【発明の詳細な説明】
乳ガン特異的遺伝子１
発明の分野
本発明は、新規の乳ガン特異的マーカーに関する。より詳細には、ヒト乳ガン
特異的遺伝子１(BCSG1)をコードする単離された核酸分子が提供される。BCSG1ポ
リペプチドもまた、ベクター、宿主細胞、およびこれらを作製するための組換え
方法と同様に提供される。乳ガンを検出するための診断方法もまた、提供される
。本発明はさらに、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドによってコードさ
れるアミノ酸配列を有する、単離されたBCSG1ポリペプチドを提供する。
関連分野
190,000を超える新しい症例の乳ガンが、毎年約１％ほどの発症率増加を伴っ
て、毎年米国で診断される(Goldhirsch，A.，JNCI97:1141-1145(1995);Emster，
V.L.ら、JAMA 275:913-918(1996))。新たな遺伝子マーカーおよびさらなる危険
因子の発見に関する研究は、乳ガンを取り囲む、患者の複雑な管理に適合する新
たな情報を提供し得る。多くの新たな予後因子および予測因子が、乳ガンについ
て提唱されそして研究されている。HER2/neu陽性腫瘍は内分泌処置には十分に反
応しない(Allred D.C.ら、Ｊ．Clin Oncol．10:599-605(1992);Gusterson B.A.
ら、J．Clin Oncol．10:1049-56(1992))。p53の変化は、予後の十分な指標とは
ならず、そしてタモキシフェンに対して十分に応答しない(Bergh J.ら、Nature
Medicine 10:1029-34(1995);Elledge R.M.ら、Breast Cancer Res Treat 27:95-
102(1993))。Nm23発現の欠失は、侵襲性腺管癌において転移性潜在能力および不
十分な予後を示す価値を有する(Steeg P.S.ら、Breast Cancer Res Treat 25:17
5-87(1993))。乳ガンにおいて役割を有することが示唆されるプロテアーゼであ
るカテプシンＤは、侵襲性増殖のための潜在能力に影響するようである(Velcule
scu，V.E.ら、Science 270:484-7(1995);Schena，M.ら、Science 270:467-70(19
95);M.L.Angerer & R.C．Angerer，In:In situ hybridiz
ation，D．RickwoodおよびB.D.Hames（編）．London:LRL Press.，(1992),15〜3
2頁;Ferno M.ら、Eur J．Cancer 30A:2042-8(1994))。第VIII因子抗体を有する
腫瘍切片の陽性免疫染色は、血管新生についてのマーカーであるようである(Kli
jn J.G.M.ら、Breast Cancer 18:165-98(1993);Harris A.L.ら、Eur J．Cancer
31A:831-2(1995);Gasparini G.ら、JNCI 85:1206-19(1993)(誤植訂正JNCI 85:16
05(1993))。これらの腫瘍は抗血管新生薬処置に対する標的であると仮定されて
いる。mdr-1遺伝子の発現は、多剤耐性の指標であると提唱されている(Harris A
.L.ら、Eur J.Cancer 31A:831-2(1995);Gasparini G.ら、JNCI 85:1206-19(1993
)(誤植訂正JNCI 85:1605(1993)))。内分泌腺治療に対する不十分な応答は、プラ
スミノゲンアクチベーター／インヒビターであるuPA/PAI-1について示されてい
る(Foekens J.A.ら、JNCI 87:751-6(1995))。また、受け取られている主な注目
は、家族性乳ガン関連遺伝子(BRCA1およびBRCA2)である(Miki，Y.ら、Science 2
66:66-71(1994);Wooster，R.ら、Science 265:2088-2090(1994);Futreal，P.A.
ら、Science 266:120-122(1994))。
従って、乳ガンの発症および進行には、個々の遺伝子発現における定性的変化
および定量的変化を生じる複数の遺伝子変化が伴う(Porter-Jordan，K.およびLi
ppman,M.E.，Hematol．Oncol．Clin．N．Am．8:73-100(1994))。多くのこれらの
定量的遺伝子変化は、新たに転写されたmRNAの細胞成分中における変化としてそ
れら自身を明確にし得る。これらのmRNAの同定は、患者の管理および予後につい
て、臨床的に有用な情報を提供し得、一方で、乳ガンの病理の本発明者らの理解
を増強し得る。
悪性乳腺中に生じる、遺伝子発現における定量的変化の同定は、新規の分子マ
ーカー（これは、ヒト乳ガンの診断および処置において有用であり得る）を生じ
得る。いくつかの示差的クローニング方法（例えば、ディファレンシャルディス
プレイポリメラーゼ連鎖反応およびサブトラクティブハイブリダイゼーション）
は、正常乳房組織コントロールと比較して乳ガン生検において示差的に発現する
遺伝子を同定するために使用されている(Watson，M.A.およびFleming，T．P.，C
ancer Res．54:4598-4602(1994);Sager，R.ら、FASEB J.:964-970(1993);Chen，
Z.およびSager，R.，Mol．Med．1:153-160(1995);Zhang，M.ら、Cance
r Res．55:2537-2541(1995);Zou，Z.ら、Science 263:526-529))。しかし、これ
らの研究は、比較的時間集約的な工程および労働集約的な工程である、サブクロ
ーニング、ライブラリースクリーニング、ならびに個々遺伝子のcDNA配列決定を
必要とする(Sager，R.ら、FASEB J.7:964-970(1993);Liang，P.ら、Cancer Res
．52:6966-6968(1992))。
腫瘍サイズ、リンパ節の状態、およびエストロゲンレセプターならびにプロジ
ェステロンレセプターの状態のような病理学的指標が、乳ガンについての予後お
よび処置選択の戦略において最も有用な指針であるままである(Manning，D.L.ら
、Acta Oncol．34:641-646(1995))が、個々の腫瘍の特性（例えば、転移の確率
）を決定する分子機構をさらに研究する必要性がさらにある。多数の予後因子が
同定されているが、治療に対する臨床応答を定義するためにはほとんど寄与して
いない。
発明の要旨
本発明は、図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列、またはATCC受託番号
97175(1995年６月２日)としてまたはATCC受託番号97856(1997年１月23日)として
細菌宿主中に寄託されたcDNAクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する
BCSG1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子
を提供する。
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクターに関連し、
そしてこの組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび
宿主細胞を作製する方法、ならびに組換え技術によるBCSG1ポリペプチドまたはB
CSG1ペプチドの産生のためにそれらを使用する方法に関する。
本発明の別の局面に従って、宿主に由来するサンプルにおいて本発明の乳房特
異的遺伝子に対応する変化ポリペプチドのレベルを検出すること（それにより高
レベルのポリペプチドが乳ガン診断を示す）により、乳ガン転移を診断するため
の方法および産物が提供される。
本発明はさらに、本発明のポリペプチド（乳ガン細胞または乳ガン転移を検出
するために使用され得る）に対して特異的な抗体に関係する。
本明細書中に記載されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドは乳ガンのため
のマーカーとして有用である。
図面の簡単な説明
図１は、BCSG1のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（
配列番号２）を示す。このタンパク質は、約14.2kDaの推定分子量を有する。
BCSG1タンパク質の予測されるアミノ酸配列もまた示される。
図２は、示差的cDNA配列決定のアプローチを示す。正常組織および罹患組織由
来のメッセンジャーRNAを抽出し、そしてcDNAライブラリーを作製するために用
いた。これらのライブラリーを、無作為に選択されたcDNAクローンの自動化DNA
配列分析を含むEST方法により検索する。重複している配列を有するESTは一意の
EST群へ分類した。個々の一意のEST群（配列中でお互いに重複しない）を正常組
織対罹患組織のライブラリー中に発現した個々のEST数を試験することによりそ
の相対的発現について分析した。３つのEST群が列挙されている。青色のEST群は
、両方のライブラリー中で同寄に発現する遺伝子を表す。緑色のEST群は罹患し
たライブラリーと比べて正常ライブラリー中でより多く発現する遺伝子を表す。
赤色のEST群は正常ライブラリーと比べて罹患したライブラリー中でより多く発
現する遺伝子を表す。
図３は、pHE4-5発現ベクター（配列番号10）およびサブクローン化されたBSCG
-1 cDNAコード配列の概略図を示す。カナマイシン耐性マーカー遺伝子、BSCG-1
コード配列、oriC配列、およびlacIqコード配列の位置が示されている。
図４は、pHEプロモーターの調節エレメントのヌクレオチド配列（配列番号11
）を示す。２つのlacオペレーター配列、Shine-Delgarno配列(S/D)、および末端
HindIIIおよびNdeI制限部位（イタリック体）を示す。
詳細な説明
本発明は、クローン化されたcDNAを配列決定することにより決定された、図１
（配列番号２）で示されるアミノ酸配列を有するBCSG1ポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。本発明のBCSG1タン
パク質はヒトADアミロイドと配列相同性を共有する。図１で示されるヌクレオチ
ド配列（配列番号１）は、184,497クローンを配列決定することにより得られ、
アメリカンタイプカルチャーコレクション12301 Parklawn Drive，Rockville，M
aryland 20852に1997年１月23日に寄託され、そして、97856の受託番号が与えら
れた。寄託されたクローンは、pBluescript SK(-)プラスミド(Stratagene，La J
olla，CA)に含まれる。BSCG-1遺伝子はまた、アメリカンタイプカルチャーコレ
クション12301 Park Lawn Drive，Rockville，Maryland 20852に1995年６月２日
に寄託され、そして、97175の受託番号が与えられた。
核酸分子
他に示されない限り、本明細書中でDNA分子を配列決定することによって決定
されたすべてのヌクレオチド配列は、自動化DNA配列決定機（例えば、Applied B
iosystems，Inc.のModel 373）を用いて決定され、そして本明細書中で決定され
るDNA分子によってコードされるポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、上記
のように決定されたDNA配列の翻訳によって推定された。従って、この自動化ア
プローチによって決定された任意のDNA配列について当該分野において公知のよ
うに、本明細書中で決定される任意のヌクレオチド配列はいくつかの誤りを含み
得る。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されるDNA分子
の実際のヌクレオチド配列に対して、代表的には少なくとも約90％同一、より代
表的には少なくとも約95％から少なくとも約99.9％同一である。実際の配列は、
当該分野において周知の手動DNA配列決定方法を含む他のアプローチによってさ
らに正確に決定され得る。当該分野においてまた公知のように、実際の配列と比
較した、決定されるヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は、ヌクレ
オチド配列の翻訳においてフレームシフトを引き起こし、その結果、決定される
ヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列は、配列決定されるDN
A分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なり、これは、こ
のような挿入または欠失の点にて始まる。
本明細書中に提供される情報を使用して、BCSG1ポリペプチドをコードする本
発明の核酸分子（例えば、図１のヌクレオチド配列）は、標準的クローニングお
よび標準的スクリーニング手順（例えば、出発物質であるmRNAを使用してcDNAを
クローニングするための手順）を使用して得られ得る。本発明の例示である、図
１に記載される核酸分子（配列番号１）は乳ガンに由来するcDNAライブラリー中
で発見された。この遺伝子はまた、脳組織由来のcDNAライブラリー中で同定され
た。図１のBCSG1cDNAの決定されたヌクレオチド配列（配列番号１）は、127アミ
ノ酸残基のタンパク質（図１（配列番号１）のヌクレオチド配列の12〜14位に開
始コドンを有し、そして約14.2kDaの推定分子量を有する）をコードするオープ
ンリーディングフレームを含む。図１（配列番号２）に示されるBCSG1タンパク
質は、ヒトアルツハイマー病(AD)アミロイドタンパク質の非Ａβフラグメントと
約54%同一である。
当業者が理解するように、配列決定誤差の可能性に起因して、寄託されたcDNA
によりコードされる予測されるBCSG1ポリペプチドは、約127アミノ酸を含むが、
110〜140アミノ酸の範囲内ならどこででもあり得る。
示されるように、本発明の核酸分子は、RNA（例えば、mRNA）の形態、またはD
NA（例えば、cDNA、およびクローニングによって得られるか、または合成的に生
成されるゲノムDNAを含む）の形態で存在し得る。DNAは、二本鎖または一本鎖で
あり得る。一本鎖DNAまたはRNAは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であ
り得るか、または非コード鎖（アンチセンス鎖とも呼ばれる）であり得る。
「単離された」核酸分子によって、ネイティブな環境から取り出された核酸分
子（DNAまたはRNA）が意図される。例えば、ベクター中に含まれる組換えDNA分
子は、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたDNA分子
のさらなる例は、異種の宿主細胞において維持される組換えDNA分子、または溶
液中の（部分的または実質的に）精製されたDNA分子を含む。単離されたRNA分子
は、本発明のDNA分子のインビボまたはインビトロでのRNA転写物を含む。本発明
に従う単離された核酸分子は、そのような合成的に生成された分子をさらに含む
。
本発明の単離された核酸分子は、以下：図１（配列番号１）に示されるオープ
ンリーディングフレーム(ORF)を含むDNA分子；および上記の配列とは実質的に異
なる配列を含むDNA分子、が挙げられるが、これは遺伝子コードの縮重に起因し
、なおBCSG1タンパク質をコードする。もちろんのことながら、遺伝コードは当
該
分野において周知である。従って、当業者にとって、このような縮重型改変体を
作成することは日常的である。
別の局面において、1997年１月23日にATCC受託番号第97856号として寄託され
たプラスミド中に含まれるか、または1995年６月２日にATCC受託番号第97175号
として寄託されたプラスミド中に含まれるcDNAクローンによりコードされるアミ
ノ酸配列を有するBCSG1ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を、本発
明は提供する。本発明はさらに、図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配
列、または上記の寄託されたクローンである、Ｎ末端メチオニンを欠失した全長
BCSG1ポリペプチド中に含まれるBCSG1cDNAのヌクレオチド配列を有する単離され
た核酸分子、あるいは上記配列の１つに相補的な配列を有する核酸分子を提供す
る。このような単離された分子（特にDNA分子）は、染色体とのインサイチュハ
イブリダイゼーションによる遺伝子マッピングのための、および例えば、ノーザ
ンブロット分析によるヒト組織におけるBCSG1遺伝子の発現を検出するためのプ
ローブとして有用である。
本発明はさらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメント
に関する。寄託されたcDNAのヌクレオチド配列または図１（配列番号１）に示さ
れるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子のフラグメントによって、少
なくとも約15nt、そしてより好ましくは少なくとも約20nt、さらにより好ましく
は少なくとも約30nt、そしてさらにより好ましくは少なくとも約40ntの長さのフ
ラグメントが意図され、これらは本明細書中で議論されるように、診断用プロー
ブおよびプライマーとして有用である。当然に、50、75、100、125、150、175、
200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、55
0ntの長さである、より大きなフラグメントもまた、寄託されたcDNAのヌクレオ
チド配列、または図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列の、全てでな
い場合には、そのほとんどに対応するフラグメントと同様、本発明に従って有用
である。例えば、少なくとも20nt長のフラグメントにより、寄託されたcDNAのヌ
クレオチド配列または図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列由来の20
以上の連続した塩基を含むフラグメントが意図される。
本発明の好ましい核酸フラグメントには、BCSG1タンパク質のエピトープ保有
部分をコードする核酸分子が挙げられる。詳細には、本発明のこのような核酸フ
ラグメントは、以下をコードする核酸分子を含む：図１（配列番号２）の約94〜
約107のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図１（配列番号２）の約120〜約127
のアミノ酸残基を含むポリペプチド。本発明者らは、上記のポリペプチドフラグ
メントがBCSG1タンパク質の抗原性領域であることを決定した。BCSG1タンパク質
の他のこのようなエピトープ保有部分を決定するための方法は、以下に詳細に記
載される。
別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件下で、上記の本発明の核酸分子（例えば、ATCC受託番号第97856号または同第9
7175号に含まれるcDNAクローン）中のポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズ
するポリヌクレオチドを含む単離した核酸分子を提供する。「ストリンジェント
なハイブリダイゼーション条件」によって、以下：50％ホルムアミド、５×SSC
（150mM NaCl、15mMクエン酸三ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、
５×デンハート溶液、10％硫酸デキストラン、および20g/mlの変性剪断サケ精子
DNA、を含む溶液中での42℃での一晩のインキュベーション、続いて約65℃での0
.1×SSC中でフィルターの洗浄が意図される。
ポリヌクレオチドの「部分」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって
、参照ポリヌクレオチドの少なくとも約15ヌクレオチド(nt)、そしてより好まし
くは少なくとも約20nt、さらにより好ましくは少なくとも約30nt、そしてさらに
より好ましくは約30〜70ntにハイブリダイズするポリヌクレオチド（DNAまたはR
NAのいずれか）が意図される。これらは、先に議論し、そして以下でより詳細に
考察されるような診断用プローブおよびプライマーとして有用である。
例えば、「少なくとも20nt長」のポリヌクレオチドの部分により、参照ポリヌ
クレオチドのヌクレオチド配列（例えば、寄託されたcDNA、または図１（配列番
号１）に示されるようなヌクレオチド配列）由来の20以上の連続したヌクレオチ
ドが意図される。当然のことながら、ポリＡ配列（例えば、図１（配列番号１）
に示されるBCSG1 cDNAの3'末端ポリ（A）トラクト）にのみ、またはT（もしくは
U）残基の相補的なストレッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、
本発明の核酸の一部分にハイブリダイズさせるために使用される本発明のポリヌ
クレオチドに含まれない。なぜなら、このようなポリヌクレオチドは、ポリ（A
）ストレッチまたはその相補体（例えば、実際には、任意の二本鎖cDNAクローン
）を含む任意の核酸分子にハイブリダイズするからである。
示されるように、BCSG1ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、以下
：ポリペプチド自体；ポリペプチドのコード配列および付加的配列（例えば、プ
レタンパク質配列またはプロタンパク質配列またはプレプロタンパク質配列のよ
うなアミノ酸リーダー配列あるいは分泌配列をコードする配列）；上記の付加的
コード配列を、例えば、イントロンおよび非コード5'および3'配列（例えば、転
写、mRNAプロセシング（スプライシングを含む）およびポリアデニル化シグナル
（例えば、mRNAのリボソーム結合および安定性）において役割を担う転写された
非翻訳配列）を含むがこれらに限定されないさらなる非コード配列を共に含むか
または含まない、ポリペプチドのコード配列；さらなる機能性を提供するような
付加的アミノ酸をコードする付加的コード配列のポリペプチドのアミノ酸配列を
コードする核酸分子を含み得る。従って、例えば、ポリペプチドをコードする配
列は、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列の
ようなマーカー配列と融合され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施熊
様において、マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、pQEベクター（Qiagen,Inc.）
中に提供されるタグのような、ヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、これらの多
くは市販されている。例えば、Gentzら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:821-8
24(1989)において記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の
簡便な精製を提供する。「HA」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質
由来のエピトープに対応する、精製のために有用な別のペプチドであり、それは
、Wilsonら、Cell 37:767(1984)によって記載されている。以下で考察されるよ
うに、他のそのような融合タンパク質には、Ｎ末端またはＣ末端にてFcに融合さ
れたBCSG1が含まれる。
本発明は、さらに、BCSG1タンパク質の一部分、アナログ、または誘導体をコ
ードする、本発明の核酸分子の改変体に関する。改変体は、天然の対立遺伝子改
変体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子改変体」によって、生物の染色体
上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの選択形態の１つが意図される。
Genes II，Lewin，B.編、John Wiley&Sons，New York(1985)。天然に存在しない
改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
このような改変体には、１つ以上のヌクレオチドが関与し得るヌクレオチドの
置換、欠失、または付加により産生される改変体が含まれる。改変体は、コード
領域、非コード領域、または両方において変化され得る。コード領域における変
化は、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加を生じ得る。これ
らの間で特に好ましいのは、サイレントな置換、付加、および欠失であり、これ
らはBCSG1タンパク質、またはそれらの一部の特性および活性を変化させない。
この点に関してまた特に好ましいのは、保存的置換である。
本発明のさらなる実施熊様には、以下に対して少なくとも90％同一、そしてよ
り好ましくは少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一であるヌクレ
オチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子が含まれる：（
ａ）図１（配列番号２）中のアミノ酸配列を有するBCSG1ポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２中のアミノ酸配列を有するが、Ｎ末端
メチオニンを欠損したポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）ATCC
受託番号第97856号または同第97175号に含まれるcDNAクローンによりコードされ
るアミノ酸配列を有するBCSG1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ま
たは（ｄ）（ａ）、（ｂ）、もしくは（ｃ）のヌクレオチド配列のいずれかに相
補的なヌクレオチド配列。
BCSG1ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に、例えば、少なくと
も95％「同一な」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、そのポ
リヌクレオチドのヌクレオチド配列が、BCSG1ポリペプチドをコードする参照ヌ
クレオチド配列の各100ヌクレオチドあたり５つまでの点変異をポリヌクレオチ
ド配列が含み得ることを除いて、参照配列に同一であることが意図される。言い
換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95％同一であるヌクレオチド配列
を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列における５％までのヌクレオ
チドが欠失され得るか、もしくは別のヌクレオチドで置換され得るか、または参
照配列において全ヌクレオチドの５％までのある数のヌクレオチドが、参照配列
中に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の5'もし
くは3'末端位置において、または参照配列中のヌクレオチド間で個々に、もしく
は参照配列内の１つ以上の連続した基中のいずれかに散在されて、これらの末端
位置の間のどこかで生じ得る。
実際には、任意の特定の核酸分子が、例えば、図１（配列番号１）に示される
ヌクレオチド配列または寄託されたcDNAクローンのヌクレオチド配列に少なくと
も90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるかどうかは、Bestfit
プログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Gene
tics Computer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madiso
n，WI 53711)のような公知のコンピュータープログラムを用いて従来通りに決定
され得る。Bestfitは、SmithおよびWaterman，Advances in Applied Mathematic
s 2:482-489(1981)の局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の最も
相同性のセグメントを見出す。Bestfitまたは任意の他の配列整列プログラムを
使用して、特定の配列が、本発明による参照配列に例えば95％同一であるか否か
を決定する場合、パラメーターは、もちろん、同一性の割合が、参照ヌクレオチ
ド配列の全長にわたって計算されるように、そして参照配列の総ヌクレオチド数
の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、設定される。
本出願は、BCSG1活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関係なく、
図１（配列番号１）に示される核酸配列、または寄託されたcDNAの核酸配列と少
なくとも90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一である核酸分子に関す
る。これは、特定の核酸分子がBCSG1活性を有するポリペプチドをコードしない
場合でさえ、当業者は、核酸分子をどのようにして、例えば、ハイブリダイゼー
ションプローブ、またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のプライマーとして使用す
るかをなお知るからである。BCSG1活性を有するポリペプチドをコードしない、
本発明の核酸分子の用途としては、とりわけ(1)cDNAライブラリー中のBCSG1遺伝
子またはその対立遺伝子改変体を単離すること；(2)Vermaら，Human Chromosome
s:A Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)に記載の、
BCSG1遺伝子の正確な染色体位置を提供するための分裂中期染色体展開物に対す
るインサイチュハイブリダイゼーション(例えば、「FISH」)；および、特定の組
織におけるBCSG1 mRNA発現を検出するためのノーザンブロット分析、が挙げられ
る。
しかし、実のところ、BCSG1タンパク質活性を有するポリペプチドをコードす
る図１（配列番号１）に示される核酸配列、あるいは寄託されたcDNAの核酸配列
に少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一である配列を有す
る核酸分子が好ましい。「BCSG1活性を有するポリペプチド」によって、特定の
生物学的アッセイにおいて測定される場合に、本発明のBCSG1タンパク質活性に
類似するが必ずしも同一ではない活性を示すポリペプチドが意図される。BCSG1
タンパク質は、アポトーシスに関与すると考えられる。BCSG1タンパク質活性は
、アポトーシスを測定するアッセイを用いて測定され得る。例えば、Lab-Tekチ
ャンバースライド(Nunc，Inc.)で培養されたヒト乳ガン細胞は、組換えBDSG1タ
ンパク質または候補BCSG1タンパク質を伴うかまたは伴わずに、処理される。次
いで、この細胞は、いくつかの濃度のアポトーシス誘導物質（例えば、アドリア
マイシン）で処理される。アポトーシスは、DNAの断片化が以下のアッセイを用
いるアポトーシス死の基準である場合、処理細胞とコントロール細胞との間で比
較される。アドリアマイシン処理後に種々の時点で、接着細胞をDNA特異的蛍光
色素であるジアミノ-2フェニルインドール（Boehringer Mannheim）の１μg/ml
メタノール溶液で染色した。細胞を、Zeiss Axiophot蛍光顕微鏡を用いて、染色
して20分以内に計数する。実験は、各点で評価された少なくとも150の細胞を用
いて３連で実施する。フラグメント化された核または濃縮された核は、アポトー
シス死として評価される。インタクトな核または有糸分裂の核は、正常であると
評価される。
もちろん、遺伝子コードの縮重のために、当業者は、寄託されたcDNAの核酸配
列、または図１（配列番号１）に示される核酸配列に少なくとも90％、95％、96
％、97％、98％、または99％同一である配列を有する多数の核酸分子が「BCSG1
タンパク質活性を有する」ポリペプチドをコードすることを直ちに認識する。実
際に、これらのヌクレオチド配列の縮重改変体の全てが同じポリペプチドをコー
ドするので、このことは、上記の比較アッセイを行うことすら必要なく、当業者
に明らかである。縮重改変体でないそのような核酸分子について、妥当な数がBC
SG1タンパク質活性を有するポリペプチドをコードすることもまた、当該分野で
さらに認識される。これは、当業者が、タンパク質の機能に有意に影響する可能
性が低いか、またはその可能性がないかのいずれかのアミノ酸置換（例えば、１
つの脂肪族アミノ酸の第二の脂肪族アミノ酸での置換）を十分に知っているから
である。
例えば、いかにしてアミノ酸置換を表現型的にサイレントにするかに関する手
引きが、Bowie，J．U.ら、「Deciphering the Message in Protein Sequences:T
olerance to Amino Acid Substitutions」Science 247:1306-1310(1990)に提供
され、ここで、その著者らは、タンパク質はアミノ酸置換に驚くほど寛容である
ことを示している。
ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明の単離されたDNA分子を含むベクター、この組換えベク
ターで遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術によるBCSG1ポリペプチド
またはそのフラグメントの産生に関する。
ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために、選択マーカーを含むベクタ
ーに結合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈澱物
のような沈澱物中か、または荷電された脂質との複合体中で導入される。ベクタ
ーがウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いてイ
ンビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
DNAインサートは、適切なプロモーター（例えば、少し名を挙げると、ファー
ジλPLプロモーター、E.coli lacプロモーター、trpプロモーター、およびtacプ
ロモーター、SV40初期プロモーターおよび後期プロモーター、ならびにレトロウ
イルスLTRのプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプ
ロモーターは、当業者に公知である。発現構築物は、さらに、転写開始、転写終
結のための部位、および、転写領域中に翻訳のためのリボゾーム結合部位を含む
。構築物によって発現される成熟型転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳さ
れるべきポリペプチドの始めに翻訳開始コドンを含み、そして終わりに適切に位
置される終止コドン(UAA、UGA、またはUAG)を含む。
示されるように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカ
ーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ
葉酸レダクターゼ、またはネオマイシン耐性、およびE.coliおよび他の細菌にお
ける培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子、またはアンピシリン耐性遺伝
子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例えば、E.coli
細胞、Streptomyces細胞、およびSalmonella typhimurium細胞）；真菌細胞（例
えば酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Drosophila S2細胞およびSpodoptera Sf9
細胞）；動物細胞（例えば、CHO細胞、COS細胞、およびBowes黒色腫細胞）；な
らびに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のため
の適切な培養培地および条件は当該分野で公知である。
本発明の実施における発現ベクターの使用に加えて、本発明はさらに、目的の
タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結するオペレーターお
よびプロモーターエレメントを含む新規な発現ベクターを含む。このようなベク
ターの一例として、以下で詳細に記述されるpHE4-5が挙げられる。
図３および４にまとめられるように、pHE4-5ベクター（配列番号10）の成分は
、以下を含む：１）選択マーカーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラー
ゼ遺伝子、２）E.coliの複製起点、３）T5ファージプロモーター配列、４）２つ
のlacオペレーター配列、５）Shine-Delgarno配列、６）ラクトースオペロン抑
制遺伝子(lacIq)。複製起点(oriC)は、pUC19(LTI，Gaithersburg，MD)に由来す
る。プロモーター配列およびオペレーター配列は、合成的に作製される。核酸配
列の合成的作製は、当該技術分野で周知である。CLONTECH 95/96 Catalog，215-
216頁，CLONTECH，1020 East Meadow Circle，Palo Alto，CA 94303。BSCG-1を
コードするヌクレオチド配列（配列番号１）は、pHE4-5ベクターのNdeIとAsp718
部位との間のヌクレオチド配列を挿入することによって、プロモーターおよびオ
ペレーターに作動可能に連結される。
上記で記載されるように、pHE4-5ベクターはlacIq遺伝子を含む。LacIqは、la
cオペレーターの厳密な調節をもたらすlacI遺伝子の対立遺伝子である。Amann,E
.ら、Gene 69:301-315(1988);Stark,M.,Gene 51:255-267(1987)。lacIq遺伝子は
、lacオペレーター配列に結合するリプレッサータンパク質をコードし、そして
下流（すなわち、３’）配列の転写をブロックする。しかし、lacIq遺伝子産物
は、
ラクトースまたは特定のラクトースアナログ(例えば、イソプロピルB-D-チオガ
ラクトピラノシド(IPTG))のいずれかの存在下ではlacオペレーターから解離する
。
従って、BSCG-1は、pHE4-5ベクターを含む非誘導宿主細胞では認識され得る量で
は産生されない。しかし、IPTGのような薬剤の添加によるこれらの宿主細胞の誘
導は、BSCG-1コード配列の発現を生じる。
pHE4-5ベクターのプロモーター／オペレーター配列（配列番号11）は、T5ファ
ージプロモーターおよび２つのlacオペレーター配列を含む。１つのオペレータ
ーは、転写開始部位の５’側に配置され、そして他方は同じ部位の３’側に配置
される。これらのオペレーターは、lacIq遺伝子産物との組合せで存在する場合
、lacオペロンインデューサー(例えば、IPTG)不在下での下流配列の厳密な抑制
をもたらす。lacオペレーターの下流に位置する作動可能に連結された配列の発
現は、lacオペロンインデューサー(例えば、IPTG)の添加により誘導され得る。l
acIqタンパク質へのlacインデューサーの結合は、lacオペレーター配列からのそ
れらの放出を生じ、そして作動可能に連結された配列の転写開始を生じる。遺伝
子発現のLacオペロン調節は、Devlin,T.,TEXTBOOK OF BIOCHEMISTRY WITH CLINI
CAL CORRELATIONS,第4版(1997),802-807頁で論じられている。
ベクターpHE4のシリーズは、pHE4-5ベクターの全ての成分（BSCG-1コード配列
を除く）を含む。pHE4ベクターの特徴は、最適化された合成T5ファージプロモー
ター、lacオペレーター、およびShine-Delagarno配列を含む。さらに、これらの
配列はまた、挿入された遺伝子の発現が厳密に調節され得、そして高レベルの発
現が誘導により生じるように最適に間隔があけられる。
本発明のタンパク質の産生での使用に適切な公知の細菌性プロモーターには、
E.coliのlacIおよびlacZプロモーター、T3プロモーターおよびT7プロモーター、
gptプロモーター、λPRプロモーターおよびλPLプロモーター、およびtrpプロモ
ーターが含まれる。適切な真核生物のプロモーターには、CMV前初期プロモータ
ー、HSVチミジンキナーゼプロモーター、SV40の早期および後期プロモーター、
レトロウイルスLTRのプロモーター（例えば、ラウス肉肺ウイルス(RSV)のプロモ
ーター）、ならびにメタロチオネインプロモーター（例えば、マウスメタロチオ
ネイン−Iプロモーター）が含まれる。
pHE4-5ベクターはまた、AUG開始コドンの５’側にShine-Delgarno配列を含む
。Shine-Delgarno配列は、一般にはAUG開始コドンのおよそ10ヌクレオチド上流
（すなわち、５’側）に配置される短い配列である。これらの配列は、AUG開始
コドンに対して原核生物のリボソームを本質的に指向する。
従って、本発明はまた、本発明のタンパク質の産生に有用な発現ベクターに関
する。本発明のこの局面は、pHE4-5ベクター（配列番号10）により例示される。
細菌における使用に好ましいベクターの中には、pQE70、pQE60、およびpQE-9（Q
iagenから入手可能）;pBSベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター
、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A（Stratageneから入手可能）;ならびにptrc99
a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmaciaから入手可能）が含まれる
。好ましい真核生物ベクターの中には、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、および
pSG（Stratageneから入手可能）;ならびにpSVK3、pBPV、pMSG、およびpSVL（Pha
rmaciaから入手可能）がある。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかで
ある。
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE
-デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェク
ション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によりもた
らされ得る。このような方法は、多くの標準的な実験室マニュアル(例えば、Dav
isら、Basic Methods In Molecular Biology(1986))に記載される。
ポリペプチドは、改変された形態（例えば、融合タンパク質）で発現され得、
そして分泌シグナルだけではなく、さらなる異種機能領域を含み得る。例えば、
さらなるアミノ酸（詳細には荷電アミノ酸）の領域は、宿主細胞中、精製の間、
またはその後の操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、ポ
リペプチドのN末端に付加され得る。また、ペプチド部分は、精製を容易にする
ためにポリペプチドに付加され得る。このような領域は、ポリペプチドの最終調
製に先だって除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じるため、安定性を
改善するため、および精製を容易にするための、ポリペプチドへのペプチド部分
の付加は、当該分野でよく知られており、そして日常的な技術である。好ましい
融合タンパク質は、タンパク質を可溶化するために有用な免疫グロブリン由来の
異種領域を含む。例えば、EP-A-0 464533(カナダ対応出願2045869)は、免疫グロ
ブリン分子の定常領域の種々の部分を別のヒトタンパク質またはその部分と一緒
に含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質におけるFc部分
は、治療および診断での使用について完全に都合良く、従って、例えば、改善さ
れた薬物動態学的特性を生じる（EP-A 0232 262）。一方、いくつかの使用につ
いては、融合タンパク質が、記載される都合の良い様式で発現、検出、および精
製された後に、Fc部分を欠失し得ることが所望される。これは、Fc部分が治療お
よび診断での使用に対する妨害であると判明する場合、例えば、融合タンパク質
が免疫化のための抗原として使用される場合である。薬物探索では、例えば、ヒ
トタンパク質（例えば、hIL-5レセプター）が、hIL-5のアンタゴニストを同定す
るための高処理量スクリーニングアッセイの目的のために、Fc部分と融合された
。D.Bennettら、Journal of Molecular Recognition,第8巻:52-58(1995)およびK
.Johansonら、The Journal of Biological Chimistry,第270巻、第16号:9459-94
71(1995)を参照のこと。
BCSG1タンパク質は、硫酸アンモニウム沈澱、またはエタノール沈澱、酸抽出
、アニオン交換クロマトグラフィー、またはカチオン交換クロマトグラフィー、
ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、
およびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法により組換え細胞培養物か
ら回収および精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「
HPLC」）が精製に使用される。本発明のポリペプチドは、天然から精製された生
成物、化学的合成手順の生成物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例え
ば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む
）から、組換え技術により産生される生成物を含む。組換え産生手順に使用され
る宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されてもよいし、グ
リコシル化されなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドはまた、いくつか
の場合では宿主媒介性プロセスの結果として、改変された開始メチオニン残基を
含み得る。
BCSG1ポリペプチドおよびフラグメント
本発明は、寄託されたcDNAクローンによりコードされるアミノ酸配列、または
図１（配列番号２）で示されるアミノ酸配列、または上記のポリペプチドの一部
を含むペプチドもしくはポリペプチドを有する、単離されたBCSG1ポリペプチド
をさらに提供する。
BCSG1ポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列は、タンパク質の構造または機
能に重大な影響を与えることなく変更され得ることが当該分野で認識される。配
列でのこのような差異が意図される場合、タンパク質には、活性を決定する重要
な領域があることを思い出すべきである。
従って、本発明は、実質的なBCSG1ポリペプチド活性を示すか、またはBCSG1タ
ンパク質の領域（例えば、以下で議論されるタンパク質部分）を含む、BCSG1ポ
リペプチドの改変体をさらに含む。このような変異体は、欠失、付加、反転、反
復、およびタイプ置換を含む。上記で示したように、どのアミノ酸の変化が表現
型的にサイレントであるようであるかに関連するガイダンスが、Bowie,J.U.ら、
「Deciphering the Message in Protein Sequences:Tolerance to Amino Acid S
ubstitutions」、Science 247:1306-1310(1990)で見出され得る。
従って、図１（配列番号２）の、または寄託されたcDNAによりコードされるポ
リペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つ以上のアミノ
酸残基が、保存的アミノ酸残基または非保存的アミノ酸残基と置換され（好まし
くは、保存的アミノ酸残基）、そしてこのような置換されたアミノ酸残基が、遺
伝コードによりコードされてもよいし、コードされなくてもよいもの、または（
ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）ポリペプ
チドが別の化合物（例えば、ポリペプチドの半減期を長くするための化合物（例
えば、ポリエチレングリコール））と融合されたもの、または（ｉＶ）さらなる
アミノ酸がポリペプチド（例えば、IgG Fc融合領域ペプチド、またはリーダー配
列、もしくは分泌配列、またはポリペプチドの精製について使用される配列、ま
たはプロタンパク質配列）に融合されるものであり得る。このようなフラグメン
ト、誘導体、およびアナログは、本明細書の教示から、当業者の範囲内にあると
考えられる。
特に興味深いのは、荷電アミノ酸の別の荷電アミノ酸および中性または負に荷
電したアミノ酸への置換である。後者は、減少した正電荷を有し、BCSG1タンパ
ク質の特徴が改良されたタンパク質を生じる。凝集の防止は、非常に望ましい。
タンパク質の凝集は、活性の損失を生じるだけではなくそれらが免疫原性であり
得るので、薬学的処方物を調製する場合にも問題であり得る(Pinckardら、Clin
Exp.Immunol.2:331-340(1967);Robbinsら、Diabetes 36:838-845(1987);Cleland
ら、Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377(1993))。
示されるように、変更は、好ましくは、重要ではない性質についてである（例
えば、タンパク質のフォールディングまたは活性には重大な影響を与えない保存
的アミノ酸の置換（表１を参照のこと））。
表１。保存的アミノ酸置換 当然、当業者は、アミノ酸置換の数を上記で記載される因子を含む多くの因子
に依存させる。一般には、任意の所定のAIM-IIポリペプチドについての置換の数
は、50、40、30、25、20、15、10、5、または3より多くない。
本発明のBCSG1タンパク質の機能に必須のアミノ酸は、当該分野で公知の方法
（例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャン変異誘発(Cunninghamお
よびWells,Science 244:1081-1085(1989))により同定され得る。後者の手順は、
分子のすべての残基に単一のアラニン変異を導入する。次いで、得られた変異体
分子は生物学的活性（例えば、レセプター結合またはインビトロでの増殖活性）
について試験される。リガンド−レセプター結合に重要な部位はまた、構造分析
（例えば、結晶化、核磁気共鳴、またはフォトアフィニティーラベル(Smithら、
J.Mol.Biol.224:899-904(1992)およびde Vosら、Science 255:306-312(1992))に
より決定され得る。
本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離された形態で提供される。「単離
されたポリペプチド」とは、その天然環境から取り出されたポリペプチドを意図
する。従って、組換え宿主細胞内で産生される、および／または含まれるポリペ
プチドは、本発明の目的のために単離されたとみなされる。「単離されたポリペ
プチド」として意図されるのはまた、組換え宿主細胞から、または天然の供絵源
から部分的または実質的に精製されたポリペプチドである。例えば、BCSG1ポリ
ペプチドの組換え産生版は、SmithおよびJohnson,Gene 67:31-40(1988)に記載さ
れるワンステップ法により実質的に精製され得る。
本発明のポリペプチドは、寄託されたcDNAによってコードされるポリペプチド
；配列番号２（図１）のアミノ酸のほぼ１〜ほぼ１２７を含むポリペプチド；配
列番号２のアミノ酸のほぼ2〜ほぼ127を含むポリペプチド；ならびに寄託された
cDNAによってコードされるポリペプチドに対して、図１（配列番号２）のポリペ
プチドに対して、少なくとも80％同一、より好ましくは、少なくとも90％または
95％同一、なおより好ましくは少なくとも96％、97％、98％、または99％同一で
あるポリペプチドを含み、そしてまた、少なくとも30アミノ酸、およびより好ま
しくは少なくとも50アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの部分を含む。
BCSG1ポリペプチドの参照アミノ酸配列に対して、少なくとも、例えば、95％
「同一の」アミノ酸配列を有するポリペプチドにより、そのポリペプチド配列が
、BCSG1ポリペプチドの参照アミノ酸配列の各100アミノ酸毎に５つまでのアミノ
酸変化を含み得ることを除いて、そのポリペプチドのアミノ酸配列は参照配列と
同一であることが意図される。言い換えれば、参照アミノ酸配列に対して少なく
とも95％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列にお
いて５％までのアミノ酸残基が、欠失され得るかもしくは別のアミノ酸で置換さ
れ得、または参照配列における総アミノ酸残基の５％までの多数のアミノ酸が参
照配列に挿入され得る。これらの参照配列の変化は、参照アミノ酸配列のアミノ
末端位置もしくはカルボキシ末端位置で、または参照配列の残基間で個々に、も
しくは参照配列内で１つ以上の隣接した基内のいずれかで散在した、これらの末
端位置の間のどこかで起こり得る。
実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、図ｌ（配列番号２）
に示されるアミノ酸配列、または寄託されたcDNAクローンによりコードされるア
ミノ酸配列に対して、少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、または99％同
一であるかどうかは、Bestfitプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Packa
ge，Version 8 for Unix、Genetics Ccmputer Group，University Research Par
k，575 Science Drive，Madison，WI 53711）のような公知のコンピュータープ
ログラムを使用して従来通りに決定され得る。特定の配列が、本発明の参照配列
に対して、例えば、95％同一であるかどうかを決定するために、Bestfltまたは
任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、当然のことながら、
同一性のパーセンテージが参照アミノ酸配列の全長にわたって計算され、そして
参照配列内のアミノ酸残基の総数の５％までの相同性におけるギャップが許容さ
れるようにパラメーターが設定される。
本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いるSDS-PAGEゲル、または
分子ふるいゲル濾過カラム上で分子量マーカーとして使用され得る。
別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を
含む、ペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピト
ープは、明細書中に記載のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピトープであ
る。「免疫原性エピトープ」は、タンパク質全体が免疫原である場合、抗体応答
を誘発するタンパク質の一部として定義される。一方では、抗体が結合し得る、
タンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」と定義される。タンパク質の免
疫原性エピトープの数は、一般には、抗原性エピトープの数よりも少ない。例え
ば、Geysenら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:3998-4002（1983）を参照のこ
と。
抗原性エピトープを保有する（すなわち、抗体が結合し得るタンパク質分子の
領域を含む）ペプチドまたはポリペプチドの選択については、タンパク質配列の
一部を模倣する相対的に短い合成ペプチドが、部分的に模倣されるタンパク質と
反応する抗血清を日常的に惹起し得ることが当該分野で周知である。例えば、Su
tcliffe,J.G.,Shinnick,T.M.,Green,N.およびLearner,R.A.(1983)Antibodies th
at react with predetermined sites on proteins.Science 219:660-666を参照
のこと。タンパク質反応性血清を惹起し得るペプチドは、タンパク質の一次配列
中で頻繁に示され、１揃いの簡単な化学法則により特徴づけられ得、そしてイン
タクトなタンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトープ）に対して
も、アミノ末端またはカルボキシル末端に対しても限定されない。
本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、それゆえ、本
発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む、抗体を惹起
するために有用である。例えば、Wilsonら、Cell 37:767-778(1984)777頁を参照
のこと。
本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、好ましくは本
発明のポリペプチドのアミノ酸配列中に含まれる、少なくとも７つ、より好まし
くは少なくとも９つ、そして最も好ましくは少なくとも約15〜約30アミノ酸の配
列を含む。
BCSG1特異的抗体を産生するために使用され得る抗原性ポリペプチドまたは抗
原性ペプチドの制限しない例は、以下を含む：図１（配列番号２）のほぼ94〜ほ
ぼ107のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図１（配列番号２）のほぼ120〜ほぼ
127のアミノ酸残基を含むポリペプチド。上記で示されるように、本発明者らは
、上記のポリペプチドフラグメントがBCSG1タンパク質の抗原性領域であること
を決定した。
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の従来の方法に
より産生され得る。Houghten,H.A.(1985)General method for the rapid solid-
phase synthesis of large numbers of peptides:specificity of antigen-anti
body interaction at the level of individual amino acids．Proc．Natl．Aca
d．Sci．USA 82:5131-5135。この「多ペプチド同時合成（Simultaneous Multipl
e Peptide Synthesis）（SMPS）」手順は、Houghtenら、（1986）に対する米国
特許第4,631,211号にさらに記載されている。
当業者に明らかなように、上記の本発明のBCSG1ポリペプチドおよびそのエピ
トープ保有フラグメントは、免疫グロブリン（IgG）の定常ドメインの部分と組
み合わされてキメラポリペプチドを産生し得る。これらの融合タンパク質は精製
を容易にし、そしてインビボで増加した半減期を示す。このことは、例えば、ヒ
トCD4ポリペプチドの初めの２つのドメインおよびヒト免疫グロブリンの重鎖ま
たは軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示され
ている（EPA 394,827；Trauneckerら、Nature 331:84-86(1988))。IgG部分に起
因するジスルフィド結合型２量体構造を有する融合タンパク質もまた、単量体BC
SG1タンパク質以外の分子またはタンパク質フラグメント単独との結合および中
和においてより効率的であり得る（Fountoulakisら、J.Biochem 270:3958-3964(
1995)）。
癌の診断および予後
腫瘍の発症に影響を与える遺伝子には２つのクラスがある。DNAレベルでの変
化の結果（例えば、変異）として直接的に作用する癌表現型に影響を与える遺伝
子（例えば、BRCA1、BRCA2、およびp53）は、クラスＩ遺伝子と呼ばれる。クラ
スII遺伝子は、発現レベルでの調節によって表現型に影響し得る。乳癌の発症お
よび引き続いての悪性への進行は、両方のクラスの種々の遺伝子の変化に関連す
る。悪性乳腺に生じる遺伝子発現における量的変化の同定は、うまく特徴付けら
れた場合、ヒト乳癌の診断および処置に有用であり得る新規の分子マーカーをも
たらし得る。
本発明者らは、進行した浸潤性乳癌細胞において過剰発現される新規の乳癌マ
ーカーを同定した。正常なまたは良性の胸部上皮細胞におけるBCSG1の発現の欠
損および低度の上皮内癌（low grade in situ carcinoma）における弱い発現は
、BCSG1の過剰発現が乳癌悪性進行を示すことを示唆する。（実施例６および７
を参照のこと）。細胞増殖の２次的な影響としてBCSG1が過剰発現されていると
いうことはおそらく無い。なぜならば、迅速に増殖している非悪性胸部病変には
BCSG1の検出可能な発現は明らかでないからである。（実施例７を参照のこと）
。
BCSG1は、乳癌の臨床的管理および処置に有用であり得る。この点に関して、B
CSG1転写物の発現は、浸潤性乳癌の新生物上皮細胞には観察されるが、正常およ
び良性胸部組織の上皮細胞には観察されなかった。（実施例７を参照のこと）。
低度の上皮内癌における低いレベルの発現と比較した、悪性浸潤性胸部上皮細胞
におけるBCSG1の過剰発現は、BCSG1発現のアップレギュレーションが胸部悪性進
行に関連し、そしてヒト乳癌のより進行した浸潤／転移表現型をシグナル伝達し
得ることを示唆する。この示唆は、４つの腺管浸潤性癌腫由来乳癌細胞株のうち
４つでBCSG1の発現が検出されるが、初期固形癌腫由来乳癌細胞株では検出され
ない（０／３）ことによりさらに支持される（実施例６を参照のこと）。腺管上
皮内癌（DCIS）におけるBCSG1の過剰発現は、転移を導く悪性進行を示し得る。D
CISの発生率における注目すべき増加が、1980年代の初期に始まった（Emster、V
．L.、ら、JAMA 275:913-918(1996)）。1992年の米国におけるDCIS事例の評価総
数は、1983年の割合および1973〜1983年の間の傾向に基づく予想よりも200％高
かった（Emster、V.L.、ら、JAMA 275:913-918(1996)）。浸潤性乳癌の早期検出
が有益である一方で、DCISの検出の有用性は現在のところ未知である。乳房Ｘ線
撮影のスクリーニングの結果として診断される、多数のDCIS事例について懸念の
理由がある。そのほとんどはいくつかの外科手術の形態で処置される。さらに、
乳房切除によって処置される事例の割合は、不適当に高いかもしれない（Emster
、V.L.、ら、JAMA 275:913-918(1996)）。BCSG1の発現は、浸潤性になりそうに
ないDCISと、非常に浸潤性になる可能性があるDCISとを区別することに関してい
くらかの診断的情報を提供し得、このことはいくらかの不適当な乳房切除または
不要な乳房切除を減少させるために役立つ。さらに、BCSG1遺伝子の使用は、異
常な増殖性胸部病変を癌と区別するために非常に重要であり得、そして異常性の
可能性について胸部生体検査のスクリーニングに有用であり得る。
BCSG1遺伝子の推定アミノ酸配列が、最近クローニングされたアルツハイマー
病（AD）アミロイド前駆体タンパク質の非Aβ成分と高い配列相同性を共有する
ことに留意することは興味深い（Ueda、K.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90(23):
11282-6(1993)）。ADの神経病理学的特徴は、β−アミロイド前駆体タンパク質
（βAPPS）により生じる広範なアミロイド沈着である。βAPPは、大型の膜貫通
タンパク質であり、これはβA4ペプチド（ABフラグメント）（Masters、C.L.、
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：4245-4249(1985)）またはADアミロイドの非A
β成分(Ueda、K.、ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA．90(23):11282-6(1993)）のい
ずれかを生じ、ADアミロイドプラーク中に堆積するか、または可溶性形態を生じ
るかのいずれかである。不溶性膜結合型ADアミロイドは、カルシウム定常性を不
安定にし、従って、エネルギー欠乏もしくは過剰興奮から生じるカルシウム流入
の興奮毒性状態に対して細胞を脆弱にする（Mattson、M.P.ら、Ann.N.Y.Acad.Sc
i.679:121(1993)）一方、可溶性ADアミロイドタンパク質は、グルコース欠乏
およびグルタミン酸毒性に対して、おそらく神経細胞内カルシウム濃度を下げる
能力を介することによって、神経保護的である（Barger、S.W.、J.Neurochem．6
4:2087-96(1995)）。BCSG1は、可溶性ADアミロイドのように、局部的癌侵襲に起
因して組織再構築により生じる組織損傷に、おそらく関与し得る可能性がある。
それにもかかわらず、実施例６および７は、段階特異的なBCSG1発現、およびBCS
Gl過剰発現と乳癌の臨床的病原力との関連を証明する。BCSG1過剰発現は、良性
乳癌もしくは低度の上皮内癌から高度に浸潤性の癌肺への乳癌悪性進行を示し得
る。
実施例は、癌を有する哺乳動物内の特定の組織が、対応する「標準的な」哺乳
動物、すなわち癌を有さない同種の哺乳動物と比較した場合に、有意に増強され
たレベルのBCSG1タンパク質およびBCSG1タンパク質をコードするmRNAを発現する
ことを実証する。さらに、BCSG1タンパク質の増強されたレベルは、癌を有さな
い同種の哺乳動物由来の血清と比較した場合、癌を有する哺乳動物由来の特定の
体液（例えば、血清、血漿、尿、および髄液）中で検出され得ると考えられる。
従って、本発明は、腫瘍の診断中に有用な診断方法を提供し、これは哺乳動物細
胞中または体液中のBCSG1タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルをアッセ
イする工程、およびその遺伝子の発現レベルを標準的なBCSG1遺伝子発現レベル
と比較する工程を包含し、それによって標準を超える遺伝子発現レベルの増加が
特定の腫瘍を示す。
腫瘍の診断がすでに従来法に従って行われている場合、本発明は予後の指標と
して有用であり、それによって、増強されたBCSG1遺伝子発現を示す患者は低い
レベルで遺伝子を発現する患者と比較して、より悪い臨床的結果を経験する。
「BCSG1タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイする」によっ
て、第一の生物学的サンプル中のBCSG1タンパク質のレベルまたはBCSG1タンパク
質をコードするmRNAのレベルを、直接的（例えば、絶対タンパク質レベルまたは
mRNAレベルの決定または評価によって）または相対的（例えば、第二の生物学的
サンプル中のBCSG1タンパク質レベルまたはmRNAレベルに対する比較による）の
いずれかで、定性または定量的に測定または評価することを意図する。
好ましくは、第一の生物学的サンプル中のBCSG1タンパク質レベルまたはmRNA
レベルは、測定および評価され、標準BCSG1タンパク質レベルまたはmRNAレベル
と比較され、この標準は、癌を有さない個体から得た第二の生物学的サンプルか
ら得られる。当該分野で認識されるように、一旦標準BCSG1タンパク質レベルま
たはmRNAレベルが判明すると、それは比較のための標準として繰り返し使用され
得る。
「生物学的サンプル」によって、BCSG1タンパク質またはmRNAを含有する、個
体、細胞株、組織培養物、またはその他の供給源から得られた、任意の生物学的
サンプルが意図される。生物学的サンプルは、分泌型成熟BCSG1タンパク質を含
有する哺乳動物体液（血清、血漿、尿、滑液、および髄液のような）、ならびに
卵巣、前立腺、心臓、胎盤、膵臓、肝臓、脾臓、肺、胸部、および臍帯組織を包
含する。
本発明は、哺乳動物における癌の検出に有用である。特に、本発明は、哺乳動
物における以下の型の癌の診断に有用である：胸部、卵巣、前立腺、骨、肝臓、
肺、膵臓性、および脾臓性。好ましい哺乳動物には、有尾猿、無尾猿、ネコ、イ
ヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギおよびヒトが含まれる。特に好ましいのはヒトで
ある。
全細胞RNAが、ChomczynskiおよびSacchi、Anal．Biochem．162:156-159(1987)
に記載されている単一工程のグアニジン−チオシアネート−フェノール−クロロ
ホルム法を使用して生物学的サンプルから単離され得る。次いで、BCSG1タンパ
ク質をコードするmRNAのレベルが、任意の適切な方法を用いてアッセイされる。
これらは、ノーザンブロット分析（Haradaら、Cell 63:303-312(1990)）、S1ヌ
クレアーゼマッピング(Fujitaら、Cell 49:357-367(1987))、ポリメラーゼ連鎖
反応（PCR）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（RT-PCR）（Makino
ら、Technique 2:295-301(1990)）、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆
転写（RT-LCR）を含む。
生物学的サンプル中のBCSG1タンパク質レベルのアッセイは、抗体に基づく技
術を用いて実施され得る。例えば、組織でのBCSG1タンパク質発現は、古典的な
免疫組織学的方法によって研究され得る（Jalkanen、M.ら、J．Cell．Biol．101
:976-985(1985);Jalkanen、M.ら、J．Cell．Biol．105:3087-3096(1987)）。
BCSG1タンパク質遺伝子発現を検出するために有用なその他の抗体に基づく方
法は、イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）およびラジ
オイムノアッセイ（RIA））を包含する。
適切な標識は、当該分野で公知であり、グルコースオキシダーゼのような酵素
標識、およびヨウ素（125I、121I）、炭素（14C）、イオウ（35S）、トリチウム
（3H）、インジウム（112In）、およびテクネチウム（99mTc）のようなラジオア
イソトープ、およびフルオレセインおよびローダミンのような蛍光標識、および
ビオチンを包含する。
染色体アッセイ
本発明の核酸分子はまた、染色体の同定に有益である。配列は、個々のヒト染
色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてその位置にハイブリダイズし
得る。本発明によるDNAの染色体へのマッピングは、これらの配列と疾患に関連
する遺伝子との相関付けにおいて重要な第１工程である。
この点における特定の好ましい実施態様において、本明細書中に開示されるcD
NAは、BCSG1タンパク質遺伝子のゲノムDNAをクローニングするために使用される
。これは、種々の周知の技術およびライブラリー（これらは、一般に市販されて
いる）を使用して達成され得る。次いで、ゲノムDNAは、この目的のための周知
の技術を使用してインサイチュ染色体マッピングのために使用される。
さらに、いくつかの場合において、配列は、cDNAからPCRプライマー（好まし
くは、15〜25bp）を調製することにより、染色体にマッピングされ得る。遺伝子
の3'非翻訳領域のコンピューター分析を用いて、ゲノムDNAにおいて１つを超え
るエキソンにまたがらず、従って増幅プロセスを複雑化することのないプライマ
ーを迅速に選択する。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有
する体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングのために用いられる。
中期染色体拡がりに対するcDNAクローンの蛍光インサイチュハイブリダイセー
ション（「FISH」）は、一工程で、正確な染色体位置を提供するために用いられ
得る。この技術は、50または60bp程度の短さのcDNA由来のプローブと共に用いら
れ得る。この技術の概説については、Vermaら、Human Chromosomes:A Manual O
f Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)を参照のこと。
一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理
的な位置は、遺伝子マップデータと相関づけられ得る。このようなデータは、例
えば、V．McKusick，Mendelian Inheritance In Man（Johns Hopkins Universit
y，Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能である）に見出される。次
いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関連が、連鎖分
析（物理的に隣接した遺伝子の共同遺伝）によって同定される。
次に、罹患個体と非罹患個体との間でのcDNAまたはゲノム配列における差異を
決定することが必要である。変異が罹患個体のいくらかまたは全てにおいて認め
られるが、いずれの正常個体でも認められない場合、変異はおそらく疾患の原因
因子である。
本発明を一般的に記載したが、本発明は、以下の実施例を参照することにより
、より迅速に理解される。以下の実施例は、例示の目的で提供され、限定である
とは意図されない。
実施例
実施例１：E.coliにおけるBCSG1の発現および精製
細菌性発現ベクターpQE9(pD10)を、本実施例の細菌性発現のために使用する（
QIAGEN，Inc.,9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311）。pQE9はアンピシリ
ン抗生物質耐性(「Ampr」)をコードし、そして細菌の複製起点(「ori」)、IPTG
誘導性プロモーター、リボソーム結合部位（「RBS」）、QIAGEN Inc．（前出）
から販売されているニッケル-ニトリロ-三酢酸（「NI-NTA」）アフィニティー樹
脂を用いてアフィニティー精製を可能にする、ヒスチジン残基をコードする６つ
のコドン、および適切な単一の制限酵素切断部位を含む。これらのエレメントは
、ポリペプチドをコードする、挿入されたDNAフラグメントが、このポリペプチ
ドのアミノ末端に共有結合した６つのHis残基（すなわち、「６×Hisタグ」）を
有するこのポリペプチドを発現するように、配置される。
BCSG1タンパク質配列の所望の部分をコードするDNA配列を、BCSG1タンパク質
の所望の部分のアミノ末端配列、およびcDNAコード配列の3'側の寄託された構築
物中の配列にアニーリングするPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、寄
託されたcDNAクローンから増幅する。pQE9ベクターにおけるクローニングを容易
にする制限部位を含むさらなるヌクレオチドを、それぞれ、5'および3'プライマ
ー配列に付加する。
成熟タンパク質をクローニングするために、5'プライマーは、下線を付したBa
mHI制限部位、続いて図１のBCSG1配列のアミノ末端コード配列に相補的な16ヌク
レオチドを含む、配列5'GGGGATCCATGTTTTCAAGAAGG3'（配列番号３）を有する。
当然のように、5'プライマーが開始させるタンパク質コード配列の位置は、この
タンパク質より短いかまたは長い、完全なBCSG1タンパク質の任意の所望の部分
をコードするDNAセグメントを増幅するために変動され得ることを、当業者は認
識する。3'プライマーは、下線を付したHindIII制限部位、続いて図１のBCSG1 D
NA配列の非コード配列に相補的な19ヌクレオチドを含む、配列5'GGAAGCTTCTAGTC
TCCCCCACTCTGG3'（配列番号４）を有する。
増幅されたBCSG1 DNAフラグメントおよびベクターpQE9をBamHI/HindIIIで消化
、次いで消化されたDNAを一緒に連結する。制限化されたpQE9ベクターへBCSG1 D
NAを挿入することによって、IPTG誘導性プロモーターの下流および開始AUGコド
ンおよび６ヒスチジンコドンにインフレームに、BCSG1タンパク質コード領域を
配置する。
連結混合物を、Sambrookら、Molecular Cloning:a Laboratory Manual、第２
版；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y．（1989
）に記載されるような標準的な手順を用いて、コンピテントなE.coll細胞に形質
転換する。複数のコピーのプラスミドpREP4（これは、lacリプレッサーを発現し
、そしてカナマイシン耐性（「Kanr」）を付与する）を含有するE.coli株M15/re
p4を本明細書中に記載の例示的実施例を行うにあたって使用する。この株（これ
は、BCSG1タンパク質を発現するために適切である多くの株の内の唯一の１つで
ある）は、QIAGEN Inc.，（前出）から市販されている。形質転換体を、アンピ
シリンおよびカナマイシンの存在下でLBプレート上で増殖するそれらの能力によ
り同定する。プラスミドDNAを耐性コロニーから単離し、そしてクローニングさ
れたDNAの同一性を、制限分析、PCRおよびDNA配列決定により確認する。
所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン（100μg/ml）およびカナマイ
シン（25μg/ml）の両方を補充したLB培地における液体培養物中で一晩（「O/N
」）増殖させる。O/N培養物を用いて約1:25〜1:250の希釈で大規模培養物に接種
する。細胞を、0.4と0.6との間の、600nmでの光学密度（「OD600」）にまで増殖
させる。次いで、イソプロピル-b-D-チオガラクトピラノシド（「IPTG」）を１m
Mの最終濃度で加えて、lacIリプレッサーを不活化することにより、lacリプレッ
サー感受性プロモーターからの転写を誘導する。細胞をさらに３〜４時間の間引
き続きインキュベートする。次いで細胞を遠心分離により採集する。
次いで、細胞をpH8の６Ｍグアニジン-HCl中で、４℃にて３〜４時間撹拌する
。細胞細片を遠心分離により除去し、そしてBCSG1を含む上清をニッケル−ニト
ロ−三酢酸（「NiNTA」）アフィニティー樹脂カラム（QIAGEN，Inc．（前出）か
ら入手可能）へ入れる。６×His Tagを有するタンパク質は、高い親和性でNI-NT
A樹脂へ結合し、そして、単純な一工程手順で精製され得る（詳細については、T
he QIAexpressionist，1995，QIAGEN，Inc.、（前出）を参照のこと）。簡単に
いうと、この上清をpH8の６Ｍグアニジン-HCl中のカラムへヘ入れる。このカラ
ムを、最初に10容量のpH8の６Ｍグアニジン-HClで洗浄し、次いで10容量のpH6の
６Ｍグアニジン-HClで洗浄し、そして最終的に、このBCSG1をpH5の６Ｍグアニジ
ン-HClで溶出する。
次いで、この精製したタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)または50m
M酢酸ナトリウム（pH6）緩衝液＋200mM NaClに対してタンパク質を透析すること
により再生する。あるいは、タンパク質をNi-NTAカラムに固定化する間に、首尾
良く再び折り畳みさせ得る。推奨される条件は以下である：プロテアーゼインヒ
ビターを含む、500mM NaCl、20%グリセロール、20mM Tris/HCl pH7.4中で、6M尿
素から1M尿素への直線勾配を使用する再生。再生は1.5時間以上の期間にわたり
実施すべきである。再生後、このタンパク質を250mMのイミダゾールの添加によ
り溶出し得る。イミダゾールを、PBSまたは50mM酢酸ナトリウム(pH6)緩衝液＋20
0mM NaClに対する最終透析工程により除去する。精製したタンパク質は４℃で保
存するかまたは-80℃で凍結する。
実施例２：バキュロウイルス発現系におけるBCSG1タンパク質のクローニング
および発現
この例示的実施例において、バキュロウイルスリーダーおよびSummerら、A Ma
nual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedur
es、Texas Agricultural Experimental Station Bulletin第1555号(1987)に記載
のような標準的な方法を用いて、タンパク質をコードするクローニングされたDN
Aを、プラスミドシャトルベクタ−pA2GPを用いてバキュロウイルスに挿入し、BC
SG1タンパク質を発現させる。この発現ベクターは、Autographa californica核
多角体病ウイルス(AcMNPV)の強力なポリヘドリンプロモーターを含み、続いてバ
キュロウィルスgp67タンパク質の分泌シグナルペプチド（リーダー）ならびにBa
mHI、XbaI、およびAsp718のような都合良い制限部位を含む。サルウイルス40（
「SV40」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。
組換えウイルスの平易な選択のために、プラスミドは、同じ方向で、弱いDrosop
hilaプロモーターの制御下で、E.coli由来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を含み
、続いて、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む。挿入遺伝子は
、野生型ウイルスのDNAとの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列の両側
に隣接し、クローニングされたポリヌクレオチドを発現する生存ウイルスを産生
する。
当業者に容易に理解されるように、構築物が、必要に応じて、シグナルペプチ
ドおよびインフレームAUGを含む、転写、翻訳、分泌などのための適切に配置さ
れたシグナルを提供する限り、多くの他のバキュロウイルスベクターを、上記の
ベクター（例えば、pAc373、pVL941、およびpAcIM1）の代わりに用い得る。この
ようなベクターは、例えば、Luckowら、Virology 170:31〜39に記載される。
図１（配列番号２）に示す寄託されたクローン中のBCSG1タンパク質をコード
するcDNA配列を、遺伝子の5'配列および3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いて増幅する。
5'プライマーは、下線を付したBamHI制限酵素部位、続いて、BCSG1タンパク質
のN-末端が開始する、図１に示すBCSG1タンパク質配列の16塩基を含む、配列5'G
GGGATCCcGATGTTTTCAAGAAGG 3'（配列番号５）（小文字「c」はコードフレーム
を保存するために含まれるヌクレオチド）を有する。3'プライマーは、下線を付
したAsp718制限部位、続いて図１の3'非コード配列に相補的な18ヌクレオチドを
含む、配列5'GGGGTACCCTAGTCTCCCCCACTCTGG 3'（配列番号６）を有する。
増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.，La
Jolla，Ca）を用いて１％アガロースゲルから単離する。次いで、このフラグメ
ントをBamHI／Asp718で消化し、そして再度１％アガロースゲル上で精製する。
このフラグメントを、本明細書中では「F1」と称する。
プラスミドを、制限酵素BamHI／Asp718で消化し、そして必要に応じて、当該
分野で公知の日常的な手順を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸
化し得る。次いで、このDNAを市販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.，La J
olla，Ca）を用いて１％アガロースゲルから単離する。このベクターDNAを、本
明細書中では「V1」と称する。
フラグメントF1および脱リン酸化プラスミドV1を、一緒に、T4 DNAリガーゼで
連結する。E.coli HB101またはXL-1Blue（Stratagene Cloning Systems，La Jol
la，CA）のような他の適切なE.coli宿主細胞を、連結混合物で形質転換し、そし
て培養プレートに塗布する。プライマーの１つは遺伝子を増幅するために使用し
、そして２番目のプライマーはベクター内well由来であり、BCSG1遺伝子フラグ
メントを含むこれらの細菌コロニーのみがDNAの増幅を示すようなPCR法を用いて
、ヒトBCSG1遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を同定する。クローニングさ
れたフラグメントの配列を、DNA配列決定によって確認する。このプラスミドを
、本明細書中ではpBac-BCSG1と称する。
５μgのプラスミドpBac-BCSG1を、FelgnerらProc．Natl．Acad．Sci．USA 84:
7413-7417(1987)によって記載されるリポフェクション法を用いて、1.0μgの市
販の線状化バキュロウイルスDNA（「BaculoGoldTMbaculovirus DNA」，Pharming
en，San Diego，CA.）とともに同時トランスフェクトする。1μgのBaculoGoldTM
ウイルスDNAおよび５μgのプラスミドpBacBCSG1を、50μlの無血清グレース培地
（Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD）を含むマイクロタイタープレー
トの無菌ウェル中で混合する。その後、10μlのリポフェクチンおよび90μlのグ
レース培地を添加し、混合し、そして室温にて15分間インキュベートする。次い
で、このトランスフェクション混合物を、無血清グレース培地１mlを有する35mm
組織培養プレート内に播種されたSf9昆虫細胞（ATCC CRL 1711）に滴下する。プ
レートを揺らして新規に加えた溶液を混合する。次いでプレートを、27℃で５時
間インキュベートする。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除
去し、そして10％ウシ胎児血清を補充した１mlのグレース昆虫培地を添加する。
プレートをインキュベーターに戻し、そして27℃で４日間培養を続ける。
４日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith（前出）に記載されるよう
にプラークアッセイを行う。青く染色されたプラークを産生するgal発現クロー
ンの容易な同定および単離を可能にするために、「Blue Gal」（Life Technolog
ies Inc.，Gaithersburg）を有するアガロースゲルを用いる。（このタイプの「
プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、Life Technologies Inc.、Gaithersbu
rg、で配布される昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学のための使用者ガイド
（９〜10頁）においても見い出され得る）。適切なインキュベーションの後、青
く染色されたプラークをマイクロピペッターの（例えば、エッペンドルフ）チッ
プで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、200μｌのグレース培地を含
む微小遠心管中に再懸濁する。そして、組換えバキュロウイルスを含む懸濁液を
用いて、35mmディッシュに播種されたSf9細胞を感染させる。４日後、これらの
培養ディッシュの上清を回収し、次いでそれらを４℃で保存する。この組換えウ
イルスをV-BCSG1と称する。
BCSG1遺伝子の発現を確認するために、Sf9細胞を、10％熱非働化FBSを補充し
たグレース培地中で増殖させる。細胞を、約２の感染多重度（「MOI」）で組換
えバキュロウイルスV-BCSG1で感染させる。６時間後、その培地を除去し、そし
てメチオニンおよびシステインを除いたSF900 II培地（Life Technologies Inc.
，Rockville，MDから入手可能）に置き換える。放射性標識タンパク質が所望さ
れる場合、42時間後、５μCiの35Ｓ-メチオニンおよび５μCiの35Ｓ-システイン
（Amershamから入手可能）を添加する。細胞をさらに16時間インキュベートし、
次いで細胞を遠心分離により収集する。上清中のタンパク質および細胞性のタン
パク質をSDS-PAGE、続いて（放射性標識された場合）オートラジオグラフィーに
より分析する。精製タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の微小配列決定を用
い
て、成熟タンパク質のアミノ末端配列を決定し得、従って切断点および分泌シグ
ナルペプチドの長さを決定し得る。
実施例３：哺乳動物細胞におけるBCSG1のクローニングおよび発現
代表的な哺乳動物発現ベクターは、プロモーターエレメント（mRNAの転写の開
始を媒介する）、タンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写物のポ
リアデニル化に必要なシグナルを含む。さらなるエレメントとしては、エンハン
サー、Kozak配列、ならびにRNAスプライシングのためのドナー部位およびアクセ
プター部位に隣接する介在配列が挙げられる。非常に効率的な転写を、SV40由来
の初期および後期プロモーター、レトロウイルス由来の長末端反復（LTR）（例
えば、RSV、HTLVI、HIVIならびにサイトメガロウイルス（CMV）の初期プロモー
ター）を用いて達成し得る。しかし、細胞性エレメント（例えば、ヒトアクチン
プロモーター）もまた使用され得る。本発明の実施における使用に適切な発現ベ
クターとしては、例えば、PSVLおよびPMSG（Pharmacia，Uppsala，Sweden）、pR
SVcat（ATCC 37152）、pSV2dhfr（ATCC 37146）、ならびにpBC12MI（ATCC 67109
）のようなベクターが挙げられる。使用され得る哺乳動物宿主細胞としては、ヒ
トHela293細胞、H9細胞およびJurkat細胞、マウスNIH3T3細胞およびC127細胞、C
os1細胞、Cos7細胞およびCV1細胞、ウズラQC1-3細胞、マウスL細胞、ならびにチ
ャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が挙げられる。
あるいは、遺伝子は、染色体に組み込まれたその遺伝子を含む安定な細胞株に
おいて発現され得る。選択マーカー（例えば、dhfr、gpt、ネオマイシン、ある
いはハイグロマイシン）との同時トランスフェクションは、トランスフェクトさ
れた細胞の同定および単離を可能にする。
トランスフェクトされた遺伝子はまた、増幅されて大量のコードされたタンパ
ク質を発現し得る。DHFR（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、目的の遺伝
子の数百または数千ものコピーを有する細胞株を開発するのに有用である。別の
有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（GS）である（Murphyら、Bi
ochem J．227:277-279(1991)；Bebbingtonら、Bio/Technology 10:169-175(1992
)）。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地において増殖させ
、
そして最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は染色体に組み込
まれた増幅された遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞およ
びNSO細胞は、タンパク質の産生にしばしば使用される。
発現ベクターpC1およびpC4は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（LT
R）（Cullenら、Molecular and Cellular Biology，438-447（1985年３月））お
よびCMVエンハンサーのフラグメント（Boshartら、Cell 41:521-530（1985））
を含む。複数のクローニング部位（例えば、制限酵素切断部位BamHI、XbaI、お
よびAsp718を有する）は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。ベクター
は3'イントロンに加えて、ラットプレプロインシュリン遺伝子のポリアデニル化
および終結シグナルを含む。
実施例３(a)：COS細胞におけるクローニングおよび発現
発現プラスミドpBCSG1 HAを、BCSG1をコードするcDNAを発現ベクターpcDNAI/A
mpまたはpcDNAIII(これらは、Invitrogen，Inc.から入手し得る)へクローニング
することによって作製する。
発現ベクターpcDNAI/ampは以下を含む：(1)E.coliおよび他の原核生物細胞に
おける増殖に有効なE.coli複製起点；(2)プラスミド含有原核生物細胞の選択の
ためのアンピシリン耐性遺伝子；(3)真核生物細胞における増殖のためのSV40複
製起点；(4)CMVプロモーター、ポリリンカー、SV40イントロン；(5)cDNAが都合
良くCMVプロモーターの発現制御下におかれ、そしてポリリンカーにおける制限
部位によってSV40イントロンおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結さ
れ得るように配置された、赤血球凝集素フラグメント（すなわち、精製を容易に
するための「HA」タグ）をコードするいくつかのコドン、続いて終止コドン、お
よびポリアデニル化シグナル。HAタグは、Wilsonら、Cell 37:767(1984)によっ
て記載されたインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対
応する。標的タンパク質へのHAタグの融合は、HAエピトープを認識する抗体を用
いる、組換えタンパク質の容易な検出および回収を可能にする。pcDNAIIIはさら
に、ネオマイシン選択マーカーを含む。
BCSG1をコードするDNAフラグメントを、組換えタンパク質発現がCMVプロモー
ターによって指向されるように、ベクターのポリリンカー領域にクローン化する
。プラスミド構築ストラテジーは以下の通りである。寄託されたクローンのBCSG
1cDNAを、E.coliにおけるBCSG1の発現のためのベクターの構築について先に記載
されるのとほとんど同じように、都合の良い制限部位を含むプライマーを用いて
増幅する。適切なプライマーは、以下の本実施例に使用されたプライマーを含む
。5'プライマーは、下線を付したBamHI部位、Kozak配列、AUG開始コドン、およ
び完全なBCSG1の5'コード領域の４コドンを含む、以下の配列を有する：5'GGGGA Tcc
gccaccATGTTTTCAAGAAGG 3'（配列番号７） （Kozak配列を小文字で示す）。
3'プライマーは、下線を付したBamHI部位、停止コドン、および3'コード配列の1
9bpを含む、以下の配列（3'末端で）を有する：5'GGGGATCCTCAgaaagcgtagtctggg
acgtcgtatgggtaCTAGTCTCCCCCACTCTGG 3'（配列番号８）(HAタグを小文字で示す)
。
PCR増幅DNAフラグメントおよびベクターpcDNAI/Ampを、BamHIで消化し、次い
で連結する。連結混合物を、E.coli株SURE(Stratagene Cloning Systems，11099
North Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037より入手可能)へ形質転換し、
そして形質転換培養物を、次いでインキュベートしてアンピシリン耐性コロニー
の増殖を可能にするアンピシリン培地プレートへプレーティングする。プラスミ
ドDNAを耐性コロニーから単離し、そしてBCSG1をコードするフラグメントの存在
について制限分析または他の手段によって試験する。
組換えBCSG1の発現のために、COS細胞を、例えば、Sambrookら，Molecular Cl
oning:a Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，Cold Spring Har
bor，New York(1989)に記載のようにDEAE-DEXTRANを用いて、上記のように発現
ベクターでトランスフェクトする。細胞を、ベクターによるBCSG1の発現のため
の条件下でインキュベートする。
BCSG1-HA融合タンパク質の発現を、例えば、Harlowら，Antibodies:A Laborat
ory Manual,第２版;Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbo
r，New York(1988)に記載の方法を用いて放射標識化および免疫沈降法によって
検出する。この目的のため、トランスフェクションの２日後に、細胞を、35S-シ
ステインを含む培地中で８時間インキュベートすることによって標識する。細胞
および培地を採取し、そして細胞を洗浄し、そしてWilsonら（上記に引用され
る）に記載されるように界面活性剤含有RIPA緩衝液：150mM NaCl、１％ NP-40、
0.1％ SDS、0.5％ DOC、50mM TRIS、pH7.5で溶解する。タンパク質を、HA特異的
モノクローナル抗体を用いて細胞溶解物および培養培地から沈降する。次いで、
沈降されたタンパク質を、SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーによって分析
する。期待されるサイズの発現産物は、細胞溶解物において観察され、これはネ
ガティブコントロールにおいては見られない。
実施例３(b)：CHO細胞におけるクローニングおよび発現
ベクターpC4を、BCSG1タンパク質の発現のために使用する。プラスミドpC4は
、プラスミドpSV2-dhfr（ATCC受託番号37146）の誘導体である。このプラスミド
は、SV40初期プロモーターの制御下で、マウスDHFR遺伝子を含む。これらのプラ
スミドでトランスフェクトされるジヒドロ葉酸活性を欠如するチャイニーズハム
スター卵巣細胞または他の細胞は、化学治療剤メトトレキサートを補充した選択
培地（αマイナスMEM、Life Technologies）中で細胞を増殖させることによって
選択され得る。メトトレキサート（MTX）に耐性である細胞におけるDHFR遺伝子
の増幅は、よく考証されている（例えば、Alt，F.W.，Kellems，R.M.，Bertino
，J.R.、およびSchimke，R.T.，1978，J．Biol．Chem．253:1357-1370、Hamlin
，J.L.およびMa，C.1990，Biochem．et Biophys．Acta，1097:107-143、Page，M
.J.およびSydenham，M.A.，1991，Biotechnology 9:64-68を参照のこと）。漸増
濃度のMTXにおける細胞増殖は、DHFR遺伝子の増幅の結果として、標的酵素DHFR
を過剰産生することによって薬物への耐性を生じる。第２の遺伝子がDHFR遺伝子
と連鎖する場合、通常、同時増幅され、そして過剰発現される。増幅した遺伝子
の1,000を超えるコピーを有する細胞株を開発するためにこのアプローチを使用
し得ることは、当該分野において公知である。続いて、メトトレキサートを取り
除き、宿主細胞の１つ以上の染色体に組み込まれた増幅遺伝子を含む細胞株を得
る。
プラスミドpC4は、目的の遺伝子の発現のために、ラウス肉肺ウイルス（Culle
nら、Molecular and Cellular Biology，1985年3月:438-447）の長末端反復（LT
R）の強力なプロモーター、およびヒトサイトメガロウイルス（CMV）（Boshart
ら、Cell 41:521-530(1985)）の前初期遺伝子のエンハンサーから単離されたフ
ラグメントを含む。プロモーターの下流には、BamHI、XbaI、およびAsp718の制
限酵素切断部位が存在し、遺伝子の組み込みを可能にする。プラスミドは、これ
らのクローニング部位の後ろに、ラットプレプロインスリン遺伝子の3'イントロ
ンおよびポリアデニル化部位を含む。他の高効率プロモーター（例えば、ヒトβ
-アクチンプロモーター、SV40初期もしくは後期プロモーター、または他のレト
ロウイルス（例えば、HIVおよびHTLVI）由来の長末端反復）もまた、発現のため
に使用され得る。ClontechのTet-OffおよびTet-On遺伝子発現系および同様の系
は、哺乳動物細胞において調節された方法でBCSG1を発現するために使用され得
る（Gossen，M.，およびBujard，H．1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:554
7-5551）。mRNAのポリアデニル化のために、他のシグナル（例えば、ヒト成長ホ
ルモンまたはグロビン遺伝子由来）もまた、同様に使用され得る。染色体に組み
込まれた目的の遺伝子を含む安定な細胞株もまた、選択マーカー（例えば、gpt
、G418、またはハイグロマイシン）との同時トランスフェクションの際に選択さ
れ得る。最初は、１つより多い選択マーカー（例えば、G418およびメトトレキサ
ート）を使用することが、有利である。
当該分野で公知の手順により、プラスミドpC4を、制限酵素BamHI／Asp718で消
化し、次いで仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。次いで、ベクタ
ーを、１％アガロースゲルから単離する。
BCSG1タンパク質配列をコードするDNA配列を、遺伝子の5'および3'配列に対応
するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。5'プライマーは、下
線を付したBamHI制限酵素部位、続いて、Kozak，M.，J．Mol．Biol．196:947-95
0（1987）により記載された、真核生物における翻訳の開始の効率的なシグナル
、および図１（配列番号１）に示すBCSG1のコード配列の15塩基を含む、以下の
配列を有する：5'GGGGATccgccaccATGTTTTCAAGAAGG 3'（配列番号７）(Kozak配列
を小文字で示した)。3'プライマーは、下線を付したAsp718制限酵素部位、続い
て図１（配列番号１）に示すBCSG1遺伝子の非翻訳領域に相補的な22塩基を含む
、以下の配列を有する：5'GGGGTACCTCACTAGTCTCCCCCACTCTGG 3'（配列番号９）
。
増幅させたフラグメントを、エンドヌクレアーゼBamHI/Asp718で消化し、次い
で１％アガロースゲルで再度精製する。次いで、単離したフラグメントおよび脱
リン酸化ベクターをT4 DNAリガーゼで連結する。次いで、E.coli HB101またはXL
-1 Blue細胞を形質転換し、そして例えば制限酵素分析を用いてプラスミドpC4に
挿入されたフラグメントを含む細菌を同定する。
活性なDHFR遺伝子を欠失するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランスフ
ェクションのために使用する。５μgの発現プラスミドpC4を、リポフェクチン（
Felgnerら、前出）を用いて、0.5μgのプラスミドpSV2-neoとともに同時トラン
スフェクトする。プラスミドpSV2 neoは、優性選択マーカー（G418を含む一群の
抗生物質に対する耐性を与える酵素をコードするTn5由来のneo遺伝子）を含む。
細胞を、１mg/mlのG418を補充したαマイナスMEMに播種する。２日後、細胞をト
リプシン処理し、そして10、25、または50ng/mlのメトトレキサートおよび１mg/
ml G418を補充したαマイナスMEM中のハイブリドーマクローニングプレート（Gr
einer，Germany）に播種する。約10〜14日後、単一のクローンをトリプシン処理
し、次いで異なる濃度のメトトレキサート（50nM、100nM、200nM、400nM、800nM
）を用いて、６ウェルペトリ皿または10mlフラスコに播種する。次いで、最高濃
度のメトトレキサートで増殖するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサート
（１μM、２μM、５μM、10mM、20mM）を含む新たな６ウェルプレートに移す。
同じ手順を、100〜200μMの濃度で増殖するクローンが得られるまで繰り返す。
所望の遺伝子産物の発現を、例えば、SDS-PAGEおよびウェスタンブロットによっ
て、または逆相HPLC分析によって分析する。
実施例４：BCSG1 mRNA発現の組織分布
ノーザンブロット分析を、ヒト組織におけるBCSG1遺伝子の発現の試験のため
に以下のように行った。全RNAは、ChomcznskiおよびSacchiの方法（Chomczynski
,P.およびSacchi,N.,Anal.Biochem.162:156-159(1987)）に従って組織から抽出
した。RNAの等量のアリコートをホルムアルデヒドを含む1.2%のアガロースゲル
にて電気泳動し、そしてナイロンメンブレン（Boehringer Mannheim）へ移した
。メンブレンをExpressHybハイブリダイゼーション溶液（Clontech,Inc）を用い
、６８℃で３０分間、プレハイブリダイズした。32P標識のBCSG1プローブ（1.5
×106cpm/ml）を含む同じ溶液中で、１時間68℃でハイブリダイゼーションを行
った。
次いで、メンブレンを0.05%のSDSを含む２×SSC中において、30分間室温で３回
リンスした。続いて、0.1%のSDSを含む0.1×SSCを用いて40分間50℃で２回洗浄
した。EcoRIおよびXhoI消化に続いて、全長BCSG1 cDNA（配列番号１）をBluescr
iptベクターから単離し、そしてランダム標識cDNAプローブの調製のためのテン
プレートとして使用した。ランダムプライマーDNA標識キットをBoehringer Mann
heim,Indianapolisから得た。32P-dATPをAmershamから購入した。
ノーザンブロットにより、BCSG1は、ADアミロイドファミリー遺伝子の豊富な
供給源である脳において、予測された1kbの転写物として大量に発現されること
を示した。以下の組織、すなわち、卵巣、精巣、結腸および心臓ではまた、強度
のほとんどない類似のサイズのバンドが見られた。
実施例５：cDNAライブラリーからのBCSG1のクローニング
EST分析を、正常の乳房に対して乳ガンにおいて示差的に発現される新規の遺
伝子を探索するために使用した。およそ500,000のヒトの部分的なcDNA配列（発
現される配列タグ）を含むデータベースを、ランダムに選択されたヒトcDNAクロ
ーン（Adams,M.D.ら、Science 252:1651-6(1991)）の高処理能力自動化DNA配列
分析を用いてInstitute for Genomic ResearchおよびHuman Genome Science Inc
．間の共同研究者の努力で確立した。ステージIIIの乳ガン由来のRNAおよび患者
に対応する正常な乳房由来のRNAを単離し、そしてcDNAライブラリーの調製に供
した。ランダムに選択したcDNAクローンにおいてEST自動化DNA配列分析を行った
。両ライブラリーは、公表されたヒト遺伝子に対し正確にはマッチしない約60%
の新規な遺伝子配列を有していた。乳ガンcDNAライブラリー由来の全3048ESTお
よび正常な乳房のcDNAライブラリー由来の全2886ESTをランダムに採取し、そし
て配列を分析した。重複配列を伴うESTを固有のEST群に分類し；そして各EST群
は、遺伝子または配列関連遺伝子のファミリーを示し得る。乳ガンに対する正常
な乳房からの対のcDNAライブラリーにおいて、ESTヒットを定量的比較するため
に、個々のEST配列の発現を試験することにより分析した、2,200より多いのEST
群がある。ライブラリーにおけるESTヒット数は、ESTの相対的な発現またはmRNA
転写コピー数を反映する。図２に示されるように、正常な乳房および乳ガンから
作製
された対のcDNAライブラリーにおける直接的EST配列決定分析を同時に利用する
、この直接的示差的cDNA配列決定を、個々の遺伝子の発現プロフィールおよび乳
ガンに対する正常な乳房における遺伝子パターンの研究に使用した。
結果
cDNAライブラリーは、乳ガン生検標本および患者にマッチする正常な乳房から
生成し、そしてEST配列決定により分析された。およそ6000ESTが分析され、そし
て重複配列に基づいて、異なる群に分類された。そして、2,200の独特のEST群が
最初に、乳ガンに対する正常な乳房からのcDNAライブラリーにおける相対的な発
現について分析され、次いで、種々の異なる組織型由来の大多数のESTに対する
個々のEST配列の組織の起源を試験することにより、組織特異的発現に供された
。EST群の３つのクラスは、同定され、そしてこれは乳ガンに対して正常な乳房
に示差的に発現された。このアプローチの示すように、表１は乳ガンに対し正常
な乳房において示差的に発現される遺伝子の３つのクラスの部分的なリストを示
す。クラスＩは、正常な乳房より乳ガンにおいてより豊富に遺伝子を示し、そし
てこれは、良く研究されるステロイド調節細胞外マトリックス分解プロテイナー
ゼであるカプテシンＤを含む（Rochefort,H.ら、J.Cell.Biochem.35:17-29(1987
);Cavailles,V.ら、Biochem.Biophys.Res.Commun.174:816-24(1991);Capony,F.
ら、Biochem.Biophys.Res.Commun.171:972-80(1990)）。カプテシンＤは、乳ガ
ン転移において重要な役割を果たすと考えられ（Rochefort,H.ら、J.Cell.Bioch
em.35:17-29(1987);Cavailles,V.ら、Biochem.Biophys.Res.Commun.174:816-24(
1991);Capony,F.ら、Biochem.Biophys.Res.Commun.171:972-80(1990)）、そして
乳ガンの進行における予後のマーカーとして提唱されている（Brouillet,J.P．
ら、Eur.J.Cancer 26:437-41(1990);Spyratos,F.ら、Lancet,11:1115-8(1989);R
ochefort,H.,ら、J.steroid.Biochem.34:177-82(1989);FoekensJ.A.ら、JNCI 87
:751-6(1995)）。列挙されるように、乳ガンcDNAライブラリーにおいてEST配列
決定された５つのカプテシンＤが存在し、そして正常な乳房cDNAライブラリーに
おいては、ただ１つのESTが存在した。提唱された別の乳ガン転移に関連する遺
伝子および乳ガンについての予後のマーカー、67kDaのラミニンレセプター（Hor
an-Hand,P.
ら、Cancer Res.45:833-40(1986);Hunt,G.Exp.Cell Biol 57(3):165-76(1989);C
astronovo,V.ら、Am.J.Pathol.137(6):1373-81(1990);Marques,L.A.ら、Cancer
Res．50(5):1479-83(1990);Gasparini,G.ら、Int.J.Cancer.60(5):604-10(1995)
）もまた、示差的cDNA配列決定アプローチにより、このクラスにおいて採取され
た。クラスIIは、乳ガンより正常な乳房においてより豊富な遺伝子を示す。
クラスＩおよびクラスIIにおける遺伝子は、乳ガンよりも正常な乳房において
示差的に発現されるが、これらの遺伝子はどれも乳房組織に独特のものではない
。クラスIIIは、他の組織型と比較して乳房において選択的に発現される特別な
遺伝子群である。独特の遺伝子の組織特異的な発現はBLASTプログラム（Altschu
l,S.F.ら、J.Mol.Biol.215(3):403-10(1990)）を用いておよそ500,000ESTに対し
て探索された。最初の１つを除くこれらの乳ガン特異的遺伝子（BCSG）はいずれ
も、公表された遺伝子配列データベース中の任意の配列とマッチしなかった。BC
SG1は、分析のための、最初の推定乳ガンマーカー遺伝子として選択された。な
ぜなら、１）その配列は、公表の遺伝子配列データベース中の配列とマッチし；
そして２）BCSG1中の個々のEST配列のほとんどは、乳房腫瘍cDNAライブラリー由
来であるからである。BCSG１における特有の８つのESTのうち、これらのうち７
つは、乳房のcDNAライブラリーにおいて発見され、そして１つのみが脳のライブ
ラリーにおいて発見された。乳房のcDNAライブラリーにおいて発見された７つの
ESTクローンのうち、これらのうち６つが乳房腫瘍ライブラリーで同定され、そ
して１つのみが正常な乳房のライブラリーで同定された。６つのESTクローンの
全ての完全配列決定後、１つのESTクローンが、完全な全長配列を有することが
見出された。得られた全長遺伝子のオープンリーディングフレームは、127アミ
ノ酸のポリペプチドをコードすると推定された。最適なアラインメントの後、推
定BCSG1コードタンパク質は、最近クローン化されたヒトアルツハイマー病（AD
）のアミロイドタンパク質の非-Aβフラグメントと54％の配列同一性を示す（Ue
da,K.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90(23):11282-6(1993)）。
表１.示差的cDNA配列決定により同定されたガン性の乳房に対する正常な乳房で示差的に発現される遺伝子の部分リスト
乳ガンにおいてより豊富な遺伝子
遺伝子 EST
ガン 正常
乳房基本的保存遺伝子 33 9
カテプシンＤ 5 1
67kDaラミニンレセプタ− 4 0伸長因子Ｉ 13 5
正常乳房においてより豊富な遺伝子
遺伝子 EST
ガン 正常
マトリックスGlaタンパク質 0 823kDa 高塩基性タンパク質 3 11
乳ガン特異的および示差的に発現される遺伝子
遺伝子 EST
NB1 BC2 全組織
BCSG1 1 6 8
BCSG2 0 7 7
BCSG3 0 5 5
BCSG4 4 0 4BCSG5 0 4 4 1
正常な乳房、2乳ガン
表１.相補的DNAライブラリーは、ステージIIIの乳ガンおよび患者にマッチする
正常な乳房から確立された。5,934ESTの全てがランダムに採取され、そして配
列分析された。2,200より多い特定のEST群が、「材料および方法」に記載される
ように正常な乳房に対する乳ガンからの対のcDNAライブラリーにおけるESTのヒ
ットの定量的比較のために分析された。同じEST群はまた、種々の異なるcDNAラ
イブラリーからの500,000ESTの全てに対して組織特異的発現の試験により分析さ
れた。乳房に特異的なESTヒットが３より多い独特のEST群のみが列挙され、そし
て乳房に特異的なESTヒットが４未満である多くのEST群の残りは、このリストか
ら省略した。
実施例６：ヒト乳ガン細胞におけるBCSG1の発現
ヒト乳ガンの発生および進行におけるBCSG1の潜在的な生物学的重要性を評価
する試みにおいて、ヒト乳房生検サンプル中のBCSG1遺伝子の発現をノーザンブ
ロット分析を用いて試験した。
ヒト乳ガン細胞由来のRNAを、RNA単離キットRNAzol B（Tel-Test，Inc）を用
いて製造者の指示に基づき調製した。RNAの等量のアリコートをホルムアルデヒ
ドを含む1.2%のアガロースゲル上で電気泳動し、そしてナイロンメンブレン（Bo
ehringer Mannheim）に移した。メンブレンをExpressHybハイブリダイゼーショ
ン溶液（Clontech,Inc.）を用いて68℃で30分間プレハイブリダイズした。ハイ
ブリダイゼーションを32P標識化BCSG1プローブ（1.5×106cpm/ml）を有する同じ
溶液中で１時間68℃で行った。次いで、メンブレンを0.05%のSDSを含む２×SSC
で30分間室温にて３回リンスし、続いて、0.1%のSDSを含む0.1×SSCで40分間50
℃にて２回洗浄した。全長BCSG1 cDNA（配列番号１）を、EcoRIおよびXhoIで消
化した後、Bluescriptベクターから単離し、そしてランダムに標識したcDNAプロ
ーブの調製のためのテンプレートとして使用した。ランダムプライマーDNA標識
キットをBoehringer Mannheim,Indianapolisから得た。P32-dATPをAmershamから
購入した。
転移性乳ガンおよび良性の乳房組織におけるBCSG1発現をノーザンブロットに
より分析した。BCSG1転写物の過剰発現が乳ガンにある。対照的に、BCSG1転写物
は良性乳ガンでは検出不可能であった。ヒト乳房組織におけるBCSG1転写物の存
在および乳ガンでのBCSG1転写物の過剰発現は、示差的cDNA配列決定クローニン
グストラテジーが、乳ガン発生におけるBCSG1の可能な役割、またはBCSG1のアッ
プレギュレーションの生物マーカーを示すことと一致する。
BCSG1の発現をまた、種々のヒト乳ガン細胞株（すなわち、原発性固形腫瘍由
来の細胞株であるH3477、H3630、H3680B；胸水由来の細胞株である、H3396、MCF
7、SKBR-3、MDAMB231;浸潤腺管ガン由来の細胞株であるH3914、H3922、ZR-75-1
、T47D）において試験した。T47D、ZR-75-1、SKBR-3、MCF-7およびMDA-MB-231細
胞株はATCCからであり；他の全ての株は、Bristol-Myers Squibb Pharmaceutica
l Research Institute(Liu,J.,Cancer Res.)で、最初に単離された。
１KbのBCSG1転写物を、４つの胸水由来細胞株のうち２つ（すなわち、SKBR-3
、MDAMB231）および４つの浸潤腺管ガン細胞株の全てにおいてノーザンブロット
で検出した。興味深いことに、原発性固形乳ガン由来のいずれの細胞株もBCSG1
mRNAを発現しなかった。これらの株において、H3922が、最も高いレベルのBCSG1
mRNAを発現した。いくつかの胸水由来の細胞株におけるBCSG1 mRNAの欠如は、B
CSG1遺伝子の発現が特異的インビボ条件を必要とし得ること、または腫瘍細胞と
間質細胞との間の相互作用により誘導されることを示唆する。
実施例７：乳ガン細胞におけるBCSG1のインサイチュハイブリダイゼーション
細胞のBCSG1発現の供給源を局在化するために、そして乳ガンにおけるBCSG1過
剰発現の生物学的な関連性をさらに評価するために、インサイチュハイブリダイ
ゼーションを20の浸潤性のガン、15のインサイチュのガンおよび15の良性の乳房
病巣（乳房過形成および線維腺腫）由来の固定された乳房切片上で行った。
インサイチュハイブリダイゼーションをM.L.AngererおよびR.C.Angerer,In si
tu hybridization,D.RickwoodおよびB.D.Hames（編）.London:LRL Press.,(1992
),15〜32頁に記載のように行った。簡潔には、脱パラフィン化、そして酸処理し
た切片（厚さ5μm）をプロテイナーゼＫで処理し、プレハイブリダイズし、そし
てBCSG1 cDNA挿入物由来のジゴキシゲニン標識化アンチセンス転写物と一晩ハイ
ブリダイズした。BCSG1アンチセンスプローブは、550bpの全長フラグメントであ
る。プローブを、BCSG1cDNAプラスミドのPstI切断により、続いてT7ポリメラー
ゼにより産生した。ハイブリダイゼーションに続いて、RNase処理し、そして
３回のストリンジェントな洗浄を行った。切片をマウス抗ジゴキシゲニン抗体（
Boehringer）とともにインキュベートし、続いてビオチン結合ウサギ抗マウス二
次抗体（DAKO）とともにインキュベートした。熱量測定検出を、DAKOのUniversa
l LSAB Kitにより標準の間接的なストレプトアビジン-ビオチン免疫反応方法を
用いて製造者の指示に従って行った。
これらの実験において、BCSG1発現の２つの局面が試験された：１）組織局在
化（間質対上皮）；および２）BCSG1発現と乳ガンの悪性表現型との相関。高浸
潤性乳ガンの腫瘍性上皮細胞における強陽性BCSG1ハイブリダイゼーションが観
察された。BCSG1mRNAの発現は、20のうち18の浸潤性乳ガンの腫瘍性上皮細胞に
おいて検出可能であった。間質細胞において、BCSG1発現は検出可能ではなかっ
た。対照的に、BCSG1の発現は、正常な乳房または良性の乳房病巣の15の症例の
全てにおいて欠如していた。異型の増殖性乳房病巣、良性線維腺肺および正常な
腺管乳房上皮細胞においてBCG1の陰性染色を示すものが提示される。さらに、高
浸潤性乳ガンにおいて、周囲の浸潤性乳ガン細胞は、BCSG1の発現に対し陽性に
染色されたが、残りの正常な小葉の乳房上皮細胞において、検出可能なBCSG1発
現のシグナルは明白でなかった。これらのインサイチュハイブリダイゼーション
の結果は、BCSG1転写物を乳ガンにおいて強く発現するが、正常または良性の乳
房病巣では強い発現を示さないノーザンブロット分析と一致する。
強いBCSG1シグナルが、浸潤性乳ガンの悪性の乳房上皮細胞において容易に検
出されたが、インサイチュの低程度のガンは、低密度および軽度の染色を示した
ことに注意することは興味深いことである。15のインサイチュのガンのうち、９
標本は、陰性に染色され、そして６標本は部分的に染色された。染色の強度およ
び陽性細胞数の両方が、転移性乳ガンにおける強い発現と比較して、インサイチ
ュの乳ガンにおいて有意に減少された。正常または良性の乳房における実質的に
検出可能でない発現から、低いレベルおよびインサイチュの低程度の乳ガンの部
分的発現までならびに浸潤する悪性の乳ガンにおける高発現までの勾配およびス
テージ特異的なBCSG1発現を示したこれらの結果は、乳ガンの悪性化の進行を伴
うBCSG1発現の関連性を示唆する。このBCSG1発現パターンに基づいて、BCSG1は
、乳ガンの進行マーカーとして有用である。
本発明は、前記および実施例に特に記載されるような方法とは別の方法で行わ
れ得ることは明らかである。
本発明の多数の改変および変更は、上記教示の見地において可能であり、そし
て、それゆえ、添付の請求の範囲の範囲内にある。
本明細書中に引用される全ての刊行物（特許、特許出願、投稿雑誌、研究室マ
ニュアル、書籍または他の文書を含む）の開示の全体は、本明細書中で参考とし
て援用される。
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(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｚ
Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｇ０１Ｎ 33/574 5/00 Ａ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ
Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ
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ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ
Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ
，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，
ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ
Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ
，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，
ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ
Ｎ，ＹＵ，ＺＷ
(72)発明者 ローゼン，クレイグ エイ.
アメリカ合衆国 メリーランド 20882,
レイトンズビル，ローリング ヒル ロー
ド 22400