CN115786509A - 一种鼻咽癌患病风险预测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鼻咽癌患病风险预测试剂盒。本发明通过对EB病毒EBNA3B核抗原蛋白的氨基酸表位进行多态性分析，发现了与鼻咽癌患病风险相关的氨基酸表位变异；即当EBNA3B的第399位氨基酸表位由A变为S，第400位氨基酸表位由V变为F，第417位氨基酸表位由V变为L时，鼻咽癌患病风险降低；而当EBNA3B第402位氨基酸表位由D变为N，第424位氨基酸表位由K变为N时，鼻咽癌患病风险升高。在此基础上，本发明提供了可用于预测鼻咽癌患病风险的试剂盒，可用于鼻咽癌高危人群的筛查，有助于鼻咽癌的早期诊断，降低鼻咽癌的发生率及死亡率。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。具体地，涉及一种鼻咽癌患病风险预测试剂盒。
背景技术
鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)是起源于鼻咽上皮细胞的一种与EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)相关的恶性肿瘤，好发于我国南方，我国南方及东南亚人群易感。由于鼻咽癌的早期症状不明显，多数患者在初次就诊时已属中晚期。因此，对高危地区及高危人群进行筛查，早发现、早治疗，是防治鼻咽癌的重要措施。
EB病毒在人群中的感染非常普遍，约有90％以上的成人呈血清EB病毒抗体阳性，但仅有小部分人会得EB病毒相关肿瘤。除与鼻咽癌的发生发展密切相关外，EB病毒还与霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤等多种肿瘤相关，且存在不同的地理分布差异和人群易感性差异。例如，NK/T细胞淋巴瘤(NKTCL)和鼻咽癌均为EB病毒相关肿瘤，均好发于鼻腔及鼻咽部位，但鼻咽癌在我国南方高发，易感人群为我国南方及东南亚人群，而NK/T细胞淋巴瘤在东亚和拉丁美洲国家的土著人群中高发，提示着EB病毒中可能存在着与肿瘤相关的不同的EB病毒变异，由此导致了NK/T细胞淋巴瘤和鼻咽癌独特的地理分布以及人群的遗传易感性。因此，针对不同的EB病毒相关肿瘤寻找挖掘与其相关的EB病毒变异，开发相关的检测产品和方法，通过检测不同的EB病毒变异对EB病毒相关肿瘤进行预测，有助于了解患病风险，以便及时采取措施，降低EB病毒相关肿瘤的发生率和死亡率。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种鼻咽癌患病风险预测试剂盒。
本发明的第一个目的是提供检测EB病毒EBNA3B核抗原蛋白第399、400和417位氨基酸表位变异和/或检测EB病毒EBNA3B核抗原蛋白第402和424位氨基酸表位变异的试剂在制备预测鼻咽癌患病风险的产品中的应用。
本发明的第二个目的是提供一种鼻咽癌患病风险预测试剂盒。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
根据EB病毒核抗原基因的多态性，即EBNA2、EBNA3A、EBNA3B和EBNA3C基因的多态性，EB病毒被分为以B95.8为原型的Type 1型和以AG876为原型的Type 2型(也分别称TypeA和Type B型)。本发明从NCBI数据库中收集了已经发表的来自中国、日本、韩国、东南亚、新几内亚、欧洲、北美、南美和非洲等地区的718例EB病毒的测序结果，通过对EB病毒核抗原的氨基酸表位进行分析，发现EBNA3B核抗原蛋白的氨基酸表位变异存在世界分布差异；中国是EBNA3B核抗原蛋白表位变异最丰富的区域。
在此基础上，本发明对鼻咽癌和健康对照中的EB病毒EBNA3B核抗原蛋白的氨基酸表位进行了多态性分析，通过扩增编码EBNA3B核抗原蛋白的DNA序列，以B95.8中编码EBNA3B核抗原蛋白的DNA序列(Gene ID：3783763；核心编码序列，即CDS序列如SEQ ID NO.9所示)为原型进行比对，发现EBNA3B第402和424位氨基酸表位变异与鼻咽癌发病风险增加显著相关，EBNA3B第399、400和417位氨基酸表位变异与鼻咽癌发病风险降低显著相关。因此，本发明申请保护以下应用：
本发明请求保护检测EB病毒EBNA3B核抗原蛋白第399、400和417位氨基酸表位变异和/或检测EB病毒EBNA3B核抗原蛋白第402和424位氨基酸表位变异的试剂在制备预测鼻咽癌患病风险的产品中的应用。
具体地，当EB病毒EBNA3B核抗原蛋白第399位氨基酸表位的变异为A变为S(A399S)，第400位氨基酸表位的变异为V变为F(V400F)，第417位氨基酸表位的变异为V变为L(V417L)时，鼻咽癌患病风险降低。
具体地，当EB病毒EBNA3B核抗原蛋白第402位氨基酸表位的变异为D变为N(D402N)，第424位氨基酸表位的变异为K变为N(K424N)时，鼻咽癌患病风险升高。
具体地，所述试剂为对含编码EB病毒EBNA3B核抗原蛋白第399、400和417位氨基酸表位和/或对含编码EB病毒EBNA3B核抗原蛋白第402和424位氨基酸表位的DNA序列进行扩增及测序的引物对。
本发明还提供了一种鼻咽癌患病风险预测试剂盒，所述试剂盒中含有检测EB病毒EBNA3B核抗原蛋白第399、400和417位氨基酸表位变异和/或检测EB病毒EBNA3B核抗原蛋白第402和424位氨基酸表位变异的试剂。
具体地，所述试剂为对含编码EB病毒EBNA3B核抗原蛋白第399、400和417位氨基酸表位和/或对含编码EB病毒EBNA3B核抗原蛋白第402和424位氨基酸表位的DNA序列进行扩增及测序的引物对。
具体地，所述检测氨基酸表位变异是通过扩增含编码EB病毒EBNA3B核抗原蛋白第399、400和417位氨基酸表位和/或含编码EB病毒EBNA3B核抗原蛋白第402和424位氨基酸表位的DNA序列并测序，以B95.8中EBNA3B的DNA序列(Gene ID：3783763；核心编码序列，即CDS序列如SEQ ID NO.9所示)为原型，通过比对测序结果，分析EBNA3B变异情况。
具体地，当EB病毒EBNA3B核抗原蛋白第399位氨基酸表位的变异为A变为S(A399S)，第400位氨基酸表位的变异为V变为F(V400F)，第417位氨基酸表位的变异为V变为L(V417L)时，鼻咽癌患病风险降低。
具体地，当EB病毒EBNA3B核抗原蛋白第402位氨基酸表位的变异为D变为N(D402N)，第424位氨基酸表位的变异为K变为N(K424N)时，鼻咽癌患病风险升高。
可选地，所述引物对为巢氏PCR引物对，包括外引物和内引物；其中，所述外引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示，所述内引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示。
当所述预测鼻咽癌患病风险的试剂盒中所用引物对为SEQ ID NO.1～4所示巢氏PCR引物对时，该试剂盒的两轮巢氏PCR的反应条件相同，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；再72℃延伸3min，12℃保存。
可选地，所述引物对为巢氏PCR引物对，包括外引物和内引物；其中，所述外引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示，所述内引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示。
当所述预测鼻咽癌患病风险的试剂盒中所用引物对为SEQ ID NO.5～8所示巢氏PCR引物对时，第一轮巢氏PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸40s，40个循环；再72℃延伸3min，12℃保存；第二轮巢氏PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；再72℃延伸3min，12℃保存。
此外，本申请所述预测鼻咽癌患病风险的试剂盒中可同时含有SEQ ID NO.1～4所示巢氏PCR引物对和SEQ ID NO.5～8所示巢氏PCR引物对；SEQ ID NO.5～8所示巢氏PCR引物对可用于复检或补充SEQ ID NO.1～4所示巢氏PCR引物对未检出的情况。
本发明所述试剂盒中还含有PCR扩增所需试剂。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过从NCBI数据库中收集已经发表的718例EB病毒测序结果，通过对EB病毒核抗原的氨基酸表位进行分析，发现EBNA3B核抗原蛋白的氨基酸表位变异存在世界分布差异。在此基础上，本发明通过对鼻咽癌和健康对照中的EB病毒EBNA3B核抗原蛋白的氨基酸表位进行多态性分析，发现了与鼻咽癌患病风险相关的氨基酸表位变异；即当EBNA3B核抗原蛋白的第399位氨基酸表位由A变为S，第400位氨基酸表位由V变为F，第417位氨基酸表位由V变为L时，鼻咽癌患病风险降低；而当EBNA3B核抗原蛋白第402位氨基酸表位由D变为N，第424位氨基酸表位由K变为N时，鼻咽癌患病风险升高。此外，本发明还提供了一种可用于预测鼻咽癌患病风险的试剂盒，可用于鼻咽癌高危人群的筛查，有助于鼻咽癌的早期诊断，降低鼻咽癌的发生率及死亡率。
附图说明
图1为EB病毒EBNA3B核抗原蛋白氨基酸表位的变异分析结果及其与鼻咽癌的关联性分析结果；其中，图A为EBNA3B氨基酸表位的变异频率统计结果；图B为EBNA3B氨基酸表位变异与鼻咽癌的关联性分析结果。
图2为EB病毒EBNA3B核抗原蛋白氨基酸表位变异和EBER2、Zta promoter(Zp)的变异连锁分析结果；其中，图A为EBER2野生型及突变型在NPC中的比例；图B为EBNA3B氨基酸表位与EBER2变异连锁分析结果；图C为EBNA3B氨基酸表位与Zta promoter多态性连锁分析结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 EBNA3B的多态性分析
本发明通过从NCBI数据库中收集已经发表的来自中国、日本、韩国、东南亚、新几内亚、欧洲、北美、南美和非洲等地区的718例EBV的测序结果，通过对EBV核抗原蛋白的氨基酸表位进行分析，发现EBNA3B核抗原蛋白的氨基酸表位变异存在世界分布差异；其中，中国是EBNA3B核抗原蛋白表位变异最丰富的区域。在此基础上，本发明对鼻咽癌和健康对照中的EB病毒EBNA3B核抗原蛋白的氨基酸表位进行了多态性分析。
分别采集鼻咽癌及健康人的外周血各5mL，400g离心10分钟，提取白膜层中的单核细胞，提取基因组DNA；通过巢式PCR的方法，对编码EB病毒EBNA3B核抗原蛋白的DNA序列进行扩增；将扩增所得产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，将电泳条带进行切割和纯化后送广州睿博生物科技有限公司进行DNA测序。
以B95.8中编码EBNA3B的DNA序列(Gene ID：3783763；核心编码序列，即CDS序列如SEQ ID NO.9所示)为原型，通过NCBI Blast比对测序结果，分析EBNA3B的变异情况。从EBNA3B基因的独立PCR扩增中重复测序反应至少两次，并且在这些分析中获得的序列是相同的。
通过巢式PCR的方法，本发明分别对性别、年龄、地域大致匹配的鼻咽癌及健康对照外周血单核细胞中的EB病毒EBNA3B核抗原蛋白的氨基酸表位进行了多态性分型。从174例鼻咽癌以及204例健康对照的外周血单核细胞中获得了EB病毒表位测序结果并进行了后续分析。除与B95.8相同的Type1野生型(Type1 WT)表位以及与AG876相同的Type2野生型(Type2 WT)表位外，还有6种常见的表位变异(分别为A399S，V400F，V417L；A399P，V400L，K424N；A399P，V417L；V400A，F420L；D402N，K424N；V417L)及18种低频表位变异。
本发明通过Logistic回归分析，在校正了性别，年龄，地域因素后，所得EB病毒EBNA3B核抗原蛋白氨基酸表位的变异分析结果及其与鼻咽癌的关联性分析结果如图1所示。其中，图1中的A为EBNA3B核抗原蛋白氨基酸表位的变异频率统计结果；图1中的B为EBNA3B核抗原蛋白氨基酸表位变异与鼻咽癌的关联性分析结果。由图1可知，与健康对照相比，EB病毒EBNA3B蛋白的A399S，V400F和V417L氨基酸表位变异与鼻咽癌患病风险降低显著相关(OR＝0.321，95％ CI:0.142-0.724，P＝6.19E-03)；EB病毒EBNA3B的D402N和K424N氨基酸表位与鼻咽癌患病风险增加显著相关(OR＝2.189，95％CI:1.351-3.547，P＝1.47E-03)；，其余表位与鼻咽癌不存在显著的风险相关性。
实施例2 连锁分析
由实施例1所述结果可知，鼻咽癌中存在与患病风险相关的EB病毒EBNA3B表位变异。根据已有报道，EB病毒基因组EBER2区域，Zta promoter(Zp)区域均具有多态性，且其多态性与疾病之间存在关联，其中突变型EBER2(EBER2-Variant)和V3突变型Zta promoter(Zp-V3)在鼻咽癌中的频率显著升高。因此，本发明进一步对鼻咽癌和健康对照外周血单核细胞中的EB病毒EBER2多态性区域及Zta promoter多态性区域进行了分型分析。EB病毒EBNA3B核抗原蛋白氨基酸表位变异和EBER2、Zta promoter(Zp)的变异连锁分析结果如图2所示。图2中的A为EBER2野生型及突变型在NPC中的比例；图2中的B为EBNA3B氨基酸表位与EBER2变异连锁分析结果；图2中的C为EBNA3B氨基酸表位与Zta promoter多态性连锁分析结果。
由图2中的A所示结果可知，与健康对照相比，鼻咽癌中突变型EBER2(EBER2-Variant)比例明显升高(健康对照43％vs鼻咽癌92％)。本发明对EBNA3B表位变异和EBER2变异进行了连锁分析，结果如图2中的B所示。由图2中的B所示结果可知，EBNA3B表位变异A399S，V400F，V417L与野生型EBER2(EBER2-WT)高度连锁，而D402N和K424N表位与突变型EBER2(EBER2-Variant)高度连锁。同时，本发明利用数据库中已有的EB病毒测序信息，分析了EBNA3B表位变异与Zta promoter(Zp)的连锁情况，结果如图2中的C所示。由图2中的C所示结果可知，EBNA3B表位变异A399S，V400F和V417L与野生型Zta promoter(Zp-WT)高度连锁，而D402N，K424N表位与突变型Zta promoter(Zp-V3)高度连锁。
由上述结果可知，EBNA3B表位变异A399S，V400F，V417L与野生型EBER2(EBER2-WT)以及野生型Zta promoter(Zp-WT)高度连锁，EBNA3B表位变异D402N，K424N与突变型EBER2(EBER2-Variant)及突变型Zta promoter(Zp-V3)高度连锁，证实了肿瘤相关EB病毒亚型具有相对保守的结构以及高度连锁的变异。通过分析EBNA3B与EB病毒其他多态性区域(EBER2，Zp)的连锁情况，本发明发现EBNA3B A399S，V400F，V417L表位和D402N，K424N表位与EB病毒基因组上其它多态性区域的变异高度连锁，证实该肿瘤相关性EB病毒变异存在着较为保守的连锁变异，而EBNA3B表位可以作为比较理想的分型位点。当EB病毒EBNA3B核抗原蛋白中存在A399S、V400F和V417L变异时，鼻咽癌患病风险降低；当EB病毒EBNA3B核抗原蛋白中存在D402N和K424N变异时，鼻咽癌患病风险升高。
实施例3 风险预测试剂盒
基于实施例1和2所述结果，本发明还提供了一种预测鼻咽癌患病风险的试剂盒，所述试剂盒中含有检测EB病毒EBNA3B核抗原蛋白第399、400和417位氨基酸表位变异和/或检测EB病毒EBNA3B核抗原蛋白第402和424位氨基酸表位变异的巢氏PCR引物(包括所述EBNA3B分型引物1和EBNA3B分型引物2)，引物序列在EB病毒Type A型和B型之间是保守的，引物序列如下表所示：
对EB病毒进行EBNA3B基因分型，检测EBNA3B表位变异时，先提取待测样本(外周血单核细胞)中的基因组DNA，以此为模板，利用上述EBNA3B分型引物1或EBNA3B分型引物2进行巢氏PCR扩增。EBNA3B分型引物2可用于重复或补充EBNA3B分型引物1的结果。具体引物序列及反应条件如下：
当使用EBNA3B分型引物1进行分型时：
第一轮巢氏PCR所用外引物如下所示：产物大小为380bp
EBNA3B-typing-1-F(SEQ ID NO.1)：ATAATTGTTGAGGATGACG
EBNA3B-typing-1-R(SEQ ID NO.2)：AGGTTGCCATGGCTCCAG
第一轮巢氏PCR反应的反应体系：
| 组分 | 体积μL |
| ddH<sub>2</sub>O | Up to 50μL |
| 2×Taq PCR StarMix | 25 |
| 10μM Forward primer | 2 |
| 10μM Reverse primer | 2 |
| DNA template | 50ng* |
第一轮巢氏PCR反应的反应条件：
第二轮巢氏PCR所用内引物如下所示：产物大小为339bp
EBNA3B-typing-2-F(SEQ ID NO.3)：GAAAGTGAGGAAATTGAAG
EBNA3B-typing-2-R(SEQ ID NO.4)：GAGCCTGGACACTCAGTG
第二轮巢氏PCR反应的反应体系：
第二轮巢氏PCR反应的反应条件同第一轮巢氏PCR。测序引物为EBNA3B-typing-2-R：GAGCCTGGACACTCAGTG，反向测序。
当使用EBNA3B分型引物2进行分型时：
第一轮巢氏PCR所用外引物如下所示：产物大小为665bp
E3B8.2(SEQ ID NO.5)：AAGAAGGACCACACTCATATACG
E3B9.2(SEQ ID NO.6)：TTTTCAAGAAGGTCTAGCAT
反应体系同EBNA3B分型引物1的第一轮巢氏PCR反应的反应体系。
第一轮巢氏PCR反应的反应条件：
第二轮巢氏PCR所用内引物如下所示：产物大小为543bp
E3B8(SEQ ID NO.7)：CGCCAGTGCACCGGGAGACCC
E3B9(SEQ ID NO.8)：CAAAGGTTGCCATGGCTCCAG
反应体系同EBNA3B分型引物1的第二轮巢氏PCR反应的反应体系。
第二轮巢氏PCR反应的反应条件：
测序引物为E3B9：CAAAGGTTGCCATGGCTCCAG，反向测序。
第二轮巢氏PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳后进行切割和纯化，送公司对PCR产物进行反向测序。以B95.8中EBNA3B的DNA序列(Gene ID：3783763；核心编码序列，即CDS序列如SEQ ID NO.9所示)为原型，通过NCBI Blast比对测序结果，分析EBNA3B变异情况。从EBNA3B基因的独立PCR扩增中重复测序反应至少两次，并且在这些分析中获得的序列是相同的。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.检测EB病毒EBNA3B核抗原蛋白第399、400和417位氨基酸表位变异和/或检测EB病毒EBNA3B核抗原蛋白第402和424位氨基酸表位变异的试剂在制备预测鼻咽癌患病风险的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述试剂为对含编码EB病毒EBNA3B核抗原蛋白第399、400和417位氨基酸表位和/或对含编码EB病毒EBNA3B核抗原蛋白第402和424位氨基酸表位的DNA序列进行扩增及测序的引物对。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，当EBNA3B核抗原蛋白第399位氨基酸表位的变异为A变为S，第400位氨基酸表位的变异为V变为F，第417位氨基酸表位的变异为V变为L时，鼻咽癌患病风险降低。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，当EBNA3B核抗原蛋白第402位氨基酸表位的变异为D变为N，第424位氨基酸表位的变异为K变为N时，鼻咽癌患病风险升高。
5.一种鼻咽癌患病风险预测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有检测EB病毒EBNA3B核抗原蛋白第399、400和417位氨基酸表位变异和/或检测EB病毒EBNA3B核抗原蛋白第402和424位氨基酸表位变异的试剂。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述试剂为对含编码EB病毒EBNA3B核抗原蛋白第399、400和417位氨基酸表位和/或对含编码EB病毒EBNA3B核抗原蛋白第402和424位氨基酸表位的DNA序列进行扩增及测序的引物对。
7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述引物对为巢氏PCR引物对，包括外引物和内引物；其中，所述外引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示，所述内引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示。
8.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述引物对为巢氏PCR引物对，包括外引物和内引物；其中，所述外引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示，所述内引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示。
9.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有SEQ IDNO.5～6所示外引物和SEQ ID NO.7～8所示内引物。
10.根据权利要求5～9任一所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有PCR扩增所需试剂。
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- 2023-10-20 CN CN202311372391.5A patent/CN117660644A/zh active Pending
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