 상기 기재한 바와 같이 스핑고모나스 KRC-K2 균주를 이용하여 비스페놀 알칸을 분해하는 방법을 이용하되, 비스페놀 알칸의 농도 및 상기 균주에 의한 비스페놀 알칸이 처리시간을 적절히 조절함으로써 완전히 분해되지 않고 4-HAP와 같이 유용한 물질로 전환될 수 있도록 할 수 있다. 예를들면, 0.5mM의 BPA를 첨가하고 반응시킨 후, 1 시간 뒤에 배양액을 수득함으로써 입체적 특이성을 갖는 4-HAP를 얻을 수 있다(여기서 입체적 특이성이란 '4-' 위치에 수산화(hydroxylation)된 것을 의미한다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 좀더 구체적으로 설명한다. 그러나 본발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1: 스핑고모나스 KRC-K2 균주의 분리]

비스페놀 알칸을 이용하는 균주를 유도하기 위하여, 페놀화합물이 많이 포함되어 있는 여천공단내의 하천 등 여러 곳에서 토양 및 액체 시료를 채취하였다. 채취한 시료를 플라스크에 모은 후 동량의 최소배지와 하기 기재된 바와 같은 양의 BPA를 첨가하여 30℃, 120rpm에서 회전진탕시키면서 배양하였다. 배양시간에 따른 BPA의 주기적인 첨가는 시간 경과에 따라 BPA 첨가량은 증가시키고, 주기는 줄이는 방법으로 진행되어졌다. 즉, 처음에는 BPA 0.2mM이 되도록 첨가하여 배양하였고, 45 일이 경과한 후에는 BPA 0.5mM, 75 일째는 BPA 0.7mM, 90 일째는 BPA 1mM 이 되도록 첨가하여 계속적으로 배양하였다. 약 3 내지 4 개월 후, 현탁액을 채취하여 0.5mM의 BPA 가 함유된 평판최소배지에 도말하였다. 그 결과 플레이트당 약 4 내지 6 개의 잘 자란 미생물 콜로니를 얻었고. 이들을 반복적으로 계대배양함으로써 순수하게 분리하였다. 분리된 균주들이 액체배지 상에서 BPA를 분해하는 것은 HPLC 분석으로 확인하였다. 또한, 분리된 균주들의 성장패턴이나 BPA 분해패턴 등이 모두 동일하므로 분리된 균주들은 하나의 미생물로 확인되었고, 이에따라 KRC-K2 균주라 명명하였다.

[실시예 2: 스핑고모나스 KRC-K2 균주의 배양조건]

분리된 균주의 최적 배양조건을 알아보기 위한 실험이 온도와 pH 에 대해 실시되었다.

먼저 BPA를 0.5mM로 함유한 평판최소배지에 잘 자란 배양액을 스트리킹(streaking) 한 후 4, 10, 20, 30, 37, 42, 55℃ 로 조절하고(이때의 pH 는 각각 7.0 임), 각각 배양함으로써 온도조건에 대한 실험을 실시하였으며, 이때 스트리킹된 평판배지에서 콜로니가 형성되는지의 여부로써 각 온도에서의 성장유무를 결정하였다. 그 결과 이 온도 범위 중 25 내지 30 ℃에서는 콜로니 형성이 하루만에 눈에 보일 정도로 이루어졌으나, 20℃ 에서는 2 일이 소요되었고, 10, 37℃ 에서는 약 4 일 후에야 콜로니의 형성이 관찰되었다. 그리고 4℃에서는 일주일 이상의 시간이 걸렸고, 42℃ 이상에서는 콜로니가 형성되지 않았다. 따라서 스핑고모나스 KRC-K2 균주가 성장가능한 온도범위는 4℃에서 37℃ 까지로서 40℃ 이상에서는 콜로니 형성이 이루어지지 않으며, 이 균주의 최적생장을 나타낼 수 있는 온도는 25 내지 30℃ 임을 알 수 있었다.

또한 BPA 0.5mM을 함유한 최소배지를 각각 5.5부터 9.0 까지 0.5 단위로 pH가 조절된 배지로 만든 후(이때의 온도는 각각 30℃임), 스핑고모나스 KRC-K2 균주를 각각 접종하여 회전진탕시키면서 배양함으로써 pH 조건에 대한 실험을 실시하였다. 그후 4 시간 후에 분해된 BPA 량을 측정함으로써 각 pH 에 있어서의 성장정도를 확인하였고 그 결과를 제1도에 나타내었다. 그결과 pH 4부터 8.5 의 범위에서 BPA 가 분해되었으므로, 이 범위에서 균주 성장이 이루어졌음을 알 수 있었고(pH 9 이상은 배지에 사용된 완충액의 pH 조절범위를 벗어나므로 실험을 못함), pH 6 내지 6.5 범위에서 BPA가 가장 많이 분해되었으므로 이 범위에서 균주성장이 최대로 이루어졌음을 알 수 있었다. 이상의 결과로부터 스핑고모나스 KRC-K2 균주는 약산성조건에서 더욱 잘 자라는 것으로 나타났으며, 이에따라 이후의 실험은 30℃, pH 6.5에서 실시하였다.

[실시예 3: 스핑고모나스 KRC-K2 균주의 성장곡선 및 BPA 분해곡선]

KRC-K2 균주를 배양한 현탁액을 BPA 0.5mM을 함유한 새로운 최소배지에 5%(V/V)접종하여 600nm에서의 흡광도가 0.1 정도 되도록 한다음, 실시예 2에서 명기한 것과 같은 조건에서 배양하였다. 그후 시간별로 시료를 채취하여 600nm 에서의 흡광도 측정 및 HPLC 분석을 실시함으로써 세포의 성장과 BPA 분해정도를 조사하였는데, HPLC 분석시에는 포타슘 포스페이트(pH4.0) 완충액과 메탄을 구배 30 내지 100%가 사용되었다. 그 결과 BPA 0.5mM 일 경우에는 600nm 에서의 흡광도가 약 1.2 정도 되는 세포성장을 보여주었고, 특히 BPA 가 완전히 분해되는 시기는 6 내지 7 시간 후였으며, 실제 세포중량의 증가는 그 이후에 일어나는 것을 알 수 있었다(제 2,3 도 참조). 즉 KRC-K2 균주는 일단 BPA를 분해하여 특정의 중간대사산물로 분해한 후 다시 그 물질을 이용하여 성장하는 것을 HPLC 분석을 통하여 확인할 수 있었다(제3도 참조). 또한 다수의 중간대사산물들이 배지 밖에서 검출되었다(제3도 참조).

[실시예 4: 중간대사산물의 분리 및 구조분석]

균주 KRC-K2 에 의한 BPA 분해과정에서 형성되는 중간대사산물들은 배양 후 4 내지 5 시간째에 가장 잘 나타난다. 따라서 이때의 배양액을 7,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 균체를 제거한 후 상등액을 얻고, 이 상등액에 약 4 내지 6 가지의 중간대사산물이 존재함을 HPLC 분석결과로 확인하였다(제3도 참조).

또한 이들을 에틸아세테이트와 디에틸에테를 이용하여 추출하였다.

먼저 배양액에 동량(V/V)의 에틸아세테이트를 첨가하여 혼합한 후 12 내지 24 시간 실온에 방치함으로써 에틸아세테이트층과 수층으로 분리하였다. 분리된 에틸아세테이트층은 자동증발기(autoevaporator)를 통해 농축하여 에틸아세테이트분획을 만들었으며, 수층은 pH 2 로 조정한 후 디에틸에테를로 다시 추출하여 디에텔에테르분획을 만들었다.

분리된 산물들은 실시예 3 에서와 같이 HPLC 분석을 통해 확인하였고(제 4도 참조), 각 산물 들은 TLC(Thin Layer Chromatography) 및 HPLC 부분분리(fractionation)를 통하여 순수분리하였다. TLC 분석조건은 n-핵산 : 에틸아세테이트= 6 : 4로 구성된 전개용매를 사용하였는데, TLC 분석 결과 에틸아세테이트 분획에서는 HPLC 분석시 다량으로 나오는 물질(8 내지 9 분대 피크)이 검출됨을 확인하였다. 이와같이 하여 순수분리한 산물들을 GC-MSD 와 NMR을 이용하여 분석한 결과, BPA 분해시 형성되는 가장 큰 피크(0.8ml/분의 유속에서 8 내지 9 분대에 용출)는 4- 하이드록시아세토페논(4-hydroxyacetophenone ; 4-HAP)인 것으로 밝혀졌다(제5도 참조).

[실시예 5: 스핑고모나스 KRC-K2 균주를 이용한 비스페놀 알칸의 생전환]

실시예 3, 4에서 설명된 바와같이 KRC-K2 균주는 비스페놀 알칸을 일단 중간대사산물로 분해한 후 재사용하며, 그중에서도 비스페놀 에이를 이용할 경우 4-HAP를 다량으로 축적하는 것이 확인되었으므로 이에따라 KRC-K2 균주를 이용한 비스페놀 알칸의 생전환 방법을 모색하였다.

사용한 방법은 휴지세포분석법(Resting Cell Assay ; RCA)으로서, 세포배양 후 균체를 수획하고, 최소배지를 사용하여 이들 균체의 농도가 600nm에서 1.5 내지 2.0 으로 되도록 조절한 후 BPA를 첨가하는 방법으로 진행되어졌다. 그 후 실시예 2 의 조건에 따라 균주를 배양하면서 BPA 가 4-HAP 로 전환되는 것을 HPLC 분석을 통해 추적하였고, 그 결과 BPA 농도가 0.5mM 일 경우에는 처리 후 1 시간 이면 대부분의 BPA 가 4-HAP 로 전환됨을 확인 할 수 있었다(제6도 참조).

따라서, 결론적으로 비스페놀 알칸은 KRC-K2 균주에 의해 특정의 중간대사산물로 특이적으로 전환될 수 있으므로, 비스페놀 알칸의 농도 및 이에따른 비스페놀 알칸의 균주에 의한 처리시간을 적절하게 조절함으로써 비스페놀 알칸의 완전분해를 막고 유용한 물질로 전환시킬 수 있다.

Claims (8)

1. 스핑고모나스 KRC-K2(Sphingomonas KRC-K2) 균주(KCTC 8549P).
2. 스핑고모나스 KRC-K2 균주(KCTC 8549P)를 pH 4 내지 8.5, 10 내지 37℃, 100 내지 140rpm의 조건으로 회전진탕시킴으로써 제 1 항에 따른 균주(KCTC 854P)를 배양하는 방법.
3. 제2항에 있어서, pH 6 내지 6.5, 25 내지 30℃, 120rpm의 조건으로 회전진탕시킴으로써 배양하는 방법.
4. 제1항에 따른 스핑고모나스 KRC-K2 균주(KCTC 8549P)를 이용하여 폐수중에 포함된 비스페놀 알칸 화합물 처리하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 비스페놀 알칸 화합물이 비스(4-하이드록시페닐)알칸 또는 2,2-비스(4-하이드록시-3-알킬페닐)알칸인 방법.
6. 제5항에 있어서, 비스페놀 알칸 화합물이 비스페놀 에이(BPA)인 방법.
7. 제1항에 따른 스핑고모나스 KRC-K2 균주(KCTC 8549P)를 이용하여 비스페놀 알칸화합물을 생전환시키는 방법.
8. 제7항에 있어서, 비스페놀 에이(BPA)를 4-하이드록시아세토페논(4-HAP)으로 생전환시키는 방법.