JP2019530449A - 幹細胞様メモリーｔ細胞の生成および養子免疫療法における使用 - Google Patents
幹細胞様メモリーｔ細胞の生成および養子免疫療法における使用 Download PDFInfo
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Abstract
病原体またはがんを有するかまたはその疑いがあるヒト患者への治療的投与のための抗原特異的Ｔ細胞を、幹細胞様メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ細胞）を利用して生成する方法が本明細書に提示される。そのような方法によって生成された抗原特異的Ｔ細胞、およびそのような抗原特異的Ｔ細胞を使用してヒト患者を処置する方法も開示される。本発明は、病原体またはがんを有するかまたはその疑いがあるヒト患者への治療的投与のための抗原特異的Ｔ細胞を生成する方法、そのような方法によって生成された抗原特異的Ｔ細胞、およびそのような抗原特異的Ｔ細胞を使用してヒト患者を処置する方法を提供する。
Description
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年９月２３日に出願された米国仮出願第６２／３９９，３１１号の利益を主張し、その全体が、参照によって本明細書中に組み込まれる。
本願は、２０１６年９月２３日に出願された米国仮出願第６２／３９９，３１１号の利益を主張し、その全体が、参照によって本明細書中に組み込まれる。
政府の権利の陳述
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＣＡ０２３７６６のもとの政府援助により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
電子的に提出された配列表の参照
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＣＡ０２３７６６のもとの政府援助により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
電子的に提出された配列表の参照
本出願は、２０１７年９月１２日に作成され、サイズが４．５７キロバイトである、「Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿１４２５９−０３４−２２８．ｔｘｔ」という表題のテキストファイルとして本出願と共に提出された配列表を参照により組み込む。
病原体またはがんを有するかまたはその疑いがあるヒト患者への治療的投与のための抗原特異的Ｔ細胞を、幹細胞様メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ細胞）を利用して生成する方法が本明細書に提示される。そのような方法によって生成された抗原特異的Ｔ細胞、およびそのような抗原特異的Ｔ細胞を使用してヒト患者を処置する方法も開示される。
増大および養子移入のために選択されるＴ細胞の特性は、移入された細胞の持続性を決定する重大な因子であると確認されている。抗原特異的Ｔ細胞は、感染症またはがんの存在下で、増大し、病原体を急速に一掃することに専念するエフェクターＴ細胞、ならびに、長期間持続し、疾患の再発からの防御をなし得るメモリーＴ細胞に分化し得る。メモリーＴ細胞区画は、異種性であり、示差的な性質を有する多数のサブセットを包含する。現在の証拠により、ＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７を高レベルで発現するセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）はあまり分化していないが、一方、ＣＤ６２Ｌ−ＣＣＲ７−エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞）は、最終分化を受ける委任前駆体細胞であることが示される（Ｂｅｒｇｅｒら、２００８年、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１１８巻：２９４〜３０５頁）。さらに、マウスおよび非ヒト霊長類における試験により、ＴＣＭ集団に由来する注入されたＴ細胞は、ＴＥＭ集団に由来するものと比較して大きな、抗原に応答した複製潜在能力および長期にわたるｉｎ ｖｉｖｏ持続性を表すことが示されている（Ｂｅｒｇｅｒら、２００８年、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１１８巻：２９４〜３０５頁；Ｗａｎｇら、２０１１年、Ｂｌｏｏｄ、１１７巻：１８８８〜１８９８頁）。最近、ナイーブＴ細胞と同様にＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７およびＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＤ９５も発現する幹細胞様メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ細胞）の同定に伴って免疫記憶のスペクトルが拡張された。ヒトＴＳＣＭ細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで増大されている（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉら、２０１１年、Ｎａｔ Ｍｅｄ、１７巻：１２９０〜１２９７頁；Ｃｉｅｒｉら、２０１３年、Ｂｌｏｏｄ、１２１巻：５７３〜５８４頁）。他のメモリーＴ細胞集団と比較すると、ヒトＴＳＣＭ細胞は、増殖能力の増大を示している。メソテリン特異的キメラ抗原受容体を発現するように形質導入されたＴＳＣＭ細胞も、ヒト化マウスモデルへの養子移入後に大きな増殖および優れた抗腫瘍応答を示した（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉら、２０１１年、Ｎａｔ Ｍｅｄ、１７巻：１２９０〜１２９７頁）。ＴＳＣＭ細胞は、ＴＣＭ細胞、ＴＥＭ細胞およびエフェクターＴ細胞に分化することができるが、段階的移植実験によって示されている通り、自己再生する顕著な潜在性も有する（Ｃｉｅｒｉら、２０１３年、Ｂｌｏｏｄ、１２１巻：５７３〜５８４頁）。これらの特質に起因して、ＴＳＣＭ細胞は、ヒト同種異系造血細胞移植（アロＨＣＴ）後の免疫を再構成するための抗原特異的Ｔ細胞の潜在的な重大なレザバーとして大きな関心を集めている（Ｃｉｅｒｉら、２０１３年、Ｂｌｏｏｄ、１２１巻：５７３〜５８４頁；Ｘｕら、２０１５年、Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ、８巻：１１３号；Ｂｉａｓｃｏら、２０１５年、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、７巻：２７３ｒａ２１３頁；Ｒｏｂｅｒｔｏら、２０１５年、Ｂｌｏｏｄ、１２５巻：２８５５〜２８６４頁）。実際に、Ｔ細胞受容体ＣＤＲ３配列の解析により、ＴＳＣＭ細胞が、アロＨＣＴ後初期に顕著な増殖およびクローン多様化を受けることが示されている（Ｒｏｂｅｒｔｏら、２０１５年、Ｂｌｏｏｄ、１２５巻：２８５５〜２８６４頁；Ｃｉｅｒｉら、２０１５年、Ｂｌｏｏｄ、１２５巻：２８６５〜２８７４頁）。さらに、レトロウイルスベクター挿入部位により区別されるＴＳＣＭ細胞クローンは、ヒトにおいて注入後１２年に至るまで存在し得る（Ｂｉａｓｃｏら、２０１５年、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、７巻：２７３ｒａ２１３頁）。抗原特異的ＴＳＣＭ細胞は、発生頻度が低いことにより、それらの詳細な特徴付けが限定されている（Ｓｃｈｍｕｅｃｋ−Ｈｅｎｎｅｒｅｓｓｅら、２０１５年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９４巻：５５５９〜５５６７頁）。さらに、抗原特異的Ｔ細胞のメモリー区画全体の維持に対する異なるメモリーサブセットの寄与は完全には解明されていない。
本明細書における参考文献の引用は、それが本開示の先行技術であると容認するものと解釈されるべきではない。
本明細書における参考文献の引用は、それが本開示の先行技術であると容認するものと解釈されるべきではない。
Ｂｅｒｇｅｒら、２００８年、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１１８巻：２９４〜３０５頁
Ｗａｎｇら、２０１１年、Ｂｌｏｏｄ、１１７巻：１８８８〜１８９８頁
Ｇａｔｔｉｎｏｎｉら、２０１１年、Ｎａｔ Ｍｅｄ、１７巻：１２９０〜１２９７頁
Ｃｉｅｒｉら、２０１３年、Ｂｌｏｏｄ、１２１巻：５７３〜５８４頁
Ｘｕら、２０１５年、Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ、８巻：１１３号
Ｂｉａｓｃｏら、２０１５年、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、７巻：２７３ｒａ２１３頁
Ｒｏｂｅｒｔｏら、２０１５年、Ｂｌｏｏｄ、１２５巻：２８５５〜２８６４頁
Ｓｃｈｍｕｅｃｋ−Ｈｅｎｎｅｒｅｓｓｅら、２０１５年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９４巻：５５５９〜５５６７頁
本発明は、病原体またはがんを有するかまたはその疑いがあるヒト患者への治療的投与のための抗原特異的Ｔ細胞を、幹細胞様メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ細胞）を利用して生成する方法を提供する。そのような方法によって生成された抗原特異的Ｔ細胞、およびそのような抗原特異的Ｔ細胞を使用してヒト患者を処置する方法も開示される。
一態様では、病原体またはがんを有するかまたはその疑いがあるヒト患者への治療的投与のための抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法であって、（ａ）ヒト血液細胞の集団を、病原体またはがんの１つまたは複数の抗原に培養下で所定期間にわたりｅｘ ｖｉｖｏ感作させるステップであって、前記期間の開始時にヒト血液細胞の集団が少なくとも５０％の幹細胞様メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ細胞）を含有する、ステップと、（ｂ）（ｉ）ｅｘ ｖｉｖｏ感作させたヒト血液細胞の集団、または（ｉｉ）それに由来する、病原体またはがんの１つまたは複数の抗原を認識する抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞を凍結保存するステップとを含み、それにより、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を産生する、方法が本明細書に提示される。
ある特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法は、凍結保存するステップの後に、ｅｘ ｖｉｖｏ感作させたヒト血液細胞またはそれに由来する細胞の集団を解凍するステップ、および必要に応じて、培養下で増大させるステップをさらに含む。
特定の実施形態では、上述の培養下におく期間（本明細書では「感作培養期間（Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｉｍｅ）」と称される；すなわち、感作が起こっている培養期間）は、９〜２１日間の範囲である。特定の実施形態では、感作培養期間は、９〜１４日間の範囲である。別の特定の実施形態では、感作培養期間は、１４日間である。
特定の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップは、ヒト血液細胞の集団を、１つまたは複数の抗原に由来する１つまたは複数の免疫原性ペプチドまたはタンパク質と共培養することを含む。特定の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップは、ヒト血液細胞の集団を、１つまたは複数の抗原を提示する抗原提示細胞と共培養することを含む。
ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップにおいて使用する抗原提示細胞は、樹状細胞、サイトカインにより活性化された単球、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、エプスタイン・バーウイルスにより形質転換されたＢリンパ芽球様細胞株細胞（ＥＢＶ−ＢＬＣＬ細胞）、または人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）などの、１つまたは複数の抗原の提示に適した任意の抗原提示細胞であってよい。特定の実施形態では、抗原提示細胞は、ＡＡＰＣである。
一部の実施形態では、抗原提示細胞は、１つまたは複数の抗原に由来する１つまたは複数の免疫原性ペプチドまたはタンパク質が負荷されたものである。他の実施形態では、抗原提示細胞は、１つまたは複数の抗原に由来する１つまたは複数の免疫原性ペプチドまたはタンパク質を組換え発現するように遺伝子操作されたものである。
一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫原性ペプチドまたはタンパク質は、１つまたは複数の抗原に由来するオーバーラップするペプチドのプールである。特定の実施形態では、オーバーラップするペプチドのプールは、オーバーラップするペンタデカペプチドのプールである。他の実施形態では、１つまたは複数の免疫原性ペプチドまたはタンパク質は、１つまたは複数の抗原に由来する１つまたは複数のタンパク質である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団は、１つまたは複数の抗原を認識するパブリック（ｐｕｂｌｉｃ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を内因的に発現する抗原特異的Ｔ細胞を含む。他の実施形態では、本明細書に記載の抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団は、１つまたは複数の抗原を認識するパブリックＴＣＲを組換え発現する抗原特異的Ｔ細胞を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法は、ヒト血液細胞の集団にパブリックＴＣＲをコードする核酸を形質導入するステップ（例えば、ヒト血液細胞の集団を３〜５日間培養した時点で）をさらに含む。１つまたは複数の抗原がサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ｐｐ６５である特定の実施形態では、パブリックＴＣＲは、ＣＡＳＳＰＱＴＧＡＳＹＧＹＴＦ（配列番号３）である相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む可変ドメインを含むβ鎖を含む。１つまたは複数の抗原がＣＭＶ ｐｐ６５である別の特定の実施形態では、パブリックＴＣＲは、ＣＡＳＳＰＫＴＧＡＶＹＧＹＴＦ（配列番号４）であるＣＤＲ３を含む可変ドメインを含むβ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団は、１つまたは複数の抗原を認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を組換え発現する抗原特異的Ｔ細胞を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法は、ヒト血液細胞の集団にＣＡＲをコードする核酸を形質導入するステップ（例えば、ヒト血液細胞の集団を３〜５日間培養した時点で）をさらに含む。
別の態様では、病原体またはがんを有するかまたはその疑いがあるヒト患者への治療的投与のための抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法であって、ヒト血液細胞の集団を３〜５日間培養した時点で、ヒト血液細胞の集団に病原体またはがんの１つまたは複数の抗原を認識するパブリックＴＣＲをコードする核酸を形質導入するステップであって、ヒト血液細胞の集団が、少なくとも５０％のＴＳＣＭ細胞を含有する、ステップを含み、それにより、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を産生する方法が本明細書に提示される。１つまたは複数の抗原がＣＭＶ ｐｐ６５である特定の実施形態では、パブリックＴＣＲは、ＣＡＳＳＰＱＴＧＡＳＹＧＹＴＦ（配列番号３）であるＣＤＲ３を含む可変ドメインを含むβ鎖を含む。１つまたは複数の抗原がＣＭＶ ｐｐ６５である別の特定の実施形態では、パブリックＴＣＲは、ＣＡＳＳＰＫＴＧＡＶＹＧＹＴＦ（配列番号４）であるＣＤＲ３を含む可変ドメインを含むβ鎖を含む。特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法は、形質導入するステップの後に、形質導入されたヒト血液細胞またはそれに由来する細胞の集団を凍結保存するステップをさらに含む。特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法は、凍結保存するステップの後に、形質導入されたヒト血液細胞またはそれに由来する細胞の集団を解凍し、必要に応じて培養下で増大させるステップをさらに含む。
別の態様では、ＣＭＶ感染症を有するかまたはその疑いがあるヒト患者への治療的投与のための抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法であって、ヒト血液細胞の集団を３〜５日間培養した時点で、ヒト血液細胞の集団にＣＭＶ ｐｐ６５を認識するパブリックＴＣＲをコードする核酸を形質導入するステップであって、パブリックＴＣＲが、ＣＡＳＳＰＱＴＧＡＳＹＧＹＴＦ（配列番号３）であるＣＤＲ３を含む可変ドメインを含むβ鎖を含み、ヒト血液細胞の集団が少なくとも５０％のＴＳＣＭ細胞を含有する、ステップを含み、それにより、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を産生する方法が本明細書に提示される。特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法は、形質導入するステップの後に、形質導入されたヒト血液細胞またはそれに由来する細胞の集団を凍結保存するステップをさらに含む。特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法は、凍結保存するステップの後に、形質導入されたヒト血液細胞またはそれに由来する細胞の集団を解凍し、必要に応じて培養下で増大させるステップをさらに含む。
別の態様では、ＣＭＶ感染症を有するかまたはその疑いがあるヒト患者への治療的投与のための抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法であって、ヒト血液細胞の集団を３〜５日間培養した時点で、ヒト血液細胞の集団にＣＭＶ ｐｐ６５を認識するパブリックＴＣＲをコードする核酸を形質導入するステップであって、パブリックＴＣＲが、ＣＡＳＳＰＫＴＧＡＶＹＧＹＴＦ（配列番号４）であるＣＤＲ３を含む可変ドメインを含むβ鎖を含み、ヒト血液細胞の集団が、少なくとも５０％のＴＳＣＭ細胞を含有する、ステップを含み、それにより、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を産生する方法が本明細書に提示される。特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法は、形質導入するステップの後に、形質導入されたヒト血液細胞またはそれに由来する細胞の集団を凍結保存するステップをさらに含む。特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法は、凍結保存するステップの後に、形質導入されたヒト血液細胞またはそれに由来する細胞の集団を解凍し、必要に応じて培養下で増大させるステップをさらに含む。
別の態様では、病原体またはがんを有するかまたはその疑いがあるヒト患者への治療的投与のための抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法であって、ヒト血液細胞の集団を３〜５日間培養した時点で、ヒト血液細胞の集団に病原体またはがんの１つまたは複数の抗原を認識するＣＡＲをコードする核酸を形質導入するステップであって、ヒト血液細胞の集団が、少なくとも５０％のＴＳＣＭ細胞を含有する、ステップを含み、それにより、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を産生する方法が本明細書に提示される。特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法は、形質導入するステップの後に、形質導入されたヒト血液細胞またはそれに由来する細胞の集団を凍結保存するステップをさらに含む。特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法は、凍結保存するステップの後に、形質導入されたヒト血液細胞またはそれに由来する細胞の集団を解凍し、必要に応じて培養下で増大させるステップをさらに含む。
本明細書に記載の抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法に従って使用されるヒト血液細胞の集団は、少なくとも５０％のＴＳＣＭ細胞を含有する。特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、少なくとも９０％のＴＳＣＭ細胞を含有する。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、少なくとも９５％のＴＳＣＭ細胞を含有する。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、少なくとも９９％のＴＳＣＭ細胞を含有する。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、１００％のＴＳＣＭ細胞を含有する。
ある特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、１０％未満のＴＮ細胞を含有する。特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、５％未満のＴＮ細胞を含有する。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、１％未満のＴＮ細胞を含有する。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、ＴＮ細胞を含有しない。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法は、ヒト血液細胞の集団をヒト細胞試料から引き出すステップをさらに含む。特定の実施形態では、引き出すステップは、ヒト細胞試料からＴＳＣＭ細胞を濃縮することを含む。特定の実施形態では、濃縮するステップは、ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ９５＋である細胞を選択することを含む。一部の実施形態では、ヒト血液細胞の集団をヒト細胞試料から引き出すステップは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によってヒト細胞試料からＴＳＣＭ細胞を選別することを含む。
好ましい実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、１つまたは複数の抗原について血清陽性であるヒトドナーに由来する。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団は、１つまたは複数の抗原に由来する１つまたは複数のペプチドまたはタンパク質が負荷されていないまたはそれを発現するように遺伝子操作されていない抗原提示細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏにおける実質的な細胞傷害性を欠く。
本明細書に記載の抗原特異的細胞を含む細胞の集団を生成する方法の特定の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップは、ヒト血液細胞の集団を、病原体の１つまたは複数の抗原にｅｘ ｖｉｖｏ感作させることを含む。病原体は、ウイルス、細菌、真菌、蠕虫または原生生物であり得る。一部の実施形態では、病原体は、ウイルスである。特定の実施形態では、ウイルスは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）である。
本明細書に記載の抗原特異的細胞を含む細胞の集団を生成する方法の特定の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップは、ヒト血液細胞の集団を、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）の１つまたは複数の抗原にｅｘ ｖｉｖｏ感作させることを含む。
本明細書に記載の抗原特異的細胞を含む細胞の集団を生成する方法の特定の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップは、ヒト血液細胞の集団を、ＢＫウイルス（ＢＫＶ）、Ｊｏｈｎ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）、ヘルペスウイルス、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、ポックスウイルス、ラブドウイルス、またはパラミクソウイルスの１つまたは複数の抗原にｅｘ ｖｉｖｏ感作させることを含む。
本明細書に記載の抗原特異的細胞を含む細胞の集団を生成する方法の特定の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップは、ヒト血液細胞の集団を、がんの１つまたは複数の抗原にｅｘ ｖｉｖｏ感作させることを含む。がんは、血液がんであってよい。特定の実施形態では、がんは、多発性骨髄腫または形質細胞白血病である。特定の実施形態のある態様では、がんの１つまたは複数の抗原は、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）である。がんはまた、例えば、これだけに限定されないが、乳がん、肺がん、卵巣がん、胃がん、膵臓がん、喉頭がん、食道がん、精巣がん、肝臓がん、耳下腺がん、胆道がん、結腸がん、直腸がん、子宮頸がん、子宮がん、子宮内膜がん、腎臓がん、膀胱がん、前立腺がん、甲状腺がん、脳がん、または皮膚がんなどの固形腫瘍がんであってもよい。
別の態様では、病原体またはがんを有するヒト患者を処置する方法であって、（ｉ）本明細書に記載の方法に従って抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成するステップと、（ｉｉ）抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者に投与するステップとを含む方法が本明細書に提示される。
別の態様では、病原体またはがんを有するヒト患者を処置する方法であって、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者に投与するステップであって、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団が、本明細書に記載の方法に従って抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成することを含む方法の産生物である、ステップを含む方法が本明細書に提示される。
一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団に含有される抗原特異的Ｔ細胞は、処置されるヒト患者の疾患細胞と共有するＨＬＡ対立遺伝子によって拘束される。他の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団に含有される抗原特異的Ｔ細胞は、処置されるヒト患者の疾患細胞と、少なくとも２つのＨＬＡ対立遺伝子（例えば、２つのＨＬＡ−Ａ対立遺伝子、２つのＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子、２つのＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子、および２つのＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子などの８つのＨＬＡ対立遺伝子のうち少なくとも２つ）を共有する。
特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、ヒト患者に対して同種異系であるヒトドナーに由来する。特定の実施形態では、ヒト患者は、移植ドナーからの移植のレシピエントであり、ヒトドナーは、移植ドナーとは異なる第三者ドナーである。
一部の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、ヒト患者に、ヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約１×１０５個未満またはそれと等しい用量で投与することを含む。特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、ヒト患者に、ヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約５×１０４個未満またはそれと等しい用量で投与することを含む。好ましい実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、ヒト患者に、ヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約１×１０４個未満またはそれと等しい用量で投与することを含む。別の特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、ヒト患者に、ヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約５×１０３個未満またはそれと等しい用量で投与することを含む。別の特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、ヒト患者に、ヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約１×１０３個未満またはそれと等しい用量で投与することを含む。
ある特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、ヒト患者に、上記の用量で毎週投与することを含む。
ある特定の実施形態では、投与するステップは、ボーラス静脈内注入によるものである。
ある特定の実施形態では、投与するステップは、少なくとも２用量の、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者に投与することを含む。特定の実施形態では、投与するステップは、２用量、３用量、４用量、５用量、または６用量の、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者に投与することを含む。
特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、３週間連続して１週間当たり１用量の第１のサイクル、その後、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の用量を投与しない休薬期間、その後、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、３週間連続して１週間当たり前記１用量の第２のサイクルを施行することを含む。
特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、３週間連続して１週間当たり１用量のサイクルを２回、３回、４回、５回、または６回施行することを含み、各サイクルは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の用量を投与しない休薬期間によって隔てられる。
特定の実施形態では、休薬期間は、約１週間、約２週間、約３週間、または約４週間である。好ましい実施形態では、休薬期間は、約３週間である。
特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を投与するステップによりヒト患者においていかなる移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）も生じない。
別の態様では、病原体またはがんを有するかまたはその疑いがあるヒト患者への治療的投与のための抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団であって、本明細書に記載の方法に従って抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成することを含む方法の生成物である、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団が本明細書に提示される。特定の実施形態では、病原体またはがんを有するかまたはその疑いがあるヒト患者への治療的投与のための抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団であって、本明細書に記載の方法に従って抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成することを含む方法の産生物であり、凍結保存されている、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団が本明細書に提示される。
別の態様では、本明細書に記載の抗原特異的Ｔ細胞を含む複数の細胞の集団を含む細胞バンクが本明細書に提示される。
本発明は、病原体またはがんを有するかまたはその疑いがあるヒト患者への治療的投与のための抗原特異的Ｔ細胞を生成する方法、そのような方法によって生成された抗原特異的Ｔ細胞、およびそのような抗原特異的Ｔ細胞を使用してヒト患者を処置する方法を提供する。本発明に従って、幹細胞様メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ細胞）は、ヒト血液中に見出される病原体の抗原の優性エピトープを認識し、また、ｉｎ ｖｉｖｏにおける免疫優性Ｔ細胞の迅速な再増殖のための主要な持続的レザバーである抗原特異的Ｔ細胞の迅速、持続的、かつ選択的なｉｎ ｖｉｔｒｏにおける増大を可能にするので、ナイーブＴ細胞（ＴＮ細胞）、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）およびエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞）と比較してより適切な、養子免疫療法用の抗原特異的Ｔ細胞を生成するためのＴ細胞の供給源である。
５．１．養子免疫療法用の抗原特異的Ｔ細胞を生成する方法
５．１．１．ＴＳＣＭ細胞のｅｘ ｖｉｖｏ感作を使用する方法
５．１．養子免疫療法用の抗原特異的Ｔ細胞を生成する方法
５．１．１．ＴＳＣＭ細胞のｅｘ ｖｉｖｏ感作を使用する方法
一態様では、病原体またはがんを有するかまたはその疑いがあるヒト患者への治療的投与のための抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法であって、（ａ）ヒト血液細胞の集団を病原体またはがんの１つまたは複数の抗原に培養下である期間にわたってｅｘ ｖｉｖｏ感作させるステップであって、前記期間の開始時にヒト血液細胞の集団が少なくとも５０％の幹細胞様メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ細胞）を含有する、ステップと、（ｂ）（ｉ）ｅｘ ｖｉｖｏ感作させたヒト血液細胞の集団、または（ｉｉ）それに由来する、病原体またはがんの１つまたは複数の抗原を認識する抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞を凍結保存するステップとを含み、それにより、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を産生する方法が本明細書に提示される。
ｅｘ ｖｉｖｏ感作
特定の実施形態では、上述の培養下におく期間（本明細書では「感作培養期間」と称される；すなわち、感作が起こっている培養期間）は、９〜２１日間の範囲である。明らかになるように、これは、抗原の存在下での最初の培養から開始して抗原の存在下での培養の終わりまでの、感作のために培養下におく期間が、９〜２１日間だけであり、それより長くはないことを意味する（必要に応じて、細胞をより長い期間にわたって培養することができるが、感作のための抗原の存在下にはおかない）。特定の実施形態では、感作培養期間は、９〜１４日間の範囲である。別の特定の実施形態では、感作培養期間は、９日間である。別の特定の実施形態では、感作培養期間は、１０日間である。別の特定の実施形態では、感作培養期間は、１１日間である。別の特定の実施形態では、感作培養期間は、１２日間である。別の特定の実施形態では、感作培養期間は、１３日間である。別の特定の実施形態では、感作培養期間は、１４日間である。別の特定の実施形態では、感作培養期間は、１５日間である。別の特定の実施形態では、感作培養期間は、１６日間である。別の特定の実施形態では、感作培養期間は、１７日間である。別の特定の実施形態では、感作培養期間は、１８日間である。別の特定の実施形態では、感作培養期間は、１９日間である。別の特定の実施形態では、感作培養期間は、２０日間である。別の特定の実施形態では、感作培養期間は、２１日間である。
ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップは、ｅｘ ｖｉｖｏにおいてＴ細胞を刺激して抗原特異的にするための当技術分野で公知の任意の方法、例えば、Ｋｏｅｈｎｅら、２０００年、Ｂｌｏｏｄ、９６巻：１０９〜１１７頁；Ｔｒｉｖｅｄｉら、２００５年、Ｂｌｏｏｄ、１０５巻：２７９３〜２８０１頁；Ｈａｑｕｅら、２００７年、Ｂｌｏｏｄ、１１０巻：１１２３〜１１３１頁；Ｈａｓａｎら、２００９年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８３巻：２８３７〜２８５０頁；Ｆｅｕｃｈｔｉｎｇｅｒら、２０１０年、Ｂｌｏｏｄ、１１６巻：４３６０〜４３６７頁；Ｄｏｕｂｒｏｖｉｎａら、２０１２年、Ｂｌｏｏｄ、１２０巻：１６３３〜１６４６頁；Ｌｅｅｎら、２０１３年、Ｂｌｏｏｄ、１２１巻：５１１３〜５１２３頁；Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｕら、２０１４年、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、６巻：２４２ｒａ８３頁；Ｓｕｋｄｏｌａｋら、２０１３年、Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、１９巻：１４８０〜１４９２頁；Ｋｏｅｈｎｅら、２０１５年、Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２１巻：１６６３〜１６７８頁、または国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／０７３５５０号に記載されている方法などによって実施することができる。
特定の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップは、ヒト血液細胞の集団を、１つまたは複数の抗原に由来する１つまたは複数の免疫原性ペプチドまたはタンパク質と共培養することを含む（抗原提示細胞も存在することが好ましい）。特定の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップは、ヒト血液細胞の集団を、１つまたは複数の抗原を提示する抗原提示細胞と共培養することを含む。ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップは、最初に、培養物にＩＬ−１５およびＩＬ−７を補充し（例えば、感作培養期間の開始後４日目、またはそれより前から開始する）、次いで、培養物にＩＬ−２を補充し（例えば、少なくとも感作培養期間の開始の７日後）、必要に応じてＩＬ−１５およびＩＬ−７と共に補充することを含むことが好ましい。ＩＬ−１５およびＩＬ−７はＴＳＣＭ細胞の幹細胞様表現型の維持に役立ち、ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップにおける培養の最初の７日以内、およびその後、再度多数回にわたって培養物に添加することが好ましい。ＩＬ−２は、抗原特異的Ｔ細胞の増大を増進させるのに役立ち、ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップにおいてＩＬ−１５およびＩＬ−７を細胞培養物に最初に添加した日よりも後の培養日に細胞培養物に添加すること（例えば、ＩＬ−２を少なくとも感作培養期間の開始の７日後に添加する）ことが好ましい。特定の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップは、感作培養期間の開始後４日目および７日目に培養物にＩＬ−１５およびＩＬ−７を補充し、次いで、感作培養期間の開始後１２日目の後に開始して２日に１回、培養物にＩＬ−１５、ＩＬ−７およびＩＬ−２を補充することを含む。
ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップにおいて使用する抗原提示細胞は、樹状細胞、サイトカインにより活性化された単球、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、エプスタイン・バーウイルスにより形質転換されたＢリンパ芽球様細胞株細胞（ＥＢＶ−ＢＬＣＬ細胞）、または人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）などの、１つまたは複数の抗原の提示に適した任意の抗原提示細胞であってよい。特定の実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞である。別の特定の実施形態では、抗原提示細胞は、ＰＢＭＣである。別の特定の実施形態では、抗原提示細胞は、ＥＢＶ−ＢＬＣＬ細胞である。別の特定の実施形態では、抗原提示細胞は、ＡＡＰＣである。ある特定の実施形態では、抗原提示細胞は、ヒト血液細胞の集団のドナーに由来する。抗原提示細胞は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、Ｋｏｅｈｎｅら、２０００年、Ｂｌｏｏｄ、９６巻：１０９〜１１７頁；Ｋｏｅｈｎｅら、２００２年、Ｂｌｏｏｄ、９９巻：１７３０〜１７４０頁；Ｔｒｉｖｅｄｉら、２００５年、Ｂｌｏｏｄ、１０５巻：２７９３〜２８０１頁；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、２００７年、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ、３８巻：２３７〜２５０頁；Ｈａｓａｎら、２００９年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８３巻：２８３７〜２８５０頁；Ｂａｒｋｅｒら、２０１０年、Ｂｌｏｏｄ、１１６巻：５０４５〜５０４９頁；Ｏ’ Ｒｅｉｌｌｙら、２０１１年、Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ＆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、２４巻：３８１〜３９１頁；Ｄｏｕｂｒｏｖｉｎａら、２０１２年、Ｂｌｏｏｄ、１２０巻：１６３３〜１６４６頁；Ｋｏｅｈｎｅら、２０１５年、Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２１巻：１６６３〜１６７８頁、または国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／０７３５５０号に記載されている方法（複数可）などによって得ることができる。
一部の実施形態では、抗原提示細胞は、１つまたは複数の抗原に由来する１つまたは複数の免疫原性ペプチドまたはタンパク質が負荷されたものである。抗原提示細胞に抗原（複数可）に由来するペプチド（複数可）を負荷させるための非限定的な典型的方法は、Ｔｒｉｖｅｄｉら、２００５年、Ｂｌｏｏｄ、１０５巻：２７９３〜２８０１頁；Ｈａｓａｎら、２００９年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８３巻：２８３７〜２８５０頁；および国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／０７３５５０号に見出すことができる。他の実施形態では、抗原提示細胞は、１つまたは複数の抗原に由来する１つまたは複数の免疫原性ペプチドまたはタンパク質を組換え発現するように遺伝子操作されたものである。細胞に核酸ビヒクルを導入してタンパク質を発現させるための当技術分野で公知の任意の適切な方法、例えば、形質導入または形質転換などを使用して、抗原提示細胞を１つまたは複数の抗原に由来する１つまたは複数の免疫原性ペプチドまたはタンパク質を組換え発現するように遺伝子操作することができる。
一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫原性ペプチドまたはタンパク質は、１つまたは複数の抗原に由来するオーバーラップするペプチドのプールである。特定の実施形態では、オーバーラップするペプチドのプールは、オーバーラップするペンタデカペプチドのプールである。他の実施形態では、１つまたは複数の免疫原性ペプチドまたはタンパク質は、１つまたは複数の抗原に由来する１つまたは複数のタンパク質である。
凍結保存
好ましい実施形態では、凍結保存するステップは、（ｃ）培養物からｅｘ ｖｉｖｏ感作させたヒト血液細胞またはそれに由来する細胞の集団を回収するステップと、（ｄ）凍結保存剤とｅｘ ｖｉｖｏ感作させたヒト血液細胞の集団またはそれに由来する細胞を合わせるステップと、（ｅ）凍結保存剤と合わせた、ｅｘ ｖｉｖｏ感作させたヒト血液細胞またはそれに由来する細胞の集団を凍結するステップとを含む。ｅｘ ｖｉｖｏ感作させたヒト血液細胞の集団に由来し、病原体またはがんの１つまたは複数の抗原を認識する抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏ感作させたヒト血液細胞の集団の画分（例えば、ｅｘ ｖｉｖｏ感作させたヒト血液細胞の集団から濃縮されたＣＤ３＋Ｔ細胞集団もしくはｅｘ ｖｉｖｏ感作させたヒト血液細胞の集団から濃縮されたＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞集団）であってもよく、ｅｘ ｖｉｖｏ感作させたヒト血液細胞の集団を増大させた集団であってもよい。
細胞の凍結は、普通は、破壊的なものでる。冷却すると、細胞内の水が凍結する。次いで、細胞膜に対する浸透効果、細胞脱水、溶質濃縮、および氷結晶の形成によって傷害が生じる。細胞の外側で氷が形成されるにしたがい、利用可能な水が溶液から取り出され、細胞から引き出され、それにより、浸透脱水および溶質濃縮の上昇が引き起こされ、最終的に細胞が破壊される（考察に関しては、Ｍａｚｕｒ、１９７７年、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４巻：２５１〜２７２頁を参照されたい）。これらの傷害性の影響は、（ａ）凍結保存剤の使用、（ｂ）凍結速度の制御、および（ｃ）分解反応が最小限になるように十分に低い温度での貯蔵によって回避することができる。
本発明に従って使用することができる凍結保存剤は、これだけに限定されないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ポリビニルピロリジン、ポリエチレングリコール、アルブミン、デキストラン、スクロース、エチレングリコール、ｉ−エリスリトール、Ｄ−リビトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、ｉ−イノシトール、Ｄ−ラクトース、塩化コリン、アミノ酸、メタノール、アセトアミド、グリセロールモノアセテート、または無機塩であり得る。好ましい実施形態では、本発明に従って使用される凍結保存剤は、ＤＭＳＯである。小分子として、ＤＭＳＯは、細胞に自由に透過し、細胞内細胞小器官を、水と組み合わさってその凍結性を改変し、氷形成による損傷を防止することによって保護する。血漿、ウシ胎仔血清、またはヒトアルブミンの添加により、ＤＭＳＯの保護効果が強化される。約１％のＤＭＳＯ濃度は４℃を超える温度では毒性であるので、ＤＭＳＯの添加後は細胞を凍結するまで０℃に保つべきである。
制御された遅い冷却速度も重要である。異なる凍結保存剤（Ｒａｐａｔｚ、Ｇ．ら、１９６８年、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ、５巻（１号）：１８〜２５頁）および異なる細胞型は、異なる最適な冷却速度を有する（例えば、ＲｏｗｅおよびＲｉｎｆｒｅｔ、１９６２年、Ｂｌｏｏｄ、２０巻：６３６頁；Ｒｏｗｅ、１９６６年、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ、３巻：１２〜１８頁；Ｌｅｗｉｓら、１９６７年、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、７巻：１７〜３２頁；およびＭａｚｕｒ、１９７０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１６８巻：９３９〜９４９頁を参照されたい）。水が氷に変化する融合相の熱は最小であるべきである。冷却手順は、例えば、プログラム可能な凍結デバイスまたはメタノールバス手順を使用することによって行うことができる。細胞の生存能力を保存する凍結保存のための任意の方法を使用することができる。特定の実施形態では、凍結保存ステップにおいて速度制御冷凍装置を使用して、細胞のバイアルの温度を毎分−０．３〜−２℃の速度で≦−９０℃またはそれ未満にする。限定ではなく例として、以下のプログラムを使用することができる：１）チャンバーが４℃になり、試料が６．０℃になるまで待つ；２）試料が−６．０℃になるまで毎分１．０℃で低下させる；３）チャンバーが−４５℃になるまで毎分２５℃で低下させる；４）チャンバーが−１４℃になるまで毎分１０℃で低下させる；５）チャンバーが−４０℃になるまで毎分１．０℃で低下させる；６）チャンバーが−９０℃になるまで毎分１０℃で低下させる；そして７）液体窒素に移す。あるいは、細胞を、−２０℃で予備馴化させたＭｒ．Ｆｒｏｓｔｙ（商標）または他のアルコール／ポリスチレン遮断凍結チャンバーに入れ、チャンバーを−８０℃の冷凍装置に移すことによって終夜凍結した後、液体窒素での貯蔵に移すことができる。
徹底的な凍結後、ｅｘ ｖｉｖｏ感作させたヒト血液細胞またはそれに由来する細胞の集団を長期低温貯蔵用容器に速やかに移すことができる。好ましい実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ感作させたヒト血液細胞またはそれに由来する細胞の集団を液体窒素（−１９６℃）またはその蒸気（−１６５℃）中、極低温で貯蔵することができる。特定の実施形態では、細胞を−８０℃で２日間貯蔵し、次いで、液体窒素に移す。特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む複数の細胞の集団を本明細書に記載の通り生成し、貯蔵し、それにより、細胞バンクを作製する。
好ましい実施形態では、限定ではなく例として、凍結保存ステップを以下の通り実施する：最初に、９０％ウシ胎仔血清および１０％ＤＭＳＯを含有する凍結混合物を調製する（滅菌された１５ｍｌのチューブ中、熱失活させ、濾過したウシ胎仔血清９ｍｌを、滅菌し、濾過したＤＭＳＯ １ｍｌと混合する）。この凍結混合物の一定分量を滅菌条件下で調製し、次いで、細胞を凍結させるための懸濁培地として使用するために−２０℃で貯蔵する。Ｔ細胞培地中に１×１０６個／ｍｌで懸濁させたＴ細胞を１５ｍｌまたは５０ｍｌのチューブ中、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上清を穏やかに廃棄し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、次いで、細胞ペレットを解凍した凍結混合物に１ｍｌ当たり細胞１０×１０６個で懸濁させる。
生存細胞の凍結保存の他の公知の方法、またはそれらの改変が利用可能であり、使用が構想される（例えば、コールドメタルミラー（ｃｏｌｄ ｍｅｔａｌ−ｍｉｒｒｏｒ）技法；ＬｉｖｅｓｅｙおよびＬｉｎｎｅｒ、１９８７年、Ｎａｔｕｒｅ、３２７巻：２５５頁；Ｌｉｎｎｅｒら、１９８６年、Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、３４巻：１１２３〜１１３５頁； Ｓｅｎｋａｎらによる米国特許第４，１９９，０２２号、Ｓｃｈｗａｒｔｚによる米国特許第３，７５３，３５７号、Ｆａｈｙによる米国特許第４，５５９，２９８号も参照されたい）。
ある特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法は、凍結保存するステップの後に、ｅｘ ｖｉｖｏ感作させたヒト血液細胞またはそれに由来する細胞の集団を解凍するステップ、および必要に応じて、培養下で増大させるステップをさらに含む。凍結細胞は、迅速に解凍し（例えば、３７〜４１℃で維持したウォーターバス中で）、解凍したらすぐに冷却することが好ましい。具体的には、凍結細胞を含有するバイアルをその首部分まで温暖なウォーターバスに浸漬する；穏やかな回転により、細胞懸濁液が解凍されるにつれ混合されることが確実になり、温暖な水から内部の氷塊まで熱伝達が増大する。氷が完全に融解したらすぐにバイアルを直ちに氷中に入れる。
凍結保存剤がヒトにおいて毒性である場合には、治療的投与前に除去することができ、除去は、解凍時に実現されることが好ましい。しかし、凍結保存剤がＤＭＳＯである場合、低濃度のＤＭＳＯには重大な毒性はないので、細胞の喪失を回避するために、このステップを省略することが好ましい。
ＴＣＲ発現またはＣＡＲ発現
一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団は、目的のタンパク質、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を組換え発現する抗原特異的Ｔ細胞を含む。これは、ヒト血液細胞の集団に、それらの培養中、目的のタンパク質をコードする核酸を形質導入することによって実現することができる。核酸は、目的のタンパク質をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結しているベクターであることが好ましい。形質導入は、培養下の３日目〜５日目に行うことが好ましく、これは、本明細書の実施例の節（すなわち、第６節）に示される通り、この時点が、ＴＳＣＭ細胞が最も高い増殖能力を示す時点だからである。
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団、１つまたは複数の抗原を認識するパブリックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を内因的に発現する抗原特異的Ｔ細胞を含む。他の実施形態では、本明細書に記載の抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団は、１つまたは複数の抗原を認識するパブリックＴＣＲを組換え発現する抗原特異的Ｔ細胞を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法は、例えば、下記の第５．１．２節に記載されている形質導入方法を使用し、ヒト血液細胞の集団にパブリックＴＣＲをコードする核酸を形質導入するステップ（例えば、ヒト血液細胞の集団を３〜５日間培養した時点で）をさらに含む。形質導入するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の同種異系反応性が低下する、ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップの前、その間、またはその後に実施することができる。
パブリックＴＣＲは、多数の個体において検出される高度に相同な配列を有するペプチド特異的ＴＣＲである（Ｌｉら、２０１２年、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、２２巻：３３〜４２頁）。種々のヒトウイルスに対するパブリックＴＣＲが記載されている（Ａｒｇａｅｔら、１９９４年、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、１８０巻：２３３５〜２３４０頁；Ｗａｎｇら、２０１２年、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、４巻：１２８ｒａ１４２頁；Ｎｇｕｙｅｎら、２０１４年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９２巻：５０３９〜５０４９頁；Ｔｒａｕｔｍａｎｎら、２００５年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７５巻：６１２３〜６１３２頁）。
１つまたは複数の抗原がサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ｐｐ６５である特定の実施形態では、パブリックＴＣＲは、ＣＡＳＳＰＱＴＧＡＳＹＧＹＴＦ（配列番号３）である相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む可変ドメインを含むβ鎖を含む。１つまたは複数の抗原がＣＭＶ ｐｐ６５である別の特定の実施形態では、パブリックＴＣＲは、ＣＡＳＳＰＫＴＧＡＶＹＧＹＴＦ（配列番号４）であるＣＤＲ３を含む可変ドメインを含むβ鎖を含む。１つまたは複数の抗原がＣＭＶ ｐｐ６５である別の特定の実施形態では、パブリックＴＣＲは、Ｓ＊ ｎＴＧ＊ ｎＧＹ（配列番号１６；＊ｎは、任意の長さの任意のアミノ酸配列および任意のアミノ酸の組合せを示す）であるＣＤＲ３を含む可変ドメインを含むβ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団は、１つまたは複数の抗原を認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を組換え発現する抗原特異的Ｔ細胞を含む（ＣＡＲに関するさらなる詳細については、下記の第５．１．３節を参照されたい）。特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法は、例えば、下記の第５．１．３節に記載されている形質導入方法を使用し、ヒト血液細胞の集団にＣＡＲをコードする核酸を形質導入するステップ（例えば、ヒト血液細胞の集団を３〜５日間培養した時点で）をさらに含む。形質導入するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の同種異系反応性が低下する、ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップの前、その間、またはその後に実施することができる。
５．１．２．ＴＣＲが形質導入されたＴＳＣＭ細胞を使用する方法
５．１．２．ＴＣＲが形質導入されたＴＳＣＭ細胞を使用する方法
別の態様では、病原体またはがんを有するかまたはその疑いがあるヒト患者への治療的投与のための抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法であって、ヒト血液細胞の集団に病原体またはがんの１つまたは複数の抗原を認識するパブリックＴＣＲをコードする核酸を形質導入するステップ（好ましくはヒト血液細胞の集団を３〜５日間培養した時点で）であって、ヒト血液細胞の集団が、少なくとも５０％のＴＳＣＭ細胞を含有する、ステップを含み、それにより、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を産生する方法が本明細書に提示される。形質導入は、培養下の３日目〜５日目に行うことが好ましく、これは、本明細書の実施例の節（すなわち、第６節）に示される通り、この時点が、ＴＳＣＭ細胞が最も高い増殖能力を示す時点だからである。
１つまたは複数の抗原がＣＭＶ ｐｐ６５である特定の実施形態では、パブリックＴＣＲは、ＣＡＳＳＰＱＴＧＡＳＹＧＹＴＦ（配列番号３）であるＣＤＲ３を含む可変ドメインを含むβ鎖を含む。１つまたは複数の抗原がＣＭＶ ｐｐ６５である別の特定の実施形態では、パブリックＴＣＲは、ＣＡＳＳＰＫＴＧＡＶＹＧＹＴＦ（配列番号４）であるＣＤＲ３を含む可変ドメインを含むβ鎖を含む。１つまたは複数の抗原がＣＭＶ ｐｐ６５である別の特定の実施形態では、パブリックＴＣＲは、Ｓ＊ ｎＴＧ＊ ｎＧＹ（配列番号１６；＊ｎは、任意の長さの任意のアミノ酸配列および任意のアミノ酸の組合せを示す）であるＣＤＲ３を含む可変ドメインを含むβ鎖を含む。
別の態様では、ＣＭＶ感染症を有するかまたはその疑いがあるヒト患者への治療的投与のための抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法であって、ヒト血液細胞の集団にＣＭＶ ｐｐ６５を認識するパブリックＴＣＲをコードする核酸を形質導入するステップ（好ましくはヒト血液細胞の集団を３〜５日間培養した時点で）であって、パブリックＴＣＲが、ＣＡＳＳＰＱＴＧＡＳＹＧＹＴＦ（配列番号３）であるＣＤＲ３を含む可変ドメインを含むβ鎖を含み、ヒト血液細胞の集団が、少なくとも５０％のＴＳＣＭ細胞を含有する、ステップを含み、それにより、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を産生する方法が本明細書に提示される。
別の態様では、ＣＭＶ感染症を有するかまたはその疑いがあるヒト患者への治療的投与のための抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法であって、ヒト血液細胞の集団にＣＭＶ ｐｐ６５を認識するパブリックＴＣＲをコードする核酸を形質導入するステップ（好ましくはヒト血液細胞の集団を３〜５日間培養した時点で）であって、パブリックＴＣＲが、ＣＡＳＳＰＫＴＧＡＶＹＧＹＴＦ（配列番号４）であるＣＤＲ３を含む可変ドメインを含むβ鎖を含み、ヒト血液細胞の集団が、少なくとも５０％のＴＳＣＭ細胞を含有する、ステップを含み、それにより、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を産生する方法が本明細書に提示される。
別の態様では、ＣＭＶ感染症を有するかまたはその疑いがあるヒト患者への治療的投与のための抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法であって、ヒト血液細胞の集団にＣＭＶ ｐｐ６５を認識するパブリックＴＣＲをコードする核酸を形質導入するステップ（好ましくはヒト血液細胞の集団を３〜５日間培養した時点で）であって、パブリックＴＣＲが、Ｓ＊ ｎＴＧ＊ ｎＧＹ（配列番号１６；＊ｎは、任意の長さの任意のアミノ酸配列および任意のアミノ酸の組合せを示す）であるＣＤＲ３を含む可変ドメインを含むβ鎖を含み、ヒト血液細胞の集団が、少なくとも５０％のＴＳＣＭ細胞を含有する、ステップを含み、それにより、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を産生する方法が本明細書に提示される。
特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法は、形質導入するステップの後に、形質導入されたヒト血液細胞またはそれに由来する細胞の集団を凍結保存するステップをさらに含む。特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法は、凍結保存するステップの後に、形質導入されたヒト血液細胞またはそれに由来する細胞の集団を解凍し、必要に応じて培養下で増大させるステップをさらに含む。凍結保存ステップおよび解凍ステップは、上記の第５．１．１節に記載されている通り実施することができる。
特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法は、形質導入するステップの後に、形質導入されたヒト血液細胞またはそれに由来する細胞の集団を培養下で増大させるステップであって、形質導入されたヒト血液細胞またはそれに由来する細胞の集団が凍結保存されていない、ステップをさらに含む。
ＴＣＲは、抗原ペプチドが結合した主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子の認識に関与するＴ細胞上の細胞表面分子である。パブリックＴＣＲは、多数の個体において検出される高度に相同な配列を有するペプチド特異的ＴＣＲである（Ｌｉら、２０１２年、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、２２巻：３３〜４２頁）。種々のヒトウイルスに対するパブリックＴＣＲが記載されている（Ａｒｇａｅｔら、１９９４年、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、１８０巻：２３３５〜２３４０頁；Ｗａｎｇら、２０１２年、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、４巻：１２８ｒａ１４２頁；Ｎｇｕｙｅｎら、２０１４年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９２巻：５０３９〜５０４９頁；Ｔｒａｕｔｍａｎｎら、２００５年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７５巻：６１２３〜６１３２頁）。
ＴＣＲをコードする核酸が形質導入されたヒト血液細胞の集団は、例えば、Ｓｔａｕｓｓら、２０１５年、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、２４巻：１１３〜１１８頁；ＳｈａｒｐｅおよびＭｏｕｎｔ、２０１５年、Ｄｉｓ Ｍｏｄｅｌ Ｍｅｃｈ、８巻：３３７〜３５０頁；Ｋｕｎｅｒｔら、２０１３年、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、４巻：３６３号；Ｓｔｏｎｅら、２０１２年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、５０３巻：１８９〜２２２頁；またはＰａｒｋら、２０１１年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２９巻：５５０〜５５７頁に記載されている通り、当技術分野で公知の任意の方法によって生成することができる。
ＴＣＲをコードする核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または核酸類似体であってよい。特定の実施形態では、そのような核酸は、ベクターの一部であってよい。特定の実施形態では、ベクターは、Ｔ細胞において本明細書に記載のＴＣＲのポリペプチドをコードする核酸の発現を導くことができる発現ベクターである。本明細書に記載のＴＣＲのポリペプチドをコードする核酸の発現を導くために適した発現ベクターの非限定的な例としては、これだけに限定されないが、合成ベクター、レンチウイルスベクター、複製欠損レトロウイルスベクター、自律複製プラスミドなどのプラスミドおよびウイルスベクターが挙げられる。特定の実施形態では、本明細書に記載のＴＣＲのポリペプチドをコードする核酸の発現を導くために使用される発現ベクターは、発現させる核酸に作動可能に連結した１つまたは複数の調節配列を含む。「作動可能に連結した」とは、目的の核酸が、調節配列（複数可）に、Ｔ細胞における核酸の発現が可能になる様式で連結していることを意味するものとする。調節配列は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。
本明細書に記載のＴＣＲのポリペプチドをコードする核酸、例えば、発現ベクターは、従来の形質転換またはトランスフェクション技法（例えば、ウイルス、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスによるトランスフェクションなど）によって宿主細胞に形質導入することができる。そのような技法としては、これだけに限定されないが、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈澱、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、および電気穿孔が挙げられる。本明細書に記載のＴＣＲのポリヌクレオチドをコードする核酸を含有する細胞は、当技術分野で公知の１つまたは複数の選択マーカーを使用して選択することができる。
５．１．３．ＣＡＲが形質導入されたＴＳＣＭ細胞を使用する方法
５．１．３．ＣＡＲが形質導入されたＴＳＣＭ細胞を使用する方法
別の態様では、病原体またはがんを有するかまたはその疑いがあるヒト患者への治療的投与のための抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法であって、ヒト血液細胞の集団に病原体またはがんの１つまたは複数の抗原を認識するＣＡＲをコードする核酸を形質導入するステップ（好ましくはヒト血液細胞の集団を３〜５日間培養した時点で）であって、ヒト血液細胞の集団が、少なくとも５０％のＴＳＣＭ細胞を含有する、ステップを含み、それにより、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を産生する方法が本明細書に提示される。形質導入は、培養下の３日目〜５日目に行うことが好ましく、これは、本明細書の実施例の節（すなわち、第６節）に示される通り、この時点が、ＴＳＣＭ細胞が最も高い増殖能力を示す時点だからである。
特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法は、形質導入するステップの後に、形質導入されたヒト血液細胞またはそれに由来する細胞の集団を凍結保存するステップをさらに含む。特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法は、凍結保存するステップの後に、形質導入されたヒト血液細胞またはそれに由来する細胞の集団を解凍し、必要に応じて培養下で増大させるステップをさらに含む。凍結保存ステップおよび解凍ステップは、上記の第５．１．１節に記載されている通り実施することができる。
特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法は、形質導入するステップの後に、形質導入されたヒト血液細胞またはそれに由来する細胞の集団を培養下で増大させるステップであって、形質導入されたヒト血液細胞またはそれに由来する細胞の集団が凍結保存されていない、ステップをさらに含む。
ＣＡＲは、抗原結合機能および免疫細胞活性化機能の両方をもたらす工学的に作製された受容体である（Ｓａｄｅｌａｉｎら、２０１３年、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、３巻：３８８〜３９８頁）。ＣＡＲは、通常、抗原結合性ドメイン（例えば、モノクローナル抗体または受容体の細胞外ドメインに由来するもの）、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインを含み、必要に応じて、共刺激ドメインを含む。ＣＡＲを使用して、抗原結合性ドメインの特異性をＴ細胞などの免疫細胞上に移植することができる。
ＣＡＲをコードする核酸が形質導入されたヒト血液細胞の集団は、例えば、Ｓｔａｕｓｓら、２０１５年、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、２４巻：１１３〜１１８頁；ＳｈａｒｐｅおよびＭｏｕｎｔ、２０１５年、Ｄｉｓ Ｍｏｄｅｌ Ｍｅｃｈ、８巻：３３７〜３５０頁；またはＰａｒｋら、２０１１年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２９巻：５５０〜５５７頁に記載されている通り、当技術分野で公知の任意の方法によって生成することができる。
ＣＡＲをコードする核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または核酸類似体であってよい。特定の実施形態では、そのような核酸は、ベクターの一部であってよい。特定の実施形態では、ベクターは、Ｔ細胞において本明細書に記載のＣＡＲのポリペプチドをコードする核酸の発現を導くことができる発現ベクターである。本明細書に記載のＣＡＲのポリペプチドをコードする核酸の発現を導くために適した発現ベクターの非限定的な例としては、これだけに限定されないが、合成ベクター、レンチウイルスベクター、複製欠損レトロウイルスベクター、自律複製プラスミドなどのプラスミドおよびウイルスベクターが挙げられる。特定の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲのポリペプチドをコードする核酸の発現を導くために使用される発現ベクターは、発現させる核酸に作動可能に連結した１つまたは複数の調節配列を含む。「作動可能に連結した」とは、目的の核酸が、調節配列（複数可）に、Ｔ細胞における核酸の発現が可能になる様式で連結していることを意味するものとする。調節配列は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。
本明細書に記載のＣＡＲのポリペプチドをコードする核酸、例えば、発現ベクターは、従来の形質転換またはトランスフェクション技法（例えば、ウイルス、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスによるトランスフェクションなど）によって宿主細胞に形質導入することができる。そのような技法としては、これだけに限定されないが、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈澱、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、および電気穿孔が挙げられる。本明細書に記載のＣＡＲのポリヌクレオチドをコードする核酸を含有する細胞は、当技術分野で公知の１つまたは複数の選択マーカーを使用して選択することができる。
５．１．４．ヒト血液細胞の集団
５．１．４．ヒト血液細胞の集団
本明細書に記載の抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法に従って使用されるヒト血液細胞の集団は、少なくとも５０％のＴＳＣＭ細胞を含有する。特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、少なくとも６０％のＴＳＣＭ細胞を含有する。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、少なくとも７０％のＴＳＣＭ細胞を含有する。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、少なくとも８０％のＴＳＣＭ細胞を含有する。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、少なくとも９０％のＴＳＣＭ細胞を含有する。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、少なくとも９５％のＴＳＣＭ細胞を含有する。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、少なくとも９９％のＴＳＣＭ細胞を含有する。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、１００％のＴＳＣＭ細胞を含有する。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、約５０〜７５％のＴＳＣＭ細胞を含有する。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、約７５〜９０％のＴＳＣＭ細胞を含有する。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、約９０〜１００％のＴＳＣＭ細胞を含有する。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、約９５〜１００％のＴＳＣＭ細胞を含有する。
一部の実施形態では、ＴＳＣＭ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ９５＋である。他の実施形態では、ＴＳＣＭ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋である。他の実施形態では、ＴＳＣＭ細胞は、ＣＤ３＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋である。他の実施形態では、ＴＳＣＭ細胞は、ＣＤ３＋ＣＣＲ７＋ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ９５＋である。他の実施形態では、ＴＳＣＭ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋である。他の実施形態では、ＴＳＣＭ細胞は、ＣＤ３＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２８＋ＣＤ９５＋である。他の実施形態では、ＴＳＣＭ細胞は、ＣＤ３＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ９５＋である。他の実施形態では、ＴＳＣＭ細胞は、ＣＤ３＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１２７＋ＣＤ９５＋である。他の実施形態では、ＴＳＣＭ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２７＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ９５＋である。他の実施形態では、ＴＳＣＭ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２７＋ＣＤ１２７＋ＣＤ１０３−ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ９５＋である。種々の実施形態では、ＴＳＣＭ細胞の細胞表面マーカー発現は、以下を満たす：（ｉ）ＣＤ３＋ＣＤ９５＋；（ｉｉ）ＣＤ４５ＲＯ−またはＣＤ４５ＲＡ＋、またはこれらの組合せ；および（ｉｉｉ）ＣＤ６２Ｌ＋、またはＣＣＲ７＋、またはＣＤ１２７＋、またはこれらの組合せ；および必要に応じて（ｉｖ）ＣＤ２８＋、またはＣＤ２７＋、またはＣＤ１０３−、またはこれらの組合せ。
種々の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、５０％未満のＴＮ細胞を含有する。特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、４０％未満のＴＮ細胞を含有する。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、３０％未満のＴＮ細胞を含有する。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、２０％未満のＴＮ細胞を含有する。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、１０％未満のＴＮ細胞を含有する。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、５％未満のＴＮ細胞を含有する。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、２％未満のＴＮ細胞を含有する。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、１％未満のＴＮ細胞を含有する。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、ＴＮ細胞を含有しない。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、約５０〜３０％のＴＮ細胞を含有する。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、約３０〜２０％のＴＮ細胞を含有する。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、約２０〜１０％のＴＮ細胞を含有する。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、約１０〜０％のＴＮ細胞を含有する。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、約１０〜５％のＴＮ細胞を含有する。別の特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、約５〜０％のＴＮ細胞を含有する。
一部の実施形態では、ＴＮ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ９５−である。他の実施形態では、ＴＮ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５−である。他の実施形態では、ＴＮ細胞は、ＣＤ３＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５−である。他の実施形態では、ＴＮ細胞は、ＣＤ３＋ＣＣＲ７＋ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ９５−である。他の実施形態では、ＴＮ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５−である。他の実施形態では、ＴＮ細胞は、ＣＤ３＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２８＋ＣＤ９５−である。他の実施形態では、ＴＮ細胞は、ＣＤ３＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ９５−である。他の実施形態では、ＴＮ細胞は、ＣＤ３＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１２７＋ＣＤ９５−である。他の実施形態では、ＴＮ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２７＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ９５−である。他の実施形態では、ＴＮ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２７＋ＣＤ１２７＋ＣＤ１０３−ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ９５−である。種々の実施形態では、ＴＮ細胞の細胞表面マーカー発現は、以下を満たす：（ｉ）ＣＤ３＋ＣＤ９５−；（ｉｉ）ＣＤ４５ＲＯ−またはＣＤ４５ＲＡ＋、またはこれらの組合せ；および（ｉｉｉ）ＣＤ６２Ｌ＋、またはＣＣＲ７＋、またはＣＤ１２７＋、またはこれらの組合せ；および必要に応じて（ｉｖ）ＣＤ２８＋、またはＣＤ２７＋、またはＣＤ１０３−、またはこれらの組合せ。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法は、ヒト血液細胞の集団をヒト細胞試料から引き出すステップをさらに含む。ヒト細胞試料は、ＴＳＣＭ細胞または培養下でＴＳＣＭ細胞になるように誘導することができる細胞、例えば、これだけに限定されないが、造血細胞試料、血液細胞試料、分画もしくは未分画全血試料、分画もしくは未分画アフェレーシス収集物（例えば、ｌｅｕｋｏｐａｋなどの白血球アフェレーシス収集物）、ＰＢＭＣ、またはＴ細胞集団（例えば、ＰＢＭＣから濃縮されたＴ細胞）などを含有する任意の細胞試料であってよい。特定の実施形態では、ヒト細胞試料は、ＰＢＭＣである。ＰＢＭＣは、血液試料からＰＢＭＣを単離するための当技術分野で公知の任意の方法、例えば、Ｋｏｅｈｎｅら、２０００年、Ｂｌｏｏｄ、９６巻：１０９〜１１７頁；Ｔｒｉｖｅｄｉら、２００５年、Ｂｌｏｏｄ、１０５巻：２７９３〜２８０１頁に記載されている；または下記の第６．２節に記載されているＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ遠心分離などによって血液試料から単離することができる。別の特定の実施形態では、ヒト細胞試料は、ＰＢＭＣに由来するＴ細胞が濃縮された集団である。Ｔ細胞は、血液試料またはＰＢＭＣからＴ細胞を濃縮するための当技術分野で公知の任意の方法によってＰＢＭＣから濃縮することができる。ＰＢＭＣからＴ細胞を濃縮するための非限定的な典型的方法は、Ｋｏｅｈｎｅら、２０００年、Ｂｌｏｏｄ、９６巻：１０９〜１１７頁；Ｔｒｉｖｅｄｉら、２００５年、Ｂｌｏｏｄ、１０５巻：２７９３〜２８０１頁；Ｈａｓａｎら、２００９年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８３巻：２８３７〜２８５０頁；およびＫｏｅｈｎｅら、２０１５年、Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２１巻：１６６３〜１６７８頁に見出すことができる。例えば、抗ＣＤ３抗体を使用してＰＢＭＣを選別することならびに／またはＰＢＭＣから接着性単球およびナチュラルキラー細胞を枯渇させることによってＰＢＭＣからＴ細胞を濃縮させることができる。
ヒト血液細胞の集団をヒト細胞試料から引き出すステップでは、ヒト細胞試料から少なくとも５０％のＴＳＣＭ細胞を含有するヒト血液細胞の集団を産生するための当技術分野における任意の公知の方法、例えば、これだけに限定されないが、ヒト細胞試料を選別してＴＳＣＭ細胞を選択すること、またはヒト細胞試料中の細胞をそれらがＴＳＣＭ細胞に変化するようにｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて再プログラミングすることなどを使用することができる。特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団をヒト細胞試料から引き出すステップは、ＴＳＣＭ細胞の細胞表面マーカーを発現する細胞の親和性選択（例えば、細胞表面マーカーに対する抗体を使用する）を含む。一部の実施形態では、ヒト血液細胞の集団をヒト細胞試料から引き出すステップは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によってヒト細胞試料からＴＳＣＭ細胞を選別することを含む。他の実施形態では、ヒト血液細胞の集団をヒト細胞試料から引き出すステップは、磁気分離によってヒト細胞試料からＴＳＣＭ細胞を選別することを含む。
特定の実施形態では、引き出すステップは、ヒト細胞試料からＴＳＣＭ細胞を濃縮することを含む。ＴＳＣＭ細胞は、それらを他のＴ細胞サブセットと区別するために使用することができる細胞表面マーカーのセットを示し、したがって、濃縮するステップは、ＴＳＣＭ細胞をそれらのマーカーに基づいて選択することを含み得る。特定の実施形態では、濃縮するステップは、ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ９５＋であるＴＳＣＭ細胞を選択することを含む。別の特定の実施形態では、濃縮するステップは、ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋であるＴＳＣＭ細胞を選択することを含む。別の特定の実施形態では、濃縮するステップは、ＣＤ３＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋であるＴＳＣＭ細胞を選択することを含む。別の特定の実施形態では、濃縮するステップは、ＣＤ３＋ＣＣＲ７＋ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ９５＋であるＴＳＣＭ細胞を選択することを含む。別の特定の実施形態では、濃縮するステップは、ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋であるＴＳＣＭ細胞を選択することを含む。別の特定の実施形態では、濃縮するステップは、ＣＤ３＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２８＋ＣＤ９５＋であるＴＳＣＭ細胞を選択することを含む。別の特定の実施形態では、濃縮するステップは、ＣＤ３＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ９５＋であるＴＳＣＭ細胞を選択することを含む。別の特定の実施形態では、濃縮するステップは、ＣＤ３＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１２７＋ＣＤ９５＋であるＴＳＣＭ細胞を選択することを含む。別の特定の実施形態では、濃縮するステップは、ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２７＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ９５＋であるＴＳＣＭ細胞を選択することを含む。別の特定の実施形態では、濃縮するステップは、ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２７＋ＣＤ１２７＋ＣＤ１０３−ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ９５＋であるＴＳＣＭ細胞を選択することを含む。種々の実施形態では、濃縮するステップは、細胞表面マーカー発現が、以下：（ｉ）ＣＤ３＋ＣＤ９５＋；（ｉｉ）ＣＤ４５ＲＯ−またはＣＤ４５ＲＡ＋、またはこれらの組合せ；および（ｉｉｉ）ＣＤ６２Ｌ＋、またはＣＣＲ７＋、またはＣＤ１２７＋、またはこれらの組合せ；および必要に応じて（ｉｖ）ＣＤ２８＋、またはＣＤ２７＋、またはＣＤ１０３−、またはこれらの組合せを満たす細胞を選択することを含む。
特定の実施形態では、引き出すステップは、ヒト細胞試料からＴＮ細胞を枯渇させることを含む。ナイーブＴ細胞（ＴＮ細胞）は、ＴＳＣＭ細胞とは細胞表面マーカーＣＤ９５の発現によって区別される。特定の実施形態では、枯渇させるステップは、ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ９５−である細胞を選択すること（すなわち、枯渇させるまたは排除すること）を含む。別の特定の実施形態では、枯渇させるステップは、ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５−である細胞を選択すること（すなわち、枯渇させるまたは排除すること）を含む。別の特定の実施形態では、枯渇させるステップは、ＣＤ３＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５−である細胞を選択すること（すなわち、枯渇させるまたは排除すること）を含む。別の特定の実施形態では、枯渇させるステップは、ＣＤ３＋ＣＣＲ７＋ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ９５−である細胞を選択すること（すなわち、枯渇させるまたは排除すること）を含む。別の特定の実施形態では、枯渇させるステップは、ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５−である細胞を選択すること（すなわち、枯渇させるまたは排除すること）を含む。別の特定の実施形態では、枯渇させるステップは、ＣＤ３＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２８＋ＣＤ９５−である細胞を選択すること（すなわち、枯渇させるまたは排除すること）を含む。別の特定の実施形態では、枯渇させるステップは、ＣＤ３＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ９５−である細胞を選択すること（すなわち、枯渇させるまたは排除すること）を含む。別の特定の実施形態では、枯渇させるステップは、ＣＤ３＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１２７＋ＣＤ９５−である細胞を選択すること（すなわち、枯渇させるまたは排除すること）を含む。別の特定の実施形態では、枯渇させるステップは、ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２７＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ９５−である細胞を選択すること（すなわち、枯渇させるまたは排除すること）を含む。別の特定の実施形態では、枯渇させるステップは、ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２７＋ＣＤ１２７＋ＣＤ１０３−ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ９５−である細胞を選択すること（すなわち、枯渇させるまたは排除すること）を含む。種々の実施形態では、枯渇させるステップは、細胞表面マーカー発現レベルが、以下：（ｉ）ＣＤ３＋ＣＤ９５−；（ｉｉ）ＣＤ４５ＲＯ−またはＣＤ４５ＲＡ＋、またはこれらの組合せ；および（ｉｉｉ）ＣＤ６２Ｌ＋、またはＣＣＲ７＋、またはＣＤ１２７＋、またはこれらの組合せ；および必要に応じて（ｉｖ）ＣＤ２８＋、またはＣＤ２７＋、またはＣＤ１０３−、またはこれらの組合せを満たす細胞を選択すること（すなわち、枯渇させるまたは排除すること）を含む。
好ましい実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、１つまたは複数の抗原について血清陽性であるヒトドナーに由来する。ある特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、１つまたは複数の抗原について血清反応陰性であるヒトドナーに由来する。
ヒトドナーは、成人（少なくとも１６歳）、青年（１２〜１５歳）、小児（１２歳未満）、または胎児であり得る。特定の実施形態では、ヒトドナーは、成人である。
「約」という用語は、通常の変動が許容されるように解釈される。
５．２．生成された抗原特異的Ｔ細胞を使用して患者を処置する方法
５．２．生成された抗原特異的Ｔ細胞を使用して患者を処置する方法
別の態様では、病原体またはがんを有するヒト患者を処置する方法であって、（ｉ）上記の第５．１節に記載されている方法に従って抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成するステップと、（ｉｉ）抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者に投与するステップとを含む方法が本明細書に提示される。
別の態様では、病原体またはがんを有するヒト患者を処置する方法であって、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者に投与するステップであって、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団が、上記の第５．１節に記載されている方法に従って抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成することを含む方法の産生物である、ステップを含む方法が本明細書に提示される。
特定の実施形態では、ヒト血液細胞の集団は、ヒト患者に対して同種異系であるヒトドナーに由来する。特定の実施形態では、ヒト患者は、移植ドナーからの移植のレシピエントであり、ヒトドナーは、移植ドナーとは異なる第三者ドナーである。別の特定の実施形態では、ヒト患者は、移植ドナーからの移植のレシピエントであり、ヒトドナーは、移植ドナーである。一部の実施形態では、移植は、末梢血幹細胞移植、骨髄移植、または臍帯血移植などの造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）である。他の実施形態では、移植は、腎移植、肝移植、心臓移植、腸移植、膵臓移植、肺移植、または小腸移植などの実質臓器移植である。
特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を投与するステップによりヒト患者においていかなる移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）も生じない。
５．２．１．投与および投与量
５．２．１．投与および投与量
抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の投与経路およびヒト患者に投与される量は、ヒト患者の状態および医師の知見に基づいて決定することができる。一般に、投与は、静脈内へのものである。ある特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の注入によるものである。特定の実施形態では、注入は、ボーラス静脈内注入である。
一部の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者にヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約１×１０５個未満またはそれと等しい用量で投与することを含む。特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者にヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約５×１０４個未満またはそれと等しい用量で投与することを含む。好ましい実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者にヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約１×１０４個未満またはそれと等しい用量で投与することを含む。別の特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者にヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約５×１０３個未満またはそれと等しい用量で投与することを含む。別の特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者にヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約１×１０３個未満またはそれと等しい用量で投与することを含む。別の特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、ヒト患者に、ヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約１×１０３〜５×１０３個の用量で投与することを含む。別の特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、ヒト患者に、ヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約５×１０３〜１×１０４個の用量で投与することを含む。別の特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、ヒト患者に、ヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約１×１０４〜５×１０４個の用量で投与することを含む。別の特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、ヒト患者に、ヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約５×１０４〜１×１０５個の用量で投与することを含む。
他の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、ヒト患者に、ヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞少なくとも１×１０５個である用量で投与することを含む。特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、ヒト患者に、ヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約５×１０５個である用量で投与することを含む。別の特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者にヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約１×１０６個である用量で投与することを含む。別の特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者にヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約２×１０６個である用量で投与することを含む。別の特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者にヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約３×１０６個である用量で投与することを含む。別の特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者にヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約４×１０６個である用量で投与することを含む。別の特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者にヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約５×１０６個である用量で投与することを含む。別の特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者にヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約６×１０６個である用量で投与することを含む。別の特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者にヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約１×１０７個である用量で投与することを含む。別の特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者にヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約１×１０５〜５×１０５個である用量で投与することを含む。別の特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者にヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約５×１０５〜１×１０６個である用量で投与することを含む。別の特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者にヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約１×１０６〜２×１０６個である用量で投与することを含む。別の特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者にヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約２×１０６〜５×１０６個である用量で投与することを含む。別の特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者にヒト患者１ｋｇ当たり抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約５×１０６〜１×１０７個である用量で投与することを含む。
ある特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、ヒト患者に、上記の用量で毎週投与することを含む。ある特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、ヒト患者に、上記の用量で週２回投与することを含む。ある特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、ヒト患者に、上記の用量で２週間に１回投与することを含む。ある特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、ヒト患者に、上記の用量で３週間に１回投与することを含む。
ある特定の実施形態では、投与するステップは、少なくとも２用量の、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者に投与することを含む。特定の実施形態では、投与するステップは、２用量、３用量、４用量、５用量、または６用量の、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者に投与することを含む。特定の実施形態では、投与するステップは、２用量の、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者に投与することを含む。別の特定の実施形態では、投与するステップは、３用量の、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者に投与することを含む。別の特定の実施形態では、投与するステップは、４用量の、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団をヒト患者に投与することを含む。
特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、少なくとも２週間連続して（例えば、２週間、３週間、４週間、５週間、または６週間連続して）１週間当たり１用量のサイクルを少なくとも２回（例えば、２回、３回、４回、５回、または６回）施行することを含み、各サイクルは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の用量を投与しない休薬期間によって隔てられる。特定の実施形態では、少なくとも２週間連続とは、２週間連続である。好ましい実施形態では、少なくとも２週間連続とは、３週間連続である。別の特定の実施形態では、少なくとも２週間連続とは、４週間連続である。別の特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、３週間連続して１週間当たり１用量のサイクルを２回、３回、４回、５回、または６回施行することを含み、各サイクルは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の用量を投与しない休薬期間によって隔てられる。別の特定の実施形態では、投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、３週間連続して１週間当たり１用量の第１のサイクル、その後、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の用量を投与しない休薬期間、その後、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、３週間連続して１週間当たり前記１用量の第２のサイクルを施行することを含む。特定の実施形態では、休薬期間は、少なくとも約１週間（例えば、約１〜６週間）である。特定の実施形態では、休薬期間は、約１週間、約２週間、約３週間、または約４週間である。特定の実施形態では、休薬期間は、約２週間である。好ましい実施形態では、休薬期間は、約３週間である。別の特定の実施形態では、休薬期間は、約４週間である。追加的なサイクルは、前のサイクルで毒性が示されていない（例えば、ＮＣＩ ＣＴＣＡＥ ４．０に従ってグレード付けして、グレード３〜５の重篤な有害事象がない）場合にのみ施行することが好ましい。
特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を投与するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を本明細書に記載の用量で毎週連続的に投与することを含む（すなわち、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団が投与されない週がない、したがって、休薬期間がない）。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の第１の投薬レジメンを第１の期間にわたって行い、その後、本明細書に記載の第２の異なる投薬レジメンを第２の期間にわたって行い、ここで、第１の期間および第２の期間は、必要に応じて休薬期間により隔てられる。特定の実施形態では、休薬期間は、少なくとも約１週間（例えば、約１〜６週間）である。特定の実施形態では、休薬期間は、約１週間、約２週間、約３週間、または約４週間である。特定の実施形態では、休薬期間は、約２週間である。好ましい実施形態では、休薬期間は、約３週間である。別の特定の実施形態では、休薬期間は、約４週間である。第２の投薬レジメンは、第１の投薬レジメンで毒性が示されていない（例えば、ＮＣＩ ＣＴＣＡＥ ４．０に従ってグレード付けして、グレード３〜５の重篤な有害事象がない）場合にのみ行うことが好ましい。
「約」という用語は、通常の変動が許容されるように解釈される。
５．２．２．異なる細胞集団を用いた段階的処置
５．２．２．異なる細胞集団を用いた段階的処置
ある特定の実施形態では、上記の病原体またはがんを有するヒト患者を処置する方法は、ヒト患者に上記の第５．１節に記載されている方法に従って生成された抗原特異的Ｔ細胞を含む第１の細胞の集団を投与した後、ヒト患者に上記の第５．１節に記載されている方法に従って生成された抗原特異的Ｔ細胞を含む第２の細胞の集団を投与することをさらに含み、抗原特異的Ｔ細胞を含む第２の細胞の集団内の抗原特異的Ｔ細胞は、ヒト患者の疾患細胞と共有する異なるＨＬＡ対立遺伝子（抗原特異的Ｔ細胞を含む第１の細胞の集団に含有される抗原特異的細胞が拘束されるＨＬＡ対立遺伝子とは異なる）によって拘束される。特定の実施形態では、病原体またはがんを有するヒト患者を処置する方法は、少なくとも２週間連続して（例えば、２週間、３週間、４週間、５週間、または６週間連続して）抗原特異的Ｔ細胞を含む第１の細胞の集団を、１週間当たり１用量の第１のサイクル、必要に応じて、その後、いかなる抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の用量も投与しない休薬期間、およびその後、少なくとも２週間連続して（例えば、２週間、３週間、４週間、５週間、または６週間連続して）抗原特異的Ｔ細胞を含む第２の細胞の集団を、１週間当たり１用量の第２のサイクルを施行することを含む。特定の実施形態では、休薬期間は、少なくとも約１週間（例えば、約１〜６週間）である。特定の実施形態では、休薬期間は、約１週間、約２週間、約３週間、または約４週間である。特定の実施形態では、休薬期間は、約２週間である。好ましい実施形態では、休薬期間は、約３週間である。ある特定の実施形態では、ヒト患者は、抗原特異的Ｔ細胞を含む第１の細胞の集団を投与した後、抗原特異的Ｔ細胞を含む第２の細胞の集団を投与する前に、応答を有さない、不完全な応答を有する、または最適以下の応答を有する（すなわち、ヒト患者は、処置を継続することが実質的に有益な可能性があるが、最適な長期間転帰の可能性は低い）。
抗原特異的Ｔ細胞を含む第１の細胞の集団および第２の細胞の集団は、それぞれ、上記の第５．２．１節に記載されている任意の経路および任意の投薬レジメンによって投与することができる。
特定の実施形態では、ヒト患者の疾患細胞と共有する異なるＨＬＡ対立遺伝子によってそれぞれ拘束される抗原特異的Ｔ細胞を含む２つの細胞の集団（すなわち、２つの細胞の集団内の抗原特異的Ｔ細胞が、ヒト患者の疾患細胞と共有する異なるＨＬＡ対立遺伝子によってそれぞれ拘束される）を段階的に投与する。特定の実施形態では、ヒト患者の疾患細胞と共有する異なるＨＬＡ対立遺伝子によってそれぞれ拘束される抗原特異的Ｔ細胞を含む３つの細胞の集団（すなわち、３つの細胞の集団内の抗原特異的Ｔ細胞が、ヒト患者の疾患細胞と共有する異なるＨＬＡ対立遺伝子によってそれぞれ拘束される）を段階的に投与する。特定の実施形態では、ヒト患者の疾患細胞と共有する異なるＨＬＡ対立遺伝子によってそれぞれ拘束される抗原特異的Ｔ細胞を含む４つの細胞の集団（すなわち、４つの細胞の集団内の抗原特異的Ｔ細胞が、ヒト患者の疾患細胞と共有する異なるＨＬＡ対立遺伝子によってそれぞれ拘束される）を段階的に投与する。特定の実施形態では、ヒト患者の疾患細胞と共有する異なるＨＬＡ対立遺伝子によってそれぞれ拘束される抗原特異的Ｔ細胞を含む４つよりも多くの細胞の集団（すなわち、４つよりも多くの細胞の集団内の抗原特異的Ｔ細胞が、ヒト患者の疾患細胞と共有する異なるＨＬＡ対立遺伝子によってそれぞれ拘束される）を段階的に投与する。
５．２．３．追加的な治療
５．２．３．追加的な治療
特定の実施形態では、病原体またはがんを有するヒト患者を処置する方法は、ヒト患者を、病原体またはがんに対する第２の治療を用いて並行して処置することをさらに含み、第２の治療は、本発明による抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、例えば、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団が投与されるのとほぼ同じ時間、同じ日、または同じ週、または同じ処置期間（処置サイクル）に、または同様の投薬スケジュールで、または異なるが重複する投薬スケジュールで用いた処置ではない。特定の実施形態では、病原体またはがんに対する第２の治療は、ヒト患者に対して細胞の集団がヒト患者に繰り返し投与されている期間にわたって並行して施行されない。特定の実施形態では、病原体またはがんを有するヒト患者を処置する方法は、投与するステップの前に、ヒト患者を、本発明による抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を用いた処置ではない、病原体またはがんに対する第２の治療を用いて処置するステップをさらに含む。
５．３．抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団およびそれらの特徴付け
５．３．抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団およびそれらの特徴付け
別の態様では、病原体またはがんを有するかまたはその疑いがあるヒト患者への治療的投与のための抗原特異的Ｔ細胞を含む単離された細胞の集団であって、上記の第５．１節に記載されている方法に従って抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成することを含む方法の産生物である、集団が本明細書に提示される。特定の実施形態では、病原体またはがんを有するかまたはその疑いがあるヒト患者への治療的投与のための抗原特異的Ｔ細胞を含む単離された細胞の集団であって、上記の第５．１節に記載されている方法に従って抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成することを含む方法の産生物であり、凍結保存されている、集団が本明細書に提示される。
特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む単離された細胞の集団は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む単離された細胞の集団は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む単離された細胞の集団は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の両方を含む。
養子免疫療法におけるヒト患者への治療的投与に適したものであるには、上記の第５．１節に記載されている方法によって生成された抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団は、（１）病原体またはがんの１つまたは複数の抗原に由来する１つまたは複数のペプチドまたはタンパク質が負荷されているまたはそれを発現するように遺伝子操作されている完全または部分的ＨＬＡ適合（ヒト血液細胞の集団のヒトドナーに対して）抗原提示細胞に対する実質的な細胞傷害性を示し、（２）実質的な同種異系反応性を欠き、かつ／または（３）ヒト患者の疾患細胞と共有するＨＬＡ対立遺伝子によって拘束される（すなわち、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団に含有される抗原特異的Ｔ細胞が、ヒト患者の疾患細胞と共有するＨＬＡ対立遺伝子によって拘束される）、かつ／もしくは、ヒト患者の疾患細胞と、少なくとも２つのＨＬＡ対立遺伝子（例えば、８つのＨＬＡ対立遺伝子のうち少なくとも２つ）を共有する（すなわち、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団に含有される抗原特異的Ｔ細胞が少なくとも２つのＨＬＡ対立遺伝子（例えば、８つのＨＬＡ対立遺伝子のうち少なくとも２つ）を共有する）ことが好ましい。したがって、細胞傷害性、同種異系反応性、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団が拘束されるＨＬＡ対立遺伝子（複数可）（すなわち、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団に含有される抗原特異的Ｔ細胞が拘束されるＨＬＡ対立遺伝子（複数可））、および／もしくは抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団のＨＬＡ割り当て（すなわち、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団に含有される抗原特異的Ｔ細胞のＨＬＡ割り当て）に関する情報を、ヒト患者への投与前に、当技術分野で公知の方法によって測定することが好ましい（例えば、Ｋｏｅｈｎｅら、２０００年、Ｂｌｏｏｄ、９６巻：１０９〜１１７頁；Ｔｒｉｖｅｄｉら、２００５年、Ｂｌｏｏｄ、１０５巻：２７９３〜２８０１頁；Ｈａｑｕｅら、２００７年、Ｂｌｏｏｄ、１１０巻：１１２３〜１１３１頁；Ｈａｓａｎら、２００９年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８３巻：２８３７〜２８５０頁；Ｆｅｕｃｈｔｉｎｇｅｒら、２０１０年、Ｂｌｏｏｄ、１１６巻：４３６０〜４３６７頁；Ｄｏｕｂｒｏｖｉｎａら、２０１２年、Ｂｌｏｏｄ、１２０巻：１６３３〜１６４６頁；Ｌｅｅｎら、２０１３年、Ｂｌｏｏｄ、１２１巻：５１１３〜５１２３頁；Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｕら、２０１４年、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、６巻：２４２ｒａ８３頁；Ｓｕｋｄｏｌａｋら、２０１３年、Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、１９巻：１４８０〜１４９２頁；Ｋｏｅｈｎｅら、２０１５年、Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２１巻：１６６３〜１６７８頁；または国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／０７３５５０号に記載されている方法）。
本明細書に記載の抗原特異的Ｔ細胞を含む複数の単離された細胞の集団を含む細胞バンクも本明細書に提示される。ヒト患者への治療的投与に適した抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を複数の中から選択することを容易にするために、細胞バンクに含有される、抗原特異的Ｔ細胞を含む複数の単離された細胞の集団のそれぞれについて、本明細書に記載の通り、細胞傷害性、同種異系反応性、ならびに／またはＨＬＡ拘束および／もしくは割り当てに関する情報を確認し、対応する抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の識別子と結びつけることが好ましい。
本明細書に記載の抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の前述の特徴付けの特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の効力を測定する種々の方法（例えば、細胞溶解を測定する代わりに、例えば、ＣＤ１０７脱顆粒またはＩＦＮ−γなどのサイトカインの放出を測定するアッセイなど）が細胞傷害性アッセイの代わりに使用されることが意図されている。
５．３．１．細胞傷害性
５．３．１．細胞傷害性
上記の第５．１節に記載されている方法によって生成された抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の、完全または部分的ＨＬＡ適合（ヒト血液細胞の集団のヒトドナーに対して）抗原提示細胞に対する細胞傷害性は、Ｔ細胞媒介性細胞傷害性を測定するための当技術分野で公知の任意のアッセイによって決定することができる。アッセイは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を直接使用して、その一定分量を使用して、または抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞傷害性を示す前駆細胞集団を使用して実施することができる。特定の実施形態では、細胞傷害性をＴｒｉｖｅｄｉら、２００５年、Ｂｌｏｏｄ、１０５巻：２７９３〜２８０１頁またはＨａｓａｎら、２００９年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８３巻：２８３７〜２８５０頁に記載されている標準の５１Ｃｒ放出アッセイによって決定する。
ある特定の実施形態では、上記の第５．１節に記載されている方法によって生成された抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団は、病原体またはがんの１つまたは複数の抗原に由来する１つまたは複数のペプチドまたはタンパク質が負荷されているまたはそれを発現するように遺伝子操作されている、完全または部分的ＨＬＡ適合抗原提示細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏにおける実質的な細胞傷害性を示す（例えば、その実質的な溶解を示す）。完全または部分的ＨＬＡ適合抗原提示細胞は、完全ＨＬＡ適合抗原提示細胞（例えば、ヒトドナーに由来する抗原提示細胞）であることが好ましい。特定の実施形態では、上記の第５．１節に記載されている方法によって生成された抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団は、病原体またはがんの１つまたは複数の抗原に由来する１つまたは複数のペプチドまたはタンパク質が負荷されているまたはそれを発現するように遺伝子操作されている完全または部分的ＨＬＡ適合抗原提示細胞の２０％よりも多く、２５％よりも多く、３０％よりも多く、３５％よりも多く、もしくは４０％よりも多く、または２０％、２５％、３０％、３５％、もしくは４０％の溶解を示す。特定の実施形態では、上記の第５．１節に記載されている方法によって生成された抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団は、病原体またはがんの１つまたは複数の抗原に由来する１つまたは複数のペプチドまたはタンパク質が負荷されているまたはそれを発現するように遺伝子操作されている完全または部分的ＨＬＡ適合抗原提示細胞の２０％よりも多くまたは２０％の溶解を示す。
細胞傷害性アッセイにおいて使用することができる抗原提示細胞としては、これだけに限定されないが、樹状細胞、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）−リンパ芽球、マクロファージ、抗体を生成するＢ細胞、ＥＢＶ−ＢＬＣＬ細胞、および人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）が挙げられる。
特定の実施形態では、細胞傷害性アッセイにおいて使用する完全または部分的ＨＬＡ適合抗原提示細胞は、病原体またはがんの１つまたは複数の抗原に由来するペプチドのプールが負荷されたものである。ペプチドのプールは、例えば、病原体またはがんの１つまたは複数の抗原の配列にわたりオーバーラップするペプチドのプール（例えば、ペンタデカペプチド）であってよい。
５．３．２．同種異系反応性
５．３．２．同種異系反応性
上記の第５．１節に記載されている方法によって生成された抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の同種異系反応性は、Ｔ細胞媒介性細胞傷害性を測定するための当技術分野で公知の細胞傷害性アッセイ、例えば、上記の第５．３．１節に記載されている通りの標準の５１Ｃｒ放出アッセイなどを使用して測定することができるが、病原体もしくはがんの１つもしくは複数の抗原に由来する１つもしくは複数のペプチドもしくはタンパク質が負荷されていないまたはそれを発現するように遺伝子操作されていない抗原提示細胞、および／またはＨＬＡ不適合（ヒト細胞の集団のヒトドナーに対して）抗原提示細胞を用いる。アッセイは、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を直接使用して、その一定分量を使用して、または抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の同種異系反応性を示す前駆細胞集団を使用して実施することができる。実質的な同種異系反応性を欠く抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団は、一般に、ヒト患者に投与された際に移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を生じさせない。
ある特定の実施形態では、上記の第５．１節に記載されている方法によって生成された抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団は、病原体またはがんの１つまたは複数の抗原に由来する１つまたは複数のペプチドまたはタンパク質が負荷されていないまたはそれを発現するように遺伝子操作されていない抗原提示細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏにおける実質的な細胞傷害性を欠く。好ましい実施形態では、そのような抗原提示細胞は、完全または部分的ＨＬＡ適合抗原提示細胞（ヒト血液細胞の集団のヒトドナーに対して）（例えば、ヒト血液細胞の集団のヒトドナーに由来する抗原提示細胞）である。特定の実施形態では、上記の第５．１節に記載されている方法によって生成された抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団は、病原体またはがんの１つまたは複数の抗原に由来する１つまたは複数のペプチドまたはタンパク質が負荷されていないまたはそれを発現するように遺伝子操作されていない抗原提示細胞の１５％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、または１％満、または１５％、１０％、５％、２％、または１％を溶解させる。特定の実施形態では、上記の第５．１節に記載されている方法によって生成された抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団は、病原体またはがんの１つまたは複数の抗原に由来する１つまたは複数のペプチドまたはタンパク質が負荷されていないまたはそれを発現するように遺伝子操作されていない抗原提示細胞の１０％未満または１０％を溶解させる。別の特定の実施形態では、上記の第５．１節に記載されている方法によって生成された抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団は、病原体またはがんの１つまたは複数の抗原に由来する１つまたは複数のペプチドまたはタンパク質が負荷されていないまたはそれを発現するように遺伝子操作されていない抗原提示細胞の５％未満または５％を溶解させる。
ある特定の実施形態では、上記の第５．１節に記載されている方法によって生成された抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団は、ＨＬＡ不適合（ヒト血液細胞の集団のヒトドナーに対して）抗原提示細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏにおける実質的な細胞傷害性を欠く。一部の実施形態では、そのような抗原提示細胞は、病原体またはがんの１つまたは複数の抗原に由来する１つまたは複数のペプチドまたはタンパク質が負荷されているまたはそれを発現するように遺伝子操作されている。他の実施形態では、そのような抗原提示細胞は、病原体またはがんの１つまたは複数の抗原に由来する１つまたは複数のペプチドまたはタンパク質が負荷されていないまたはそれを発現するように遺伝子操作されていない。特定の実施形態では、上記の第５．１節に記載されている方法によって生成された抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団は、ＨＬＡ不適合（ヒト血液細胞の集団のヒトドナーに対して）抗原提示細胞の１５％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、または１％未満、または１５％、１０％、５％、２％、または１％を溶解させる。特定の実施形態では、上記の第５．１節に記載されている方法によって生成された抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団は、ＨＬＡ不適合（ヒト血液細胞の集団のヒトドナーに対して）抗原提示細胞の１０％未満または１０％を溶解させる。別の特定の実施形態では、上記の第５．１節に記載されている方法によって生成された抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団は、ＨＬＡ不適合（ヒト血液細胞の集団のヒトドナーに対して）抗原提示細胞の５％未満または５％を溶解させる。
ある特定の実施形態では、上記の第５．１節に記載されている方法によって生成された抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団は、上記の通り、病原体またはがんの１つまたは複数の抗原に由来する１つまたは複数のペプチドまたはタンパク質が負荷されていないまたはそれを発現するように遺伝子操作されていない抗原提示細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏにおける実質的な細胞傷害性を欠き、かつ、上記の通り、ＨＬＡ不適合抗原提示細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏにおける実質的な細胞傷害性を欠く。
同種異系反応性アッセイにおいて使用することができる抗原提示細胞としては、これだけに限定されないが、樹状細胞、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）−リンパ芽球、マクロファージ、抗体を生成するＢ細胞、ＥＢＶ−ＢＬＣＬ細胞、および人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）が挙げられる。
５．３．３．ＨＬＡ型
５．３．３．ＨＬＡ型
上記の第５．１節に記載されている方法によって生成された抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団のＨＬＡ割り当て（すなわち、ＨＬＡ遺伝子座型）（すなわち、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団に含有される抗原特異的Ｔ細胞のＨＬＡ割り当て）および／または処置されるヒト患者の疾患細胞のＨＬＡ割り当ては、ＨＬＡ対立遺伝子をタイピングするための当技術分野で公知の任意の方法によって確認する（すなわち、タイピングする）ことができる。割り当ては、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を直接使用して、その一定分量を使用して、または抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団のＨＬＡ割り当てを示す前駆細胞集団を使用して実施することができる。ＨＬＡ割り当てを確認するための非限定的な典型的方法は、ＡＳＨＩ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第４．２版（２００３年）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ；ＡＳＨＩ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、補遺１（２００６年）および２（２００７年）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ；Ｈｕｒｌｅｙ、「ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ＨＬＡ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．」、Ｌｅｆｆｅｌｌら編、１９９７年、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｄｕｎｎ、２０１１年、Ｉｎｔ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ、３８巻：４６３〜４７３頁；Ｅｒｌｉｃｈ、２０１２年、Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ、８０巻：１〜１１頁；Ｂｏｎｔａｄｉｎｉ、２０１２年、Ｍｅｔｈｏｄｓ、５６巻：４７１〜４７６頁；およびＬａｎｇｅら、２０１４年、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１５巻：６３頁に見出すことができる。特定の実施形態では、少なくとも４つのＨＬＡ遺伝子座（好ましくは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、およびＨＬＡ−ＤＲ）をタイピングする。特定の実施形態では、４つのＨＬＡ遺伝子座（好ましくは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、およびＨＬＡ−ＤＲ）をタイピングする。別の特定の実施形態では、６つのＨＬＡ遺伝子座をタイピングする。別の特定の実施形態では、８つのＨＬＡ遺伝子座をタイピングする。
一般に、ＨＬＡタイピングには高分解能タイピングが好ましい。高分解能タイピングは、例えば、ＡＳＨＩ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第４．２版（２００３年）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ；ＡＳＨＩ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、補遺１（２００６年）および２（２００７年）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ；Ｆｌｏｍｅｎｂｅｒｇら、Ｂｌｏｏｄ、１０４巻：１９２３〜１９３０頁；Ｋｏｇｌｅｒら、２００５年、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、３６巻：１０３３〜１０４１頁；Ｌｅｅら、２００７年、Ｂｌｏｏｄ、１１０巻：４５７６〜４５８３頁；Ｅｒｌｉｃｈ、２０１２年、Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ、８０巻：１〜１１頁；Ｌａｎｋら、２０１２年、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１３巻：３７８号；またはＧａｂｒｉｅｌら、２０１４年、Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ、８３巻：６５〜７５頁に記載されている通り、当技術分野で公知の任意の方法によって実施することができる。
特定の実施形態では、処置されるヒト患者の疾患細胞のＨＬＡ割り当てを、疾患細胞の起源（例えば、場合によって、ヒト患者またはヒト患者に対する移植ドナー）をタイピングすることによって確認する。疾患細胞の起源は、当技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、可変縦列反復（ＶＴＲ）を分析することによって（異なる人の小さなＤＮＡ配列の独特のＤＮＡ署名を使用して移植のレシピエントとドナーを区別する方法）、または、移植のドナーおよびレシピエントが異性である場合にはＹ染色体の有無を探すことによって（細胞遺伝学またはＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）によって行う）決定することができる。
上記の第５．１節に記載されている方法によって生成された抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団が拘束されるＨＬＡ対立遺伝子（すなわち、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団に含有される抗原特異的Ｔ細胞が拘束されるＨＬＡ対立遺伝子）は、例えば、Ｔｒｉｖｅｄｉら、２００５年、Ｂｌｏｏｄ、１０５巻：２７９３〜２８０１頁；Ｂａｒｋｅｒら、２０１０年、Ｂｌｏｏｄ、１１６巻：５０４５〜５０４９頁；Ｈａｓａｎら、２００９年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８３巻：２８３７〜２８５０頁；Ｄｏｕｂｒｏｖｉｎａら、２０１２年、Ｂｌｏｏｄ、１２０巻：１６３３〜１６４６頁；または国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／０７３５５０号に記載されている通り、当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる。決定は、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を直接使用して、その一定分量を使用して、または抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団が拘束されるＨＬＡ対立遺伝子（すなわち、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団に含有される抗原特異的Ｔ細胞が拘束されるＨＬＡ対立遺伝子）を示す前駆細胞集団を使用して実施することができる。
一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団に含有される抗原特異的Ｔ細胞は、処置されるヒト患者の疾患細胞と共有するＨＬＡ対立遺伝子によって拘束される。他の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団に含有される抗原特異的Ｔ細胞は、処置されるヒト患者の疾患細胞と、少なくとも２つのＨＬＡ対立遺伝子（例えば、２つのＨＬＡ−Ａ対立遺伝子、２つのＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子、２つのＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子、および２つのＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子などの８つのＨＬＡ対立遺伝子のうち少なくとも２つ）を共有する。他の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団に含有される抗原特異的Ｔ細胞は、処置されるヒト患者の疾患細胞と共有するＨＬＡ対立遺伝子によって拘束され、また、処置されるヒト患者の疾患細胞と少なくとも２つのＨＬＡ対立遺伝子（例えば、２つのＨＬＡ−Ａ対立遺伝子、２つのＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子、２つのＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子、および２つのＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子などの８つのＨＬＡ対立遺伝子のうち少なくとも２つ）を共有する。
５．３．４．組成物およびキット
５．３．４．組成物およびキット
別の態様では、治療有効量の、本明細書に記載の抗原特異的Ｔ細胞を含む単離された細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が本明細書に提示される。好ましい実施形態では、医薬組成物は、凍結保存された形態である。
薬学的に許容される担体は、Ｔ細胞の貯蔵および／または治療的投与に適した任意の生理的に許容される溶液、例えば、１つまたは複数の凍結保存剤を含む、生理食塩溶液、緩衝生理食塩溶液、または生体適合性溶液（例えば、７％ＤＭＳＯ、５％ブドウ糖および１％デキストランを含有するリン酸緩衝食塩水；５％ＤＭＳＯおよび５％ヒト血清アルブミンを含有するｈｙｐｏｔｈｅｒｍｏｓｏｌ；１０％ＤＭＳＯおよび１６％ヒト血清アルブミンを含有する通常の生理食塩水；または１０％ＤＭＳＯおよび１５％ヒト血清アルブミンを含有する通常の生理食塩水）であってよい。
抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団は、医薬組成物として、長期間の貯蔵ならびに貯蔵および取扱いの利便性のために望ましい任意の濃度で貯蔵することができる。特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、医薬組成物として１ｍＬ当たり細胞約５×１０６個の濃度で貯蔵する。別の特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、医薬組成物として１ｍＬ当たり細胞約１０×１０６個の濃度で貯蔵する。別の特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、医薬組成物として１ｍＬ当たり細胞約２０×１０６個の濃度で貯蔵する。別の特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、医薬組成物として１ｍＬ当たり細胞約５０×１０６個の濃度で貯蔵する。別の特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、医薬組成物として１ｍＬ当たり細胞約１００×１０６個の濃度で貯蔵する。別の特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、医薬組成物として１ｍＬ当たり細胞約２００×１０６個の濃度で貯蔵する。別の特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、医薬組成物として１ｍＬ当たり細胞約５００×１０６個の濃度で貯蔵する。別の特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、医薬組成物として１ｍＬ当たり細胞約１〜１０×１０６個の濃度で貯蔵する。別の特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、医薬組成物として１ｍＬ当たり細胞約１０〜１００×１０６個の濃度で貯蔵する。別の特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、医薬組成物として１ｍＬ当たり細胞約１００〜１０００×１０６個の濃度で貯蔵する。
１つまたは複数の容器中に本明細書に記載の医薬組成物を含むキットも本明細書に提示される。特定の実施形態では、キットは、病原体感染症またはがんを処置するための第２の化合物または生物学的製品を含む第２の医薬組成物をさらに含む。
必要に応じて、そのような１つまたは複数の容器には医薬品または生物学的産生物の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態の通知が付随してよく、この通知は、ヒト投与のための製造、使用または販売の機関による認可を反映するものである。
本明細書に包含される医薬組成物およびキットは、本開示に提示されている通り、ヒト患者を処置する方法に従って使用することができる。
５．４．抗原特異性および患者
５．４．抗原特異性および患者
病原体の１つまたは複数の抗原は、上に開示される通り、その発現が病原体に独特である１つまたは複数のペプチドまたはタンパク質であり得る。
病原体は、ウイルス、細菌、真菌、蠕虫または原生生物であり得る。一部の実施形態では、病原体は、ウイルスである（例えば、潜伏期を有するウイルスなど）。特定の実施形態では、ウイルスは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）である。特定の実施形態のある態様では、ＣＭＶの１つまたは複数の抗原は、ＣＭＶ ｐｐ６５、ＣＭＶ ＩＥ１、またはこれらの組合せである。特定の実施形態の別の態様では、ＣＭＶの１つまたは複数の抗原は、ＣＭＶ ｐｐ６５である。
別の特定の実施形態では、ウイルスは、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）である。特定の実施形態のある態様では、ＥＢＶの１つまたは複数の抗原は、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ３Ａ、ＥＢＮＡ３Ｂ、ＥＢＮＡ３Ｃ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、またはこれらの組合せである。特定の実施形態の別の態様では、ＥＢＶの１つまたは複数の抗原は、ＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、またはこれらの組合せである。
別の特定の実施形態では、ウイルスは、ＢＫウイルス（ＢＫＶ）、Ｊｏｈｎ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）、ヘルペスウイルス（例えば、ヒトヘルペスウイルス−６もしくはヒトヘルペスウイルス−８など）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、ポックスウイルス、ラブドウイルス、またはパラミクソウイルスである。別の実施形態では、ウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、またはメルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）である。
本明細書に記載の抗原特異的細胞を含む細胞の集団を生成する方法の特定の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップは、ヒト血液細胞の集団を、本明細書に記載の病原体の１つまたは複数の抗原にｅｘ ｖｉｖｏ感作させることを含む。本明細書に記載の抗原特異的細胞を含む細胞の集団を生成する方法の特定の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップは、ヒト血液細胞の集団を、ＣＭＶの１つまたは複数の抗原にｅｘ ｖｉｖｏ感作させることを含む。別の本明細書に記載の抗原特異的細胞を含む細胞の集団を生成する方法の特定の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップは、ヒト血液細胞の集団を、ＥＢＶの１つまたは複数の抗原にｅｘ ｖｉｖｏ感作させることを含む。別の本明細書に記載の抗原特異的細胞を含む細胞の集団を生成する方法の特定の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ感 作ステップは、ヒト血液細胞の集団を、ＢＫＶ、ＪＣＶ、ヘルペスウイルス（例えば、ヒトヘルペスウイルス−６またはヒトヘルペスウイルス−８など）、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、ポックスウイルス、ラブドウイルス、またはパラミクソウイルスの１つまたは複数の抗原にｅｘ ｖｉｖｏ感作させることを含む。
本明細書に記載のヒト患者を処置する方法の特定の実施形態では、ヒト患者は、病原体による感染を有する。本明細書に記載のヒト患者を処置する方法の一部の実施形態では、ヒト患者は、ＣＭＶ感染症（例えば、ＣＭＶウイルス血症、ＣＭＶ網膜炎、ＣＭＶ肺炎、ＣＭＶ肝炎、ＣＭＶ大腸炎、ＣＭＶ脳炎、ＣＭＶ髄膜脳炎、ＣＭＶ陽性髄膜腫（ｍｅｎｉｎｇｏｍａ）、またはＣＭＶ陽性多形神経膠芽腫）を有する。本明細書に記載のヒト患者を処置する方法の他の実施形態では、ヒト患者は、ＥＢＶ感染に起因するＥＢＶ陽性リンパ球増殖性障害（ＥＢＶ−ＬＰＤ）（例えば、ＥＢＶ陽性移植後リンパ増殖性障害）、例えば、Ｂ細胞過形成、リンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、例えば高齢者におけるものなど）、Ｔ細胞リンパ腫、ＥＢＶ陽性ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫）、多形性または単形性ＥＢＶ−ＬＰＤ、自己免疫性リンパ増殖性症候群、または混合型ＰＴＬＤ（移植後リンパ増殖性障害）などを有する。本明細書に記載のヒト患者を処置する方法の他の実施形態では、ヒト患者は、ＥＢＶ陽性上咽頭癌を有する。本明細書に記載のヒト患者を処置する方法の他の実施形態では、ヒト患者は、ＥＢＶ陽性胃がんを有する。本明細書に記載のヒト患者を処置する方法の他の実施形態では、ヒト患者は、ＥＢＶ＋平滑筋肉腫を有する。本明細書に記載のヒト患者を処置する方法の他の実施形態では、ヒト患者は、ＥＢＶ陽性ＮＫ／Ｔリンパ腫を有する。
他の実施形態では、病原体は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓなどの細菌である。
上に開示されるがんの１つまたは複数の抗原は、がん性細胞（対応する型のがんの）における発現が非がん性細胞と比べて高い１つまたは複数のペプチドまたはタンパク質であってもよく、がん性細胞（対応する型のがんの）において非がん性細胞と比べて一意的に発現する１つまたは複数のペプチドまたはタンパク質であってもよい。
がんは、例えば、これだけに限定されないが、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリー細胞白血病、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、大顆粒リンパ球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、形質細胞白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、または多発性骨髄腫などの血液がんであってよい。特定の実施形態では、がんは、多発性骨髄腫または形質細胞白血病である。特定の実施形態のある態様では、がんの１つまたは複数の抗原は、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）である。
がんはまた、これだけに限定されないが、肉腫、癌腫、リンパ腫、胚細胞性腫瘍、または芽細胞腫を含めた固形腫瘍がんであってもよい。固形腫瘍がんは、例えば、これだけに限定されないが、乳がん、肺がん、卵巣がん、胃がん、膵臓がん、喉頭がん、食道がん、精巣がん、肝臓がん、耳下腺がん、胆道がん、結腸がん、直腸がん、子宮頸がん、子宮がん、子宮内膜がん、腎臓がん、膀胱がん、前立腺がん、甲状腺がん、脳がん、または皮膚がんなどであってよい。
本明細書に記載の抗原特異的細胞を含む細胞の集団を生成する方法の特定の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップは、ヒト血液細胞の集団を本明細書に記載のがんの１つまたは複数の抗原にｅｘ ｖｉｖｏ感作させることを含む。本明細書に記載の抗原特異的細胞を含む細胞の集団を生成する方法の特定の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップは、ヒト血液細胞の集団をＷＴ１にｅｘ ｖｉｖｏ感作させることを含む。
本明細書に記載のヒト患者を処置する方法の特定の実施形態では、ヒト患者は、本明細書に記載のがんを有する。本明細書に記載のヒト患者を処置する方法の一部の実施形態では、ヒト患者は、多発性骨髄腫または形質細胞白血病（例えば、ＷＴ１陽性多発性骨髄腫または形質細胞白血病）を有する。
特定の実施形態では、ヒト患者は、成人（少なくとも１６歳）である。別の特定の実施形態では、ヒト患者は、青年（１２〜１５歳）である。別の特定の実施形態では、患者は、小児（１２歳未満）である。
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を用いて処置されるヒト患者は、病原体またはがんに対する以前の治療が、以前の治療に対する抵抗性または不耐性に起因して失敗しており、ここで、以前の治療は、本発明による抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を用いた処置ではない。疾患は、治療後に、応答を有さない、または不完全な応答（完全寛解未満の応答）を有する、または進行した、または再燃した場合、その治療に対して抵抗性であると考えられる。以前の治療は、場合によって、当技術分野で公知の抗ウイルス剤（例えば、抗ウイルス薬もしくは抗体）、または、当技術分野で公知の抗がん療法（例えば、化学療法もしくは放射線療法であり得る。
本明細書に提示されるある特定の実施形態は、幹細胞様メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ細胞）が養子免疫療法用の抗原特異的Ｔ細胞を生成するためのＴ細胞の有利な供給源であることを実証する以下の非限定的な実施例によって例示される。本明細書に記載されている結果から、Ｔｅｔ＋ＴＮ細胞ではなくＴｅｔ＋ＴＳＣＭ細胞が、循環中の免疫優性Ｔ細胞の迅速な再増殖の主要なレザバーであることが示唆される。
６．１．概要
６．１．概要
潜伏ＣＭＶ感染症は、ウイルスペプチドに特異的な免疫優性Ｔ細胞の限られたレパートリーによって制御される。メモリーＴ細胞の維持および周期的なウイルス再活性化に応答したメモリーＴ細胞の再増殖に関与する抗原特異的Ｔ細胞サブセットは、不明なままである。本明細書に記載のこの実施例では、ＣＭＶ ｐｐ６５に特異的なＴ細胞を、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１血清陽性ヒトドナーの血液から単離されたナイーブＴ細胞（ＴＮ細胞）サブセット、幹細胞様メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ細胞）サブセット、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）サブセットおよびエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞）サブセットから生成し、これらのサブセットのそれぞれに由来するＮＬＶ−ＨＬＡ−Ａ＊０２０１四量体（Ｔｅｔ）＋Ｔ細胞を比較的に特徴付けた。ｉｎ ｖｉｔｒｏ感作後、Ｔｅｔ＋Ｔ細胞をＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ９５−ＴＮ細胞およびＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ９５＋ＴＳＣＭ細胞、ならびにＴＣＭ細胞およびＴＥＭ細胞から規則的に生成した。ＴＮサブセット、ＴＳＣＭサブセット、ＴＣＭサブセットおよびＴＥＭサブセットのそれぞれに由来するＴｅｔ＋Ｔ細胞により、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびグランザイムＢが生成された。各サブセットに由来するＴｅｔ＋Ｔ細胞はまた、同様のレベルのＰＤ−１およびＫＬＲＧ−１も発現した。しかし、ＴＮサブセットに由来するＴｅｔ＋Ｔ細胞およびＴＳＣＭサブセットに由来するＴｅｔ＋Ｔ細胞はＴＣＭサブセットまたはＴＥＭサブセットに由来するＴｅｔ＋Ｔ細胞よりも高いレベルのＣＤ２７およびより低いレベルのＣＤ５７を発現した。ＴＳＣＭサブセットに由来するＴｅｔ＋Ｔ細胞は、ＴＮサブセットに由来するＴｅｔ＋Ｔ細胞、ＴＣＭサブセットに由来するＴｅｔ＋Ｔ細胞およびＴＥＭサブセットに由来するＴｅｔ＋Ｔ細胞とは、増殖のレベルが有意に高いことによって、ならびに、それらにより、血液中のＴＥＭおよびＴＣＭによって発現されるものと配列が同一であるＴＣＲを有するＮＬＶ特異的Ｔ細胞が迅速かつ選択的に増大することによって区別された。本明細書に記載の実施例により、Ｔｅｔ＋ＴＮ細胞ではなくＴｅｔ＋ＴＳＣＭ細胞が、循環中の免疫優性Ｔ細胞の迅速な再増殖の主要なレザバーであることが示唆される。
６．２．材料および方法
６．２．１．ドナー
６．２．材料および方法
６．２．１．ドナー
血液試料を健康な志願者ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋ＣＭＶ血清陽性ドナー１２名から得た。標準の高分解能タイピング技法を使用してＨＬＡ対立遺伝子特異的ヌクレオチド配列を解析することによって高分解能ＨＬＡタイピングを実施した。ＣＭＶ血清状態を、Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒの臨床微生物学研究室において標準の血清学的技法によって決定した。
６．２．２．ＣＭＶ特異的Ｔ細胞の生成
６．２．２．ＣＭＶ特異的Ｔ細胞の生成
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を全血からＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配分離（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ ＵＳＡ）によって単離し、これらから、ｍＡｂでコーティングした免疫磁気ビーズ（Ｐａｎ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ ＵＳＡ）を使用してＣＤ１９＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、およびＣＤ５６＋細胞を枯渇させることによってＴ細胞を濃縮した。濃縮されたＴ細胞を、蛍光Ａｂ：抗ＣＤ３ ＰｅｒＣＰ、抗ＣＤ４５ＲＯ ＰＥ、抗ＣＤ９５ ＡＰＣ、抗ＣＤ６２Ｌ ＦＩＴＣ（全てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した）、および抗ＣＤ４５ＲＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）で標識した。ＴＮ細胞、ＴＳＣＭ細胞、ＴＣＭ細胞およびＴＥＭ細胞を表すＴ細胞集団を、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ−ＩＩ ＳＯＲＴ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で以下のマーカーに基づいてゲーティングし、選別した：ＴＳＣＭ集団、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５＋、ＴＮ集団、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５−、ならびにＴＣＭ集団およびＴＥＭ集団、それぞれＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ−。次いで、選別されたＴ細胞サブセット（１×１０６）を照射ＨＬＡ−Ａ０２０１＋およびＣＭＶ ｐｐ６５＋人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）（０．１×１０６）に以前に記載されている通り感作させ（Ｈａｓａｎら、２００９年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８３巻：２８３７〜２８５０頁）、フィーダー細胞として照射自己由来ＰＢＭＣ（２×１０６）の存在下、ゲンタマイシン（Ｌｏｎｚａ、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ ＮＪ、ＵＳＡ）および１５％熱失活ヒト血清（Ｇｅｍｉｎｉ、ＣＡ、ＵＳＡ）を伴う培養培地Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１５、加湿したインキュベーター中、３７℃および５％ＣＯ２でさらに培養した。Ｔ細胞に、培養開始後４日目および７日目にＩＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍｌ）を補充し、１０日毎にＡＡＰＣおよび自己由来ＰＢＭＣフィーダーを用いて再刺激した。１２日後、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）をＴ細胞培養物に２日に１回補充した。
６．２．３．四量体分析による抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の定量化
６．２．３．四量体分析による抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の定量化
培養したＴ細胞内のＮＬＶペプチドに対して応答性のＣＭＶ ｐｐ６５特異的Ｔ細胞を以前に記載されている通り四量体分析によって列挙した（Ｈａｓａｎら、２００９年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８３巻：２８３７〜２８５０頁）。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＡ＊２４０２を有するペプチド配列ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１）およびＱＹＤＰＶＡＡＬＦ（配列番号２）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）に対する市販のＣＭＶ ｐｐ６５ ＭＨＣ−ペプチド四量体を使用した。簡単に述べると、Ｔ細胞を、ＣＤ３ ＦＩＴＣ、ＣＤ８ ＰＥ、ＣＤ４ ＰｅｒＣＰ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＡＰＣとコンジュゲートした四量体複合体と一緒に氷上で２０分インキュベートし、洗浄し、４色性能のためのデュアルレーザーを備えたＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用してＦＡＣＳによって分析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用してデータを解析した。Ｔ細胞をＣＤ３陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞でゲーティングして、四量体陽性ＣＤ８＋Ｔリンパ球の百分率を決定した。
６．２．４．Ｔ細胞サブセットの表現型解析
６．２．４．Ｔ細胞サブセットの表現型解析
Ｔ細胞サブセットを、特定のＴ細胞メモリーおよび共刺激マーカーを使用したフローサイトメトリーによってさらに特徴付けた。Ｔ細胞を、蛍光抗体ＣＣＲ７ ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ２７ ＦＩＴＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ＣＤ５７ ＦＩＴＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ＣＤ１２７ ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ＣＤ２８ ＰＥＣｙ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＫＬＲＧ１ ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）およびＰＤ１ ＰＥＣｙ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で標識し、ＦＡＣＳによって分析した。前方散乱（ＦＳＣ）対側方散乱（ＳＳＣ）でゲーティングし、その後、ＦＳＣ（高さ）対ＦＳＣ（面積）でゲーティングすることによってリンパ球についてのダブレット除去を実現した。
６．２．５．抗原特異的Ｔ細胞の機能的特徴付け
６．２．５．抗原特異的Ｔ細胞の機能的特徴付け
Ｔ細胞の機能活性を、簡潔な二次刺激後に、細胞内サイトカイン（ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α）の分泌、活性化マーカー発現（ＣＤ１３７）、および細胞傷害性（ＣＤ１０７ａ）を含めたいくつかのパラメータを使用して細胞内蛍光染色によって評価した。抗体は全てＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１）ペプチドを負荷した照射自己由来Ｂリンパ芽球様細胞株細胞（ＢＬＣＬ細胞）をＴ細胞とエフェクター対標的比１：５、１μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で１６時間共インキュベートした。次いで、共培養したＴ細胞を抗ＣＤ３ ＡＰＣおよび抗ＣＤ８ ＰＥを用いて室温で１５分にわたって標識し、洗浄し、次いで、Ｐｅｒｍ溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて透過処理し、次いで、抗ＩＦＮ−γ ＰＥＣｙ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および抗ＴＮＦ−α ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、または抗ＣＤ１３７ ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、または抗ＣＤ１０７ａ ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共インキュベートした。
６．２．６．Ｔ細胞増殖およびアポトーシスの分析
６．２．６．Ｔ細胞増殖およびアポトーシスの分析
ＥｄＵ標識（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してＴ細胞増殖を評価した。１０μＭのＥｄＵを培養培地に添加し、３７℃で１時間置いた。標識された細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｔ細胞培養培地に再浮遊させた。次いで、Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって分析し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を使用し、ＥｄＵ＋でゲーティングされたＴ細胞の百分率によって増殖しているＴ細胞の割合を決定した。アポトーシス性Ｔ細胞をアネキシンＶ染色（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって定義した。
６．２．７．ＴＣＲ次世代配列決定
６．２．７．ＴＣＲ次世代配列決定
刺激後０日目、１５日目または３０日目からの、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって単離したＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞サブセット（ＴＮ、ＴＳＣＭ、ＴＣＭ、およびＴＥＭ）（純度＞９５％）またはこれらのサブセットに由来するＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞から抽出したＤＮＡからＴ細胞受容体Ｖβ（ＴＣＲＶβ）鎖超可変相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を増幅し、Ａｄａｐｔｉｖｅ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにおいてｉｍｍｕｎｏＳＥＱプラットフォームを使用して配列決定した。ｉｍｍｕｎｏＳＥＱ有効アルゴリズムに従って、再構成されたＣＤＲ３配列がフレームシフトまたは中途終止コドンをもたらす挿入または欠失を含む場合にはそれらを非生産的と分類し、その後の分析から排除した。０〜１の範囲で、小さい数字により多様性が大きいことが示され、大きい数字によりクローン性が大きいことが示されるｉｍｍｕｎｏＳＥＱ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２．０を使用し、試料中のＴＣＲクローン性および試料のオーバーラップを決定した。試料のオーバーラップにより試料型の対内での同様のクローンのパーセントが示される。
６．２．８．統計解析
６．２．８．統計解析
統計解析を、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して実施した。比較の大部分については、ノンパラメトリックマン・ホイットニー検定を使用して、２つの群を比較した。一元配置ＡＮＯＶＡを使用して３つまたはそれよりも多くの群を比較した。２つの群間の差異の有意性はｔ検定（α＝０．０５）を使用して算出した。全ての比較について、両側Ｐ値を使用した；示されている場合、＊Ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５。
６．３．結果
６．３．１．健康な血清陽性ドナー由来のＰＢＭＣ内のＣＭＶ ｐｐ６５特異的ＴＳＣＭ細胞の検出および単離
６．３．結果
６．３．１．健康な血清陽性ドナー由来のＰＢＭＣ内のＣＭＶ ｐｐ６５特異的ＴＳＣＭ細胞の検出および単離
Ｇａｔｔｉｎｏｎｉら（２０１１年、Ｎａｔ Ｍｅｄ、１７巻：１２９０〜１２９７頁）により、ヒトＰＢＭＣ内のＴＳＣＭ細胞が、腫瘍特異的キメラ抗原受容体を発現するように改変すると優れた機能活性も示す、高い増殖性潜在性を有するメモリーＴ細胞の特異的なサブセットであることが最初に記載された。ｉｎ ｖｉｖｏで初回刺激されたウイルス特異的ヒトＴＳＣＭ細胞がこれらの特質も示すかどうかを試験するために本明細書に記載のこの実施例を設計した。Ｔ細胞を健康なＨＬＡ Ａ０２０１＋ＣＭＶ血清陽性ドナー１２名のＰＢＭＣから単離した。これらのＣＭＶ血清陽性ドナーのそれぞれにおいて、ＴＳＣＭ集団をＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５＋細胞として同定し、ＴＮ集団をＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５−細胞として同定し、ＴＣＭ集団およびＴＥＭ集団をそれぞれＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞およびＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ−細胞として同定した（図１）。いかなるｉｎ ｖｉｔｒｏにおける刺激も不在下で、ＴＳＣＭ細胞の割合は末梢血中のＴ細胞集団内で１．２％〜１０．８％にわたった。ＰＢＭＣ内の割合が低いにもかかわらず、試験した全てのドナーにおいてＴＳＣＭ細胞を一貫して同定することができた（ｎ＝１２）。比較すると、ＴＮ細胞、ＴＣＭ細胞およびＴＥＭ細胞の割合は、それぞれ３．８％〜２８．９％、１．７％〜３２．４％および１５．４％〜３４．９％であった（表１）。
表１．健康なＣＭＶ血清陽性個体におけるナイーブおよびメモリーＴＮ、ＴＳＣＭ、ＴＣＭおよびＴＥＭ ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率（ＮＤ＝検出できず； ＮＡ＝該当なし）
次いで、ＣＭＶ ｐｐ６５をモデル抗原として使用して抗原特異的Ｔ細胞のメモリー表現型を試験した。したがって、１２ドナーのうち１１ドナーの血液中のＣＭＶ ｐｐ６５特異的Ｔ細胞集団を評価した。試験したドナーのそれぞれにおいて、ＨＬＡ−Ａ０２０１によって提示される周知のＣＭＶ ｐｐ６５エピトープＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１）に対して応答性のＨＬＡペプチド四量体を使用して、抗原特異的Ｔ細胞の別個の集団を同定することができた。これらの四量体陽性Ｔ細胞のさらなる分析により、ＮＬＶエピトープを認識する末梢血中の大多数のメモリーＴ細胞がＴＣＭ表現型またはＴＥＭ表現型のいずれかを有し（それぞれ０．９％〜３１％および１５．１％〜７０．６％）および残りはエフェクターＴ細胞であることが実証された（表１）。次いで、健康なドナーの末梢血中を、同じく抗原特異的なＴＳＣＭ細胞の集団が循環しているかどうかを決定した。全部で１１ドナーのうち１０ドナーがＣＤ９５＋ナイーブＴ細胞前駆体（ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ６２Ｌ＋）内にＡ２−ＮＬＶ四量体に結合することができるＴＳＣＭ細胞の別個の集団を有した（０．６％〜８．３％）（表１）。
他の試験により、ナイーブＴ細胞区画に由来する臍帯血ドナー由来のＣＭＶ特異的Ｔ細胞を生成することの実現性が実証された（Ｈａｎｌｅｙら、２０１５年、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、７巻：２８５ｒａ２６３頁；Ｓｚａｂｏｌｃｓ、２０１１年、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ、４９巻：５６〜６９頁）。したがって、ＣＤ９５陰性ナイーブＴ細胞内のＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞の割合を試験した。しかし、末梢血中のＮＬＶ−Ｔｅｔ＋集団内のＴＮ細胞は、１１ドナーのうち２ドナーでしか検出することができなかった。総合すると、データから、ＮＬＶ−四量体結合性ＣＤ８＋Ｔ細胞はＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ６２Ｌ＋区画内に軽微な割合で存在し、ＣＤ９５＋ＴＳＣＭ細胞およびＣＤ９５−ＴＮ細胞の両方からなることが示唆される。
６．３．２．エピトープ特異的ＴＳＣＭ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて首尾よく増大させ、抗原特異的刺激中に分化の程度が低いメモリー表現型を維持することができる
６．３．２．エピトープ特異的ＴＳＣＭ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて首尾よく増大させ、抗原特異的刺激中に分化の程度が低いメモリー表現型を維持することができる
次に、これらの健康な潜在的に無関係の血清陽性ドナーにおいて検出されたメモリーＴ細胞集団のいずれが、二次攻撃時に抗原特異的Ｔ細胞が生成されるＴ細胞免疫のレザバーとしての機能を果たすかを評価した。ＣＭＶ特異的ＴＳＣＭ細胞の、増大し、耐久性のあるＴ細胞レザバーとしての機能を果たす潜在性を比較評価することが特に望ましかった。これらの試験のために、ヒトＰＢＭＣ由来の全てのメモリーＴ細胞区画からＣＭＶ ｐｐ６５特異的Ｔ細胞を増大させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏ系を展開した。ＴＳＣＭ細胞集団、ＴＮ細胞集団、ＴＣＭ細胞集団およびＴＥＭ細胞集団を上記のＨＬＡ−Ａ＊０２０１ ＣＭＶ血清陽性ドナーから発現マーカーＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ９５を使用してＦＡＣＳにより選別した。次いで、選別されたＴ細胞サブセットをＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＣＭＶ ｐｐ６５および以前に記載されているＴ細胞共刺激分子を排他的に発現する人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）に感作させた（Ｈａｓａｎら、２００９年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８３巻：２８３７〜２８５０頁）。次いで、この手法を改変して、以前に記載されている通り４日目に開始して２日毎に培養物にＩＬ−７およびＩＬ−１５を補充することを含めた（Ｃｉｅｒｉら、２０１３年、Ｂｌｏｏｄ、１２１巻：５７３〜５８４頁）。
この方法をＴＳＣＭ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ感作のために使用して、代表的な１ドナーについて示されている通り、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ ＮＬＶ−四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、０日目の０．６％から７日間で５．５％まで濃縮することができた（図２Ａ）。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ＮＬＶ−四量体＋Ｔ細胞の同様の濃縮がＴＣＭ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴＥＭ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞内でも観察された（それぞれ６．１％および４．１％）（図２Ａ）。抗原特異的ｉｎ ｖｉｔｒｏ感作後４週間にわたって、ＴＳＣＭ由来細胞はＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞集団内ならびにＮＬＶ−Ｔｅｔ−Ｔ細胞集団内の両方でＴＣＭ表現型およびＴＥＭ表現型を徐々に獲得した（図２Ｂおよび２Ｃ）。著しいことに、ＴＳＣＭサブセットに由来するＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞内で、ＣＤ４５ＲＡ＋表現型およびＣＤ６２Ｌ＋ＴＳＣＭ表現型を有する細胞の割合を培養下１４日まで検出することができた。この時点までに、ＴＣＭ由来細胞およびＴＥＭ由来細胞の両方がＴＥＭ表現型に変換された（図２Ｂ）。抗原特異的刺激１４日後に、ＴＳＣＭ細胞に由来するＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞内ならびにＮＬＶ−Ｔｅｔ−Ｔ細胞内の両方で、ＴＣＭ由来細胞およびＴＥＭ由来細胞と比較して、より高いＣＣＲ７発現も検出された（図２Ｄおよび２Ｅ）。ＣＣＲ７はＴＳＣＭ由来ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞の７．５％で発現した（図２Ｄ）。これらのデータから、ＴＳＣＭ細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける増大中にＴＣＭ細胞、次いでＴＥＭ細胞に進行する分化軌道に従うことが示唆される。これらの結果から、ＴＳＣＭ由来細胞がＴＣＭ由来細胞よりも分化の程度が低い表現型を維持できることも示唆される。
同じ手法を使用して、ＣＤ９５−ＴＮ細胞に由来するＣＭＶ特異的Ｔ細胞も生成した。抗原刺激前の末梢血中の選別されたＴＮ細胞内でＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞が検出されたにもかかわらず、異なる６ドナー中６ドナーで、この感作方法により、選別されたＴＮ細胞からＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞を生成することができた。刺激すると、ＴＮ細胞は、２日以内にＣＤ９５発現が上方制御され、ＴＳＣＭ表現型に変換された。ＴＮ細胞はまた、抗原性刺激の間、ＴＣＭ由来細胞およびＴＥＭ由来細胞よりも長い持続時間にわたって、分化の程度が低いメモリー表現型を維持し、ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞の割合内でＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７の発現を伴った。代表的な例では（図２Ｄ）、ＴＮ由来細胞では、連続的な抗原性刺激の１４日後に、ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞の１２％においてＣＣＲ７発現が実証され、それと比較して、ＴＳＣＭサブセット、ＴＣＭサブセットおよびＴＥＭサブセットに由来するＣＣＲ７発現ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞はそれぞれ７．５％、０．８％および０．５％であった。試験した合計６ドナーの中で、ＴＮ由来ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞におけるＣＣＲ７の示差的な発現は、ＴＣＭ由来ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞およびＴＥＭ由来ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞において観察されたものよりも有意に高かった（ｐ＜０．０１）（図２Ｄ）。これらの試験により、ＴＮ細胞およびＴＳＣＭ細胞に由来する抗原を受けたＴ細胞では分化の程度が低い表現型が実証される。しかし、ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋集団の濃縮は、ＴＮ由来細胞では（図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃに示されている通り、７日目、１４日目および３０日目において０．４％、０．４％および３．６％）メモリーＴ細胞集団（ＴＳＣＭ、ＴＣＭおよびＴＥＭ細胞）に由来するＴ細胞よりも明白ではなかった。ＣＭＶ特異的細胞の遅い濃縮は、末梢血中のＴＮサブセットにおける前駆体発生頻度が非常に低いことに起因する可能性がある。
６．３．３．メモリーＴ細胞集団内の共刺激マーカーおよび老化マーカーの特徴付け
６．３．３．メモリーＴ細胞集団内の共刺激マーカーおよび老化マーカーの特徴付け
次に、増殖および持続性の潜在性がより高い特定のサブセットを同定するために、ナイーブおよび異なるメモリーＴ細胞サブセット内の他の特性を評価した。共刺激マーカーＣＤ２７およびＣＤ２８ならびにＩＬ−７Ｒα（ＣＤ１２７）、活性化マーカーＰＤ−１および老化マーカーＣＤ５７を含めたマーカーのパネルの発現を評価した。これらのマーカーのそれぞれの発現を同じ抗原を認識する細胞において比較して、各サブセット内の抗原特異的Ｔ細胞の示差的な濃縮の結果として生じる差異を除外した。
ＣＤ２７は、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞上に共刺激分子として構成的に発現する。その発現は、Ｔ細胞活性化の際に増大し、完全に分化したエフェクター相では失われる（Ｈｉｎｔｚｅｎら、１９９３年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５１巻：２４２６〜２４３５頁）。Ｔ細胞活性化および増殖におけるその役割と一致して、最近の試験でも、ＣＤ２７共刺激によりキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で改変されたＴ細胞の機能が改善されることが実証された（Ｓｏｎｇら、２０１２年、Ｂｌｏｏｄ、１１９巻：６９６〜７０６頁）。本明細書における実施例では、試験した６ドナーにおいて、抗原刺激時に、ＣＤ２７を発現する細胞が、ＴＮ細胞に由来するＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞内でそれぞれＴＣＭ細胞に由来するＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞およびＴＥＭ細胞に由来するＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞と比較して、ならびにＴＳＣＭ細胞に由来するＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞内で、ＴＥＭ細胞に由来するＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞と比較して有意に高い割合で見出された（＊＊ｐ≦０．００５および＊ｐ≦０．０５）（図３Ａ）。示されている代表的な例では（図３Ｂ）、ＴＮ細胞に由来するＮＬＶ−Ｔｅｔ−ＣＤ８＋Ｔ細胞のほとんど全てにおいてＣＤ２７の高発現も実証された（図３Ｂ）。
次いで、ＨＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞における複製に関わる老化および抗原誘導性アポトーシスを示すものであることが記載されているＣＤ５７の発現（Ｂｒｅｎｃｈｌｅｙら、２００３年、Ｂｌｏｏｄ、１０１巻：２７１１〜２７２０頁）を評価した。試験した６ドナーについて示されている通り、抗原特異的刺激後、ＴＮ由来ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞内で、ＴＣＭ由来ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞およびＴＥＭ由来ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞と比較して有意に低い割合のＣＤ５７発現細胞が見出された（＊＊ｐ≦０．００５および＊ｐ≦０．０５）（図３Ｃおよび３Ｄ）。ＴＳＣＭ由来細胞は、ＴＣＭ由来細胞およびＴＥＭ由来細胞よりも低いレベルのＣＤ５７を発現したが、この差は試験したドナーに関して統計的に有意ではなかった。それにもかかわらず、このデータにより、Ｔ細胞分化の増大に伴ってＣＤ５７発現のレベルが上昇する傾向が実証される（ＴＮ＜ＴＳＣＭ＜ＴＣＭ＜ＴＥＭ）。
次に、マウスモデルにおいてＴ細胞の生着および持続性を容易にすることが示されているＩＬ−７Ｒα（ＣＤ１２７）の発現（Ｋａｅｃｈら、２００３年、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、４巻：１１９１〜１１９８頁）を試験した。本明細書における実施例では、ＴＳＣＭ由来ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞内で、ＴＣＭ由来Ｔ細胞およびＴＥＭ由来Ｔ細胞と比較してわずかに高いレベルのＣＤ１２７発現が観察されたが、これは統計的に有意ではなかった（ＴＳＣＭ対ＴＥＭ、ｐ＝０．１１およびＴＳＣＭ対ＴＣＭ、ｐ＝０．０３）（図３Ｅ）。対照的に、全てのサブセット由来ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞内で中〜高レベルのＣＤ２８発現が観察され、これにより、これらの活性化された抗原特異的Ｔ細胞内の適切な活性化および共刺激能力が示唆される（図３Ｆ）。抗原性刺激後、試験した全てのＴ細胞サブセットに由来するＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞内で変動レベルのＰＤ−１発現が検出され、明らかな傾向は伴わなかった（図３Ｉ）。しかし、ＮＬＶ−Ｔｅｔ−ＣＤ８＋Ｔ細胞内のＰＤ−１の発現は、ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋対応物よりも低かった（図３Ｊ）。これらのＴ細胞におけるＰＤ−１の発現は、おそらく活性化された状態を示すものである。試験した全てのＴ細胞サブセットに由来するＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞内では高レベルのＫＬＲＧ−１発現も検出され、これにより、抗原を受けた細胞における後期分化段階が示唆される（図３Ｇ）。対照的に、ＴＮ由来ＮＬＶ−Ｔｅｔ−Ｔ細胞におけるＫＬＲＧ１の発現は、それぞれＴＣＭ由来ＮＬＶ−Ｔｅｔ−Ｔ細胞およびＴＥＭ由来ＮＬＶ−Ｔｅｔ−Ｔ細胞における発現よりも有意に低かった（図３Ｈ）。総合すると、これらのデータから、ＴＳＣＭメモリーサブセット由来の抗原を受けた細胞では、ＴＣＭ由来の抗原特異的Ｔ細胞およびＴＥＭ由来の抗原特異的Ｔ細胞では観察されないＣＤ２７ｈｉ、ＣＤ５７ｌｏｗおよびＣＤ１２７ｉｎｔを有する表現型が実証されることが示唆される。
６．３．４．ＴＳＣＭ由来Ｔ細胞では優れた抗原特異的Ｔ細胞の増大を導く高い増殖能力が実証される
６．３．４．ＴＳＣＭ由来Ｔ細胞では優れた抗原特異的Ｔ細胞の増大を導く高い増殖能力が実証される
上記のデータから、ＴＳＣＭ細胞が、抗原特異的活性化の間に分化の程度が低いメモリー表現型、およびより大きな増殖潜在性を持続させるより高いレベルのＣＤ２７発現を維持することが示される。これらのデータから、ＴＳＣＭ細胞が、抗原による再攻撃時のメモリー免疫応答のための、抗原を受けたＴ細胞の耐久性のあるレザバーとして役立ち得ることが示唆される。これに対処するために、ＥｄＵ標識を使用して、ＣＭＶ ｐｐ６５を発現するＡＡＰＣを用いた抗原特異的刺激時の異なるメモリーＴ細胞サブセットのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖能力を評価し、増殖しているＴ細胞の表現型を試験した（上記の第６．２節を参照されたい）。刺激した総Ｔ細胞集団内で、刺激の３日後に始まり、活発なＴ細胞増殖が観察された。ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞内では、１０．２％の増殖細胞が代表的なドナーにおいて３日目に観察され、刺激後５日目に５２．２％のピークに達した（図４Ａ）。３日目に、分化の程度が低いＴＳＣＭおよびＴＣＭ細胞は、増殖しているメモリーＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞のそれぞれ３２％および２３％を構成した（図４Ｂ）。この時点で、総ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞が２２％のＴＳＣＭ細胞および３２％のＴＣＭ細胞を含有した（図４Ｂ）。５日目までに、ＴＳＣＭサブセットおよびＴＣＭサブセットは、増殖しているメモリーＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞の２１％に寄与する一方で、ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋メモリーＴ細胞区画の１３％に相当した（図４Ｂ）。これらのデータから、抗原特異的刺激時にＴＳＣＭサブセット内およびＴＣＭサブセット内で初期の優先的増殖が存在することが示唆される（図４Ｂ）。このドナーでは、刺激後７日目までに大多数のＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞がＴＥＭ表現型に分化し、この時点で、ＴＥＭは、増殖しているＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞を構成する優性なサブセットである（図４Ｂ）。総合すると、ＴＳＣＭ細胞は、培養下３〜５日でそれらの最大の増殖能力に達すると思われ、これにより、これがＴＳＣＭ細胞の形質導入、所望であれば、特に、組み込みのために細胞増殖が必要になるベクター（例えば、レトロウイルスベクター）を用いた形質導入を行うのに最適な時間であることが示唆される。各メモリーサブセットの増殖潜在性を比較するために、これらのナイーブサブセットおよびメモリーサブセットのそれぞれに由来するＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞の増大倍率を試験した。抗原特異的Ｔ細胞の収率を算出し、末梢血中に存在するＴｅｔ＋Ｔ細胞の数に対して正規化した。２ラウンドの抗原曝露後、ＴＳＣＭ由来細胞内でＴＥＭ由来細胞と比較して有意に高い抗原特異的Ｔ細胞の増大倍率が観察された（ｐ＝０．０３）（図４Ｃ）。ＴＣＭ由来ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞の全体的な増大倍率はＴＳＣＭ由来細胞よりも低かったが、この差は統計的に有意ではなかった。ＴＮドナーの一部については、抗原刺激前に末梢血中のＴｅｔ＋Ｔ細胞のレベルが検出不可能なことに起因して同じ分析を実施することができなかった。総合すると、これらのデータから、ＴＳＣＭサブセットに由来する細胞は、優れた抗原特異的細胞の増大を示し、Ｔ細胞メモリープール内の他のサブセットの有意な供給源としての機能を果たし得ることが示される。
６．３．５．ｉｎ ｖｉｔｒｏで増大させたＴＮ由来Ｔ細胞およびＴＳＣＭ由来Ｔ細胞では、ＴＣＭ由来Ｔ細胞およびＴＥＭ由来Ｔ細胞と同様に特異的なエピトープに対する機能活性が実証される
６．３．５．ｉｎ ｖｉｔｒｏで増大させたＴＮ由来Ｔ細胞およびＴＳＣＭ由来Ｔ細胞では、ＴＣＭ由来Ｔ細胞およびＴＥＭ由来Ｔ細胞と同様に特異的なエピトープに対する機能活性が実証される
エピトープ特異的ＴＮ細胞およびＴＳＣＭ細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける増大の間に分化の程度が低い表現型を維持すると考えると、これにより抗原に対するそれらの機能活性が妨害されないかという疑問が生じる。したがって、ナイーブＴ細胞サブセットに由来する細胞およびメモリーＴ細胞サブセットに由来する細胞の、抗原による二次刺激に応答してサイトカインを生成する能力を評価した。ＣＤ１３７は、サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの産生、ならびに細胞傷害性活性（ＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイによって評価される）を含めた機能活性と相関する、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のマーカーとして記載されている（Ｗｏｌｆｌら、２００７年、Ｂｌｏｏｄ、１１０巻：２０１〜２１０頁）。単離された、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増大させたナイーブ由来Ｔ細胞およびメモリー由来Ｔ細胞を自己由来ＮＬＶペプチドを負荷させたＢＬＣＬによって二次刺激した。図５Ａにおいて代表的なドナーについて示されている通り、抗原による刺激後、ＣＤ８＋Ｔ細胞内のＣＤ１３７発現細胞の割合が上昇した（ＴＮ：３．３６％、ＴＳＣＭ：３７％、ＴＣＭ、９０．４％およびＴＥＭ、８２％）。全てのサブセット（ＴＮ、ＴＳＣＭ、ＴＣＭおよびＴＥＭ）に由来するＴ細胞がサイトカインを産生することができた。注目すべきことに、ＴＮおよびＴＳＣＭを含めた全てのサブセットに由来するＴ細胞において、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの両方を分泌することができるＴ細胞が観察された。異なるサブセットに由来するＴ細胞の細胞傷害性活性を実証するために、ＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイを実施した。ＴＮ由来細胞およびＴＳＣＭ由来細胞は、サイトカインを分泌するそれらの能力を補完することで、ペプチドが負荷された自己由来標的に対する機能的な細胞傷害活性も示した。ＴＮ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞集団内およびＴＳＣＭ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞集団内のＣＤ１０７ａ発現細胞の百分率は、それぞれ２０％および２２％であった（図５Ｂ）。総合すると、エピトープ特異的Ｔ細胞は、ＴＮ細胞およびＴＳＣＭ細胞から、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で抗原発現ＡＡＰＣを用いて刺激することによってｉｎ ｖｉｔｒｏで増大させることができる。これらのエピトープ特異的ＴＮ由来細胞およびＴＳＣＭ由来細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増大後に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増大させたＴＣＭ由来のエピトープ特異的Ｔ細胞またはＴＥＭ由来のエピトープ特異的Ｔ細胞よりも分化の程度が低いメモリー表現型を示す。しかし、これらの抗原特異的ＴＮ由来細胞およびＴＳＣＭ由来細胞は、抗原刺激に応答してサイトカインを放出し、脱顆粒させるそれらの能力によって証明される通り、機能的である。
６．３．６．ｉｎ ｖｉｔｒｏで増大させたＴＳＣＭ由来のＣＭＶ特異的Ｔ細胞は、ＴＣＭ由来集団およびＴＥＭ由来集団のものと同様のパブリックＴＣＲのオリゴクローナルレパートリーを示す
６．３．６．ｉｎ ｖｉｔｒｏで増大させたＴＳＣＭ由来のＣＭＶ特異的Ｔ細胞は、ＴＣＭ由来集団およびＴＥＭ由来集団のものと同様のパブリックＴＣＲのオリゴクローナルレパートリーを示す
次に、ナイーブＴ細胞サブセットなならびにメモリーＴ細胞サブセットに由来するＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞間のクローン多様性および／または類似性を試験した。ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞内のＴＣＲ配列のクローン差異を評価するために、２名のＣＭＶ血清陽性ドナー由来のＴＮ由来ＮＬＶ特異的Ｔ細胞、ＴＳＣＭ由来ＮＬＶ特異的Ｔ細胞、ＴＣＭ由来ＮＬＶ特異的Ｔ細胞およびＴＥＭ由来ＮＬＶ特異的Ｔ細胞を評価した。ＴＮ細胞に由来するＣＭＶ特異的Ｔ細胞、ＴＳＣＭ細胞に由来するＣＭＶ特異的Ｔ細胞、ＴＣＭ細胞に由来するＣＭＶ特異的Ｔ細胞およびＴＥＭ細胞に由来するＣＭＶ特異的Ｔ細胞内で共通するＴＣＲ配列が存在するかどうかをまず評価した。したがって、ＴＮ由来Ｔ細胞、ＴＳＣＭ由来Ｔ細胞、ＴＣＭ由来Ｔ細胞およびＴＥＭ由来Ｔ細胞を、人工抗原提示細胞を使用して３０日にわたってｉｎ ｖｉｔｒｏで増大させ、ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞およびＮＬＶ−Ｔｅｔ−Ｔ細胞を選別した。次いで、選別されたＴｅｔ＋Ｔ細胞に対してＴｅｔ−Ｔ細胞と比較して次世代配列決定によってＴＣＲレパートリー分析を実施した。ＴＣＲ配列決定データをヌクレオチド配列の類似性について試料のオーバーラップによって解析した。この解析により、刺激後のＴＣＭ由来ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞およびＴＥＭ由来ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞のＴＣＲ配列間の大きなオーバーラップが実証される（９６％のオーバーラップ、図６Ｃ）。ＴＳＣＭ由来細胞は、ＴＮ由来細胞およびＴＣＭ由来細胞と高い類似性を示し、ＴＥＭ由来細胞とは低い類似性を示す（ＴＮ：８４％；ＴＣＭ：９１％；およびＴＥＭ：５７％、図６Ｃ）。ＴＮ由来Ｔｅｔ＋細胞も、Ｔｅｔ＋ＴＣＭ由来細胞と高い程度のＴＣＲ類似性／オーバーラップを有したが（８７％）、ＴＥＭ由来細胞とのオーバーラップは非常に小さかった（１４％）。ナイーブＴ細胞またはメモリーＴ細胞のいずれに由来するＮＬＶ−Ｔｅｔ−Ｔ細胞内でもＴＣＲのオーバーラップは検出されなかった（データは示していない）。全体的に、これらのデータから、ナイーブ様ＴＮサブセットに由来するＮＬＶエピトープを認識するＴｅｔ＋Ｔ細胞が、ＴＳＣＭ由来細胞およびＴＣＭ由来細胞によって発現されるＴＣＲ配列間に高い程度のオーバーラップを示すことが示される。ＴＳＣＭ由来Ｔ細胞およびＴＣＭ由来Ｔ細胞において検出されたＴＣＲ配列は、ＴＥＭ由来細胞ではより低発生頻度で検出されたが、それにもかかわらず、全てのメモリーＴ細胞区画に由来するＴ細胞に共通する特異的パブリックＴＣＲが有意な数存在した。
次いで、末梢血中で抗原刺激の前に同じＴＣＲのオーバーラップの傾向が存在するかどうかを試験した。したがって、ＴＮ由来ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞、ＴＳＣＭ由来ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞、ＴＣＭ由来ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞およびＴＥＭ由来ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞を刺激前に別のドナーから選別し、ＴＣＲ配列をクローン性およびオーバーラップについて評価した。ＴＣＲクローン性は、１つまたは少数のクローンがレパートリーの優位を占める程度を記載するものであり、０が平らな分布であり、１が完全にオリゴクローナルな試料である。抗原性刺激前には、ＴＥＭ ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞は高い程度のクローン性を示し、クローン性指数は０．６６であった（図６Ａ）。比較すると、ＴＣＭ ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞のクローン性指数は０．０６であり、これにより、ＴＣＲクローン多様性がより高いことが示唆され、一方、循環ＴＳＣＭ ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞および循環ＴＮ ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞は、クローン指数が０．０１であり、多様性が高度であった（図６Ａ）。しかし、異なるサブセット内のＴｅｔ＋Ｔ細胞を比較するオーバーラップ分析では、ＴＥＭ画分中に検出されたＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞は、ＴＣＭレパートリーにおいても示差的に出現した（９４％、図６Ｄ）。他方では、高度に多様なＴＣＲレパートリーを有したＴＳＣＭ細胞は、ＴＣＭ ＴＣＲ配列およびＴＥＭ ＴＣＲ配列と非常にわずかなオーバーラップを示す（それぞれ１３．２％および２４．６％）（図６Ｄ）。著しいことに、末梢血中のＴＮ ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞とＴＳＣＭ ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞、ＴＣＭ ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞またはＴＥＭ ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞の間でＴＣＲのオーバーラップは同定されなかった（図６Ｄ）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗原性刺激の１５日後には、全てのサブセットについて、増大したＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞は拘束クローン多様性をとり、クローン性指数は０．３５から０．８３までにわたった（図６Ｂ）。オーバーラップ分析データは、ＴＣＭ由来ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞とＴＥＭ由来ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞が高度にオーバーラップしたＴＣＲ配列を有するという以前の観察と相関した（図６Ｅおよび６Ｆに示されている通り、１５日目および３０日目に９７％および９５％）。興味深いことに、ＴＳＣＭ由来Ｔｅｔ＋Ｔ細胞では刺激後１５日以内に拘束ＴＣＲレパートリーが発生し、これは、ＴＣＭ由来Ｔｅｔ＋Ｔ細胞およびＴＥＭ由来Ｔｅｔ＋Ｔ細胞と高度に類似する（ＴＳＣＭ／ＴＣＭ：８６％およびＴＳＣＭ／ＴＥＭ：９５％、図６Ｅ）。再刺激後初期のＴＳＣＭ由来Ｔｅｔ＋Ｔ細胞とは異なり、ＴＮ由来Ｔｅｔ＋Ｔ細胞は、ＴＣＭ由来Ｔｅｔ＋Ｔ細胞およびＴＥＭ由来Ｔｅｔ＋Ｔ細胞と比較して全く異なるＴＣＲ配列を示し、オーバーラップはそれぞれ３８％および３．８％であった（図６Ｅ）。ＴＣＭ由来Ｔｅｔ＋Ｔ細胞と共有するＴＣＲを発現するＴＮ由来Ｔｅｔ＋Ｔ細胞の有意な画分は、３０日目までに検出することができるが、ＴＥＭ由来Ｔｅｔ＋Ｔ細胞と共有する画分は３０日間の増大全体を通して小さいままであった。したがって、これらのデータから、抗原刺激時に、ＴＳＣＭが、循環中に免疫優性ＮＬＶ特異的ＴＣＭ集団およびＴＥＭ集団を補充するための主要な即時供給源を構成することが示唆される。
０日目のＴＣＭ Ｔｅｔ＋Ｔ細胞集団およびＴＥＭ Ｔｅｔ＋Ｔ細胞集団ならびに１５日目のＴＳＣＭ由来Ｔｅｔ＋Ｔ細胞集団の追加的な著しい特徴は、これらのＴｅｔ＋Ｔ細胞が、ＮＬＶペプチドに特異的なパブリックＴ細胞受容体において以前報告されたＣＤＲ３配列ＣＡＳＳＰＱＴＧＡＳＹＧＹＴＦ（配列番号３）およびＣＡＳＳＰＫＴＧＡＶＹＧＹＴＦ（配列番号４）を発現したことである（Ｙａｎｇら、２０１５年、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２９０巻：２９１０６〜２９１１９頁）。これらの配列はＴＮ由来Ｔｅｔ＋Ｔ細胞においても検出されたが、発生頻度はＴＳＣＭ由来Ｔｅｔ＋Ｔ細胞、ＴＣＭ由来Ｔｅｔ＋Ｔ細胞またはＴＥＭ由来Ｔｅｔ＋Ｔ細胞よりもはるかに低かった（表２）。本明細書における実施例のデータセットでは、ＴＮ由来Ｔｅｔ＋Ｔ細胞は他のサブセットに由来するＴｅｔ＋Ｔ細胞と共有しない独特の配列も含有した。例えば、配列ＣＡＳＳＹＶＴＧＴＧＮＹＧＹＴＦ（配列番号５）は刺激後のＴＮ由来Ｔｅｔ＋Ｔ細胞においてのみ高い発生頻度で検出された（１５日目および３０日目にそれぞれ８９％および８７％、表２）。これにより、ＴＮ由来Ｔｅｔ＋Ｔ細胞が、抗原曝露時に最終的に潜在的に増大して免疫優性メモリーＴ細胞プールに入ることができ、また、抗原を認識する独特のクローンを増大させることもできることが示唆される。
表２． ＣＭＶ血清陽性ドナーにおいてナイーブＡ２−ＮＬＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞およびメモリーＡ２−ＮＬＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞内に出現する優性クローン型
６．３．７．循環中のＴＳＣＭ細胞の歪んだ増殖によって免疫優性は引き起こされない
上記のデータから、ＴＳＣＭ由来Ｔ細胞が、抗原特異的Ｔ細胞の優れた増大を生じさせる高い増殖能力を示すことが示される。次に、エピトープ特異的Ｔ細胞免疫優性の現象が準優性エピトープと比較して、免疫優性に応答するＴ細胞内のＴＳＣＭ細胞の過剰出現または優先的増殖のいずれかの結果であり得るかどうかを試験した。この問題に対処するために、抗原特異的刺激時の、それぞれＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＡ＊２４０２が共遺伝するＣＭＶ血清陽性ドナー由来のＴＳＣＭサブセット、ＴＣＭサブセット、およびＴＥＭサブセットのｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞増殖能力を測定した。これらの対立遺伝子が共遺伝するドナーにおける免疫優性抗ＣＭＶ Ｔ細胞応答は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１によって提示されるＮＬＶエピトープを対象とすることが示されている（Ｌｉｄｅｈａｌｌら、２００５年、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２５巻：４７３〜４８１頁）。同じドナー由来のＴ細胞をＮＬＶが負荷された自己由来樹状細胞およびＱＹＤが負荷された自己由来樹状細胞で刺激した。刺激後８日以内に、ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞は３１．７％まで濃縮され、ＱＹＤ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞は１．６％まで濃縮され、これにより、それぞれ免疫優性応答および免疫準優性応答が示される（図７Ａ）。著しいことに、Ａ２−ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞およびＡ２４−ＱＹＤ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞のどちらについても同様のメモリー表現型が見出され、培養下の免疫優性Ａ２−ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞内でＴＳＣＭ由来Ｔ細胞の過剰出現は認められなかった（図７Ｂ）。免疫優性エピトープ特異的Ｔ細胞および準優性エピトープ特異的Ｔ細胞の相対的な増殖潜在性をさらに評価するために、それらを、増殖マーカーとしてＥｄＵ組み入れおよびアポトーシスマーカーとしてアネキシンＶ発現について試験した。Ａ２−ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞内およびＡ２４−ＱＹＤ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞内で同様のレベルの増殖細胞が見出され、免疫優性Ａ２−ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞内で優先的増殖は認められなかった（図７Ｂ）。しかし、Ａ２４−ＱＹＤ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞は、Ａ２−ＮＬＶ−Ｔｅｔ＋Ｔ細胞と比較して高い百分率のアネキシンＶ＋細胞を含有した（図７Ｂ）。これらのデータから、準優性エピトープ特異的Ｔ細胞内のＴ細胞アポトーシスがより高いレベルであることにより免疫優性Ｔ細胞の優先的な濃縮が促進される可能性があることが示唆される。
６．４．考察
６．４．考察
本明細書に記載のこの実施例では、健康な血清陽性ドナーの血液由来の四量体への免疫吸着によって単離されたＣＭＶ ｐｐ６５の免疫優性ＮＬＶペプチドに特異的なＨＬＡ−Ａ０２０１拘束ＴＮ細胞、ＴＳＣＭ細胞、ＴＣＭ細胞およびＴＥＭ細胞、ならびにこれらのサブセットに由来するＴ細胞を逐次的間隔のｉｎ ｖｉｔｒｏ感作後に特徴付けた。同じＴ細胞サブセット集団に由来するＴｅｔ＋Ｔ細胞およびＴｅｔ−Ｔ細胞も比較した。結果から、免疫応答の復活におけるＴ細胞メモリーの耐久性のあるレザバーとしてのＴＳＣＭ細胞の主要な役割が示唆される。
これらの異なるＴ細胞サブセットにおける抗原特異的Ｔ細胞のこの分析により、血液中のＴｅｔ＋ＴＳＣＭが、ＴＮ細胞と同様のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋およびＣＤ６２Ｌ＋表現型を示すが、ＣＤ９５も発現することが実証された。抗原に感作させると、Ｔｅｔ＋ＣＤ９５−ＴＮ細胞およびＴｅｔ＋ＣＤ９５＋ＴＳＣＭ細胞はどちらも規則的に検出された。Ｔｅｔ＋ＴＮ細胞およびＴｅｔ＋ＴＳＣＭ細胞はどちらも、共刺激マーカーＣＤ２７をＴｅｔ＋ＴＣＭおよびＴｅｔ＋ＴＥＭ細胞で検出されたものよりも有意に高いレベルで発現し、Ｔｅｔ＋ＴＳＣＭ細胞は活性化マーカーＣＤ１２７のいくらか高い発現を示した。逆に、Ｔｅｔ＋ＴＮ細胞およびＴｅｔ＋ＴＳＣＭ細胞は、老化マーカーＣＤ５７をより低いレベルで発現し、Ｔｅｔ＋ＴＮ細胞はＣＤ２８を有意に低いレベルで発現した。著しいことに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ感作後、全てのサブセットに由来するＴｅｔ＋Ｔ細胞がＰＤ−１を発現する細胞を同様に高い割合で生成し、これは、これらのサブセットに由来するＴｅｔ−Ｔ細胞ではＰＤ−１＋細胞の割合が低いこととは有意に異なった。さらに、後期分化のマーカーであると通常考えられているキラー細胞レクチン様受容体Ｇ１（ＫＬＲＧ１）がＮＬＶペプチド応答性ＴＮ由来Ｔ細胞、ＴＳＣＭ由来Ｔ細胞、ＴＣＭ由来Ｔ細胞およびＴＥＭ由来Ｔ細胞において同程度に発現した。対照的に、このマーカーはＴｅｔ−ＴＮ由来Ｔ細胞では最小レベルで発現した。したがって、潜伏感染している健康な血清陽性個体では、ウイルス抗原による二次刺激により、全段階のＴ細胞メモリーにおいてＰＤ−１およびＫＬＲＧ−１の両方の発現が誘導される。しかし、Ｔｅｔ＋ＴＮ由来Ｔ細胞およびＴｅｔ＋ＴＳＣＭ由来Ｔ細胞はなお、より早い成熟化段階ならびに標的化移動および長期生存の能力に関連付けられるＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７およびＣＤ６２Ｌマーカーを示差的に発現する。
機能的レベルで、Ｔｅｔ＋ＴＮ由来Ｔ細胞、Ｔｅｔ＋ＴＳＣＭ由来Ｔ細胞、Ｔｅｔ＋ＴＣＭ由来Ｔ細胞およびＴｅｔ＋ＴＥＭ由来Ｔ細胞は全て、抗原刺激に応答してＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γを分泌し、脱顆粒することができる細胞を含有するが、これらの機能を示すＴｅｔ＋ＴＥＭ由来Ｔ細胞およびＴｅｔ＋ＴＣＭ由来Ｔ細胞の割合は、Ｔｅｔ＋ＴＳＣＭ由来Ｔ細胞またはＴｅｔ＋ＴＮ由来Ｔ細胞よりも高かった。したがって、ＣＤ９５−Ｔ細胞がＨＣＭＶ特異的刺激後にサイトカインを分泌することができないという以前の報告とは対照的に（Ｓｃｈｍｕｅｃｋ−Ｈｅｎｎｅｒｅｓｓｅら、２０１５年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９４巻：５５５９〜５５６７頁）、本明細書に記載の実施例は、抗原応答性ＴＮ由来Ｔ細胞がこれらのエフェクター機能を示し、それにより、抗原応答性ＴＳＣＭ由来Ｔ細胞と定性的に区別することができないという証拠を提供する。Ｐｕｌｋｏら（２０１６年、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７巻：９６６〜９７５頁）による試験でも、ナイーブ表現型を有するヒトメモリーＴ細胞はウイルス抗原による二次刺激に応答して多数のサイトカインを分泌するが、メモリーＴ細胞およびエフェクターＴ細胞とは転写的に異なることが示されている。しかし、本明細書に記載の実施例では、Ｔｅｔ＋ＣＤ９５＋ＴＳＣＭ細胞とＴｅｔ＋ＣＤ９５−ＴＮ細胞がそれらの抗原刺激に対する増殖応答に基づいて機能的に区別可能であることは見出されなかった。実際に、それらの増殖応答はＴｅｔ＋ＴＣＭ細胞およびＴｅｔ＋ＴＥＭ細胞の増殖応答も有意に超えた。
多様なＴＣＲレパートリーにより、微生物エスケープ突然変異がレパートリー内に出現するＴＣＲαβ対の１つによって認識される確率を上昇させることによる病原体の最適な制御が媒介されると仮定されている（Ｃｏｒｎｂｅｒｇら、２００６年、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１１６巻：１４４３〜１４５６頁；Ｍｅｙｅｒ−Ｏｌｓｏｎら、２００４年、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、２００巻：３０７〜３１９頁）。本明細書に記載の実施例におけるＴＣＲ配列決定解析により、末梢循環中では、同じエピトープＮＬＶを認識するＴＮ細胞およびＴＳＣＭ細胞がＴＣＭ細胞およびＴＥＭ細胞よりも多様であることが示された。同じ病原体を認識するＴＮ細胞およびＴＳＣＭ細胞のこの広範なＴＣＲレパートリーによりウイルス感染のより良好な制御がもたらされるという仮説を立てることができる。しかし、抗原刺激時に、本明細書における実施例では、ＴＳＣＭ細胞が、抗原との遭遇後に１５日以内にオリゴクローナルであるＴ細胞を生成すること、さらに、これらのＴ細胞が、循環中で優性であるＴｅｔ＋ＴＥＭ細胞およびＴｅｔ＋ＴＣＭ細胞のレパートリーと密接に関連するレパートリーを発現することが見出された。刺激後初期にＴＳＣＭ由来のＣＭＶ特異的Ｔ細胞がＴＣＭ由来ＣＭＶ特異的Ｔ細胞およびＴＥＭ由来ＣＭＶ特異的Ｔ細胞とＴＣＲ使用の高いオーバーラップを共有するという事実から、ＴＳＣＭ由来Ｔ細胞が血液中の免疫優性メモリーＴ細胞の集団の再構成において特に有効であるという証拠がもたらされる。さらに、他のメモリーＴ細胞サブセットのものとは異なる、抗原刺激後にＴＮ細胞から生成されるクローンの異種スペクトルにより、ＴＮ細胞が、必要であればウイルスバリアントを制御するために最適な結合活性のメモリーＴ細胞を増大のために選択することができる、より広範なスペクトルの結合特性を有するペプチド特異的Ｔ細胞を選択することができる前駆細胞のプールとして役立つことが示唆される。
潜伏ウイルスに対するＴ細胞応答は、多くの場合、少数の利用可能な抗原エピトープに焦点が当てられ、狭いＴＣＲレパートリーが使用される、これは、「免疫優性」と称される現象である。抗原の提示、ペプチド−ＭＨＣ結合親和性およびナイーブＴ細胞プール内の前駆体の安定性またはＴＣＲ結合活性および発生頻度を含めたいくつもの因子が免疫優性に影響を及ぼすことが報告されている（Ｋｈａｎら、２００７年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７８巻：４４５５〜４４６５頁）。本明細書における実施例で試験した２ドナーでは、免疫優性エピトープに応答するＴＳＣＭ由来Ｔ細胞の過剰出現または優先的増殖は、準優性エピトープに応答するものと比較して、見出されなかった。その代わりに、準優性エピトープ特異的Ｔ細胞内では、免疫優性Ｔ細胞の優先的な濃縮を促進する可能性がある、より高いレベルのＴ細胞アポトーシスが観察された。以前の試験によっても、ｐＭＨＣ複合体に結合するＴＣＲ特性によりクローンのアポトーシスも調節される可能性があることが示されている（Ｔｓｃｈａｒｋｅら、２０１５年、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５巻：７０５〜７１６頁）。実際に、ｐＭＨＣ−Ｉに対して閾値下の親和性を有するＴＣＲは応答の初期にＢＣＬ−２ファミリーメンバーであるＢＩＭ、ＮＯＸＡおよびＭＣＬ１によって調節されるプロセスによって優先的にアポトーシスを受ける（Ｗｅｎｓｖｅｅｎら、２０１０年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、３２巻：７５４〜７６５頁）。したがって、本明細書における実施例のデータは、他のデータと一致し、適応免疫応答を適合させ、それにより、持続性がより高いクローンの選択を増強するためにアポトーシスが極めて重要であり得ることが示唆される。
ＴＳＣＭ細胞から生成されるＮＬＶ ＨＬＡ−Ａ０２０１エピトープ特異的Ｔｅｔ＋Ｔ細胞の別の特徴は、ＮＬＶエピトープに特異的なパブリックＴ細胞受容体について以前報告された配列と同一のアミノ酸配列を有するＴ細胞受容体を発現することであった（Ｙａｎｇら、２０１５年、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２９０巻：２９１０６〜２９１１９頁）。パブリックＴ細胞受容体は、多数の個体において検出される高度に相同な配列を有するペプチド特異的ＴＣＲである（Ｌｉら、２０１２年、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、２２巻：３３〜４２頁）。パブリックＴＣＲは、種々のヒトウイルスに応答するＴ細胞に関して記載されている（Ａｒｇａｅｔら、１９９４年、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、１８０巻：２３３５〜２３４０頁）。ＮＬＶペプチド特異的Ｔ細胞レパートリーは、パブリックＴＣＲの高い普及率を示すことが示されている（Ｗａｎｇら、２０１２年、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、４巻：１２８ｒａ１４２頁；Ｎｇｕｙｅｎら、２０１４年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９２巻：５０３９〜５０４９頁；Ｔｒａｕｔｍａｎｎら、２００５年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７５巻：６１２３〜６１３２頁）。実際に、７種のパブリックＣＤＲ３αモチーフおよび６種のＣＤＲ３βモチーフが全ＮＬＶ特異的ＴＣＲ応答の約７０％を占める（Ｗａｎｇら、２０１２年、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、４巻：１２８ｒａ１４２頁）。本明細書における実施例では、他の公開されたモチーフの中で報告されている発生頻度が最も高いＳ＊ ｎＴＧ＊ ｎＧＹ（配列番号１６；＊ｎは、任意の長さの任意のアミノ酸配列および任意のアミノ酸の組合せを示す）モチーフを有する、刺激後にＴＮ由来Ｔｅｔ＋Ｔ細胞内、ＴＳＣＭ由来Ｔｅｔ＋Ｔ細胞内、ＴＣＭ由来Ｔｅｔ＋Ｔ細胞内およびＴＥＭ由来Ｔｅｔ＋Ｔ細胞内に出現する共通のＴＣＲβＣＤＲ３も同定された。２つの他の試験によっても、両方のＣＭＶ血清陽性ドナー由来のＨＬＡ−Ａ＊０２０１ ＮＬＶ特異的Ｔ細胞内で同じＳ＊ ｎＴＧ＊ ｎＧＹ（配列番号１６；＊ｎは、任意の長さの任意のアミノ酸配列および任意のアミノ酸の組合せを示す）モチーフが示された（Ｈａｎｌｅｙら、２０１５年、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、７巻：２８５ｒａ２６３頁；Ｎｅｌｌｅｒら、２０１５年、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、９３巻：６２５〜６３３頁）。ＮＬＶ−ＨＬＡ−Ａ２と複合体を形成した２種のパブリックＴＣＲの結晶構造が報告されている（Ｙａｎｇら、２０１５年、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２９０巻：２９１０６〜２９１１９頁）。これらおよび他の試験（Ｙａｎｇら、２０１５年、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２９０巻：２９１０６〜２９１１９頁；Ｗｅｌｓｈら、２０１０年、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ、２３５巻：２４４〜２６６頁）により、パブリックＣＤＲ３αおよびβドメインの種々の対形成により同じペプチドＭＨＣリガンドを認識する親和性が高いＴＣＲの多数性が媒介され得る証拠がもたらされた（Ｙａｎｇら、２０１５年、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２９０巻：２９１０６〜２９１１９頁）。現在の証拠から、パブリックＴＣＲが、「収束組換え（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」と称されるランダムなプロセスであるランダムＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子再構成の間により頻繁に産生されることが示される（Ｍｉｌｅｓら、２０１１年、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、８９巻：３７５〜３８７頁）。その後、パブリックＴＣＲをコンビナトリアルバイアスによってさらに選択することができる。そのようなパブリックＴＣＲは、潜在的により大きく伝播し、ＴＣＲレパートリーの他のクローンよりも良好なウイルス制御を確立し得る。
結論として、第１に、本明細書における実施例では、抗原特異的ＴＳＣＭ由来Ｔ細胞が、単一のエピトープに応答し、ＴＮ由来細胞とＴＣＭ由来細胞の中間の組織ホーミング、共刺激マーカーおよび老化マーカーの増大プロファイルを示す他のメモリーＴ細胞集団に由来するものよりも分化の程度が低い表現型を示し、維持することが実証された。さらに、Ｔｅｔ＋ＣＭＶ ｐｐ６５ ＮＬＶ特異的Ｔ細胞がＣＤ９５−ＴＮ細胞区画に由来する細胞で規則的に検出された。しかし、抗原特異的ＴＳＣＭ細胞は、Ｔｅｔ＋ＴＮ細胞ならびにＴｅｔ＋ＴＣＭ細胞およびＴｅｔ＋ＴＥＭ細胞とは、抗原刺激に応答してはるかに高い程度に増殖するという点で異なる。第２に、抗原特異的Ｔｅｔ＋ＴＮ由来細胞およびＴｅｔ＋ＴＳＣＭ由来細胞は、Ｔｅｔ−ＴＮ由来細胞およびＴｅｔ−ＴＳＣＭ由来細胞とは異なり、ＰＤ−１およびＫＬＲＧ−１をＴｅｔ＋ＴＣＭ由来細胞およびＴｅｔ＋ＴＥＭ由来細胞による発現と同様のレベルで発現することが見出された。抗原特異的Ｔｅｔ＋ＴＮ由来細胞およびＴｅｔ＋ＴＳＣＭ由来細胞はまた、エフェクター機能も示し、これにより、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γおよびグランザイムＢを生成する能力が示される。第３に、この実施例により、抗原刺激に応答して、ＴＳＣＭ細胞が顕著な増殖を受けるだけでなく、ＴＣＲ配列決定によると、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１血清陽性ドナーの血液中で免疫優性であるＮＬＶ／ＨＬＡ−Ａ＊０２０１特異的ＴＥＭ細胞およびＴＣＭ細胞によって発現されるものと同一のパブリックＴＣＲである、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１によって提示されるＣＭＶ ｐｐ６５ ＮＬＶエピトープに特異的なＴ細胞クローンを急速に選択することが実証された。Ｔｅｔ＋ＴＳＣＭ細胞とは異なり、Ｔｅｔ＋ＴＮ細胞は、血液中のＴＥＭ集団およびＴＣＭ集団において検出される免疫優性ＴＣＲを発現するクローンを急速に選択しない。そうではなく、Ｔｅｔ＋ＴＮ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激して１５日目にＴＳＣＭ由来細胞において検出されたものと同様に、血液中のＮＬＶ特異的ＴＣＭ細胞およびＴＥＭ細胞において検出されたものよりも著しく変動する別個のレパートリーを維持する。最後に、本明細書における実施例により、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１によって提示される免疫優性エピトープＮＬＶに応答して増殖するＴＳＣＭ細胞、ＴＣＭ細胞およびＴＥＭ細胞の増大が、同じドナーによって発現されるＨＬＡ−Ａ＊２４０２によって提示される準優性ＱＹＤエピトープに応答した増殖と同様であり、アポトーシスを受ける免疫優性ＮＬＶ特異的ＴＳＣＭ由来細胞、ＴＣＭ由来細胞、およびＴＥＭ由来細胞の割合は準優性ＱＹＤ特異的対応物のものよりも著しく小さいことが示唆される。
これらの所見には、Ｔ細胞に基づく免疫療法の設計のための意味がある。この実施例により、ＴＳＣＭサブセットが、二次抗原攻撃時に循環中の免疫優性ＴＥＭ細胞およびＴＣＭ細胞を再増殖させるための主要な耐久性のあるレザバーとしての機能を果たす証拠がもたらされた。ＴＳＣＭが濃縮されたウイルス特異的Ｔ細胞株の養子移入により、迅速かつ広範囲にわたる増殖および持続性の増強が可能な免疫優性ウイルス特異的Ｔ細胞を提供することによってより良好な疾患制御を潜在的にもたらすことができる。
７．参照による組み込み
７．参照による組み込み
本明細書において引用された全ての参考文献は、個々の刊行物または特許または特許出願が具体的にかつ個別にその全体があらゆる目的に関して参照により組み込まれることが示されたものと同じ程度に、その全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれる。
当業者には明らかになる通り、本発明の多くの改変および変形をその主旨および範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書に記載の特定の実施形態は単に例として提供され、本発明は、添付の特許請求の範囲の条件によってのみ、そのような特許請求の範囲に権利が与えられる等価物の全範囲と共に、限定されるものとする。
Claims (80)
- 病原体またはがんを有するかまたはその疑いがあるヒト患者への治療的投与のための抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法であって、（ａ）ヒト血液細胞の集団を、前記病原体またはがんの１つまたは複数の抗原に培養下で所定期間にわたりｅｘ ｖｉｖｏ感作させるステップであって、前記期間の開始時に前記ヒト血液細胞の集団が少なくとも５０％の幹細胞様メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ細胞）を含有する、ステップと、（ｂ）（ｉ）前記ｅｘ ｖｉｖｏ感作させたヒト血液細胞の集団、または（ｉｉ）それに由来する、前記病原体もしくはがんの１つもしくは複数の抗原を認識する抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞を凍結保存するステップとを含み、それにより、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を産生する方法。
- 凍結保存するステップの後に、前記ｅｘ ｖｉｖｏ感作させたヒト血液細胞またはそれに由来する細胞の集団を解凍するステップ、および必要に応じて、培養下で増大させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 前記培養下におく期間が、９〜２１日間の範囲である、請求項１または２に記載の方法。
- 前記培養下におく期間が、９〜１４日間の範囲である、請求項３に記載の方法。
- 前記培養下におく期間が、１４日間である、請求項３に記載の方法。
- 前記ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップが、前記ヒト血液細胞の集団を、前記１つまたは複数の抗原に由来する１つまたは複数の免疫原性ペプチドまたはタンパク質と共培養することを含む、請求項１から５までのいずれかに記載の方法。
- 前記ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップが、前記ヒト血液細胞の集団を、前記１つまたは複数の抗原を提示する抗原提示細胞と共培養することを含む、請求項１から５までのいずれかに記載の方法。
- 前記抗原提示細胞が、樹状細胞、サイトカインにより活性化された単球、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、エプスタイン・バーウイルスにより形質転換されたＢリンパ芽球様細胞株細胞（ＥＢＶ−ＢＬＣＬ細胞）、または人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）である、請求項７に記載の方法。
- 前記抗原提示細胞がＡＡＰＣである、請求項８に記載の方法。
- 前記抗原提示細胞が、前記１つまたは複数の抗原に由来する１つまたは複数の免疫原性ペプチドまたはタンパク質が負荷されたものである、請求項７から９までのいずれかに記載の方法。
- 前記抗原提示細胞が、前記１つまたは複数の抗原に由来する１つまたは複数の免疫原性ペプチドまたはタンパク質を組換え発現するように遺伝子操作されたものである、請求項７から９までのいずれかに記載の方法。
- 前記１つまたは複数の免疫原性ペプチドまたはタンパク質が、前記１つまたは複数の抗原に由来するオーバーラップするペプチドのプールである、請求項６、１０および１１のいずれかに記載の方法。
- 前記オーバーラップするペプチドのプールが、オーバーラップするペンタデカペプチドのプールである、請求項１２に記載の方法。
- 前記１つまたは複数の免疫原性ペプチドまたはタンパク質が、前記１つまたは複数の抗原に由来する１つまたは複数のタンパク質である、請求項６、１０および１１のいずれかに記載の方法。
- 前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団が、前記１つまたは複数の抗原を認識するパブリックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を内因的に発現する抗原特異的Ｔ細胞を含む、請求項１から１４までのいずれかに記載の方法。
- 前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団が、前記１つまたは複数の抗原を認識するパブリックＴＣＲを組換え発現する抗原特異的Ｔ細胞を含む、請求項１から１４までのいずれかに記載の方法。
- 前記ヒト血液細胞の集団にパブリックＴＣＲをコードする核酸を形質導入するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
- 前記形質導入するステップが、前記ヒト血液細胞の集団を３〜５日間培養した時点で、前記ヒト血液細胞の集団に前記パブリックＴＣＲをコードする前記核酸を形質導入することを含む、請求項１７に記載の方法。
- 前記１つまたは複数の抗原がサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ｐｐ６５であり、前記パブリックＴＣＲが配列番号３の相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む可変ドメインを含むβ鎖を含む、請求項１５から１８までのいずれかに記載の方法。
- 前記１つまたは複数の抗原がＣＭＶ ｐｐ６５であり、前記パブリックＴＣＲが配列番号４のＣＤＲ３を含む可変ドメインを含むβ鎖を含む、請求項１５から１８までのいずれかに記載の方法。
- 前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団が、前記１つまたは複数の抗原を認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を組換え発現する抗原特異的Ｔ細胞を含む、請求項１から１４までのいずれかに記載の方法。
- 前記ヒト血液細胞の集団にＣＡＲをコードする核酸を形質導入するステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
- 前記ヒト血液細胞の集団を３〜５日間培養した時点で、前記ヒト血液細胞の集団に前記ＣＡＲをコードする前記核酸を形質導入するステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
- 病原体またはがんを有するかまたはその疑いがあるヒト患者への治療的投与のための抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法であって、ヒト血液細胞の集団を３〜５日間培養した時点で、前記ヒト血液細胞の集団に前記病原体またはがんの１つまたは複数の抗原を認識するパブリックＴＣＲをコードする核酸を形質導入するステップであって、前記ヒト血液細胞の集団が、少なくとも５０％のＴＳＣＭ細胞を含有する、ステップを含み、それにより、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を産生する方法。
- 前記１つまたは複数の抗原がＣＭＶ ｐｐ６５であり、前記パブリックＴＣＲが配列番号３のＣＤＲ３を含む可変ドメインを含むβ鎖を含む、請求項２４に記載の方法。
- 前記１つまたは複数の抗原がＣＭＶ ｐｐ６５であり、前記パブリックＴＣＲが配列番号４のＣＤＲ３を含む可変ドメインを含むβ鎖を含む、請求項２４に記載の方法。
- ＣＭＶ感染症を有するかまたはその疑いがあるヒト患者への治療的投与のための抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法であって、ヒト血液細胞の集団に、ＣＭＶ ｐｐ６５を認識するパブリックＴＣＲをコードする核酸を形質導入するステップであって、前記パブリックＴＣＲが配列番号３のＣＤＲ３を含む可変ドメインを含むβ鎖を含み、前記ヒト血液細胞の集団が少なくとも５０％のＴＳＣＭ細胞を含有する、ステップを含み、それにより、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を産生する方法。
- ＣＭＶ感染症を有するかまたはその疑いがあるヒト患者への治療的投与のための抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法であって、ヒト血液細胞の集団に、ＣＭＶ ｐｐ６５を認識するパブリックＴＣＲをコードする核酸を形質導入するステップであって、前記パブリックＴＣＲが配列番号４のＣＤＲ３を含む可変ドメインを含むβ鎖を含み、前記ヒト血液細胞の集団が少なくとも５０％のＴＳＣＭ細胞を含有する、ステップを含み、それにより、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を産生する方法。
- 病原体またはがんを有するかまたはその疑いがあるヒト患者への治療的投与のための抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成する方法であって、ヒト血液細胞の集団を３〜５日間培養した時点で前記ヒト血液細胞の集団に前記病原体またはがんの１つまたは複数の抗原を認識するＣＡＲをコードする核酸を形質導入するステップであって、前記ヒト血液細胞の集団が、少なくとも５０％のＴＳＣＭ細胞を含有する、ステップを含み、それにより、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を産生する方法。
- 前記形質導入するステップの後に、前記形質導入されたヒト血液細胞またはそれに由来する細胞の集団を凍結保存するステップをさらに含む、請求項２４から２９までのいずれかに記載の方法。
- 前記凍結保存するステップの後に、前記形質導入されたヒト血液細胞またはそれに由来する細胞の集団を解凍し、必要に応じて培養下で増大させるステップをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
- 前記ヒト血液細胞の集団が、少なくとも９０％のＴＳＣＭ細胞を含有する、請求項１から３１までのいずれかに記載の方法。
- 前記ヒト血液細胞の集団が、少なくとも９５％のＴＳＣＭ細胞を含有する、請求項１から３１までのいずれかに記載の方法。
- 前記ヒト血液細胞の集団が、少なくとも９９％のＴＳＣＭ細胞を含有する、請求項１から３１までのいずれかに記載の方法。
- 前記ヒト血液細胞の集団が、１００％のＴＳＣＭ細胞を含有する、請求項１から３１までのいずれかに記載の方法。
- 前記ヒト血液細胞の集団が、１０％未満のナイーブＴ（ＴＮ）細胞を含有する、請求項１から３５までのいずれかに記載の方法。
- 前記ヒト血液細胞の集団が、５％未満のＴＮ細胞を含有する、請求項１から３５までのいずれかに記載の方法。
- 前記ヒト血液細胞の集団が、１％未満のＴＮ細胞を含有する、請求項１から３５までのいずれかに記載の方法。
- 前記ヒト血液細胞の集団が、ＴＮ細胞を含有しない、請求項１から３５までのいずれかに記載の方法。
- 前記ヒト血液細胞の集団をヒト細胞試料から引き出すステップをさらに含む、請求項１から３９までのいずれかに記載の方法。
- 前記引き出すステップが、前記ヒト細胞試料からＴＳＣＭ細胞を濃縮することを含む、請求項４０に記載の方法。
- 前記濃縮するステップが、ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ９５＋である細胞を選択することを含む、請求項４１に記載の方法。
- 前記引き出すステップが、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって前記ヒト細胞試料からＴＳＣＭ細胞を選別することを含む、請求項４０から４２までのいずれかに記載の方法。
- 前記ヒト血液細胞の集団が、前記１つまたは複数の抗原について血清陽性であるヒトドナーに由来するものである、請求項１から４３までのいずれかに記載の方法。
- 前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団が、前記１つまたは複数の抗原に由来する１つまたは複数のペプチドまたはタンパク質が負荷されていないまたはそれを発現するように遺伝子操作されていない抗原提示細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏにおける実質的な細胞傷害性を欠く、請求項１から４４までのいずれかに記載の方法。
- 前記ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップが、前記ヒト血液細胞の集団を、前記病原体の１つまたは複数の抗原にｅｘ ｖｉｖｏ感作させることを含む、請求項１から４５までのいずれかに記載の方法。
- 前記病原体が、ウイルス、細菌、真菌、蠕虫または原生生物である、請求項４６に記載の方法。
- 前記病原体がウイルスである、請求項４６に記載の方法。
- 前記ウイルスがＣＭＶである、請求項４８に記載の方法。
- 前記ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップが、前記ヒト血液細胞の集団を、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）の１つまたは複数の抗原にｅｘ ｖｉｖｏ感作させることを含む、請求項１から１８まで、２１から２４まで、および２９から４５までのいずれかに記載の方法。
- 前記ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップが、前記ヒト血液細胞の集団を、ＢＫＶ、ＪＣＶ、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、ポックスウイルス、ラブドウイルス、またはパラミクソウイルスの１つまたは複数の抗原にｅｘ ｖｉｖｏ感作させることを含む、請求項１から１８まで、２１から２４まで、および２９から４５までのいずれかに記載の方法。
- 前記ｅｘ ｖｉｖｏ感作ステップが、前記ヒト血液細胞の集団を、前記がんの１つまたは複数の抗原にｅｘ ｖｉｖｏ感作させることを含む、請求項１から１８まで、２１から２４まで、および２９から４５までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記がんが、血液がんである、請求項５２に記載の方法。
- 前記がんが、多発性骨髄腫または形質細胞白血病である、請求項５３に記載の方法。
- 前記がんの前記１つまたは複数の抗原が、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）である、請求項５４に記載の方法。
- 前記がんが、乳がん、肺がん、卵巣がん、胃がん、膵臓がん、喉頭がん、食道がん、精巣がん、肝臓がん、耳下腺がん、胆道がん、結腸がん、直腸がん、子宮頸がん、子宮がん、子宮内膜がん、腎臓がん、膀胱がん、前立腺がん、甲状腺がん、脳がん、または皮膚がんである、請求項５２に記載の方法。
- 病原体またはがんを有するヒト患者を処置する方法であって、（ｉ）請求項１から５６までのいずれかに記載の方法に従って抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成するステップと、（ｉｉ）前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を前記ヒト患者に投与するステップとを含む方法。
- 病原体またはがんを有するヒト患者を処置する方法であって、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を前記ヒト患者に投与するステップであって、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団が、請求項１から５６までのいずれかに記載の方法に従って抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成することを含む方法の産生物である、ステップを含む方法。
- 前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団に含有される前記抗原特異的Ｔ細胞が、前記ヒト患者の疾患細胞と共有するＨＬＡ対立遺伝子によって拘束される、請求項５７または５８に記載の方法。
- 前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団に含有される前記抗原特異的Ｔ細胞が、前記ヒト患者の前記疾患細胞と８つのＨＬＡ対立遺伝子のうち少なくとも２つを共有する、請求項５７から５９までのいずれかに記載の方法。
- 前記８つのＨＬＡ対立遺伝子が、２つのＨＬＡ−Ａ対立遺伝子、２つのＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子、２つのＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子、および２つのＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子である、請求項６０に記載の方法。
- 前記ヒト血液細胞の集団が、前記ヒト患者に対して同種異系であるヒトドナーに由来するものである、請求項５７から６１までのいずれかに記載の方法。
- 前記ヒト患者が、移植ドナーからの移植のレシピエントであり、前記ヒトドナーが、移植ドナーとは異なる第三者ドナーである、請求項６２に記載の方法。
- 前記投与するステップが、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、前記ヒト患者に前記ヒト患者１ｋｇ当たり前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約１×１０５個未満またはそれと等しい用量で投与することを含む、請求項５７から６３までのいずれかに記載の方法。
- 前記投与するステップが、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を前記ヒト患者に前記ヒト患者１ｋｇ当たり前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約５×１０４個未満またはそれと等しい用量で投与することを含む、請求項５７から６３までのいずれかに記載の方法。
- 前記投与するステップが、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を前記ヒト患者に前記ヒト患者１ｋｇ当たり前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約１×１０４個未満またはそれと等しい用量で投与することを含む、請求項５７から６３までのいずれかに記載の方法。
- 前記投与するステップが、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を前記ヒト患者に前記ヒト患者１ｋｇ当たり前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約５×１０３個未満またはそれと等しい用量で投与することを含む、請求項５７から６３までのいずれかに記載の方法。
- 前記投与するステップが、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を前記ヒト患者に前記ヒト患者１ｋｇ当たり前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の細胞約１×１０３個未満またはそれと等しい用量で投与することを含む、請求項５７から６３までのいずれかに記載の方法。
- 前記投与するステップが、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を前記ヒト患者に前記用量で毎週投与することを含む、請求項５７から６８までのいずれかに記載の方法。
- 前記投与するステップが、ボーラス静脈内注入によるものである、請求項５７から６９までのいずれかに記載の方法。
- 前記投与するステップが、少なくとも２用量の、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を前記ヒト患者に投与することを含む、請求項５７から７０までのいずれかに記載の方法。
- 前記投与するステップが、２用量、３用量、４用量、５用量、または６用量の、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を前記ヒト患者に投与することを含む、請求項５７から７０までのいずれかに記載の方法。
- 前記投与するステップが、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、３週間連続して１週間当たり１用量の第１のサイクル、その後、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の用量を投与しない休薬期間、その後、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、３週間連続して１週間当たり前記１用量の第２のサイクルを投与することを含む、請求項５７から７０までのいずれかに記載の方法。
- 前記投与するステップが、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を、３週間連続して１週間当たり１用量のサイクルを２回、３回、４回、５回、または６回投与することを含み、各サイクルが、前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団の用量を投与しない休薬期間によって隔てられる、請求項５７から７０までのいずれかに記載の方法。
- 前記休薬期間が、約１週間、約２週間、約３週間、または約４週間である、請求項７３または７４に記載の方法。
- 前記休薬期間が、約３週間である、請求項７３または７４に記載の方法。
- 前記抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を投与するステップにより前記ヒト患者においていかなる移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）も生じない、請求項５７から７６までに記載の方法。
- 病原体またはがんを有するかまたはその疑いがあるヒト患者への治療的投与のための抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団であって、請求項１から５６までのいずれかに記載の方法に従って抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成することを含む方法の産生物である、集団。
- 病原体またはがんを有するかまたはその疑いがあるヒト患者への治療的投与のための抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団であって、請求項１、請求項３から３０まで、および請求項３２から５６までのいずれかに記載の方法に従って抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団を生成することを含む方法の産生物であり、凍結保存されている、集団。
- 請求項７８または７９に記載の複数の集団を含む細胞バンク。
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