JP2001509514A - Ｅｂｖ由来のｃｔｌエピトープ - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明はエプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス（ＥＢＶ）構造抗原に由来すＥＢＶ細胞傷害性Ｔ細胞エピトープを提供する。好ましいエピトープは、ＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（配列番号１）、ＹＦＬＥＩＬＷＧＬ（配列番号３２）、ＹＬＬＥＩＬＷＲＬ（配列番号３３）、ＹＬＱＱＮＷＷＴＬ（配列番号６）、ＬＬＬＡＬＬＦＷＬ（配列番号２）、ＬＬＶＤＬＬＷＬＬ（配列番号３）、ＬＬＬＩＡＬＷＮＬ（配列番号４）、ＷＬＬＬＦＬＡＩＬ（配列番号５）、ＴＬＬＶＤＬＬＷＬ（配列番号７）、ＬＬＷＬＬＬＦＬＡ（配列番号８）、ＩＬＬＩＩＡＬＹＬ（配列番号９）、ＶＬＦＩＦＧＣＬＬ（配列番号１０）、ＲＬＧＡＴＩＷＱＬ（配列番号１１）、ＩＬＹＦＩＡＦＡＬ（配列番号１５）、ＳＬＶＩＶＴＴＦＶ（配列番号１７）、ＬＭＩＩＰＬＩＮＶ（配列番号２０）、ＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号２４）、ＬＩＰＥＴＶＰＹＩ（配列番号２６）、ＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号２７）およびＱＬＴＰＨＴＫＡＶ（配列番号２９）を含む。本発明はまた、ＥＢＶ細胞傷害性Ｔ細胞エピトープを投与することを含む、患者におけるＥＢＶ感染を治療または阻止する方法を提供する。
Description
【０００１】 （発明の分野） 本発明はＥＢＶ感染を治療または阻止する方法に関する。本発明はまた、エプ
スタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス（ＥＢＶ）構造抗原およ
び潜在抗原内の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープ、ならびにこれらのエピ
トープを含むサブユニットワクチンおよび核酸ワクチンに関する。
スタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス（ＥＢＶ）構造抗原およ
び潜在抗原内の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープ、ならびにこれらのエピ
トープを含むサブユニットワクチンおよび核酸ワクチンに関する。
【０００２】 （発明の背景） 持続性ウイルス感染からの長期的保護には、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ
分子と連携してウイルス抗原を認識するウイルス特異的記憶Ｔ細胞の分化を必要
とすることが現在ではよく確証されている。全ウイルスタンパク質を用いた免疫
感作は有効なＣＴＬ応答を誘導することができないので、明確に規定されたエピ
トープ配列に基づくワクチンを設計することに関心が向けられてきた。癌ウイル
スについては特にそうである。なぜなら、組換えベクターに導入された個々のウ
イルス遺伝子は腫瘍形成プロセスを開始させる可能性を有するからである。ＥＢ
Ｖ関連疾患（総論については、参照文献（７）参照）を制御する効果的なワクチ
ンを設計するため、現在２つの広範なアプローチが考えられている。これらのア
プローチには、ＥＢＶ構造抗原または潜在抗原に対する免疫応答を引き出すこと
が含まれている。
分子と連携してウイルス抗原を認識するウイルス特異的記憶Ｔ細胞の分化を必要
とすることが現在ではよく確証されている。全ウイルスタンパク質を用いた免疫
感作は有効なＣＴＬ応答を誘導することができないので、明確に規定されたエピ
トープ配列に基づくワクチンを設計することに関心が向けられてきた。癌ウイル
スについては特にそうである。なぜなら、組換えベクターに導入された個々のウ
イルス遺伝子は腫瘍形成プロセスを開始させる可能性を有するからである。ＥＢ
Ｖ関連疾患（総論については、参照文献（７）参照）を制御する効果的なワクチ
ンを設計するため、現在２つの広範なアプローチが考えられている。これらのア
プローチには、ＥＢＶ構造抗原または潜在抗原に対する免疫応答を引き出すこと
が含まれている。
【０００３】 最近数年おいて、ワクチン開発努力の殆どはｇｐ３５０（組換え体であってア
フィニティー精製されたもの）のサブユニット調製物の使用に焦点があてられ、
そして口腔咽頭部における標的細胞へのウイルスの結合をブロックすることに向
けられてきた（３１）。一般的なアプローチは、ｇｐ３５０を用いてコットント
ップマーモセット（ｃｏｔｔｏｎ−ｔｏｐ ｍａｒｍｏｓｅｔ）を免疫感作し、
これらの動物におけるＥＢＶ陽性リンパ種の発生を制限する能力を測定する、と
いうものであった。実際、アジュバント（ムラミールジペプチドまたはＩＳＣＯ
ＭＳ）と共に皮下に投与した場合、高度に精製されたｇｐ３５０は高レベルの血
清中和抗体を誘導し、コットントップタマリン（ｃｏｔｔｏｎ−ｔｏｐ ｔａｍ
ａｒｉｎ）における腫瘍形成を抑制した（３２）。ワクシニア−ｇｐ３５０およ
びアデノウイルス５−ｇｐ３５０を含む幾つかの組換えベクターもまたこれらの
動物において上首尾に用いられ、腫瘍の発生をブロックした（３３）。ｇｐ３５
０がコットントップタマリンをリンパ種から保護する作用機構はいまだに不明で
ある。ワクチンを投与した動物における中和抗体力価の増大は必ずしも保護と相
関しないという事実から、ｇｐ３５０特異的Ｔ細胞媒介免疫応答がエフェクター
の役割をも有するかもしれないことが示される（３４）。さらに、Ｙａｏら（３
５）は健常なＥＢＶ−免疫ドナーの唾液中に非常に低レベルの中和抗ｇｐ３５０
抗体が存在することを示し、これはそのような抗体は健常な血清陽性個体におけ
る長期免疫の基礎ではなさそうだということを示唆している。ｇｐ３５０特異的
Ｔ細胞媒介免疫応答は保護の際エフェクターの役割を有するという仮定がなされ
た。しかし、今日にいたるまでＥＢＶ構造抗原内のＣＴＬエピトープの同定は全
くなされていない。
フィニティー精製されたもの）のサブユニット調製物の使用に焦点があてられ、
そして口腔咽頭部における標的細胞へのウイルスの結合をブロックすることに向
けられてきた（３１）。一般的なアプローチは、ｇｐ３５０を用いてコットント
ップマーモセット（ｃｏｔｔｏｎ−ｔｏｐ ｍａｒｍｏｓｅｔ）を免疫感作し、
これらの動物におけるＥＢＶ陽性リンパ種の発生を制限する能力を測定する、と
いうものであった。実際、アジュバント（ムラミールジペプチドまたはＩＳＣＯ
ＭＳ）と共に皮下に投与した場合、高度に精製されたｇｐ３５０は高レベルの血
清中和抗体を誘導し、コットントップタマリン（ｃｏｔｔｏｎ−ｔｏｐ ｔａｍ
ａｒｉｎ）における腫瘍形成を抑制した（３２）。ワクシニア−ｇｐ３５０およ
びアデノウイルス５−ｇｐ３５０を含む幾つかの組換えベクターもまたこれらの
動物において上首尾に用いられ、腫瘍の発生をブロックした（３３）。ｇｐ３５
０がコットントップタマリンをリンパ種から保護する作用機構はいまだに不明で
ある。ワクチンを投与した動物における中和抗体力価の増大は必ずしも保護と相
関しないという事実から、ｇｐ３５０特異的Ｔ細胞媒介免疫応答がエフェクター
の役割をも有するかもしれないことが示される（３４）。さらに、Ｙａｏら（３
５）は健常なＥＢＶ−免疫ドナーの唾液中に非常に低レベルの中和抗ｇｐ３５０
抗体が存在することを示し、これはそのような抗体は健常な血清陽性個体におけ
る長期免疫の基礎ではなさそうだということを示唆している。ｇｐ３５０特異的
Ｔ細胞媒介免疫応答は保護の際エフェクターの役割を有するという仮定がなされ
た。しかし、今日にいたるまでＥＢＶ構造抗原内のＣＴＬエピトープの同定は全
くなされていない。
【０００４】 臓器移植患者に発生する移植後リンパ球増殖性疾患（ＰＴＬＤ）は、重要性を
増しつつある臨床問題である。ＰＴＬＤの組織学的分析は、多形性Ｂリンパ球過
形成から悪性モノクローナルリンパ腫まで、きわめて複雑なクローン的多様性を
示している。リンパ腫はしばしば免疫芽球性リンパ腫（ＩＬ）と呼ばれるが、病
理学の上記範囲はＰＴＬＤという総称を包含する。この状態はエプスタインバー
ウイルス（ＥＢＶ）感染Ｂ細胞の増殖に明確に関連している。これらＢ細胞は以
前に感染した個体（成人の約８０％および７才児の約２０％）のすべてにおいて
一生担持される（４５、４６、４７、４９）。これらのＥＢＶ感染Ｂ細胞は通常
では、ＥＢＶ潜在タンパク質内に含まれるエピトープ（下記参照）を認識するウ
イルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によってｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ
ｖｉｖｏにおいてその増殖が制限される（４８）。免疫抑制はこれらの特異的
ＣＴＬを抑制し、ＥＢＶ感染Ｂ細胞プールの拡大およびＰＴＬＤに関連する臨床
問題の発生をもたらす。ＰＴＬＤの危険が最大である個体とは、血清陽性ドナー
から移植片を受けるＥＢＶ血清陰性レシピエントであることが知られている（Ｃ
ｒａｗｆｏｒｄおよびＴｈｏｍａｓ，１９９３）。移植に先立ってＥＢＶ血清陰
性の移植レシピエントを免疫感作することはＰＴＬＤの危険を大幅に減少させる
であろう。
増しつつある臨床問題である。ＰＴＬＤの組織学的分析は、多形性Ｂリンパ球過
形成から悪性モノクローナルリンパ腫まで、きわめて複雑なクローン的多様性を
示している。リンパ腫はしばしば免疫芽球性リンパ腫（ＩＬ）と呼ばれるが、病
理学の上記範囲はＰＴＬＤという総称を包含する。この状態はエプスタインバー
ウイルス（ＥＢＶ）感染Ｂ細胞の増殖に明確に関連している。これらＢ細胞は以
前に感染した個体（成人の約８０％および７才児の約２０％）のすべてにおいて
一生担持される（４５、４６、４７、４９）。これらのＥＢＶ感染Ｂ細胞は通常
では、ＥＢＶ潜在タンパク質内に含まれるエピトープ（下記参照）を認識するウ
イルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によってｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ
ｖｉｖｏにおいてその増殖が制限される（４８）。免疫抑制はこれらの特異的
ＣＴＬを抑制し、ＥＢＶ感染Ｂ細胞プールの拡大およびＰＴＬＤに関連する臨床
問題の発生をもたらす。ＰＴＬＤの危険が最大である個体とは、血清陽性ドナー
から移植片を受けるＥＢＶ血清陰性レシピエントであることが知られている（Ｃ
ｒａｗｆｏｒｄおよびＴｈｏｍａｓ，１９９３）。移植に先立ってＥＢＶ血清陰
性の移植レシピエントを免疫感作することはＰＴＬＤの危険を大幅に減少させる
であろう。
【０００５】 ウイルス関連癌の拒絶における免疫系の役割もまた、近年熱心に研究されてい
る主題である。現在検討されている仮説は、多くの新生物がヘルパーＴ細胞およ
び細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の両者を含む免疫系によって該新生物が認識
され破壊されることを可能にするに相違ないウイルス抗原を発現する、というも
のである。エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）関連悪性疾患の殆どは、ウイ
ルス遺伝子の発現を制限することによってこの強力なウイルス特異的ＣＴＬ応答
を免れるという注目すべき証拠が現在存在する（７、２０、２１）。鼻咽頭癌（
ＮＰＣ）およびホジキン（Ｈｏｄｇｋｉｎ）病（ＨＤ）などの悪性疾患について
は、一貫して発現される抗原はＥＢＶ核抗原１（ＥＢＮＡ１）および潜在膜タン
パク質１（ＬＭＰ１）のみであり、それゆえこれらの抗原は上記腫瘍をコントロ
ールするために設計される将来のワクチンの可能性のある標的抗原である（３、
２８）。全ウイルスタンパク質を用いた免疫感作は効率的なＣＴＬ応答を誘導し
ないことが確証されているので、明確に規定されているエピトープ配列に基づく
ペプチドワクチンの開発に関心が向けられてきた。
る主題である。現在検討されている仮説は、多くの新生物がヘルパーＴ細胞およ
び細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の両者を含む免疫系によって該新生物が認識
され破壊されることを可能にするに相違ないウイルス抗原を発現する、というも
のである。エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）関連悪性疾患の殆どは、ウイ
ルス遺伝子の発現を制限することによってこの強力なウイルス特異的ＣＴＬ応答
を免れるという注目すべき証拠が現在存在する（７、２０、２１）。鼻咽頭癌（
ＮＰＣ）およびホジキン（Ｈｏｄｇｋｉｎ）病（ＨＤ）などの悪性疾患について
は、一貫して発現される抗原はＥＢＶ核抗原１（ＥＢＮＡ１）および潜在膜タン
パク質１（ＬＭＰ１）のみであり、それゆえこれらの抗原は上記腫瘍をコントロ
ールするために設計される将来のワクチンの可能性のある標的抗原である（３、
２８）。全ウイルスタンパク質を用いた免疫感作は効率的なＣＴＬ応答を誘導し
ないことが確証されているので、明確に規定されているエピトープ配列に基づく
ペプチドワクチンの開発に関心が向けられてきた。
【０００６】 （発明の概要） 本発明の発明者らによって得られた結果は、ＥＢＶ構造タンパク質および潜在
タンパク質内のＣＴＬエピトープは、ＥＢＶ感染に対する抗ウイルス免疫を提供
するのに効果的でありうることを示す。特に、本発明者らはペプチド安定化アッ
セイを用いて潜在抗原ＬＭＰ１配列を分析し、その結果この抗原が可能性のある
ＣＴＬエピトープを含むことを見いだした。これらのペプチドを用いてｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ活性化を行なった後、ＨＬＡ Ａ２陽性ドナー由来のポリクローナルお
よびモノクローナルＣＴＬは両方ともＬＭＰ１抗原を発現する標的細胞に対して
強い反応性を示した。さらに、異なるＨＬＡ Ａ２スーパータイプ（ｓｕｐｅｒ
ｔｙｐｅ）を発現するリンパ芽球様細胞系（ＬＣＬ）は、これらのＣＴＬによっ
て効率的に認識された。これは異なる人種集団の保護を目指す抗ウイルスワクチ
ンの設計に重要な掛かり合いをもつ結果である。
タンパク質内のＣＴＬエピトープは、ＥＢＶ感染に対する抗ウイルス免疫を提供
するのに効果的でありうることを示す。特に、本発明者らはペプチド安定化アッ
セイを用いて潜在抗原ＬＭＰ１配列を分析し、その結果この抗原が可能性のある
ＣＴＬエピトープを含むことを見いだした。これらのペプチドを用いてｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ活性化を行なった後、ＨＬＡ Ａ２陽性ドナー由来のポリクローナルお
よびモノクローナルＣＴＬは両方ともＬＭＰ１抗原を発現する標的細胞に対して
強い反応性を示した。さらに、異なるＨＬＡ Ａ２スーパータイプ（ｓｕｐｅｒ
ｔｙｐｅ）を発現するリンパ芽球様細胞系（ＬＣＬ）は、これらのＣＴＬによっ
て効率的に認識された。これは異なる人種集団の保護を目指す抗ウイルスワクチ
ンの設計に重要な掛かり合いをもつ結果である。
【０００７】 本発明者らはまた、急性の伝染性単核球症（ＩＭ）患者由来のＣＴＬは、ＥＢ
Ｖ構造抗原ｇｐ８５およびｇｐ３５０に対して強い反応性を示すことを見いだし
た。さらに、ＥＢＶ構造抗原ｇｐ８５およびｇｐ３５０内の特異的ＣＴＬエピト
ープが初めて同定された。重要なことに、これらｇｐ８５およびｇｐ３５０ＣＴ
Ｌエピトープを用いてＨＬＡ Ａ２／Ｋｂトランスジェニックマウスを前もって
免疫感作すると、強いエピトープ特異的ＣＴＬ応答が誘導され、ｇｐ８５または
ｇｐ３５０発現ワクシニアウイルスチャレンジに対する保護をもたらした。これ
らの結果は、ＥＢＶ構造タンパク質中にＣＴＬエピトープが存在する証拠を初め
て提供し、そしてＥＢＶ感染に対する強い抗ウイルス免疫を確立するためにそれ
らのエピトープを使用できることを示している。
Ｖ構造抗原ｇｐ８５およびｇｐ３５０に対して強い反応性を示すことを見いだし
た。さらに、ＥＢＶ構造抗原ｇｐ８５およびｇｐ３５０内の特異的ＣＴＬエピト
ープが初めて同定された。重要なことに、これらｇｐ８５およびｇｐ３５０ＣＴ
Ｌエピトープを用いてＨＬＡ Ａ２／Ｋｂトランスジェニックマウスを前もって
免疫感作すると、強いエピトープ特異的ＣＴＬ応答が誘導され、ｇｐ８５または
ｇｐ３５０発現ワクシニアウイルスチャレンジに対する保護をもたらした。これ
らの結果は、ＥＢＶ構造タンパク質中にＣＴＬエピトープが存在する証拠を初め
て提供し、そしてＥＢＶ感染に対する強い抗ウイルス免疫を確立するためにそれ
らのエピトープを使用できることを示している。
【０００８】 したがって、第１の態様において、本発明はエプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅ
ｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス（ＥＢＶ）構造抗原に由来するＥＢＶ細胞傷害性Ｔ細
胞エピトープを提供する。
ｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス（ＥＢＶ）構造抗原に由来するＥＢＶ細胞傷害性Ｔ細
胞エピトープを提供する。
【０００９】 本発明の第１の態様の好ましい実施形態においては、ＥＢＶ構造抗原はｇｐ８
５またはｇｐ３５０である。
５またはｇｐ３５０である。
【００１０】 第２の態様において、本発明はＥＢＶ細胞傷害性Ｔ細胞エピトープであって、
ＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（配列番号１）、ＹＦＬＥＩＬＷＧＬ（配列番号３２）、Ｙ
ＬＬＥＩＬＷＲＬ（配列番号３３）、ＹＬＱＱＮＷＷＴＬ（配列番号６）、ＬＬ
ＬＡＬＬＦＷＬ（配列番号２）、ＬＬＶＤＬＬＷＬＬ（配列番号３）、ＬＬＬＩ
ＡＬＷＮＬ（配列番号４）、ＷＬＬＬＦＬＡＩＬ（配列番号５）、ＴＬＬＶＤＬ
ＬＷＬ（配列番号７）、ＬＬＷＬＬＬＦＬＡ（配列番号８）、ＩＬＬＩＩＡＬＹ
Ｌ（配列番号９）、ＶＬＦＩＦＧＣＬＬ（配列番号１０）、ＲＬＧＡＴＩＷＱＬ
（配列番号１１）、ＩＬＹＦＩＡＦＡＬ（配列番号１５）、ＳＬＶＩＶＴＴＦＶ
（配列番号１７）、ＬＭＩＩＰＬＩＮＶ（配列番号２０）、ＴＬＦＩＧＳＨＶＶ
（配列番号２４）、ＬＩＰＥＴＶＰＹＩ（配列番号２６）、ＶＬＱＷＡＳＬＡＶ
（配列番号２７）およびＱＬＴＰＨＴＫＡＶ（配列番号２９）からなる群より選
択される該エピトープを提供する。
ＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（配列番号１）、ＹＦＬＥＩＬＷＧＬ（配列番号３２）、Ｙ
ＬＬＥＩＬＷＲＬ（配列番号３３）、ＹＬＱＱＮＷＷＴＬ（配列番号６）、ＬＬ
ＬＡＬＬＦＷＬ（配列番号２）、ＬＬＶＤＬＬＷＬＬ（配列番号３）、ＬＬＬＩ
ＡＬＷＮＬ（配列番号４）、ＷＬＬＬＦＬＡＩＬ（配列番号５）、ＴＬＬＶＤＬ
ＬＷＬ（配列番号７）、ＬＬＷＬＬＬＦＬＡ（配列番号８）、ＩＬＬＩＩＡＬＹ
Ｌ（配列番号９）、ＶＬＦＩＦＧＣＬＬ（配列番号１０）、ＲＬＧＡＴＩＷＱＬ
（配列番号１１）、ＩＬＹＦＩＡＦＡＬ（配列番号１５）、ＳＬＶＩＶＴＴＦＶ
（配列番号１７）、ＬＭＩＩＰＬＩＮＶ（配列番号２０）、ＴＬＦＩＧＳＨＶＶ
（配列番号２４）、ＬＩＰＥＴＶＰＹＩ（配列番号２６）、ＶＬＱＷＡＳＬＡＶ
（配列番号２７）およびＱＬＴＰＨＴＫＡＶ（配列番号２９）からなる群より選
択される該エピトープを提供する。
【００１１】 第３の態様において、本発明は本発明の第１の態様に記載のＥＢＶ細胞傷害性
Ｔ細胞エピトープを含むサブユニットワクチンを提供する。
Ｔ細胞エピトープを含むサブユニットワクチンを提供する。
【００１２】 好ましい実施形態においては、上記サブユニットワクチンはＹＬＬＥＭＬＷＲ
Ｌ（配列番号１）、ＹＦＬＥＩＬＷＧＬ（配列番号３２）、ＹＬＬＥＩＬＷＲＬ
（配列番号３３）、ＹＬＱＱＮＷＷＴＬ（配列番号６）、ＬＬＬＡＬＬＦＷＬ（
配列番号２）、ＬＬＶＤＬＬＷＬＬ（配列番号３）、ＬＬＬＩＡＬＷＮＬ（配列
番号４）、ＷＬＬＬＦＬＡＩＬ（配列番号５）、ＴＬＬＶＤＬＬＷＬ（配列番号
７）、ＬＬＷＬＬＬＦＬＡ（配列番号８）、ＩＬＬＩＩＡＬＹＬ（配列番号９）
、ＶＬＦＩＦＧＣＬＬ（配列番号１０）、ＲＬＧＡＴＩＷＱＬ（配列番号１１）
、ＩＬＹＦＩＡＦＡＬ（配列番号１５）、ＳＬＶＩＶＴＴＦＶ（配列番号１７）
、ＬＭＩＩＰＬＩＮＶ（配列番号２０）、ＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号２４）
、ＬＩＰＥＴＶＰＹＩ（配列番号２６）、ＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号２７）
およびＱＬＴＰＨＴＫＡＶ（配列番号２９）からなる群より選択される少なくと
も１つのＴ細胞エピトープを含む。
Ｌ（配列番号１）、ＹＦＬＥＩＬＷＧＬ（配列番号３２）、ＹＬＬＥＩＬＷＲＬ
（配列番号３３）、ＹＬＱＱＮＷＷＴＬ（配列番号６）、ＬＬＬＡＬＬＦＷＬ（
配列番号２）、ＬＬＶＤＬＬＷＬＬ（配列番号３）、ＬＬＬＩＡＬＷＮＬ（配列
番号４）、ＷＬＬＬＦＬＡＩＬ（配列番号５）、ＴＬＬＶＤＬＬＷＬ（配列番号
７）、ＬＬＷＬＬＬＦＬＡ（配列番号８）、ＩＬＬＩＩＡＬＹＬ（配列番号９）
、ＶＬＦＩＦＧＣＬＬ（配列番号１０）、ＲＬＧＡＴＩＷＱＬ（配列番号１１）
、ＩＬＹＦＩＡＦＡＬ（配列番号１５）、ＳＬＶＩＶＴＴＦＶ（配列番号１７）
、ＬＭＩＩＰＬＩＮＶ（配列番号２０）、ＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号２４）
、ＬＩＰＥＴＶＰＹＩ（配列番号２６）、ＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号２７）
およびＱＬＴＰＨＴＫＡＶ（配列番号２９）からなる群より選択される少なくと
も１つのＴ細胞エピトープを含む。
【００１３】 本発明の好ましい態様においては、上記エピトープはＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（配
列番号１）、ＹＬＱＱＮＷＷＴＬ（配列番号６）、ＹＦＬＥＩＬＷＧＬ（配列番
号３２）、ＹＬＬＥＩＬＷＲＬ（配列番号３３）、ＳＬＶＩＶＴＴＦＶ（配列番
号１７）、ＬＭＩＩＰＬＩＮＶ（配列番号２０）、ＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番
号２４）およびＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号２７）からなる群より選択される
。
列番号１）、ＹＬＱＱＮＷＷＴＬ（配列番号６）、ＹＦＬＥＩＬＷＧＬ（配列番
号３２）、ＹＬＬＥＩＬＷＲＬ（配列番号３３）、ＳＬＶＩＶＴＴＦＶ（配列番
号１７）、ＬＭＩＩＰＬＩＮＶ（配列番号２０）、ＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番
号２４）およびＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号２７）からなる群より選択される
。
【００１４】 さらに好ましい実施形態においては、上記サブユニットワクチンは１以上の追
加のＥＢＶ細胞傷害性Ｔ細胞エピトープを含む。この追加のＥＢＶ細胞傷害性Ｔ
細胞エピトープは、参照としてその全体をここに組み入れるＷＯ ９７／４５４
４４に記載のエピトープから選択することができる。
加のＥＢＶ細胞傷害性Ｔ細胞エピトープを含む。この追加のＥＢＶ細胞傷害性Ｔ
細胞エピトープは、参照としてその全体をここに組み入れるＷＯ ９７／４５４
４４に記載のエピトープから選択することができる。
【００１５】 本発明のさらに好ましい実施形態においては、上記ワクチンは油中水型製剤を
含む。さらに好ましくは、上記ワクチンは、少なくとも１つの細胞傷害性Ｔ細胞
エピトープに加えて、個体がそれに対して既往性応答を開始する（ｍｏｕｎｔ）
少なくとも１つの抗原をさらに含む。
含む。さらに好ましくは、上記ワクチンは、少なくとも１つの細胞傷害性Ｔ細胞
エピトープに加えて、個体がそれに対して既往性応答を開始する（ｍｏｕｎｔ）
少なくとも１つの抗原をさらに含む。
【００１６】 上記少なくとも１つの抗原は、好ましくは、破傷風トキソイド、ジフテリアト
キソイド、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）抗原、ポリ
オウイルス抗原、精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）およびｇｐ３５０タンパク質
〔Ｔｈｏｒｌｅｙ−Ｌａｗｓｏｎ，Ｄ．Ａ．およびＰｏｏｄｒｙ，Ｃ．Ａ．（１
９８２），「ｉｎ ｖｉｖｏにおける中和抗体の生成に関与するエプスタイン・
バーウイルスの主要成分（ｇｐ３５０−ｇｐ２２０）の同定および単離」、Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．４３，７３０−７３６］、ヘルパーエピトープおよびそれらの組合
せからなる群より選択され、そして好ましくは破傷風トキソイドである。
キソイド、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）抗原、ポリ
オウイルス抗原、精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）およびｇｐ３５０タンパク質
〔Ｔｈｏｒｌｅｙ−Ｌａｗｓｏｎ，Ｄ．Ａ．およびＰｏｏｄｒｙ，Ｃ．Ａ．（１
９８２），「ｉｎ ｖｉｖｏにおける中和抗体の生成に関与するエプスタイン・
バーウイルスの主要成分（ｇｐ３５０−ｇｐ２２０）の同定および単離」、Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．４３，７３０−７３６］、ヘルパーエピトープおよびそれらの組合
せからなる群より選択され、そして好ましくは破傷風トキソイドである。
【００１７】 好ましくは、上記油中水型製剤はＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０である
。この製剤に関するさらなる情報は、相互参照としてその開示をここに組み入れ
るＷＯ ９５／２４９２６に記載されている。
。この製剤に関するさらなる情報は、相互参照としてその開示をここに組み入れ
るＷＯ ９５／２４９２６に記載されている。
【００１８】 上記サブユニットワクチンは、ＩＳＣＯＭを用いて製剤化してもよい。ＩＳＣ
ＯＭに関するさらなる情報は、相互参照としてその開示をここに組み入れるオー
ストラリア国特許第５５８２５８、５９０９０４、６３２０６７および５８９９
１５号に記載されている。
ＯＭに関するさらなる情報は、相互参照としてその開示をここに組み入れるオー
ストラリア国特許第５５８２５８、５９０９０４、６３２０６７および５８９９
１５号に記載されている。
【００１９】 第４の態様において、本発明は本発明の第１の態様によるエプスタイン・バー
ウイルス（ＥＢＶ）細胞傷害性Ｔ細胞エピトープをコードする単離された核酸配
列を提供する。
ウイルス（ＥＢＶ）細胞傷害性Ｔ細胞エピトープをコードする単離された核酸配
列を提供する。
【００２０】 好ましい実施形態においては、上記単離された核酸配列はＹＬＬＥＭＬＷＲＬ
（配列番号１）、ＹＦＬＥＩＬＷＧＬ（配列番号３２）、ＹＬＬＥＩＬＷＲＬ（
配列番号３３）、ＹＬＱＱＮＷＷＴＬ（配列番号６）、ＬＬＬＡＬＬＦＷＬ（配
列番号２）、ＬＬＶＤＬＬＷＬＬ（配列番号３）、ＬＬＬＩＡＬＷＮＬ（配列番
号４）、ＷＬＬＬＦＬＡＩＬ（配列番号５）、ＴＬＬＶＤＬＬＷＬ（配列番号７
）、ＬＬＷＬＬＬＦＬＡ（配列番号８）、ＩＬＬＩＩＡＬＹＬ（配列番号９）、
ＶＬＦＩＦＧＣＬＬ（配列番号１０）、ＲＬＧＡＴＩＷＱＬ（配列番号１１）、
ＩＬＹＦＩＡＦＡＬ（配列番号１５）、ＳＬＶＩＶＴＴＦＶ（配列番号１７）、
ＬＭＩＩＰＬＩＮＶ（配列番号２０）、ＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号２４）、
ＬＩＰＥＴＶＰＹＩ（配列番号２６）、ＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号２７）お
よびＱＬＴＰＨＴＫＡＶ（配列番号２９）からなる群より選択される細胞傷害性
Ｔ細胞エピトープの少なくとも１つをコードする。
（配列番号１）、ＹＦＬＥＩＬＷＧＬ（配列番号３２）、ＹＬＬＥＩＬＷＲＬ（
配列番号３３）、ＹＬＱＱＮＷＷＴＬ（配列番号６）、ＬＬＬＡＬＬＦＷＬ（配
列番号２）、ＬＬＶＤＬＬＷＬＬ（配列番号３）、ＬＬＬＩＡＬＷＮＬ（配列番
号４）、ＷＬＬＬＦＬＡＩＬ（配列番号５）、ＴＬＬＶＤＬＬＷＬ（配列番号７
）、ＬＬＷＬＬＬＦＬＡ（配列番号８）、ＩＬＬＩＩＡＬＹＬ（配列番号９）、
ＶＬＦＩＦＧＣＬＬ（配列番号１０）、ＲＬＧＡＴＩＷＱＬ（配列番号１１）、
ＩＬＹＦＩＡＦＡＬ（配列番号１５）、ＳＬＶＩＶＴＴＦＶ（配列番号１７）、
ＬＭＩＩＰＬＩＮＶ（配列番号２０）、ＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号２４）、
ＬＩＰＥＴＶＰＹＩ（配列番号２６）、ＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号２７）お
よびＱＬＴＰＨＴＫＡＶ（配列番号２９）からなる群より選択される細胞傷害性
Ｔ細胞エピトープの少なくとも１つをコードする。
【００２１】 当業者によって理解されるように、上記核酸配列はむき出しの核酸として移送
することもできるし、または適切なウイルスもしくは細菌ベクターを用いて移送
することもできる。適切な細菌ベクターはサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
）亜種の細菌である。適切なウイルスベクターは、例えば、レトロウイルスベク
ター、アデノウイルスベクターおよびワクシニアベクターである。適切なワクシ
ニアベクターの１例は、改変ワクシニア・アンカラ（Ｖａｃｃｉｎｉａ Ａｎｋ
ａｒａ）ベクターである。
することもできるし、または適切なウイルスもしくは細菌ベクターを用いて移送
することもできる。適切な細菌ベクターはサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
）亜種の細菌である。適切なウイルスベクターは、例えば、レトロウイルスベク
ター、アデノウイルスベクターおよびワクシニアベクターである。適切なワクシ
ニアベクターの１例は、改変ワクシニア・アンカラ（Ｖａｃｃｉｎｉａ Ａｎｋ
ａｒａ）ベクターである。
【００２２】 核酸配列の移送に適するベクターは以前に文献記載されている。例えば、アル
ファウイルス（ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）ベクターがタンパク質の構造および機能
を研究するため及びタンパク質産生のための基礎研究において広く使用されるよ
うになった。種々のベクターの開発が、外来の配列をむき出しのＲＮＡもしくは
ＤＮＡとして、またはヘルパーベクター戦略を用いて作製される自殺ウイルス（
ｓｕｉｃｉｄｅ ｖｉｒｕｓ）粒子として移送することを可能とした。以前の報
告はまた、一過性の高レベルのタンパク質発現が望まれる場合、これらのベクタ
ーはｉｎ ｖｉｖｏにおける適用にも有用であることを示唆している（例えば、
組換えワクチンなど）。初期の研究では、アルファウイルスワクチンは良好な免
疫学的記憶および保護作用を伴う強い体液性および細胞性免疫応答を誘導できる
ことをすでに示されている。例えば、Ｔｕｂｕｌｅｋａｓ Ｉ．，Ｂｅｒｇｌｕ
ｎｄ Ｐ．，Ｆｌｅｅｔｏｎ Ｍ．およびＬｉｌｊｅｓｔｒｏｍ Ｐ．（１９９
７），「アルファウイルス発現ベクター、および組換えワクチンとしてのそれら
の使用：小総論」、Ｇｅｎｅ １９０（１）：１９１−１９５を参照されたい。
ファウイルス（ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）ベクターがタンパク質の構造および機能
を研究するため及びタンパク質産生のための基礎研究において広く使用されるよ
うになった。種々のベクターの開発が、外来の配列をむき出しのＲＮＡもしくは
ＤＮＡとして、またはヘルパーベクター戦略を用いて作製される自殺ウイルス（
ｓｕｉｃｉｄｅ ｖｉｒｕｓ）粒子として移送することを可能とした。以前の報
告はまた、一過性の高レベルのタンパク質発現が望まれる場合、これらのベクタ
ーはｉｎ ｖｉｖｏにおける適用にも有用であることを示唆している（例えば、
組換えワクチンなど）。初期の研究では、アルファウイルスワクチンは良好な免
疫学的記憶および保護作用を伴う強い体液性および細胞性免疫応答を誘導できる
ことをすでに示されている。例えば、Ｔｕｂｕｌｅｋａｓ Ｉ．，Ｂｅｒｇｌｕ
ｎｄ Ｐ．，Ｆｌｅｅｔｏｎ Ｍ．およびＬｉｌｊｅｓｔｒｏｍ Ｐ．（１９９
７），「アルファウイルス発現ベクター、および組換えワクチンとしてのそれら
の使用：小総論」、Ｇｅｎｅ １９０（１）：１９１−１９５を参照されたい。
【００２３】 組換えポックスウイルス（ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）は、異種病原体に対するワク
チン投与のために作製された。これらの中で、下記のものは代表的な例である。
（ｉ）狂犬病ウイルス（ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ）糖タンパク質を発現するた
めのワクシニアウイルスＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ株の作製。餌に適用した場合、こ
の組換え体はヨーロッパのアカギツネおよび米国のアライグマにワクチン接種を
施し、野生における狂犬病ウイルス感染の蔓延をくい止めることが示された。（
ｉｉ）ニューカッスル（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ）病ウイルス融合体およびヘマグル
チニン糖タンパク質を発現する、鶏痘（ｆｏｗｌｐｏｘ）ウイルスに基づく組換
え体は、このワクチンを１日令で投与した場合、ニューカッスル病ウイルスまた
はポックスベクターに対する母児免疫の存在下においても、商業用ブロイラーニ
ワトリを一生にわたって保護することが示された。（ｉｉｉ）カナリア痘（ｃａ
ｎａｒｙｐｏｘ）ウイルス（この複製は鳥類種に限定されている）の組換え体は
、ネコおよびイヌにおいて狂犬病ウイルスチャレンジに対する保護を、ならびに
イヌ・ジステンバーウイルス、ネコ白血病ウイルスおよびウマ・インフルエンザ
ウイルス病に対する保護を提供した。ヒトにおいては、狂犬病ウイルス、日本脳
炎ウイルスおよびＨＩＶ由来の抗原を発現するカナリヤ痘ウイルスに基づく組換
え体は、安全かつ免疫原性であることが示された。（ｉｖ）動物およびヒト病原
体の両方に由来する抗原を発現するために、高度に弱毒化されたワクシニア誘導
体ＮＹＶＡＣが作製された。狂犬病ウイルス糖タンパク質、日本脳炎ウイルス由
来のポリタンパク質、熱帯熱マラリヤ原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉ
ｐａｒｕｍ）由来の７つの抗原を発現するＮＹＶＡＣに基づく組換え体は、安全
かつ免疫原性であることが初期のヒトワクチン研究において実証された。例えば
、Ｐａｏｌｅｔｔｉ Ｅ．（１９９６）「ポックスウイルスベクターのワクチン
接種への適用：最新情報」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
９３（２１）：１１３４９−１１３５３を参照されたい。
チン投与のために作製された。これらの中で、下記のものは代表的な例である。
（ｉ）狂犬病ウイルス（ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ）糖タンパク質を発現するた
めのワクシニアウイルスＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ株の作製。餌に適用した場合、こ
の組換え体はヨーロッパのアカギツネおよび米国のアライグマにワクチン接種を
施し、野生における狂犬病ウイルス感染の蔓延をくい止めることが示された。（
ｉｉ）ニューカッスル（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ）病ウイルス融合体およびヘマグル
チニン糖タンパク質を発現する、鶏痘（ｆｏｗｌｐｏｘ）ウイルスに基づく組換
え体は、このワクチンを１日令で投与した場合、ニューカッスル病ウイルスまた
はポックスベクターに対する母児免疫の存在下においても、商業用ブロイラーニ
ワトリを一生にわたって保護することが示された。（ｉｉｉ）カナリア痘（ｃａ
ｎａｒｙｐｏｘ）ウイルス（この複製は鳥類種に限定されている）の組換え体は
、ネコおよびイヌにおいて狂犬病ウイルスチャレンジに対する保護を、ならびに
イヌ・ジステンバーウイルス、ネコ白血病ウイルスおよびウマ・インフルエンザ
ウイルス病に対する保護を提供した。ヒトにおいては、狂犬病ウイルス、日本脳
炎ウイルスおよびＨＩＶ由来の抗原を発現するカナリヤ痘ウイルスに基づく組換
え体は、安全かつ免疫原性であることが示された。（ｉｖ）動物およびヒト病原
体の両方に由来する抗原を発現するために、高度に弱毒化されたワクシニア誘導
体ＮＹＶＡＣが作製された。狂犬病ウイルス糖タンパク質、日本脳炎ウイルス由
来のポリタンパク質、熱帯熱マラリヤ原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉ
ｐａｒｕｍ）由来の７つの抗原を発現するＮＹＶＡＣに基づく組換え体は、安全
かつ免疫原性であることが初期のヒトワクチン研究において実証された。例えば
、Ｐａｏｌｅｔｔｉ Ｅ．（１９９６）「ポックスウイルスベクターのワクチン
接種への適用：最新情報」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
９３（２１）：１１３４９−１１３５３を参照されたい。
【００２４】 体内寄生生物、特に粘膜コンパートメント（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）を冒す
ものをコントロールする効果的なワクチンを目指す進展は、寄生生物の抗原の複
雑性および宿主応答の理解の欠如という問題によって停止してしまった。しかし
、粘膜免疫の調節に関する情報の蓄積は、ワクチン接種選択の再評価を可能とさ
せ、適切な粘膜エフェクター応答を提供した。Ｔ細胞の作用の重要な役割、そし
て特にサイトカインシグナルの関与はｉｎ ｖｉｔｒｏ研究から明確に確証され
たが、本発明者らの研究室で得られたデータはｉｎ ｖｉｖｏにおけるこれらの
作用の証拠を提供する。本発明者らは、腸応答の経過の決定におけるＴ細胞の役
割を示した。そして、これに関連して局部的Ｔｈ２サイトカイン産生の役割を提
案する。この提案を支持するため、我々は健常な動物および寄生生物に冒されて
いる動物を用いて、サイトカインｍＲＮＡの分布をｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイ
ゼーション技法によって測定した。さらに、我々は（遺伝子ノックアウト動物を
用いて）Ｔｈ２サイトカインの不在下では粘膜応答が全般に不十分であることを
示した。本発明者らはまた、この不十分さが特定のベクターを用いた遺伝子治療
によって克服できることを示した。これらの研究は、伝統的な免疫感作方法を、
局部的なサイトカイン産生をアップレギュレーションする戦略と組合せることに
よって、新規な粘膜免疫感作の機会が存在することを示した。しかし、これらの
新しい戦略の成功は、適切なアジュバント／ビヒクル組成物を用いたサイトカイ
ン操作およびデリバリーのための技法と組合せた、高度に免疫原性なサブユニッ
ト抗原の選択に依存するであろう。本明細書は、全身性または経口投与後に粘膜
を刺激するために、適切な部位までシャペロンに不安定な抗原および遺伝物質を
運んでいくのに利用可能なデリバリー技法を再検討する。例えば、Ｓｕｔｔｅｒ
Ｇ．ら，（１９９４）「宿主を限定され、かつ高度に弱毒化されたワクシニア
ウイルスＭＶＡ株に由来する組換えベクターはマウスにおいてインフルエンザウ
イルスに対する保護免疫を刺激する」，Ｖａｃｃｉｎｅ１２：１０３２−１０４
０；およびＨｕｓｂａｎｄ Ａ．Ｊ．，Ｂａｏ Ｓ．，ＭｃＣｌｕｒｅ Ｓ．Ｊ
．，Ｅｍｅｒｙ Ｄ．Ｌ．，Ｒａｍｓａｙ Ａ．Ｊ．（１９９６）「粘膜ワクチ
ンのための抗原デリバリー戦略」，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ ８−９：
８２５−８３４を参照されたい。
ものをコントロールする効果的なワクチンを目指す進展は、寄生生物の抗原の複
雑性および宿主応答の理解の欠如という問題によって停止してしまった。しかし
、粘膜免疫の調節に関する情報の蓄積は、ワクチン接種選択の再評価を可能とさ
せ、適切な粘膜エフェクター応答を提供した。Ｔ細胞の作用の重要な役割、そし
て特にサイトカインシグナルの関与はｉｎ ｖｉｔｒｏ研究から明確に確証され
たが、本発明者らの研究室で得られたデータはｉｎ ｖｉｖｏにおけるこれらの
作用の証拠を提供する。本発明者らは、腸応答の経過の決定におけるＴ細胞の役
割を示した。そして、これに関連して局部的Ｔｈ２サイトカイン産生の役割を提
案する。この提案を支持するため、我々は健常な動物および寄生生物に冒されて
いる動物を用いて、サイトカインｍＲＮＡの分布をｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイ
ゼーション技法によって測定した。さらに、我々は（遺伝子ノックアウト動物を
用いて）Ｔｈ２サイトカインの不在下では粘膜応答が全般に不十分であることを
示した。本発明者らはまた、この不十分さが特定のベクターを用いた遺伝子治療
によって克服できることを示した。これらの研究は、伝統的な免疫感作方法を、
局部的なサイトカイン産生をアップレギュレーションする戦略と組合せることに
よって、新規な粘膜免疫感作の機会が存在することを示した。しかし、これらの
新しい戦略の成功は、適切なアジュバント／ビヒクル組成物を用いたサイトカイ
ン操作およびデリバリーのための技法と組合せた、高度に免疫原性なサブユニッ
ト抗原の選択に依存するであろう。本明細書は、全身性または経口投与後に粘膜
を刺激するために、適切な部位までシャペロンに不安定な抗原および遺伝物質を
運んでいくのに利用可能なデリバリー技法を再検討する。例えば、Ｓｕｔｔｅｒ
Ｇ．ら，（１９９４）「宿主を限定され、かつ高度に弱毒化されたワクシニア
ウイルスＭＶＡ株に由来する組換えベクターはマウスにおいてインフルエンザウ
イルスに対する保護免疫を刺激する」，Ｖａｃｃｉｎｅ１２：１０３２−１０４
０；およびＨｕｓｂａｎｄ Ａ．Ｊ．，Ｂａｏ Ｓ．，ＭｃＣｌｕｒｅ Ｓ．Ｊ
．，Ｅｍｅｒｙ Ｄ．Ｌ．，Ｒａｍｓａｙ Ａ．Ｊ．（１９９６）「粘膜ワクチ
ンのための抗原デリバリー戦略」，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ ８−９：
８２５−８３４を参照されたい。
【００２５】 ａｒｏＣおよびａｒｏＤに欠失突然変異を有する弱毒化腸チフス菌（Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ）ワクチン株ＣＶＤ９０８は十分に寛容であり、かつ高
度に免疫原性であって、効果的な血清抗体、粘膜ＩｇＡおよび細胞媒介免疫応答
を誘導することが示された。ｈｔｒＡ（これはＣＶＤ ９０８中でセリンプロテ
アーゼとしての活性をも有する熱ショックタンパク質をコードする）に欠失を導
入することによって作製されたさらなる誘導体は、ＣＶＤ ９０８−ｈｔｒＡを
もたらした。フェース１臨床トライアルにおいて、ＣＶＤ ９０８−ｈｔｒＡは
経口生ワクチン候補として非常に魅力的に思われる。ＣＶＤ ９０８およびＣＶ
Ｄ ９０８−ｈｔｒＡは両方とも、外来抗原を免疫系にデリバリーする生ベクター
ワクチンとして有用である。ＣＶＤ ９０８およびＣＶＤ ９０８−ｈｔｒＡに
担持される外来抗原の発現および免疫原性を増大させる条件が現在検討されてい
る。サルモネラベクターの総論については、Ｌｅｖｉｎｅ Ｍ．Ｍ．，Ｇａｌｅ
ｎ Ｊ．，Ｂａｒｒｙ Ｅ．，Ｎｏｒｉｅｇａ Ｆ．，Ｃｈａｔｆｉｅｌｄ Ｓ
．，Ｓｚｔｅｉｎ Ｍ．，Ｄｏｕｇａｎ Ｇ．およびＴａｃｋｅｔ Ｃ．（１９
９６），「腸チフスに対する経口生ワクチンとしての、および生ベクターとして
の弱毒化サルモネラ」，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４４（１−３）：１９３−
１９６。
ｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ）ワクチン株ＣＶＤ９０８は十分に寛容であり、かつ高
度に免疫原性であって、効果的な血清抗体、粘膜ＩｇＡおよび細胞媒介免疫応答
を誘導することが示された。ｈｔｒＡ（これはＣＶＤ ９０８中でセリンプロテ
アーゼとしての活性をも有する熱ショックタンパク質をコードする）に欠失を導
入することによって作製されたさらなる誘導体は、ＣＶＤ ９０８−ｈｔｒＡを
もたらした。フェース１臨床トライアルにおいて、ＣＶＤ ９０８−ｈｔｒＡは
経口生ワクチン候補として非常に魅力的に思われる。ＣＶＤ ９０８およびＣＶ
Ｄ ９０８−ｈｔｒＡは両方とも、外来抗原を免疫系にデリバリーする生ベクター
ワクチンとして有用である。ＣＶＤ ９０８およびＣＶＤ ９０８−ｈｔｒＡに
担持される外来抗原の発現および免疫原性を増大させる条件が現在検討されてい
る。サルモネラベクターの総論については、Ｌｅｖｉｎｅ Ｍ．Ｍ．，Ｇａｌｅ
ｎ Ｊ．，Ｂａｒｒｙ Ｅ．，Ｎｏｒｉｅｇａ Ｆ．，Ｃｈａｔｆｉｅｌｄ Ｓ
．，Ｓｚｔｅｉｎ Ｍ．，Ｄｏｕｇａｎ Ｇ．およびＴａｃｋｅｔ Ｃ．（１９
９６），「腸チフスに対する経口生ワクチンとしての、および生ベクターとして
の弱毒化サルモネラ」，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４４（１−３）：１９３−
１９６。
【００２６】 上記の単離された核酸配列は、核酸ワクチンの形態であってよい。核酸ワクチ
ンに関するさらなる情報は、相互参照としてその開示をここに組み入れるＷＯ９
６／０３１４４およびＳｕｈｒｂｉｅｒ Ａ．（１９９７）「多重エピトープＤ
ＮＡワクチン」、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７５（４）：４０２−
４０８に見出すことができる。
ンに関するさらなる情報は、相互参照としてその開示をここに組み入れるＷＯ９
６／０３１４４およびＳｕｈｒｂｉｅｒ Ａ．（１９９７）「多重エピトープＤ
ＮＡワクチン」、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７５（４）：４０２−
４０８に見出すことができる。
【００２７】 第５の態様において、本発明は本発明の第１または第２の態様によるエピトー
プを少なくとも１つを含む単離されたポリペプチドを提供する。
プを少なくとも１つを含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００２８】 本発明のワクチンは、予防目的または治療目的で用いることができる。
【００２９】 本発明のＣＴＬエピトープは、当業者に周知の技法を用いて合成することが可
能である。例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎによって編集され、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓによって出版された”Ｓｙ
ｎｔｈｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ”におさめられた、Ａｔｈｅｒｔｏｎおよび
Ｓｈｅｐｐａｒｄによる第９章”Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”に記述
されている液相合成または固相合成を用いて、上記ＣＴＬエピトープを合成する
ことができる。好ましくは固相支持体が用いられる。これはポリスチレンゲルビ
ーズであってよく、その場合、このポリスチレンは少量（例えば１％）のジビニ
ルベンゼンを用いて架橋されていてもよく、ジクロロメタン等の親油性溶媒また
はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等のより極性の溶媒によってさらに膨潤させ
る。クロロメチル基またはアミノメチル基を用いて上記ポリスチレンを機能化し
てもよい。または、ＤＭＦおよび他の双極性非プロトン性溶媒によって高度に溶
媒和させ、膨潤させることができる、架橋され、かつ機能化されたポリジメチル
−アクリルアミドゲルが用いられる。ポリエチレングリコールをベースとする他
の支持体も使用できる。この場合、通常ポリエチレングリコールはグラフト化し
ているか、または不活性なポリスチレンビーズの表面に結合している。好ましい
形態では、ＰＡＬ−ＰＥＧ、ＰＡＫ−ＰＥＧ、ＫＡ、ＫＲまたはＴＧＲから選択
される市販の固相支持体または樹脂が使用される。
能である。例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎによって編集され、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓによって出版された”Ｓｙ
ｎｔｈｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ”におさめられた、Ａｔｈｅｒｔｏｎおよび
Ｓｈｅｐｐａｒｄによる第９章”Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”に記述
されている液相合成または固相合成を用いて、上記ＣＴＬエピトープを合成する
ことができる。好ましくは固相支持体が用いられる。これはポリスチレンゲルビ
ーズであってよく、その場合、このポリスチレンは少量（例えば１％）のジビニ
ルベンゼンを用いて架橋されていてもよく、ジクロロメタン等の親油性溶媒また
はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等のより極性の溶媒によってさらに膨潤させ
る。クロロメチル基またはアミノメチル基を用いて上記ポリスチレンを機能化し
てもよい。または、ＤＭＦおよび他の双極性非プロトン性溶媒によって高度に溶
媒和させ、膨潤させることができる、架橋され、かつ機能化されたポリジメチル
−アクリルアミドゲルが用いられる。ポリエチレングリコールをベースとする他
の支持体も使用できる。この場合、通常ポリエチレングリコールはグラフト化し
ているか、または不活性なポリスチレンビーズの表面に結合している。好ましい
形態では、ＰＡＬ−ＰＥＧ、ＰＡＫ−ＰＥＧ、ＫＡ、ＫＲまたはＴＧＲから選択
される市販の固相支持体または樹脂が使用される。
【００３０】 固相合成においては、アミノ基、カルボキシル基または側鎖官能基の望ましく
ない反応性をマスクする、ならびにアミノ酸およびペプチドを不活性にするそれ
らの双極性を破壊する、という二重の機能をもつ可逆性ブロッキング基が用いら
れる。そのような官能基は、ｔ−ブトキシカルボキシルまたはＲＯＣ誘導体とし
て知られる、ＲＣＯ−ＯＣＭｅ３−ＣＯ−ＮＨＲの構造を有するｔ−ブチルエス
テルから選択することができる。また、ベンジルオキシカルボニルまたはＺ−誘
導体として知られる、ＲＣＯ−ＯＣＨ２−Ｃ６Ｈ５の構造を有する対応するベン
ジルエステルおよびＣ６Ｈ５ＣＨ２ＯＣＯ−ＮＨＲの構造を有する対応するウレ
タンを用いてもよい。また、フルオレニルメタノールの誘導体、特にフルオレニ
ル−メトキシカルボニルまたはＦｍｏｃ基を用いてもよい。これらのタイプの保
護基のそれぞれは、他の保護基の存在下で独立した開裂が可能であり、例えばＢ
ＯＣ−ベンジルおよびＦｍｏｃ−第三級ブチル保護戦略が頻繁に用いられている
。
ない反応性をマスクする、ならびにアミノ酸およびペプチドを不活性にするそれ
らの双極性を破壊する、という二重の機能をもつ可逆性ブロッキング基が用いら
れる。そのような官能基は、ｔ−ブトキシカルボキシルまたはＲＯＣ誘導体とし
て知られる、ＲＣＯ−ＯＣＭｅ３−ＣＯ−ＮＨＲの構造を有するｔ−ブチルエス
テルから選択することができる。また、ベンジルオキシカルボニルまたはＺ−誘
導体として知られる、ＲＣＯ−ＯＣＨ２−Ｃ６Ｈ５の構造を有する対応するベン
ジルエステルおよびＣ６Ｈ５ＣＨ２ＯＣＯ−ＮＨＲの構造を有する対応するウレ
タンを用いてもよい。また、フルオレニルメタノールの誘導体、特にフルオレニ
ル−メトキシカルボニルまたはＦｍｏｃ基を用いてもよい。これらのタイプの保
護基のそれぞれは、他の保護基の存在下で独立した開裂が可能であり、例えばＢ
ＯＣ−ベンジルおよびＦｍｏｃ−第三級ブチル保護戦略が頻繁に用いられている
。
【００３１】 保護されたアミノ酸またはペプチドのアミノ基およびカルボキシル基を結合す
る縮合剤にも言及しなければならない。これは、カルボキシル基が遊離の第一級
または第二級アミンと自然に反応するように、カルボキシル基を活性化すること
により行われる。この目的のためには、ｐ−ニトロフェノールおよびペンタフル
オロフェニルなどから誘導された活性化エステルを用いることができる。それら
の反応性は１−ヒドロキシベンゾトリアゾールなどの触媒の添加によって増大さ
せることができる。トリアジンのエステルＤＨＢＴ（上記Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ文
献の第２１５−２１６頁に記述されている）を用いることもできる。上記カルボ
ン酸（すなわち、Ｎα保護アミノ酸またはペプチド）を縮合試薬で処理すること
によって他のアシル化種がｉｎ ｓｉｔｕで形成され、すぐにアミノ成分（カル
ボキシル基またはＣ−保護アミノ酸またはペプチド）と反応させられる。ジクロ
ロヘキシルカルボジイミド、ＢＯＰ試薬（上記Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ文献の第２１
６頁に記述されている）、Ｏ’ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラ
メチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびその類似体
であるテトラフルオロホウ酸塩が縮合剤として頻繁に用いられている。
る縮合剤にも言及しなければならない。これは、カルボキシル基が遊離の第一級
または第二級アミンと自然に反応するように、カルボキシル基を活性化すること
により行われる。この目的のためには、ｐ−ニトロフェノールおよびペンタフル
オロフェニルなどから誘導された活性化エステルを用いることができる。それら
の反応性は１−ヒドロキシベンゾトリアゾールなどの触媒の添加によって増大さ
せることができる。トリアジンのエステルＤＨＢＴ（上記Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ文
献の第２１５−２１６頁に記述されている）を用いることもできる。上記カルボ
ン酸（すなわち、Ｎα保護アミノ酸またはペプチド）を縮合試薬で処理すること
によって他のアシル化種がｉｎ ｓｉｔｕで形成され、すぐにアミノ成分（カル
ボキシル基またはＣ−保護アミノ酸またはペプチド）と反応させられる。ジクロ
ロヘキシルカルボジイミド、ＢＯＰ試薬（上記Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ文献の第２１
６頁に記述されている）、Ｏ’ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラ
メチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびその類似体
であるテトラフルオロホウ酸塩が縮合剤として頻繁に用いられている。
【００３２】 固相支持体への第１のアミノ酸の結合は、ＢＯＣアミノ酸を用いて任意の適切
な方法で実施することができる。１つの方法では、トリエチルアンモニウム塩を
クロロメチル樹脂と共に温めることによってＢＯＣアミノ酸を該樹脂に結合させ
る。同様の方法でＦｍｏｃアミノ酸をｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂に
結合させてもよい。または、種々の結合剤または第１のアミノ酸を樹脂に連結さ
せる「ハンドル（ｈａｎｄｌｅ）」を用いてもよい。この目的のためには、アミ
ノエチルポリスチレンに結合させたｐ−ヒドロキシメチルフェニル乳酸を用いる
ことができる。
な方法で実施することができる。１つの方法では、トリエチルアンモニウム塩を
クロロメチル樹脂と共に温めることによってＢＯＣアミノ酸を該樹脂に結合させ
る。同様の方法でＦｍｏｃアミノ酸をｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂に
結合させてもよい。または、種々の結合剤または第１のアミノ酸を樹脂に連結さ
せる「ハンドル（ｈａｎｄｌｅ）」を用いてもよい。この目的のためには、アミ
ノエチルポリスチレンに結合させたｐ−ヒドロキシメチルフェニル乳酸を用いる
ことができる。
【００３３】 当業者によって容易に理解されるように、本発明のＬＭＰ１、ｇｐ８５および
ｇｐ３５０エピトープならびにワクチンは、ＥＢＶ感染を治療し、またＥＢＶか
ら保護するために用いることができる。さらに、免疫無防備状態の個体における
ＥＢＶ感染のさらに大きい関与の可能性を考えるならば、本発明は免疫機能の低
下した個体（例：移植患者）の治療および保護において特別の用途をもちうる。
重要なことに、本発明者らは、異なるＨＬＡ Ａ２スーパータイプを発現する、
ＥＢＶで形質転換したリンパ芽球様細胞系がＬＭＰ１特異的ＣＴＬクローンによ
って効率的に認識されることを見いだした。このことは、異なる人種集団の治療
および保護を目指す抗ウイルスワクチン設計の可能性を強く示す。
ｇｐ３５０エピトープならびにワクチンは、ＥＢＶ感染を治療し、またＥＢＶか
ら保護するために用いることができる。さらに、免疫無防備状態の個体における
ＥＢＶ感染のさらに大きい関与の可能性を考えるならば、本発明は免疫機能の低
下した個体（例：移植患者）の治療および保護において特別の用途をもちうる。
重要なことに、本発明者らは、異なるＨＬＡ Ａ２スーパータイプを発現する、
ＥＢＶで形質転換したリンパ芽球様細胞系がＬＭＰ１特異的ＣＴＬクローンによ
って効率的に認識されることを見いだした。このことは、異なる人種集団の治療
および保護を目指す抗ウイルスワクチン設計の可能性を強く示す。
【００３４】 したがって、第６の態様において、本発明は患者にＣＴＬを誘導するための組
成物の調製方法を提供する。この方法は、本発明の第１または第２の態様による
少なくとも１つのエピトープを少なくとも１つの製薬上許容される担体、希釈剤
または賦形剤と混合することを含む。
成物の調製方法を提供する。この方法は、本発明の第１または第２の態様による
少なくとも１つのエピトープを少なくとも１つの製薬上許容される担体、希釈剤
または賦形剤と混合することを含む。
【００３５】 第７の態様において、本発明は患者におけるＥＢＶ感染の危険を減少させる方
法を提供する。この方法は、患者に有効量の： （１）本発明の第１または第２の態様による少なくとも１つのＣＴＬエピトー
プ； （２）本発明の第３の態様によるサブユニットワクチン； （３）本発明の第４の態様による核酸配列； （４）本発明の第４の態様によるベクター；または （５）本発明の第５の態様によるポリペプチド を投与することを含む。
法を提供する。この方法は、患者に有効量の： （１）本発明の第１または第２の態様による少なくとも１つのＣＴＬエピトー
プ； （２）本発明の第３の態様によるサブユニットワクチン； （３）本発明の第４の態様による核酸配列； （４）本発明の第４の態様によるベクター；または （５）本発明の第５の態様によるポリペプチド を投与することを含む。
【００３６】 第８の態様において、本発明は患者における鼻咽頭癌またはホジキン（Ｈｏｄ
ｇｋｉｎ）病を治療または阻止する方法を提供する。この方法は、患者にＥＢＶ
構造抗原または潜在抗原に由来する少なくとも１つのＣＴＬエピトープを有効量
投与することを含む。
ｇｋｉｎ）病を治療または阻止する方法を提供する。この方法は、患者にＥＢＶ
構造抗原または潜在抗原に由来する少なくとも１つのＣＴＬエピトープを有効量
投与することを含む。
【００３７】 「有効量」という用語は、ＥＢＶ抗原に対するＣＴＬ応答を誘導または増幅す
るに十分なエピトープの量を意味する。
るに十分なエピトープの量を意味する。
【００３８】 本発明の第８の態様の好ましい実施形態においては、ＥＢＶ構造抗原はｇｐ８
５またはｇｐ３５０であり、潜在抗原はＬＭＰ１またはＬＭＰ２である。さらに
好ましい実施形態においては、ＣＴＬエピトープは本発明の第２の態様によって
規定されるエピトープである。
５またはｇｐ３５０であり、潜在抗原はＬＭＰ１またはＬＭＰ２である。さらに
好ましい実施形態においては、ＣＴＬエピトープは本発明の第２の態様によって
規定されるエピトープである。
【００３９】 本発明者らはまた、ＣＴＬクローンによって認識されるＮＰＣ細胞はＣＴＬ溶
解を受けるという驚くべき発見をした。この発見はＮＰＣ腫瘍をｉｎ ｖｉｖｏ
で制御するためのワクチンの設計に重要な意味をもつ。
解を受けるという驚くべき発見をした。この発見はＮＰＣ腫瘍をｉｎ ｖｉｖｏ
で制御するためのワクチンの設計に重要な意味をもつ。
【００４０】 第９の態様において、本発明はＮＰＣまたはＨＤ細胞の増殖を治療または阻止
する必要のある患者における該細胞の増殖を治療または阻止する方法を提供する
。この方法は、患者にＥＢＶ構造抗原または潜在抗原に由来する少なくとも１つ
のＣＴＬエピトープを投与することを含む。
する必要のある患者における該細胞の増殖を治療または阻止する方法を提供する
。この方法は、患者にＥＢＶ構造抗原または潜在抗原に由来する少なくとも１つ
のＣＴＬエピトープを投与することを含む。
【００４１】 本発明の第９の態様の好ましい実施形態においては、ＥＢＶ ＣＴＬエピトー
プはｇｐ８５またはｇｐ３５０抗原に由来する。さらに好ましい実施形態におい
ては、ＥＢＶ ＣＴＬエピトープはＬＭＰ１またはＬＭＰ２抗原に由来する。好
ましくは、ＣＴＬエピトープはＬＭＰ１抗原に由来する。
プはｇｐ８５またはｇｐ３５０抗原に由来する。さらに好ましい実施形態におい
ては、ＥＢＶ ＣＴＬエピトープはＬＭＰ１またはＬＭＰ２抗原に由来する。好
ましくは、ＣＴＬエピトープはＬＭＰ１抗原に由来する。
【００４２】 第１０の態様において、本発明は第１の患者におけるＮＰＣまたはＨＤ細胞の
増殖を治療または阻止する方法を提供する。この方法は、該患者にＮＰＣまたは
ＨＤ細胞を認識するＥＢＶ特異的ＣＴＬを導入することを含む。
増殖を治療または阻止する方法を提供する。この方法は、該患者にＮＰＣまたは
ＨＤ細胞を認識するＥＢＶ特異的ＣＴＬを導入することを含む。
【００４３】 好ましい実施形態において、上記ＥＢＶ特異的ＣＴＬは、ＣＴＬをＥＢＶ Ｃ
ＴＬエピトープに暴露してｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激することよってＮＰＣ患者か
ら獲得される。または、上記ＥＢＶ特異的ＣＴＬは、ＥＢＶに感染しているがＮ
ＰＣを持たない第２の患者から得てもよい。
ＴＬエピトープに暴露してｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激することよってＮＰＣ患者か
ら獲得される。または、上記ＥＢＶ特異的ＣＴＬは、ＥＢＶに感染しているがＮ
ＰＣを持たない第２の患者から得てもよい。
【００４４】 本発明の第１０の態様のさらに好ましい実施形態においては、上記ＥＢＶ特異
的ＣＴＬはＬＭＰ１および／またはＬＭＰ２特異的ＣＴＬである。
的ＣＴＬはＬＭＰ１および／またはＬＭＰ２特異的ＣＴＬである。
【００４５】 第１１の態様において、本発明は患者における伝染性単核球症または移植後リ
ンパ球増殖性疾患の危険性を低減する方法を提供する。この方法は、患者に有効
量の： （１）本発明の第１または第２の態様による少なくとも１つのＣＴＬエピトー
プ； （２）本発明の第３の態様によるサブユニットワクチン； （３）本発明の第４の態様による核酸配列； （４）本発明の第４の態様によるベクター；または （５）本発明の第５の態様によるポリペプチド を投与することを含む。
ンパ球増殖性疾患の危険性を低減する方法を提供する。この方法は、患者に有効
量の： （１）本発明の第１または第２の態様による少なくとも１つのＣＴＬエピトー
プ； （２）本発明の第３の態様によるサブユニットワクチン； （３）本発明の第４の態様による核酸配列； （４）本発明の第４の態様によるベクター；または （５）本発明の第５の態様によるポリペプチド を投与することを含む。
【００４６】 本明細書をとおして用いる「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含んでいる
（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、記述された成分もしくは特徴または
一群の成分もしくは特徴を含むことを言い、さらなる成分もしくは特徴または一
群の成分もしくは特徴を含む場合も含まない場合もある。
（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、記述された成分もしくは特徴または
一群の成分もしくは特徴を含むことを言い、さらなる成分もしくは特徴または一
群の成分もしくは特徴を含む場合も含まない場合もある。
【００４７】 本発明の性質がより明確に理解されるように、以下の実施例および図面によっ
て本発明の形態を説明する。
て本発明の形態を説明する。
【００４８】 ［発明の詳細な説明］ 実施例１材料および方法 細胞系の樹立および維持 Ｂ９５．８（１型）またはＡＧ８７６（２型）ウイルス分離株を用いた末梢Ｂ
細胞の外因性ウイルス形質転換によって、血清陽性ドナーからＬＣＬを樹立した
。さらに、Ｂ９５．８分離株で形質転換された、異なるＨＬＡ Ａ２スーパータ
イプを発現するＬＣＬもこの試験に用いた（第１２回組織適合性ワークショップ
細胞パネル；ＥＡＣＣ）。ペプチド輸送体（ＴＡＰ）陰性ＢｘＴハイブリッド細
胞系１７４ｘＣＥＭ．Ｔ２（Ｔ２と呼ぶ）（２２）をペプチド安定化アッセイに
使用した。全ての細胞系は、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリンお
よび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ
）を含むＲＰＭＩ １６４０（増殖培地）を用いて通常の方法で維持した。ＥＢ
Ｖ陰性の正常なＢ細胞の芽球の長期培養物は、前述したようにＣＤ４０系を用い
て樹立した（ＣＤ４０ Ｂ細胞と呼ぶ）（１２）。
細胞の外因性ウイルス形質転換によって、血清陽性ドナーからＬＣＬを樹立した
。さらに、Ｂ９５．８分離株で形質転換された、異なるＨＬＡ Ａ２スーパータ
イプを発現するＬＣＬもこの試験に用いた（第１２回組織適合性ワークショップ
細胞パネル；ＥＡＣＣ）。ペプチド輸送体（ＴＡＰ）陰性ＢｘＴハイブリッド細
胞系１７４ｘＣＥＭ．Ｔ２（Ｔ２と呼ぶ）（２２）をペプチド安定化アッセイに
使用した。全ての細胞系は、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリンお
よび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ
）を含むＲＰＭＩ １６４０（増殖培地）を用いて通常の方法で維持した。ＥＢ
Ｖ陰性の正常なＢ細胞の芽球の長期培養物は、前述したようにＣＤ４０系を用い
て樹立した（ＣＤ４０ Ｂ細胞と呼ぶ）（１２）。
【００４９】 バーキット（Ｂｕｒｋｉｔｔ）リンパ種（ＢＬ）細胞系ＢＪＡＢ．ｇｐｔ１，
ＢＪＡＢ．ＭＴＬＭ６，ＭＵＴＵ ｃｌ．５９およびＭＵＴＵ ｃｌ．２１６を
この試験に用いた。これらは、非風土病性または風土病性バーキットリンパ種を
もつ患者由来であった。ＢＪＡＢ．ｇｐｔ１およびＭＵＴＵ ｃｌ．２１６はＬ
ＭＰ１に関して陰性であるが、ＢＪＡＢ．ＭＴＬＭ６およびＭＵＴＵ ｃｌ．５
９はＬＭＰ１を発現することが以前に示された（５、２７）。これらのＢＬ細胞
系は増殖培地中で通常の方法で維持した。
ＢＪＡＢ．ＭＴＬＭ６，ＭＵＴＵ ｃｌ．５９およびＭＵＴＵ ｃｌ．２１６を
この試験に用いた。これらは、非風土病性または風土病性バーキットリンパ種を
もつ患者由来であった。ＢＪＡＢ．ｇｐｔ１およびＭＵＴＵ ｃｌ．２１６はＬ
ＭＰ１に関して陰性であるが、ＢＪＡＢ．ＭＴＬＭ６およびＭＵＴＵ ｃｌ．５
９はＬＭＰ１を発現することが以前に示された（５、２７）。これらのＢＬ細胞
系は増殖培地中で通常の方法で維持した。
【００５０】 フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）芽球化細胞（ｂｌａｓｔｓ）を生成するため
、ＰＨＡ（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ Ｓｅｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ）を用いて末梢血単核（ＰＢＭＣ）細胞を刺激し、３日後
にＭＬＡ １４４上清およびｒＩＬ−２を含む増殖培地を添加した（２）。ＩＬ
−２およびＭＬＡ上清を２週間ごとに交換しながら（ＰＨＡはそれ以上添加しな
い）６週間までＰＨＡ芽球化細胞を増殖させた。
、ＰＨＡ（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ Ｓｅｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ）を用いて末梢血単核（ＰＢＭＣ）細胞を刺激し、３日後
にＭＬＡ １４４上清およびｒＩＬ−２を含む増殖培地を添加した（２）。ＩＬ
−２およびＭＬＡ上清を２週間ごとに交換しながら（ＰＨＡはそれ以上添加しな
い）６週間までＰＨＡ芽球化細胞を増殖させた。
【００５１】ウイルス分離株 常在性ＥＢＶを単離するため、親戚関係にない１２人の健常なＥＢＶ血清陽性
なドナーの１群から、０．１μｇ／ｍｌシクロスポリンＡの存在下で培養したＰ
ＢＭＣから自然に発生させることによって、自然発生的ＬＣＬを樹立した（１９
）。さらに、８個の異なるＮＰＣサンプル（東南アジア由来）から得たウイルス
分離株を生検材料から直接配列決定した。これらの分離株は、ゲノムのＢＡＭ
Ｈ１ ＷＹＨおよびＥ領域内のＤＮＡ配列の多様性に基づいて１型ＥＢＶと分類
された（２３、２４）。
なドナーの１群から、０．１μｇ／ｍｌシクロスポリンＡの存在下で培養したＰ
ＢＭＣから自然に発生させることによって、自然発生的ＬＣＬを樹立した（１９
）。さらに、８個の異なるＮＰＣサンプル（東南アジア由来）から得たウイルス
分離株を生検材料から直接配列決定した。これらの分離株は、ゲノムのＢＡＭ
Ｈ１ ＷＹＨおよびＥ領域内のＤＮＡ配列の多様性に基づいて１型ＥＢＶと分類
された（２３、２４）。
【００５２】ＣＴＬエピトープのＰＣＲおよびＤＮＡ塩基配列決定 ＰＣＲ増幅のため、ＬＭＰ１エピトープをコードするＤＮＡ領域の両側に位置
する特定のオリゴヌクレオチドプライマーを選択した。得られたＰＣＲ産物をＱ
ＩＡｑｕｉｃｋ ｓｐｉｎｃｏｌｕｍｎ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓ
ｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いて精製し、次にＰＲＩＳＭ ｒｅａｄｙｒｅａｃｔｉ
ｏｎ ｄｙｅｄｅｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃ
ｉｎｇ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔ
ｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を製造者のプロトコールにしたがって使用して両方向に
配列を決定した。
する特定のオリゴヌクレオチドプライマーを選択した。得られたＰＣＲ産物をＱ
ＩＡｑｕｉｃｋ ｓｐｉｎｃｏｌｕｍｎ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓ
ｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いて精製し、次にＰＲＩＳＭ ｒｅａｄｙｒｅａｃｔｉ
ｏｎ ｄｙｅｄｅｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃ
ｉｎｇ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔ
ｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を製造者のプロトコールにしたがって使用して両方向に
配列を決定した。
【００５３】ペプチドの合成 Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相法（１６）によって合成したペプチドをＣｈｉｒｏ
ｎ Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入
し、ジメチルスルホキシドに溶解し、そして標準的ＣＴＬアッセイに用いるため
無血清ＲＰＭＩ １６４０培地を用いて希釈した。
ｎ Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入
し、ジメチルスルホキシドに溶解し、そして標準的ＣＴＬアッセイに用いるため
無血清ＲＰＭＩ １６４０培地を用いて希釈した。
【００５４】ＭＨＣ安定化アッセイ ＬＭＰ１内の可能性のあるＨＬＡ Ａ２結合ペプチドを同定するため、他の文
献に記述されているコンピュータに基づくプログラムを採用した（ｈｔｔｐ：／
／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ ｂｉｎｄ／
ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）（１８）。次に、これらの予測されたペプチドを、先に
記述したＴ２細胞を用いる標準的ＭＨＣ安定化アッセイに使用した（１）。すな
わち、Ｔ２細胞（２ｘ１０５）を２００μｌの各ペプチド（２００μｇ／ｍｌ）
と共に２６℃で１４〜１６時間インキュベートし、次に３７℃で２〜３時間イン
キュベートした。インキュベーション後、モノクローナルＨＬＡ Ａ２特異的抗
体（ＭＡ２．１；ＡＴＣＣ）を用いてＦＡＣＳによってＨＬＡ Ａ２発現を測定
した。
献に記述されているコンピュータに基づくプログラムを採用した（ｈｔｔｐ：／
／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ ｂｉｎｄ／
ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）（１８）。次に、これらの予測されたペプチドを、先に
記述したＴ２細胞を用いる標準的ＭＨＣ安定化アッセイに使用した（１）。すな
わち、Ｔ２細胞（２ｘ１０５）を２００μｌの各ペプチド（２００μｇ／ｍｌ）
と共に２６℃で１４〜１６時間インキュベートし、次に３７℃で２〜３時間イン
キュベートした。インキュベーション後、モノクローナルＨＬＡ Ａ２特異的抗
体（ＭＡ２．１；ＡＴＣＣ）を用いてＦＡＣＳによってＨＬＡ Ａ２発現を測定
した。
【００５５】ポリクローナルおよびクローナルＬＭＰ１特異的ＣＴＬの作製 ポリクローナルＣＴＬを作製するため、ＨＬＡ Ａ２陽性ドナー由来のＰＢＭ
Ｃを、合成ペプチドで感作した放射線照射（８，０００ラド）Ｔ２細胞と共に７
日間培養した。７日目に、ペプチド感作Ｔ２細胞を用いてこれらのリンパ球を再
度刺激した。増殖培地で１０日間培養した後、これらの細胞を標準的５１Ｃｒ放
出アッセイにおいてペプチド感作自己ＰＨＡ芽球化細胞に対するポリクローナル
エフェクターとして用いた。
Ｃを、合成ペプチドで感作した放射線照射（８，０００ラド）Ｔ２細胞と共に７
日間培養した。７日目に、ペプチド感作Ｔ２細胞を用いてこれらのリンパ球を再
度刺激した。増殖培地で１０日間培養した後、これらの細胞を標準的５１Ｃｒ放
出アッセイにおいてペプチド感作自己ＰＨＡ芽球化細胞に対するポリクローナル
エフェクターとして用いた。
【００５６】 ＬＭＰ１特異的ＣＴＬクローンを作製するため、ＰＢＭＣ（１０６／ｍｌ）を
ペプチドで感作した自己リンパ球と共に（レスポンダー対スティミュレーターの
比は４：１）２ｍｌの培養ウエル（Ｌｉｎｂｒｏ）で３日間、増殖培地中で培養
した。０．３５％アガロース中に播くことによって生じたＣＴＬクローンを樹立
し、そして自己ＬＣＬを用いて週に２回再刺激しながら、高度に精製した大腸菌
由来の組換えヒトＩＬ−２を含有する増殖培地中で維持した（１６）。これらの
ＣＴＬクローンを、組換えワクシニアに感染した自己ＣＤ４０ Ｂ細胞の１群を
用いてスクリーニングし、抗原特異性を確認した（下記参照）。
ペプチドで感作した自己リンパ球と共に（レスポンダー対スティミュレーターの
比は４：１）２ｍｌの培養ウエル（Ｌｉｎｂｒｏ）で３日間、増殖培地中で培養
した。０．３５％アガロース中に播くことによって生じたＣＴＬクローンを樹立
し、そして自己ＬＣＬを用いて週に２回再刺激しながら、高度に精製した大腸菌
由来の組換えヒトＩＬ−２を含有する増殖培地中で維持した（１６）。これらの
ＣＴＬクローンを、組換えワクシニアに感染した自己ＣＤ４０ Ｂ細胞の１群を
用いてスクリーニングし、抗原特異性を確認した（下記参照）。
【００５７】ワクシニアウイルス組換え体 ＥＢＶ潜在抗原をコードする組換えワクシニア構築物、およびｐＳＣ１１ベク
ターのみを挿入して作製したチミジンキナーゼ陰性のワクシニアウイルス構築物
（Ｖａｃｃ．ＴＫ−）は、以前に記述されている（６、１１）。ＣＤ４０ Ｂ細
胞を以前に記述されているように、感染多重度（ＭＯＩ）１０：１で１時間３７
℃で組換えワクシニアウイルスに感染させた（６、１１）。１晩感染させた後、
細胞を増殖培地で洗浄し、ＣＴＬアッセイのため、または組換えＥＢＶ抗原の発
現を評価するイムノブロッティングのために処理した（１２）。
ターのみを挿入して作製したチミジンキナーゼ陰性のワクシニアウイルス構築物
（Ｖａｃｃ．ＴＫ−）は、以前に記述されている（６、１１）。ＣＤ４０ Ｂ細
胞を以前に記述されているように、感染多重度（ＭＯＩ）１０：１で１時間３７
℃で組換えワクシニアウイルスに感染させた（６、１１）。１晩感染させた後、
細胞を増殖培地で洗浄し、ＣＴＬアッセイのため、または組換えＥＢＶ抗原の発
現を評価するイムノブロッティングのために処理した（１２）。
【００５８】細胞傷害性アッセイ 標的細胞を組換えワクシニアウイルスに感染させるか、または合成ペプチドエ
ピトープ（野生型または変異型）を用いて前もって感作し、次に５１Ｃｒと共に
９０分間インキュベートした。インキュベーション後、これらの細胞を増殖培地
で洗浄し、標準的な５時間５１Ｃｒ放出アッセイに標的として用いた（１６）。
いくつかの実験においては、ＭＨＣクラスＩ（Ｗ６／３２）またはクラスＩＩ（
Ｌ２４３）抗原上の非多形性決定基に特異的なモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）
を添加して、ＣＴＬクローンのＭＨＣ拘束を明らかにした。
ピトープ（野生型または変異型）を用いて前もって感作し、次に５１Ｃｒと共に
９０分間インキュベートした。インキュベーション後、これらの細胞を増殖培地
で洗浄し、標準的な５時間５１Ｃｒ放出アッセイに標的として用いた（１６）。
いくつかの実験においては、ＭＨＣクラスＩ（Ｗ６／３２）またはクラスＩＩ（
Ｌ２４３）抗原上の非多形性決定基に特異的なモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）
を添加して、ＣＴＬクローンのＭＨＣ拘束を明らかにした。
【００５９】限界希釈分析（ＬＤＡ） ＨＬＡ Ａ２陽性ドナー由来のＰＢＭＣを丸底マイクロタイタープレートに１
ウエルあたり６．２５ｘ１０３から５ｘ１０４個までの段階づけた数（２倍希釈
）で分布させた。約５ｘ１０４個のＫ照射（２，０００ラド）ペプチド感作（１
μｇ／ｍｌ）自己ＰＢＭＣを加えて全容量を１００μｌとした。各実験において
、各濃度に２４個のレプリカを使用した。４日目および７日目に、２０ＵのｒＩ
Ｌ−２および３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＭＬＡ−１４４培養物の上清を補充し
た５０μｌの培地を培養物に供給した。１０日目に各ＣＴＬ微量培養物を２個の
レプリカに分割し、そして標準的５時間５１Ｃｒ放出アッセイにおいてＬＭＰ１
ペプチドをあらかじめ塗布した、または塗布していない自己ＰＨＡ芽球化細胞に
対するエフェクターとして用いた。ペプチド感作標的細胞に対する特異的クロミ
ウム放出パーセントが未処理対照ウエルからの平均放出をＳＤの３倍上回った場
合、ウエルは陽性と評価された。最大可能性予測（ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌ
ｉｈｏｏｄ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ）の方法によってＬＤＡを実施した（４）。
全ての実験から得たデータは１ヒット速度論（ｓｉｎｇｌｅ−ｈｉｔ ｋｉｎｅ
ｔｉｃｓ）の仮説と両立した（Ｐ＞０．４）。そして、信頼限界９５％で前駆体
が推定される。
ウエルあたり６．２５ｘ１０３から５ｘ１０４個までの段階づけた数（２倍希釈
）で分布させた。約５ｘ１０４個のＫ照射（２，０００ラド）ペプチド感作（１
μｇ／ｍｌ）自己ＰＢＭＣを加えて全容量を１００μｌとした。各実験において
、各濃度に２４個のレプリカを使用した。４日目および７日目に、２０ＵのｒＩ
Ｌ−２および３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＭＬＡ−１４４培養物の上清を補充し
た５０μｌの培地を培養物に供給した。１０日目に各ＣＴＬ微量培養物を２個の
レプリカに分割し、そして標準的５時間５１Ｃｒ放出アッセイにおいてＬＭＰ１
ペプチドをあらかじめ塗布した、または塗布していない自己ＰＨＡ芽球化細胞に
対するエフェクターとして用いた。ペプチド感作標的細胞に対する特異的クロミ
ウム放出パーセントが未処理対照ウエルからの平均放出をＳＤの３倍上回った場
合、ウエルは陽性と評価された。最大可能性予測（ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌ
ｉｈｏｏｄ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ）の方法によってＬＤＡを実施した（４）。
全ての実験から得たデータは１ヒット速度論（ｓｉｎｇｌｅ−ｈｉｔ ｋｉｎｅ
ｔｉｃｓ）の仮説と両立した（Ｐ＞０．４）。そして、信頼限界９５％で前駆体
が推定される。
【００６０】結果 ＬＭＰ１内のＨＬＡ Ａ２結合ペプチドの同定 ＬＭＰ１内の可能性のあるＨＬＡ Ａ２に拘束されるエピトープを同定するた
め、ＨＬＡ−ペプチド複合体の半期（ｈａｌｆ−ｔｉｍｅ）解離の推定値に基づ
いてＨＬＡ結合ペプチドを予測するために設計されたコンピュータプログラムに
よってアミノ酸配列を分析した（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ
．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ ｂｉｎｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）（１８）
。推定される半期解離スコアが＞４００である合計１１個のペプチドを選択した
（表１）。次に、ＨＬＡ Ａ２陽性Ｔ２細胞を用いて、これらのペプチドをＨＬ
Ａ Ａ２結合効率について試験した。一連の実験によって得た代表的データを図
１に示す。この分析は、６個のペプチドがＴ２細胞上のＨＬＡ Ａ２発現を大幅
に増大させたことを示し、これらのペプチドがこの対立遺伝子に結合することを
示唆している。
め、ＨＬＡ−ペプチド複合体の半期（ｈａｌｆ−ｔｉｍｅ）解離の推定値に基づ
いてＨＬＡ結合ペプチドを予測するために設計されたコンピュータプログラムに
よってアミノ酸配列を分析した（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ
．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ ｂｉｎｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）（１８）
。推定される半期解離スコアが＞４００である合計１１個のペプチドを選択した
（表１）。次に、ＨＬＡ Ａ２陽性Ｔ２細胞を用いて、これらのペプチドをＨＬ
Ａ Ａ２結合効率について試験した。一連の実験によって得た代表的データを図
１に示す。この分析は、６個のペプチドがＴ２細胞上のＨＬＡ Ａ２発現を大幅
に増大させたことを示し、これらのペプチドがこの対立遺伝子に結合することを
示唆している。
【００６１】ＬＭＰ１ペプチドに特異的なポリクローナルＣＴＬの作製 上に示したデータはＬＭＰ１がＨＬＡ Ａ２分子と結合でき、それゆえウイル
ス特異的ＣＴＬにとって可能性のある標的である配列を含むことを強く示唆した
。この仮説を証明するため、２人のＨＬＡ Ａ２陽性ＥＢＶ免疫ドナー（ＳＢお
よびＡＳ）由来のＰＢＭＣを、ＬＭＰ１由来のＨＬＡ Ａ２結合ペプチドのそれ
ぞれで感作したＴ２細胞を用いて刺激した。１０日目にこれらのエフェクター細
胞をペプチド感作自己ＰＨＡ芽球化細胞に対して試験した。ドナーＳＢ由来のポ
リクローナルＣＴＬから得た代表的データを図２に示す。２個のペプチド、すな
わちＹＬＱＱＮＷＷＴＬ（配列番号６）およびＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（配列番号１
）はポリクローナルＣＴＬの重大な活性化を示した。しかし、ＹＬＬＥＭＬＷＲ
Ｌによって刺激されたＣＴＬはＹＬＱＱＮＷＷＴＬに刺激された細胞に較べて一
貫して有意に強いＣＴＬ活性を示した。もう１人のＨＬＡ Ａ２陽性ドナー（Ａ
Ｓ）についても類似のデータが得られた（データは掲載していない）。
ス特異的ＣＴＬにとって可能性のある標的である配列を含むことを強く示唆した
。この仮説を証明するため、２人のＨＬＡ Ａ２陽性ＥＢＶ免疫ドナー（ＳＢお
よびＡＳ）由来のＰＢＭＣを、ＬＭＰ１由来のＨＬＡ Ａ２結合ペプチドのそれ
ぞれで感作したＴ２細胞を用いて刺激した。１０日目にこれらのエフェクター細
胞をペプチド感作自己ＰＨＡ芽球化細胞に対して試験した。ドナーＳＢ由来のポ
リクローナルＣＴＬから得た代表的データを図２に示す。２個のペプチド、すな
わちＹＬＱＱＮＷＷＴＬ（配列番号６）およびＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（配列番号１
）はポリクローナルＣＴＬの重大な活性化を示した。しかし、ＹＬＬＥＭＬＷＲ
Ｌによって刺激されたＣＴＬはＹＬＱＱＮＷＷＴＬに刺激された細胞に較べて一
貫して有意に強いＣＴＬ活性を示した。もう１人のＨＬＡ Ａ２陽性ドナー（Ａ
Ｓ）についても類似のデータが得られた（データは掲載していない）。
【００６２】
【表１】 ＊ＬＭＰ１内の可能性のあるＨＬＡ Ａ２結合ペプチドを同定するため、別の文
献に記述されているコンピュータに基づくプログラムを用いた（１８）。 このプログラムはインターネット経由で直接アクセスすることができる： ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ
ｂｉｎｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ
献に記述されているコンピュータに基づくプログラムを用いた（１８）。 このプログラムはインターネット経由で直接アクセスすることができる： ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ
ｂｉｎｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ
【００６３】ＬＭＰ１ ＣＴＬエピトープの特徴づけ ポリクローナルＣＴＬによって同定されたＣＴＬエピトープをさらに特徴づけ
るため、ペプチド感作自己ＰＢＭＣを用いて最初の刺激を行ない、次に放射線照
射自己ＬＣＬを用いて継続的に再刺激することによって、ウイルス特異的ＣＴＬ
クローンを作製した。ＣＴＬ特異性に関する迅速な可視的アッセイを用いて、増
殖しているクローンをペプチド認識についてスクリーニングした（２）。１つの
クローン（ＳＢ７）は明らかにＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（配列番号１）ペプチドを認
識した。この方法では、ＹＬＱＱＮＷＷＴＬ（配列番号６）に特異的なＣＴＬク
ローンは全く単離されなかった。ＳＢ７クローンの抗原特異性をさらに確認する
ため、自己ＣＤ４０で刺激したＢ細胞を、個々のＥＢＶ抗原をコードする組換え
ワクシニアウイルスに感染させ、次にこれらのＣＴＬに暴露した。図３Ａに示す
データは、ＬＭＰ１発現ワクシニア構築物に感染した標的細胞のみが認識される
ことを明確に示している。さらに、ＬＭＰ１およびＨＬＡ Ａ２陽性ＢＬ細胞系
（ＢＪＡＢ．ＭＴＬＭ６またはＭｕｔｕ ｃｌ．５９）のみがこのクローンによ
って効率的に溶解された。他方、この抗原について陰性のＢＬ細胞（ＢＪＡＢ．
ｇｐｔ１およびＭｕｔｕ ｃｌ．２１６）は認識されなかった（図３Ｂ）。これ
らの結果は、ＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（配列番号１）がウイルス感染細胞によって内
在的にプロセシングされるＬＭＰ１ ＣＴＬエピトープであることを確認する。
るため、ペプチド感作自己ＰＢＭＣを用いて最初の刺激を行ない、次に放射線照
射自己ＬＣＬを用いて継続的に再刺激することによって、ウイルス特異的ＣＴＬ
クローンを作製した。ＣＴＬ特異性に関する迅速な可視的アッセイを用いて、増
殖しているクローンをペプチド認識についてスクリーニングした（２）。１つの
クローン（ＳＢ７）は明らかにＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（配列番号１）ペプチドを認
識した。この方法では、ＹＬＱＱＮＷＷＴＬ（配列番号６）に特異的なＣＴＬク
ローンは全く単離されなかった。ＳＢ７クローンの抗原特異性をさらに確認する
ため、自己ＣＤ４０で刺激したＢ細胞を、個々のＥＢＶ抗原をコードする組換え
ワクシニアウイルスに感染させ、次にこれらのＣＴＬに暴露した。図３Ａに示す
データは、ＬＭＰ１発現ワクシニア構築物に感染した標的細胞のみが認識される
ことを明確に示している。さらに、ＬＭＰ１およびＨＬＡ Ａ２陽性ＢＬ細胞系
（ＢＪＡＢ．ＭＴＬＭ６またはＭｕｔｕ ｃｌ．５９）のみがこのクローンによ
って効率的に溶解された。他方、この抗原について陰性のＢＬ細胞（ＢＪＡＢ．
ｇｐｔ１およびＭｕｔｕ ｃｌ．２１６）は認識されなかった（図３Ｂ）。これ
らの結果は、ＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（配列番号１）がウイルス感染細胞によって内
在的にプロセシングされるＬＭＰ１ ＣＴＬエピトープであることを確認する。
【００６４】 次の１組の実験において、我々は限界希釈分析によって、ＨＬＡ Ａ２陽性の
健常なＥＢＶ免疫ドナー由来のＰＢＭＣにおける上記エピトープに対するＣＴＬ
前駆体（ＣＴＬｐ）の頻度を分析した。ＹＬＬＥＭＬＷＲＬ特異的ＣＴＬｐは、
ドナーＳＢおよびＡＳ由来のＰＢＭＣを自己のペプチド感作ＰＢＭＣで刺激する
ことによってｉｎ ｖｉｔｒｏで再活性化された。ペプチドＹＬＬＥＭＬＷＲＬ
（配列番号１）をあらかじめ塗布した、または塗布していない自己ＰＨＡ芽球化
細胞を標的細胞としてクロミウム放出アッセイに用いた。図４の代表的データは
、ＨＬＡ Ａ２陽性ドナーＡＳ（１：２２３，５３５＋／−１０７，４３７）お
よびＳＢ（１：２５２，６５０＋／−１２２，８７５）において、ＹＬＬＥＭＬ
ＷＲＬ（配列番号１）エピトープに特異的な記憶ＣＴＬが非常に低頻度で検出さ
れたことを示している。
健常なＥＢＶ免疫ドナー由来のＰＢＭＣにおける上記エピトープに対するＣＴＬ
前駆体（ＣＴＬｐ）の頻度を分析した。ＹＬＬＥＭＬＷＲＬ特異的ＣＴＬｐは、
ドナーＳＢおよびＡＳ由来のＰＢＭＣを自己のペプチド感作ＰＢＭＣで刺激する
ことによってｉｎ ｖｉｔｒｏで再活性化された。ペプチドＹＬＬＥＭＬＷＲＬ
（配列番号１）をあらかじめ塗布した、または塗布していない自己ＰＨＡ芽球化
細胞を標的細胞としてクロミウム放出アッセイに用いた。図４の代表的データは
、ＨＬＡ Ａ２陽性ドナーＡＳ（１：２２３，５３５＋／−１０７，４３７）お
よびＳＢ（１：２５２，６５０＋／−１２２，８７５）において、ＹＬＬＥＭＬ
ＷＲＬ（配列番号１）エピトープに特異的な記憶ＣＴＬが非常に低頻度で検出さ
れたことを示している。
【００６５】 異なるＨＬＡ Ａ２スーパータイプを発現するＥＢＶ形質転換ＬＣＬはクロー
ンＳＢ７によって認識されうるかどうかを決定するため、１０個の異なるスーパ
ータイプのＨＬＡ Ａ２対立遺伝子（ＨＬＡ Ａ＊０２０１−ＨＬＡ Ａ＊０２
１０）を発現するＬＣＬの１群を標準ＣＴＬアッセイでスクリーニングした。図
５に示すデータは、ＨＬＡ Ａ＊０２０５以外の主要なＨＬＡ Ａ２スーパータ
イプの全てを発現するＬＣＬはＣＴＬクローンＳＢ７によって効率的に認識され
ることを明確に示している。この溶解は、ＨＬＡクラスＩ特異的抗体Ｗ６／３２
によって重大に抑制された。驚くべきことに、ＨＬＡ Ａ２陽性でかつＴＡＰ陰
性のＴ２細胞もまたこのクローンによって認識され、これはＹＬＬＥＭＬＷＲＬ
（配列番号１）エピトープがＴＡＰ独立性経路を経て内在的にプロセシングされ
ることを示唆している（図５）。
ンＳＢ７によって認識されうるかどうかを決定するため、１０個の異なるスーパ
ータイプのＨＬＡ Ａ２対立遺伝子（ＨＬＡ Ａ＊０２０１−ＨＬＡ Ａ＊０２
１０）を発現するＬＣＬの１群を標準ＣＴＬアッセイでスクリーニングした。図
５に示すデータは、ＨＬＡ Ａ＊０２０５以外の主要なＨＬＡ Ａ２スーパータ
イプの全てを発現するＬＣＬはＣＴＬクローンＳＢ７によって効率的に認識され
ることを明確に示している。この溶解は、ＨＬＡクラスＩ特異的抗体Ｗ６／３２
によって重大に抑制された。驚くべきことに、ＨＬＡ Ａ２陽性でかつＴＡＰ陰
性のＴ２細胞もまたこのクローンによって認識され、これはＹＬＬＥＭＬＷＲＬ
（配列番号１）エピトープがＴＡＰ独立性経路を経て内在的にプロセシングされ
ることを示唆している（図５）。
【００６６】ＮＰＣ患者および健常なドナー由来のウイルス分離株における、ＨＬＡ Ａ２に
拘束されるＬＭＰ１エピトープの配列分析 ＨＬＡ Ａ＊０２０１，ＨＬＡ Ａ＊０２０３およびＨＬＡ Ａ＊０２０７（
これらは東南アジア人の人種集団によくみられるスーパータイプである）による
ＬＭＰ１エピトープの効率的な提示は、このエピトープはＬＭＰ１発現ＮＰＣの
標的エピトープとして重要であるかもしれないという可能性を提起した。８個の
ＮＰＣサンプル由来のウイルス分離株におけるこのＣＴＬエピトープ領域全体に
わたる配列分析を、ＬＭＰ１特異的プライマーを用いて実施した。この分析には
、健常なＥＢＶ免疫ドナーからの自然発生ＬＣＬを対照として用いた。興味深い
ことに、ＮＰＣサンプル由来の全てのＥＢＶ分離株がこのエピトープ内で同一の
置換を示した（表２）。
拘束されるＬＭＰ１エピトープの配列分析 ＨＬＡ Ａ＊０２０１，ＨＬＡ Ａ＊０２０３およびＨＬＡ Ａ＊０２０７（
これらは東南アジア人の人種集団によくみられるスーパータイプである）による
ＬＭＰ１エピトープの効率的な提示は、このエピトープはＬＭＰ１発現ＮＰＣの
標的エピトープとして重要であるかもしれないという可能性を提起した。８個の
ＮＰＣサンプル由来のウイルス分離株におけるこのＣＴＬエピトープ領域全体に
わたる配列分析を、ＬＭＰ１特異的プライマーを用いて実施した。この分析には
、健常なＥＢＶ免疫ドナーからの自然発生ＬＣＬを対照として用いた。興味深い
ことに、ＮＰＣサンプル由来の全てのＥＢＶ分離株がこのエピトープ内で同一の
置換を示した（表２）。
【００６７】 対照的に、健常なＥＢＶ免疫ドナー由来の１２のウイルス分離株のうち、４つ
はＢ９５．８分離株の配列と同一の配列をコードし、６つはＮＰＣサンプルに見
いだされる変化とは異なる、このエピトープ内における違ったパターンの変化を
示した。いくつかの分離株においては、２位のロイシン、５位のメチオニンおよ
び８位のアルギニンがそれぞれフェニルアラニン、イソロイシンおよびグリシン
に置換されていたが（表２）、他の分離株においては５位のメチオニンのみがイ
ソロイシンに置換されていた。重要なことに、Ｔ２細胞をこれらの変異型ペプチ
ド〔すなわちＹＦＬＥＩＬＷＧＬ（配列番号３２）およびＹＬＬＥＩＬＷＲＬ（
配列番号３３）〕と共にインキュベートすると、該細胞上でのＭＨＣ発現が大幅
に増大し（図６Ａ）、ＨＬＡ Ａ２への有効な結合を示した。ペプチドＹＬＬＥ
ＩＬＷＲＬ（配列番号３３）はＳＢ７クローンによって有効に認識されたが、他
方ペプチドＹＦＬＥＩＬＷＧＬ（配列番号３２）の存在下ではＣＴＬ活性は全く
見られなかった（図６Ｂ）。後者の結果は、ペプチドＹＦＬＥＩＬＷＧＬ（配列
番号３２）はこの配列をコードするＥＢＶ株に感染したヒトにおけるエピトープ
であるという可能性を除外しない。ＳＢ７クローンによる認識の喪失は、ＭＨＣ
結合の喪失よりもむしろＴ細胞受容体とＭＨＣ−ペプチド複合体との不適切な相
互作用のためであるように思われる。したがって、異なるＴ細胞受容体を発現す
るＴ細胞はこのＨＬＡ結合ペプチドを有効に認識することができる、ということ
が考えられる（８）。興味深いことに、他の２人の健常なＥＢＶ免疫ドナー（東
南アジア人１人を含む）由来のウイルス分離株は、エピトープ配列内でＮＰＣサ
ンプルに見られた変化と同一の変化を示した（表２）。
はＢ９５．８分離株の配列と同一の配列をコードし、６つはＮＰＣサンプルに見
いだされる変化とは異なる、このエピトープ内における違ったパターンの変化を
示した。いくつかの分離株においては、２位のロイシン、５位のメチオニンおよ
び８位のアルギニンがそれぞれフェニルアラニン、イソロイシンおよびグリシン
に置換されていたが（表２）、他の分離株においては５位のメチオニンのみがイ
ソロイシンに置換されていた。重要なことに、Ｔ２細胞をこれらの変異型ペプチ
ド〔すなわちＹＦＬＥＩＬＷＧＬ（配列番号３２）およびＹＬＬＥＩＬＷＲＬ（
配列番号３３）〕と共にインキュベートすると、該細胞上でのＭＨＣ発現が大幅
に増大し（図６Ａ）、ＨＬＡ Ａ２への有効な結合を示した。ペプチドＹＬＬＥ
ＩＬＷＲＬ（配列番号３３）はＳＢ７クローンによって有効に認識されたが、他
方ペプチドＹＦＬＥＩＬＷＧＬ（配列番号３２）の存在下ではＣＴＬ活性は全く
見られなかった（図６Ｂ）。後者の結果は、ペプチドＹＦＬＥＩＬＷＧＬ（配列
番号３２）はこの配列をコードするＥＢＶ株に感染したヒトにおけるエピトープ
であるという可能性を除外しない。ＳＢ７クローンによる認識の喪失は、ＭＨＣ
結合の喪失よりもむしろＴ細胞受容体とＭＨＣ−ペプチド複合体との不適切な相
互作用のためであるように思われる。したがって、異なるＴ細胞受容体を発現す
るＴ細胞はこのＨＬＡ結合ペプチドを有効に認識することができる、ということ
が考えられる（８）。興味深いことに、他の２人の健常なＥＢＶ免疫ドナー（東
南アジア人１人を含む）由来のウイルス分離株は、エピトープ配列内でＮＰＣサ
ンプルに見られた変化と同一の変化を示した（表２）。
【００６８】
【表２】
【００６９】ＮＰＣ細胞の抗原プロセシング機能の分析 ＮＰＣ細胞は内在的に発現された抗原をウイルス特異的ＣＴＬに提示すること
ができるかどうかを決定するため、腫瘍細胞をＥＢＮＡ４をコードする組換えワ
クシニア（Ｖａｃｃ．ＥＢＮＡ４）に感染させるか、または合成ペプチドエピト
ープを用いて前もって感作した。図７は、組換えワクシニアに感染させたＮＰＣ
細胞（Ｃ１５）を、Ｖａｃｃ．ＥＢＮＡ４に感染させた、ＨＬＡが一致した２型
ＬＣＬと比較した実験の結果を示す。ＥＢＮＡ４特異的ＣＴＬに暴露した後、Ｖ
ａｃｃ．ＥＢＮＡ４に感染した、またはペプチド感作したＮＰＣ細胞はＣＭ９お
よびＣＭ２９ ＣＴＬクローンの両方によって有効に認識された。ＣＴＬ溶解の
レベルはＬＣＬについて見られたレベルに匹敵した。これらの結果は、ＮＰＣ細
胞はＴＡＰ依存性作用機構によって十分なレベルのペプチドをＥＲに運ぶことが
できること、そしてＭＨＣ−ペプチド複合体をＥＲから細胞表面に有効に運ぶこ
とができることを明確に示している。
ができるかどうかを決定するため、腫瘍細胞をＥＢＮＡ４をコードする組換えワ
クシニア（Ｖａｃｃ．ＥＢＮＡ４）に感染させるか、または合成ペプチドエピト
ープを用いて前もって感作した。図７は、組換えワクシニアに感染させたＮＰＣ
細胞（Ｃ１５）を、Ｖａｃｃ．ＥＢＮＡ４に感染させた、ＨＬＡが一致した２型
ＬＣＬと比較した実験の結果を示す。ＥＢＮＡ４特異的ＣＴＬに暴露した後、Ｖ
ａｃｃ．ＥＢＮＡ４に感染した、またはペプチド感作したＮＰＣ細胞はＣＭ９お
よびＣＭ２９ ＣＴＬクローンの両方によって有効に認識された。ＣＴＬ溶解の
レベルはＬＣＬについて見られたレベルに匹敵した。これらの結果は、ＮＰＣ細
胞はＴＡＰ依存性作用機構によって十分なレベルのペプチドをＥＲに運ぶことが
できること、そしてＭＨＣ−ペプチド複合体をＥＲから細胞表面に有効に運ぶこ
とができることを明確に示している。
【００７０】 ＮＰＣ細胞における正常な抗原プロセシング機能は、これらの腫瘍をｉｎ ｖ
ｉｖｏで制御するために設計されるワクチンにとって重要な意味をもつ。以前の
研究は、ＮＰＣにおける潜在遺伝子発現はＥＢＮＡ１ならびに膜貫通タンパク質
ＬＭＰ１およびＬＭＰ２にしばしば限定されることを示した（２９）。
ｉｖｏで制御するために設計されるワクチンにとって重要な意味をもつ。以前の
研究は、ＮＰＣにおける潜在遺伝子発現はＥＢＮＡ１ならびに膜貫通タンパク質
ＬＭＰ１およびＬＭＰ２にしばしば限定されることを示した（２９）。
【００７１】 ＥＢＮＡ１はＥＢＶ特異的ＣＴＬによって認識されないので、ＬＭＰ１にに含
まれることが知られているエピトープのまわりでＮＰＣを制御しようという設計
戦略が非常に重要視されている（１、１７）。本研究において提示されたデータ
を検討すると、ＬＭＰエピトープはＮＰＣ細胞によって有効にプロセシングされ
ると仮定することが妥当である。ＮＰＣ細胞をｉｎ ｖｉｖｏで制御するために
効果的なアプローチは、これらの患者においてＬＭＰ特異的ＣＴＬ応答を増幅す
ることであるかもしれない。これは２つの異なる方法によって達成されるであろ
う。第１は、ＬＭＰ１および／またはＬＭＰ２由来のＣＴＬエピトープを含む合
成ペプチドを用いてＮＰＣ患者を免疫感作することである。もうひとつは、ＨＬ
Ａが一致した健常なウイルスキャリア由来のＬＭＰ１およびＬＭＰ２特異的ＣＴ
Ｌを、骨髄移植レシピエントにおいてＥＢＶ関連ポリクローナルリンパ腫をうま
く治療するのに用いられた方法（３０）に類似した方法で、ＮＰＣ患者に導入し
てもよい。
まれることが知られているエピトープのまわりでＮＰＣを制御しようという設計
戦略が非常に重要視されている（１、１７）。本研究において提示されたデータ
を検討すると、ＬＭＰエピトープはＮＰＣ細胞によって有効にプロセシングされ
ると仮定することが妥当である。ＮＰＣ細胞をｉｎ ｖｉｖｏで制御するために
効果的なアプローチは、これらの患者においてＬＭＰ特異的ＣＴＬ応答を増幅す
ることであるかもしれない。これは２つの異なる方法によって達成されるであろ
う。第１は、ＬＭＰ１および／またはＬＭＰ２由来のＣＴＬエピトープを含む合
成ペプチドを用いてＮＰＣ患者を免疫感作することである。もうひとつは、ＨＬ
Ａが一致した健常なウイルスキャリア由来のＬＭＰ１およびＬＭＰ２特異的ＣＴ
Ｌを、骨髄移植レシピエントにおいてＥＢＶ関連ポリクローナルリンパ腫をうま
く治療するのに用いられた方法（３０）に類似した方法で、ＮＰＣ患者に導入し
てもよい。
【００７２】考察 種々の研究所でなされた初期の研究は、ＥＢＶ関連悪性疾患のウイルス表現型
はウイルス特異的ＣＴＬ監視（ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）に対する腫瘍感受性
を低下させる上で非常に重要な因子であるらしいことを示した。なぜなら、これ
ら悪性細胞におけるｉｎ ｖｉｖｏでのウイルス抗原の発現は、ＥＢＮＡ１、ま
たはＥＢＮＡ１およびＬＭＰ１に限定されているからである（９、２０、２１）
。現在ではＥＢＮＡ１がクラスＩに拘束されるＣＴＬエピトープを含まないこと
がはっきり立証されたので（６、１７）、ＬＭＰ１内の可能性のあるエピトープ
を同定することに大きな関心が向けられている。本研究はこの問題を取り扱うた
めに的確に企画された。ＬＭＰ１内のエピトープを同定する際の限定要因の１つ
は、この抗原に対するＣＴＬ応答はしばしば全ウイルス特異的応答のマイナーな
要素を構成する、という事実であった（６、１７）。この問題を克服するため、
我々はＬＭＰ１内の、ＨＬＡ Ａ２に拘束される、可能性のあるエピトープを同
定するための改変されたプロトコールを採用した。この方法における重要な手段
は、Ｐａｒｋｅｒらによって開発されたコンピュータに基づくプログラム（１８
）の使用であった。このプログラムは、ヒト病原体由来の種々のタンパク質内の
可能性のあるＨＬＡ結合ペプチドを予測するために設計されたものである。Ｂ９
５．８ＥＢＶ分離株のＬＭＰ１配列の分析は、多数の可能性のあるＨＬＡ Ａ２
結合ペプチドを明らかにした。そしてこれらペプチドのかなりの部分が、機能的
にはＴ２細胞上でＨＬＡ Ａ２分子を安定化させることがに示された。これらの
ペプチドを用いたＰＢＭＣの刺激は、ペプチドＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（配列番号１
）に特異的な強いポリクローナルＣＴＬ応答の活性化をもたらした。他方、ペプ
チドＹＬＱＱＮＷＷＴＬ（配列番号６）に対してはより弱い応答が見られた。配
列ＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（配列番号１）は、このペプチドに対して特異的なＣＴＬ
クローン（ＳＢ７）を単離することによってＬＭＰ１エピトープとして確認され
た。ＳＢ７ ＣＴＬクローンのＬＭＰ１特異性は、組換えワクシニア実験および
ＬＭＰ１発現ＨＬＡ Ａ２陽性ＢＬ細胞の有効な溶解によってさらに確認された
。
はウイルス特異的ＣＴＬ監視（ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）に対する腫瘍感受性
を低下させる上で非常に重要な因子であるらしいことを示した。なぜなら、これ
ら悪性細胞におけるｉｎ ｖｉｖｏでのウイルス抗原の発現は、ＥＢＮＡ１、ま
たはＥＢＮＡ１およびＬＭＰ１に限定されているからである（９、２０、２１）
。現在ではＥＢＮＡ１がクラスＩに拘束されるＣＴＬエピトープを含まないこと
がはっきり立証されたので（６、１７）、ＬＭＰ１内の可能性のあるエピトープ
を同定することに大きな関心が向けられている。本研究はこの問題を取り扱うた
めに的確に企画された。ＬＭＰ１内のエピトープを同定する際の限定要因の１つ
は、この抗原に対するＣＴＬ応答はしばしば全ウイルス特異的応答のマイナーな
要素を構成する、という事実であった（６、１７）。この問題を克服するため、
我々はＬＭＰ１内の、ＨＬＡ Ａ２に拘束される、可能性のあるエピトープを同
定するための改変されたプロトコールを採用した。この方法における重要な手段
は、Ｐａｒｋｅｒらによって開発されたコンピュータに基づくプログラム（１８
）の使用であった。このプログラムは、ヒト病原体由来の種々のタンパク質内の
可能性のあるＨＬＡ結合ペプチドを予測するために設計されたものである。Ｂ９
５．８ＥＢＶ分離株のＬＭＰ１配列の分析は、多数の可能性のあるＨＬＡ Ａ２
結合ペプチドを明らかにした。そしてこれらペプチドのかなりの部分が、機能的
にはＴ２細胞上でＨＬＡ Ａ２分子を安定化させることがに示された。これらの
ペプチドを用いたＰＢＭＣの刺激は、ペプチドＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（配列番号１
）に特異的な強いポリクローナルＣＴＬ応答の活性化をもたらした。他方、ペプ
チドＹＬＱＱＮＷＷＴＬ（配列番号６）に対してはより弱い応答が見られた。配
列ＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（配列番号１）は、このペプチドに対して特異的なＣＴＬ
クローン（ＳＢ７）を単離することによってＬＭＰ１エピトープとして確認され
た。ＳＢ７ ＣＴＬクローンのＬＭＰ１特異性は、組換えワクシニア実験および
ＬＭＰ１発現ＨＬＡ Ａ２陽性ＢＬ細胞の有効な溶解によってさらに確認された
。
【００７３】 本報告において特徴づけられたＣＴＬ応答は、それが多数のＥＢＶ関連悪性疾
患（ＨＤおよびＮＰＣ）において構成的に発現されるウイルス抗原に向けられて
いるというばかりでなく、ＨＬＡ Ａ２遺伝子が事実上全てのヒト集団に共通に
見られるゆえに、興味深い（１３）。より重要なことに、すべての主要ＨＬＡ
Ａ２スーパータイプを発現するＥＢＶ形質転換ＬＣＬは、ＬＭＰ１特異的ＣＴＬ
クローンによって有効に認識された。これは、異なる人種集団の保護を目的とす
る抗ウイルスワクチンの設計にとって重大な意味をもつ結果である。健常な血清
陽性のヒトにおけるＬＭＰ１エピトープに対するＣＴＬ応答はウイルス特異的Ｃ
ＴＬ応答のマイナーな要素を構成すること、そしてこのエピトープに対しては非
常に低レベルのＣＴＬ前駆体がみられること、をここで述べておくことは重要で
ある。それにもかかわらず、適切なペプチドを用いたワクチン投与、またはｉｎ
ｖｉｔｒｏ活性化ＬＭＰ１特異的ＣＴＬの借用的（ａｄｏｐｔｉｖｅ）導入に
よってこの要素を増幅することは可能である。このようなアプローチはＨＤおよ
びＮＰＣの制御に有用でありうる。
患（ＨＤおよびＮＰＣ）において構成的に発現されるウイルス抗原に向けられて
いるというばかりでなく、ＨＬＡ Ａ２遺伝子が事実上全てのヒト集団に共通に
見られるゆえに、興味深い（１３）。より重要なことに、すべての主要ＨＬＡ
Ａ２スーパータイプを発現するＥＢＶ形質転換ＬＣＬは、ＬＭＰ１特異的ＣＴＬ
クローンによって有効に認識された。これは、異なる人種集団の保護を目的とす
る抗ウイルスワクチンの設計にとって重大な意味をもつ結果である。健常な血清
陽性のヒトにおけるＬＭＰ１エピトープに対するＣＴＬ応答はウイルス特異的Ｃ
ＴＬ応答のマイナーな要素を構成すること、そしてこのエピトープに対しては非
常に低レベルのＣＴＬ前駆体がみられること、をここで述べておくことは重要で
ある。それにもかかわらず、適切なペプチドを用いたワクチン投与、またはｉｎ
ｖｉｔｒｏ活性化ＬＭＰ１特異的ＣＴＬの借用的（ａｄｏｐｔｉｖｅ）導入に
よってこの要素を増幅することは可能である。このようなアプローチはＨＤおよ
びＮＰＣの制御に有用でありうる。
【００７４】 ＨＬＡ Ａ＊０２０１，ＨＬＡ Ａ＊０２０３およびＨＬＡ Ａ＊０２０７陽
性ＬＣＬ（これらは東南アジア人の人種集団によく見られるスーパータイプであ
る）によるＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（配列番号１）ペプチドの有効な提示は、このエ
ピトープはＬＭＰ１発現ＮＰＣの標的エピトープとして利用できるかもしれない
という可能性を提起する。
性ＬＣＬ（これらは東南アジア人の人種集団によく見られるスーパータイプであ
る）によるＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（配列番号１）ペプチドの有効な提示は、このエ
ピトープはＬＭＰ１発現ＮＰＣの標的エピトープとして利用できるかもしれない
という可能性を提起する。
【００７５】 実施例２材料および方法 伝染性単核球症（ＩＭ）患者 臨床的根拠から、また異好抗体陽性によって同定されたＩＭ患者から疾患の最
初の５〜１０日間に採血した。また、２人の患者については２４〜３６カ月の間
に症状がなくなった後で２度目の採血を実施した。これらの患者を、ＨＬＡ Ａ
２対立遺伝子をもとめて、微量細胞傷害試験による血清タイピングおよび遺伝子
タイピングによってＨＬＡタイピングした。３人の患者（ＳＢ，ＬＰおよびＭＧ
）がＨＬＡ Ａ２陽性であると同定され、このことは次にＨＬＡ Ａ２特異的モ
ノクローナル抗体（ＡＴＣＣ）を用いたＦＡＣＳ分析によって確認された。
初の５〜１０日間に採血した。また、２人の患者については２４〜３６カ月の間
に症状がなくなった後で２度目の採血を実施した。これらの患者を、ＨＬＡ Ａ
２対立遺伝子をもとめて、微量細胞傷害試験による血清タイピングおよび遺伝子
タイピングによってＨＬＡタイピングした。３人の患者（ＳＢ，ＬＰおよびＭＧ
）がＨＬＡ Ａ２陽性であると同定され、このことは次にＨＬＡ Ａ２特異的モ
ノクローナル抗体（ＡＴＣＣ）を用いたＦＡＣＳ分析によって確認された。
【００７６】細胞系の樹立および維持 １型（Ｂ９５．８）または２型（Ａｇ８７６）ＥＢＶ分離株を用いた末梢Ｂ細
胞の外因性ウイルス形質転換によって、１群のＩＭ患者および健常なＥＢＶ血清
陽性ドナーからＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞系（ＬＣＬ）を樹立した。そし
て、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌス
トレプトマイシン、および１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ １６
４０（増殖培地）を用いて通常の方法で維持した。さらに、ペプチド輸送体（Ｔ
ＡＰ）陰性ＢｘＴハイブリッド細胞系１７４ｘＣＥＭ．Ｔ２（Ｔ２と呼ぶ）（２
２）をペプチド安定化アッセイに使用した。
胞の外因性ウイルス形質転換によって、１群のＩＭ患者および健常なＥＢＶ血清
陽性ドナーからＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞系（ＬＣＬ）を樹立した。そし
て、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌス
トレプトマイシン、および１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ １６
４０（増殖培地）を用いて通常の方法で維持した。さらに、ペプチド輸送体（Ｔ
ＡＰ）陰性ＢｘＴハイブリッド細胞系１７４ｘＣＥＭ．Ｔ２（Ｔ２と呼ぶ）（２
２）をペプチド安定化アッセイに使用した。
【００７７】 フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）芽球化細胞（ｂｌａｓｔｓ）を生成させるた
め、ＰＨＡ（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ Ｓｅｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ）を用いて末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を刺激し、３日
後にＭＬＡ １４４上清およびｒＩＬ−２を含む増殖培地を添加した（３６）。
ＩＬ−２およびＭＬＡ上清を２週間ごとに交換しながら（ＰＨＡはそれ以上添加
しない）６週間までＰＨＡ芽球化細胞を増殖させた。
め、ＰＨＡ（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ Ｓｅｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ）を用いて末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を刺激し、３日
後にＭＬＡ １４４上清およびｒＩＬ−２を含む増殖培地を添加した（３６）。
ＩＬ−２およびＭＬＡ上清を２週間ごとに交換しながら（ＰＨＡはそれ以上添加
しない）６週間までＰＨＡ芽球化細胞を増殖させた。
【００７８】ＣＴＬエフェクターの樹立および作製 ｅｘ ｖｉｖｏ細胞傷害性アッセイに用いるための急性ＩＭ ＰＢＭＣエフェ
クターを組換えＩＬ−２を補充した増殖培地に再懸濁し、細胞傷害性アッセイ（
下記参照）に直接使用した。ポリクローナルＣＴＬを生成させるため、ＨＬＡ
Ａ２陽性ドナー由来のＰＢＭＣを、あらかじめ合成ペプチドで感作した放射線照
射（８，０００ラド）Ｔ２細胞と共に７日間培養した（３７）。７日目および１
４日目に、ペプチド感作Ｔ２細胞を用いてこれらの培養物を再刺激した。増殖培
地で１８日間培養した後、これらの細胞を標準的５１Ｃｒ放出アッセイにおいて
ペプチド感作自己ＰＨＡ芽球化細胞に対するポリクローナルエフェクターとして
用いた。
クターを組換えＩＬ−２を補充した増殖培地に再懸濁し、細胞傷害性アッセイ（
下記参照）に直接使用した。ポリクローナルＣＴＬを生成させるため、ＨＬＡ
Ａ２陽性ドナー由来のＰＢＭＣを、あらかじめ合成ペプチドで感作した放射線照
射（８，０００ラド）Ｔ２細胞と共に７日間培養した（３７）。７日目および１
４日目に、ペプチド感作Ｔ２細胞を用いてこれらの培養物を再刺激した。増殖培
地で１８日間培養した後、これらの細胞を標準的５１Ｃｒ放出アッセイにおいて
ペプチド感作自己ＰＨＡ芽球化細胞に対するポリクローナルエフェクターとして
用いた。
【００７９】ペプチドの合成 Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相法（１６）によって合成したペプチドをＣｈｉｒｏ
ｎ Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入
し、ジメチルスルホキシドに溶解し、そして標準的ＣＴＬアッセイに用いるため
無血清ＲＰＭＩ １６４０培地を用いて希釈した。
ｎ Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入
し、ジメチルスルホキシドに溶解し、そして標準的ＣＴＬアッセイに用いるため
無血清ＲＰＭＩ １６４０培地を用いて希釈した。
【００８０】ＭＨＣ安定化アッセイ 実施例１に記述したプロトコールを用いて、ｇｐ８５およびｇｐ３５０抗原内
の可能性のあるＨＬＡ Ａ２結合ペプチドを同定した。次に、これらの予測され
たペプチドを、Ｔ２細胞を用いる標準的ＭＨＣ安定化アッセイに使用した。すな
わち、Ｔ２細胞（２ｘ１０５）を２００μｌの各ペプチド（２００μｇ／ｍｌ）
と共に２６℃で１４〜１６時間インキュベートし、次に３７℃で２〜３時間イン
キュベートした。インキュベーション後、モノクローナルＨＬＡ Ａ２特異的抗
体（ＭＡ２．１：ＡＴＣＣ）を用いてＦＡＣＳによってＨＬＡ Ａ２発現を測定
した。
の可能性のあるＨＬＡ Ａ２結合ペプチドを同定した。次に、これらの予測され
たペプチドを、Ｔ２細胞を用いる標準的ＭＨＣ安定化アッセイに使用した。すな
わち、Ｔ２細胞（２ｘ１０５）を２００μｌの各ペプチド（２００μｇ／ｍｌ）
と共に２６℃で１４〜１６時間インキュベートし、次に３７℃で２〜３時間イン
キュベートした。インキュベーション後、モノクローナルＨＬＡ Ａ２特異的抗
体（ＭＡ２．１：ＡＴＣＣ）を用いてＦＡＣＳによってＨＬＡ Ａ２発現を測定
した。
【００８１】ワクシニアウイルス組換え体 ＥＢＶ構造抗原ｇｐ３５０（Ｖａｃｃ．ｇｐ３５０）およびｇｐ８５（Ｖａｃ
ｃ．ｇｐ８５）をコードする組換えワクシニア構築物、およびｐＳＣ１１ベクタ
ーのみを挿入して作製したチミジンキナーゼ陰性のワクシニアウイルス構築物（
Ｖａｃｃ．ＴＫ−）は、以前に記述されている（３８）。以前に記述されている
ように、標的細胞を感染多重度（ＭＯＩ）１０：１で１時間３７℃で組換えワク
シニアウイルスに感染させた（６、１２）。１晩感染させた後、細胞を増殖培地
で洗浄し、ＣＴＬアッセイのため、または組換えＥＢＶ抗原の発現を評価するイ
ムノブロッティングのために処理した（１１）。
ｃ．ｇｐ８５）をコードする組換えワクシニア構築物、およびｐＳＣ１１ベクタ
ーのみを挿入して作製したチミジンキナーゼ陰性のワクシニアウイルス構築物（
Ｖａｃｃ．ＴＫ−）は、以前に記述されている（３８）。以前に記述されている
ように、標的細胞を感染多重度（ＭＯＩ）１０：１で１時間３７℃で組換えワク
シニアウイルスに感染させた（６、１２）。１晩感染させた後、細胞を増殖培地
で洗浄し、ＣＴＬアッセイのため、または組換えＥＢＶ抗原の発現を評価するイ
ムノブロッティングのために処理した（１１）。
【００８２】細胞傷害性アッセイ 標的細胞を組換えワクシニアウイルスに感染させるか、または合成ペプチドエ
ピトープを用いて前もって感作し、次に５１Ｃｒと共に９０分間インキュベート
した。インキュベーション後、これらの細胞を増殖培地で洗浄し、標準的な５時
間５１Ｃｒ放出アッセイに標的として用いた（１６）。
ピトープを用いて前もって感作し、次に５１Ｃｒと共に９０分間インキュベート
した。インキュベーション後、これらの細胞を増殖培地で洗浄し、標準的な５時
間５１Ｃｒ放出アッセイに標的として用いた（１６）。
【００８３】ｇｐ３５０およびｇｐ８５ ＣＴＬエピトープを用いたＨＬＡ Ａ２／Ｋｂトラ
ンスジェニックマウスの免疫感作 この試験に用いたＨＬＡ Ａ２／Ｋｂトランスジェニックマウスは別の文献に
記述されている（３９）。これらのマウスは、ヒトＡ＊０２０１対立遺伝子のα
１および２ドメイン、およびマウスＨ−２ＫｂクラスＩ分子のα３ドメインから
構成されるキメラクラスＩ分子を発現する。ペプチド免疫感作はＶｉｔｅｌｌｏ
ら（４０）によって記述されているように実施した。すなわち、１匹あたり５０
μｇのＩＦＡで乳化したＣＴＬエピトープを５μｇの補助供給源としての破傷風
トキソイドと共に用いて、これらのマウスを２回（１４日間隔で）皮下的に免疫
感作した。ペプチド感作の４週間後に、ｇｐ３５０およびｇｐ８５特異的ＣＴＬ
応答についてマウスを評価した。これらのＣＴＬ応答を評価するため、脾臓細胞
（３ｘ１０６個／ｍｌ）を同遺伝子型の、放射線照射（２０００ラド）ペプチド
を塗布したＬＰＳ芽球化細胞（３ｘ１０５個／ｍｌ）および３μｇ／ｍｌヒトＢ
２ミクログロブリンと共に培養した。６日目に標準的５１Ｃｒ放出アッセイを用
いてＣＴＬ活性を試験した。
ンスジェニックマウスの免疫感作 この試験に用いたＨＬＡ Ａ２／Ｋｂトランスジェニックマウスは別の文献に
記述されている（３９）。これらのマウスは、ヒトＡ＊０２０１対立遺伝子のα
１および２ドメイン、およびマウスＨ−２ＫｂクラスＩ分子のα３ドメインから
構成されるキメラクラスＩ分子を発現する。ペプチド免疫感作はＶｉｔｅｌｌｏ
ら（４０）によって記述されているように実施した。すなわち、１匹あたり５０
μｇのＩＦＡで乳化したＣＴＬエピトープを５μｇの補助供給源としての破傷風
トキソイドと共に用いて、これらのマウスを２回（１４日間隔で）皮下的に免疫
感作した。ペプチド感作の４週間後に、ｇｐ３５０およびｇｐ８５特異的ＣＴＬ
応答についてマウスを評価した。これらのＣＴＬ応答を評価するため、脾臓細胞
（３ｘ１０６個／ｍｌ）を同遺伝子型の、放射線照射（２０００ラド）ペプチド
を塗布したＬＰＳ芽球化細胞（３ｘ１０５個／ｍｌ）および３μｇ／ｍｌヒトＢ
２ミクログロブリンと共に培養した。６日目に標準的５１Ｃｒ放出アッセイを用
いてＣＴＬ活性を試験した。
【００８４】ワクシニア保護アッセイ 保護実験のため、８週齢の雌Ａ２／Ｋｂトランスジェニックマウスの群を上記
のようにＣＴＬエピトープで免疫感作した。２８日目にＶａｃｃ．ｇｐ８５およ
びＶａｃｃ．ｇｐ３５０をマウスの腹腔内に投与してチャレンジした（１００μ
ｌのＰＢＳに溶解した１ｘ１０７ ｐｆｕ）。チャレンジの４日後、これらのマ
ウスを屠殺し、コンフルエントなＣＶ１細胞を用いたプラークアッセイによって
両方の卵巣についてワクシニア力価を測定した。
のようにＣＴＬエピトープで免疫感作した。２８日目にＶａｃｃ．ｇｐ８５およ
びＶａｃｃ．ｇｐ３５０をマウスの腹腔内に投与してチャレンジした（１００μ
ｌのＰＢＳに溶解した１ｘ１０７ ｐｆｕ）。チャレンジの４日後、これらのマ
ウスを屠殺し、コンフルエントなＣＶ１細胞を用いたプラークアッセイによって
両方の卵巣についてワクシニア力価を測定した。
【００８５】結果 ｇｐ８５およびｇｐ３５０内のＨＬＡ Ａ２結合ペプチドの同定 ｇｐ８５およびｇｐ３５０内の可能性のあるＨＬＡ Ａ２に拘束されるエピト
ープを同定するため、ＨＬＡ−ペプチド複合体の半期（ｈａｌｆ−ｔｉｍｅ）解
離の推定値に基づいてＨＬＡ結合ペプチドを予測するために設計されたコンピュ
ータプログラムによってアミノ酸配列を分析した（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．
ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ ｂｉｎｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈ
ｔｍｌ）（１８）。推定される半期解離スコアがｇｐ８５については＞１００、
そしてｇｐ３５０については＞５０ である合計２０個のペプチド（ｇｐ８５由
来が１３個、ｇｐ３５０由来が７個）を選択した（表３）。次に、ＨＬＡ Ａ２
陽性Ｔ２細胞を用いて、これらのペプチドをＨＬＡ Ａ２結合効率について試験
した。一連の実験によって得た代表的データを図８に示す。この分析は、試験し
たペプチドのうち７個がＴ２細胞上のＨＬＡ Ａ２発現を大幅に増大させたこと
を示し、これらのペプチドがＨＬＡ Ａ２に拘束されるエピトープであるかもし
れないことを示唆した。
ープを同定するため、ＨＬＡ−ペプチド複合体の半期（ｈａｌｆ−ｔｉｍｅ）解
離の推定値に基づいてＨＬＡ結合ペプチドを予測するために設計されたコンピュ
ータプログラムによってアミノ酸配列を分析した（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．
ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ ｂｉｎｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈ
ｔｍｌ）（１８）。推定される半期解離スコアがｇｐ８５については＞１００、
そしてｇｐ３５０については＞５０ である合計２０個のペプチド（ｇｐ８５由
来が１３個、ｇｐ３５０由来が７個）を選択した（表３）。次に、ＨＬＡ Ａ２
陽性Ｔ２細胞を用いて、これらのペプチドをＨＬＡ Ａ２結合効率について試験
した。一連の実験によって得た代表的データを図８に示す。この分析は、試験し
たペプチドのうち７個がＴ２細胞上のＨＬＡ Ａ２発現を大幅に増大させたこと
を示し、これらのペプチドがＨＬＡ Ａ２に拘束されるエピトープであるかもし
れないことを示唆した。
【００８６】
【表３】 ＊ｇｐ８５およびｇｐ３５０内の可能性のあるＨＬＡ Ａ２結合ペプチドを同定
するため、別の文献に記述されているコンピュータに基づくプログラムを用いた
（１８参照）。
するため、別の文献に記述されているコンピュータに基づくプログラムを用いた
（１８参照）。
【００８７】 このプログラムはインターネット経由で直接アクセスすることができる： ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌ
ａ ｂｉｎｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ
ａ ｂｉｎｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ
【００８８】ＩＭエフェクターによるｇｐ８５およびｇｐ３５０エピトープのｅｘ ｖｉｖｏ
認識 次に、７個のＨＬＡ Ａ２結合ペプチド（ｇｐ８５由来の４個およびｇｐ３５
０由来の３個）を、ＩＭ患者由来のエフェクターによるＣＴＬ認識について試験
した。さらに、我々は陽性対照としてＥＢＶ潜在膜タンパク質（ＬＭＰ１）由来
の、ＨＬＡ Ａ２に拘束されるＣＴＬエピトープをも試験に含めた（３８）。３
人のＨＬＡ Ａ２陽性ＩＭ患者（ＳＢ、ＬＰおよびＭＧ）由来のＰＢＭＣを、Ｉ
Ｌ−２を補充した増殖培地に再懸濁し、そして標準的５１Ｃｒ放出アッセイにお
いてｇｐ８５、ｇｐ３５０またはＬＭＰ１ペプチドで感作した、ＨＬＡが一致す
るＰＨＡ芽球化細胞に対するエフェクターとして使用した。２つの異なる実験か
ら得た代表的データを図９（Ａ−Ｃ）に示す。３人の全てのＩＭ患者に由来する
エフェクターが対照ＬＭＰ１ペプチド（ＹＬＱＱＮＷＷＴＬ（配列番号６））の
明確な認識を示し、このペプチドはＥＢＶ特異的ＣＴＬに認識されるという我々
の以前の発見に一致した。より重要なことに、これらのＩＭ患者は選択されたｇ
ｐ８５またはｇｐ３５０ペプチドによって感作した標的細胞に対してより強い認
識を示した。興味深いことに、これらの患者はそれぞれ別個の反応性パターンを
これらのペプチドに対して示した。ＩＭ患者ＳＢはペプチドＳＬＶＩＶＴＴＦＶ
（配列番号１７）（ｇｐ８５）およびＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号２７）（ｇ
ｐ３５０）に強い反応性を示したが（図９Ａ）、他方ＬＰおよびＭＧエフェクタ
ーは前もってペプチドＬＭＩＩＰＬＩＮＶ（配列番号２０）（ｇｐ８５）および
ＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号２７）（ｇｐ３５０）で感作した標的細胞を認識
した（図９（Ｂ−Ｃ））。さらに、患者ＩＬ由来のｅｘ ｖｉｖｏエフェクター
はＶａｃｃ．ｇｐ３５０およびＶａｃｃ．ｇｐ８５に感染した標的細胞をも認識
した（図９Ｄ）。
認識 次に、７個のＨＬＡ Ａ２結合ペプチド（ｇｐ８５由来の４個およびｇｐ３５
０由来の３個）を、ＩＭ患者由来のエフェクターによるＣＴＬ認識について試験
した。さらに、我々は陽性対照としてＥＢＶ潜在膜タンパク質（ＬＭＰ１）由来
の、ＨＬＡ Ａ２に拘束されるＣＴＬエピトープをも試験に含めた（３８）。３
人のＨＬＡ Ａ２陽性ＩＭ患者（ＳＢ、ＬＰおよびＭＧ）由来のＰＢＭＣを、Ｉ
Ｌ−２を補充した増殖培地に再懸濁し、そして標準的５１Ｃｒ放出アッセイにお
いてｇｐ８５、ｇｐ３５０またはＬＭＰ１ペプチドで感作した、ＨＬＡが一致す
るＰＨＡ芽球化細胞に対するエフェクターとして使用した。２つの異なる実験か
ら得た代表的データを図９（Ａ−Ｃ）に示す。３人の全てのＩＭ患者に由来する
エフェクターが対照ＬＭＰ１ペプチド（ＹＬＱＱＮＷＷＴＬ（配列番号６））の
明確な認識を示し、このペプチドはＥＢＶ特異的ＣＴＬに認識されるという我々
の以前の発見に一致した。より重要なことに、これらのＩＭ患者は選択されたｇ
ｐ８５またはｇｐ３５０ペプチドによって感作した標的細胞に対してより強い認
識を示した。興味深いことに、これらの患者はそれぞれ別個の反応性パターンを
これらのペプチドに対して示した。ＩＭ患者ＳＢはペプチドＳＬＶＩＶＴＴＦＶ
（配列番号１７）（ｇｐ８５）およびＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号２７）（ｇ
ｐ３５０）に強い反応性を示したが（図９Ａ）、他方ＬＰおよびＭＧエフェクタ
ーは前もってペプチドＬＭＩＩＰＬＩＮＶ（配列番号２０）（ｇｐ８５）および
ＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号２７）（ｇｐ３５０）で感作した標的細胞を認識
した（図９（Ｂ−Ｃ））。さらに、患者ＩＬ由来のｅｘ ｖｉｖｏエフェクター
はＶａｃｃ．ｇｐ３５０およびＶａｃｃ．ｇｐ８５に感染した標的細胞をも認識
した（図９Ｄ）。
【００８９】ｇｐ８５およびｇｐ３５０ペプチドエピトープ反応性ＣＴＬのｉｎ ｖｉｔｒｏ
拡大 上に提示したデータはｇｐ８５およびｇｐ３５０が、ＨＬＡ Ａ２分子に結合
することができ、そしてＩＭ患者由来のｅｘ ｖｉｖｏエフェクターによって有
効に認識されるＣＴＬ決定基を含むことを明確に示している。ｇｐ８５またはｇ
ｐ３５０反応性ＣＴＬがＩＭからの回復後に検出できるかどうかを決定するため
、２人のドナー（ＳＢおよびＬＰ）由来のＰＢＭＣをＩＭの２４〜３６カ月後に
それぞれ採取し、そして強いＨＬＡ Ａ２結合を示したｇｐ８５およびｇｐ３５
０ペプチドのそれぞれで前もって感作したＴ２細胞を用いて刺激した。１８日目
に、これらのＣＴＬエフェクターをペプチド感作自己ＰＨＡ芽球化細胞に対して
試験した。ドナーＳＢ由来のポリクローナルＣＴＬから得た代表的データを図１
０に示す。ドナーＳＢ由来のＣＴＬエフェクターはペプチドＳＬＶＩＶＴＴＦＶ
（配列番号１７）（ｇｐ８５）およびＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号２７）に対
して強い反応性を示したばかりでなく、ｇｐ８５由来の他の２つのペプチドＬＭ
ＩＩＰＬＩＮＶ（配列番号２０）およびＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号２４）を
認識した。ドナーＬＰもまた類似のＣＴＬ溶解パターンを示した。したがって、
ペプチドＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号２４）はこれらＡ２陽性のヒトの記憶応
答におけるＥＢＶ特異的ＣＴＬ認識の標的であるが、この応答は急性感染の間は
ｅｘ ｖｉｖｏエフェクターでは検出できない。強調する必要があるもう１つの
重要な点は、刺激物質として自己ＬＣＬを用いてｇｐ８５またはｇｐ３５０特異
的ＣＴＬを活性化しようとした我々の試みはうまくいかなかったことである。こ
の結果は驚くにあたらない。なぜなら、潜在的に感染したＢ細胞においてはｇｐ
３５０またはｇｐ８５抗原は殆ど発現されないことが十分実証されているからで
ある。これらのドナー由来のＬＣＬ刺激ポリクローナルＴ細胞系は潜在抗原に対
して強度に反応性である（データは記載していない）。この所見は、健常なウイ
ルスキャリアにおけるＣＴＬ応答は潜在抗原に対する反応性によってしばしば支
配されるということを示した我々の初期の研究（６）に一致する。自己ＬＣＬを
用いた刺激を行ってもｇｐ３５０またはｇｐ８５特異的ＣＴＬ反応性が検出でき
ないことに対する別の説明は、健常なウイルスキャリアにおいては、これらの応
答は全ウイルス特異的ＣＴＬ応答のマイナーな要素にすぎないということである
。実際、ＩＭ後のドナーＳＢおよびＬＰにおけるｇｐ３５０またはｇｐ８５ペプ
チドエピトープに特異的なＣＴＬ前駆体の限界希釈分析は＞１／５０，０００と
いう前駆体頻度を示したが、他方、潜在抗原内のＣＴＬエピトープを認識するＣ
ＴＬの前駆体頻度は１／４，０００〜１／１５，０００の間であった（データは
記載していない）。
拡大 上に提示したデータはｇｐ８５およびｇｐ３５０が、ＨＬＡ Ａ２分子に結合
することができ、そしてＩＭ患者由来のｅｘ ｖｉｖｏエフェクターによって有
効に認識されるＣＴＬ決定基を含むことを明確に示している。ｇｐ８５またはｇ
ｐ３５０反応性ＣＴＬがＩＭからの回復後に検出できるかどうかを決定するため
、２人のドナー（ＳＢおよびＬＰ）由来のＰＢＭＣをＩＭの２４〜３６カ月後に
それぞれ採取し、そして強いＨＬＡ Ａ２結合を示したｇｐ８５およびｇｐ３５
０ペプチドのそれぞれで前もって感作したＴ２細胞を用いて刺激した。１８日目
に、これらのＣＴＬエフェクターをペプチド感作自己ＰＨＡ芽球化細胞に対して
試験した。ドナーＳＢ由来のポリクローナルＣＴＬから得た代表的データを図１
０に示す。ドナーＳＢ由来のＣＴＬエフェクターはペプチドＳＬＶＩＶＴＴＦＶ
（配列番号１７）（ｇｐ８５）およびＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号２７）に対
して強い反応性を示したばかりでなく、ｇｐ８５由来の他の２つのペプチドＬＭ
ＩＩＰＬＩＮＶ（配列番号２０）およびＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号２４）を
認識した。ドナーＬＰもまた類似のＣＴＬ溶解パターンを示した。したがって、
ペプチドＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号２４）はこれらＡ２陽性のヒトの記憶応
答におけるＥＢＶ特異的ＣＴＬ認識の標的であるが、この応答は急性感染の間は
ｅｘ ｖｉｖｏエフェクターでは検出できない。強調する必要があるもう１つの
重要な点は、刺激物質として自己ＬＣＬを用いてｇｐ８５またはｇｐ３５０特異
的ＣＴＬを活性化しようとした我々の試みはうまくいかなかったことである。こ
の結果は驚くにあたらない。なぜなら、潜在的に感染したＢ細胞においてはｇｐ
３５０またはｇｐ８５抗原は殆ど発現されないことが十分実証されているからで
ある。これらのドナー由来のＬＣＬ刺激ポリクローナルＴ細胞系は潜在抗原に対
して強度に反応性である（データは記載していない）。この所見は、健常なウイ
ルスキャリアにおけるＣＴＬ応答は潜在抗原に対する反応性によってしばしば支
配されるということを示した我々の初期の研究（６）に一致する。自己ＬＣＬを
用いた刺激を行ってもｇｐ３５０またはｇｐ８５特異的ＣＴＬ反応性が検出でき
ないことに対する別の説明は、健常なウイルスキャリアにおいては、これらの応
答は全ウイルス特異的ＣＴＬ応答のマイナーな要素にすぎないということである
。実際、ＩＭ後のドナーＳＢおよびＬＰにおけるｇｐ３５０またはｇｐ８５ペプ
チドエピトープに特異的なＣＴＬ前駆体の限界希釈分析は＞１／５０，０００と
いう前駆体頻度を示したが、他方、潜在抗原内のＣＴＬエピトープを認識するＣ
ＴＬの前駆体頻度は１／４，０００〜１／１５，０００の間であった（データは
記載していない）。
【００９０】ｇｐ８５およびｇｐ３５０ペプチドエピトープを用いたＨＬＡ Ａ２／Ｋｂマウ
スの免疫感作は特異的ＣＴＬ応答を誘導する 。 ｇｐ８５およびｇｐ３５０がＣＴＬエピトープを含むことを証明した後、我々
はこれらのペプチドエピトープを用いてｉｎ ｖｉｖｏで特異的ＣＴＬ応答を誘
導する可能性の探究へと研究を拡大した。この問題に取り組むための実験モデル
としてＨＬＡ Ａ２／Ｋｂトランスジェニックマウスを用いた。これらのマウス
は、ヒトＡ＊０２０１対立遺伝子のα１および２ドメイン、およびマウスＨ−２
ＫｂクラスＩ分子のα３ドメインから構成されるキメラクラスＩ分子を発現する
。ＩＦＡで乳化したｇｐ３５０またはｇｐ８５ＣＴＬエピトープを補助供給源と
しての破傷風トキソイドと共に用いて、これらのマウスを皮下的に免疫感作した
。ｇｐ８５由来のＳＬＶＩＶＴＴＦＶ（配列番号１７）およびＴＬＦＩＧＳＨＶ
Ｖ（配列番号２４）ペプチド、ならびにｇｐ３５０由来のＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（
配列番号２７）ペプチドを免疫感作に使用した。免疫感作の２週間後に、脾細胞
またはプールされた鼠径部リンパ節細胞をエフェクターとして用いて各マウスに
おける特異的ＣＴＬ応答を評価した。図１１（Ａ−Ｃ）に示すデータは、ｇｐ８
５由来のペプチドエピトープ〔ＳＬＶＩＶＴＴＦＶ（配列番号１７）およびＴＬ
ＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号２４）〕ならびにｇｐ３５０由来のペプチドエピトー
プ〔ＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号２７）〕が脾細胞に強いＣＴＬ応答を誘導す
ることを示している。興味深いことに、ペプチドＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号
２４）を用いて脾細胞から活性化されたＣＴＬは一貫して標的の強い溶解を示し
たが、他方、ＳＬＶＩＶＴＴＦＶ（配列番号１７）およびＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（
配列番号２７）で免疫感作したマウス由来の脾細胞は変動するｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＣＴＬ溶解を示した。強い特異的ＣＴＬ活性が、鼠径部リンパ節由来のプール
されたリンパ球にも見られた（図１１Ｄ）。
スの免疫感作は特異的ＣＴＬ応答を誘導する 。 ｇｐ８５およびｇｐ３５０がＣＴＬエピトープを含むことを証明した後、我々
はこれらのペプチドエピトープを用いてｉｎ ｖｉｖｏで特異的ＣＴＬ応答を誘
導する可能性の探究へと研究を拡大した。この問題に取り組むための実験モデル
としてＨＬＡ Ａ２／Ｋｂトランスジェニックマウスを用いた。これらのマウス
は、ヒトＡ＊０２０１対立遺伝子のα１および２ドメイン、およびマウスＨ−２
ＫｂクラスＩ分子のα３ドメインから構成されるキメラクラスＩ分子を発現する
。ＩＦＡで乳化したｇｐ３５０またはｇｐ８５ＣＴＬエピトープを補助供給源と
しての破傷風トキソイドと共に用いて、これらのマウスを皮下的に免疫感作した
。ｇｐ８５由来のＳＬＶＩＶＴＴＦＶ（配列番号１７）およびＴＬＦＩＧＳＨＶ
Ｖ（配列番号２４）ペプチド、ならびにｇｐ３５０由来のＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（
配列番号２７）ペプチドを免疫感作に使用した。免疫感作の２週間後に、脾細胞
またはプールされた鼠径部リンパ節細胞をエフェクターとして用いて各マウスに
おける特異的ＣＴＬ応答を評価した。図１１（Ａ−Ｃ）に示すデータは、ｇｐ８
５由来のペプチドエピトープ〔ＳＬＶＩＶＴＴＦＶ（配列番号１７）およびＴＬ
ＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号２４）〕ならびにｇｐ３５０由来のペプチドエピトー
プ〔ＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号２７）〕が脾細胞に強いＣＴＬ応答を誘導す
ることを示している。興味深いことに、ペプチドＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号
２４）を用いて脾細胞から活性化されたＣＴＬは一貫して標的の強い溶解を示し
たが、他方、ＳＬＶＩＶＴＴＦＶ（配列番号１７）およびＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（
配列番号２７）で免疫感作したマウス由来の脾細胞は変動するｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＣＴＬ溶解を示した。強い特異的ＣＴＬ活性が、鼠径部リンパ節由来のプール
されたリンパ球にも見られた（図１１Ｄ）。
【００９１】ｇｐ８５またはｇｐ３５０ ＣＴＬエピトープを用いてＨＬＡ Ａ２／Ｋｂマウ
スを前もって免疫感作することは、組換えワクシニアウイルスチャレンジに対す
る保護を提供する 。 ｇｐ８５またはｇｐ３５０ ＣＴＬエピトープを用いてペプチド免疫感作した
４週間後に、ｇｐ８５またはｇｐ３５０をコードする１０７ｐｆｕの組換えワク
シニアウイルスを用いてＨＬＡ Ａ２／Ｋｂマウスをチャレンジした。チャレン
ジの４日後、これらのマウスを屠殺し、コンフルエントなＣＶ１細胞を用いたプ
ラークアッセイによって両方の卵巣についてワクシニア力価を測定した。これら
の実験の１つから得たデータを図１２に示す。ｇｐ８５およびｇｐ３５０エピト
ープを用いて免疫感作したマウスは、その卵巣に非常に低レベルないし検出不可
能レベルのウイルスを有した。他方、未処理のマウスにおいては、非常に高力価
のワクシニアウイルスが検出された。この保護は、ＨＬＡ Ａ２／Ｋｂトランス
ジェニックマウスへの第一次ペプチドワクチン投与の４週間後に採取された脾細
胞およびリンパ節細胞に検出されるエピトープ特異的ＣＴＬ応答の強い誘導と相
関していた。
スを前もって免疫感作することは、組換えワクシニアウイルスチャレンジに対す
る保護を提供する 。 ｇｐ８５またはｇｐ３５０ ＣＴＬエピトープを用いてペプチド免疫感作した
４週間後に、ｇｐ８５またはｇｐ３５０をコードする１０７ｐｆｕの組換えワク
シニアウイルスを用いてＨＬＡ Ａ２／Ｋｂマウスをチャレンジした。チャレン
ジの４日後、これらのマウスを屠殺し、コンフルエントなＣＶ１細胞を用いたプ
ラークアッセイによって両方の卵巣についてワクシニア力価を測定した。これら
の実験の１つから得たデータを図１２に示す。ｇｐ８５およびｇｐ３５０エピト
ープを用いて免疫感作したマウスは、その卵巣に非常に低レベルないし検出不可
能レベルのウイルスを有した。他方、未処理のマウスにおいては、非常に高力価
のワクシニアウイルスが検出された。この保護は、ＨＬＡ Ａ２／Ｋｂトランス
ジェニックマウスへの第一次ペプチドワクチン投与の４週間後に採取された脾細
胞およびリンパ節細胞に検出されるエピトープ特異的ＣＴＬ応答の強い誘導と相
関していた。
【００９２】考察 健常なヒトにおける潜在的に感染したＢ細胞の発生を抑制するばかりでなく、
多くのＥＢＶ関連悪性疾患（例えばバーキットリンパ腫（ＢＬ）、鼻咽頭癌（Ｎ
ＰＣ）およびホジキン病（ＨＤ）等）の発症をブロックするように設計されたＥ
ＢＶに対する効果的なワクチンの製剤化への関心が高まっている。欧米社会にお
いては、このようなワクチンの主要な目的はＩＭからの保護にあるであろう。こ
の関係においては、ウイルス荷重（ｌｏａｄ）（経口的に送りこまれる大量のウ
イルスおよび／またはウイルス形質転換Ｂ細胞プールの臨界しきいを越えた過剰
拡大）が疾病リスクの重大な決定要素となりうる（７）。それゆえ、一次ＥＢＶ
感染をブロックすることができる、または一次感染の際にＥＢＶ荷重を大幅に減
少させることができるワクチンは、臨床症状を回避するのに十分であろう。類似
のワクチンは、免疫抑制療法を受けている移植患者におけるリンパ球増殖性疾患
の当面の危険を減少させることもできるであろう。他方、ＢＬ、ＮＰＣおよびＨ
Ｄ等のＥＢＶ関連悪性疾患は患者が一次感染してから何年もたってから起きるも
ので、これらの長期的成り行きからの保護には無菌性（ｓｔｅｒｉｌｅ）免疫を
理想的に付与し、キャリア状態の確立を阻止するワクチンが必要である。
多くのＥＢＶ関連悪性疾患（例えばバーキットリンパ腫（ＢＬ）、鼻咽頭癌（Ｎ
ＰＣ）およびホジキン病（ＨＤ）等）の発症をブロックするように設計されたＥ
ＢＶに対する効果的なワクチンの製剤化への関心が高まっている。欧米社会にお
いては、このようなワクチンの主要な目的はＩＭからの保護にあるであろう。こ
の関係においては、ウイルス荷重（ｌｏａｄ）（経口的に送りこまれる大量のウ
イルスおよび／またはウイルス形質転換Ｂ細胞プールの臨界しきいを越えた過剰
拡大）が疾病リスクの重大な決定要素となりうる（７）。それゆえ、一次ＥＢＶ
感染をブロックすることができる、または一次感染の際にＥＢＶ荷重を大幅に減
少させることができるワクチンは、臨床症状を回避するのに十分であろう。類似
のワクチンは、免疫抑制療法を受けている移植患者におけるリンパ球増殖性疾患
の当面の危険を減少させることもできるであろう。他方、ＢＬ、ＮＰＣおよびＨ
Ｄ等のＥＢＶ関連悪性疾患は患者が一次感染してから何年もたってから起きるも
ので、これらの長期的成り行きからの保護には無菌性（ｓｔｅｒｉｌｅ）免疫を
理想的に付与し、キャリア状態の確立を阻止するワクチンが必要である。
【００９３】 ＥＢＶ構造抗原、主としてｇｐ３５０は長い間ＥＢＶワクチンの可能性のある
候補と考えられてきた。ｇｐ３５０が有望なワクチン候補であるという示唆は、
そもそもこの糖タンパク質がウイルス中和抗体応答の主要な標的であるという所
見に基づいていた（４１）。高力価の中和抗体を誘導するために設計され、サブ
ユニット抗原として提示される又は組換えウイルスベクターから発現されるｇｐ
３５０の多数の組換え製剤がコットントップタマリンのＥＢＶ誘導Ｂ細胞リンパ
腫に対して重大な保護を示した（３１）。しかし、最近の結果はＥＢＶ感染から
の保護におけるｇｐ３５０特異的ＣＴＬの役割を示唆したが（３４）、ワクチン
投与された動物における中和抗体の発生はＥＢＶ感染からの保護との間に必ずし
も限定された相関性を示すわけではない。上記の示唆が正しいならば、ＥＢＶ構
造タンパク質内の可能性のあるＣＴＬ決定基を同定することは重要である。なぜ
なら、全ウイルスタンパク質を用いた免疫感作は有効なＣＴＬ応答を誘導できな
いことが現在では十分証明されているからである。さらに、ＣＴＬエピトープに
基づくワクチンはｇｐ３５０由来の決定基ばかりでなく他の構造抗原（例えばｇ
ｐ８５）由来の決定基をも含む機会を提供する。この問題と取り組むため、我々
はｇｐ３５０およびｇｐ８５内のＣＴＬエピトープをうまく同定するための新規
なプロトコールを用いた。最初の１組の実験において、我々はｇｐ３５０および
ｇｐ８５内のＨＬＡ Ａ２結合ペプチドを同定した。次の実験は、ＨＬＡ Ａ２
対立遺伝子を有するＩＭ患者に重点を置いた。ｅｘ ｖｉｖｏ一次エフェクター
を用いて、我々は３つの異なるｇｐ３５０およびｇｐ８５ペプチドに対する強い
反応性を観察した。興味深いことに、各ＩＭ患者はこれらのペプチドに対してそ
れぞれ別個の反応性パターンを示した。患者ＳＢ由来のｅｘ ｖｉｖｏエフェク
ターを用いた場合、ペプチドＳＬＶＩＶＴＴＦＶ（配列番号１７）（ｇｐ８５）
およびＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号２７）（ｇｐ３５０）に対する強い反応性
が観察された。他方、他方ＬＰおよびＭＧエフェクターは前もってペプチドＬＭ
ＩＩＰＬＩＮＶ（配列番号２０）（ｇｐ８５）およびＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列
番号２７）（ｇｐ３５０）で感作した標的細胞を認識した。さらに重要なことに
、患者ＩＬ由来のｅｘ ｖｉｖｏエフェクターはＶａｃｃ．ｇｐ３５０およびＶ
ａｃｃ．ｇｐ８５に感染した標的細胞をも認識した。興味深いことに、構造抗原
由来のエピトープに向けられたｅｘ ｖｉｖｏ ＣＴＬ溶解のレベルは、同一ア
ッセイにおいて見られた、潜在抗原由来のＨＬＡ Ａ２に拘束されるＣＴＬエピ
トープに対するレベルよりも一貫して高かった。これらの結果は、ＩＭ患者にお
ける溶解抗原に対するｅｘ ｖｉｖｏ ＣＴＬ反応性は潜在抗原に較べて有意に
高い、というＳｔｅｖｅｎら（４２）による最近の所見と一致している。
候補と考えられてきた。ｇｐ３５０が有望なワクチン候補であるという示唆は、
そもそもこの糖タンパク質がウイルス中和抗体応答の主要な標的であるという所
見に基づいていた（４１）。高力価の中和抗体を誘導するために設計され、サブ
ユニット抗原として提示される又は組換えウイルスベクターから発現されるｇｐ
３５０の多数の組換え製剤がコットントップタマリンのＥＢＶ誘導Ｂ細胞リンパ
腫に対して重大な保護を示した（３１）。しかし、最近の結果はＥＢＶ感染から
の保護におけるｇｐ３５０特異的ＣＴＬの役割を示唆したが（３４）、ワクチン
投与された動物における中和抗体の発生はＥＢＶ感染からの保護との間に必ずし
も限定された相関性を示すわけではない。上記の示唆が正しいならば、ＥＢＶ構
造タンパク質内の可能性のあるＣＴＬ決定基を同定することは重要である。なぜ
なら、全ウイルスタンパク質を用いた免疫感作は有効なＣＴＬ応答を誘導できな
いことが現在では十分証明されているからである。さらに、ＣＴＬエピトープに
基づくワクチンはｇｐ３５０由来の決定基ばかりでなく他の構造抗原（例えばｇ
ｐ８５）由来の決定基をも含む機会を提供する。この問題と取り組むため、我々
はｇｐ３５０およびｇｐ８５内のＣＴＬエピトープをうまく同定するための新規
なプロトコールを用いた。最初の１組の実験において、我々はｇｐ３５０および
ｇｐ８５内のＨＬＡ Ａ２結合ペプチドを同定した。次の実験は、ＨＬＡ Ａ２
対立遺伝子を有するＩＭ患者に重点を置いた。ｅｘ ｖｉｖｏ一次エフェクター
を用いて、我々は３つの異なるｇｐ３５０およびｇｐ８５ペプチドに対する強い
反応性を観察した。興味深いことに、各ＩＭ患者はこれらのペプチドに対してそ
れぞれ別個の反応性パターンを示した。患者ＳＢ由来のｅｘ ｖｉｖｏエフェク
ターを用いた場合、ペプチドＳＬＶＩＶＴＴＦＶ（配列番号１７）（ｇｐ８５）
およびＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号２７）（ｇｐ３５０）に対する強い反応性
が観察された。他方、他方ＬＰおよびＭＧエフェクターは前もってペプチドＬＭ
ＩＩＰＬＩＮＶ（配列番号２０）（ｇｐ８５）およびＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列
番号２７）（ｇｐ３５０）で感作した標的細胞を認識した。さらに重要なことに
、患者ＩＬ由来のｅｘ ｖｉｖｏエフェクターはＶａｃｃ．ｇｐ３５０およびＶ
ａｃｃ．ｇｐ８５に感染した標的細胞をも認識した。興味深いことに、構造抗原
由来のエピトープに向けられたｅｘ ｖｉｖｏ ＣＴＬ溶解のレベルは、同一ア
ッセイにおいて見られた、潜在抗原由来のＨＬＡ Ａ２に拘束されるＣＴＬエピ
トープに対するレベルよりも一貫して高かった。これらの結果は、ＩＭ患者にお
ける溶解抗原に対するｅｘ ｖｉｖｏ ＣＴＬ反応性は潜在抗原に較べて有意に
高い、というＳｔｅｖｅｎら（４２）による最近の所見と一致している。
【００９４】 次の１組の実験において、我々はＩＭ症状が消散した後で構造抗原特異的ＣＴ
Ｌ応答を検出する可能性を検討した。この追跡分析は、急性ＩＭの２４〜３６カ
月後に実施した。我々の最初の試みは、自己ＬＣＬを用いて刺激することによっ
てＩＭ後のドナーからｇｐ３５０またはｇｐ８５特異的ＣＴＬを単離することで
あったが、これはうまくいかなかった。次に、我々は刺激物質としてペプチドを
負荷したＴ２細胞を用いてｇｐ３５０またはｇｐ８５特異的ＣＴＬを生成させた
。我々は最近、低頻度ＥＢＶ特異的ＣＴＬ前駆体を生じさせるためにこの方法を
上首尾に使用できることを示した（３８）。ドナーＳＢおよびＬＰ由来のＰＢＭ
Ｃの刺激は、ｇｐ８５およびｇｐ３５０ ＣＴＬエピトープに対する強いＣＴＬ
応答を引き起こした。ＳＢおよびＬＰ両ドナーは、ペプチドＳＬＶＩＶＴＴＦＶ
（配列番号１７）、ＬＭＩＩＰＬＩＮＶ（配列番号２０）およびＶＬＱＷＡＳＬ
ＡＶ（配列番号２７）に対して反応性を示したばかりでなく、ｇｐ８５由来のも
う１つのペプチドＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号２４）をも認識した。両ドナー
とも急性ＩＭの間にはＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号２４）に対してｅｘ ｖｉ
ｖｏ ＣＴＬ反応性を全く示さなかったことを注記することは興味深い。これら
の分析から引き出される重要な結果の１つは、急性ＩＭから回復した後、構造抗
原に対するＣＴＬ前駆体は大幅に減少し、そして応答は潜在抗原に対して反応性
のＣＴＬによって支配されるようになる、ということである。実際、ＩＭ後のド
ナーＳＢおよびＬＰにおけるｇｐ３５０またはｇｐ８５ペプチドエピトープに特
異的なＣＴＬ前駆体の限界希釈分析は＞１／５０，０００という頻度を示したが
、他方、潜在抗原内のＣＴＬエピトープに対する前駆体頻度は１／４，０００〜
１／１５，０００の間であった。
Ｌ応答を検出する可能性を検討した。この追跡分析は、急性ＩＭの２４〜３６カ
月後に実施した。我々の最初の試みは、自己ＬＣＬを用いて刺激することによっ
てＩＭ後のドナーからｇｐ３５０またはｇｐ８５特異的ＣＴＬを単離することで
あったが、これはうまくいかなかった。次に、我々は刺激物質としてペプチドを
負荷したＴ２細胞を用いてｇｐ３５０またはｇｐ８５特異的ＣＴＬを生成させた
。我々は最近、低頻度ＥＢＶ特異的ＣＴＬ前駆体を生じさせるためにこの方法を
上首尾に使用できることを示した（３８）。ドナーＳＢおよびＬＰ由来のＰＢＭ
Ｃの刺激は、ｇｐ８５およびｇｐ３５０ ＣＴＬエピトープに対する強いＣＴＬ
応答を引き起こした。ＳＢおよびＬＰ両ドナーは、ペプチドＳＬＶＩＶＴＴＦＶ
（配列番号１７）、ＬＭＩＩＰＬＩＮＶ（配列番号２０）およびＶＬＱＷＡＳＬ
ＡＶ（配列番号２７）に対して反応性を示したばかりでなく、ｇｐ８５由来のも
う１つのペプチドＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号２４）をも認識した。両ドナー
とも急性ＩＭの間にはＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号２４）に対してｅｘ ｖｉ
ｖｏ ＣＴＬ反応性を全く示さなかったことを注記することは興味深い。これら
の分析から引き出される重要な結果の１つは、急性ＩＭから回復した後、構造抗
原に対するＣＴＬ前駆体は大幅に減少し、そして応答は潜在抗原に対して反応性
のＣＴＬによって支配されるようになる、ということである。実際、ＩＭ後のド
ナーＳＢおよびＬＰにおけるｇｐ３５０またはｇｐ８５ペプチドエピトープに特
異的なＣＴＬ前駆体の限界希釈分析は＞１／５０，０００という頻度を示したが
、他方、潜在抗原内のＣＴＬエピトープに対する前駆体頻度は１／４，０００〜
１／１５，０００の間であった。
【００９５】 ＩＭ患者における構造抗原に対する強いｅｘ ｖｉｖｏ ＣＴＬ応答の検出は
、将来におけるいかなるワクチンの設計に対しても重要な意味をもつ。上に記述
したように、今日まで、ＥＢＶ構造抗原に基づくワクチン設計の重点は強い中和
抗体応答を生成することに向けられてきた。しかし、これらの中和抗体応答は、
コットントップマーモセットにおいてはＥＢＶ誘導ポリクローナルリンパ腫から
の保護と相関しない。それにもかかわらず、この保護が構造抗原特異的ＣＴＬ応
答によって媒介されるということが考えられる。この問題に取り組むため、我々
は実験動物モデル系を用いて、ｇｐ３５０またはｇｐ８５ ＣＴＬエピトープで
免疫感作したトランスジェニックマウス（ヒトＨＬＡ Ａ２抗原を発現する）は
、（ａ）構造抗原特異的ＣＴＬ応答を生じることができるか、および（ｂ）ｇｐ
３５０またはｇｐ８５抗原を発現する組換えワクシニアウイルスによる感染を低
下させることができるか、を決定した。これらのマウスは免疫感作後、強いＣＴ
Ｌ応答の誘導を示したのみでなく、ウイルス感染に対する強い耐性を獲得した。
この実験はｇｐ３５０および／またはｇｐ８５ ＣＴＬエピトープに基づくワク
チンのヒトにおける有効性について何ら確実な結論を許すものではないが、ＥＢ
Ｖ構造抗原由来のＣＴＬエピトープは有効なＣＴＬ応答をｉｎ ｖｉｖｏで誘導
するための免疫原として用いうることを明確に示している、とここで述べること
は重要である。さらに、このアプローチは、ヒトにＣＴＬ応答を誘導するのに有
効でないかもしれない全ｇｐ３５０またはｇｐ８５タンパク質の限界を克服する
。明らかに、ヒトにおけるワクチン投与を目指す、エピトープに基づくいずれの
アプローチにとっても考えられる障害の１つはＨＬＡ多型性である。なぜならエ
ピトープ選択は対立遺伝子特異的だからである。しかし、この障害は合成ペプチ
ドエピトープの適切な混合物を用いることによって、または適切なエピトープ配
列が線状に連結されているポリペプチドを発現するベクターを構築することによ
って克服できるかもしれない。実際、我々の研究室における初期の研究は、その
ようなＥＢＶポリエピトープ配列が細胞内で組換えワクシニアベクターから発現
されたならば、構成性エピトープの全てがＣＴＬ認識のために有効に提示される
ことを示し（４３）、ワクチン戦略としてのこのアプローチの可能性を示した。
より最近になって、マウスモデルを用いた研究が、ポリエピトープ構築物中に組
合せられた数個のＣＴＬエピトープのそれぞれがＣＴＬ応答をｉｎ ｖｉｖｏで
誘導することができ、かつ該マウスを後のチャレンジから保護することができた
、ということを示した（４４）。長期的にはＥＢＶ構造抗原由来のＣＴＬエピト
ープを潜在抗原エピトープと組合せ、効果的なワクチンを設計するのに重要な、
２つの異なる種類の抗原に由来する免疫原性決定基を融合させるキメラタンパク
質を作製することが可能であるかもしれない。
、将来におけるいかなるワクチンの設計に対しても重要な意味をもつ。上に記述
したように、今日まで、ＥＢＶ構造抗原に基づくワクチン設計の重点は強い中和
抗体応答を生成することに向けられてきた。しかし、これらの中和抗体応答は、
コットントップマーモセットにおいてはＥＢＶ誘導ポリクローナルリンパ腫から
の保護と相関しない。それにもかかわらず、この保護が構造抗原特異的ＣＴＬ応
答によって媒介されるということが考えられる。この問題に取り組むため、我々
は実験動物モデル系を用いて、ｇｐ３５０またはｇｐ８５ ＣＴＬエピトープで
免疫感作したトランスジェニックマウス（ヒトＨＬＡ Ａ２抗原を発現する）は
、（ａ）構造抗原特異的ＣＴＬ応答を生じることができるか、および（ｂ）ｇｐ
３５０またはｇｐ８５抗原を発現する組換えワクシニアウイルスによる感染を低
下させることができるか、を決定した。これらのマウスは免疫感作後、強いＣＴ
Ｌ応答の誘導を示したのみでなく、ウイルス感染に対する強い耐性を獲得した。
この実験はｇｐ３５０および／またはｇｐ８５ ＣＴＬエピトープに基づくワク
チンのヒトにおける有効性について何ら確実な結論を許すものではないが、ＥＢ
Ｖ構造抗原由来のＣＴＬエピトープは有効なＣＴＬ応答をｉｎ ｖｉｖｏで誘導
するための免疫原として用いうることを明確に示している、とここで述べること
は重要である。さらに、このアプローチは、ヒトにＣＴＬ応答を誘導するのに有
効でないかもしれない全ｇｐ３５０またはｇｐ８５タンパク質の限界を克服する
。明らかに、ヒトにおけるワクチン投与を目指す、エピトープに基づくいずれの
アプローチにとっても考えられる障害の１つはＨＬＡ多型性である。なぜならエ
ピトープ選択は対立遺伝子特異的だからである。しかし、この障害は合成ペプチ
ドエピトープの適切な混合物を用いることによって、または適切なエピトープ配
列が線状に連結されているポリペプチドを発現するベクターを構築することによ
って克服できるかもしれない。実際、我々の研究室における初期の研究は、その
ようなＥＢＶポリエピトープ配列が細胞内で組換えワクシニアベクターから発現
されたならば、構成性エピトープの全てがＣＴＬ認識のために有効に提示される
ことを示し（４３）、ワクチン戦略としてのこのアプローチの可能性を示した。
より最近になって、マウスモデルを用いた研究が、ポリエピトープ構築物中に組
合せられた数個のＣＴＬエピトープのそれぞれがＣＴＬ応答をｉｎ ｖｉｖｏで
誘導することができ、かつ該マウスを後のチャレンジから保護することができた
、ということを示した（４４）。長期的にはＥＢＶ構造抗原由来のＣＴＬエピト
ープを潜在抗原エピトープと組合せ、効果的なワクチンを設計するのに重要な、
２つの異なる種類の抗原に由来する免疫原性決定基を融合させるキメラタンパク
質を作製することが可能であるかもしれない。
【００９６】 当業者には、概括的に記述された本発明の精神または範囲から逸脱することな
く、多数の変更および／または改変が具体的な実施形態に示された本発明になさ
れうることが理解されよう。したがって、本発明の実施形態はあらゆる面におい
て限定的なものではなく、説明的なものであると考えられるべきである。
く、多数の変更および／または改変が具体的な実施形態に示された本発明になさ
れうることが理解されよう。したがって、本発明の実施形態はあらゆる面におい
て限定的なものではなく、説明的なものであると考えられるべきである。
【００９７】
【図１】 ＬＭＰ１内の可能性のあるＨＬＡ Ａ２結合ペプチドを用いた、
Ｔ２細胞上のＭＨＣ安定化分析。最初にＴ２細胞を２００μｌの各ペプチド（２
００μｇ／ｍｌ）と共に１４〜１６時間２６℃でインキュベートし、次に３７℃
で２〜３時間インキュベートした。これらの細胞上のＨＬＡ Ａ２発現を、ＢＢ
７．２抗体を用いて、ＦＡＣＳによって分析した。点線は、ペプチドがない場合
のＴ２細胞上のＨＬＡ Ａ２のバックグラウンド平均蛍光強度を示す。Ｔ２細胞
上でＨＬＡ Ａ２分子の重大な安定化を示すＬＭＰ１ペプチドを矢印で示す。
Ｔ２細胞上のＭＨＣ安定化分析。最初にＴ２細胞を２００μｌの各ペプチド（２
００μｇ／ｍｌ）と共に１４〜１６時間２６℃でインキュベートし、次に３７℃
で２〜３時間インキュベートした。これらの細胞上のＨＬＡ Ａ２発現を、ＢＢ
７．２抗体を用いて、ＦＡＣＳによって分析した。点線は、ペプチドがない場合
のＴ２細胞上のＨＬＡ Ａ２のバックグラウンド平均蛍光強度を示す。Ｔ２細胞
上でＨＬＡ Ａ２分子の重大な安定化を示すＬＭＰ１ペプチドを矢印で示す。
【図２】 ＨＬＡ Ａ２陽性ドナーＳＢ由来のポリクローナルＣＴＬによる
ＬＭＰ１ペプチドの認識。ドナーＳＢ由来のＰＢＭＣを、合成ペプチド（縦軸に
示す）で感作した放射線照射Ｔ２細胞と共に７日間培養した。１０日目に、これ
らの細胞を標準的５１Ｃｒ放出アッセイにおいてペプチド感作（１μｇ／ｍｌ）
自己ＰＨＡ芽球化細胞に対するポリクローナルエフェクターとして用いた。この
アッセイでは、エフェクター：標的の比として２０：１を用いた。３つの実験の
うち代表的な１つの実験のデータを示す。結果を特異的溶解パーセントとして示
す。
ＬＭＰ１ペプチドの認識。ドナーＳＢ由来のＰＢＭＣを、合成ペプチド（縦軸に
示す）で感作した放射線照射Ｔ２細胞と共に７日間培養した。１０日目に、これ
らの細胞を標準的５１Ｃｒ放出アッセイにおいてペプチド感作（１μｇ／ｍｌ）
自己ＰＨＡ芽球化細胞に対するポリクローナルエフェクターとして用いた。この
アッセイでは、エフェクター：標的の比として２０：１を用いた。３つの実験の
うち代表的な１つの実験のデータを示す。結果を特異的溶解パーセントとして示
す。
【図３】 ドナーＳＢ由来のＥＢＶ特異的ＣＴＬクローン（ＳＢ７）によ
る、自己ＬＣＬおよびＶａｃｃ．ＥＢＮＡ１、２、３、４、５、６、ＬＭＰ１、
ＬＭＰ２ＡおよびＶａｃｃ．ＴＫ−に感染した自己ＣＤ４０ Ｂ細胞の特異的
溶解（パネルＡ）。標的細胞を１２〜１４時間（Ｍ．Ｏ．Ｉ＝１０：１）ワクシ
ニア構築物に感染させ、次に標準的５１Ｃｒ放出アッセイ用に処理した。対照組
換えワクシニアとしてＶａｃｃ．ＴＫ−を用いた。ＳＢ７クローンのＬＭＰ１特
異性をさらに確認するため、ＬＭＰ１−およびＨＬＡ Ａ２−陽性ＢＬ細胞系（
ＢＪＡＢ．ＭＴＬＭ６またはＭｕｔｕ ｃｌ．５９）およびＬＭＰ１−陰性ＨＬ
Ａ Ａ２−陽性ＢＬ細胞系（ＢＪＡＢ．ｇｐｔ１およびＭｕｔｕ ｃｌ．２１６
）を標準的５１Ｃｒ放出アッセイにおける標的として用いた（パネルＢ）。両方
のアッセイとも、エフェクター：標的の比として４：１を用いた。結果を特異的
溶解パーセントとして示す。
る、自己ＬＣＬおよびＶａｃｃ．ＥＢＮＡ１、２、３、４、５、６、ＬＭＰ１、
ＬＭＰ２ＡおよびＶａｃｃ．ＴＫ−に感染した自己ＣＤ４０ Ｂ細胞の特異的
溶解（パネルＡ）。標的細胞を１２〜１４時間（Ｍ．Ｏ．Ｉ＝１０：１）ワクシ
ニア構築物に感染させ、次に標準的５１Ｃｒ放出アッセイ用に処理した。対照組
換えワクシニアとしてＶａｃｃ．ＴＫ−を用いた。ＳＢ７クローンのＬＭＰ１特
異性をさらに確認するため、ＬＭＰ１−およびＨＬＡ Ａ２−陽性ＢＬ細胞系（
ＢＪＡＢ．ＭＴＬＭ６またはＭｕｔｕ ｃｌ．５９）およびＬＭＰ１−陰性ＨＬ
Ａ Ａ２−陽性ＢＬ細胞系（ＢＪＡＢ．ｇｐｔ１およびＭｕｔｕ ｃｌ．２１６
）を標準的５１Ｃｒ放出アッセイにおける標的として用いた（パネルＢ）。両方
のアッセイとも、エフェクター：標的の比として４：１を用いた。結果を特異的
溶解パーセントとして示す。
【図４】 ＨＬＡ Ａ２−陽性ドナーにおけるＬＭＰ１エピトープＹＬＱＱ
ＮＷＷＴＬ（配列番号６）（Ａ）およびＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（配列番号１）（Ｂ
）に対するＣＴＬｐ頻度を示す。限界希釈分析を用いて、ドナーＳＢ由来の末梢
血リンパ球におけるペプチドＹＬＱＱＮＷＷＴＬ（配列番号６）（Ａ）およびＹ
ＬＬＥＭＬＷＲＬ（配列番号１）（Ｂ）に対するＣＴＬｐの頻度を推定した。「
材料および方法」の節に記述するように、ペプチドで感作したＰＢＭＣを用いて
このドナー由来のＰＢＭＣを刺激した。レスポンダー頻度（ｆ１）の逆数を示す
。影をつけた領域は、９５％信頼限界を示す。
ＮＷＷＴＬ（配列番号６）（Ａ）およびＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（配列番号１）（Ｂ
）に対するＣＴＬｐ頻度を示す。限界希釈分析を用いて、ドナーＳＢ由来の末梢
血リンパ球におけるペプチドＹＬＱＱＮＷＷＴＬ（配列番号６）（Ａ）およびＹ
ＬＬＥＭＬＷＲＬ（配列番号１）（Ｂ）に対するＣＴＬｐの頻度を推定した。「
材料および方法」の節に記述するように、ペプチドで感作したＰＢＭＣを用いて
このドナー由来のＰＢＭＣを刺激した。レスポンダー頻度（ｆ１）の逆数を示す
。影をつけた領域は、９５％信頼限界を示す。
【図５】 異なるスーパータイプのＨＬＡ Ａ２を発現するＬＣＬのＳＢ７
ＣＴＬクローンによるＣＴＬ認識。このアッセイに用いた全てのＬＣＬは、Ｂ
９５．８ＥＢＶ分離株によって形質転換された。各ＬＣＬについてのＨＬＡ Ａ
２サブタイピングは第１２回組織適合性ワークショップによって定められた。両
方のアッセイとも、エフェクター：標的の比として４：１を用いた。結果を特異
的溶解パーセントとして示す。４つの実験のうち代表的な１つの実験のデータを
示す。
ＣＴＬクローンによるＣＴＬ認識。このアッセイに用いた全てのＬＣＬは、Ｂ
９５．８ＥＢＶ分離株によって形質転換された。各ＬＣＬについてのＨＬＡ Ａ
２サブタイピングは第１２回組織適合性ワークショップによって定められた。両
方のアッセイとも、エフェクター：標的の比として４：１を用いた。結果を特異
的溶解パーセントとして示す。４つの実験のうち代表的な１つの実験のデータを
示す。
【図６】 ＨＬＡ Ａ２結合（パネルＡ）およびＣＴＬ認識（パネルＢ）に
対する変異型ＬＭＰ１ペプチドの効果。ＨＬＡ Ａ２結合分析については、最初
にＴ２細胞を２００μｌの各ペプチド（２００μｇ／ｍｌ）と共に１４〜１６時
間２６℃でインキュベートし、次に３７℃で２〜３時間インキュベートした。こ
れらの細胞上のＨＬＡ Ａ２発現を、ＢＢ７．２抗体を用いて、ＦＡＣＳによっ
て分析した（パネルＡ）。点線は、ペプチドがない場合のＴ２細胞上のＨＬＡ
Ａ２のバックグラウンド平均蛍光強度を示す。変異型および原型ＨＬＡ Ａ２拘
束ＬＭＰ１エピトープのＣＴＬ認識については、ドナーＳＢ由来のＰＨＡ芽球化
細胞を各ペプチドの連続希釈物で感作し、次にエフェクター：標的の比を４：１
としてＳＢ７ ＣＴＬクローンに暴露した（パネルＢ）。結果を特異的溶解パー
セントとして示す。３つの実験のうち代表的な１つの実験のデータを示す。変異
型ペプチドにおけるアミノ酸変化を太字で示す。
対する変異型ＬＭＰ１ペプチドの効果。ＨＬＡ Ａ２結合分析については、最初
にＴ２細胞を２００μｌの各ペプチド（２００μｇ／ｍｌ）と共に１４〜１６時
間２６℃でインキュベートし、次に３７℃で２〜３時間インキュベートした。こ
れらの細胞上のＨＬＡ Ａ２発現を、ＢＢ７．２抗体を用いて、ＦＡＣＳによっ
て分析した（パネルＡ）。点線は、ペプチドがない場合のＴ２細胞上のＨＬＡ
Ａ２のバックグラウンド平均蛍光強度を示す。変異型および原型ＨＬＡ Ａ２拘
束ＬＭＰ１エピトープのＣＴＬ認識については、ドナーＳＢ由来のＰＨＡ芽球化
細胞を各ペプチドの連続希釈物で感作し、次にエフェクター：標的の比を４：１
としてＳＢ７ ＣＴＬクローンに暴露した（パネルＢ）。結果を特異的溶解パー
セントとして示す。３つの実験のうち代表的な１つの実験のデータを示す。変異
型ペプチドにおけるアミノ酸変化を太字で示す。
【図７】 ＥＢＶ特異的ＨＬＡ Ａ１１拘束ＣＴＬクローンＣＭ９（ａおよ
びｃ）およびＣＭ２９（ｂおよびｄ）によるＮＰＣ細胞およびＬＣＬのＣＴＬ認
識。Ｖａｃｃ．ＥＢＮＡ４もしくはＶａｃｃ．ＴＫに感染した、またはペプチド
感作したＣ１５ＮＰＣ細胞（ａおよびｂ）を異なるエフェクター：標的の比を用
いてＣＴＬクローンに暴露し、ＣＴＬ溶解のレベルを２型ＬＣＬ（ＣＭ／Ａｇ８
７６ＬＣＬ）と比較した。陽性対照として、標的細胞をＩＶＴＤＦＳＶＩＫペプ
チド（ａおよびｃ）またはＡＶＦＤＲＫＳＤＡＫペプチド（ｂおよびｄ）を用い
てあらかじめ感作した。結果を特異的溶解パーセントとして示す。
びｃ）およびＣＭ２９（ｂおよびｄ）によるＮＰＣ細胞およびＬＣＬのＣＴＬ認
識。Ｖａｃｃ．ＥＢＮＡ４もしくはＶａｃｃ．ＴＫに感染した、またはペプチド
感作したＣ１５ＮＰＣ細胞（ａおよびｂ）を異なるエフェクター：標的の比を用
いてＣＴＬクローンに暴露し、ＣＴＬ溶解のレベルを２型ＬＣＬ（ＣＭ／Ａｇ８
７６ＬＣＬ）と比較した。陽性対照として、標的細胞をＩＶＴＤＦＳＶＩＫペプ
チド（ａおよびｃ）またはＡＶＦＤＲＫＳＤＡＫペプチド（ｂおよびｄ）を用い
てあらかじめ感作した。結果を特異的溶解パーセントとして示す。
【図８】 ｇｐ８５（パネルＡ）およびｇｐ３５０（パネルＢ）内の可能性
のあるＨＬＡＡ２結合ペプチドを用いた、Ｔ２細胞上のＭＨＣ安定化分析。最初
にＴ２細胞を２００μｌの各ペプチド（２００μｇ／ｍｌ）と共に１４〜１６時
間２６℃でインキュベートし、次に３７℃で２〜３時間インキュベートした。こ
れらの細胞上のＨＬＡ Ａ２発現を、ＢＢ７．２抗体を用いて、ＦＡＣＳによっ
て分析した。点線は、ペプチドがない場合のＴ２細胞上のＨＬＡ Ａ２のバック
グラウンド平均蛍光強度を示す。Ｔ２細胞上でＨＬＡ Ａ２分子の重大な安定化
を示すｇｐ８５およびｇｐ３５０ペプチドを矢印で示す。
のあるＨＬＡＡ２結合ペプチドを用いた、Ｔ２細胞上のＭＨＣ安定化分析。最初
にＴ２細胞を２００μｌの各ペプチド（２００μｇ／ｍｌ）と共に１４〜１６時
間２６℃でインキュベートし、次に３７℃で２〜３時間インキュベートした。こ
れらの細胞上のＨＬＡ Ａ２発現を、ＢＢ７．２抗体を用いて、ＦＡＣＳによっ
て分析した。点線は、ペプチドがない場合のＴ２細胞上のＨＬＡ Ａ２のバック
グラウンド平均蛍光強度を示す。Ｔ２細胞上でＨＬＡ Ａ２分子の重大な安定化
を示すｇｐ８５およびｇｐ３５０ペプチドを矢印で示す。
【図９】 ＩＭドナー由来の末梢血リンパ球におけるｇｐ８５およびｇｐ３
５０特異的ｅｘ ｖｉｖｏ細胞傷害性Ｔ細胞活性。パネルＡ、ＢおよびＣは、２
つの異なるエフェクター：標的（Ｅ／Ｔ）比を用いてペプチド感作（１μｇ／ｍ
ｌ）したＰＨＡ芽球化細胞のｅｘ ｖｉｖｏにおけるＣＴＬ溶解を示す。ＩＭ患
者ＳＢ、ＬＰおよびＭＧのデータをパネルＡ、ＢおよびＣにそれぞれ示す。パネ
ルＤは患者ＬＰ由来の末梢血リンパ球による、ｇｐ８５（Ｖａｃｃ．ｇｐ８５）
またはｇｐ３５０（Ｖａｃｃ．３５０）をコードする組換えワクシニアに感染し
た標的細胞のｅｘ ｖｉｖｏ ＣＴＬ溶解を示す。このアッセイでは、Ｖａｃｃ
．ＴＫ−およびＶａｃｃ．ＥＢＮＡ２を対照として用いた。
５０特異的ｅｘ ｖｉｖｏ細胞傷害性Ｔ細胞活性。パネルＡ、ＢおよびＣは、２
つの異なるエフェクター：標的（Ｅ／Ｔ）比を用いてペプチド感作（１μｇ／ｍ
ｌ）したＰＨＡ芽球化細胞のｅｘ ｖｉｖｏにおけるＣＴＬ溶解を示す。ＩＭ患
者ＳＢ、ＬＰおよびＭＧのデータをパネルＡ、ＢおよびＣにそれぞれ示す。パネ
ルＤは患者ＬＰ由来の末梢血リンパ球による、ｇｐ８５（Ｖａｃｃ．ｇｐ８５）
またはｇｐ３５０（Ｖａｃｃ．３５０）をコードする組換えワクシニアに感染し
た標的細胞のｅｘ ｖｉｖｏ ＣＴＬ溶解を示す。このアッセイでは、Ｖａｃｃ
．ＴＫ−およびＶａｃｃ．ＥＢＮＡ２を対照として用いた。
【図１０】 ＨＬＡ Ａ２陽性の、ＩＭから回復した（ＩＭの３６カ月後の
）患者由来のポリクローナルＣＴＬによるｇｐ８５およびｇｐ３５０ペプチドの
認識。ＰＢＭＣを、合成ペプチド（縦軸に示す）で感作した放射線照射Ｔ２細胞
と共に７日間培養した。１８日目に、これらの細胞を標準的５１Ｃｒ放出アッセ
イにおいてペプチド感作（１μｇ／ｍｌ）自己ＰＨＡ芽球化細胞に対するポリク
ローナルエフェクターとして用いた。このアッセイでは、エフェクター：標的の
比として２０：１を用いた。この実験に用いた各ペプチドで刺激したＣＴＬエフ
ェクターを図に示す。３つの実験のうち代表的な１つの実験のデータを示す。結
果を特異的溶解パーセントとして示す。
）患者由来のポリクローナルＣＴＬによるｇｐ８５およびｇｐ３５０ペプチドの
認識。ＰＢＭＣを、合成ペプチド（縦軸に示す）で感作した放射線照射Ｔ２細胞
と共に７日間培養した。１８日目に、これらの細胞を標準的５１Ｃｒ放出アッセ
イにおいてペプチド感作（１μｇ／ｍｌ）自己ＰＨＡ芽球化細胞に対するポリク
ローナルエフェクターとして用いた。このアッセイでは、エフェクター：標的の
比として２０：１を用いた。この実験に用いた各ペプチドで刺激したＣＴＬエフ
ェクターを図に示す。３つの実験のうち代表的な１つの実験のデータを示す。結
果を特異的溶解パーセントとして示す。
【図１１】 ｇｐ８５およびｇｐ３５０ ＣＴＬエピトープを用いたＨＬＡ
Ａ２／Ｋｂマウスの免疫感作は、強いＣＴＬ応答を誘導する。破傷風トキソイ
ドと共に各ＣＴＬエピトープを用いてマウスを（１４日間隔で）２回、皮下的に
免疫感作した。ペプチド免疫感作の４週間後に、ｇｐ３５０およびｇｐ８５特異
的ＣＴＬ応答について動物を評価した。パネルＡ、ＢおよびＣは、ＶＬＱＷＡＳ
ＬＡＶ（配列番号２７）（ｇｐ３５０）、ＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号２４）
（ｇｐ８５）およびＳＬＶＩＶＴＴＦＶ（配列番号１７）（ｇｐ８５）をそれぞ
れ用いて免疫感作した２匹のマウス由来の脾細胞におけるＣＴＬ活性を示す。ペ
プチドエピトープによって感作した標的細胞のＣＴＬ溶解を黒塗りの記号で示し
、非感作標的細胞の溶解を白抜きの記号で示す。パネルＤは、ペプチドＶＬＱＷ
ＡＳＬＡＶ（配列番号２７）（■、□）、ＳＬＶＩＶＴＴＦＶ（配列番号１７）
（▲、△）およびＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号２４）（●、○）を用いて免疫
感作したマウス由来のプールされた鼠径部リンパ節におけるＣＴＬ活性を示す。
ＣＴＬ活性は６日目に標準的５１Ｃｒ放出アッセイを用いて試験した。
Ａ２／Ｋｂマウスの免疫感作は、強いＣＴＬ応答を誘導する。破傷風トキソイ
ドと共に各ＣＴＬエピトープを用いてマウスを（１４日間隔で）２回、皮下的に
免疫感作した。ペプチド免疫感作の４週間後に、ｇｐ３５０およびｇｐ８５特異
的ＣＴＬ応答について動物を評価した。パネルＡ、ＢおよびＣは、ＶＬＱＷＡＳ
ＬＡＶ（配列番号２７）（ｇｐ３５０）、ＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号２４）
（ｇｐ８５）およびＳＬＶＩＶＴＴＦＶ（配列番号１７）（ｇｐ８５）をそれぞ
れ用いて免疫感作した２匹のマウス由来の脾細胞におけるＣＴＬ活性を示す。ペ
プチドエピトープによって感作した標的細胞のＣＴＬ溶解を黒塗りの記号で示し
、非感作標的細胞の溶解を白抜きの記号で示す。パネルＤは、ペプチドＶＬＱＷ
ＡＳＬＡＶ（配列番号２７）（■、□）、ＳＬＶＩＶＴＴＦＶ（配列番号１７）
（▲、△）およびＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号２４）（●、○）を用いて免疫
感作したマウス由来のプールされた鼠径部リンパ節におけるＣＴＬ活性を示す。
ＣＴＬ活性は６日目に標準的５１Ｃｒ放出アッセイを用いて試験した。
【図１２】 ｇｐ８５またはｇｐ３５０ＣＴＬエピトープを用いてＨＬＡ
Ａ２／Ｋｂマウスを前もって免疫感作すると、組換えワクシニアウイルスチャレ
ンジに対する保護が提供される。免疫感作していない、またはＣＴＬエピトープ
で免疫感作した雌ＨＬＡ Ａ２／Ｋｂトランスジェニックマウスの群を、Ｖａｃ
ｃ．ｇｐ８５およびＶａｃｃ．ｇｐ３５０を用いて腹腔内的にチャレンジした。
チャレンジの４日後にこれらのマウスを屠殺し、両方の卵巣を用いて、コンフル
エントなＣＶ１細胞上のプラークアッセイによってワクシニア力価を測定した。
横軸は免疫感作に用いたペプチドを示し、縦軸は未処理のマウスおよびペプチド
で免疫感作したマウスにおけるワクシニアウイルス力価の平均値±ＳＥを示す。
これらの動物のチャレンジに用いた組換えワクシニアウイルスを各パネルに示す
。
Ａ２／Ｋｂマウスを前もって免疫感作すると、組換えワクシニアウイルスチャレ
ンジに対する保護が提供される。免疫感作していない、またはＣＴＬエピトープ
で免疫感作した雌ＨＬＡ Ａ２／Ｋｂトランスジェニックマウスの群を、Ｖａｃ
ｃ．ｇｐ８５およびＶａｃｃ．ｇｐ３５０を用いて腹腔内的にチャレンジした。
チャレンジの４日後にこれらのマウスを屠殺し、両方の卵巣を用いて、コンフル
エントなＣＶ１細胞上のプラークアッセイによってワクシニア力価を測定した。
横軸は免疫感作に用いたペプチドを示し、縦軸は未処理のマウスおよびペプチド
で免疫感作したマウスにおけるワクシニアウイルス力価の平均値±ＳＥを示す。
これらの動物のチャレンジに用いた組換えワクシニアウイルスを各パネルに示す
。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 31/12 35/00 35/00 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 16/08 Ｃ０７Ｋ 16/08 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オ ーガニゼーション ＣＯＭＭＯＮＷＥＡＬＴＨ ＳＣＩＥＮＴ ＩＦＩＣ ＡＮＤ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＯＲＧＡＮＩＺＡＴ ＩＯＮ オーストラリア国 2601 オーストラリア ン キャピタル テリトリー キャンベル ライムストーン アベニュー 番地なし (71)出願人 ザ ユニバーシティー オブ メルボルン オーストラリア国 3052 ヴィクトリア 州，パークヴィル，ロイヤル パレード (71)出願人 ザ ウォルター アンド エリザ ホール インスティテュートオブ メディカル リサーチ オーストラリア国 3052 ヴィクトリア 州，パークヴィル，ロイヤル パレード (71)出願人 シーエスエル、リミテッド オーストラリア連邦ビクトリア州、パーク ビル、ポプラー、ロード、45 (72)発明者 バロウズ，スコット，レントン オーストラリア国 4036 クイーンズラン ド州，ボルド ヒルズ，サムソン コート ４ (72)発明者 カーンナ，ラジヴ オーストラリア国 4006 クイーンズラン ド州，ハーストン，エイバリー ロード 59 (72)発明者 シェーリット，マルティナ，アリスン オーストラリア国 4031 クイーンズラン ド州，ケドロン，テンス アベニュー 34 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 DA02 EA02 EA04 GA11 GA18 4C084 AA13 BA17 NA10 ZA512 ZB262 ZB272 ZB332 4C085 AA03 AA04 BA80 BB11 CC08 CC32 EE01 EE06 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA10 ZA51 ZB26 ZB27 ZB33 4H045 AA11 AA30 BA15 DA83 DA86 EA28 EA29 EA31 FA33 FA74
Claims (32)
- 【請求項１】 エプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス
（ＥＢＶ）細胞傷害性Ｔ細胞エピトープであって、ＥＢＶ構造抗原に由来する該
エピトープ。 - 【請求項２】 前記ＥＢＶ構造抗原がｇｐ８５またはｇｐ３５０である、請
求項１に記載のＥＢＶ細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ。 - 【請求項３】 細胞傷害性Ｔ細胞エピトープであって、ＹＬＬＥＭＬＷＲＬ
（配列番号１）、ＹＦＬＥＩＬＷＧＬ（配列番号３２）、ＹＬＬＥＩＬＷＲＬ（
配列番号３３）、ＹＬＱＱＮＷＷＴＬ（配列番号６）、ＬＬＬＡＬＬＦＷＬ（配
列番号２）、ＬＬＶＤＬＬＷＬＬ（配列番号３）、ＬＬＬＩＡＬＷＮＬ（配列番
号４）、ＷＬＬＬＦＬＡＩＬ（配列番号５）、ＴＬＬＶＤＬＬＷＬ（配列番号７
）、ＬＬＷＬＬＬＦＬＡ（配列番号８）、ＩＬＬＩＩＡＬＹＬ（配列番号９）、
ＶＬＦＩＦＧＣＬＬ（配列番号１０）、ＲＬＧＡＴＩＷＱＬ（配列番号１１）、
ＩＬＹＦＩＡＦＡＬ（配列番号１５）、ＳＬＶＩＶＴＴＦＶ（配列番号１７）、
ＬＭＩＩＰＬＩＮＶ（配列番号２０）、ＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号２４）、
ＬＩＰＥＴＶＰＹＩ（配列番号２６）、ＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号２７）お
よびＱＬＴＰＨＴＫＡＶ（配列番号２９）からなる群より選択される該エピトー
プ。 - 【請求項４】 請求項１または２に記載のＥＢＶ細胞傷害性Ｔ細胞エピトー
プを含むサブユニットワクチン。 - 【請求項５】 ＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（配列番号１）、ＹＦＬＥＩＬＷＧＬ（
配列番号３２）、ＹＬＬＥＩＬＷＲＬ（配列番号３３）、ＹＬＱＱＮＷＷＴＬ（
配列番号６）、ＬＬＬＡＬＬＦＷＬ（配列番号２）、ＬＬＶＤＬＬＷＬＬ（配列
番号３）、ＬＬＬＩＡＬＷＮＬ（配列番号４）、ＷＬＬＬＦＬＡＩＬ（配列番号
５）、ＴＬＬＶＤＬＬＷＬ（配列番号７）、ＬＬＷＬＬＬＦＬＡ（配列番号８）
、ＩＬＬＩＩＡＬＹＬ（配列番号９）、ＶＬＦＩＦＧＣＬＬ（配列番号１０）、
ＲＬＧＡＴＩＷＱＬ（配列番号１１）、ＩＬＹＦＩＡＦＡＬ（配列番号１５）、
ＳＬＶＩＶＴＴＦＶ（配列番号１７）、ＬＭＩＩＰＬＩＮＶ（配列番号２０）、
ＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号２４）、ＬＩＰＥＴＶＰＹＩ（配列番号２６）、
ＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号２７）およびＱＬＴＰＨＴＫＡＶ（配列番号２９
）からなる群より選択される少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むサブユニ
ットワクチン。 - 【請求項６】 前記エピトープがＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（配列番号１）、ＹＬ
ＱＱＮＷＷＴＬ（配列番号６）、ＹＦＬＥＩＬＷＧＬ（配列番号３２）、ＹＬＬ
ＥＩＬＷＲＬ（配列番号３３）、ＳＬＶＩＶＴＴＦＶ（配列番号１７）、ＬＭＩ
ＩＰＬＩＮＶ（配列番号２０）、ＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号２４）およびＶ
ＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号２７）からなる群より選択される、請求項５に記載
のサブユニットワクチン。 - 【請求項７】 少なくとも１つの細胞傷害性Ｔ細胞エピトープに加えて、個
体がそれに対して既往性応答を開始する少なくとも１つの抗原を前記ワクチンが
さらに含む、請求項４から６のいずれかに記載のサブユニットワクチン。 - 【請求項８】 前記少なくとも１つの抗原が破傷風トキソイド、ジフテリア
トキソイド、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）抗原、ポ
リオウイルス抗原、精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、ｇｐ３５０タンパク質、
ヘルパーエピトープおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項７
に記載のサブユニットワクチン。 - 【請求項９】 前記少なくとも１つの抗原が破傷風トキソイドである、請求
項８に記載のサブユニットワクチン。 - 【請求項１０】 前記ワクチンが油中水型組成物を含む、請求項４から９の
いずれかに記載のサブユニットワクチン。 - 【請求項１１】 請求項１または２に記載のＥＢＶ細胞傷害性Ｔ細胞エピト
ープをコードする単離された核酸配列。 - 【請求項１２】 ＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（配列番号１）、ＹＦＬＥＩＬＷＧＬ
（配列番号３２）、ＹＬＬＥＩＬＷＲＬ（配列番号３３）、ＹＬＱＱＮＷＷＴＬ
（配列番号６）、ＬＬＬＡＬＬＦＷＬ（配列番号２）、ＬＬＶＤＬＬＷＬＬ（配
列番号３）、ＬＬＬＩＡＬＷＮＬ（配列番号４）、ＷＬＬＬＦＬＡＩＬ（配列番
号５）、ＴＬＬＶＤＬＬＷＬ（配列番号７）、ＬＬＷＬＬＬＦＬＡ（配列番号８
）、ＩＬＬＩＩＡＬＹＬ（配列番号９）、ＶＬＦＩＦＧＣＬＬ（配列番号１０）
、ＲＬＧＡＴＩＷＱＬ（配列番号１１）、ＩＬＹＦＩＡＦＡＬ（配列番号１５）
、ＳＬＶＩＶＴＴＦＶ（配列番号１７）、ＬＭＩＩＰＬＩＮＶ（配列番号２０）
、ＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号２４）、ＬＩＰＥＴＶＰＹＩ（配列番号２６）
、ＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号２７）およびＱＬＴＰＨＴＫＡＶ（配列番号２
９）からなる群より選択される細胞傷害性Ｔ細胞エピトープの少なくとも１つを
コードする単離された核酸配列。 - 【請求項１３】 前記エピトープがＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（配列番号１）、Ｙ
ＬＱＱＮＷＷＴＬ（配列番号６）、ＹＦＬＥＩＬＷＧＬ（配列番号３２）、ＹＬ
ＬＥＩＬＷＲＬ（配列番号３３）、ＳＬＶＩＶＴＴＦＶ（配列番号１７）、ＬＭ
ＩＩＰＬＩＮＶ（配列番号２０）、ＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号２４）および
ＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号２７）からなる群より選択される、請求項１２に
記載の単離された核酸配列。 - 【請求項１４】 請求項１１から１３のいずれかに記載の核酸配列を含むベ
クター。 - 【請求項１５】 前記ベクターが細菌、好ましくはサルモネラ属（Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ）亜種である、請求項１４に記載のベクター。 - 【請求項１６】 前記ベクターがウイルス、好ましくはアデノウイルス、レ
トロウイルスまたはワクシニアウイルス、そして最も好ましくは改変ワクシニア
・アンカラ（Ｖａｃｃｉｎｉａ Ａｎｋａｒａ）である、請求項１４に記載のベ
クター。 - 【請求項１７】 単離されたポリペプチドであって、請求項１から３のいず
れかに記載の少なくとも１つのＥＢＶ細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープを
含む該ポリペプチド。 - 【請求項１８】 患者にＣＴＬを誘導するための組成物を調製する方法であ
って、請求項１から３のいずれかに記載の少なくとも１つのエピトープを少なく
とも１つの製薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤と混合することを含む該
方法。 - 【請求項１９】 患者におけるＥＢＶ感染の危険を減少させる方法であって
、該患者に有効量の （１）請求項１から３のいずれかに記載の少なくとも１つのＣＴＬエピトープ
； （２）請求項４から１０のいずれかに記載のサブユニットワクチン； （３）請求項１１から１３のいずれかに記載の核酸配列； （４）請求項１４から１６のいずれかに記載のベクター；または （５）請求項１７に記載のポリペプチド を投与することを含む該方法。 - 【請求項２０】 患者における鼻咽頭癌またはホジキン（Ｈｏｄｇｋｉｎ）
病を治療または阻止する方法であって、該患者にＥＢＶ構造抗原または潜在抗原
に由来する少なくとも１つのＣＴＬエピトープを有効量投与することを含む該方
法。 - 【請求項２１】 前記ＥＢＶ構造抗原がｇｐ８５またはｇｐ３５０である、
請求項２０に記載の方法。 - 【請求項２２】 前記ＥＢＶ構造抗原がＬＭＰ１またはＬＭＰ２である、請
求項２０に記載の方法。 - 【請求項２３】 ＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（配列番号１）、ＹＦＬＥＩＬＷＧＬ
（配列番号３２）、ＹＬＬＥＩＬＷＲＬ（配列番号３３）、ＹＬＱＱＮＷＷＴＬ
（配列番号６）、ＬＬＬＡＬＬＦＷＬ（配列番号２）、ＬＬＶＤＬＬＷＬＬ（配
列番号３）、ＬＬＬＩＡＬＷＮＬ（配列番号４）、ＷＬＬＬＦＬＡＩＬ（配列番
号５）、ＴＬＬＶＤＬＬＷＬ（配列番号７）、ＬＬＷＬＬＬＦＬＡ（配列番号８
）、ＩＬＬＩＩＡＬＹＬ（配列番号９）、ＶＬＦＩＦＧＣＬＬ（配列番号１０）
、ＲＬＧＡＴＩＷＱＬ（配列番号１１）、ＩＬＹＦＩＡＦＡＬ（配列番号１５）
、ＳＬＶＩＶＴＴＦＶ（配列番号１７）、ＬＭＩＩＰＬＩＮＶ（配列番号２０）
、ＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号２４）、ＬＩＰＥＴＶＰＹＩ（配列番号２６）
、ＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号２７）およびＱＬＴＰＨＴＫＡＶ（配列番号２
９）からなる群より選択される少なくとも１つのＣＴＬエピトープが該患者に投
与される、請求項２０に記載の方法。 - 【請求項２４】 ＮＰＣ細胞の増殖を治療または阻止する必要のある患者に
おける該細胞の増殖を治療または阻止する方法であって、該患者にＥＢＶ構造抗
原または潜在抗原に由来する少なくとも１つのＣＴＬエピトープを投与すること
を含む該方法。 - 【請求項２５】 前記ＥＢＶ構造抗原がｇｐ８５またはｇｐ３５０である、
請求項２４に記載の方法。 - 【請求項２６】 前記ＥＢＶ構造抗原がＬＭＰ１またはＬＭＰ２である、請
求項２４に記載の方法。 - 【請求項２７】 ＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（配列番号１）、ＹＦＬＥＩＬＷＧＬ
（配列番号３２）、ＹＬＬＥＩＬＷＲＬ（配列番号３３）、ＹＬＱＱＮＷＷＴＬ
（配列番号６）、ＬＬＬＡＬＬＦＷＬ（配列番号２）、ＬＬＶＤＬＬＷＬＬ（配
列番号３）、ＬＬＬＩＡＬＷＮＬ（配列番号４）、ＷＬＬＬＦＬＡＩＬ（配列番
号５）、ＴＬＬＶＤＬＬＷＬ（配列番号７）、ＬＬＷＬＬＬＦＬＡ（配列番号８
）、ＩＬＬＩＩＡＬＹＬ（配列番号９）、ＶＬＦＩＦＧＣＬＬ（配列番号１０）
、ＲＬＧＡＴＩＷＱＬ（配列番号１１）、ＩＬＹＦＩＡＦＡＬ（配列番号１５）
、ＳＬＶＩＶＴＴＦＶ（配列番号１７）、ＬＭＩＩＰＬＩＮＶ（配列番号２０）
、ＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号２４）、ＬＩＰＥＴＶＰＹＩ（配列番号２６）
、ＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号２７）およびＱＬＴＰＨＴＫＡＶ（配列番号２
９）からなる群より選択される少なくとも１つのＣＴＬエピトープが該患者に投
与される、請求項２７に記載の方法。 - 【請求項２８】 第１の患者におけるＮＰＣまたはＨＤ細胞の増殖を治療ま
たは阻止する方法であって、ＮＰＣまたはＨＤ細胞を認識するＥＢＶ特異的ＣＴ
Ｌを該第１の患者に導入することを含む該方法。 - 【請求項２９】 前記ＥＢＶ特異的ＣＴＬが、ＣＴＬをＥＢＶ ＣＴＬエピ
トープに暴露してｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激することよって該第１の患者から獲得
される、請求項２８に記載の方法。 - 【請求項３０】 前記ＥＢＶ特異的ＣＴＬが第２の患者から獲得され、ここ
で該第２の患者はＥＢＶに感染しているがＮＰＣまたはＨＤを持たない、請求項
２８に記載の方法。 - 【請求項３１】 前記ＥＢＶ特異的ＣＴＬがＬＭＰ１および／またはＬＭＰ
２特異的ＣＴＬである、請求項２６に記載の方法。 - 【請求項３２】 患者における伝染性単核球症または移植後リンパ球増殖性
疾患の危険を減少させる方法であって、該患者に有効量の： （１）請求項１から３のいずれかに記載の少なくとも１つのＣＴＬエピトープ
； （２）請求項４から１０のいずれかに記載のサブユニットワクチン； （３）請求項１１から１３のいずれかに記載の核酸配列； （４）請求項１４から１６のいずれかに記載のベクター；または （５）請求項１７に記載のポリペプチド を投与することを含む該方法。
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