JP2001511000A

JP2001511000A - アンチセンスオリゴヌクレオチドの製造方法

Info

Publication number: JP2001511000A
Application number: JP53253398A
Authority: JP
Inventors: カール−ヘルマンシュリンゲンジーペン; ヴォルフガングブリッシュ
Original assignee: バイオグノスティックゲゼルシャフトフュアバイオモレキュラーダイアグノスティックミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1997-01-31
Filing date: 1998-01-30
Publication date: 2001-08-07
Also published as: EP2028274A2; WO1998033904A3; US7563778B2; EP1889911A2; EP1889911A3; AU6617898A; EP1012267A2; ES2323252T3; EP2028274A3; DE69840748D1; US20050130927A1; WO1998033904A2; ATE428780T1; EP1012267B1; US6972171B1; EP0856579A1

Abstract

(57)【要約】アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその誘導体の製造方法であって、標的核酸を選択し、必要に応じてその配列を解明し、アンチセンスオリゴヌクレオチドを生成し、但し該オリゴヌクレオチドは少なくとも８個の残基を含み、該オリゴヌクレオチドはシトシン塩基に対しそれぞれ３個の水素結合を形成することができる最大で12のエレメントを含むものとし、該オリゴヌクレオチドは、標的分子内で４個の連続シトシン塩基（CCCC）とそれぞれ３個の水素結合を形成できる４個以上の連続エレメントを含まず、あるいはGGGGの４個以上の連続エレメントを含まないものとし、また該オリゴヌクレオチドは、標的分子内で３個の連続シトシン塩基（CCC）とそれぞれ３個の水素結合を形成できる３個以上の連続エレメントを２シリーズ以上含まず、あるいはGGGの３個の連続エレメントを２シリーズ以上含まないものとし、残基あたり２個の水素結合を標的分子と形成する残基(2H-結合-R)と残基あたり３個の水素結合を標的分子と形成する残基(3H-結合-R)との間の比が以下の関係、3H-結合-R/(3H-結合-R+2H-結合-R)≧0.29に支配され、そして上記のように生成されるオリゴヌクレオチドはそれ自体公知の方法で合成する、ステップを含む前記方法。

Description

【発明の詳細な説明】アンチセンスオリゴヌクレオチドの製造方法本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの製造方法、オリゴヌクレオチドまたはその機能上もしくは構造上の類似体、もしくはその有効な誘導体に関する。これらはデオキシリボ核酸（DNA）及び／またはリボ核酸（RNA）あるいはその誘導体と水素結合を形成し、それらには、限定するものではないが、それらの分子に含まれる塩基アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、ウラシル（U）またはチミジン（T）との水素結合の形成が含まれ、あるいは特定のタンパクの残基と水素結合を形成し、そのような分子は、遺伝子、RNA分子もしくはタンパク質の発現構造もしくは機能を変化させ、あるいは遺伝子、RNA分子もしくはタンパク質の活性のレベルを変化させ得る。さらに本発明は、葉酸、ホルモン、ステロイドホルモン、例えばエストロゲン、プロゲステロン、コルチコステロイド、ミネラルコルチコイド、アンドロゲン、ペプチド、プロテオグリカン、ホスホリピド、グリコリピド及びそれらの誘導体と結合されるか混合されたそのような核酸またはその機能上もしくは構造上の類似体、もしくはその有効な誘導体に関する。さらに本発明は、特定の遺伝子、RNAまたはタンパク質の活性、構造、機能を変化させ、あるいは発現レベルを変化させることによりそれらの機能的特性を分析するための前記核酸またはその機能上もしくは構造上の類似体、もしくはその有効な誘導体の使用に関する。さらに本発明は、例えば培養物中あるいは生体生物中で、細胞増殖を制御し、それにより細胞増殖あるいは細胞増加の増強、阻害、あるいは調整、及び／または一次細胞もしくは幹細胞の増加をもたらすタンパク質の発現または機能的活性を調整することができるアンチセンス核酸に関する。さらに本発明は、標的遺伝子のメッセンジャーRNA（mRNA）またはDNAの領域とハイブリダイズし、または特定のタンパクに結合する、前記核酸またはその機能上もしくは構造上の類似体、もしくはその有効な誘導体を含む医薬組成物に関し、また本発明は、特定の標的遺伝子、特定の標的RNAまたは特定の標的タンパク質の構造、機能、活性または発現の変化が前記核酸またはその誘導体の効果に関連する治療上の利益を誘導する疾患の治療用の医薬組成物の製造のための前記核酸またはその機能上もしくは構造上の類似体、もしくはその有効な誘導体の使用に関する。遺伝子、RNA分子もしくはタンパク質の発現またはそれらの活性レベルを、核酸またはその機能上もしくは構造上の類似体、もしくはその有効な誘導体により調整することはそれぞれの分子の機能の研究の強力な手段である。例えば、特定のタンパク質の発現をノックダウンあるいは増加させることにより、培養細胞並びに生体生物におけるin vivoでのその生理学的並びに病理生理学的役割を特定することができる。さらに、遺伝子、RNA分子またはタンパク質の異常発現または過剰発現、例えば感染性生物に由来する外来DNA、RNAまたはタンパク質の発現、あるいは変異DN A、RNA及びタンパク質の発現が種々の疾患に見られる。そのようなDNA、RNA及び／またはタンパク質の発現または活性のダウンレギュレーションは、特定のDNA 、RNA及び／またはタンパク質の発現が関与する病理的プロセスの阻害あるいは反転を誘導し得る。しかし、DNA、RNA及び／またはタンパク質発現のダウンレギュレーションに使用される核酸またはその誘導体は、そのような分子で治療される細胞または生物に対して効果がなく、及び／または毒性であることが多い。本発明の目的は、先行技術の欠点を回避するオリゴヌクレオチドまたはその誘導体の設計及び製造方法を提供し、増強された有効性及び／または低減された毒性及び／または低減された非選択的効果を有するオリゴヌクレオチドの信頼性の高い製造方法を提供することである。上記目的は、請求項１に記載の特徴を有する方法によって達成される。本発明の方法の好ましい態様は、請求項2〜7に記載のものである。本発明の方法は、 -標的核酸を選択し、必要に応じてその配列を解明し、 -アンチセンスオリゴヌクレオチドを生成し、但し -該オリゴヌタレオチドは少なくとも８個の残基を含み、 -該オリゴヌクレオチドはシトシン塩基に対しそれぞれ３個の水素結合を形成することができる最大で12のエレメントを含むものとし、 -該オリゴヌクレオチドは、標的分子内で４個の連続シトシン塩基（CCCC）とそれぞれ３個の水素結合を形成できる４個以上の連続エレメントを含まず、あるいはGGGGの４個以上の連続エレメントを含まないものとし、 -また該オリゴヌクレオチドは、標的分子内で３個の連続シトシン塩基(CCC) とそれぞれ３個の水素結合を形成できる３個以上の連続エレメントを２シリーズ以上含まず、あるいはGGGの３個の連続エレメントを２シリーズ以上含まないものとし、 -残基あたり２個の水素結合を標的分子と形成する残基（2H-結合-R）と残基あたり３個の水素結合を標的分子と形成する残基（3H-結合-R）との間の比が以下の関係に支配され、 -そして上記のように生成されるオリゴヌクレオチドはそれ自体公知の方法で合成する、ステップを含む。生成されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的分子と十分な相互作用を示すために少なくとも８個の残基を含み、好ましくは30個まで、より好ましくは 24個まで、最も好ましくは18個までの残基を有する。特異性を高め、及び／または非特異的作用を低減するためにはより長いものもより短い鎖長が好ましい。前記オリゴヌクレオチドは、それぞれがシトシン塩基に対して３個の水素結合を形成することができる最大12のエレメントを含む。オリゴヌクレオチドを生成する場合、エレメントは残基、すなわちオリゴヌクレオチドのヌクレオチドによって表される。誘導体を生成する場合は、エレメントは水素結合を形成することができる分子の部分とする。前記オリゴヌクレオチドは、シトシン塩基に対してそれぞれが３個の水素結合を形成することができるエレメントを最大で10個、より好ましくは最大で８個含むことが好ましい。生成されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは４個以上の連続したグアニン塩基を含まず、また３個の連続グアニン塩基を２シリーズ以上含まない。好ましくは、残基あたり２個の水素結合を標的分子と形成する残基（2H-結合- R）と残基あたり３個の水素結合を形成する残基（3H-結合-R）との間の比は0.33より大きく0.86より小さい範囲にあり、より好ましくは0.79未満、さらに好ましくは0.72未満である。１つの態様においては、本発明の方法によって生成されるオリゴヌクレオチドは、天然のヌクレオチドより高いヌクレアーゼ耐性を有するように修飾される。オリゴヌクレオチド及びその誘導体を合成するための方法は当分野において知られており、例えば"Oligonucleotides and Analogues",F.Eckstein(Ed.),1991,IR L Press Oxfordまたは"Protocols for Oligonucleotides and Analogs,Synthesi s and Properties",Sudhir Agrawal(Ed.),1993,Humana Press,Totowa,New Jerse yを参照されたい。また、本発明のオリゴヌクレオチドはその鎖中にRNA及びDNA残基を含むことができる。修飾は、オリゴヌクレオチドの塩基、糖または結合に行うことができる。好ましくは、修飾は、ホスホロチオエート（S-ODN）ヌクレオチド間結合、及び／またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合、N'3→P5'ホスホルアミデート結合、ペプチド結合あるいは糖部分の2'-メトキシエトキシ修飾あるいは塩基の修飾である。好ましい態様においては、前記オリゴヌクレオチドは少なくとも２種の異なる種類の修飾、より好ましくは少なくとも２種の異なる種類のヌクレオチド間結合を有する。別の好ましい態様においては、前記オリゴヌクレオチドは、葉酸、ホルモン、例えばステロイドホルモンまたはコルチコステロイド、ペプチド、プロテオグリカン、グリコリピド、ホスホリピドまたはそれらの誘導体に結合されているかそれらと混合されている。驚くべきことに、本発明の方法により得られる分子は、そのような分子の毒性及び／または非特異的効果を強力に低減しあるいは回避することができ、及び／または異なる方法により選択された配列よりも有意に高い活性を有していた。好ましくは本発明の分子は以下の特徴を有する。すなわち、４個以上の連続したグアノシン（N_aGGGGN_b）またはイノシン（N_aIIIIN_b）残基を含まず、また前記オリゴヌクレオチドは３個以上の連続したグアノシン残基を２シリーズ(N_aGGGN_cGGGN_b )以上含まず、３個以上の連続したイノシン残基を２シリーズ（N_aIIIN_cIIIN_b）以上含まない。上記中、N_a、N_b、N_cは独立して0〜20の残基を有する任意の配列を表す。好ましい態様においては、前記分子は残基あたり２個または３個の水素結合を形成することができる残基を少なくとも10個含む。さらに、前記分子は残基あたり２個または３個の水素結合を形成することができる、ホスホロチオエート結合によって結合された連続した残基を最大で24個含む。18個以上の残基を含む本発明の分子においては、追加される結合は、メチルホスホネート結合またはホスホジエステル結合からなることが好ましい。アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドの化学構造を図１に示す。アンチセンスオリゴリボヌクレオチドの化学構造は図２に示す。このオリゴヌクレオチドは、より長いヌクレオチド鎖の詳細部分として理解されるべきものである。もちろん、前記オリゴヌクレオチドはどちらの図のエレメントからも構成され得る。図１及び２において、文字Bは、デオキシリボースに結合された、例えばアデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、イノシン(I)、ウラシル(U)、チミン（T）等の有機塩基を意味する。ヌクレオチド間の結合は、天然のDNAにおけるようなホスホジエステル結合でもよく、あるいはその活性を調整するために標的核酸とのハイブリダイゼーションあるいはタンパク質への結合を可能とするようにヌクレオチドに間隔を与える結合、例えばホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、ホスホルアミデート結合、ペプチド結合等としてもよい。 R₂及びR₃は、オリゴヌクレオチドまたは誘導体のそれら以外の残基を表す。 R₄は、OHまたは2'-メトキシエトキシ誘導体のような修飾を表す。図１及び２に示すホスホジエステル結合の修飾は、限定するものではないが、下記から選択することができる。 1. 下記の置換を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチド 1.1 R1=0 1.2 R1=S 1.3 R1=F 1.4 R1=CH₃ 1.4 R1＝OEt 2. １個のオリゴヌクレオチド内のヌクレオチド間ホスフェートにおいてR1が変化するオリゴデオキシリボヌクレオチド上記中、文字pはR1a、R1b、もしくR1cへの結合で修飾されたホスホジエステルまたはホスホルアミデート結合、またはペプチド結合、またはその活性、構造、機能あるいは発現レベルを調整するために標的核酸とのハイブリダイゼーションあるいはタンパク質への結合を可能とするような間隔をヌクレオチドに与える結合を表す。文字Bは、本発明の遺伝子配列に応じて、任意のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを表す。 n、m、x、yは0〜20の整数を表す。塩基の合計数の好ましい最大長は30である。 2.1 R_1a=S R_1b=CH₃ R_1c=S 2.2 R_1a=S R_1b=CH₃ R_1c=O 2.2 R_1a=S R_1b=O R_1c=S 2.2 R_1a=S R_1b=O R_1c=CH₃ 2.3 R_1a=CH₃ R_1b=S R_1c=CH₃ 2.4 R_1a=CH₃ R_1b=S R_1c=O 2.5 R_1a=CH₃ R_1b=O R_1c=CH₃ 2.6 R_1a=CH₃ R_1b=O R_1c=S 2.7 R_1a=O R_1b=S R_1c=O 2.8 R_1a=O R_1b=S R_1a=CH₃ 2.9 R_1a=O R_1b=CH₃ R_1a=O 2.10 R_1a=O R_1b=CH₃ R_1c=S 好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、エレメントあたり２個または３個の水素結合を形成できる最低10個、最大24個のエレメントを含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、塩基、糖またはリン酸エステル部分に修飾を有することができる。好ましい修飾は、ホスホロチオエート（S-ODN）ヌクレオチド間結合、及び／またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合、N'3→P5'ホスホルアミデート結合、ペプチド結合あるいは糖部分の2'-メトキシエトキシ修飾あるいは塩基の修飾である。非常に好ましい態様においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、図３の配列41〜73、74〜106、154〜172、173〜203、298〜380、476〜506、5 19〜556、及び597〜641、及び図５の1273〜1764を含む。本発明の別の形態は、特に例えば肝細胞、腎臓細胞、破骨細胞、骨芽細胞及び／またはケラチン合成細胞及び／または血液系細胞、例えば骨髄幹細胞及び／または赤血球及び白血球の始原細胞及び／または器官幹細胞の初代細胞の細胞増殖に影響を与えるために、遺伝子p53、rb、junD、junB、TGF-β1、TGF-β2の阻害のための本発明のオリゴヌクレオチドの使用である。配列41〜73及び／または74〜106及び／または154〜203及び／または519〜556 及び／または597〜641及び／または1273〜1277及び／または1481〜1490及び／または1532〜1549及び／または1656は、限定するものではないが、神経膠腫及びその他の脳腫瘍、肉腫、癌腫及びリンパ腫等の腫瘍疾患における免疫抑制、及び／または、限定するものではないが、細胞障害剤の副作用等の医薬の副作用としての免疫抑制、及び／またはＡＩＤＳ患者における免疫抑制等の免疫抑制疾患の治療及び／または予防に有用である。本発明の別の態様においては、これらの配列は、限定するものではないが、免疫細胞、骨髄幹細胞、内皮細胞、器官幹細胞、小腸の増殖細胞等の正常細胞の低増殖状態の治療及び／または予防にも有用である。配列41〜73及び／または74〜106及び／または298〜380及び／または476〜506 及び／または519〜556及び／または1273〜1480及び／または1596〜1614及び／または1657〜1658及び／または1690及び／または1696〜1712及び／または1751及び／または1753〜1754及び／または1757は、限定するものではないが、脳腫瘍、肉腫、癌腫及びリンパ腫、再狭窄、過形成、肺線維症、脈管形成及び乾癬等の過増殖疾患の治療及び／または予防に有用である。配列1278〜1480及び／または1491〜1531及び／または1582〜1595及び／または 1615〜1655及び／または1691〜1694及び／または1697〜1750及び／または1759〜 1764は、限定するものではないが、喘息(本発明の分子は吸入及び／または腸管外の経路及び／または経口的に投与される)、多発性硬化症、空腸炎、回腸炎及び／または大腸炎を含む炎症性腸疾患等の免疫系の機能亢進を特徴とする疾患及び／または炎症性疾患及び／または自己免疫疾患、並びに過増殖を特徴とする炎症性疾患及び／または好酸球系の細胞の機能亢進及び／または糸球体腎炎及び／または移植体の拒絶反応等の治療及び／または予防に有用である。配列476〜506及び／または1550〜1581及び／または1582〜1595及び／または16 58〜1689及び／または1691〜1694及び／または1713〜1752は、限定するものではないが、例えばアルツハイマー型痴呆、パーキンソン病等の神経変性等の細胞変性に関連する疾患、心筋虚血症及び／または卒中等の神経系の虚血症等の虚血性疾患の治療及び／または予防に有用である。本発明の別の形態は、添加剤と共に本発明のオリゴヌクレオチドを含む医薬である。本発明のオリゴヌクレオチドは、腫瘍、低増殖状態、過剰増殖状態、変性疾患、神経性変性疾患、虚血症、免疫系の疾患及び／または感染症の予防及び／または治療用の医薬の製造に使用することができ、また遺伝子機能の分析または医薬標的確認ために使用することができる。本発明の分子は、RNA分子及びタンパク質等の、標的分子及びそれらがコードする転写及び／または翻訳産物の機能を研究するために使用することができる。本発明の分子を使用したタンパク質または核酸分子のダウンレギュレーションは、分子の機能を研究するために使用することができる。また、本発明の分子が、産物の調整が治療効果等の所望の効果を有するかどうかを試験するのに使用することができ、そしてこの情報をタンパク質の機能を調整するために別の分子を開発するのに使用できることも本発明の特徴である。このようなものとしては例えば、可能性のある標的分子の構造、機能または発現を調整できる物質、例えば標的分子のアゴニストまたはアンタゴニストの開発が所望の効果を有しているかどうか、また例えば治療用あるいは診断用の用途を有し得るかどうかという疑問に答えるための、本発明の分子による医薬標的確認が挙げられる。従って、限定するものではないが、タンパク質または核酸分子の調整が治療効果等の所望の効果を有するかどうかを試験し、この情報を、その機能を本発明の分子により先に調べた分子の構造、機能あるいは発現を調整することができる治療用化合物のような化合物を開発するのに使用すること等の医薬標的確認のために本発明の分子を使用することができることも本発明の特徴である。実施例１ TGF-β1アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドによる末梢血単核細胞の処理ヒト末梢血単核細胞（PBMC）は、トランスフォーミング増殖因子β1（TGF-β1 ）を生産する。これらの細胞によって生産されるTGF-β1は、自己由来的な形態で免疫細胞増殖を負に制御する。この自己由来的な免疫細胞増殖の負の制御は本発明のアンチセンスTGF-β1分子により反転させ、免疫細胞増殖の刺激を誘導することができた。本発明の分子とは異なり、Hatzfeld et al．（1991）に記載されたもののような慣用の方法により選択されたアンチセンス分子は免疫細胞増殖を刺激しなかった。さらに驚くべきことに、慣用の方法により選択さた配列のいくつかは免疫細胞増殖を低下させさえした。末梢血単核細胞(PBMC)は、健康なドナーの静脈血を10%胎仔ウシ血清及び１mM のL-グルタミンを補充したRPMI 1640培地（Gibco）の等容量と混合し、その後Fi coll-Hypaque（Pharmacia）勾配上に重層し、400gで30分間遠心分離することにより単離した。PBMCを血漿-Ficoll界面から取り出し、上記の培地で洗浄した。血清を補充した完全培地中の細胞（100μlの培地中2 x 10⁴）を96ウェル平底マイクロタイタープレート（Nunc）に塗布した。細胞を３μg/mlのフィトヘマグルチニンで活性化し、オリゴデオキシヌクレオチドなし（未処置の対照細胞）で、あるいはヒトTGF-β1 mRNAの異なる領域に相補的な種々のアンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの８μMと４日間インキュベートした。その後細胞をトリパンブルーで染色し、細胞の生存を判断しNeubauer血球計算板でカウントした。オリゴヌクレオチド配列はTGF-β1-1〜TGF-β1-33と命名した33の本発明の配列のいずれか、あるいはHatzfeld et al．(1991)，J．Exp．Med.，174，pp.925- 929からのTGF-β1アンチセンス配列、またはN1〜N39と命名した39の他の慣用の方法により選択されたヒトTGF-β1 mRNAに相補的なアンチセンス配列から選択した(図３参照)。驚くべきことに、本発明の分子は慣用の方法により選択されたアンチセンスTG F-β1分子より顕著に有効であった。配列TGF-β1-1〜TGF-β1-33(図３参照)は未処置のコントロールの135〜213%、リンパ球増殖を増強した。これに対し、Hatzfeld et al.の文献のアンチセンス配列による処理は増殖を62.8%に減少させた。慣用の方法により選択されたTGF-β1アンチセンス配列N1〜N39で処理した細胞は、驚くべきことにリンパ球増殖を増加させなかったばかりか、これらの配列のいくつかは対照の51.4%〜77%に細胞増殖を顕著に阻害することが判明した(配列N 1〜N14、N20、N26及びN30〜N39)。アンチセンスTGF-β1配列N15〜N19、N21〜N25 、N28及びN29は、94%〜103%の間の値で細胞増殖の有意な増強も有意な阻害も示さなかった。配列N27は弱い毒性を示し、88%まで細胞増殖を低下させた。 TGF-β1配列のいくつかによる細胞増殖の阻害は、それらが単に有効でないだけでなく、有毒でもあり得ることを示唆する。26の配列N1〜N14、N20、N26及びN 30〜N39の分析により、それらのうちの23が３個の連続したGを有する配列モチーフ(以下GGGモチーフという)を２以上含むか、あるいは４、５または６個のGを有する少なくとも１個のモチーフ（モチーフGGGG、GGGGGまたはGGGGGG）を含んでいることが判った。また、同様にPBMC増殖を阻害したHatzfeld et al.の配列の分析により、驚くべきことにこれもGGGGGとGGGモチーフを含むことが示された。２個のGGGモチーフも４個以上の連続したGのモチーフも含まなかった３つの毒性配列、すなわちN8、N26及びN35は配列あたり11〜13のG塩基含量を有することが判った。 Hatzfeld et al.からの配列、N1〜N14、N20、N26及びN30〜N39の配列とは異なり、配列TGF-β1-1〜TGF-β1-33は、最大６のG塩基のG-含量を示し、単一の配列中では２個のGGGモチーフの組合わせはなく、GGGG、GGGGGまたはGGGGGGモチーフは見られなかった。TGF-β1 RNAは85を越えるGGGアンチセンスモチーフに対する標的領域、及び34を越えるGGGGアンチセンスモチーフに対する標的領域を有しているので、本発明によるこれらの配列における知見は統計的には殆どあり得ないものであった。有効でない配列N15〜N19、N21〜N25、N28及びN29は、毒性の配列及び有効な配列の両者とは異なる塩基含量を含むことが判った。それらの塩基AとTを合わせた含量(A/T含量)は14.3%〜28.5%の範囲であった。これらの配列はPBMC増殖を増強も阻害もしなかった。すなわち、それらは有効でも毒性でもないようであった。これらの14.3%〜28.5%のA/T含量の有効でない配列に対して、有効な配列TGF-β1 -1〜TGF-β1-33は33%〜71.4%のA/T含量を有することが判明した。本発明の配列とその他の配列の３分の２のものの別の相違は、非特異的タンパク質結合に関して明らかになった。Hatzfeld et al.の文献からの配列及びN1〜N 14、N20、N26及びN30〜N39は、本発明の配列と比較して著しく増強された非特異的タンパク質結合を示すことが判った。 Hatzfeld et al.からの配列(H)及びN1〜N39を本発明のTGF-β1アンチセンス配列とともに図３に示す。配列TGF-β1-1〜TGF-β1-33がPBMC免疫細胞の増殖を刺激したのに対し、 Hatzfeld et al.からの配列、及び配列N1〜N39はPBMC増殖において有効でないか殆ど変化を与えず、あるいは毒性作用を有しPBMC増殖を阻害するという知見は、下記の実施例2〜7において詳述するようにTGF-β2及びその他の遺伝子の両者の別のアンチセンス配列に拡張された。 TGF-β1と関連するオリゴヌクレオチドの配列は、理解を容易にするために図３に挙げる。限定するものではないが、腫瘍細胞等の分裂細胞における用途を含む一定の用途のためには、本発明の核酸またはその機能上もしくは構造上の類似体あるいは有効な誘導体は、葉酸にそのカルボキシ基のいずれかあるいは窒素原子のいずれかにおいて結合した。さらに、一定の用途のためには、本発明の核酸またはその機能上もしくは構造上の類似体あるいは有効な誘導体は、ホルモン、ステロイドホルモン、例えばエストロゲン、プロゲステロン、コルチコステロイド、ミネラルコルチコイド、アンドロゲン、ホスホリピド、ペプチド、プロテオグリカン、グリコリピド及びそれらの誘導体と混合し、及び／または結合した。好ましくは、結合は図１及び２のR²及び／またはR³で行う。実施例２ p53アンチセンス核酸（図３にそれぞれのオリゴヌクレオチドを示す） p53は、細胞増殖を負に調整する腫瘍抑制遺伝子である。この遺伝子中の一定の突然変異は、それが癌遺伝子になるようにp53の機能を変化させ得る。野生型p 53を含む細胞に対するp53アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの効果を分析し、そして変異p53を有する細胞に対するこれらの配列の効果も分析した。野生型p53を有する細胞においては、有効なアンチセンス核酸は野生型p53タンパク質のダウンレギュレーションをもたらし、従って処理された細胞の増強された増殖をもたらす。本発明の分子は、p53-1〜p53-33と命名した。有効でないp53 アンチセンス配列は、p53-N-1〜p53-N-18と命名した。有効なp53アンチセンス配列が示す増強ではなく増殖を阻害する毒性配列はp53-T-1〜p53-T-29と命名した。正常なヒト繊維芽細胞を5%のウシ胎仔血清（FCS）を補充したRPMI培地で増殖させ、96ウェルマイクロタイタープレートにウェルあたり2500細胞を塗布した。２時間後にアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを２μMの濃度で加えた。細胞増殖を測定するための２種類のアッセイを行った。 -3H-チミジン取り込みを測定するため、細胞を0.15μCi 3H-チミジン/ウェルとともに６時間インキュベートした後に回収した。細胞を凍結により溶解し、ガラスフィルター上にスポットし、液体シンチレーションカウンティングにより取り込まれたトリチウムの量を測定した。 -細胞数を測定するため、細胞をトリパンブルーで染色し、Neubauer血球計算板においてカウントした。驚くべきことに、本発明のアンチセンス配列（p53-1〜p53-33）による細胞の処理のみが3〜9倍のチミジン取り込みの増加を示した。これに対し、有効でない配列（p53-N-1〜p53-N-18）による処理はチミジン取り込みの有意な変化を与えなかった。さらに、毒性アンチセンスp53配列（p53-T-1〜p53-T-29）による処理は、増殖の増加ではなく減少をもたらした。要約すると、33の本発明のアンチセンス配列はp53による負の増殖調節の有効なダウンレギュレーションと増加した細胞増殖をもたらしたが、47のその他のアンチセンス配列は細胞増殖に対して有意な効果を有しなかったか、あるいは細胞増殖を抑制さえした。実施例３ junBアンチセンス核酸（図３にそれぞれのオリゴヌクレオチドを示す） jun遺伝子ファミリーの転写因子をコードする２種の遺伝子、junB及びjunDはp 53と同様に細胞増殖の負の調節因子である。種々のjunB及びjunDアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの効果を分析した。有効なjunB及びJunDアンチセンス核酸は、それぞれJunD及びJunBタンパク質のダウンレギュレーションをもたらし、従って処理された細胞の増強された増殖をもたらす。本発明のアンチセンス分子は、JunB-1〜JunB-19及びJunD-1〜Jun D-31と命名した。有効でないjunBアンチセンス配列は、JunB-N-1〜JunB-N-57と命名した。増殖を増強せず、阻害する毒性配列はJunB-T-1〜JunB-T-20及びJunD- T-1〜JunD-T-17と命名した。正常なヒト繊維芽細胞を5%のウシ胎仔血清（FCS）を補充したRPMI培地で増殖させ、96-ウェルマイクロタイタープレートにウェルあたり2500細胞を塗布した。２時間後にアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを２μMの濃度で加えた。細胞増殖を測定するための２種類のアッセイを行った。 -3H-チミジン取り込みを測定するため、細胞を0.15μCi 3H-チミジン/ウェルとともに６時間インキュベートした後に回収した。細胞を凍結により溶解し、ガラスフィルター上にスポットし、液体シンチレーションカウンティングにより取り込まれたトリチウムの量を測定した。 -細胞数を測定するため、細胞をトリパンブルーで染色し、Neubauer血球計算板においてカウントした。驚くべきことに、やはり本発明のアンチセンス配列（JunB-1〜JunB-19及びJun D1〜JunD31）による細胞の処理のみが、2〜7倍のチミジン取り込みの増加を与えた。これに対し、有効でない配列（JunB-N-1〜JunB-N-57）による処理はチミジン取り込みの有意な変化を与えなかった。さらに、毒性アンチセンスjunBまたはJunD配列（JunB-T-1〜JunB-T-20及びJun D-T-1〜JunD-T-17）による処理は、増殖の増加ではなく減少をもたらした。要約すると、50の本発明のアンチセンス配列はJunB及びJunDによる負の増殖調節の有効なダウンレギュレーションをもたらしたが、94のその他のアンチセンス配列は細胞増殖に対して有意な効果を有しなかったか、あるいは毒性でありさえした。実施例４（図３にそれぞれのオリゴヌクレオチドを示す） erbB-2は、乳癌、肺癌、食道及び胃癌、胆管癌、膀胱癌、膵臓癌、卵巣癌等の種々の腫瘍において癌細胞により増幅され、及び／または過剰発現される細胞内チロシンキナーゼ活性を有するトランスメブラン分子である。これらの腫瘍のいくつかにおいて、c-erbB-2遺伝子の腫瘍組織における増幅及び過剰発現が悪い臨床的予後と相関することが示されている。非小細胞肺癌におけるp185erbB-2の過剰発現は、いくつかの化学療法薬に耐性を与えることが示されている。有効なerbB-2アンチセンス核酸はerbB-2タンパク質のダウンレギュレーションをもたらし、過剰発現する腫瘍細胞系においては、処理された細胞の低下した細胞増殖をもたらす。本発明のアンチセンス分子はerbB-2-1〜erbB-2-83と命名した。有効でないerbB-2アンチセンス配列はerbB-2-N-1〜erbB-2-N-95と命名した。 erbB-2を過剰発現しているSK-Br-3ヒト乳癌細胞を、5%のウシ胎仔血清（FCS）を補充したRPMI培地で増殖させ、96-ウェルマイクロタイタープレートにウェルあたり2500細胞を塗布した。２時間後にアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを２μMの濃度で加えた。 erbB-2タンパク質発現を測定するため、細胞をセルスクレーパーで回収し、EL ISAタンパク定量を行った。本発明のアンチセンス配列(erbB-2-1〜erbB-2-83)による細胞の処理のみが、4 0〜95%のerbB-2タンパク質発現の減少を与えた。これに対し、有効でない配列(erbB-2-N-1〜erbB-2-N-95)による処理はerbB-2 タンパク質発現の有意な変化を与えなかった。細胞数を測定するため、細胞をトリパンブルーで染色し、Neubauer血球計算板においてカウントした。本発明のアンチセンス配列(erbB-2-1〜erbB-2-83)による細胞の処理のみが、3 5〜70%の細胞数の減少を与えた。これに対し、有効でない配列（erbB-2-N-1〜erbB-2-N-95）による処理は細胞増殖の有意な変化を与えなかった。 erbB-2アンチセンス配列は、図3-8〜3-11に示した。実施例５（図３にそれぞれのオリゴヌクレオチドを示す） c-fos遺伝子は、前初期遺伝子型転写因子をコードする。有効なc-fosアンチセンス核酸は、c-Fosタンパク質のダウンレギュレーションをもたらす。本発明のアンチセンス分子は、c-fos-1〜c-fos-31と命名した。有効でないc-f osアンチセンス配列はc-fos-N-1〜c-fos-N-12と命名した。正常なヒト繊維芽細胞を5%のウシ胎仔血清（FCS）を補充したRPMI培地で増殖させ、96-ウェルマイクロタイタープレートにウェルあたり2500細胞を塗布した。２時間後にアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを２μMの濃度で加えた。 c-Fosタンパク質の発現を、細胞ライゼート中でELISAによって測定した。本発明のアンチセンス配列（c-fos-1〜c-fos-31）による細胞の処理のみが、4 5〜95%のc-fosタンパク質発現の有意な減少を与えた。これに対し、有効でない配列（c-fos-N-1〜c-fos-N-12）による処理はc-Fosタンパク質発現の有意な変化を与えなかった。実施例６（図３にそれぞれのオリゴヌクレオチドを示す） TGF-β1と同様に、TGF-β2はサイトカインのトランスフォーミング増殖因子- βファミリーのメンバーである。 TGF-β1及びTGF-β2の過剰発現は、悪性腫瘍の進行、免疫抑制、及び免疫系による監視からの腫瘍の逃避に関連する。有効なTGF-β2アンチセンス核酸は、TGF-β2増殖因子のダウンレギュレーションをもたらす。本発明のアンチセンス分子は、TGF-β2-1〜TGF-β2-38と命名した。有効でないTGF-β2アンチセンス配列は、TGF-β2-N-1〜TGF-β2-N-40と命名した。 TGF-β2を過剰発現している腫瘍細胞を、5%のウシ胎仔血清（FCS）を補充した RPMI培地で増殖させ、96-ウェルマイクロタイタープレートにウェルあたり2500 細胞を塗布した。２時間後にアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを２μMの濃度で加えた。上清及び細胞ライゼートの両方においてTGF-β2タンパク質発現をELISAで測定した。本発明のアンチセンス配列（TGF-β2-1〜TGF-β2-38）による細胞の処理のみが35〜80%のTGF-β2タンパク質発現の有意な減少を与えた。これに対し、有効でない配列（TGF-β2-N-1〜TGF-β2-N-40）による処理はTGF -β2タンパク質発現の有意な変化を与えなかった。実施例７（図３にそれぞれのオリゴヌクレオチドを示す） rbアンチセンス核酸 rbは、細胞増殖を負に制御する腫瘍抑制遺伝子である。野生型rbを含む細胞に対するrbアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの効果を分析した。野生型rbを有する細胞においては、有効なアンチセンス核酸は野生型rbタンパク質のダウンレギュレーションをもたらし、従って処理された細胞の増強された増殖をもたらす。本発明の分子はrb-1〜rb-45と命名した。有効でないrbアンチセンス配列は、rb-N-1〜rb-N-168と命名した。有効なrbアンチセンス配列が示す増強ではなく増殖を阻害する毒性配列はrb-T-1〜rb-T-16と命名した。正常なヒト繊維芽細胞を5%のウシ胎仔血清（FCS）を補充したRPMI培地で増殖させ、96-ウェルマイクロタイタープレートにウェルあたり2500細胞を塗布した。２時間後にアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを２μMの濃度で加えた。細胞増殖を測定するための２種類のアッセイを行った。 -3H-チミジン取り込みを測定するため、細胞を0.15μCi 3H-チミジン/ウェルとともに６時間インキュベートした後に回収した。細胞を凍結により溶解し、ガラスフィルター上にスポットし、液体シンチレーションカウンティングにより取り込まれたトリチウムの量を測定した。 -細胞数を測定するため、細胞をトリパンブルーで染色し、Neubauer血球計算板においてカウントした。驚くべきことに、本発明のアンチセンス配列（rb-1〜rb-45）による細胞の処理のみが2〜6倍のチミジン取り込みの増加を示した。これに対し、有効でない配列（rb-N-1〜rb-N-168）による処理はチミジン取り込みの有意な変化を与えなかった。さらに、毒性アンチセンスrb配列（rb-T-1〜rb-T-16）による処理は、増殖の増加ではなく減少をもたらした。要約すると、45の本発明のアンチセンス配列はrbによる負の増殖調節の有効なダウンレギュレーションと増加した細胞増殖をもたらしたが、184のその他のアンチセンス配列は細胞増殖に対して有意な効果を有しなかったか、あるいは細胞増殖を抑制さえした。実施例８本発明のオリゴヌクレオチド配列を、種々の異なるバックボーン修飾を加えて合成した。結果の例を下記に示す。配列erbB-2-42：CATCTGGAAACTTCCAGATGについて、erbB-2を過剰発現している癌細胞中で下記の化学修飾を試験した。 1．S-ODN erbB-2-42（全てのバックボーン結合がチオエート修飾物であるもの） C-pS-A-pS-T-pS-C-pS-T-pS-G-pS-G-pS-A-pS-A-pS-A-pS-C-pS-T-pS-T-pS-C-pS-C- pS-A-pS-G-pS-A-pS-T-pS-G 2．Me-ODN/S-ODN/Me-ODN erbB-2-42（下記のように5'及び3'末端の結合がメチルホスホネート結合であり、中間の結合がチオエート修飾物であるもの） C-pMe-A-pMe-T-pS-C-pS-T-pS-G-pS-G-pS-A-pS-A-pS-A-pS-C-pS-T-pS-T-pS-C-pS- C-pS-A-pS-G-pS-A-pMe-T-pMe-Gまたは C-pMe-A-pMe-T-pMe-C-pS-T-pS-G-pS-G-pS-A-pS-A-pS-A-pS-C-pS-T-pS-T-pS-C-pS -C-pS-A-pS-G-pMe-A-pMe-T-pMe-Gまたは C-pMe-A-pMe-T-pMe-C-pMe-T-pS-G-pS-G-pS-A-pS-A-pS-A-pS-C-pS-T-pS-T-pS-C-p S-C-pS-A-pMe-G-pMe-A-pMe-T-pMe-Gまたは C-pMe-A-pMe-T-pMe-C-pMe-T-pMe-G-pMe-G-pS-A-pS-A-pS-A-pS-C-pS-T-pS-T-pS-C -pMe-C-pMe-A-pMe-G-pMe-A-pMe-T-pMe-G 3．Me-ODN/S-ODN erbB-2-42（下記のように5'末端の結合がメチルホスホネート結合であり、3'末端がチオエート修飾物であるもの） C-pMe-A-pMe-T-pMe-C-pMe-T-pMe-G-pMe-G-pMe-A-pMe-A-pMe-A-pS-C-pS-T-pS-T-p S-C-pS-C-pS-A-pS-G-pS-A-pS-T-pS-G 4．S-ODN/Me-ODN erbB-2-42（下記のように5'末端の結合がメチルホスホネート結合であり、3'末端がチオエート修飾物であるもの） C-pS-A-pS-T-pS-C-pS-T-pS-G-pS-G-pS-A-pS-A-pS-A-pMe-C-pMe-T-pMe-T-pMe-C-p Me-C-pMe-A-pMe-G-pMe-A-pMe-T-pMe-G 5．Me-ODN erbB-2-42（結合がメチルホスホネート結合であるもの） C-pMe-A-pMe-T-pMe-C-pMe-T-pMe-G-pMe-G-pMe-A-pMe-A-pMe-A-C-pMe-T-pMe-T-pM e-C-pMe-C-pMe-A-pMe-G-pMe-A-pMe-T-pMe-G 6．pN/S-ODN/pN erbB-2-42（下記のように5'及び3'末端の結合がホスホルアミデート結合であり、中間の結合がチオエート修飾物であるもの） C-pN-A-pN-T-pS-C-pS-T-pS-G-pS-G-pS-A-pS-A-pS-A-pS-C-pS-T-pS-T-pS-C-pS-C- pS-A-pS-G-pS-A-pN-T-pN-Gまたは C-pN-A-pN-T-pN-C-pS-T-pS-G-pS-G-pS-A-pS-A-pS-A-pS-C-pS-T-pS-T-pS-C-pS-C- pS-A-pS-G-pN-A-pN-T-pN-Gまたは C-pN-A-pN-T-pN-C-pN-T-pS-G-pS-G-pS-A-pS-A-pS-A-pS-C-pS-T-pS-T-pS-C-pS-C- pS-A-pN-G-pS-A-pN-T-pN-Gまたは C-pN-A-pN-T-pN-C-pN-T-pN-G-pN-G-pS-A-pS-A-pS-A-pS-C-pS-T-pS-T-pS-C-pN-C- pN-A-pN-G-pN-A-pN-T-pN-G 上記中、pSはバックボーン結合の非架橋酸素原子のうちの１個の硫黄原子による置換を表し、pMeはバックボーン結合の非架橋酸素原子のうちの１個のメチル基による置換を表す。pNは、N3'→P5'ホスホルアミデート結合を表す。また、結合の組み合わせ(N-pS-N-pO-N-pO-N)n-[pS-N]mであり、式中n=1〜 10、m=0〜6であり、Nは任意のヌクレオチドまたはその構造上もしくは機能上の類似体もしくは誘導体を表す。 Me-ODNバックボーン修飾はerbB-2-42配列のerbB-2活性を20%未満に強力に減少させたが、バックボーン修飾1.〜4.は強力なerbB-2阻害能力を有し、２μMの濃度で、過剰発現癌細胞の処理の開始後48時間で78%〜89%のerbB-2タンパタ質発現の阻害を示した。純粋なS-ODNは89%の最も高い抑制効果を有し、Me-ODN/S-ODN/M e-ODN、並びにMe-ODN/S-ODN及びS-ODN/Me-ODN及びpN/S-ODN/pNは、減少したタンパク質結合を示し、補体活性を試験したところ補体活性は低下していた。これらの特徴は、例えばin vivoにおける静脈全身投与等の一定の用途に有利である。実施例９上記のバックボーン修飾を有する本発明のその他の配列を試験したところ、同様な効果が得られた。本発明のTGF-β-1についての有効な配列によるTGF-β-1遺伝子発現の阻害は、 S-ODN及びMe-ODN/S-ODN/Me-ODNバックボーン修飾により最高となり、Me-ODN修飾で最低となり、タンパク質結合及び補体活性化はMe-ODN結合を含む配列において低下していた。実施例10 驚くべきことに、本発明の配列の有効性は、本発明の核酸を葉酸に結合することにより種々の細胞種において有意に向上した。 erb-B2阻害能力は24時間後では48時間と比較して比較的低く、24〜37%のerbB- 2タンパク質合成の阻害を示したが、本発明の配列を葉酸に結合することにより、２μMの濃度で、過剰発現癌細胞の処理の開始後24時間で48%〜62%に顕著に増加した。アミノプテリン及びアメトプテリンのような葉酸誘導体に本発明の配列を結合することにより同様の効果が得られた。実施例11 驚くべきことに、本発明の配列の有効性は、本発明のオリゴヌクレオチドをコルチゾールに結合することにより大きく向上した。 TGF-β-1、TGF-β-2、c-fos、p53、erbB-2、rb、c-fos、junB、junD、c-jun、 MIP-1α、JAK-2、bc1-2に対する配列を含む本発明の配列の細胞取込み及び阻害能力は、コルチゾールを本発明のオリゴヌクレオチド配列の3'または5'-ヒドロキシル基に結合することにより顕著に増加した。実施例12 また本発明の配列の有効性は、本発明の核酸をその他のステロイドホルモン及びその他の誘導体、例えばエストロゲン、抗エストロゲン、プレドニソン、プレドニソロン、アンドロゲン、抗アンドロゲン、プロゲステロンのようなゲスタゲン、並びにペプチド、プロテオグリカン、グリコリピド、ホスホリピド及びそれらの誘導体と結合するか混合することにより大きく向上した。前記核酸に結合したアンドロゲン、特にアンドロステンジオン及びテストステロン、並びに抗アンドロゲン、例えばシプロテロンアセテート、フルタミド、アナンドロン等は、前立腺癌細胞等の種々の細胞種において分子の有効性を増強した。オリゴヌクレオチドに結合されたエストロゲン、抗エストロゲン及びその誘導体、例えばホスフェストロール、トレミフェン、エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストール及びエストラジオール誘導体、エストラジオールベンゾエート、エストラジオールバレリネート及びエストラジオールウンデシレート、並びにプロゲステロン及びその誘導体、例えばメドロキシプロゲストロンアセテート及びメゲストロールアセテート等は、乳癌細胞等の種々の細胞種において本発明の分子の活性を強力に増強した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｐ 25/28 25/28 31/00 31/00 35/00 35/00 37/00 37/00 Ｃ０７Ｈ 21/04 ＢＣ０７Ｈ 21/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】 1. アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその誘導体の製造方法であって、 -標的核酸を選択し、必要に応じてその配列を解明し、 -アンチセンスオリゴヌクレオチドを生成し、但し -該オリゴヌクレオチドは少なくとも８個の残基を含み、 -該オリゴヌクレオチドはシトシン塩基に対しそれぞれ３個の水素結合を形成することができる最大で12のエレメントを含むものとし、 -該オリゴヌクレオチドは、標的分子内で４個の連続シトシン塩基（CCCC）とそれぞれ３個の水素結合を形成できる４個以上の連続エレメントを含まず、あるいはGGGGの４個以上の連続エレメントを含まないものとし、 -また該オリゴヌクレオチドは、標的分子内で３個の連続シトシン塩基(CCC) とそれぞれ３個の水素結合を形成できる３個以上の連続エレメントを２シリーズ以上含まず、あるいはGGGの３個の連続エレメントを２シリーズ以上含まないものとし、 -残基あたり２個の水素結合を標的分子と形成する残基（2H-結合-R）と残基あたり３個の水素結合を標的分子と形成する残基（3H-結合-R）との間の比が以下の関係に支配され、 -そして上記のように生成されるオリゴヌクレオチドをそれ自体公知の方法で合成する、ステップを含む前記方法。 2. 生成されたオリゴヌクレオチドが以下の条件を満たす請求項１に記載の方法。 3. 生成されるオリゴヌクレオチドが、天然のオリゴまたはポリヌクレオチドより高いヌクレアーゼ耐性を有するように修飾される請求項１または２に記載の方法。 4. 生成されたオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの塩基、糖または結合において、好ましくは、ホスホロチオエート（S-ODN）ヌクレオチド間結合、及び／またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合、N'3→P5'ホスホルアミデート結合、ペプチド結合、または糖部分の2'-メトキシエトキシ修飾、または塩基の修飾により修飾される請求項３に記載の方法。 5. オリゴヌクレオチドが少なくとも２種の異なる種類の修飾を有する請求項３及び／または４に記載の方法。 6. オリゴヌクレオチドが、葉酸、ホルモン、例えばステロイドホルモンもしくはコルチコステロイド、ペプチド、プロテオグリカン、グリコリピド、またはホスホリピドに共有結合されるか、混合されていることにより、オリゴヌクレオチドが葉酸、ホルモン、例えばステロイドホルモンまたはコルチコステロイド、またはそれらの誘導体と反応させられている請求項1〜5のいずれか１項に記載の方法。 7. オリゴヌクレオチドが図４に示されたものであることを除き請求項1〜6のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその誘導体。 8. ４個以上の連続したグアノシン（N_aGGGGN_b）またはイノシン（N_aIIIIN_b）残基を含まず、かつ前記オリゴヌクレオチドは３個以上の連続したグアノシン残基を２シリーズ(N_aGGGN_cGGGN_b)以上含まず、かつ３個以上の連続したイノシン残基を２シリーズ（N_aIIIN_cIIIN_b）以上含まない(但し、式中、N_a、N_b、N_cは独立して 0〜20の残基を有するヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはその誘導体を表す)請求項７に記載のオリゴヌクレオチドまたは誘導体。 9. 少なくとも10個、最大で24個のエレメントあたり２個または３個の水素結合を形成することができるエレメントを含む請求項７及び/又は８に記載のオリゴヌクレオチドまたは誘導体。 10．オリゴヌクレオチドの塩基、糖またはリン酸部分に修飾を有する請求項7 〜9のいずれか１項に記載のオリゴヌタレオチドまたは誘導体。 11．修飾は、ホスホロチオエート（S-ODN）ヌクレオチド間結合、及び／またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合、N'3→P5'ホスホルアミデート結合、ペプチド結合あるいは糖の2'-メトキシエトキシ修飾あるいは塩基の修飾である請求項7〜10のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたは誘導体。 12．葉酸、ホルモン、ステロイドホルモン、例えばエストロゲン、プロゲステロン、コルチコステロイド、ミネラルコルチコイド、ペプチド、プロテオグリカン、グリコリピド、ホスホリピド及びそれらの誘導体と結合されるか混合された請求項7〜11のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたは誘導体。 13． TGF-β1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、図３の配列41〜73 を含み、遺伝子p53に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、図３の配列74 〜106を含み、junBに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、図３の配列154 〜172を含み、junDに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、図３の配列173 〜203を含み、erbB-2遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、図３の配列298〜380を含み、c-fos遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、図３の配列476〜506を含み、遺伝子TGF-β2に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、図３の配列519〜556を含み、遺伝子rbに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、図３の配列597〜641及び図５の1273〜1764を含む請求項7〜12のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたは誘導体。 14．特に、肝細胞、腎臓細胞、破骨細胞、骨芽細胞及び／またはケラチン合成細胞及び／または血液系細胞、例えば骨髄幹細胞及び／または赤血球及び白血球の始原細胞の初代細胞の細胞増殖に影響を与えるために遺伝子p53、rb、junD、j unB、TGF-β1、TGF-β2の阻害のための組成物または医薬品の製造のための請求項7〜13のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたは誘導体を含む組成物。 15．添加剤とともに請求項7〜13のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたは誘導体を含む組成物。 16．本発明のオリゴヌクレオチドは、腫瘍、低増殖状態、過剰増殖状態、変性疾患、神経性変性疾患、虚血症、免疫系の疾患及び／または感染症、及び／または代謝機能異常の予防及び／または治療用の医薬の製造のための請求項7〜13のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。 17．遺伝子機能の分析または医薬標的評価のための請求項7〜13のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。