ES2940418T3 - Péptido para la cicatrización de heridas - Google Patents

Abstract

Los péptidos derivados de la región N-terminal de la granulina tienen actividad para promover la proliferación celular, la migración y/o la cicatrización de heridas. Además, se puede diseñar un enlace disulfuro adicional en dichos péptidos para mejorar o modificar de otro modo el plegamiento del péptido. Los péptidos también se pueden modificar, de modo que los residuos de prolina mejoren la capacidad del péptido para promover la proliferación celular. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Péptido para la cicatrización de heridas

Campo técnico

Esta invención se refiere a un péptido aislado y un ácido nucleico aislado y a su uso como medicamento, particularmente para el tratamiento de heridas, un uso de tal péptido o ácido nucleico aislados para promover in vitro la proliferación y migración celular in vitro, a un método de promover la proliferación y/o migración celulares in vitro, a una construcción genética, a una célula anfitriona y a una composición farmacéutica.

Antecedentes

Las granulinas son una familia de factores de crecimiento de proteínas implicados en una amplia gama de funciones fisiológicas y procesos patológicos, incluyendo la embriogénesis, la reparación de heridas, la inflamación y el crecimiento tumoral1. La duela hepática parasitaria humana Opisthorchis viverrinisecreta un miembro de la familia de las granulinas llamado Ov-GRN-1, que se aisló originalmente de los productos excretores/secretores (ES) del trematodo carcinogénico2,3. Ov-GRN-1 fue el primer factor de crecimiento descrito de un patógeno que causaba la proliferación de células anfitrionas4,5. Los autores de la presente invención han demostrado que concentraciones picomolares de Ov-GRN-1 recombinante inducen la angiogénesis y aceleran la reparación de heridas en ratones tras la administración tópica, hallazgos que indican que la granulina de duela hepática podría desarrollarse como un tratamiento para las heridas6.

Una comprensión de la relación estructura-actividad para Ov-GRN-1 permitiría el diseño de la forma más eficaz de esta granulina para cicatrizar heridas. La estructura tridimensional de Ov-GRN-1 no se ha determinado experimentalmente, pero se ha informado sobre estructuras para granulinas de varias especies. La estructura de granulina inicial determinada fue la de la granulina-1 de carpa; esta comprende cuatro horquillas p entrecruzadas entre sí por seis enlaces disulfuro en una disposición en forma de escalera de los enlaces disulfuro7. A pesar de la estructura bien definida observada para la granulina-1 de carpa, las relaciones estructura-función de las granulinas son complejas y parecen depender en gran medida de la secuencia primaria. Esto es particularmente evidente con las granulinas humanas. La proteína precursora de la granulina de mamíferos (progranulina, PGRN) contiene siete repeticiones y media de dominios granulina que tienen una masa molecular de aproximadamente 6 kDa y se procesan proteolíticamente en módulos de granulina individuales después de la secreción de PGRN desde la célula1. La unidad de "media granulina", denominada paragranulina, contiene solo seis restos de cisterna8.

Los siete módulos de granulina humana se ha expresado individualmente y las estructuras se han analizado mediante espectroscopia de RMN9. Tres contienen estructuras tridimensionales relativamente bien definidas en solución (A, C y F), mientras que los otros son principalmente mezclas de isómeros de disulfuro mal estructurados9. La estructura de la granulina A humana incluye una estructura de horquilla p similar a la granulina-1 de carpa, pero existe un trastorno estructural significativo en la región C-terminal. De los módulos de granulina humana bien plegados, la granulina A demuestra una potente inhibición de la proliferación de una línea celular de cáncer de mama, mientras que, por el contrario, la granulina F humana estimula la proliferación celular9. Los péptidos mal plegados exhiben una actividad inhibidora débil o nula. Cabe señalar, sin embargo, que la actividad limitada puede deberse a la ausencia de vías de señalización clave en las células diana y/o que la producción de péptidos recombinantes en bacterias indujo un plegamiento incompleto/incorrecto. Hasta la fecha, la gama de actividades de granulina y sus compañeros de unión es amplia y aparentemente depende de órganos y cofactores10-13.

El análisis estructural con espectroscopia de RMN ha demostrado que las regiones N-terminales de la granulina-1 de carpa y la granulina A humana pueden plegarse independientemente de las regiones C-terminales14- 15. Los análogos truncados de estas dos granulinas que contienen solo dos enlaces disulfuro tienen estructuras de horquilla p, como se muestra para un dominio N-terminal de 30 restos de granulina-1 de carpa (Figura 1).

MJ Smout et al. (PLoS Pathog. 5(10), 1 -16, 2009) describen un factor de crecimiento similar a la granulina secretado por la duela hepática del sudeste asiático (Opisthorchis viverrini), que promueve la proliferación de células anfitrionas. La infección crónica por el gusano parásito Opisthorchis viverrini es una de las principales causas de colangiocarcinoma. Un mecanismo es la secreción de proteínas del parásito con propiedades mitogénicas a los conductos biliares, lo que impulsa la proliferación celular y crea un entorno tumorigénico. Se ha encontrado un homólogo de la granulina humana en los productos excretores/secretores del parásito, a saber, la granulina de O. viverrini, denominada Ov-GRN-1.

MJ Smout et al. (PLoS Pathog. 11 (10), 1-20, 2015) describen que el factor de crecimiento de granulina de O. viverrini, Ov-GRN-1, acelera la cicatrización de heridas y el crecimiento de los vasos sanguíneos, pero también conduce a un microambiente carcinogénico.

En la base de datos UniProt (XP002797809; número de acceso EBI UNIPFIOT: G7Y9L4) se divulga una proteína similar a la granulina que se encuentra en Clonorchis sinensis (duela hepática china). El documento WO 93/15195 A1 divulga péptidos de leucocitos ricos en cistina con un tamaño de aprox. 5 kDa que tienen efectos cicatrizantes de heridas.

W. F. Vranken et al. (J. Pept. Res. 53(5), 590-597, 1999) describen un fragmento de 30 restos de granulina-1 de carpa que se pliega en una pila de dos horquillas beta, la misma conformación que se forma dentro de la proteína nativa. MJ Smout et al. (Protein Expr. Purif. 79(2), 263-70, 2011) describen la expresión, replegamiento y purificación del factor de crecimiento ov-GRN-1.

PS Bansal et al. (J. Med Chem 60(10), 4258-4266, 2017) describen análogos N-terminales de Ov-GRN-1 y su uso como agentes cicatrizantes de heridas.

Compendio

Sorprendentemente, los péptidos derivados de la región N-terminal de la granulina tienen actividad para promover la proliferación, migración celulares y/o cicatrización de heridas. Además, se puede modificar mediante ingeniería genética un enlace disulfuro adicional en tales péptidos para mejorar o modificar de otro modo el plegamiento del péptido.

La invención proporciona un péptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de, o basada en, la secuencia de aminoácidos de una región N-terminal de una proteína granulina, como se define en las reivindicaciones.

En un aspecto, la invención proporciona un péptido aislado que consiste en la secuencia de aminoácidos:

¹Xn C ²XD ³XVYTCR ⁴XGQTC C/A RGLHGYGC ⁵Xm (SEQ ID NO: 1), en donde ¹Xⁿ es una secuencia de aminoácidos de longitud n, con n = 0-11 y siendo ¹X cualquier aminoácido; en donde cada uno de ²X, ³X, y ⁴X es P o A; en donde ⁵X^m es una secuencia de aminoácidos de longitud m, con m = 0-4 y siendo ⁵X cualquier aminoácido; y en donde el péptido aislado comprende, o es capaz de formar, dos o tres enlaces disulfuro intracatenarios.

En una realización, cuando n es 3, ¹Xⁿ = MSF

En una realización, cuando n es 4, ¹Xⁿ = RSPS

En una realización, cuando n es 11, ¹Xⁿ = MDTLQPIRSPS

En una realización, cuando m es 1, ⁵X^m = C o A

En una realización, cuando m es 4, ⁵X^m = APMD

En otra realización, cuando m es 4, ⁵X^m = CPMD

En algunas realizaciones preferidas, al menos uno, al menos dos o cada uno de ²X ³X ⁴X = P.

En algunas realizaciones preferidas, uno de ²X ³X ⁴X = A.

En un aspecto relacionado, la invención proporciona un péptido aislado que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las FIGURAS 1-13 o la Tabla 3 distinta de SEQ ID NO:11.

En una realización particular, el péptido aislado consiste en una secuencia de aminoácidos expuesta en uno cualquiera de SEQ ID NOs: 1-10.

El péptido aislado según la invención comprende, o es capaz de formar, dos o tres enlaces disulfuro intracatenarios. En algunas realizaciones de los aspectos antes mencionados, el péptido aislado es capaz de formar isómeros cis/trans de prolina

En un segundo aspecto de la descripción que no forma parte de la invención, se proporciona un método para modificar un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en uno cualquiera de SEQ ID NOs: 1-11, o una secuencia de aminoácidos al menos 70% idéntica a esta, incluyendo la etapa de incorporación de una o más inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del péptido.

Preferiblemente, la modificación del péptido da como resultado el aumento o mejora de una o más actividades biológicas del péptido.

Un tercer aspecto de la divulgación proporciona un péptido aislado modificado según el método del segundo aspecto. También se proporciona, pero no forma parte de la invención reivindicada, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se unen específicamente al péptido aislado del primer o tercer aspecto.

En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica el péptido aislado según la invención. En otro aspecto más, la invención proporciona una construcción genética que comprende el ácido nucleico aislado del ácido nucleico mencionado anteriormente.

En otro aspecto adicional más, la invención proporciona una célula anfitriona que comprende la construcción genética del aspecto mencionado anteriormente.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el péptido aislado o el ácido nucleico aislado de los aspectos antes mencionados junto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptables. Además, la invención proporciona un polipéptido aislado según la invención para su uso como medicamento, así como un ácido nucleico aislado según la invención para su uso como medicamento.

Además, la invención proporciona un polipéptido aislado según la invención para su uso en el tratamiento de heridas, así como un ácido nucleico aislado según la invención para uso en el tratamiento de heridas.

Otro aspecto más de la invención comprende el uso de un polipéptido aislado según la invención, o un ácido nucleico aislado según la invención, o una construcción genética según la invención, o una composición farmacéutica según la invención, para iniciar, promover, estimular o facilitar la proliferación celular in vitro y/o la migración celular in vitro.

Otro aspecto más de la invención comprende el uso de un polipéptido aislado según la invención, o un ácido nucleico aislado según la invención, o una composición farmacéutica según la invención, para iniciar, promover, estimular o facilitar la proliferación celular in vitro y/o la migración celular in vitro.

En otro aspecto adicional, la invención proporciona un método para promover la proliferación y/o migración celulares in vitro, incluyendo dicho método la etapa de poner en contacto una o más células con el péptido aislado, ácido nucleico aislado o la composición farmacéutica de los aspectos antes mencionados para de ese modo iniciar, estimular o facilitar la proliferación y/o migración de una o más células.

En otro aspecto más de la divulgación que no forma parte de la invención, se proporciona un método para cicatrizar una herida, incluyendo dicho método la etapa de poner en contacto la herida con el péptido aislado, ácido nucleico aislado o la composición farmacéutica de los aspectos antes mencionados para así cicatrizar al menos parcialmente la herida.

En otro aspecto adicional más de la divulgación que no es parte de la invención, se proporciona un método para producir un agente que promueve la proliferación, migración celulares y/o cicatriza heridas, incluyendo dicho método la etapa de identificar, modificar mediante ingeniería genética, escrutar o diseñar un análogo o agonista del péptido aislado de los aspectos mencionados anteriormente que promueve la proliferación y/o migración celulares y/o cicatriza heridas.

Este aspecto de la divulgación también proporciona un agente que promueve la proliferación y migración celulares y/o cicatriza las heridas producidas por el método de este aspecto.

Adecuadamente, el agente puede utilizarse de acuerdo con los métodos de los aspectos mencionados anteriormente.

A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que se indique lo contrario, "comprenden", "comprende"y "que comprende" se utilizan de forma inclusiva y no exclusiva, de modo que un número entero o grupo de números enteros declarados pueden incluir uno o más números enteros o grupos de números enteros no declarados.

Por "consiste esencialmente en" se entiende en este contexto que la proteína aislada o cada fragmento inmunogénico tiene uno, dos o no más de tres restos de aminoácidos además de la secuencia de aminoácidos citada. Los restos de aminoácidos adicionales pueden aparecer en los extremos N y/o C de la secuencia de aminoácidos citada, aunque sin limitación.

También se apreciará que los artículos indefinidos "un", "uno" y "una"no deben leerse como artículos indefinidos singulares o como excluyentes de más de uno o más de un solo sujeto al que se refiere el artículo indefinido. Por ejemplo, "una" proteína incluye una proteína, una o más proteínas o una pluralidad de proteínas.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Estructura tridimensional de un dominio N-terminal de 30 restos de granulina-1 de carpa. (A) Código PDB 1QGM, las hebras p se muestran como flechas de color morado y los enlaces disulfuro en formato de bolas y barras de color amarillo. La imagen fue generada utilizando MolMol. (B) Conectividad de disulfuro en la proteína granulina-1 de carpa de longitud completa7. Las cisteínas se designan con números romanos I-XII consecutivos. Los dos enlaces en la granulina-1 de carpa truncada están resaltados en color amarillo.

Figura 2. Secuencias y desplazamientos secundarios de los análogos truncados de Ov-GRN-1. (A) Las secuencias muestran que CysIV y CysVI se reemplazaron por restos de alanina; las cisteínas se resaltan en color rojo y las sustituciones se muestran en color azul. También se proporcionan los 30 restos N-terminales de granulina-1 de carpa, con CysIV y VI reemplazados por restos de alanina. Los identificadores de secuencia son los siguientes: Ov-GRN(1 -35) = SEC ID NO:2; Ov-GRN(8-38) = SEC ID NO:3; Ov-GRN(12-34) = SEC ID NO:4; y Ov-GRN(12-35) = SEC ID NO:5. (B) Desplazamientos secundarios de péptidos Ov-GRN-1 con cuatro restos de cisteína (Ov-GRN1-35, Ov-GRNe -38 y Ov-GRN12-34). Los desplazamientos secundarios se obtuvieron restando los desplazamientos de bobina aleatorios16 de los desplazamientos de aH. La similitud en los desplazamientos secundarios de los restos conservados indica que el plegamiento global es el mismo en los tres péptidos. El esquema de color se mantiene en las siguientes figuras. Ambos paneles: las líneas de conexión de color negro representan la conectividad del enlace disulfuro.

Figura 3: Análisis estructural de OV-GRN^12-34 y Ov-GRN^i2-35_3s. (A) Desplazamientos secundarios de CV-GRN^12-34 y C^-GRN^{12-35_ 3s} en comparación con la granulina^1-30 de carpa. Los desplazamientos secundarios se obtuvieron restando los desplazamientos de bobina aleatorios¹⁶ de los desplazamientos de aH. Cv-GRN^12-34 tiene desplazamientos secundarios significativamente diferentes en comparación con Cv-GRN^{12-35_ 3s} y carpaⁿ , y carece de cambios positivos que indican una falta de estructura de lámina p. A pesar de las diferencias en la secuencia, las tendencias de los desplazamientos secundarios entre Cv-GRN^12-35_3s y carpaⁿ son similares, lo que indica que la lámina p presente en la granulina-1 de carpa también está presente en Cv-GRN^{12-35_ 3s} (flechas de color negro). (B) Las estructuras de Cv-GRN^12-34 y Ov-GRN^12-35_3s se determinaron mediante espectroscopia de RMN y confirma que Cy-GRN^12-34 no contiene estructura de lámina p pero Cv-GRN^{12-35_ 3s} sí (flechas de color azul). Los enlaces disulfuro se muestran como representaciones de bolas y barras de color amarillo y la estructura de carpa^1-30 se muestran para comparar. Las cadenas laterales de los restos Ser17 y Ser27 se destacan en la estructura de carpa^1-30, para indicar los sitios sustituidos con Cys-Ser de CysIV y Cys VI. Según esta estructura, parece probable que CysIV y CysVI de carpaⁿ podrían formar un enlace disulfuro, compatible con la probable conectividad en Cv-GRN^12-35_3s.

Figura 4. Los péptidos de granulina de duelas hepáticas inducen la proliferación celular. (A) Los péptidos de granulina de Cpisthorchis viverrini pero no los de granulina^1-30 de carpa indujeron la proliferación de colangiocitos humanos H69 en un rango de concentraciones verificadas usando xCELLigence. Solo los tratamientos seleccionados se representan gráficamente para facilitar la visualización. Las líneas de respuesta a la dosis de pendiente variable de mejor ajuste muestran proliferación cuatro días después de una sola aplicación de tratamiento. La potencia de Cv-GRN^12-35_3s se caracterizó por una proliferación celular significativamente mayor observada a concentraciones finales de >15 nM (p<0,05). La flecha de color negro indica una concentración de 400-483 nM utilizada en el panel B. (B) Proliferación media a 400 nM de todos los péptidos sintetizados de Ov-GRN-1 y proteína Cv-GRN-1 483 nM del panel A. ns = no significativo, ****p<0,0001. Ambos paneles: se utilizó la prueba ANOVA de 2 vías con corrección de Dunnett para comparaciones múltiples para comparar tratamientos con controles de tratamiento relevantes (La proteína Cv-GRN-1 con relación a la expresión de tiorredoxina coincidió con el control de proteína recombinante y los péptidos con relación al control de péptido). Valores medios de 4-6 repeticiones agrupadas de 2-4 experimentos con barras de ETM que se muestran arriba o abajo para mayor claridad.

Figura 5. Actividad de cicatrización de heridas de ratón de Ov-GRN-1 y péptidos. (A+B) Resultados de cicatrización de heridas de tratamientos con 56 pmoles de Cv-GRN-1 recombinante , péptidos Ov-GRN-1, péptido no relacionado, controles de proteína tiorredoxina (TRX) y 71 pmoles de Regranex en gel de metilcelulosa al 1,5% aplicado diariamente en un volumen de 50 pl de los días 0-4 a una herida de ~0,2 cm² derivada de punción de biopsia en el cuero cabelludo entre las orejas. Para facilitar la visualización, los datos se dividieron en dos gráficos con el Cv-GRN-1 y grupos de control de péptido mostrados en ambos paneles. No se observaron diferencias significativas entre el control de péptido no relacionado, el PBS o el control de proteína TRX en ningún momento. Las flechas de color negro indican el punto de tiempo del día 4 utilizado en el panel C. (C) Cicatrización de heridas con relación al control de vehículo PBS del día 4. Todos los paneles: tasas medias de cicatrización de 2-6 réplicas biológicas de grupos de 4-5 animales representados con barras ETM. Los grupos se han desplazado marginalmente hacia la izquierda o hacia la derecha para facilitar la visualización. Prueba ANOVA de 2 vías de medidas repetidas con la corrección de Dunnett para comparaciones múltiples que comparan cada grupo con otro grupo. Significación contra el control de péptido/proteína indicado por **** = p<0,0001, *** = p<0,001, ** = p<0,01, * = p<0,05, ns=no significativo. Tratamientos significativos frente a Regranex indicados por # = p<0,05. El color del asterisco o almohadilla representa el grupo relevante. Los colores y símbolos se mantienen en las Figuras 2-5.

Figura 6. Comparación de desplazamiento químico. Comparación de desplazamientos químicos entre los desplazamientos publicados de una forma truncada de granulina de carpa¹⁴ y el mutante con mutaciones C17A y C27A.

Figura 7. Estructura de cisterna conservada en la familia de las granulinas. A) Patrón de conectividad de enlaces disulfuro en granulina Carp-1. (B) Patrón de conectividad de enlace disulfuro en el péptido Cv- GRN-1 N-terminal sintético (GRN ^{12-35_ 3s}). El enlace disulfuro no nativo en GRN ^{12-35_ 3s} en función de la conectividad prevista entre Cys IV y Cys VI se resalta en color rojo; "---" podría ser cualquier residuo.

Figura 8. Trazas de HPLC de péptidos modificados mediante ingeniería genética. Todos los péptidos se oxidaron por oxidación al aire libre durante 24 horas a temperatura ambiente. Las fracciones recolectadas correspondientes al péptido oxidado con la masa molecular esperada según los análisis de espectroscopia MALDI están marcadas con *.

Figura 9. Espectro de RMN bidimensional TOCSY de GRN^12-35_3s en comparación con GRN^3Ala en la región NH. El espectro TOCSY se registró a una concentración de 0,2 mM, 290 K y un tiempo de mezcla de 80 ms. Los restos asignados se muestran con su nombre y número de resto. Los picos adicionales que surgen de la adopción de múltiples confirmaciones por GRN^12-35_3s están recuadrados.

Figura 10. Desplazamientos secundarios de péptidos Ov-GRN^12-35_3s modificados mediante ingeniería genética en comparación con Ov-GRN^12-35_3s. Los desplazamientos secundarios se obtuvieron restando los desplazamientos de bobina aleatorios de los desplazamientos de aH. Las tendencias para los desplazamientos secundarios son similares en comparación con Ov-GRN^i2-35_3s indicando que la lámina p presente en CV-GRN^i2-35_3s se mantiene en análogos mutantes de prolina.

Figura 11. Estructura tridimensional de Ov-GRN ^{i2 -35_3s} (izquierda) y GRN ^3Aia (derecha). Las estructuras se determinaron mediante espectroscopia de RMN. Las cadenas laterales de los restos de prolina 2, prolina 4 y prolina 10 se resaltan en Cv-GRN^12-35_3s. Los restos de prolina se reemplazan por alanina, cuyas cadenas laterales están resaltadas, en GRN^3Ala.

Figura 12. Efecto de péptidos Ov-GRN ^12-35_3s modificados mediante ingeniería genética sobre la proliferación celular in vitro de células H69. Las células H69 se trataron con concentraciones de péptido 200 nM durante 48 h. Las tasas de proliferación de péptidos se midieron como se describe en materiales y métodos, y los valores se proporcionan como porcentaje. Los datos se analizaron mediante ANOVA de una vía. La significación se fijó en ns P<0,05, ** P<0,001, *** P<0,001 ****P<0,0001. Los valores estadísticamente diferentes de P<0,0001(C^v-G^r N^12-35_3s, GRN^{p 2a} , GRN^{p 4a} y GRN^{p 1ü a}) y P = 0,90 (GRN3Ala) se determinaron en comparación con el péptido de control Loop6.

Figura 13. Actividad de cicatrización de heridas de ratón de Ov-GRN-1 y péptidos. (A) Los resultados de cicatrización de heridas del día 4 se muestran con relación al control de péptido de 56 pmoles de tratamientos con 56 pmoles de Cv-GRN-1 recombinante , péptidos Cv-GRN-1, controles de proteína tiorredoxina (TRX) y 71 pmoles de Regranex en gel de metilcelulosa al 1,5 % aplicados diariamente en un volumen de 50 gl de los días 0-4 a una herida de ~0,2 cm² derivada de punción de biopsia en el cuero cabelludo entre las orejas. (B) Secuencias de aminoácidos de péptidos. GRN27sps = SEC ID NO: 10.

Breve descripción de la lista de secuencias

SEQ ID NO:1 Secuencia de aminoácidos del péptido Cv-GRN-1 truncado

SEQ ID NO:2 Secuencia de aminoácidos del péptido Cv-GRN(1-35).

SEQ ID NO:3 Secuencia de aminoácidos del péptido Cv-GRN(8-38).

SEQ ID NO:4 Secuencia de aminoácidos del péptido Cv-GRN(12-34).

SEQ ID NO:5 Secuencia de aminoácidos del péptido Cv-GRN(12-35).

SEQ ID NO:6 Secuencia de aminoácidos del péptido GRN(P2A).

SEQ ID NO:7 Secuencia de aminoácidos del péptido GRN(P4A).

SEQ ID NO:8 Secuencia de aminoácidos del péptido GRN(P10A).

SEQ ID NO:9 Secuencia de aminoácidos del péptido GRN(3Ala).

SEQ ID NO: 10 Secuencia de aminoácidos de GRN27sps.

SEQ ID NO: 11 Secuencia de aminoácidos del péptido Carp(1-30).

Descripción detallada

La presente invención se basa, al menos en parte, en la síntesis de versiones truncadas de Cv-GRN-1, y/o variantes del mismo, determinando las propiedades de plegamiento de estos y su actividad en la proliferación celular y cicatrización de heridas. La región N-terminal de Cv-GRN-1 mostró nuevas propiedades de plegamiento y una potente actividad de proliferación celular. Algunos de estos péptidos truncados y variantes se han probado en un modelo de cicatrización de heridas en ratones y son tan potentes como la proteína de longitud completa y tan potentes, o incluso superiores, a Regranex, un agente de cicatrización de heridas utilizado clínicamente.

Por consiguiente, un aspecto de la invención se relaciona con un péptido aislado que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Para los propósitos de esta invención, por "aislado" se quiere significar un material que ha sido extraído de su estado natural o que ha sido objeto de manipulación humana. El material aislado puede estar sustancial o esencialmente libre de los componentes que normalmente lo acompañan en su estado natural, o puede ser manipulado para estar en un estado artificial junto con los componentes que normalmente lo acompañan en su estado natural. El material aislado puede estar en forma nativa, química sintética o recombinante.

Por "proteína" se quiere significar un polímero de aminoácidos. Los aminoácidos pueden ser aminoácidos naturales o no naturales, D- o L-aminoácidos como se entiende bien en la técnica.

El término "proteína" incluye y abarca "péptido", que se utiliza típicamente para describir una proteína que no tiene más de cincuenta (50) aminoácidos y "polipéptido", que se utiliza típicamente para describir una proteína que tiene más de cincuenta (5^ü) aminoácidos. Una realización de la invención proporciona un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 7Ü%.

El péptido aislado según la invención consiste en la secuencia de aminoácidos:

¹Xn C ²XD ³XVYTCR ⁴XGQTC C/A RGLHGYGC ⁵Xm (SEQ ID NO: 1) en donde n es 0-11 y m es 0-4.

¹Xⁿ es una secuencia de aminoácidos de longitud n, con n = 0-11 y siendo ¹X cualquier aminoácido. Se apreciará que cuando n es cero, no hay ningún aminoácido presente.

Cada uno de ²X, ³X, y ⁴X es P o A.

En una realización, cuando n es 4, ¹Xⁿ = RSPS

En una realización, cuando n es 3, ¹Xⁿ = MSF

En una realización, cuando n es 11, ¹Xⁿ = MDTLQPIRSPS

⁵X^m es una secuencia de aminoácidos de longitud m, con m = 0-4 y siendo ⁵X cualquier aminoácido. Se apreciará que cuando m es cero, no hay ningún aminoácido presente.

En una realización, cuando m es 1, ⁵X^m = C o A.

En una realización, cuando m es 4, ⁵X^m = APMD.

En otra realización, cuando m es 4, ⁵X^m = CPMD

Cada uno de ²X ³X ⁴X es independientemente P o A.

En algunas realizaciones preferidas, al menos uno, al menos dos o cada uno de ²X ³X ⁴X = P.

En algunas realizaciones preferidas, uno de ²X ³X ⁴X = A.

El péptido aislado comprende, o es capaz de formar, dos o tres enlaces disulfuro intracatenarios.

En realizaciones particulares, el péptido aislado consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOs: 1-10.

Los péptidos aislados que consisten en las respectivas secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2-5 pueden denominarse en presente documento como:

SEQ ID NO:2 CV-GRN^1-35, Ov-GRN(1 -35), o GRN^1-35;

SEQ ID NO:3 O^v-GRN^b-38, O^v-GRN(8-38), o GRN^8-38;

SEQ ID NO:4 OV-GRN^12-34, Ov-GRN(2-24), o GRN^2-24;

SEQ ID NO:5 Ov-GRN^12-35_^3s, Ov-GRN(12-35), o GRN^12-35_^3s

Con referencia a los Ejemplos y las FIG. 4 y 5, se demostró que los péptidos aislados que consisten en SEQ ID NOs: 2-5 son capaces de promover la proliferación celular y/o cicatrización de heridas en un grado o nivel tan alto como o más alto que el de Regranex.

En algunas realizaciones, el péptido aislado comprende dos o tres enlaces disulfuro intracatenarios. Como se apreciará a partir de las secuencias de aminoácidos que se muestran en la FIG. 2, SEQ ID NOs: 2-4 comprenden cuatro (4) restos de cisteína que forman dos (2) enlaces disulfuro, mientras que SEQ ID NO: 5 comprende seis (6) restos de cisteína que forman tres (3) enlaces disulfuro. Aunque sin desear vincularse a ninguna teoría en particular, se propone que el péptido aislado de SEQ ID NO:5 puede plegarse de una manera similar a una proteína granulina de longitud completa.

Los péptidos aislados que consisten en las respectivas secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 6-8 pueden denominarse en el presente documento como:

SEQ ID NO:6 ^{O v} -GRN^{p 2A}, ^{O v} -GRN(P2A), GRN^{p 2A}, GRN24(P2A);

SEQ ID NO:7 ^{O v} -GRN^{p 4A}, ^{O v} -GRN(P4A), GRN^{p 4A}, GRN24(P4A);

SEQ ID NO:8 Ov-GRN^p10a, ^{O v} -GRN(P10A), GRN^{p 10A}, GRN(P 10A);

Cada una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 6-8 es una forma de SEQ ID NO: 1 en donde uno de ²X ³X ⁴X es alanina, y el resto de ²X ³X ⁴X son prolina. Con referencia a los Ejemplos y la Tabla 3, cada una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 6-8 también es una variante de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, en donde el único resto de prolina respectivo de SEQ ID NO: 5 ha sido sustituido por un resto de alanina.

En otra realización, el péptido aislado comprende, consiste esencialmente en, o consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 9, o fragmentos o variantes de la misma. Un péptido aislado que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 puede denominarse en presente documento como Ov-GRN^3Ala, Ov-GRN(3Ala), o GRN^3Ala. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 es una forma de SEQ ID NO: 1 en donde cada uno de ²X ³X ⁴X es alanina. Con referencia a los Ejemplos y la Tabla 3, SEQ ID NO: 9 también es una variante de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, en donde cada uno de los tres restos de prolina de SEQ ID NO: 5 se ha sustituido por un resto de alanina.

Como se expone en los Ejemplos y la FIG. 12, los péptidos aislados con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 6-8 aumentaron la proliferación celular a las mismas o mayores tasas que un péptido con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Sin embargo, un péptido aislado con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 no mejoró la proliferación celular.

Por consiguiente, en algunas realizaciones preferidas, el péptido aislado comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 en donde al menos uno, pero preferiblemente menos de tres, de ²X ³X ⁴X es alanina. Preferiblemente uno de ²X ³X ⁴X es alanina. Preferentemente al menos uno de ²X ³X ⁴X es prolina.

Se apreciará adicionalmente, con referencia a los Ejemplos y las Figuras 9-10, que los péptidos con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 5-8 demostraron múltiples conformaciones que estaban ausentes en un péptido con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9. Sin estar vinculados a la teoría, se cree que estas conformaciones múltiples son el resultado de la formación de isómeros cis/trans de prolina en SEQ ID NOs:5-8, pero no en SEQ ID NO:9. Estas conformaciones múltiples pueden contribuir a la actividad biológica observada presente en péptidos con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 5-8, pero ausentes en un péptido con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

En consecuencia, en algunas realizaciones preferidas, el péptido aislado es capaz de formar isómeros cis/trans de prolina.

SEQ ID NO:10 comprende una secuencia de aminoácidos N-terminal SPS. SEQ ID NO: 10 puede denominarse en presente documento como Ov-GRN^sps, ^{O v} -GRN(SPS), GRN^sps, o GRN27sps.

La divulgación también proporciona péptidos aislados que comprenden una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 70% a uno cualquiera de SEQ ID NOs: 1-10, denominados en el presente documento "variantes" de péptidos.

Como se emplea en el presente documento, una "variante" de péptido tiene al menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos expuestas en uno cualquiera de SEQ ID NOs: 1-10. La "variante" de péptido divulgada en presente documento puede tener uno o más aminoácidos eliminados o sustituidos por diferentes aminoácidos. Se entiende bien en la técnica que algunos aminoácidos pueden sustituirse o eliminarse sin cambiar la actividad biológica del péptido (sustituciones conservativas). Convenientemente, la variante tiene al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de la actividad biológica del péptido aislado de uno cualquiera de SEQ ID NOs:1-10. En realizaciones particulares, la variante comprende, o es capaz de formar, dos o tres enlaces disulfuro intracatenarios.

Los términos utilizados generalmente en presente documento para describir las relaciones de secuencia entre las respectivas proteínas y ácidos nucleicos incluyen "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia"e "identidad sustancial". Debido a que los ácidos nucleicos/proteínas respectivos pueden comprender cada uno (1) solo una o más porciones de una secuencia completa de ácido nucleico/proteína que comparten los ácidos nucleicos/proteínas, y (2) una o más porciones que son divergentes entre los ácidos nucleicos/proteínas, las comparaciones de secuencias se realizan típicamente comparando secuencias en una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación" se refiere a un segmento conceptual típicamente de 6, 9 o 12 restos contiguos que se compara con una secuencia de referencia. La ventana de comparación puede incluir adiciones o deleciones (es decir, huecos) de aproximadamente 20% o menos en comparación con la secuencia de referencia para un alineamiento óptimo de las secuencias respectivas. El alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación se puede realizar mediante implementaciones computarizadas de algoritmos (programa Geneworks de Intelligenetics; GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA) o mediante inspección y seleccionando el mejor alineamiento (es decir dando como resultado el mayor porcentaje de homología sobre la ventana de comparación) generado por cualquiera de los diversos métodos. También se puede hacer referencia a la familia de programas BLAST como, por ejemplo, la divulgada por Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25 3389. Se puede encontrar una discusión detallada del análisis de secuencias en la Unidad 19.3 de CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel et al. (John Wiley & Sons Inc NY, 1995-2015).

El término "identidad de secuencia” se emplea en el presente documento en su sentido más amplio para incluir el número de coincidencias exactas de nucleótidos o aminoácidos teniendo en cuenta un alineamiento apropiado utilizando un algoritmo convencional, teniendo en cuenta la medida en que las secuencias son idénticas en una ventana de comparación. Así, un "porcentaje de identidad de secuencia"se calcula comparando dos secuencias alineadas de forma óptima en la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica (p. ej., A, T, C, G, I) aparece en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. Por ejemplo, "identidad de secuencia" puede entenderse como el "porcentaje de coincidencia" calculado por el programa informático DNASIS (Versión 2.5 para Windows; disponible de Hitachi Software Engineering Co., Ltd., South San Francisco, California, EE. UU.).

La divulgación también proporciona fragmentos del péptido aislado divulgado en presente documento. En algunas realizaciones, los fragmentos pueden comprender, consistir esencialmente en, o consistir en 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33 o 34 aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 1-10. En realizaciones particulares, los fragmentos comprenden, o son capaces de formar, dos o tres enlaces disulfuro intracatenarios.

Adecuadamente, los fragmentos son biológicamente activos. Preferiblemente, el fragmento tiene al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de la actividad biológica del péptido aislado de uno cualquiera de SEQ ID NOs:1-10.

También se proporcionan derivados del péptido aislado divulgado en el presente documento. Como se emplea en el presente documento, las proteínas o péptidos "derivados" han sido alterados, por ejemplo, por conjugación o formación de complejos con otros radicales químicos, por modificación postraduccional (p. ej., fosforilación, ubiquitinación, glicosilación), modificación química (p. ej., entrecruzamiento, acetilación, biotinilación, oxidación o reducción y similares ), conjugación con marcas (p. ej., fluoróforos, enzimas, isótopos radiactivos) y/o inclusión de secuencias de aminoácidos adicionales como se entendería en la técnica.

A este respecto, se remite al experto en la técnica al Capítulo 15 de CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE, Eds. Coligan et al. (John Wiley & Sons NY 1995-2015) para una metodología más extensa relacionada con la modificación química de proteínas.

Las secuencias de aminoácidos adicionales pueden incluir secuencias de aminoácidos compañeras de fusión que crean una proteína de fusión. A modo de ejemplo, las secuencias de aminoácidos compañeras de fusión pueden ayudar en la detección y/o purificación de la proteína de fusión aislada. Los ejemplos no limitantes incluyen compañeros de fusión de unión de metales (p. ej. polihistidina), proteína de unión a maltosa (MBP), Proteína A, glutatión S-transferasa (GST), secuencias de proteínas fluorescentes (p. ej. GFP), etiquetas de epítopos tales como myc, FLAG y etiquetas de hemaglutinina.

Los péptidos, variantes y/o derivados aislados de la presente divulgación pueden producirse por cualquier medio conocido en la técnica, incluidos, pero sin limitarse a, síntesis química y tecnología de ADN recombinante.

La síntesis química incluye la síntesis en fase sólida y en fase de solución. Tales métodos son bien conocidos en la técnica, aunque se hace referencia a ejemplos de técnicas de síntesis química como se proporciona en el Capítulo 9 de SYNTHETIC VACCINES Ed. Nicholson (Blackwell Scientific Publications) y el Capítulo 15 de CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al., (John Wiley & Sons, Inc. NY EE. UU. 1995-2008). En este sentido, también se hace referencia a la Publicación Internacional W^o 99/02550 y la Publicación Internacional WO 97/45444.

Las proteínas recombinantes pueden ser preparadas convenientemente por un experto en la técnica utilizando protocolos convencionales como, por ejemplo, los descritos por Sambrook et al., MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989), en particular las Secciones 16 y 17; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLO^g Y Eds. Ausubel et al., (John Wiley & Sons, Inc. NY USA 1995-2008), en particular los Capítulos 10 y 16; y CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al., (John Wiley & Sons, Inc. NY USA 1995-2008), en particular los Capítulos 1,5 y 6.

Un aspecto de la divulgación que no pertenece a la invención proporciona un método para aumentar la modificación, alteración o cambio de un péptido con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 10, o una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 70% a la misma, incluida la etapa de incorporación de una o más inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del péptido.

Preferiblemente, la modificación, alteración o cambio del péptido aumenta o potencia una o más actividades biológicas del péptido. En realizaciones preferidas, la actividad biológica se selecciona entre la actividad sobre la proliferación celular y la actividad sobre la cicatrización de heridas.

En ciertas realizaciones preferidas en donde el péptido que se modifica de acuerdo con este aspecto es un péptido con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 11, o una variante de la misma, el método incluye la etapa de insertar y/o eliminar un resto de valina en la secuencia de aminoácidos del péptido. Con referencia a la FIG. 2 (A), las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NOs: 2-5 presentan una inserción de valina con relación a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 11, entre un resto CysI y un resto CysII de SEQ ID NO:11. Además, las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NOs: 2-5 presentan una deleción de valina con relación a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 11, entre un resto CysII I y un resto CysIV de SEQ ID NO: 11. Como se expone en las FIG. 4-5, los péptidos con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NOs: 2-5 demostraron una actividad aumentada o potenciada con respecto a la proliferación celular y/o cicatrización de heridas, con relación a un péptido con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 11.

En ciertas realizaciones preferidas en donde el péptido que se modifica de acuerdo con este aspecto es un péptido con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 11, o una variante de la misma, el método incluye la etapa de sustituir un resto de alanina por un resto de cisteína. Preferiblemente, la sustitución alanina/cisteína da como resultado un motivo cisteína-cisteína en la secuencia de aminoácidos del péptido. Con referencia a la FIG. 2(A), la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:5 presenta una sustitución de cisteína con relación a una alanina de SEQ ID NO:11. La sustitución de cisteína está ubicada entre un resto CysII I y un resto CysIV de SEQ ID NO: 11, y forma un motivo cisteína-cisteína en SEQ ID NO: 5.

En ciertas realizaciones preferidas en donde el péptido que se modifica es un péptido con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 5, o una variante de la misma, el método incluye la etapa de sustituir un resto de prolina por un resto de alanina. Con referencia a la Tabla 3, SEQ ID NOs: 6-8 presentan una sustitución de alanina con relación a una prolina de SEQ ID NO: 5. Como se expone en la FIG. 12, los péptidos con la secuencia de aminoácidos expuesta en cada uno de SEQ ID NOs:6-8 mostraron un mayor porcentaje de aumento de la tasa de proliferación celular, con relación a un péptido con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:5.

Otro aspecto de la divulgación proporciona un péptido aislado producido según el método del aspecto anterior. Preferiblemente, dicho péptido aislado tiene una actividad biológica aumentada o potenciada.

La invención también proporciona un ácido nucleico aislado que codifica el péptido aislado de uno cualquiera de SEQ ID NOs: 1-10.

El término "ácido nucleico” como se emplea en el presente documento, designa ADN y ARN de hebra sencilla o doble. El ADN incluye ADN genómico y ADNc. El ARN incluye ARNm, ARN, ARNi, ARNip, ARNc y ARN autocatalítico. Los ácidos nucleicos también pueden ser híbridos de ADN-ARN. Un ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que típicamente incluye nucleótidos que comprenden una base A, G, C, T o U. Sin embargo, las secuencias de nucleótidos pueden incluir otras bases tales como inosina, metilcitosina, metilinosina, metiladenosina y/o tiouridina, aunque sin limitarse a las mismas.

En un aspecto, el ácido nucleico aislado está en una construcción genética que comprende el ácido nucleico aislado ligado o conectado operablemente a uno o más componentes genéticos. Una construcción genética puede ser adecuada para el suministro terapéutico del ácido nucleico aislado o para la producción de proteínas recombinantes en una célula anfitriona.

En términos generales, la construcción genética está en forma de, o comprende componentes genéticos de, un plásmido, bacteriófago, cósmido, levadura o cromosoma artificial bacteriano, como se entiende bien en la técnica. Las construcciones genéticas pueden ser adecuadas para el mantenimiento y la propagación del ácido nucleico aislado en bacterias u otras células anfitrionas, para la manipulación mediante tecnología de ADN recombinante y/o la expresión del ácido nucleico de la invención o una proteína codificada.

A los efectos de la expresión en la célula anfitriona, la construcción genética es una construcción de expresión. Adecuadamente, la construcción de expresión comprende el ácido nucleico de la invención ligado operablemente a una o más secuencias adicionales en un vector de expresión. Un "vector de expresión"puede ser un vector extracromosómico autorreplicante, tal como un plásmido, o un vector que se integra en el genoma del anfitrión.

Por "conectado operablemente " se quiere significar que dicha o dichas secuencias de nucleótidos adicional o adicionales está/están posicionadas con respecto al ácido nucleico de la invención preferiblemente para iniciar, regular o controlar de otro modo la transcripción.

Las secuencias de nucleótidos reguladoras serán generalmente apropiadas para la célula anfitriona utilizada para la expresión. Se conocen en la técnica numerosos tipos de vectores de expresión apropiados y secuencias reguladoras adecuadas para una variedad de células anfitrionas.

Típicamente, dichas una o más secuencias de nucleótidos reguladoras pueden incluir, pero sin limitarse a, secuencias promotoras, secuencias líder o señal, sitios de unión ribosómica, secuencias de poliadenilación, secuencias de inicio y terminación de la transcripción, secuencias de inicio y terminación de la traducción y secuencias potenciadoras o activadoras.

La invención contempla los promotores constitutivos, reprimibles o inducibles conocidos en la técnica.

La construcción de expresión también puede incluir una secuencia de nucleótidos adicional que codifica un compañero de fusión (típicamente proporcionada por el vector de expresión) de manera que la proteína recombinante se exprese como una proteína de fusión, como se describe anteriormente.

La construcción de expresión también puede incluir una secuencia de nucleótidos adicional que codifica un marcador de selección tal como ampR, neoR o kanR, aunque sin limitarse a los mismos.

En realizaciones particulares relacionadas con el suministro de ácidos nucleicos aislados a una herida o a un sujeto, la construcción de expresión puede estar en forma de ADN plasmídico, que comprende adecuadamente un promotor operable en una célula animal (p. ej., un promotor de CMV, A-cristalina a o SV40). En otras realizaciones, el ácido nucleico puede estar en forma de una construcción viral tal como un vector adenoviral, vaccinia, lentiviral o viral adenoasociado.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una célula anfitriona transformada con una molécula de ácido nucleico o una construcción genética descrita en el presente documento.

Las células anfitrionas adecuadas para la expresión pueden ser procarióticas o eucarióticas. Por ejemplo, las células anfitrionas adecuadas pueden incluir, pero sin limitarse a, células de mamífero (p. ej., células HeLa, Cos, NIH-3T3, HEK293T, Jurkat), células de levadura (p. ej., Saccharomyces cerevisiae), células de insecto (p. ej., Sf9, Trichoplusia ni) utilizadas con o sin un sistema de expresión de baculovirus, células vegetales (p. ej. Chlamydomonas reinhardtii, Phaeodactylum tricornutum) o células bacterianas, tales como E. coli. La introducción de construcciones genéticas en células anfitrionas (ya sean procarióticas o eucarióticas) es bien conocida en la técnica, como se describe, por ejemplo, en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel et al., (John Wiley & Sons, Inc. 1995-2015), en particular los Capítulos 9 y 16.

En aspectos particulares, la invención proporciona el uso del péptido aislado divulgado en el presente documento, tal como el que comprende la secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de SEQ ID NOs: 1-10, para promover la proliferación, migración celulares y/o cicatrización de heridas in vitro. También se proporciona el uso de un ácido nucleico que codifica un péptido aislado divulgado en el presente documento, o una construcción genética o un vector que comprende el mismo, para promover la proliferación, migración celulares y/o cicatrización de heridas in vitro.

Un aspecto de la invención proporciona un método para promover la proliferación y/o migración celulares in vitro, incluyendo dicho método la etapa de poner en contacto una o más células con el péptido aislado o un ácido nucleico codificante para así iniciar, estimular o facilitar la proliferación y/o migración de las una o más células.

Otro aspecto de la divulgación, que no pertenece a la invención reivindicada, proporciona un método para cicatrizar una herida, incluyendo dicho método la etapa de poner en contacto la herida con el péptido aislado o un ácido nucleico codificante para así cicatrizar al menos parcialmente la herida.

Por lo tanto, el péptido aislado divulgado en el presente documento puede promover la proliferación y/o migración de células que facilitan la cicatrización de heridas en un sujeto. Esto puede incluir alternativa o adicionalmente la promoción de la migración de células a la herida que facilitan la cicatrización de heridas. Tales células pueden incluir macrófagos, neutrófilos, células epidérmicas, queratinocitos, células dendríticas (p. ej., células de Langerhans), células vasculares, fibroblastos, plaquetas, linfocitos y/o progenitores de cualquiera de estas células, aunque sin limitarse a las mismas.

Como se emplea generalmente en presente documento, un "herida" puede ser cualquier abrasión dañina o ruptura física del sistema tegumentario, tal como la piel, e incluir cortes, lesiones, úlceras y quemaduras.

En ciertas realizaciones, que no pertenecen a la invención reivindicada, la divulgación proporciona el tratamiento de una herida, que incluye abrasiones, cortes, lesiones, úlceras y quemaduras. Por "tratamiento" se quiera significar un curso de acción terapéutico que al menos parcialmente mejora, reduce, elimina o suprime uno o más síntomas o resultados de una enfermedad, trastorno o afección. En algunas realizaciones, el tratamiento puede incluir alternativa o adicionalmente la profilaxis mediante la cual se previene al menos parcialmente la recurrencia o reaparición de uno o más síntomas o resultados de la enfermedad, trastorno o afección.

En algunas realizaciones, la etapa de poner en contacto la herida con el péptido aislado o el ácido nucleico codificante puede incluir la administración sistémica del péptido aislado o el ácido nucleico codificante al sujeto o la administración tópica del péptido aislado o el ácido nucleico codificante a la herida.

En algunas realizaciones, para fines de administración al sujeto, el péptido aislado o el ácido nucleico codificante pueden estar en forma de una composición farmacéutica que comprende el péptido aislado o el ácido nucleico codificante junto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptables.

Por "portador, diluyente o excipiente” se quiere significar generalmente una carga sólida o líquida, diluyente, disolvente, vehículo o sustancia encapsulante que se puede utilizar con seguridad en la administración sistémica. Dependiendo de la ruta particular de administración, se puede utilizar una variedad de portadores bien conocidos en la técnica. Estos portadores pueden seleccionarse de un grupo que incluye azúcares, almidones, celulosa y sus derivados, malta, gelatina, talco, sulfato de calcio, deslizantes, aceites vegetales, aceites sintéticos, polioles, ácido algínico, soluciones tamponadas con fosfato, emulsionantes, solución salina isotónica y sales tales como sales de ácidos minerales que incluyen hidrocloruros, bromuros y sulfatos, ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos y malonatos y agua libre de pirógenos.

Una referencia general útil que describe portadores, diluyentes y excipientes es Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N.J. Ee . UU., 1991).

Se contempla cualquier procedimiento adecuado para producir composiciones, tales como composiciones de vacunas. Los procedimientos ilustrativos incluyen, por ejemplo, los descritos en New Generation Vaccines (1997, Levine et al., Marcel Dekker, Inc. Nueva York, Basilea, Hong Kong)

Puede emplearse cualquier vía de administración segura para proporcionar a un animal la composición de la invención. Por ejemplo, puede emplearse la administración tópica, oral, rectal, parenteral, sublingual, bucal, intravenosa, intranasal, intraarticular, intramuscular, intradérmica, subcutánea, por inhalación, intraocular, intraperitoneal, intracerebroventricular y transdérmica.

Las formas de dosificación incluyen comprimidos, dispersiones, suspensiones, ungüentos, pomadas, cremas, pastas, dispersiones, inyecciones, soluciones, jarabes, trociscos, cápsulas, pulverizaciones nasales, supositorios, aerosoles, parches transdérmicos y similares. Estas formas de dosificación también pueden incluir inyectar o implantar dispositivos de liberación controlada diseñados específicamente para este propósito u otras formas de implantes modificados para actuar adicionalmente de esta manera. La liberación controlada del agente terapéutico puede efectuarse recubriéndolo, por ejemplo, con polímeros hidrófobos que incluyen resinas acrílicas, ceras, alcoholes alifáticos superiores, ácidos poliláctico y poliglicólico y ciertos derivados de celulosa tales como hidroxipropilmetilcelulosa. Además, la liberación controlada puede efectuarse utilizando otras matrices poliméricas, liposomas y/o microesferas.

Las composiciones adecuadas para la administración pueden presentarse como unidades discretas tales como cápsulas, comprimidos oblongos, sobres, alimentos para seres humanos o animales funcionales o comprimidos, o en forma polvo o gránulos o en forma de solución o suspensión en un líquido acuoso, un líquido no acuoso, una emulsión de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite.

La composición se puede administrar de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea inmunológicamente eficaz. La dosis administrada a un sujeto debería ser suficiente para producir una respuesta beneficiosa en un sujeto durante un período de tiempo apropiado. La cantidad de agente o agentes que se va a administrar puede depender del sujeto que se vaya a tratar incluyendo la edad, sexo, peso y estado general de salud del mismo, factores que dependerán del criterio del facultativo.

Como se emplea generalmente en el presente documento, un "sujeto" puede ser cualquier animal, incluidos los mamíferos, preferiblemente un ser humano. Las aplicaciones veterinarias pueden ser adecuadas para la cicatrización de heridas en animales tales como peces, aves de corral, mascotas domésticas, caballos de carreras, ganado y otros sujetos no humanos, aunque sin limitarse a los mismos.

En otro aspecto adicional más, la divulgación proporciona un método para producir un agente que promueve la proliferación, migración celulares y/o cicatrización de heridas, incluyendo dicho método la etapa de identificar, modificar mediante ingeniería genética, escrutar o diseñar un análogo, mimético o agonista del péptido aislado divulgado en el presente documento que promueve la proliferación, migración celulares y/o cicatrización de heridas.

Se apreciará que la presente invención proporciona información sobre el plegado de CV-GRN-1 y que la región N-terminal contribuye a la bioactividad. Dadas las dificultades para producir Cy-GRN-1 en grandes cantidades, el desarrollo de péptidos derivados de la proteína que mantienen o aumentan la bioactividad (tales como SEQ ID NOs: 1-10) puede facilitar la identificación, la modificación mediante ingeniería genética, el escrutinio o el diseño de un análogo, mimético o agonista del péptido aislado que podría ser una molécula líder para el desarrollo de nuevos agentes para la cicatrización de heridas.

El agente puede ser un péptido u otra proteína, una molécula orgánica pequeña, un mono-, oligo- o polisacárido, un lípido, un ácido nucleico o una combinación de estos que tengan una actividad de proliferación, migración celulares y/o cicatrización de heridas que al menos en parte imite la del péptido aislado divulgado en el presente documento. En algunas realizaciones ventajosas, la bioactividad del agente puede ser mayor que la del péptido aislado cuando se compara molécula a molécula.

En algunas realizaciones, el agente puede diseñarse racionalmente o modificarse mediante ingeniería genética de novo basándose en características estructurales deseadas o predichas o características que indican que el agente tiene una actividad de proliferación, migración celulares y/o cicatrización de heridas que imita al menos parcialmente la del péptido aislado divulgado en el presente documento. En otras realizaciones, el agente puede identificarse escrutando una biblioteca de moléculas sin una selección inicial basada en las características o características estructurales deseadas o predichas que indican que el agente tiene una actividad de proliferación, migración celulares y/o cicatrización de heridas que imita al menos parcialmente la del péptido aislado divulgado en el presente documento. Tales bibliotecas pueden comprender bibliotecas generadas aleatoriamente o dirigidas de proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, bibliotecas de presentación en fagos, bibliotecas de moléculas de origen natural y/o bibliotecas combinatorias de moléculas orgánicas sintéticas.

Los ejemplos no limitantes de mecanismos aplicables al diseño y/o escrutinio de moduladores candidatos pueden emplear cristalografía de rayos X, espectroscopia de RMN, escrutinio asistido por ordenador de bases de datos estructurales, modelado asistido por ordenador o mecanismos bioquímicos o biofísicos que detectan, modelan o predicen interacciones de plegamiento y/o unión, como son bien conocidas en la técnica.

Los mecanismos biofísicos y bioquímicos que identifican interacciones moleculares incluyen ensayos competitivos de unión de radioligandos, co-inmunoprecipitación, ensayos basados en fluorescencia, incluidos ensayos de unión de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), electrofisiología, ultracentrifugación analítica, transferencia de marcas, entrecruzamiento químico, espectroscopia de masas, microcalorimetría, resonancia de plasmón superficial y métodos basados en biosensores ópticos, tales como los proporcionados en el Capítulo 20 de CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al., (John Wiley & Sons, 1997-2015). Los mecanismos bioquímicos, tales como los métodos de escrutinio de dos híbridos y de presentación en fagos, se proporcionan en el Capítulo 19 de CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al., (John Wiley & Sons, 1997-2015).

Se entenderá que un agente identificado, modificado mediante ingeniería genética, escrutado o diseñado como se divulga en el presente documento puede ser adecuado para su uso en métodos para promover la proliferación, migración celulares y/o cicatrización de heridas como se describió anteriormente.

También se proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se unen específicamente al péptido aislado divulgado en presente documento. Por "se unen específicamente” se quiere significar que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se unen al péptido aislado con una afinidad sustancialmente mayor que otra proteína, tal como una proteína granulina de tipo salvaje.

El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal como se conoce bien en la técnica. Los fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos de cadena sencilla tales como fragmentos scFv, fragmentos Fab y Fab'2, diacuerpos y triacuerpos, aunque sin limitarse a los mismos. Los anticuerpos policlonales se pueden producir mediante inmunización con el péptido aislado seguido de purificación de anticuerpos séricos. Los anticuerpos monoclonales se pueden producir mediante inmunización con el péptido aislado seguido de fusiones de células de bazo y purificación de anticuerpos, o se pueden producir mediante tecnología de ADN recombinante. El anticuerpo recombinante o los fragmentos de anticuerpo pueden modificarse mediante ingeniería genética para que comprendan secuencias de aminoácidos de unión a antígeno deseadas (p. ej., secuencias CDR) y/o modificarse para facilitar la administración a un sujeto particular con probabilidad reducida de provocar respuestas inmunitarias no deseadas a porciones xenogénicas del anticuerpo (p. ej., humanizado).

Para que la invención pueda entenderse completamente y llevarse a la práctica, se hace referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1. Desarrollo de un potente agente de cicatrización de heridas basado en el armazón de granulina

Materiales y métodos

Síntesis y purificación de péptidos.

Los péptidos de granulina truncados se sintetizaron utilizando la síntesis manual de péptidos en fase sólida utilizando química de fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC). Los péptidos se ensamblaron en resina de cloruro de 2-clorotritilo (Auspep, Australia). Los aminoácidos se activaron utilizando hexafluorofosfato de 2-(1 H-benzotriazol-1 -il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU - Iris Germany) en dimetilíormamida de grado peptídico (DMF-Auspep, Australia). Los péptidos se escindieron utilizando una mezcla de TFA al 95%/TIPS al 2,5%/H2O al 2,5%. El TFA se eliminó por evaporación con nitrógeno y se añadió éter dietílico enfriado con hielo al residuo. El éter se eliminó por filtración y el péptido se disolvió en una mezcla de acetonitrilo/agua al 40% que contenía ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% y posteriormente se secó por congelación. Los péptidos brutos resultantes se purificaron con cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) en una columna preparativa C-18 (Phenomenex Jupiter 10 gm C ^{i s} 300Á 250x21,2 mm). Se utilizaron gradientes de 1%/min de disolvente B de 0%-80% (acetonitrilo al 90% en TFA al 0,045% en H²O) y disolvente A (TFA acuoso al 0,045% en H²O) y el eluyente se controló a 215 y 280 nm. Los péptidos se oxidaron agitando una solución del péptido en bicarbonato de amonio 100 mM (pH 8,2) que contenía glutatión reducido 5 mM y se dejaron durante la noche a temperatura ambiente y se purificaron utilizando RP-HPLC en una columna preparativa C-18 (Phenomenex Jupiter 10 gm C¹⁸300Á 250x21,2 mm).

Para confirmar la conectividad disulfuro de los péptidos truncados, se sintetizó CV-GRN^12-34 con protección selectiva de los restos de cisteína. Cys1 y Cys14 estaban protegidas en la cadena lateral con grupos ACM y Cys8 y Cys23 con grupos protectores (Trt). Después de la escisión y purificación del péptido bruto, se formó el enlace disulfuro entre Cys8 y Cys23 en bicarbonato de amonio 100 mM y el péptido se purificó utilizando el procedimiento descrito anteriormente. Los grupos S-ACM se eliminaron posteriormente agitando 2 mg de péptido en 0,5 mL de TFA, 10 uL de anisol y 25 mg de trifluorometanosulfonato de plata a 4°C durante 1,5 h. Se añadió éter frío (10 mL) a la mezcla y el precipitado se recogió por centrifugación. El precipitado se lavó dos veces con éter y se oxidó, sin purificación adicional, durante la noche utilizando una solución de DMSO al 50% en HCl 0,5 M. La solución se diluyó 15 veces con agua y el péptido completamente plegado se purificó por HPLC utilizando un gradiente de ACN al 1% en una columna preparativa C-18 (Phenomenex Jupiter 10 gm C¹⁸300Á 250x21,2 mm).

Autoinducción de la expresión de proteínas recombinantes en E. coli

Se transfectaron los ADNc Cv-grn-1 pET41 a o tiorredoxina (trx) de Escherichia coli contenidos en el plásmido pET32a (Novagen) a células BL21 de E. coli (Life Technologies) y se utilizaron para crear proteínas recombinantes con autoinducción como se describe^{4- 22}. Brevemente, los medios de cultivo ZYM-5052 se complementaron con Fe(III) Cl³ 100 gM y 100 gg/L de kanamicina para producir proteína recombinante (rCv-GRN-1) o 50 gg/L de ampicilina para producir TRX. Se incubaron doscientos (200) mL de medio inoculado en un matraz Erlenmeyer con deflectores de un litro durante la noche a 37°C con una rotación de 300 rpm para inducir la expresión con autoinducción.

Purificación de proteínas recombinantes

Se logró la purificación de rCv-GRN-1 utilizando un sistema de purificación AKTA10 a 4°C (GE Healthcare)²³. El sedimento de BL21 de E. coli se lisó con 3 ciclos de congelación/descongelación seguidos de sonicación en hielo con una unidad Q4000 (Qsonix). Se solubilizaron veinte (20) g del sedimento insoluble resultante en 400 mL de tampón de unión de níquel que contenía urea (urea 8 M/NaCl 300 mM/imidazol 50 mM/fosfato de sodio 50 mM pH 8 [Sigma]) a 4°C durante 24 horas con agitación lenta. El sobrenadante filtrado a 0,22 gM se pasó por columnas Histrap IMAC con níquel de 2 x 5 mL (GE Healthcare) y se lavó con concentraciones crecientes de imidazol (dos volúmenes de columna [VC] a 50 mM/5 VC a 100 mM) y se eluyó con imidazol 500 mM en tampón de unión. La proteína TRX de control se expresó de la misma manera, pero en condiciones nativas (sin agentes caotrópicos) y se purificó con columnas Histrap IMAC Nickel²³.

Replegamiento y purificación de proteínas.

Replegamiento de rCv-GRN-1 desnaturalizado con urea se realizó con 28 mL de resina G10 Sephadex (GE) en una columna XK16/20 (GE) como se describe²³. Se utilizó una columna Superdex 30 XK16/60 (GE) de 120 mL para fraccionar 3 mL de rCv-GRN-1 replegado en NaCl 150 mM, fosfato de sodio 50 mM, pH 6, a un caudal de 1 mL/min. Las fracciones que contenían el monómero rCv-GRN-1 que eluía a un tamaño equivalente de ~1 kDa (basándose en el plegamiento de proteínas de granulina a pesar de un tamaño molecular desnaturalizado de 10,4 kDa) se agruparon. La concentración de proteína se determinó mediante una combinación de ensayo Bradford en microplaca (Biorad) y absorbancia a 280 nm.

Espectroscopia de RMN y determinación de estructuras

Los péptidos purificados se disolvieron en H²O al 90%/D²O al 10% para proporcionar una reserva de ~0,2 mM. Los espectros 2D ¹H-¹H TOCSY, ¹H-¹H NOESY, ¹H-¹H DQF-COSY, ¹H-¹⁵N HSQC, y ¹H-¹³C HSQC se adquirieron a 290 K utilizando un espectrómetro de RMN AVANCE III de 600 MHz (Bruker, Karlsruhe, Alemania) equipado con una sonda enfriada criogénicamente. Los espectros se registraron con un retraso entre escaneos de 1 s. Los espectros NOESY se adquirieron con un tiempo de mezcla de 200 ms, y los espectros TOCSY se adquirieron con un período de mezcla isotrópica de 80 ms. Todos los espectros se asignaron utilizando CCPNMR²⁴ basándose en el enfoque descrito por Wuthrich et al.²⁵ Los desplazamientos secundarios de aH se determinaron restando los desplazamientos químicos de RMN ¹H de la bobina aleatoria de Wishart et al.²⁶ de los desplazamientos químicos experimentales de aH.

Se determinaron las estructuras tridimensionales de Cv-GRN^12-34 y Cv-GRN^12-35_3s . Los espectros 2D NOESY se asignaron automáticamente y se calculó una agrupación de estructuras utilizando el programa CYANA²⁷. En los cálculos de la estructura se utilizaron las restricciones del ángulo de torsión predichas con TALOS+. Las conectividades de enlaces disulfuro (Cys1-Cys14, Cys8-Cys23) se incluyeron en los cálculos para Cv-GRN^12-34 ya que estos enlaces fueron confirmados por la protección selectiva de los restos de cisteína. La protección selectiva de los restos de cisteína no se utilizó para CV-GRN^{i2 -35}_^3s en un intento de aislar la forma energéticamente más favorable. En consecuencia, las estructuras se calcularon con las 15 conectividades disulfuro posibles. Se llevó a cabo un análisis de las funciones objetivo de CYANA para determinar la conectividad más probable. Las estructuras se visualizaron utilizando MOLMOL²⁸.

Cultivo de células de mamífero

La línea celular de colangiocitos no malignos H69 es una línea celular epitelial del conducto biliar humano transformada con SV40 derivada de hígado humano, proporcionada amablemente por el Dr. Gregory J. Gores, Mayo Clinic, Rochester, Minnesota. Las células H69^{23- 29 30} se mantuvieron en matraces T75cm² ventilados (Corning) como monocapas como se describe³¹ con modificaciones mínimas. Las células se mantuvieron con división regular utilizando tripsina al 0,25% (Life Technologies) cada 2 a 5 días en medios completos [RPMI (Sigma) con medios completos especializados complementados con factor de crecimiento³⁰ [DMEM/F12 con glucosa alta, FCS al 10%, 1 x antibiótico/antimicótico, 25 pg/mL de adenina, 5 pg/mL de insulina, 1 pg/mL de epinefrina, 8,3 pg/mL de holotransferrina, 0,62 pg/mL de hidrocortisona , 13,6 ng/mL de T3 y 10 ng/mL de EGF - Life Technologies]. Los medios con bajo contenido de nutrientes para los ensayos de proliferación celular fueron medios completos al 5%, es decir, FCS al 0,5% y 1/20° de las concentraciones de factor de crecimiento enumeradas anteriormente para medios completos. Las identidades (derivadas de seres humanos) de la línea celular se confirmaron con un análisis de repetición en tándem simple (STR) en enero de 2015 (15/15 loci positivos en 2 alelos) y libre de micoplasma en el ^d N^a Diagnostics Center (DDC)-medical (EE. UU.), acreditado/certificado por CAP, ISO/IEC 17025:2005 a través de ACLASS.

Control de la proliferación celular en tiempo real utilizando xCELLigence

Las células se sembraron a 1500 células/pocillo en 180 pl de medio completo (arriba) en placas E (ACEA Biosciences) y se cultivaron durante la noche mientras se controlaban con un sistema xCELLigence SP (ACEA Biosciences) que controla eventos celulares en tiempo real midiendo la impedancia eléctrica a través de microelectrodos de oro interdigitados integrados en la base de las placas de cultivo de tejidos³². Las células se lavaron tres veces con PBS antes de la adición de 180 pl de medio bajo en nutrientes (arriba) y se incubaron durante un mínimo de 6 horas antes del tratamiento adicional. Los tratamientos se prepararon a una concentración de 10x y se añadieron a cada pocillo en un volumen total de 20 pl. El sistema xCELLigence registró índices celulares a intervalos de una hora durante 5 a 6 días después del tratamiento. Las lecturas del índice celular se normalizaron antes del tratamiento y las proporciones de proliferación celular se determinaron a partir de cuadruplicados biológicos y representan los números relativos de células en comparación con las células de control en el día 4. Las comparaciones de la inducción de la proliferación celular en respuesta a los tratamientos se realizaron utilizando una prueba ANOVA de dos vías con corrección de comparación múltiple de Dunnett, utilizando GraphPad Prism 6.02.

Ensayo de heridas en ratones

Estos estudios se realizaron con la aprobación del Comité de Ética de Pequeños Animales de la Universidad James Cook, solicitudes A1806 y A2204, como se describe⁶. Brevemente, se anestesiaron (16 mg/kg de xilazina intraperitoneal; 80 mg/kg de ketamina) 4-5 ratones hembra BALB/c por grupo, después de lo cual se infligió una herida profunda en la piel en la coronilla utilizando una punción de biopsia de 5 mm (Zivic Instruments). Se aplicó el antiséptico líquido Betadine (Sanofi) seguido de la aplicación de 50 pl que contenían 71 pmoles de Regranex (el tratamiento de 71 pmoles equivale a 1 pg por 0,25 cm² de herida, según lo recomendado por el fabricante Smith and Nephew), 56 pmoles de rCv-GRN-1, péptidos Ov-GRN-1, péptido control (EADRKYDEVARKLAMVEADL), TRX o PBS suspendidos en metilcelulosa al 1,5% (Sigma). Las heridas se fotografiaron diariamente y, después de cegar los grupos de tratamiento, se midió el área de la lesión con el soporte lógico ImageJ y se trazó como porcentaje de cierre de la herida a partir de las imágenes originales de la herida. Las tasas de heridas se compararon con la prueba ANOVA de dos vías con la corrección de Dunnett para comparaciones múltiples, utilizando GraphPad prism 6.02. Cada estudio de heridas en ratones se realizó al menos dos veces para proporcionar reproducibilidad.

Resultados

Diseño y síntesis de péptidos Ov-GRN-1 truncados

Para determinar si la región N-terminal de Cv-GRN-1 puede plegarse independientemente varios péptidos truncados fueron diseñados y sintetizados utilizando química FMOC. Las secuencias de los péptidos sintéticos se muestran en la Figura 2A.

Cv-GRN ^1-35, CV-GRN^8-38 y CV-GRN^12-34 contienen todos cuatro restos de cisteína equivalentes a Cys I, Cys II, Cys III y Cys V en la proteína de longitud completa (para el resto del informe, los números romanos se refieren a la numeración presente en la proteína de longitud completa). Se predijo que Cys IV y Cys VI formarían enlaces disulfuro con Cys VII y Cys IX respectivamente, según la estructura tridimensional de la granulina-1 de carpa⁷. En los análogos truncados, Cys IV y Cys VI se reemplazaron por restos de alanina para evitar la formación de enlaces disulfuro entre estos restos. Se utilizó protección selectiva de los restos de cisteína para dirigir el plegamiento para formar la conectividad disulfuro predicha (es decir, Cys I-Cys III y Cys II-Cys V).

Cv-GRN-1 contiene una cola N-terminal extendida (11 restos antes del primer resto de cisteína) que no está presente en la mayoría de las granulinas, y estos restos se incluyeron en Cv-GRN^1-35 para determinar si juegan un papel en la bioactividad. El extremo N-terminal se truncó y el extremo C-terminal se extendió en Cv-GRN^8-38 para proporcionar un análogo con un número similar de restos al péptido truncado de granulina-1 de carpa. Cv-GRN^12-34 es la secuencia mínima que contiene los cuatro restos de cisteína (CysI, CysII, CysIII y CysV) y fue diseñada para determinar si las regiones N- y C-terminales son necesarias para el plegamiento y la actividad.

Se sintetizó un péptido adicional (Cv-GRN^12-35_3s) con un extremo N-terminal truncado pero que contiene las primeras seis cisteínas de Cv-GRN-1 ("3s" se refiere a la presencia de tres enlaces disulfuro en el péptido). Este péptido es análogo a la paragranulina de mamífero (arriba) en cuanto a los restos de cisteína. Se sintetizó sin protección selectiva de los restos de cisteína y se purificó la conformación mayoritaria para el análisis de su estructura y actividad.

Análisis estructural con espectroscopia de RMN

Se empleó espectroscopia de RMN para analizar la estructura de los péptidos. Los espectros unidimensionales de Cv-GRN^1-35, Cv-GRN^8-38 y CV-GRN^12-34 tienen una dispersión limitada en las regiones de amida compatible con la falta de estructuras de lámina p a pesar de la formación de los dos enlaces disulfuro nativos. Se utilizaron espectros bidimensionales (TOCSY y NOESY) para asignar las resonancias, y los desplazamientos secundarios se determinaron restando los desplazamientos de bobina aleatorios¹⁶ de los desplazamientos de aH. Los desplazamientos secundarios son similares sobre los restos equivalentes para estos tres péptidos, como se muestra en la Figura 2B, lo que indica que las estructuras eran similares y, en consecuencia, que las diferencias en los extremos N y C de estos péptidos no influyeron en el plegamiento general. Además, los desplazamientos secundarios fueron compatibles con la falta de estructura de lámina p, ya que son principalmente negativos y las estructuras de lámina p se caracterizan por desplazamientos secundarios positivos. La estructura tridimensional de CV-GRN^12-34 se determinó utilizando espectroscopia de RMN, como se muestra en la Figura 3A. En contraste con el característico plegamiento de granulina, la estructura constaba de giros y una región de hélice 3¹⁰. Las estadísticas de la estructura se proporcionan en la Tabla 2 complementaria.

A diferencia de los péptidos Cv-GRN-1 que contienen dos enlaces disulfuro, Cv-GRN^12-35_3s, con tres enlaces disulfuro tiene más dispersión en la región amida en el espectro de RMN unidimensional. Además, estaban presentes picos adicionales en los espectros, probablemente debido a la isomerización de los restos de prolina. A pesar de estos picos adicionales, la conformación principal se asignó por completo y los desplazamientos secundarios fueron similares a los de granulina-1 truncada de carpa¹⁴ (Figura 3B), lo que indica la similitud de las estructuras generales. La granulina-1 truncada de carpa, que comprende los restos 1 -30, se sintetizó previamente remplazando Cys IV y Cys VI por restos de serina, y se ha demostrado que forma una estructura de lámina p¹⁴. Aquí los autores de la presente invención sintetizaron g ra nu lin a^ de carpa remplazando Cys IV y Cys VI por restos de alanina para que sean compatibles con los péptidos truncados de Cv-GRN-1. Sólo fueron evidentes variaciones mínimas entre los desplazamientos químicos publicados¹⁴ de la granulina-1 de carpa con las sustituciones de serina y el péptido con las sustituciones de alanina (Figura 6), lo que indica que aún se mantiene el plegamiento general.

Para confirmar si la estructura de Cv-GRN^12-35_3s era similar a la granulina^1-30 de carpa, las estructuras tridimensionales se calcularon utilizando CYANA. Las estructuras se calcularon inicialmente sin restricciones de enlaces disulfuro. En estas estructuras estaba presente una horquilla p de los restos 14-23, pero los restos 1-8 no estaban definidos. La falta de definición de los restos 1-8 impidió un análisis de las distancias azufre-azufre que proporcionó información sobre la conectividad más probable. Por lo tanto, se utilizó un enfoque alternativo mediante el cual las estructuras se calcularon con las 15 posibles conectividades de enlaces disulfuro. Este enfoque se ha utilizado previamente para péptidos ricos en disulfuro, tales como los ciclótidos, para analizar las conectividades de los enlaces disulfuro^{17’ 18}. Las funciones objetivo de CYANA para las 15 conectividades para Cv-GRN^12-35_3s se muestran en la Tabla 1. La conectividad con la función objetivo de CYANA más baja fue CysI-CysIII, CysII-CysV y CysIV-CysVI. La estructura tridimensional de Cv-GRN^12-35_3s con esta conectividad se muestra en la Figura 3A y las estadísticas de estructura se proporcionan en la Tabla S1 complementaria. La región mejor definida de la molécula fue la horquilla p entre los restos 14-23. La región N-terminal, que abarca CysI y CysII, mostró un marcado trastorno estructural.

Proliferación celular

Se evaluó la influencia de los péptidos Cv-GRN-1 sobre la proliferación de colangiocitos H69 en tiempo real utilizando la tecnología xCELLigence y se determinaron las curvas de respuesta a la dosis para los péptidos. Cv-GRN^12-35_3s a una concentración final 2 pM dio como resultado un aumento de 41% en el crecimiento celular en comparación con el péptido de control (p<0,0001) (Figura 4A). Se observó una curva de respuesta a la dosis similar a la obtenida para Cv-GRN-1 con tratamiento con Ov-GRN^12-35_3s, caracterizada por una proliferación celular significativamente mayor a concentraciones finales >15 nM (p<0,05). Los péptidos Cv-GRN-1 unidos mediante dos enlaces disulfuro fueron menos potentes a concentraciones nanomolares, pero a 2 pM promovieron una proliferación celular significativa (14-25% por encima del control de péptido; p<0,01) con curvas de respuesta a la dosis tipificadas por Cv-GRN^12-34 (Figura 4A).

Esto contrasta con la granulina^1-30 de carpa que indujo una proliferación celular mínima (no significativa) a todas las concentraciones probadas y una proliferación máxima de 9% sobre los controles de péptidos a 32 nM. La respuesta a 400 nM de todos los péptidos Ov-GRN (Figura 4B) destaca la potencia mejorada de los péptidos con tres enlaces disulfuro (CV-GRN^12-35_3s) en comparación con los péptidos con dos enlaces disulfuro. Cv-GRN^12-35_3s promovió un aumento altamente significativo (p<0,0001) en la proliferación celular (26% sobre los controles de péptidos) en comparación con los péptidos restantes que indujeron una proliferación mínima, de los cuales el más potente fue Cv-GRN^1-35 (9% de aumento no significativo sobre el control del péptido).

Modelo de cicatrización de heridas de ratón

Los péptidos Cv-GRN-1 truncados formulados con metilcelulosa se probaron en un modelo de cicatrización de heridas en ratones. Todo los péptidos Cv-GRN-1 exhibieron una actividad potente (Figura 5A, B) cuando se aplicaron tópicamente en comparación con el péptido de control en metilcelulosa. Los péptidos Cv-GRN-1, la proteína Cv- GRN-1 y Regranex mejoraron significativamente la cicatrización en comparación con el control de péptido los días 2-4 (p<0,05). A medida que se cerraron las heridas, las diferencias entre los tratamientos disminuyeron y las diferencias significativas no fueron evidentes más allá del día 4. Regranex y los diversos péptidos de granulina mostraron curvas de mejor ajuste casi idénticas y se mantuvieron intactas. Cv-GRN-1 fue el único compuesto probado aquí que proporcionó una mejora significativa sobre Regranex los días 3 y 4 (p<0,05; Figura 5B). No se observaron diferencias significativas entre los diversos grupos de control negativo formulados con metilcelulosa, incluido el control de vehículo PBS, el control de péptido y el control de proteína recombinante de tiorredoxina (TRX).

Cuando se evaluó la cicatrización el día 4 con relación al vehículo PBS de cada réplica biológica, el tratamiento de heridas con la proteína y los péptidos Cv-GRN-1 aceleraron significativamente la cicatrización de heridas en comparación con los controles (p<0,01 el día 4: 26-41% sobre PBS). Aunque la proteína Cv-GRN-1, Cv-GRN^1-35 y Cv-GRN^12-34 (37-41% sobre PBS) proporcionaron una cicatrización mejorada en comparación con Regranex (29% sobre PBS), ninguna de estas comparaciones alcanzó significación en el punto de tiempo del día 4.

Discusión

Esclarecer las relaciones estructura/actividad de las granulinas ha sido un desafío dada la secuencia y las variaciones estructurales en esta familia de proteínas. Las regiones con bioactividad son poco conocidas y persiste la incertidumbre sobre los receptores potenciales para este factor de crecimiento^{19- 20}.

Cv-GRN-1 parece tener distintas vías de plegamiento en comparación con otras granulinas. La región N-terminal de Cv-GRN-1, que comprende dos enlaces disulfuro nativos (CysI-CysIII y CysII-V), no se pliega de forma independiente en una estructura de horquilla p similar a la nativa, en contraste con la granulina-1 de carpa y la granulina A humana. Es digno de mención que la introducción de un tercer enlace disulfuro no nativo en Cv-GRN^12-35_3s da como resultado una estructura de horquilla p similar a la presente en los péptidos granulina-1 de carpa y granulina A humana^{14, 15}. La conectividad del enlace disulfuro de Cv-GRN^12-35_3s parece comprender los dos enlaces disulfuro nativos (CysI-CysIII y Cys II-V) además del enlace disulfuro CysIV-CysVI. Si los pares de enlaces se conservan entre especies^{7, 9} , se predice que el último enlace no estará presente en Cv-GRN-1 de longitud completa, ya que se prevé que CysIV se una a CysVII y CysVI a CysIX.

El dominio paragranulina (mitad de granulina) de la progranulina de mamíferos contiene los seis restos de cisteína equivalentes presentes en Cv-GRN^12-35_3s y es biológicamente activo²¹, lo que sugiere que Cv-GRN^12-35_3s potencialmente contiene la misma conectividad disulfuro. El péptido granulina^s de carpa podría adaptarse a esta conectividad CysI-CysIII, Cys II-CysV, CysIV-CysVI¹⁴. Aunque el péptido g ranu linas de carpa contiene solo los dos enlaces disulfuro nativos (CysI-CysIII y Cys II-CysV), el análisis de la estructura indica que las cadenas laterales de los restos de serina, que reemplazan CysIV y CysVI, están muy cerca y sugiere que es factible que estos restos de cisteína formen un enlace disulfuro.

La conectividad disulfuro en C v-G R N s ^5_3s tiene implicaciones para la estructura de Cv-GRN-1 de longitud completa, que no se ha determinado experimentalmente porque no se dispone de cantidades suficientes de material recombinante plegado correctamente. Por lo tanto, no se ha demostrado que la conectividad disulfuro de la proteína nativa se ajuste a la conectividad mostrada originalmente para la granulina-1 de carpa⁷. Es concebible que la proteína contenga un dominio disulfuro que comprenda los primeros seis restos de cisteína (equivalente al observado en Cv-GRN^12-35_3s), y un segundo dominio que contiene los últimos seis restos de cisteína. Sin la estructura de la proteína de longitud completa y una comparación con la proteína nativa secretada por el parásito, esto sigue siendo especulación. Sin embargo, informes anteriores revelaron ambigüedad en la conectividad disulfuro de las granulinas.^{9, 15}. Las estructuras de la granulina humana A y F tienen regiones N-terminales bien definidas, pero las regiones C-terminales desordenadas impidieron la caracterización de todos los enlaces disulfuro. Además, el análisis químico de la conectividad disulfuro de la granulina A humana no fue concluyente⁹.

Además de proporcionar información sobre el plegamiento de Cv-GRN-1, el estudio actual reveló que la región N-terminal contribuye a la bioactividad y la horquilla p de Cv-GRN^12-35_3s potenció adicionalmente la actividad de proliferación celular. Sin embargo, la estructura de horquilla p está lejos de ser la historia completa con respecto a la actividad proliferativa, ya que el péptido g ra nu lin as de la carpa contiene horquillas p duales y, en contraste con los péptidos Cv-GRN-1 no mostró una proliferación sustancial a las ocho concentraciones ensayadas (10 nM - 2 pM). Una comparación de las secuencias de granulina-1 de carpa con Cv-GRN-1 revela que solo hay dos restos que no son cisteína conservados entre CysI y CysVI. Esta falta de conservación en las secuencias del bucle probablemente explica las diferencias tanto en el plegamiento como en la bioactividad.

A pesar de la falta de estructura nativa, los dos enlaces disulfuro que contienen los péptidos Cv-GRN-1 promovieron la proliferación celular a altas concentraciones (>800 nM) y estimularon la cicatrización significativa de heridas cutáneas en ratones. Cv-GRN^12-35_3s fue el péptido más potente en el ensayo de proliferación celular, pero no fue más activo in vivo que los otros péptidos Cv-GRN-1. Si la horquilla p de Cv-GRN^12-35_3s interviene en la cicatrización de heridas in vivo los autores de la presente invención no observaron una diferencia en los ratones. La actividad de proliferación celular puede ser específica de la línea celular o, alternativamente, las concentraciones probadas en la reparación de heridas en ratones no fueron óptimas. En cualquier caso, la actividad observada en ratones puede ser de mayor importancia biológica y terapéutica que los hallazgos del análisis in vitro. En el futuro, los autores de la presente invención prevén explorar una gama de células de diversos órganos y tejidos e investigar ratones que muestren deficiencias en la cicatrización de heridas para aumentar su comprensión sobre el papel de las relaciones de estructura-actividad de Cv-GRN-1.

Para concluir, el análisis estructural con espectroscopia de RMN sugirió que Cv-GRN-1 exhibe propiedades de plegamiento únicas en comparación con otras granulinas, presumiblemente como resultado de la secuencia primaria. Los autores de la presente invención han identificado una región bioactiva de Ov-GRN-1, que probablemente sea menos inmunogénica y se produzca más fácilmente que la proteína recombinante completa. Los péptidos y derivados de granulina de duelas hepáticas que mantienen la bioactividad representan un avance clave hacia la identificación de nuevas terapias para el tratamiento de heridas.

Resumen

Durante el análisis de la región o regiones bioactiva de Ov-GRN-1, se sintetizó y caracterizó estructuralmente un conjunto de cuatro análogos truncados mediante espectroscopia de RMN. Los péptidos derivados de la región N-terminal de Cv-GRN-1 que comprende dos o tres enlaces disulfuro impulsaron la proliferación de una línea celular de colangiocitos humanos y mostraron una potente cicatrización de heridas en ratones. Los péptidos de Ov-GRN-1 que contienen solo dos enlaces disulfuro nativos carecen de la estructura de horquilla p característica de las granulinas. Sorprendentemente, la introducción de un enlace disulfuro no nativo fue fundamental para la formación de la estructura de horquilla p. Los péptidos derivados de Cv-GRN-1 son excelentes candidatos para nuevos medicamentos para la cicatrización de heridas, ya que es probable que sean menos inmunogénicos que la proteína de longitud completa y más convenientes de producir.

Ejemplo 2. Información sobre el plegamiento de una granulina derivada de duela hepática

Introducción

Las granulinas son una gran familia de proteínas ricas en disulfuro con diversas funciones biológicas, incluida la influencia en el crecimiento celular³³. Existe una conservación de secuencia limitada entre los dominios granulina, pero todos contienen doce restos de cisteína, con un marco conservado³⁴. La granulina mejor estudiada en términos de estructura es la granulina-1 de carpa, que muestra una pila de horquillas p unidas con los seis enlaces disulfuro (Fig. 7-A)³⁵. A pesar del marco de cisteína conservado, las relaciones estructura/función son complejas con algunos dominios granulina que muestran actividad proliferativa celular y algunos que tienen efectos inhibidores sobre el crecimiento celular^{36- 37}.

La granulina de la duela hepática, Cv-GRN-1, aislada de Cpisthorchis viverrini, muestra una potente actividad de cicatrización de heridas en vivo34, pero los bajos rendimientos en la expresión recombinante han limitado su desarrollo como agente terapéutico. La elucidación de las relaciones estructura/función también se ha visto afectada por las dificultades para producir cantidades significativas para el estudio. Sin embargo, los autores de la presente invención han demostrado que los análogos truncados de Ov-GRN-1 representan miméticos funcionales³⁴ con potencial en el tratamiento de heridas crónicas donde los mecanismos normales de reparación de tejidos se ven superados, tales como las úlceras diabéticas^38-41.

Aunque los análogos truncados de Cv-GRN-1 de los autores de la presente invención han comenzado a proporcionar información sobre el plegamiento y la región bioactiva, quedan preguntas sobre las características importantes para la formación de estructuras secundarias y la estabilidad estructural. Por ejemplo, el péptido (Cv-GRN^12-35_3s) correspondiente a los restos 12-35 en Cv-GRN-1, comprende solo una horquilla p en contraste con una forma truncada de granulina-1 de carpa³⁴. Curiosamente, este péptido contiene un enlace disulfuro no nativo basado en la conectividad predicha, y el papel de este enlace en la estabilización de la estructura secundaria no se entiende completamente (Fig. 7-B). Ov-GRN ^12-35_3s también muestra evidencia de conformaciones adicionales en los espectros de RMN. Es probable que estas conformaciones adicionales sean el resultado de la isomerización cis/trans de la prolina, pero se requieren más estudios para determinar qué restos de prolina están involucrados. En el estudio actual, los autores de la presente invención han utilizado estudios mutacionales para determinar el papel de los restos de prolina en la estructura, el plegamiento y la actividad. Es probable que la determinación del análogo estructuralmente más estable y potente facilite el desarrollo péptidos derivados de Cv-GRN-1 como nuevos agentes de cicatrización de heridas.

Materiales y métodos

Síntesis, purificación y caracterización de péptidos

Los análogos de granulina se sintetizaron mediante un procedimiento de síntesis de péptidos en fase sólida por etapas en un sintetizador PS3 de Protein Technologies. Los derivados del aminoácido Fmoc (Auspep, Australia) se activaron utilizando HCTU (Iris, Alemania) y se acoplaron a la resina de cloruro de 2-clorotritilo con DIPEA/DMF. El péptido se escindió de la resina utilizando el siguiente cóctel de escisión: TFA al 95%: TIPS al 2,5%: dH²O al 2,5%. En la siguiente etapa, el péptido se precipitó con éter dietílico enfriado con hielo y se disolvió en acetonitrilo al 50%:dH²O al 50% (TFA al 0,1% v/v) y posteriormente se liofilizó. Los polvos de color blanco resultantes se purificaron por HPLC de fase inversa utilizando una columna preparativa C-18 (Phenomenex Jupiter 250x21,2 mm) y un gradiente de 1% con mezclas de acetonitrilo-agua que contenían TFA al 0,05% (v/v). Los eluyentes se controlaron a 214 y 280 nm y la masa se determinó utilizando un espectrómetro MALDI TOF/TOF.

Formación de disulfuro

Los enlaces disulfuro se formaron por oxidación al aire durante la noche de 0,1 mg/mL de péptido en bicarbonato de amonio 0,1 M (pH 8-8,2) que contenía glutatión reducido 5 mM a temperatura ambiente durante 24 h; La solución se aciduló, filtró y purificó en una columna preparativa C-18 utilizando RP-HPLC y la masa peptídica se analizó utilizando espectrómetros 5800 MALDI TOF/TOF.

Espectroscopia de RMN y análisis de estructuras.

Las muestras se prepararon a partir de péptido liofilizado a concentraciones de aproximadamente 0,2 mM en H²O al 90%:D²O al 10%. Todos los espectros de RMN se registraron en un espectrómetro de RMN AVANCE III a 600 MHz (Bruker, Karlsruhe, Alemania). Se utilizaron 2D ¹H-¹H TOCSY, ¹H-¹H NOESY, ¹H-¹H DQF-COSY, ¹H-¹⁵N HSQC, y ¹H-¹³ C HSQC a 290 K para la asignación. Todos los espectros se registraron con un retraso entre escaneos de 1 s. Los espectros NOESY se adquirieron con tiempos de mezcla de 200 ms, y los espectros TOCSY se adquirieron con períodos de mezcla isotrópica de 80 ms. Todos los espectros se asignaron utilizando CCPNMR⁴² basado en el enfoque descrito por Wuthrich et al⁴³. Los desplazamientos secundarios de aH se determinaron restando los desplazamientos químicos de RMN ¹H la bobina aleatoria de Wishart et al.⁴⁴ de los desplazamientos químicos experimentales de aH. Se asignaron los espectros 2D NOESY y se calculó una agrupación de estructuras utilizando el programa CYANA⁴⁵. Se calcularon un total de 100 estructuras iniciales utilizando el programa CYANA. En los cálculos de la estructura se utilizaron las restricciones del ángulo de torsión predichas con TALOS N. Las estructuras se visualizaron utilizando MOLMOL⁴⁶.

Cultivo de células de mamífero

La línea celular H69, línea celular de colangiocitos no malignos se obtuvo del Dr. Gregory J. Gores, Mayo Clinic, Rochester, Minnesota³⁴. Las células H69 se cultivaron y mantuvieron como se describió anteriormente³⁴ en DMEM/F12 (Life Technologies) que contenía 1x antibiótico/antimicótico y HEPES 15 mM, complementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% (Gibco, Escocia) a 37°C y una incubadora al 5%. Los ensayos de proliferación celular se realizaron con medios DMEM/F12 modificados complementados con FBS al 0,5% y factores de crecimiento y hormonas particulares en un determinado rango de concentración, como se indica en el estudio anterior³⁴.

Control de proliferación celular en tiempo real utilizando xCELLigence

El estudio de proliferación en tiempo real se realizó utilizando el sistema xCELLigence SP (ACEA Biosciences) como se describió anteriormente³⁴. Las células H69 se sembraron en una placa xCELLigence E de 96 pocillos (ACEA Biosciences) a una densidad de 2000 células/pocillo; a continuación, se colocaron en el sistema xCELLigence colocado en una incubadora con 5% de CO² a 37°C y se controlaron durante la noche⁴⁷. A continuación, el medio completo se reemplazó por 180 pl de medio de inanición (medio DMEM/F12 modificado complementado con FBS al 5% como se describió anteriormente³⁴) y se incubó durante al menos 6 horas. Se añadieron tratamientos a cada pocillo en un volumen total de 20 pl para proporcionar concentraciones finales 200 nM. Durante 48 horas de medición, las células alcanzaron la confluencia y el sistema registró el índice de células (IC). La tasa de proliferación celular se calculó como el número relativo de células tratadas en comparación con las células de control a lo largo del tiempo (48 horas en cultivo). Se utilizó GraphPad Prism 6.02 para ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett. Cada tratamiento se midió por cuadruplicado.

Resultados

Diseño y síntesis de mutantes de GRN^i2-35_3s

Para determinar qué restos de prolina están involucrados en la adopción de múltiples conformaciones, se sintetizaron químicamente tres mutantes individuales (P2A, P4A, P10A) de GRN12-35_3s en los que cada mutante tiene una de las tres prolinas cambiada a alanina. Los tres restos de prolina se reemplazaron por alanina en un análogo adicional denominado GRN^3Aia. Las secuencias de los péptidos truncados sintéticos de Cv-GRN-1 se proporcionan en la Tabla 1.

Todos los péptidos se sintetizaron químicamente utilizando síntesis de péptidos en fase sólida FMOC. Los péptidos brutos se purificaron utilizando RP-HPLC y se llevó a cabo un análisis de masas utilizando espectrometría de masas MALDI. Los enlaces disulfuro se formaron en bicarbonato de amonio 0,1 M y glutatión 5 mM a temperatura ambiente durante 24 horas. Las trazas de HPLC de las reacciones de plegamiento oxidativo se proporcionan en la Fig. 8. Para la mayoría de los péptidos, está presente un pico de elución temprana relativamente nítido. El rendimiento de este pico de elución temprana es significativamente mayor en el mutante GRN^3Ala en comparación con los otros péptidos. En las condiciones utilizadas en el presente estudio, GRN^{12-35_ 3s} no se pliega eficientemente en un solo isómero. Para todos los péptidos, a excepción de GRN^P10A, los picos principales (resaltados con un asterisco en la Fig. 8) se aislaron de cada reacción para su posterior caracterización.

La gran cantidad de picos presentes en la reacción de plegamiento de GRN^P10A, incluso después de un período de oxidación de 48 horas, impidió la purificación de un solo isómero de disulfuro principal.

Análisis estructural con espectroscopia de RMN

Las estructuras de las fracciones purificadas o parcialmente purificadas para los análogos de GRN^12-35_3s se analizaron utilizando espectroscopia de RMN. Los espectros unidimensionales de todos los péptidos tienen una dispersión significativa en la región amida compatible con la presencia de estructura de lámina p. El análisis de los espectros TOCSY y NOESY para los mutantes de prolina individuales indica la presencia de múltiples conformaciones muy probablemente como resultado de la isomerización de los restos de prolina. Por el contrario, el péptido GRN^3Ala no parecía tener múltiples conformaciones (Fig. 9).

Se utilizaron espectros bidimensionales (TOCSY y NOESY) para asignar las conformaciones principales, y los desplazamientos secundarios se determinaron restando los desplazamientos de bobina aleatorios⁴⁸ de los desplazamientos de aH. Los desplazamientos secundarios son generalmente similares sobre los restos equivalentes para todos los mutantes de prolina en comparación con el péptido Cv-GRN-1 N-terminal , GRN^12-35_3s, como se muestra en la Fig. 10, lo que indica que las estructuras generales son similares. Los tramos de desplazamientos secundarios positivos son compatibles con la presencia de estructura de lámina p.

Para confirmar si las estructuras de los péptidos Cv-GRN-1 mantienen un plegamiento similar a GRN^12-35_3s, se determinaron las estructuras tridimensionales de los análogos seleccionados utilizando el programa CYANA. GRN^3Ala fue elegido para un análisis estructural completo debido al plegamiento eficiente, la falta de heterogeneidad conformacional y para determinar la influencia de los restos de prolina en el plegamiento general. Se predijo previamente que el patrón de enlaces disulfuro de GRN^12-35_3s sería CysI-CysIII, CysII-CysV y CysIV-CysVI⁴⁹. La estructura tridimensional de GRN^3Ala comparte la horquilla p en la región C-terminal del péptido con GRN^12-35_3s, pero la región N-terminal contiene una hélice a de los restos 4 a 11 como se muestra en la Fig. 11.

Control de la proliferación celular en tiempo real utilizando xCELLigence

Además de los estudios estructurales, para comprender mejor las relaciones estructura-función de Cv-GRN^12-35_3s, todos los péptidos modificados mediante ingeniería genética se probaron en un ensayo de proliferación celular in vitro . La Fig. 12 demuestra las tasas de proliferación celular para cada péptido de las lecturas de la placa xCELLigence durante 48 horas. Los mutantes de prolina individuales mostraron una proliferación celular significativa en comparación con el péptido de control negativo (péptido de 20 restos de tropomiosina). Las tasas de proliferación de GRN24^{p 2a} , ^P4A y ^P10A fueron 131,7% (P<0,0001), 141,6% (P<0,0001) y 131,4% (P<0,0001), respectivamente, con relación al péptido de control. Por el contrario, GRN^3Ala no tuvo un efecto estadísticamente significativo (P = 0,90) sobre la proliferación celular en comparación con el péptido de control.

Discusión

Cv-GRN-1 tiene potencial en el desarrollo de un nuevo agente de cicatrización de heridas, pero ha habido información limitada sobre las relaciones estructura/función. Aquí, los autores de la presente invención demuestran que los tres restos de prolinas en Cv-GRN^12-35_3s tienen un papel significativo tanto en la estructura como en la función.

La mutación de los restos de prolina individuales no interrumpió el plegamiento general de Cv-GRN^12-35_^3s, pero todavía estaban presentes múltiples conformaciones en los espectros de RMN. Por el contrario, cuando los tres restos de prolina se mutaron a restos de alanina, se observó un solo conjunto de picos correspondiente a una sola conformación en los espectros de RMN. Estos resultados indican que los tres restos de prolina están involucrados en isomerización cis/trans.

La isomerización cis/trans puede ser una etapa determinante de la tasa en el plegamiento de las proteínas⁴⁹, y parece estar influyendo en el plegamiento de Cv-GPN^12-35_3s. Aunque la mutación de prolina 10 con un resto de alanina no mejoró el plegamiento con relación a Cv-GRN^12-35_3s, los rendimientos de plegamiento de GRN^{p 2a} y GRN^{p 4a} mejoraron. Prevención de la isomerización cis/trans por eliminación de los tres restos de prolina dio como resultado el mayor rendimiento de plegamiento (Fig. 8). Estos resultados indican que los restos de prolina son generalmente perjudiciales para el plegamiento en las condiciones actuales.

Los restos de prolina también tienen un efecto sobre proliferación celular in vitro. Parece probable que la falta de actividad de GRN^3Ala esté relacionada con la perturbación de la estructura en la región N-terminal. La eliminación de los restos de prolina permite que se forme una estructura helicoidal, y esta conformación podría no permitir la interacción con un compañero de unión. Dado que la sustitución de restos de prolina individuales por restos de alanina aún da como resultado la proliferación celular, parece poco probable que la interacción directa con los restos de prolina esté involucrada en la bioactividad. Sin embargo, dado que los 3 restos de prolina están dentro de los primeros 10 restos de Ov-GRN^12-35_3s parece que esta región, más que la horquilla C-terminal, es importante en la bioactividad.

Estudios previos sobre módulos de granulina humana indican que la secuencia puede tener una influencia significativa en los rendimientos de plegamiento, de acuerdo con estudio actual de los autores de la presente invención. En los mamíferos, las granulinas se expresan como progranulina, que contiene siete módulos y medio de granulina³³. Los siete módulos de granulina en la progranulina humana se expresaron como proteínas de fusión de tiorredoxina en E. coli⁵⁰. Los péptidos expresados se purificaron y escindieron mediante enteroquinasa recombinante para liberar los módulos de granulina. El análisis del plegamiento por análisis HPLC y análisis RMN indica que granulina A, C y F muestran estructuras relativamente bien definidas, al menos para regiones de los péptidos. Por el contrario, las granulinas B y E no mostraron una dispersión significativa en los espectros de RMN, y se informó que las granulinas D y G tenían múltiples señales en los espectros de RMN para protones únicos⁵⁰. Las granulinas B y F contienen un resto de prolina inmediatamente después de la primera cisteína en la secuencia, compatible con la prolina 2 en Ov-GRN ^12-35_3s. La granulina B no tiene un pico agudo predominante en el perfil de HPLC de la reacción de plegamiento, pero la granulina F sí lo tiene⁵⁰. Basándose en esta comparación, no parece que este resto de prolina tenga una influencia significativa en el plegamiento de los módulos de granulina humana de longitud completa.

Resumen

En general, los resultados de los autores de la presente invención destacan la importancia de los restos de prolina en la estructura y función del Ov-GRN^12-35_3s. Además, los datos proporcionan información esencial para el diseño de una nueva generación de análogos potentes basados en Ov-GRN-1.

Ejemplo 3. Evaluación de la actividad de los péptidos en la cicatrización de heridas en ratones.

La cicatrización de heridas del día 4 se evaluó utilizando péptidos como se describe en presente documento (Ov-GRN-1, OV-GRN^1-35, Ov-GRN^8-38, OV-GRN^12-34, Ov-GRN^12-35_3s, GRN24-3ala, GRN24-P2A, GRN24-P4A y GRN27sps). Se muestran los resultados (FIG. 13(B)) con relación al control de péptido de 56 pmoles de tratamientos con 56 pmoles de Ov-GRN-1 recombinante, péptidos de Ov-GRN-1, controles de proteína tiorredoxina (TRX) y 71 pmoles de Regranex en gel de metilcelulosa al 1,5% aplicados diariamente en un volumen de 50 pl desde los días 0-4 a una herida de ~0,2 cm² derivada de punción de biopsia en el cuero cabelludo entre las orejas. No se observaron diferencias significativas (ns) entre el control de péptido no relacionado, el PBS o el control de proteína TRX en ningún momento. Los péptidos Ov-GRN-1, Ov-GRN^1-35, Ov-GRN^8-38, Ov-GRN^12-34, Ov-GRN^12-35_3s, GRN24-3ala y GRN24-3p4a mostraron aumentos significativos en la cicatrización de heridas con relación a los controles.

Todos los paneles: tasas de cicatrización medias de 2-6 réplicas biológicas de grupos de 4-5 animales trazadas con barras de ETM. Los grupos se han desplazado marginalmente hacia la izquierda o hacia la derecha para facilitar la visualización. Prueba ANOVA de dos vías de medidas repetidas con corrección de Dunnett para comparaciones múltiples compara cada grupo con el control de péptido. Significación contra el control de péptido/proteína indicado por **** = p<0,0001, *** = p<0,001, ** = p<0,01, * = p<0,05, ns=no significativo. El color del asterisco o almohadilla representa el grupo relevante.

A lo largo de la memoria descriptiva, el objetivo ha sido describir las realizaciones preferidas de la invención sin limitar la invención a ninguna realización o serie específica de características. Por lo tanto, los expertos en la técnica apreciarán que, a la luz de la presente descripción, se pueden realizar diversas modificaciones y cambios en las realizaciones particulares ejemplificadas sin apartarse del alcance de la presente invención.

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TABLAS

Tabla 1. Funciones objetivo de CYANA para las 15 posibles conectividades de enlaces disu lfuro presentes _________________________________________ en Ov-GRN12-35 ^3s . ^{________________________________________________________________} Número de conjunto Conectividad de enlaces disulfuro Función objetivo promedio ± DT

1 1-14, 8-23,15-24 0,03 ± 0,003-2 1-14, 8-24, 15-23 5,94 ± 0,44

3 1-14, 8-15, 23-24 3,56 ± 0,090

4 1-8, 14-23, 15-24 3,73 ± 0,17

5 1-8, 14-15, 23-24 14,16 ± 0,23

6 1-8, 14-24, 15-23 5,68 ± 0,04

7 1-15, 8-14, 23-24 3,74 ± 0,36

8 1-15, 8-23, 14-24 1,88 ± 1,46

9 1-15, 8-24, 14-23 1,12 ± 0,16

10 1-23, 8-14, 15-24 0,09 ± 0,11 *

11 1-23, 8-15, 14-24 0,83 ± 0,19

12 1-23, 8-24, 14-15 9,46 ± 0,2

13 1-24, 8-14, 15-23 6,79 ± 0,2

Número de conjunto Conectividad de enlaces disulfuro Función objetivo promedio ± DT 14 1-24, 8-15, 14-23 1,3 ± 0,1

15 1-24, 8-23, 14-15 9,23 ± 018

•Las dos conectividades con las funciones objetivo más bajas se resaltan con un asterisco. La conectividad correspondiente al Conjunto Número 1 tiene la función objetivo más baja, lo que indica que las restricciones de distancia y ángulo satisfacen esta conectividad mejor que las otras conectividades y, por lo tanto, es la conectividad más probable presente en Ov-GRN12-35_3s.

Tabla 2. Estadísticas estructurales para la agrupación de péptidos Ov-GRN

Ov-GRN12-34 Ov-GRN12-35_3s Restricciones experimentales

Restricciones de distancia entre protones 252 113 Intraresto 78 46 Secuencial 139 52

Rango medio (i-j<5) 21 4

Rango largo (i-j>5) 14 44 Restricciones por enlaces disulfuro 6 9 Restricciones por ángulo diedro 14 10

desviaciones R.m.s de la estructura de coordenadas media (Á)

Átomos de la cadena principal 0,32 ± 0,15 0,65 ± 0,2^ Todos los átomos pesados 0,93 ± 0,27 1,65 ± 0,33^

Estadísticas de Ramachandran

% en la región más favorecida 71,4 78,2

% en la región adicionalmente permitida 28,6 21,8

• RMSD para restos 12-24.

Tabla 3 Secuencia de GRN^i2-35_3s y sus análogos diseñados. Todos los péptidos truncados de Ov-GRN-1 contienen seis restos de cisteína equivalentes a Cys I, Cys II, Cys III, Cys IV y Cys V en la proteína de longitud completa. GRN(12-35_3s) = SEC ID NO:5; GRN(P2A) = SEC ID NO:6; GRN(P4A) = SEC ID NO:7; GRN(P10A) =

SEC ID NO:8; GRN(3Ala) = SEC ID NO:9.

Péptido Secuencia

GRN^12-35_3s CPDPVYTCRPGQTCCRGLHGYGCC

GRN^P2A CADPVYTCRPGQTCCRGLHGYGCC

GRN^P4A CPDAVYTCRPGQTCCRGLHGYGCC

GRN^P10A CPDPVYTCRAGQTCCRGLHGYGCC

GRN^3Ala CADAVYTCRAGQTCCRGLHGYGCC

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido aislado que consiste en la secuencia de aminoácidos:

¹Xⁿ C ²XD ³XVYTCR ⁴XGQTC C/A RGLHGYGC ⁵X^m (SEQ ID NO: 1),

en donde ¹Xⁿ es una secuencia de aminoácidos de longitud n, con n = 0-11 y siendo ¹X cualquier aminoácido; en donde cada uno de ²X, ³X, y ⁴X es P o A;

en donde ⁵X^m es una secuencia de aminoácidos de longitud m, con m = 0-4 y siendo ⁵X cualquier aminoácido; y en donde el péptido aislado comprende, o es capaz de formar, dos o tres enlaces disulfuro intracatenarios.

2. El péptido aislado de la Reivindicación 1, en donde n = 3 y ¹Xⁿ = SPS; o n = 4 y ¹Xⁿ = RSPS; o n = 11 y ¹Xⁿ = MDTLQPIRSPS.

3. El péptido aislado de la reivindicación 1 o 2, en donde m = 1, ⁵X^m = C o A; o m = 4 y ⁵X^m = APMD o CPMD.

4. El péptido aislado de cualquier reivindicación precedente que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en uno cualquiera de SEQ ID NOs: 2-10.

5. Un ácido nucleico aislado que codifica el péptido aislado de una cualquiera de las Reivindicaciones 1-4.

6. Una construcción genética que comprende el ácido nucleico aislado de la Reivindicación 5.

7. Una célula anfitriona que comprende la construcción genética de la Reivindicación 6.

8. Una composición farmacéutica que comprende el péptido aislado de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 -4, o el ácido nucleico aislado de la reivindicación 5, junto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptables.

9. Un polipéptido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, para su uso como medicamento.

10. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 5, para su uso como medicamento.

11. Un polipéptido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para su uso en el tratamiento de heridas.

12. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 5, para su uso en el tratamiento de heridas.

13. Uso del polipéptido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o el ácido nucleico aislado de la reivindicación 5, o la construcción genética de la reivindicación 6, o la composición farmacéutica de la reivindicación 8, para iniciar, promover, estimular o facilitar proliferación celular in vitro y/o migración celular in vitro.

14. Un método para promover la proliferación y/o migración celulares in vitro, incluyendo dicho método la etapa de poner en contacto una o más células in vitro con el péptido aislado de una cualquiera de las Reivindicaciones 1-4, o el ácido nucleico aislado de la Reivindicación 5, para de ese modo iniciar, estimular o facilitar la proliferación y/o migración de las una o más células in vitro.