JP2001519786A

JP2001519786A - 創傷治癒用医薬の製造のためのオキシトシン活性を有する物質の使用

Info

Publication number: JP2001519786A
Application number: JP54154798A
Authority: JP
Inventors: ルンドベルグ，トマス; モベルグ，ケルスティンユブナス
Original assignee: エントレテクメディカルアクチボラゲット
Priority date: 1997-03-27
Filing date: 1998-03-26
Publication date: 2001-10-23
Also published as: WO1998043661A1; SE9701162D0; ATE232393T1; ES2194308T3; AU6755098A; EP1003542B1; CN1251530A; EP1003542A1; US6262021B1; AU749479B2; DE69811371T2; DE69811371D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、オキシトシン活性を有する物質が、慢性の創傷などの創傷の治癒または予防用の医薬組成物の製造に使用することができるという発見に基づいている。この創傷治癒効果は、オキシトシンをエストロゲンと組合わせることによって、強化または延長させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】創傷治癒用医薬の製造のためのオキシトシン活性を有する物質の使用本発明は、オキシトシンの新規用途に関する。発明の背景病巣または創傷は、事故または外科的手術から生じる外傷をもたらす外的損傷により、あるいは組織における病理学的プロセスにより発生する。消化性潰瘍及び骨潰瘍などの潰瘍は主として、皮膚または膜の創傷を意味する。病巣はまた、種々の他の組織における損傷、例えば骨折を包含する。本明細書の記載において、創傷（wound）の用語は、ヒトまたは動物の身体におけるあらゆるタイプの損傷を表わすために使用されている。創傷は、急性の創傷と慢性の創傷とに分類することができる。創傷治癒におけるメカニズムは一般的に、４相、即ち、止血，炎症，増殖及び成熟に分けることができる。炎症期間中、細菌と戦うために白血球が蓄積し、次いで血管壁の透過性が増加して、膨潤する。上記事象の多くはまた、改善された微細循環を促進して、発赤及び発熱を生じさせる。感染が拡大されない場合、白血球の数は減少し、マクロファージ及びリンパ球である単核細胞により置き換えられ、例えば成長因子（サイトカイン）が、ヒスタミン，セロトニン，プロスタグランジンなどの、創傷治癒プロセスの開始及び継続の主要レギュレーターである多くの化学物質と共に放出される。最も重要な調節細胞は、マクロファージである。増殖相において、結合組織が形成され、新しい血管が成長し、損傷した組織が再生される。線維芽細胞は、ほぼ１週間後の支配的細胞であり、炎症は減少し、そして傷口の強度は急速に増大される。成熟相期間中、最終的に組織タンパク質コラーゲンが安定化され、瘢痕組織が形成される。この相は、例えば神経組織のように、傷口の強度が改善され、再生が継続するほど長期間に及ぶ場合がある。最良の創傷治癒を達成するためには、各種ビタミン類及び微量元素ならびに栄養物質の供給が、酸素供給と共に充分なものであることが必要である。確固とした細胞の恒常性が創傷治癒及び修復にとって必須であり、治癒する組織において、肉芽組織の発現及び上皮発芽には或る条件が必要である。恒常性の条件には、或る程度の水和，充分な血液潅流，種々の成長因子の利用可能性，適当な酸素分圧，許容されるレベルの非病原性微生物叢及び創傷と隣接する正常皮膚との間の電圧勾配の維持が包含される。恒常的環境において、細胞は正常な増殖及び修復プロセスを可能にする体液中に浸される。慢性の創傷または無痛の非治癒性創傷は、感染，異種物体または毒性刺激物の存在，火傷，長期間にわたり皮膚に加えられた圧力、及び循環系の損傷による貧弱な血液供給を包含する種々の原因により生じる。慢性の創傷においては、組織恒常性及び創傷の環境が弱体化されており、これにより治癒の発現に失敗するか、または治癒は開始されるが、次いで休止してしまう。上記条件に含まれる因子には、組織壊死，脱水，慢性創傷浮腫，線維硬化及び細い血管の死滅がある。下肢潰瘍は、加令とともに増加する、人口のかなりの部分に見出される慢性の創傷のタイプの１つである。この病気の進行過程は、2，3ヶ月から数十年、持続することがあり、社会的に高額の消費をもたらし、また各患者に格別の不快感をもたらす。加圧潰瘍，床づれまたは褥瘡は、主として老人が患う慢性創傷のもう１つのタイプである。慢性の非治癒性創傷は、糖尿病の患者にとって重大な問題である。恒常的環境を獲得するために、創傷が湿ったままであるようにデザインされた閉鎖包帯で覆うことができる。しかしながら、これは創傷感染を促進する危険性をもたらす。慢性の開放性創傷の最も古い治療法の１つは、水治療法であり、現在、この方法は渦巻き浴（whirlpool bath）で行うことができる。これによって、接着している包帯を洗い流し、壊疽組織を除去することができる。慢性の皮膚潰瘍及び無痛潰瘍では、壊死性の乾燥した組織が創傷周辺からの細胞移動が止められているかぎり、この創傷周辺からの細胞移動は生じない。壊死組織は、肉芽組織の形成を妨害し、また上皮細胞が創傷周辺に移動するのを妨げる。従って、創面切除、即ち、創傷からの壊死組織の分離は、細菌が生残する死滅組織を除去して、上皮細胞が移動して創傷を塞ぐことができる肉芽形成の発達及び線維芽細胞沈着という創傷治癒プロセスを可能にするためばかりでなく、存在し得る、多数の微生物を除去するために必要である。この切除は、酵素の局所的適用により、自己分解、即ち、傷口体液中に天然に存在する酵素による壊死組織の自己消化により、合成包帯を用いて、あるいは外科的切除により行うことができる。切除されれば、創傷は正常に、肉芽形成、収縮及び上皮形成を受けるものと考えられる。創傷治癒速度について深い効果を有する多くの局所用製剤が存在する。局所用抗微生物薬及び清浄剤はしばしば、創傷治療に乱用されており、その結果として、有害な細胞毒性作用ならびに最低限の抗菌及び清浄効果しかもたらしていない。このような薬剤の例としては、ヨードフォア(iodophor)、次亜塩素酸ナトリウム溶液、過酸化水素及び酸化亜鉛を挙げることができる。害された創傷治癒は、成長因子による適度の刺激の欠落から生じることがあるという仮説が立てられている。実際に、成長因子が慢性の非治癒性創傷を持つ患者において、創傷閉鎖を改善することができるか否かにかかわる臨床試験に、成長因子が使用されている。最近、創傷治癒にかかわる有望な動物実験が、成長因子を用いて行われたが、ヒトの慢性の創傷への局所投与は、成功しなかった。数種の相違する成長因子を、プロテアーゼ阻害剤と組合わせて使用することが示唆されている。もう１つの試みとして、上皮細胞が単独移植または線維芽細胞及び細胞外マトリックス組成物と組合わせて移植された。また、移植された細胞において、あるいは創傷に直接適用して、治癒性ポリペプチドの生成を調節する遺伝子の使用が考慮されている。従来技術有糸分裂を導く、あるいは走化性である成長因子、または損傷した皮膚の修復に関与する１種または２種以上のタイプの細胞の分化を促進する成長因子は、原則的に、皮膚治癒を促進させることができる。線維芽細胞成長因子（FGF）は、少なくとも４種の特異な膜貫通型（membrane-spanning）チロシンキナーゼレセプター及びそれらの別様に転写された変異体を通して、中胚様及び外胚様由来の細胞を刺激する９種の公知である同族マイトージェン（mitogens）ファミリーである。酸性FGF（aFGFまたはFGF-1）は、公知のFGFレセプターの全てと高親和性で結合する能力を有する点で、確立されているFGFの中で唯一のものと考えられている。この広いレセプター特異性は、インビトロにおけるその複数の細胞の標的に寄与し、また組織再生の動物モデルにおける治療に関連する種々の生物学的活性に関与するものと推測される。aFGFは、皮膚の基本的細胞である皮膚線維芽細胞，血管内皮細胞及び上皮角質細胞からの強力なマイトージェンである短鎖ポリペプチドである。さらにまた、aFGFは、インビトロで血管内皮細胞に対して走化性であり、インビボで新しい血管の増殖を誘発させる。ラット及びマウスにおいて、外部から適用されたaFGFは、完全厚さ（full-thickness）の皮膚の創傷の治癒を促進し、切り傷の伸張力の一時的増加をもたらす[Liying Sunらによる「aFGF cDNAのトランスフェクションは創傷治癒を促進する」(Transfection w ith aFGFcDNA improves wound healing)The Journal of Investigative Dermato logy,Vol.108,No.3,1997]。しかしながら、aFGFの適用は制限されている。この理由は、標的組織でかさぶたが広がることにより、しばしばブロックされることから、比較的大量の組換えaFGFが必要であることによる。このaFGFの短い寿命は、局所用途のもう１つの欠点である、頻回の適用を要する。拡散の問題を解消するための高用量のaFGFの頻繁な適用は、高価なものとなる。成長因子のもう１種のファミリーは、形質転換成長因子β（TGF−β）であり、これは多数の生物学的活性を有する広範な種々のポリペプチドを包含する。TG F−β１、−β２及びβ３の創傷治癒における重要な役割が実証されている。TGF −β１は、皮膚の形態形成及び皮膚の創傷の回復の重要なモデュレーターであり、また創傷に対する外部からの適用は、動物における創傷治癒プロセスを強化することが証明されている。TGF−β1作用のメカニズムに対する見識を得るために、培養された角質細胞中において、この因子により調節される遺伝子を同定し、クローン形成した。B.Munzらによる「培養された角質細胞における、及び創傷修復期間中におけるカルパクチンＩサブユニットアネキシンII 及びp11の差別的発現」（Differential Expression of the Calpactin I Subuni ts Annexin II and p11 in Cultured Keratinocytes and During Wound Repair ）The Journal of Investigative Dermatology,Vol.108,No.3,1997参照。さらにまた、上記物質はまた、上皮成長因子（EGF）及び角質細胞成長因子（KGF）により増加された。これらの成長因子は両方とも、角質細胞増殖を刺激する。 P．Luppiらによる「NGFは、ヒト妊娠中に血漿中に放出される；オキシトシンー媒介応答？」(NGF is released into plasma during human pregnancy；an ox ytocin-mediated response?)Neuroreport,4(8),1063-5,1993には、妊娠，分娩及び授乳中の女性の末梢循環系では、生物学的に活性な神経成長因子（NGF）が、５倍増加することが実証されている。雌のラットにおけるオキシトシンの静脈注射はまた、NGFの視床下部レベルの増加をもたらしたことから、増加した量の循環NGFが、血漿中のオキシトシンの高レベルまたは視床下部−下垂体−副腎軸の活性化に関連しているものと考えられた。 G．Jansenらによる「刺鍼後のラットにおける虚血性皮膚筋肉弁の増大した生存」(Increased survival of ischaemic musculocutaneous flaps in ratsafter acupuncture)Acta Physiol.Scand.,135,555-558,1989では、ラットにおける当該皮弁の生存に対する刺鍼術の効果が試験されており、手による刺鍼及び電気的刺鍼が、未処置対照に比較して、上記皮弁の生存を相当に増加させたことが証明されている。発明の説明ここに驚くべきことに、オキシトシンが、創傷治癒効果を有することが見出された。この治癒効果は、オキシトシンが、種々の組織の治癒に重要な成長因子を活性化するという事実に少なくとも部分的に帰因する。特に、本発明により、FG Fタイプの成長因子及び／またはそれらのレセプターが、オキシトシンの投与によって活性化されることが見出された。本発明は、ヒトを含む哺乳動物の創傷の治療または予防処置用の医薬組成物の製造にオキシトシン活性を有する物質を使用することに関する。好適用途は、皮膚，骨，粘膜，腱，筋肉，神経，血管及び結合組織における創傷の治療にある。もう１つの本発明の好適用途け、慢性の創傷の治療にある。オキシトシンは、単離されて配列決定された最初のペプチドホルモンの１っである。オキシトシンは、位置１と６との間でジスルフィド架橋を形成する２個のシステイン残基を有するノナペプチドであり、下記式に相当する：長年、オキシトシンに帰因する唯一の効果は、母乳放出及び子宮収縮に対する刺激効果であったが、過去数十年の間に、オキシトシンはCNS内で広いスペクトルの効果を発揮することが示された。オキシトシンは、記憶及び学習プコセスの制御及び種々のタイプの挙動、例えば食事，歩行運動，ならびに母性及び性的挙動の制御に関与することが示唆されている。オキシトシンはまた、心臓血管系機能，温度調節，痛み閾値及び体液バランスの制御に関与することが示唆されている。オキシトシンが、−種々の免疫学的プロセスの制御に関連することも証明されている。最近になって、オキシトシンの注入が血圧を低下させ、また反復投与後に、長期持続性の増加された体重増加効果を有することが実証された。オキシトシンの合成方法については、種々の方法が存在しており、商業的方法は、米国特許2,938,891及び同3,076,797に記載されている。ヒト身体において、オキシトシンは、視床下部の室傍核（PVN）及び視索上核（SON）で産生される。これらの核でまた産生されるバソプレッシンとは、2個のアミノ酸でのみ相違している。SON及びPVNのマグノ細胞（magnocellular）オキシトシン原性ニューロンは、オキシトシンまたはバソプレッシンを循環系に分泌する後部下垂体中に投射する。PVNに起源を有するパルボ細胞（parvocellular）ニューロンは、中枢神経系（CNS）の複数の領域に投射する。オキシトシン産生細胞は、コリン作用性ニューロン，カテコールアミン作用性ニューロン及びペプチド作用性ニューコンにより刺激される。脳以外、例えば子宮，卵巣，精巣，胸腺，副腎髄質及び膵臓などの種々の組織におけるオキシトシンの存在が実証されており、オキシトシンがこれらの器官で局所効果を発揮することが示唆されている。脳領域及び循環系へのオキシトシンの平行分泌は、母乳授乳などの或る種の刺激に応答して生じるが、別種の刺激がまた、脳または下垂体に末端を有するオキシトシン原性ニューロンの分離した活性化を生じさせることがある。この観点から、オキシトシンの用語は、オキシトシンに加えて、利用できるかぎりの、その先駆体，代謝誘導体，オキシトシンアゴニストまたは同一の性質を示す類縁体を意味する。本発明によるオキシトシン活性を有する物質は、一般式Ｉで表わすことができる：式中、Ｗは、Ile，Cha，Val，Hoph及びPheからなる群から選択され；Ｘは、Gln，Ser，Thr，Cit，Daba及びArgからなる群から選択され；Ｙは、Leu，Ile，Arg，Hos，Daba，Cit及びValからなる群から選択され；ここで、Leu，Ile及びValはオキシトシン類縁体をもたらし、そしてArg，Hos ，Daba及びCitはバソプレッシン類縁体をもたらす、そしてＺは、Gly及びAlaからなる群から選択される。上記物質中の非天然アミノ酸は、下記構造を有する： Cha（シクロヘキシルアラニン） Hoph（ホモフェニルアラニン） Cit（シトルリン）Daba（ジフェニル酪酸） Hos（ホモセリン）上記アミノ酸は全部が、例えばBachem及びSigmaから市販されている。本発明による物質中のアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸のどちらでもよい。本発明による物質はまた、逆行ペプチド結合を有する配列を有するノナペプチドを包含する。これらの配列は好ましくは、逆行配列を有し、さらに好ましくはＤ−アミノ酸を含有する。 I式のノナペプチドは、下記式を有するオキシトシンに類似する構造に基づき、オキシトシン活性を示すものと考えられる：オキシトシン構造において、位置1，2，5，6及び７は未変化のままである、即ちジスルフィド架橋であり、またこれらのアミノ酸、即ち、位置２に存在するTy r，位置５に存在するAsn及び位置７に存在するProは、上記架橋を安定化し、その性質にとって臨界的重要性を有するものと考えられる。位置３に存在する疎水性のIleは、別種の疎水性アミノ酸と置き換えることができ、そして位置４に存在する親水性のGlnは、別種の親水性アミノ酸と置き換えることができる。位置８において、Leuを疎水性アミノ酸であるIleまたはValにより置き換えると、オキシトシン類縁体が得られ、また親水性アミノ酸であるArg，Hos，Cit又はDaba により置き換えると、バソプレッシン類縁体が得られる。本発明によるノナペプチドは、S.Hellbergらによる「ペプチドの定量的構造−活性関係、多変数のアプローチ」（“Peptide Quantitative Structure-Activity Relationships,a mult ivariate approach")J.Med.Chem.,1987,30,1126及びJ．Jonssonらによる「55のコード及び非コードアミノ酸の多変数のパラメーター化」（“Multivariate par ametrization of 55 coded and non-coded amino acids")Quant.Struct.-Act.Re lat.,8,204-209(1989)に記載された方法により編集されている。このペプチドは、公知方法により合成することができる[例えば、Streitwieser and Heathcock によるIntroduction to Organic Chemistry,第３版，949-950頁に記載されているメリフィールド（Merrifields）固相合成法]。逆行ペプチド結合を有する配列もまた、例えばレトロ−逆修正法らによるPNAS,Vol.94,Nov97,12545-12550参照)。オキシトシンの使用は、本発明の好適態様を構成する。本発明のもう１つの好適態様は、下記式を有する物質、メソトシン(mesotocin )，アイソトシン(isotocin)，バソプレッシン（vasopressin）またはバソトシン（vasotocin）の使用にある：メソトシン（式Ｉにおいて、W=Ile，X=Gln，Y=Ile及びZ=Glyである場合）アイソトシン（式Ｉにおいて、W=Ile，X=Ser，Y=Ile及びZ=Glyである場合）バソプレッシン（式Ｉにおいて、W=Phe，X=Gln，Y=Arg及びZ=Glyである場合）バソトシン（式Ｉにおいて、W=Ile，X=Gln，Y=Arg及びZ=Glyである場合）本発明に従い使用されるその他の好適物質には、下記物質がある：配列番号：1 配列番号：2 配列番号：3 配列番号：4 配列番号：5 配列番号：6 配列番号：7 及び配列番号：8 試験は、ラットにおいて、オキシトシンが中枢作用により中枢α₂−レセプターの活性を増大させることを示した。これらのレセプターは、脳において、サイクリックAMPを活性化する、α₂−レセプターを経て主として媒介されるノルアドレナリン活性化作用に対する抑制作用を有し、そしてこの作用に対向する。α₂ −レセプター刺激がα₁−レセプター刺激を上回ると、活動は休息に置き換えられ、そしてエネルギーは成長及び治癒の方向に転じる、即ち、ストレスまたは筋肉収縮及び活動には使用されない。その結果として、副交感神経緊張が交感神経緊張全体を支配し、筋肉は弛緩する。オキシトシンは、ヒトにおいて類似の効果を発揮するものと推定される。オキシトシン反復分泌を特徴とする状態である母乳授乳期間中に、オキシトシン反復投与後に実験動物に見出される全ての効果が見出される。このオキシトシンによるα₂−レセプターに対する効果が、どのように媒介されるのかは知られていないが、多分、古典的オキシトシンレセプター媒介効果によるものではない。オキシトシンの効果は、オキシトシンの放出を増加させる医薬及び／または多くのレセプター、例えばエストロゲン、あるいはα₂−アゴニスト効果を有する医薬、例えばクロニジン（clonidine）の組合わせ投与によって拡張または強化することができる。本発明はまた、治療的または予防的な創傷治癒用の医薬組成物の製造において、エストロゲンと組合わせて、オキシトシンを使用することに関する。オキシトシン及びエストロゲンは一緒に投与することもでき、あるいはエストロゲンを最初に投与し、次いでオキシトシンを投与することもできる。エストロゲンはオキシトシンの放出及び合成を増加させ、またオキシトシンレセプターの合成を増加させ、また、α₂−レセプターの活性をアップレギュレートする。オキシトシンの短期間効果、例えば短期間痛み軽減，短期間鎮静、及びホルモン放出は、オキシトシンアンタゴニストにより減少し、従って直接作用であると言うことができる。数日ないし数ヶ月の軽減に相当する長期間効果は、数週間から数ヶ月の範囲で 3〜10日間、好ましくは5〜8日間の間隔の反復治療後に得られ、痛みを緩和するという観点ばかりでなく、一般的観点からも驚くべきものであり、このような効果は、別種の医薬による患者では、従来報告されていないものであった。上記効果が得られたならば、例えば１週間に１回の治療で、その効果を維持することができる。この長期間効果は、α₂−アンタゴニストにより減少し、そしてα₂−アゴニストにより強化される。オキシトシン含有医薬組成物は、局所，イオン導入法(iontophoretical),鼻，肺内，非経口(例えば、皮下，腹腔内または静脈内)，鞘内、または脳血管内に投与することができるように調剤することができる。好適投与経路は局所及び鼻内である。非経口用組成物は、例えば皮下，腹腔内または静脈内注入用の溶液またはエマルジョンである。局所用組成物は、ローション、クリーム、軟膏またはゲルでもよく、例えばプラスターに配合してもよい。局所投与で投与される用量は、1〜1000μg/cm²、好ましくは10〜100μg/cm²であり、非経口投与される用量は、0.05〜1mg/kgであり、そして鼻投与される用量は、1〜100IU／日、好ましくは25〜50IU／日である。1IU，内的単位（internal unit）は、2μgに相当する。臍部痛を有する子供の場合、好適用量は、鼻投与について、好ましくは1〜2時間の間に2〜3回投与して、20〜50IU／日、好ましくは 25〜30IU／日である。i.c.v．又はi.t．投与の場合、その用量は一般的に、非経口用量の1/10〜1/1000である。現在、注入用及び鼻スプレー用の市販溶液が市場に存在する。図面の説明図１は、オキシトシン及びオキシトシンアンタゴニストの皮下投与後のラットにおける筋肉皮弁の生存を示す棒グラフである。生物学的試験創傷治癒の確立されているモデルにおいて、ラットの筋肉皮弁の生存を評価する。形成外科において、再生の問題は、多くの場合、外科手術上の皮弁により解消される。外科手術上の皮弁の主要な欠点は、それが虚血を発現させ、最終的に遠位部分の壊死を生じさせ易いという性質である。この併発症は、術後に優れていると考えられた結果を、最終的に無効なものとする場合もある。外科手術上の皮弁の生存メカニズムを説明し、確立される虚血を防止して逆方向に向けさせる方法に、多くの研究が向けられている。慢性の非治癒性皮膚潰瘍に対する皮膚を冒す創傷の治癒薬の効果を評価するために、変異体C57BL/Ks-db/db糖尿病マウスを、潜在的に関連性のある治癒が害されたモデルとして発現させた。これらのホモ接合遺伝的糖尿病マウスは、ヒトタイプII糖尿病に類似する、肥満及びインシュリン抵抗性の高血糖症を発現する。これらはまた、過度の飲水及び排尿、ならびに格別に上昇した尿糖レベルなどの糖尿病の徴候を示す。これらのマウスにおける創傷は、細胞浸潤，肉芽組織形成、及び創傷閉鎖に格別の遅延を示す。従来の試験では、このモデルはaFGF製剤の評価に使用されていた。試験1．オキシトシン投与後のラットにおける皮弁の生存この試験の目的は、ラットにおける筋肉皮弁の生存に対するオキシトシンの効果を評価することにあった。 71匹の雌の白変種ラット［スプラギュー−ダウレイ(Sprague-Dawley)、体重18 0〜220g）を、抱水クロラール（0.4g/kg）により麻酔し、背中の毛を剃り、背面上部を基として標準的な皮弁（2×7cm）を持ち上げ、次いで元の位置に縫合した。その皮弁は、筋肉の深部筋膜から持ち上げ、浅在筋膜，組織層カルノサス(car nosus)，皮下組織及び皮膚を含むものとした。手術前の24時間及び１時間の時点、及び手術後の24時間の時点で、ラットを、オキシトシン1mg/kg(n＝20)，オキシトシンアンタゴニスト、即ち１−デアミノ−２−Ｄ−Tyr−(OEt)−４−Thr− ８−Orn−オキシトシン1mg/kg(n＝15)，上記オキシトシンアンタゴニスト1mg/kg 、次いで30分後に、オキシトシンまたは塩類溶液（n＝20）1mg/kgの皮下投与により処置した。手術６日後、皮弁の生存を評価した。オキシトンン処置したラットは、塩類溶液処置した対照に比較して、相当に高い生存を有していた(p＜0.05)。オキシトシンの注入前にオキシトシンアンタゴニストを投与すると、この効果は消滅した。オキシトシンアンタゴニスト単独では、塩類溶液処置ラット（有意差なし、p ＝0.13）及びオキシトシン処置ラット（p＜0.05）に比較して、皮弁生存を減少させた。この試験結果は、図１に示されており、塩類溶液(NaCl)，オキシトシン(Ox)，オキシトシンアンタゴニスト（OxA）及びオキシトシンアンタゴニスト＋オキシトシン（OxA＋Ox）の皮下投与により処置したラットにおける筋肉皮弁の生存を示している。これらの結果は、平均値±SDとして示されている。統計学的評価は、一方向（one-way）ANOVAを用いてスチューデントｔ検定により行った。試験2．オキシトシン投与後の糖尿病ラットにおける創傷治癒 11週齢の雌のC57BL/Ks-db/db糖尿病マウスを、Jackson Laboratories(BarHarb or,ME)から入手した。マウスは、無菌の微小隔離箱に、無菌水及び敷きわらとともに入れ(４匹／箱)、半障壁隔離施設内に保持した。創傷を付けた後の体温低下を防止し、死亡を減少させるために、補助暖房を電気暖房パッドにより与えた。マウスを、ケタミン110mg／体重kg及びキシラジン9mg／体重kgの腹腔内注射により麻酔した。背中中央及び胸の皮膚の毛を剃り、次いで2％クロルヘキシジン外科手術用洗浄剤により、次いで70％エタノールにより消毒した。直径1.6cmの型板を用い、背面中央領域に2.0cm²の印を付け、次いで無菌の曲がったイリスサイサー（iris scissors）による鋭い切除により、１個の完全厚さの創傷を作り出した。術後、創傷領域は直ちに、約2.3cm²に広がったが、これは創傷周囲に沿った皮膚の収縮によるものと考えられる。手術及びその後の治癒分析は全て、完全無菌技術を用いて層流フード内で行った。投与は、手術前及び手術後の０日目，３日目及び７日目に、連続して５日において行った。オキシトシンは、１用量あたり１群16匹のマウスに対してそれぞれ、種々の用量、即ち、0.001，0.01，0 .1，1.0，10.0及び100.0μg/cm²の用量で投与した。保護，湿った環境の維持及びかさぶた形成の防止のために、創傷は半透明のバイオクルーシブ（Bioclusive ）包帯（Johnson & Johnson Products，New Brunswick,NJ）で覆った。創傷からの液体試料を、手術後の10日目に採取し、好気性及び嫌気性微生物について培養した。培養物が創傷１個あたりで50よりも多いコロニーを示した動物は、試験分析から排除した。中程度のまたは臨界未満の感染の防止は、一貫した最大の治癒損傷をもたらした。これにより、治療効果を評価するための大きい創傷治癒窓が得られる。創傷の外観を写真で記録し、露出した創傷表面に直接に適用された無菌の生理食塩水滴で予め湿らせた後に、無菌ガラススライド上に、それらの周囲をトレースした。測定は、創傷を付けた直後及びその後、創傷が完全に閉鎖されるまで、週に２回、行った。創傷領域及び周囲を、コンピューター画像分析を用いてガラススライドトレーシングから決定した。各群間の統計学的に有意の差異を、非対２−テイルスチューデントｔ検定（unpaired two-tailed Student t-test）を用いて評価した。初期領域からの減少パーセントとして表わされる治癒は、創傷領域の差異を平均創傷周囲領域により割り算することによって、順次経過時間間隔で、創傷の端からの線状内部成長に変換した。特定時間における総内部成長は、その時点までの漸増内部成長距離の合計である。この変換を経過時間の関数として近似線型化した。これにより、経過時間にわたり一定である動態率として、治癒を表わすことができる。完全閉鎖までの時間を追跡するために、創傷は週に２回検査し、湿った肉芽組織がもはや見られない時点が完全治癒であると考えた。この現象は、機能的上皮水透過性障壁の形成を示す。閉鎖はまた、組織学的に確認した。未治癒の創傷に対する治癒した創傷の断片の時間−点（time-point）比較を、イエーツ（Yates ）相関法によるχ²−統計学によって分析し、各動物についての総閉鎖までの絶対日数の群比較を、非対２−テイルスチューデントｔ検定により分析した。直径1.6cmの完全厚さの皮膚切除した創傷は、対応する媒質で処置した対照と比較して、創傷を付けた後の最初の１週間に投与された10μg／初期創傷cm²の３回の投与に応答して、実質的に迅速に閉鎖した。処置された創傷において、統計学的に有意の創傷治癒率の増強が、損傷後の早くも７日目に見出され、試験期間中、継続した。オキシトシン処置した創傷と媒質処置した創傷との間の初期領域の割合における50％の最大相違は、損傷後の14日目から生じた。この差異は、対応するPBS／ヘパリン媒質を投与された場合に比較して、14日間で、処置マウスの創傷の大きさが10倍減少したことに相当する。液体媒質で処置された創傷は、無処置の創傷よりは幾分早く治癒されたが、PBSまたは生理食塩水による処置は、ヘパリン含有PBS媒質で処置された場合と同等の治癒率であった( データは示されていない)。創傷の閉鎖は、経過時間の関数として非線型であった。従って、オキシトシン処置効果の大きさは、経過時間にわたり変化するものと考えられる。これらの完全厚さの創傷は、創傷周囲から漸進的に治癒することから、我々は、創傷の初期パーセントからのデータを元の創傷の端部からの平均線型治癒長さに変換した。この計算は、初期３日の遅れの後の平均治癒率を線型化した。オキシトシンによる処置は、全部の経過時間間隔で、創傷の端部からの治癒の線型率（linear rat e）を有意に増加させた(p≦0.01)。経過時間の関数としての蓄積線型治癒長さの傾斜を、各動物について測定した。，処置によってグループ分けした、これらの傾斜は、10μg/cm²のオキシトシンが、その平均線型治癒率を、媒質処置群で見出された0.18mm／日から0.45mm／日に増加させたことを示した(p≦0.01)。この用量のオキシトシンによる処置はまた、完全な創傷の閉鎖までの時間を明確に減少させた。完全閉鎖における統計学的に有意（p≦0.05）の増加が、14目に見出された。完全閉鎖までの平均経過時間は、媒質処置群における52日間から、損傷後の最初の１週間の間におけるオキシトシンの３回の投与により僅か23日間に短縮された(p≦0.0001)。損傷後の最初の１週間に適用された、各用量当り1〜100μg/cm²のオキシトシンの３回の局所適用は、対の媒質対照に優る治癒率にかかわる有意の用量−相関性の増加をもたらした。0.001μg/cm²，0.01μg/cm²及び0.1μg/cm²の用量は無効であり、従って、「無効」レベルは、0.001μg/cm²〜0.1μg/cm²であることが確立された。用量−反応相関はまた、完全な創傷閉鎖までの経過時間にも見出された。各用量あたり1〜100μg/cm²の適用は、これらの創傷が完全に閉鎖されるまでに要する時間を有意に減少させた。1.0〜10.0μg/cm²の用量範囲において、創傷は、それらの各媒質対照よりも約10日間、早く閉鎖した。0.001μg/cm²(示されていない)及び0.01μg/cm²の用量における閉鎖速度は完全閉鎖までの時間の短縮には無効であった。 FGFの濃度を、損傷の７日後に、10μg/cm²オキシトシンで処置した10匹のマウスの損傷領域から採取した皮膚生検（「潰瘍」）とPBSで処置した10匹のマウスの損傷領域から採取した皮膚生検とを比較した。この結果は、オキシトシン処置したマウスが、PBS媒質処置したマウスに比較して、162％多いFGF−１を合成したことを示した。この濃度の増加は、格別に有意であり(p≦0.001)、オキシトシンが、FGF−1の増大した発現及び合成により、創傷の治癒を増加させるという仮説を強力に支持している。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年７月１４日（１９９９．７．１４）【補正内容】請求の範囲１．ヒトを含む哺乳動物における、創傷の治癒または予防処置用の医薬組成物の製造のためのオキシトシン活性を有する物質（ただし、バソプレッシンを除く）の使用。２．下記式Ｉ及びその逆行ペプチド結合を耳する配列：（式中、Ｗは、Ile，Cha，Val，Hoph及びPheからなる群から選択され；Ｘは、Gln，Ser，Thr，Cit，Daba及びArgがらなる群から選択され；Ｙは、Leu，Ile，Arg，Hos，Daba，Cit及びValからなる群から選択され；ここで、Leu，Ile及びValはオキシトシン類縁体をもたらし、そしてArg，Hos ，Daba及びCitはバンプレッシン類縁体をもたらし、そしてＺは、Gly及びAlaからなる群から選択される）を有することを特徴とする(ただし、バソプレッシンを除く)、請求項１に記載の物質の使用。３．上記物質が、オキシトシンであることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。４．上記物質が、メソトシン，アイソトシンまたはバソトシンであることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。５．上記物質が、下記物質からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用：及び６．皮膚，骨，粘膜，腱，筋肉，神経，血管及び結合組織における創傷を治療するための、請求項1〜5のいずれか一項に記載のオキシトシンの使用。７．慢性の創傷を治療するための、請求項1から6のいずれか一項に記載のオキシトシンの使用。８．エストコゲンと組み合わされているオキシトシンの、請求項1〜7のいずれか一項に記載の使用。９．医薬組成物が、オキシトシンを、医薬上で不活性な担体と組合わせて含有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の使用。 10．医薬組成物が、鼻または局所投与用に調剤されている、請求項1〜9のいずれか一項に記載の使用。 11．医薬組成物が、鼻スプレーの形態である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の使用。 12．創傷の治療方法であって、オキシトシン活性を有する物質またはオキシトシンアゴニスト、特にオキシトシンを治療有効量で投与することを包含する方法。 13．オキシトシンを、5〜100IU／日、好ましくは25〜50IU／日の量で鼻投与することを包含する、請求項12に記載の方法。【手続補正書】【提出日】平成１３年５月３１日（２００１．５．３１）【補正内容】請求の範囲 1. ヒトを含む哺乳動物における、創傷の治癒または予防処置用の医薬組成物の製造のためのオキシトシン活性を有する物質（ただし、バソプレッシンを除く）の使用。 2. 下記式I及びその逆行ペプチド結合を有する配列：（式中、 Wは、Ile，Cha，Val，Hoph及びPheからなる群から選択され； Xは、Gln，Ser，Thr，Cit，Daba及びArgからなる群から選択され； Yは、Leu，Ile，Arg，Hos，Daba，Cit及びValからなる群から選択され；ここで、Leu，Ile及びValはオキシトシン類縁体をもたらし、そしてArg，Hos ，Daba及びCitはバソプレッシン類縁体をもたらし、そして Zは、Gly及びAlaからなる群から選択される）を有することを特徴とする（ただし、バソプレッシンを除く）、請求項１に記載の物質の使用。 3. 上記物質が、オキシトシンであることを特徴とする、請求項1または２に記載の使用。 4. 上記物質が、メソトシン，アイソトシンまたはバソトシンであることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。 5. 上記物質が、下記物質からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用：及び 6. 皮膚，骨，粘膜，腱，筋肉，神経，血管及び結合組織における創傷を治療するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載のオキシトシンの使用。 7. 慢性の創傷を治療するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のオキシトシンの使用。 8. エストロゲンと組み合わされているオキシトシンの、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。 9. 医薬組成物が、オキシトシンを、医薬上で不活性な担体と組合わせて含有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。 10．医薬組成物が、鼻または局所投与用に調剤されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。 11．医薬組成物が、鼻スプレーの形態である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用。 12．下記式II：（式中、Ｘ₁はCha、Ｘ₂はCit、Ｘ₃はArg及びＸ₄はGly；またはＸ₁はval、Ｘ₂はThr、Ｘ₃はLeu及びＸ₄はGly；またはＸ₁はHoph、Ｘ₂はThr、Ｘ₃はVal及びＸ₄はGly；またはＸ₁はphe、Ｘ₂はCit、Ｘ₃はLeu及びＸ₄はGly；またはＸ₁はCha、Ｘ₂はArg、Ｘ₃はHos及びＸ₄はAla；またはＸ₁はVal、Ｘ₂はDaba,，Ｘ３はDaba及びＸ₄はAht；またはＸ₁はHoph、Ｘ₂はDaba、Ｘ₃はCit及びＸ₄はAla；またはＸ₁はPhe、Ｘ₂はArg、Ｘ₃はVal及びＸ₄はAla）を有する物質。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 38/11 Ａ６１Ｐ 17/02 Ａ６１Ｐ 9/00 19/00 17/02 25/00 19/00 Ｃ０７Ｋ 7/06 ＺＮＡ 25/00 Ａ６１Ｋ 37/34 Ｃ０７Ｋ 7/06 ＺＮＡ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトを含む哺乳動物における、創傷の治癒または予防処置用の医薬組成物の製造のためのオキシトシン活性を有する物質（ただし、バソプレッシンを除く）の使用。２．下記式Ｉ及びその逆行ペプチド結合を有する配列：（式中、Ｗは、Ile，Cha，Val，Hoph及びPheからなる群から選択され；Ｘは、Gln，Ser，Thr，Cit，Daba及びArgからなる群から選択され；Ｙは、Leu，Ile，Arg，Hos，Daba，Cit及びValからなる群から選択され；ここで、Leu，Ile及びValはオキシトシン類縁体をもたらし、そしてArg，Hos ，Daba及びCitはバソプレッシン類縁体をもたらし、そしてＺは、Gly及びAlaからなる群から選択される）を有することを特徴とする(ただし、バソプレッシンを除く)、請求項１に記載の物質の使用。３．上記物質が、オキシトシンであることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。４．上記物質が、メソトシン，アイソトシンまたはバソトシンであることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。５．上記物質が、下記物質からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用：及び６．皮膚，骨，粘膜，腱，筋肉，神経，血管及び結合組織における創傷を治療するための、請求項1〜5のいずれか一項に記載のオキシトシンの使用。７．慢性の創傷を治療するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のオキシトシンの使用。８．エストロゲンと組み合わされているオキシトシンの、請求項1〜7のいずれか一項に記載の使用。９．医薬組成物が、オキシトシンを、医薬上で不活性な担体と組合わせて含有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の使用。 10．医薬組成物が、鼻または局所投与用に調剤されている、請求項1〜9のいずれか一項に記載の使用。 11．医薬組成物が、鼻スプレーの形態である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の使用。 12．創傷の治療方法であって、オキシトシン活性を有する物質またはオキシトシンアゴニスト、特にオキシトシンを治療有効量で投与することを包含する方法。 13．オキシトシンを、5〜100IU／日、好ましくは25〜50IU／日の量で鼻投与することを包含する、請求項12に記載の方法。