JP2017518311A

JP2017518311A - オキシトシンアゴニストとしてのペプチド

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Publication number: JP2017518311A
Application number: JP2016571027A
Authority: JP
Inventors: ビサンツ，カテリーナ; ブライヒャー，コンラート; グルントショーバー，クリストフ
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2014-06-03
Filing date: 2015-06-01
Publication date: 2017-07-06
Anticipated expiration: 2035-06-01
Also published as: CN106414479A; AU2015270723A1; US9957298B2; SG11201610073PA; WO2015185467A1; CL2016003095A1; EP3151849B1; KR20170004013A; US20170081369A1; JP6412170B2; CN106414479B; PH12016502232A1; PE20161559A1; EA030091B1; CA2949173A1; IL248553A0; EP3151849A1; CR20160563A; EA201692404A1; MX2016015873A

Abstract

本発明は、式（Ｉ）［式中、Ｒ１は、水素、低級アルキル又はシクロアルキルであり；Ｒ２は、水素であるか、あるいは、Ｒ１及びＲ２は、これらが結合しているＮ及びＣ原子と一緒になって、場合により１個若しくは２個のＦ原子若しくはヒドロキシにより置換されている、ピロリジン環を形成してもよいか、又はアゼチジン若しくはピペラジン環を形成してもよく；Ｒ３は、水素、低級アルキル、ヒドロキシにより置換されている低級アルキル、−（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ベンジル、フェニル、−ＣＨ２−５員芳香族複素環基、−ＣＨ２−インドリル、−ＣＨ２−シクロアルキル、シクロアルキル又は−（ＣＨ２）２−Ｓ−低級アルキルであり；Ｒ３’は、水素又は低級アルキルであるか；あるいは、Ｘは、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨＲ４−ＣＨＲ４’−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−であり；Ｒ４／Ｒ４’は、水素であるか、又はＲ４若しくはＲ４’の一方は、アミノであり；ｏは、０又は１である］で示される化合物若しくはその薬学的に許容し得る酸付加塩、ラセミ混合物若しくはその対応するエナンチオマー及び／又はその光学異性体に関する。本化合物は、自閉症、心的外傷後ストレス障害を含むストレス、不安障害及び鬱病を含む不安、統合失調症、精神障害及び記憶喪失、アルコール離脱、薬物嗜癖の処置用の、並びにプラダーウィリ症候群の処置用のオキシトシン受容体アゴニストであることが見出されている。

Description

本発明は、式Ｉ：

［式中、
Ｒ^１は、水素、低級アルキル又はシクロアルキルであり；
Ｒ^２は、水素であるか、あるいは
Ｒ^１及びＲ^２は、これらが結合しているＮ及びＣ原子と一緒になって、場合により１個若しくは２個のＦ原子若しくはヒドロキシにより置換されている、ピロリジン環を形成してもよいか、又はアゼチジン若しくはピペラジン環を形成してもよく；
Ｒ^３は、水素、低級アルキル、ヒドロキシにより置換されている低級アルキル、−（ＣＨ_２）_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、ベンジル、フェニル、−ＣＨ_２−５員芳香族複素環基、−ＣＨ_２−インドリル、−ＣＨ_２−シクロアルキル、シクロアルキル又は−（ＣＨ_２）_２−Ｓ−低級アルキルであり；
Ｒ^３’は、水素又は低級アルキルであるか；あるいは
Ｘは、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨＲ^４−ＣＨＲ^４’−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ_２−であり；
Ｒ^４／Ｒ^４’は、水素であるか、又はＲ^４若しくはＲ^４’の一方は、アミノであり；
ｏは、０又は１である］で示される化合物若しくはその薬学的に許容し得る酸付加塩、ラセミ混合物若しくはその対応するエナンチオマー及び／又はその光学異性体に関する。

本化合物は、オキシトシン受容体アゴニストであって、この化合物は、オキシトシンの生物活性を保持しているオキシトシン類似体であることが見い出されている。このような類似体分子は、オキシトシン受容体との結合を含めて、内因性オキシトシンと類似のやり方で作用することができる。オキシトシンの類似体は、完全に新しい分子構造を有する。

オキシトシンは、１位と６位との間にジスルフィド架橋を形成する、２個のシステイン残基を含む９個のアミノ酸の環状ペプチドホルモンである。ヒトオキシトシンは、Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙの配列を含む。

ペプチドは、従前の低分子製剤よりも高い特異性及び効力、並びに低い毒性プロフィールという利点を提供する、商業的に妥当な分類の薬物として浮上している。これらは、糖尿病、ＨＩＶ、肝炎、癌等のような、多数の疾患について有望な処置オプションを提供しており、そして医師及び患者は、ペプチドに基づく薬物療法をより受け容れるようになっている。本発明は、ペプチド性オキシトシン受容体アゴニストであって、天然ホルモンのオキシトシン及びカルベトシン（carbetocin）をも含むアゴニストに関する。

オキシトシンは、子宮弛緩及び出血多量の制御のための強力な子宮収縮剤であり、臨床的には陣痛を誘発するために使用され、そして泌乳の開始と維持を増強することが示されている（Gimpl et al., Physiol. Rev., 81, (2001), 629 - 683, Ruis et al.,BMJ, 283, (1981), 340 - 342）。カルベトシン（１−デアミノ−１−カルバ−２−チロシン（Ｏ−メチル）−オキシトシン）もまた、子宮弛緩及び出血多量の制御のために臨床的に使用される強力な子宮収縮剤である。

ペプチド性オキシトシンアゴニストは、２５，０００人に１人の子供が罹患する稀な遺伝病である、プラダーウィリ（Prader-Willi）症候群の処置に使用され得る。更なる研究により、オキシトシンアゴニストは、腹痛及び背痛（Yang, Spine, 19, 1994, 867-71）を含む炎症及び疼痛、男性（Lidberg et al., Pharmakopsychiat., 10, 1977, 21 - 25）及び女性（Anderson-Hunt, et al., BMJ, 309, 1994, 929）両方の性機能不全、過敏性腸症候群（ＩＢＳ, Louvel et al., Gut, 39, 1996, 741 - 47）、便秘及び消化管閉塞（Ohlsson et al., Neurogastroenterol. Motil., 17, 2005, 697 - 704）、自閉症（Hollander et al., Neuropsychopharm., 28, 2008, 193 - 98）、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）を含むストレス（Pitman et al., Psychiatry Research, 48, 107 - 117）、不安障害及び鬱病を含む不安（Kirsch et al., J. Neurosci., 25, 49, 11489 - 93, Waldherr et al., PNAS, 104, 2007, 16681 - 84）、手術の失血又は分娩後出血の制御（Fujimoto et al., Acta Obstet. Gynecol., 85, 2006, 1310 -14）、陣痛の誘発及び維持（Flamm et al., Obstet. Gynecol., 70, 1987, 70 - 12）、創傷治癒及び感染症、乳腺炎及び胎盤娩出、並びに骨粗鬆症の処置に有用であることが示されている。更に、オキシトシンアゴニストは、癌及び胎盤機能不全の両者の診断に有用であり得る。

更に、“Intranasal Oxytocin blocks alcohol withdrawal in human subjects” (Alcohol Clin Exp Res, Vol, No. 2012) 及び “Breaking the loop: Oxytocin as a potential treatment for drug addiction” (Hormones and Behavior, 61, 2012 , 331- 339) という論文は、オキシトシンアゴニストでアルコール離脱及び薬物嗜癖を処置することを提案している。

オキシトシン及びその受容体は、側坐核や海馬のような、統合失調症の症状に関係する脳の領域に存在する。オキシトシン受容体アゴニストは、自閉症、心的外傷後ストレス障害を含むストレス、不安障害及び鬱病を含む不安、統合失調症、アルツハイマー病、精神障害、記憶喪失及び代謝疾患（ＷＯ２０１２／０１６２２９）の処置に使用することができる。

本発明の目的は、式Ｉで示される新規な化合物、並びにオキシトシン受容体に関連するＣＮＳ疾患（これらの疾患は、自閉症、心的外傷後ストレス障害を含むストレス、不安障害及び鬱病を含む不安、統合失調症、精神障害及び記憶喪失、アルコール離脱、薬物嗜癖である）の処置のための、及びプラダーウィリ症候群の処置のための、式（Ｉ）で示される化合物及びその薬学的に許容し得る塩の使用である。

更なる目的は、式（Ｉ）で示される新規な化合物の製造法及びこれらを含有する医薬である。

本発明は、自閉症、心的外傷後ストレス障害を含むストレス、不安障害及び鬱病を含む不安、統合失調症、精神障害及び記憶喪失、アルコール離脱、薬物嗜癖を含むある種のＣＮＳ疾患の処置における、並びにプラダーウィリ症候群の処置のための、代替法及び／又は改善法を提供する、選択的で有効な化合物を提供することができる。

本ペプチドは、表に示されるとおりバソプレシン受容体Ｖ１ａ及びＶ２に対する非常に良好な選択性を有することが示されている。これは、副作用を回避するための医薬としての使用には大きな利点となり得る。これらの生理学的効果は、中枢神経系の疾患を処置することを目的とする薬物療法の場合には望ましくない副作用であると考えられ得る。したがって、バソプレシン受容体と対比してオキシトシン受容体に対する選択性を有する薬物療法を得ることが望まれる。

本明細書に使用されるとき、「低級アルキル」という用語は、１〜７個の炭素原子を含有する飽和の直鎖−又は分岐鎖基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、２−ブチル、ｔ−ブチル等を意味する。

「ヒドロキシにより置換されている低級アルキル」という用語は、少なくとも１個の水素原子が、ヒドロキシ基により置換されている、上記と同義の低級アルキル基を意味する。

「シクロアルキル」という用語は、３〜６個の炭素原子を含有する環状アルキル鎖を意味する。

本明細書に使用されるとき、「５員芳香族複素環基」という用語は、イミダゾリル、チオフェニル、フラニル、ピロリル、ピラゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル又はイソオキサゾリル基を意味する。

「薬学的に許容し得る酸付加塩」という用語は、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、クエン酸、ギ酸、フマル酸、マレイン酸、酢酸、コハク酸、酒石酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等のような、無機酸及び有機酸との塩を包含する。

好ましい５員複素環は、イミダゾール環である。

好ましいのは、ｏが０である、式Ｉで示される化合物である。

更なる実施態様は、Ｒ^１が、メチル又はシクロプロピルである、式Ｉで示される化合物である。

更なる実施態様は、Ｒ^１及びＲ^２が、これらが結合しているＮ及びＣ原子と一緒になって、ピロリジン環を形成してもよい、式Ｉで示される化合物である。

以下の特定化合物が調製されており、オキシトシン受容体に及ぼすそのアゴニスト活性について試験されている：

本明細書中の化合物は、Ｆｍｏｃ及びＢｏｃ法の両方を利用する、固相ペプチド化学における標準法により合成された。手動実行される反応は、室温で実施され、一方マイクロ波支援ペプチド合成は、高温で実施された。

一般合成法の説明：
環状ペプチドは、オンビーズ環化（Ａｌｌｙｌ／Ａｌｏｃ方策、方法Ａ）を介するか、又は液相環化を介する完全脱保護線状ペプチドとして（方法Ｂ）のいずれかで作り出すことができる。
線状ペプチドは、手動合成されるか、又は例えば、Kates and Albericio, Eds., “Solid Phase Synthesis: A practical guide”, Marcel Decker, New York, Basel, 2000 に参照されるとおり、最先端の固相合成プロトコール（Ｆｍｏｃ化学）を介するマイクロ波技術を用いて合成されるかのいずれかとした。固相担体としてTentaGel-S-RAM樹脂（０．２４meq/g）を使用した。ＨＯＢＴ／ＨＢＴＵ（１：１）（ＤＭＦ中０．５mol/L）及びＤＩＰＥＡ（ＮＭＰ中２mol/L）４eqでの活性化後に、全てのＦｍｏｃ−アミノ酸を４倍過剰で加えた。Ｆｍｏｃ切断は、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンにより達成された。

Ａｌｌｙｌ／Ａｌｏｃ切断及びラクタム環化：
方法Ａ：樹脂結合ペプチドを、ＤＣＭ中の２０eq フェニルシラン及び０．０５eq テトラキストリフェニルホスフィンパラジウムの溶液でＲＴにて３０分間、手動処理した。この手順を繰り返した。樹脂をＤＭＦ中の０．５％ジチオカルバミン酸ナトリウムの溶液で洗浄した。オンビーズのラクタム形成のために、再び活性化試薬を樹脂に加え、ＲＴで更に８時間振盪した。環化の終了は、ニンヒドリン試験により検証した。
方法Ｂ：脱保護及び樹脂からの切断及び標準処理後に、溶液中でペプチドを環化した。ＤＭＦ中の標準ペプチド活性化試薬で粗ペプチドを処理した。ＨＰＬＣにより環化をモニターした。

切断及び処理：
トリフルオロ酢酸、トリイソプロピルシラン及び水（９５／２．５／２．５）の切断カクテルを樹脂に加えて、ＲＴで１時間振盪した。切断ペプチドを冷エーテル（−１８℃）に沈殿させた。このペプチドを遠心分離して、残渣を冷エーテルで２回洗浄した。残渣を再び水／アセトニトリルに溶解して凍結乾燥した。

精製：
固定相としてReprospher 100 C18-Tカラム（１００×４．６mm、粒径５μ）を、溶離液として水／アセトニトリル（３０分で勾配１〜５０％ＭｅＣＮ）を用いる、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いてペプチドを精製した。画分を回収して、ＬＣ／ＭＳにより分析した。純粋な生成物試料を合わせて、凍結乾燥した。全てのペプチドを純度＞８５％の白色の粉末として得た。生成物の同定は、質量分析により得られた。全ての標準アミノ酸は、CEMから購入した。Ｆｍｏｃ−ＳＡＲ−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｎ−シクロプロピル−グリシンは、それぞれBachem及びEnamineから購入した。モノ−ｔＢｕ−スクシナートは、Sigma-Aldrichから購入した。

モノ−アリルスクシナートの合成：
ＴＨＦ７０ml中の４−tert−ブトキシ−４−オキソブタン酸（Sigma-Aldrich）４６mmol及びＤＩＰＥＡ９２mmolの溶液を０℃に冷却した。そしてＴＨＦ６ml中の３−ヨードプロパ−１−エン（Fluka）５５mmolの溶液を滴下により加えて、ＲＴまで温め、一晩撹拌した。この反応混合物を重炭酸塩水溶液で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥して、溶媒を留去した。褐色の油状物３．７ｇを得た。粗物質をシリカゲル（Kieselgel）クロマトグラフィーにより精製して、ジ−エステル３．４ｇを生成した。この中間体をＤＣＭ１０mlに溶解して、ＴＦＡ５mlをＲＴで加えて一晩撹拌した。溶媒及びＴＦＡを留去することにより、最終生成物１．６ｇを生成した。

実施例１の合成のための詳細な説明は、合成条件を更に例証するために提供される：

ペプチド合成：
高温（７８℃）でアミノ酸当たり５分のカップリング時間及び０．２５mmolスケールでＣＥＭマイクロ波技術を用いてペプチドを合成した。合成は、固相担体としてTentaGel-S RAM樹脂（０．２４meq/g）を用いて行われる。使用された全てのアミノ酸をＤＭＦに０．２mol濃度に溶解した。アミノ酸を活性化するために、ＨＯＢＴ／ＨＢＴＵ（１：１）（０．５mol/L）４eq及びＤＩＰＥＡ４eqの混合物を使用した。３分間ＤＭＦ中のピペリジン（２０％）によりＦｍｏｃ切断を達成した。Ｆｍｏｃ切断を繰り返した。

Ａｌｏｃ−及びＡｌｌｙｌ−切断：
ＤＣＭ（５ml）中の２０eq フェニルシラン及び０．０５eq テトラキストリフェニルホスフィンパラジウムの溶液でＲＴにて３０分間、樹脂を手動処理した。この手順を繰り返した。樹脂をＤＭＦ中の０．５％ジチオカルバミン酸ナトリウムの溶液で２回洗浄した。ＤＣＭで洗浄工程を繰り返した。

オンビーズ環化（方法Ａ）：
再びＤＭＦ中のカップリング試薬（ＨＯＢＴ／ＨＢＴＵ（１：１）０．５mol/L溶液４ml及びＤＩＰＥＡ（４eq）１ml）を樹脂に加えた。このスラリーをＲＴで約８時間振盪した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで２回洗浄した。ニンヒドリン試験により環化の終了を検証した。

樹脂からの切断：
切断カクテル（ＴＦＡ；ＴＩＳ；水（９５／２．５／２．５））１０mlを樹脂に加えて、ＲＴで１時間振盪した。切断ペプチドを冷エーテル（−１８℃）に沈殿させた。ペプチドを遠心分離して、沈殿物を冷エーテルで２回洗浄した。沈殿物をＨ_２Ｏ／アセトニトリルに溶解して、凍結乾燥することにより、白色の粉末２１０mgを生成した。
他の全ての類似体は、オフビーズ環化方策を使用して方法Ｂで生成した。

オフビーズ環化（方法Ｂ）：
粗ペプチドをＤＭＦ（１５ml）に溶解した。ＤＭＦ中のカップリング試薬ＰｙａＯＰ（０．５mol/L）１eq及びＮＭＰ中のＤＩＰＥＡ（２mol/l）を加えた。この反応混合物をＲＴで１時間撹拌した。反応終了（ＬＣＭＳ制御）後、ＤＭＦ含量を濃縮しておよそ２mlとした。残渣を冷（−１８℃）ジエチルエーテル（４０ml）に沈殿させた。このペプチドを遠心分離して、沈殿物を冷エーテルで洗浄した。

精製：
Reprospher 100 C18-Tカラム（１００×４．６mm、粒径５μm）での分取ＨＰＬＣにより粗ペプチドを精製した。溶離系として０．１％ＴＦＡ／水／アセトニトリルの混合物を０〜３０分のうちに０〜５０％アセトニトリルの勾配で使用した。画分を回収して、分析用ＨＰＬＣにより確認した。純粋な生成物を含有する画分を合わせて、凍結乾燥した。白色の粉末７．２mgを得た。

以下に列挙される他の全てのペプチドを適切に合成した。

略語：
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニル
ｔＢｕ：tert−ブチル
Ｇｌｙ：グリシン
Ｐｈｅ：フェニルアラニン
Ｃｈａ：シクロヘキシルアラニン
Ｃｈｇ：シクロヘキシルグリシン
ＣｙｃｌｏｐｒｏｐＧｌｙ：Ｎ−シクロプロピルグリシン
Ｓａｒ：サルコシン
Ｉｌｅ：イソロイシン
Ｌｅｕ：ロイシン
Ｎｌｅ：ノルロイシン
Ｎｖａ：ノルバリン
Ａｉｂ：アミノイソ酪酸
Ｐｒｏ：プロリン
Ａｌａ：アラニン
Ｖａｌ：バリン
ｈｏｍｏＶａｌ：ホモバリン
ＭｅＶａｌ：Ｌ−α−メチル−バリン
Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）：側鎖保護（トリチル）ヒスチジン
Ａｓｎ（Ｔｒｔ）：側鎖保護（トリチル）アスパラギン
Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）：側鎖保護（トリチル）グルタミン
Ｓｅｒ（ｔＢｕ）：側鎖保護（tert−ブチル）セリン
Ｔｙｒ（ｔＢｕ）：側鎖保護（ｔＢｕ）チロシン
Ｔｈｒ（ｔＢｕ）：側鎖保護（ｔＢｕ）トレオニン
ＨＯＢＴ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＣＯＭＵ：１−［（１−（シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノモルホリノ）］ウロニウムヘキサフルオロホスファート
ＰｙｏＡＰ：（７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスファート
ＨＢＴＵ：Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロホスファート
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリドン
ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＭｅＣＮ：アセトニトリル

実施例１

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９７１．１；観測値９７１．２。

実施例２

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ａｓｐ（Ａｌｌｙｌ）−ＯＨ。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９６０．０；観測値９６０．８。

実施例３

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９４５．０；観測値９４５．５。

実施例４

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−ＡｓｐＯＡｌｌｙｌ。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９６０．０；観測値９６０．８。

実施例５

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９３１．０；観測値９３１．１。

実施例６

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｎｖａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９４５．０；観測値９４５．２。

実施例７

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＭｅＶａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９８５．０；観測値９８５．２。

実施例８

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９８９．１；観測値９８９．５。

実施例９

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９７１．０；観測値９７１．５。

実施例１０

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９５９．０；観測値９５９．５。

実施例１１

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９４５．０；観測値９４５．５。

実施例１２

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９５７．０；観測値９５７．６。

実施例１３

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９８６．０；観測値９８６．５。

実施例１４

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値１００５．０；観測値１００６．８。

実施例１５

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９９５．０；観測値９９６．７。

実施例１６

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値１０４４．１０；観測値１０４５．４。

実施例１７

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｎｖａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９５７．０；観測値９５７．５。

実施例１８

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｈａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値１０１１．１；観測値１０１１．５。

実施例１９

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｇ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９９１．０；観測値９９１．５。

実施例２０

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｈｇ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９９７．０；観測値９９７．５。

実施例２１

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｉ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値１０１１．１；観測値１０１１．４。

実施例２２

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ｈｏｍｏＬｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９８５．１；観測値９８５．５。

実施例２３

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＭｅＬｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９５９．０；観測値９５９．５。

実施例２４

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｈｇ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９７１．０；観測値９７１．２。

実施例２５

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ｈｏｍｏＬｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９５９．０；観測値９５９．１。

実施例２６

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９６３．１；観測値９６３．６。

実施例２７

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｎｖａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９３１．０；観測値９３１．５。

実施例２８

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９４５．０；観測値９４５．５。

実施例２９

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９３３．０；観測値９３３．６。

実施例３０

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９１９．０；観測値９１９．４。

実施例３１

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｈａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９８５．１；観測値９８５．６。

実施例３２

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９６０．０；観測値９６０．８。

実施例３３

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９７９．０；観測値９７９．３。

実施例３４

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｉ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９８５．１；観測値９８５．６。

実施例３５

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９６９．０；観測値９６９．９。

実施例３６

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値１０１８．０；観測値１０１８．６。

実施例３７

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｇ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９６５．０；観測値９６５．２。

実施例３８

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＣｙｃｌｏｐｒｏｐＧｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。
ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９７１．１；観測値９７１．８。

実施例３９

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＭｅＶａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＣｙｃｌｏｐｒｏｐＧｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。
ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９８５．１；観測値９８５．６。

実施例４０

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＣｙｃｌｏｐｒｏｐＧｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。
ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９５７．０；観測値９５７．５。

実施例４１

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＣｙｃｌｏｐｒｏｐＧｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。
ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９４３．０；観測値９４３．５。

実施例４２

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＣｙｃｌｏｐｒｏｐＧｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。
ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９７１．１；観測値９７１．６。

実施例４３

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｈｇ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＣｙｃｌｏｐｒｏｐＧｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。
ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９９７．１；観測値９９７．６。

実施例４４

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＣｙｃｌｏｐｒｏｐＧｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。
ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９５９．０；観測値９５９．５。

実施例４５

以下のアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＣｙｃｌｏｐｒｏｐＧｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びモノ−ｔＢｕスクシナート。
ＭＳ（Ｍ＋Ｈ^＋）：期待値９４５．０；観測値９４５．５。

材料と方法
細胞培養及び安定クローンの産生
ヒトＶ１ａ、ヒトオキシトシン（ＯＴＲ）又はヒトＶ２受容体（後者は、キメラＧｑｓ５Ｇタンパク質と組合せられてカルシウムフラックスへシグナルの向きを変える）のいずれかをコードする発現プラスミドでチャイニーズ（Chines）ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をトランスフェクトした。限界希釈法により安定な細胞をクローン化することにより、ヒトＶ１ａ、ヒトＶ２＋Ｇｑｓ５又はヒトＯＴＲ受容体のいずれかを発現するモノクローナル細胞株を生成させ、そして受容体活性化後に細胞内のカルシウムフラックスを検出する蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）で検出される機能的反応に基づいて選択した。安定な細胞株を、１０％ウシ胎仔（foetal）血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１％Ｌ−グルタミン酸、２００μg/ml ジェネティシン（Geneticin）を含有するＦ−１２Ｋ栄養混合液（Kaighnの改変培地）中で湿度９５％の１０％ＣＯ_２インキュベーター中で３７℃にて増殖させた。

蛍光イメージング（蛍光イメージングプレートリーダー、ＦＬＩＰＲ）を用いるカルシウムフラックスアッセイ
アッセイ前の午後に、各ウェルの底から細胞の検査及び蛍光測定が可能な、透明底を持つ黒色９６ウェルプレートに、５０，０００細胞／ウェルの密度で細胞を蒔いた。細胞の密度は、翌日コンフルエントな単層を生成させるのに十分であった。２０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）及び２．５mM プロベネシドを含有する、フェノールレッド不含のハンクス平衡塩溶液（アッセイ緩衝液）を各実験について新たに調製した。Beckman Biomek 2000実験室自動ワークステーションを用いて、１％ＤＭＳＯを含有するアッセイ緩衝液中に化合物の希釈を行った。色素ローディング緩衝液は、アッセイ緩衝液に最終濃度２μM Fluo-4-AM（ＤＭＳＯ及びプルロン酸（pluronic acid）に溶解）で構成された。存在する培地をウェルから除去して、色素ローディング緩衝液１００μlを各ウェルに加え、湿度９５％の５％ＣＯ_２インキュベーター中で３７℃にておよそ６０分間インキュベートした。色素を添加したら、細胞をアッセイ緩衝液を用いてEmbla細胞洗浄機で完全に洗浄することにより、取り込まれなかった色素を残らず除去した。アッセイ緩衝液ちょうど１００μlを各ウェルに残した。

色素添加細胞を含有する各９６ウェルプレートを、ＦＬＩＰＲ機に入れて、レーザー強度を、低い基礎蛍光を検出するのに適したレベルに設定した。アゴニストとして化合物を試験するために、希釈化合物２５μlをプレートに１０秒で加えて蛍光測定に付し、蛍光反応を５分間記録した。最大反応を１００％、そして最小反応を０％に設定した内因性完全アゴニストの用量反応に対して、蛍光データを正規化した。以下のとおりMicrosoft Excel XLFitによる４パラメーターのロジスティック方程式を用いて、各アゴニストの濃度反応曲線を作成した：Ｙ＝最小＋（（最大−最小）／（１＋１０^{（ＬｏｇＥＣ５０−Ｘ）ｎＨ}））［ここで、ｙは、正規化蛍光％であり、最小は、最小ｙであり、最大は、最大ｙであり、ｌｏｇＥＣ_５０は、最大誘導蛍光の５０％を生成させるｌｏｇ_１０濃度であり、ｘは、アゴニスト化合物の濃度のｌｏｇ_１０であり、そしてＨは、曲線の傾き（Hill係数）である］。最大値は、アゴニスト試験化合物の有効性をパーセントで与える。最大半量反応を生成させるアゴニストの濃度は、ＥＣ_５０値により表され、その対数はｐＥＣ_５０値を生成した。

以下に特定のペプチドに関するＥＣ_５０（nM）、及び有効性（％）が、ｈＶ１ａ及びｈＶ２に関する比較データと共に提供される：

式Ｉで示される化合物及び式Ｉで示される化合物の薬学的に許容し得る塩を、医薬として、例えば、製剤の形態で使用することができる。この製剤を、好ましくは経皮、鼻内、皮下又は静脈内（iv）投与することができる。

経皮は、活性成分が、系統的な分布のために皮膚を超えて送達される、投与の経路である。例には、薬物送達に使用される経皮パッチ、及び医療又は美容目的に使用される経皮インプラントが含まれる。

鼻内投与を、局所的又は全身的効果のいずれかのために薬物を送達するのに使用することができ、局所的効果用の鼻内スプレーはかなり一般的である。ペプチド薬物を、経口投与後の薬物分解を回避するために鼻内スプレーとして投与してもよい。

皮下注射もまた、ペプチド薬物の投与に一般的である。筋肉内注射は、物質の直接筋肉への注射である。これは、医薬品の投与の幾つかの代替方法の１つである。これはしばしば、少量で投与される特別な形態の医薬品のために使用される。この注射は皮膚の下に投与すべきである。

静脈内経路は、直接静脈内への液体物質の注入である。他の投与経路と比較して、静脈内経路は、流体及び医薬品を身体全体に送達するための最も速い方法である。

本製剤は、更に、保存料、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色料、香味料、浸透圧を変化させる塩、緩衝剤、マスキング剤又は酸化防止剤を含有することができる。これらはまた、更に他の治療有用物質を含有することができる。

式Ｉで示される化合物又はその薬学的に許容し得る塩及び治療不活性担体を含有する医薬もまた、本発明の目的であり、同様にその製造方法であって、１つ以上の式Ｉで示される化合物及び／又は薬学的に許容し得る酸付加塩、並びに必要に応じて１つ以上の他の治療有用物質を、１つ以上の治療不活性担体と一緒にしてガレヌス製剤の投与剤形にすることを含む方法もまた、本発明の目的である。

本発明の最も好ましい適応は、中枢神経系の障害を含む適応、例えば、自閉症、心的外傷後ストレス障害を含むストレス、不安障害及び鬱病を含む不安、統合失調症、精神障害及び記憶喪失、アルコール離脱、薬物嗜癖の治療又は予防、並びにプラダーウィリ症候群の処置である。

用量は、広い限界内で変化させることができ、当然ながら各特定症例における個々の要求に合わせて調整する必要があろう。成人の用量は、一般式Ｉで示される化合物を１日に約０．０１mg〜約１０００mg又はその薬学的に許容し得る塩を対応する量で変化させることができる。１日用量は、単回用量として、又は分割用量にして投与してもよく、更に必要とされることが見い出されれば、上限もまた超えることができる。

Claims

式Ｉ：

［式中、
Ｒ^１は、水素、低級アルキル又はシクロアルキルであり；
Ｒ^２は、水素であるか、あるいは
Ｒ^１及びＲ^２は、これらが結合しているＮ及びＣ原子と一緒になって、場合により１個若しくは２個のＦ原子若しくはヒドロキシにより置換されている、ピロリジン環を形成してもよいか、又はアゼチジン若しくはピペラジン環を形成してもよく；
Ｒ^３は、水素、低級アルキル、ヒドロキシにより置換されている低級アルキル、−（ＣＨ_２）_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、ベンジル、フェニル、−ＣＨ_２−５員芳香族複素環基、−ＣＨ_２−インドリル、−ＣＨ_２−シクロアルキル、シクロアルキル又は−（ＣＨ_２）_２−Ｓ−低級アルキルであり；
Ｒ^３’は、水素又は低級アルキルであるか；あるいは
Ｘは、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨＲ^４−ＣＨＲ^４’−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ_２−であり；
Ｒ^４／Ｒ^４’は、水素であるか、又はＲ^４若しくはＲ^４’の一方は、アミノであり；
ｏは、０又は１である］で示される化合物若しくはその薬学的に許容し得る酸付加塩、ラセミ混合物若しくはその対応するエナンチオマー及び／又はその光学異性体。
Ｒ^１が、メチル又はシクロプロピルである、請求項１記載の式Ｉで示される化合物。
Ｒ^１及びＲ^２が、これらが結合しているＮ及びＣ原子と一緒になって、ピロリジン環を形成してもよい、請求項１記載の式Ｉで示される化合物。
ｏが、０である、請求項１記載の式Ｉで示される化合物。
化合物が、下記式：

である、請求項１記載の式Ｉで示される化合物。
請求項１〜５のいずれか一項記載の化合物並びに薬学的に許容し得る担体及び／又は補助剤を含む医薬組成物。
自閉症、心的外傷後ストレス障害を含むストレス、不安障害及び鬱病を含む不安、統合失調症、精神障害及び記憶喪失、アルコール離脱、薬物嗜癖の処置における使用のための、並びにプラダーウィリ（Prader-Willi）症候群の処置のための、請求項１〜５のいずれか一項記載の化合物並びに薬学的に許容し得る担体及び／又は補助剤を含む医薬組成物。
治療活性物質として使用するための、請求項１〜５のいずれか一項記載の化合物。
自閉症、心的外傷後ストレス障害を含むストレス、不安障害及び鬱病を含む不安、統合失調症、精神障害及び記憶喪失、アルコール離脱、薬物嗜癖の処置における、並びにプラダーウィリ症候群の処置のための、治療活性物質として使用するための、請求項１〜５のいずれか一項記載の化合物。
自閉症、心的外傷後ストレス障害を含むストレス、不安障害及び鬱病を含む不安、統合失調症、精神障害及び記憶喪失、アルコール離脱、薬物嗜癖の治療的及び／又は予防的処置用の、並びにプラダーウィリ症候群の処置用の医薬の製造のための、請求項１〜５のいずれか一項記載の化合物の使用。
本明細書に前記の発明。