BR112017009475B1 - Métodos de seleção de uma linhagem de células t e de um doador das mesmas, sistema de computador para selecionar uma linhagem de células t, meio legível por computador, uso de uma população de células t e método para a obtenção de uma linhagem de células t - Google Patents

Métodos de seleção de uma linhagem de células t e de um doador das mesmas, sistema de computador para selecionar uma linhagem de células t, meio legível por computador, uso de uma população de células t e método para a obtenção de uma linhagem de células t Download PDF

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Ekaterina Doubrovina
Guenther Koehne
Aisha N. Hasan
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Abstract

são aqui divulgados métodos de seleção de uma linhagem de células t alogênicas para administração terapêutica a um paciente possuindo ou suspeito de possuir um patógeno ou câncer. também são revelados métodos de seleção de um doador a partir do qual se deriva uma linhagem de células t alogênicas para administração terapêutica a um paciente possuindo ou suspeito de possuir um patógeno ou câncer.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório No. 62/075.856, depositado em 5 de novembro de 2014, o qual é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
DECLARAÇÃO DE DIREITOS DO GOVERNO
[0002] Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob NCI Ca 23766, SR21 CA 162002, SP30-Ca08748-40, P01 Ca 106450, P01 Ca 52477-13; P01 Ca54350 concedido pelos Institutos Nacionais de Saúde. O governo tem certos direitos na invenção.
1. CAMPO
[0003] São aqui revelados métodos de seleção de uma linhagem de células T alogênicas para administração terapêutica a um paciente com ou suspeito de ter um patógeno ou câncer. Também são revelados métodos de seleção de um doador a partir do qual se deriva uma linhagem de células T alogênicas para administração terapêutica a um paciente com ou suspeito de ter um patógeno ou câncer.
2. ANTECEDENTES
[0004] As células T CD8+ antivirais respondem a uma fração minuciosa dos determinantes peptídicos potenciais codificados por genomas virais. As células T citotóxicas reconhecem células infectadas através da interação do receptor de células T (TCR) com peptídeos antigênicos de 8-11 aminoácidos complexados com moléculas de classe I de histocompatibilidade principal (MHC). Estes complexos MHC-peptídeo resultam do processamento intracelular de proteínas virais sintetizadas endogenamente (Saveanu, L., et al., Immunol Rev, 2005. 207: 42-59; Strehl, B., et al., Immunol Rev, 2005. 207: 19-30).
[0005] Os determinantes peptídicos se conformam com os motivos de ligação previstos dentro de moléculas HLA específicas. Embora um grande número de epítopos peptídicos possa ser gerado, as respostas das células T são focadas para um número selecionado de epítopos, um fenômeno conhecido como imunodominância (Sercarz, E.E., et al., Annu Rev Immunol, 1993. 11: 729-66; Yewdell, J.W. e J.R. Bennink, Annu Rev Immunol, 1999. 17: 51-88). A natureza altamente focada das respostas de células T CD8 para patógenos indica que os epítopos individuais diferem na sua capacidade de induzir respostas de células T (Yewdell, J.W. e J.R. Bennink, Annu Rev Immunol, 1999. 17: 51-88).
[0006] Os epítopos peptídicos que induzem as respostas das células T mais proeminentes num dado indivíduo podem ser adicionalmente classificados com base na contribuição proporcional do epítopo para a resposta global das células T a qualquer peptídeo viral particular. Os epítopos “imunodominantes” são reconhecidos pelas populações de células T cognatas mais abundantes, enquanto que os epítopos “subdominantes” são reconhecidos por populações de células T menos abundantes. Portanto, dependendo das suas contribuições relativas à resposta total das células T, os epítopos individuais podem ser classificados como dominantes, codominantes ou subdominantes, estabelecendo assim uma hierarquia de imunodominância.
[0007] No caso da infecção por vírus da gripe de camundongos, as respostas de células T de CD8 são tipicamente dirigidas apenas a um punhado de epítopos específicos (La Gruta, NL, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2006. 103: 994 999). E num exemplo particularmente extremo, toda a resposta de células T de CD8 a um vírus parainfluenza de camundongo (vírus Sendai) é dirigida a um único epítopo (Cole, GA et al., Int Immunol, 1994, 6: 1767-1775, Kast, WM, et al., Proc Natl Acad Sei USA, 1991, 88: 2283-2287).
[0008] As respostas das células T humanas foram caracterizadas por várias infecções virais. Estudos de respostas de células T contra o vírus da imunodeficiência humana (HIV) levaram à identificação de vários epítopos nas várias proteínas deste vírus, e estes estudos também mostraram que os epítopos imunodominantes podem ser apresentados por alelos de antígeno de leucócitos humanos prevalentes (HLA) tais como HLA A0301, B0702 ou A0201 dentro de indivíduos que co-herdam estes alelos HLA (Day, CL, et al., J Virol, 2001. 75: 6279-6291). Além disso, múltiplos epítopos podem ser apresentados por estes mesmos alelos HLA durante diferentes fases da infecção (Yu, XG, et al., J Virol, 2002, 76: 8690 8701). A avaliação das respostas das células T contra o citomegalovírus humano (CMV) levou à identificação de vários epítopos imunodominantes dentro das proteínas mais imunogênicas deste vírus, nomeadamente CMVpp65 e IE1, e os seus alelos HLA que se apresentam. Isto levou então ao reconhecimento de que dentre os indivíduos que herdam alelos HLA específicos, tais como HLA B0702 e HLA A0201, os epítopos apresentados por estes alelos constituem os epítopos imunodominantes. Quando estes alelos são co-herdados, os epítopos apresentados por HLA B0702 constituem a resposta de células T imunodominantes enquanto que os epítopos HLA A0201 apresentados são subdominantes (Lacey, SF, et al., Hum Immunol, 2003. 64: 440-452).
[0009] A imunodominância reflete o produto final de uma multiplicidade de fatores positivos e negativos que governam o processamento e a apresentação de antígenos bem como a ativação de células T e a avidez do receptor de células T (Yewdell, JW e JR Bennink, Annu Rev Immunol, 1999. 17: 51-88). Entre estes, os principais fatores até agora avaliados na maioria dos estudos incluíram os antecedentes genéticos de HLA de classe I dos indivíduos infectados, a sequência de proteínas virais e a cinética de infecções virais, bem como as afinidades de ligação dos epítopos peptídicos nos sulcos de HLA bem como a afinidade de TCR para o complexo peptídeo-MHC.
[0010] A imunoterapia adoptiva utilizando células T específicas de vírus derivadas de doador pode ser eficaz na erradicação de infecções virais, tais como o vírus Epstein- Barr (EBV) e CMV após transplante de células estaminais hematopoiéticas alogênicas (HSCT). A falta de disponibilidade a tempo de células T específicas de vírus derivadas de doadores tem sido uma grande limitação para a aplicação bem sucedida desta abordagem de tratamento. Além disso, tais células não podem ser geradas a partir de doadores de sangue seronegativos e de cordão umbilical. Nesses casos, as células T específicas de vírus derivadas de doadores de terceiros pré- geradas poderiam estar prontamente disponíveis para tratamento de infecções virais graves nestes pacientes. Vários grupos demonstraram a segurança e a eficácia potencial de linhagens de linfócitos T citotóxicos (CTL) específicos de vírus derivados de doadores terceiros para o tratamento de infecções por EBV, CMV e adenovírus (ADV), utilizando linhagens CTL que foram empiricamente infundidas com base em correspondência para 2 ou mais alelos HLA (Haque, T, et al., Lancet, 2002. 360: 436-442, Barker, JN, et al., Blood, 2010. 116: 5045-5049, Doubrovina, E. et al., Blood, 2012. 119: 2644-2656, Uhlin, M., et al., Clinical Infectious Diseases, 2012. 55: 1064-1073, Leen, AM, et al., Blood, 2013. 121: 5113-5123). Existe uma necessidade de um método de seleção de linhagens de CTL para assegurar uma eficácia elevada e consistente do tratamento com CTL.
[0011] A citação de uma referência aqui não deve ser interpretada como uma admissão de que tal é o estado da técnica da presente divulgação.
3. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0012] A presente invenção proporciona métodos de seleção de uma linhagem de células T alogênicas para administração terapêutica a um paciente humano com ou suspeito de possuir um patógeno ou câncer e métodos de seleção de um doador de células T alogênicas a partir de quem deriva tal linhagem de células T alogênicas.
[0013] Em vários aspectos, os métodos de seleção de uma linhagem de células T alogênicas para administração terapêutica a um paciente humano com ou suspeito de possuir um patógeno ou câncer compreendem: selecionar uma linhagem de células T alogênicas para o paciente que reconhece pelo menos um epítopo de um antígeno do agente patogênico ou o câncer, utilizando uma representação (daqui em diante “Representação da Atividade”) que (i) identifica uma pluralidade de alelos HLA e opcionalmente combinações de alelos HLA e (ii) divulga indicações de atividades relativas de linhagens de células T, cada uma reconhecendo pelo menos um epítopo de um antígeno do patógeno ou câncer, e restrita a diferentes dos alelos HLA ou combinações de alelos HLA na pluralidade; em que na representação, cada combinação identificada de alelo HLA ou alelo HLA está associada com a respectiva indicação de atividade relativa da linhagem de células T restrita ao alelo HLA ou combinação de alelos HLA, as atividades relativas sendo medidas relativas de atividade conhecida contra o patógeno ou contra o câncer exibido pelas linhagens de células T; em que (A) a linhagem de células T selecionada tem em comum com o paciente ou células doentes (por exemplo, do câncer ou associada com a presença do patógeno) no paciente a combinação do alelo HLA ou alelo HLA identificado pela representação para a qual o reconhecimento da linhagem de células T é restrito; e (B) o alelo HLA ou a combinação de alelo HLA, para a qual a linhagem de células T selecionada é restrita, está associada na representação com uma indicação da atividade relativa mais elevada entre os alelos HLA e as combinações de alelos HLA na representação que são conhecidos por serem em comum com o paciente ou com as células doentes no paciente (com base na atribuição de HLA do paciente ou das células doentes no paciente) e não são de outra forma desqualificados.
[0014] Em certas concretizações, os métodos de seleção de uma linhagem de células T alogênicas adicionalmente compreendem antes da etapa de seleção, uma etapa de geração da Representação de Atividade. Em certas concretizações, os métodos de seleção de uma linhagem de células T alogênicas compreendem ainda antes da etapa de geração, uma etapa de medição das atividades relativas. Em certas concretizações, os métodos de seleção de uma linhagem de células T alogênicas compreendem ainda antes da etapa de seleção, uma etapa de verificação da atribuição de HLA do paciente ou das células doentes no paciente. Em concretizações específicas, a etapa de verificação compreende a tipificação de pelo menos 4 loci HLA.
[0015] Em vários aspectos, os métodos de seleção de um doador de células T alogênicas de quem deriva uma linhagem de células T alogênicas para administração terapêutica a um paciente humano com ou suspeito de ter um patógeno ou câncer compreendem: selecionar um doador de células T alogênicas para o paciente, utilizando uma Representação de Atividade que (i) identifica uma pluralidade de alelos HLA e opcionalmente combinações de alelos HLA, e (ii) divulga indicações de atividades relativas de linhagens de células T, cada uma reconhecendo pelo menos um epítopo de um antígeno do patógeno ou câncer, e restrita a diferentes dos alelos HLA ou combinações de alelos HLA na pluralidade; em que na representação cada combinação de alelo HLA ou alelo HLA está associada com a respectiva indicação de atividade relativa da linhagem de células T restrita ao alelo HLA ou combinação de alelos HLA, as atividades relativas sendo medidas relativas de atividade conhecida contra o patógeno ou contra o câncer exibido pelas linhagens de células T; em que (A) o doador de células T selecionado tem pelo menos uma combinação de alelo HLA ou alelo HLA em comum com o paciente ou células doentes (por exemplo, do câncer ou associado com a presença do patógeno) no paciente; e (B) um dos pelo menos um alelo HLA ou combinação de alelos HLA em comum com o paciente ou as células doentes no paciente está associado na representação com uma indicação da atividade relativa mais elevada entre os alelos HLA e as combinações de alelos HLA na Representação de Atividade que são conhecidos como sendo em comum com o paciente ou as células doentes no paciente e não são desqualificados de outra forma.
[0016] Em certas concretizações, os métodos de seleção de um doador de células T alogênicas compreendem ainda antes da etapa de seleção, uma etapa de geração da Representação de Atividade. Em certas concretizações, os métodos de seleção de um doador de células T alogênicas compreendem ainda antes da etapa de geração, uma etapa de medição das atividades relativas. Em certas concretizações, os métodos de seleção de um doador de células T alogênicas compreendem ainda antes da etapa de seleção, uma etapa de verificação da atribuição de HLA do paciente ou das células doentes no paciente. Em certas concretizações, os métodos de seleção de um doador de células T alogênicas compreendem ainda antes da etapa de seleção, uma etapa de verificação da atribuição de HLA para o doador de células T. Em certas concretizações, os métodos de seleção de um doador de células T alogênicas compreendem ainda antes da etapa de seleção, uma etapa de verificação da atribuição de HLA para o paciente ou das células doentes no paciente e a atribuição de HLA para o doador de células T. Em concretizações específicas, a etapa de verificação compreende a tipificação de pelo menos 4 loci HLA.
[0017] Em algumas concretizações, a Representação de Atividade é uma lista da pluralidade de alelos HLA e opcionalmente combinações de alelos HLA classificadas pelas atividades relativas. Em algumas concretizações, a Representação de Atividade é uma base de dados que lista a pluralidade de alelos HLA e opcionalmente combinações de alelos HLA, cada uma associada a uma pontuação indicativa de atividade relativa. Em algumas concretizações, a Representação de Atividade é um diagrama de dispersão. Em um aspecto específico de tais concretizações, um primeiro eixo do gráfico de dispersão representa diferentes dos alelos HLA e combinações de alelos de HLA opcionalmente na pluralidade, e um segundo eixo do gráfico de dispersão representa a percentagem de células CD3+ secretoras de interferon-Y derivadas de cada linhagem de células T para a qual é revelada uma indicação de atividade relativa na representação, por estimulação com células apresentadoras de antígeno que são autólogas à respectiva linhagem de células T e são carregadas com um ou mais peptídeos que apresentam a antigenicidade do patógeno ou câncer, como a indicação da referida atividade relativa. Em concretizações preferidas, as atividades relativas são eficiências clínicas in vivo das linhagens de células T no tratamento de pacientes com o patógeno ou câncer. Em algumas concretizações, a Representação de Atividade é armazenada numa base de dados.
[0018] Em vários aspectos, os métodos de seleção de um doador de células T alogênicas a partir do qual deriva uma linhagem de células T alogênicas para administração terapêutica a um paciente humano com ou suspeito de ter um patógeno ou câncer compreendem: selecionar um doador de células T alogênicas para o paciente que tem em comum um ou mais alelos HLA com o paciente ou células doentes (por exemplo, do câncer ou associado com a presença do patógeno) no paciente, utilizando uma representação (de aqui em diante “Representação de Frequência”) que (i) identifica uma pluralidade de alelos HLA e (ii) descreve indicações de frequências relativas de geração de linhagens de células T, cada uma reconhecendo pelo menos um epítopo de um antígeno do patógeno ou do câncer e restrita a diferentes dos referidos alelos HLA na pluralidade; em que na representação, cada alelo HLA identificado está associado com a respectiva indicação da frequência relativa de geração das referidas linhagens de células T restritas ao alelo HLA, em que: o doador de células T selecionado tem pelo menos um alelo HLA em comum com o paciente ou células doentes no paciente que está associado na representação com uma indicação de maior frequência de geração do que os alelos HLA do doador que não são em comum com o paciente ou com as células doentes no paciente.
[0019] Em certas concretizações, os métodos de seleção de um doador de células T alogênicas compreendem ainda antes da etapa de seleção, uma etapa de geração da Representação de Frequência. Em certas concretizações, os métodos de seleção de um doador de células T alogênicas compreendem ainda antes da etapa de geração, uma etapa de medição das frequências relativas. Em certas concretizações, os métodos de seleção de um doador de células T alogênicas compreendem ainda antes da etapa de seleção, uma etapa de verificação da atribuição de HLA para o paciente ou para as células doentes no paciente. Em certas concretizações, os métodos de seleção de um doador de células T alogênicas compreendem ainda antes da etapa de seleção, uma etapa de verificação da atribuição de HLA para o doador de células T. Em certas concretizações, os métodos de seleção de um doador de células T alogênicas compreendem ainda antes da etapa de seleção, uma etapa de verificação da atribuição de HLA para o paciente ou das células doentes no paciente e a atribuição de HLA para o doador de células T. Em concretizações específicas, a etapa de verificação compreende a tipificação de pelo menos 4 loci HLA.
[0020] Em algumas concretizações, a Representação de Frequência é uma lista da pluralidade de alelos HLA classificados pelas frequências relativas. Em algumas concretizações, a Representação de Frequência é uma base de dados que lista a pluralidade de alelos HLA, cada um associado com uma pontuação indicativa de frequência relativa. Em algumas concretizações, a Representação de Frequência é armazenada numa base de dados.
[0021] São também aqui proporcionados métodos de tratamento de um paciente humano com ou suspeito de ter um patógeno ou câncer, compreendendo: (a) selecionar uma linhagem de células T alogênicas para administração terapêutica ao paciente de acordo com um método descrito nesta divulgação; e (b) administrar uma população de células T derivadas da linhagem de células T alogênicas selecionadas para o paciente.
[0022] Também são aqui descritos métodos para obter uma linhagem de células T alogênicas para administração terapêutica a um paciente humano com ou suspeito de ter um patógeno ou câncer, compreendendo: (a) selecionar um doador de células T alogênicas de acordo com um método de seleção de um doador de células T alogênicas tal como descrito nesta divulgação; e (b) derivar uma linhagem de células T alogênicas a partir do doador de células T alogênicas selecionado, cuja linhagem de células T alogênicas reconhece pelo menos um epítopo de um antígeno ou o patógeno ou câncer.
[0023] Em vários aspectos, o paciente tem ou é suspeito de possuir um patógeno, em que as linhagens de células T reconhecem pelo menos um epítopo de um antígeno do patógeno. Em várias concretizações, o patógeno é um vírus, bactéria, fungo, helminto ou protista. Em certas concretizações, o patógeno é um vírus.
[0024] Em algumas concretizações, o vírus é citomegalovírus (CMV). Em concretizações específicas, o paciente tem ou é suspeito de ter uma infecção por CMV subsequente ao paciente ter sido submetido a um HSCT. Em concretizações específicas, o antígeno é CMV pp65. Em concretizações específicas, o antígeno é CMV IE1.
[0025] Em algumas concretizações, o vírus é o vírus Epstein- Barr (EBV). Em concretizações específicas, o antígeno é EBNA1, EBNA2, EBNA3A, EBNA3B, EBNA3C, LMP1 ou LMP2.
[0026] Em algumas concretizações, o vírus é BKV, JCV, herpesvírus, adenovírus, vírus da imunodeficiência humana, vírus da gripe, vírus ebola, poxvírus, rhabdovírus ou paramixovírus.
[0027] Em algumas concretizações, o vírus é herpesvírus humano-6 (HHV-6) ou herpesvírus humano-8 (HHV-8).
[0028] Em vários aspectos, o paciente tem ou é suspeito de ter um câncer, em que a linhagem de células T reconhece pelo menos um epítopo de um antígeno do câncer. Em algumas concretizações, o câncer é um câncer da mama, do pulmão, do ovário, do estômago, do pâncreas, da laringe, do esôfago, dos testículos, do fígado, da parótida, do trato biliar, do cólon, do reto, do colo do útero, do útero, do endométrio, tireoide, cérebro ou pele. Em algumas concretizações, o câncer é um câncer do sangue. Em concretizações específicas, o câncer é um distúrbio linfoproliferativo.
[0029] Em algumas concretizações, o câncer é câncer WT1- positivo. Em algumas concretizações, o antígeno é WT1.
[0030] Em algumas concretizações, o câncer é um distúrbio linfoproliferativo pós-transplante (EBV-PTLD) positivo para EBV. Em concretizações específicas, o antígeno é EBNA1, EBNA2, EBNA3A, EBNA3B ou EBNA3C. Em concretizações específicas, o antígeno é LMP1 ou LMP2.
[0031] Em algumas concretizações, o câncer é carcinoma nasofaríngeo EBV-positivo. Em concretizações específicas, o antígeno é EBNA1, LMP1 ou LMP2.
[0032] Em várias concretizações, um método de seleção de uma linhagem de células T alogênicas como descrito nesta descrição é implementado por computador. Em várias concretizações, um método de seleção de um doador de células T alogênicas como descrito nesta descrição é implementado por computador.
[0033] É também aqui proporcionado um sistema de computador para selecionar uma linhagem de células T alogênicas para administração terapêutica a um paciente humano com ou suspeito de ter um patógeno ou câncer, compreendendo: uma unidade de processamento central; uma memória, um par à unidade de processamento central, a memória armazenamento instruções para executar as etapas de qualquer método de seleção de uma linhagem de células T alogênicas ou qualquer método de seleção de um doador de células T alogênicas como descrito nesta divulgação.
[0034] É também aqui proporcionado um meio legível por computador que tem instruções executáveis por computador para executar as etapas de qualquer método de seleção de uma linhagem de células T alogênicas ou qualquer método de seleção de um doador de células T alogênicas como descrito nesta divulgação.
[0035] Em várias concretizações, o paciente tem sido o receptor de um transplante de células estaminais hematopoiéticas (HSCT). Em concretizações específicas, o HSCT é um transplante de medula óssea, transplante de células estaminais de sangue periférico ou transplante de sangue de cordão. Em várias concretizações, o paciente tem sido o receptor de um transplante de órgão sólido (SOT).
[0036] O paciente referido nesta descrição é um paciente humano.
4. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0037] A Figura 1 é uma representação que ilustra a percentagem de células CD3+ secretoras de interferon-Y para cada linhagem de células T em um banco de 119 linhagens de CTL específicas a CMV que são restritas a alelos HLA ou combinações de alelos HLA que apresentam epítopos imunodominantes, agrupados pelos seus respectivos alelos HLA ou combinações de alelos HLA, como descrito no Exemplo, Seção 6.2.3.
5. DESCRIÇÃO DETALHADA
[0038] A presente invenção proporciona métodos de seleção de uma linhagem de células T alogênicas para administração terapêutica a um paciente humano com ou suspeito de possuir um patógeno ou câncer e métodos de seleção de um doador de células T alogênicas de quem deriva tal linhagem de células T alogênicas. De acordo com a invenção, há uma hierarquia de alelos HLA que apresentam epítopos imunodominantes que conduz à expansão preferencial de células T específicas de epítopo restritas a alelos HLA específicos em relação a outras herdadas e expressas. A presente invenção utiliza uma representação que reflete esta hierarquia de expansão (refletida por atividade anti-patogênica ou anti-câncer) para selecionar linhagens de células T alogênicas para terapia e para selecionar os doadores a partir dos quais derivam as linhagens de células T alogênicas.
[0039] Há também uma hierarquia de alelos HLA que apresentam epítopos imunodominantes que conduzem à geração preferencial de células T específicas de epítopo restritas a alelos HLA específicos em relação a outras herdadas e expressas. A presente invenção utiliza uma representação que reflete esta hierarquia de geração (refletida por frequência de geração) para selecionar doadores a partir dos quais derivam linhagens de células T.
5.1. Seleção de linhagem de células T para a terapia celular adotiva
[0040] São aqui proporcionados métodos de seleção de uma linhagem de células T alogênicas para administração terapêutica a um paciente humano com ou suspeito de possuir um patógeno ou câncer.
[0041] Em vários aspectos, os métodos de seleção de uma linhagem de células T alogênicas para administração terapêutica a um paciente humano com ou suspeito de ter um patógeno ou câncer compreendem: selecionar uma linhagem de células T alogênicas para o paciente que reconhece pelo menos um epítopo de um antígeno do patógeno ou o câncer, utilizando uma representação (daqui em diante “Representação da Atividade”) que (i) identifica uma pluralidade de alelos HLA e opcionalmente combinações de alelos HLA e (ii) divulga indicações de atividades relativas de linhagens de células T, cada uma delas reconhecendo pelo menos um epítopo de um antígeno do patógeno ou câncer, e restrita a diferentes dos alelos HLA ou combinações de alelos HLA na pluralidade; em que na representação cada combinação de alelo HLA ou alelo HLA está associada com a respectiva indicação de atividade relativa da linhagem de células T restrita ao alelo HLA ou combinação de alelos HLA, as atividades relativas sendo medidas relativas de atividade conhecida contra o patógeno ou contra o câncer exibido pelas linhagens de células T; em que (A) a linhagem de células T selecionada tem em comum com o paciente ou células doentes (por exemplo, do câncer ou associado com a presença do patógeno) no paciente a combinação do alelo HLA ou alelo HLA identificado pela representação para a qual o reconhecimento da linhagem de células T é restrito; e (B) a associação de alelo HLA ou alelo HLA, para a qual a linhagem de células T selecionada é restrita, está associada na representação com uma indicação da atividade relativa mais elevada entre os alelos HLA e as combinações de alelos HLA na representação que são conhecidos por ser em comum com o paciente ou com as células doentes no paciente (com base na atribuição HLA do paciente ou das células doentes no paciente) e não são desqualificados de outra forma. Uma associação de alelo HLA ou alelo HLA é considerado “desqualificado de outra forma” se a linhagem de células T restrita a essa combinação de alelo HLA ou alelo HLA é conhecida como inadequada para administração terapêutica por qualquer motivo. Por exemplo, se é observado que uma linhagem de células T tentativamente selecionada não tem nenhuma ou tem muito poucas células viáveis na amostra de linhagem celular, a combinação de alelo HLA ou alelo HLA (ao qual essa linhagem de células T está restrita) pode ser considerado desqualificado. Como apenas um outro exemplo, se as atividades relativas na Representação de Atividade se basearem em ensaios de atividade in vitro ou ex vivo e é sabido que a atividade relativa in vivo de uma linhagem de células T restrita a uma determinada combinação de alelo HLA ou alelo HLA não se correlaciona com o ensaio relativo in vitro ou ex vivo utilizado para gerar a Representação de Atividade, de modo que a atividade relativa mais elevada na Representação de Atividade não é a atividade in vivo relativa mais elevada, a associação de alelo HLA ou alelo HLA particular (para o qual tal linhagem de células T é limitada) pode ser considerado desqualificado. Por exemplo, observou-se que a atividade in vivo contra a infecção por CMV em pacientes humanos para linhagens de células T restritas a HLA-B35 é clinicamente ineficaz (portanto, atividade in vivo relativa insignificante), embora a percentagem de células T CD3+ secretoras de interferon-Y derivadas de linhagens de células T restritas a HLA-B35 indicam uma atividade relativa muito mais elevada; assim, no contexto do tratamento de infecções por CMV, se uma linhagem de células T restrita a HLA-B35 for tentativamente selecionada, preferencialmente HLA- B35 seria “desqualificada de outra forma”. Utilizando o método reivindicado, a linhagem de células T selecionada é específica para um epítopo do patógeno ou câncer, apresentada por uma combinação de alelo HLA ou alelo HLA compartilhado com o paciente, que está associado com a atividade mais elevada entre os alelos HLA ou combinação de alelos HLA no paciente. Numa concretização específica relacionada, uma combinação de alelo HLA ou alelo HLA é considerada desqualificada se a linhagem de células T restrita ao alelo HLA ou combinação de alelos HLA é conhecida por ser clinicamente ineficaz no tratamento de pacientes com o patógeno ou câncer.
[0042] Noutra concretização, o método proporcionado pela invenção é um método de seleção de uma linhagem de células T alogênicas candidatas para administração terapêutica a um paciente humano com ou suspeito de ter um patógeno ou câncer compreendendo: selecionar uma linhagem de células T alogênicas para o paciente que reconhece pelo menos um epítopo de um antígeno do patógeno ou do câncer, utilizando uma Representação de Atividade que (i) identifica uma pluralidade de alelos HLA e opcionalmente combinações de alelos HLA, e (ii) divulga indicações de atividades relativas de linhagens de células T, cada uma reconhecendo pelo menos um epítopo de um antígeno do patógeno ou câncer e restrita a diferentes dos alelos HLA ou combinações de alelos HLA na pluralidade; em que na representação, cada alelo HLA ou combinação de alelo HLA está associada com a respectiva indicação de atividade relativa da linhagem de células T restrita ao alelo HLA ou combinação de alelos HLA, as atividades relativas sendo medidas relativas de atividade conhecida contra o patógeno ou contra o câncer exibido pelas linhagens de células T; em que (A) a linhagem de células T selecionada tem em comum com o paciente ou células doentes (por exemplo, do câncer ou associado com a presença do patógeno) no paciente a combinação do alelo HLA ou alelo HLA identificado pela representação para a qual o reconhecimento da linhagem de células T é restrito; e (B) o alelo HLA ou combinação de alelo HLA, à qual a linhagem de células T selecionada é restrita, está associada na representação com uma indicação da atividade relativa mais elevada dentre os alelos HLA e as combinações de alelos HLA na representação que são conhecidos por ser em comum com o paciente ou com as células doentes no paciente (com base na atribuição de HLA do paciente ou das células doentes no paciente).
[0043] Em certas concretizações, os métodos compreendem ainda antes da etapa de seleção, uma etapa de geração da Representação de Atividade . Métodos que podem ser usados para gerar a Representação de Atividade são descritos abaixo. Em certas concretizações, os métodos compreendem ainda antes da etapa de geração, uma etapa de medição das atividades relativas. Em certas concretizações, os métodos compreendem ainda antes da etapa de seleção, uma etapa de verificação da atribuição de HLA para o paciente ou para as células doentes no paciente.
[0044] Em concretizações específicas, a linhagem de células T selecionada reconhece pelo menos um epítopo de um antígeno do patógeno ou do câncer, pelo menos um epítopo apresentado por uma combinação de alelo HLA ou alelo HLA que é em comum com o paciente ou células doentes no paciente, em que a combinação de alelo HLA ou alelo HLA está associada com uma indicação da atividade relativa mais elevada entre os alelos HLA e as combinações de alelos HLA no paciente ou as células doentes no paciente (e não são desqualificadas de outro modo tal como descrito acima). Num aspecto preferido destas concretizações, as atividades relativas são eficiências clínicas in vivo das linhagens de células T no tratamento de pacientes com o patógeno ou câncer.
[0045] Em concretizações específicas dos métodos aqui descritos, pelo menos um epítopo é pelo menos um epítopo imunodominante.
[0046] Em certas concretizações dos métodos da invenção, a linhagem de células T selecionada tem em comum com o paciente ou células doentes (por exemplo, do câncer ou associadas com a presença do patógeno) no paciente a combinação de alelo HLA ou alelo HLA identificado pela Representação da Atividade à qual o reconhecimento da linhagem de células T é restringido. Em algumas concretizações, o paciente é um receptor de transplante. Numa concretização específica em que o paciente é um receptor de transplante, o(s) alelo(s) HLA ou combinação(s) de alelo HLA que são em comum com o paciente ou as células doentes (por exemplo, cancerosas ou infectadas com um patógeno) no paciente se referem ao(s) alelo(s) HLA ou combinação(s) de alelos HLA que são comuns com o paciente antes e/ou após o transplante. Em algumas concretizações, as células doentes no paciente são derivadas do transplante dado ao paciente e assim expressam os alelos HLA do transplante; Numa tal concretização, a determinação da atribuição de HLA das células doentes no paciente pode ser feita ao tipificar os alelos HLA no transplante dado ao doente. Noutras concretizações, as células doentes no paciente não são derivadas do transplante dado ao paciente e, assim, têm a atribuição de HLA do paciente antes do transplante. Em concretizações específicas, o transplante é um HSCT ou transplante de órgão sólido.
5.1.1. Geração de linhagens de células T
[0047] As linhagens de células T a partir das quais para selecionar a administração terapêutica e/ou usar para obter informação para a geração de uma representação podem ser feitas tal como aqui descrito. Linhagens de células T que reconhecem, pelo menos, um epítopo de um antígeno de um agente patogênico ou câncer podem ser geradas por qualquer método conhecido no estado da técnica ou como aqui descrito. Modos exemplificativos não limitativos para gerar linhagens de células T que reconhecem pelo menos um epítopo de um antígeno de um agente patogênico ou de câncer podem ser encontrados em Trivedi, D., et al., Blood, 2005. 105: 2793-2801; Koehne, G., et al., Blood, 2000. 96: 109-117; Koehne, G., et al., Blood, 2002. 99: 1730-1740; Doubrovina, E., et al., Blood, 2012. 119: 2644-2656; Barker, J. N., et al., Blood, 2010. 116: 5045-5049; O’Reilly, R. J., et al., Immunol Res, 2007. 38: 237-250; and O’ Reilly, R. J., et al., Best Practice & Research Clinical Haematology, 2011. 24: 381-391.
[0048] Em certas concretizações, uma linhagem de células T é gerada estimulando as células T a partir de um doador seropositivo com células apresentadoras de antígeno que apresenta um ou mais peptídeos de antígeno(s) apresentando a antigenicidade do agente patogênico ou câncer (do paciente). De um modo preferido, a células que apresentam antígenos são autólogas às células T (e, portanto, são derivadas a partir do doador de células T). Em concretizações específicas, as células T são estimuladas com células dendríticas carregadas com um conjunto de peptídeos de um ou mais antígenos do patógeno ou câncer. Em algumas concretizações, as células dendríticas são obtidas a partir do doador das células T. Em concretizações específicas, as células T são estimuladas com monócitos ativados por citocinas (CAMS) carregadas com um conjunto de peptídeos de um ou mais antígenos do patógeno ou câncer. Em algumas concretizações, os CAMS são derivados a partir do doador das células T. Em concretizações específicas, as células T são estimuladas com células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) carregadas com um conjunto de peptídeos de um ou mais antígenos do patógeno ou câncer. Em algumas concretizações, as PBMC são derivadas a partir do doador das células T. Em certas concretizações, as linhagens de células T são geradas por estimulação das células T com as linhagens celulares de linfócitos B (BLCLs) carregadas com um conjunto de peptídeos de um ou mais antígenos do patógeno ou câncer. Em algumas concretizações as BLCLs são derivadas a partir do doador das células T. Em concretizações específicas, as BLCLs são BLCLs transformadas por EBV derivadas a partir do doador das células T. Em certas concretizações, as linhagens de células T são geradas por estimulação das células T com as células apresentadoras de antígenos artificiais (AAPCS) carregadas com um conjunto de peptídeos de um ou mais antígenos do patógeno ou câncer.
[0049] Em várias concretizações, o conjunto de peptídeos é um conjunto de peptídeos que se sobrepõem, abrangendo um antígeno do patógeno ou câncer. Em várias concretizações, o conjunto de peptídeos é um conjunto de peptídeos com sobreposição abrangendo mais do que um antígeno do patógeno ou câncer. Em uma concretização específica, o conjunto de peptídeos que se sobrepõem é um conjunto de pentadecapeptídeos sobrepostos.
[0050] Em certas concretizações, as linhagens de células T são geradas por estimulação das células T com AAPCs geneticamente manipuladas para expressar pelo menos um peptídeo imunogênico ou a proteína do patógeno. Em certas concretizações, as linhagens de células T são geradas por estimulação das células T com BLCLs que são transformadas com um vírus, em que o vírus é o agente patogênico.
[0051] Em algumas concretizações, as células T são estimuladas durante um período de 28-40 dias em cultura. Em concretizações particulares, as células T são estimuladas na presença de IL-2. Em várias concretizações, após a estimulação, as linhagens de células T são criopreservadas para armazenamento. Numa concretização específica, onde uma linhagem de células T é selecionada de acordo com o método reivindicado que é criopreservado, a linhagem de células T é descongelada antes da administração terapêutica. Numa concretização ainda mais específica, a linhagem de células T descongelada opcionalmente é expandida em cultura antes da administração terapêutica.
[0052] Em várias concretizações, as células T que são utilizadas para gerar as linhagens de células T são purificadas por métodos conhecidos no estado da técnica. Em certas concretizações, as células T são enriquecidas a partir de linfócitos do sangue periférico separadas de PBMC. Em algumas concretizações, as células T são enriquecidas a partir de linfócitos do sangue periférico separadas a partir de PBMC por depleção de monócitos aderentes seguido pela depleção de células assassinas naturais.
[0053] As células dendríticas que podem ser utilizadas para estimular células T para gerar linhagens de células T que reconhecem pelo menos um epítopo de um antígeno de um agente patogênico ou câncer podem ser derivadas a partir de monócitos ativados por citocinas (CAMS). Em algumas concretizações, os CAMS são gerados por incubação de PBMC com citocinas, tais como GM-CSF, IL-4, TNF-α, IL-1β, IL-6, e/ou prostaglandina-E2.
[0054] BLCLs que podem ser utilizadas para estimular células T para gerar linhagens de células T que reconhecem pelo menos um epítopo de um antígeno de um agente patogênico ou câncer podem ser gerados a partir de PBMC utilizando qualquer método conhecido no estado da técnica, por exemplo, como descrito em Koehne, G., et al., Blood, 2000. 96: 109-117 ou Koehne, G., et al., Blood, 2002. 99: 1730-1740.
[0055] O alelo HLA ou combinação de alelo HLA para os quais cada uma das linhagens de células T geradas que reconhecem pelo menos um epítopo de um antígeno de um agente patogênico ou câncer é restrita podem ser determinados por qualquer método conhecido no estado da técnica, por exemplo, como descrito em Trivedi, D., et al., Blood, 2005. 105: 2793-2801; Barker, J. N., et al., Blood, 2010. 116: 5045-5049; Hasan, A.N., et al., J Immunol, 2009. 183: 2837-2850; ou Doubrovina, E., et al., Blood, 2012. 120: 1633-1646.
5.1.2. A determinação da atribuição de HLA
[0056] A etapa de determinar a atribuição de HLA (isto é, tipificar o loci HLA) pode ser realizada por qualquer método conhecido no estado da técnica. Métodos exemplificativos não limitativos para determinar a atribuição de HLA podem ser encontrados em Lange, V., et al., BMC Genomics, 2014. 15: 63; Erlich, H., Tissue Antigens, 2012. 80:1-11; Bontadini, A., Methods, 2012. 56:471-476; Dunn, P.P., Int J Immunogenet, 2011 38:463-473; e Hurley, C.K., “DNA-based typing of HLA for transplantation.” in Leffell, M.S., et al., eds., Handbook of Human Immunology, 1997. Boca Raton: CRC Press. Em algumas concretizações, a etapa de determinar a atribuição de HLA compreende tipificar pelo menos quatro loci de HLA, de preferência HLA-A, HLA-B, HLA-C, e HLA-DRB1. Em algumas concretizações, a etapa de determinar a atribuição de HLA compreende tipificar 4 loci HLA, de preferência HLA-A, HLA-B, HLA-C, e HLA-DRB1. Em algumas concretizações, a etapa de determinar a atribuição de HLA compreende tipificar, pelo menos, 6 loci HLA. Em algumas concretizações, a etapa de determinar a atribuição de HLA compreende tipificar 6 loci HLA. Em algumas concretizações, a etapa de determinar a atribuição de HLA compreende tipificar, pelo menos, 8 loci HLA. Em algumas concretizações, a etapa de determinar a atribuição de HLA compreende tipificar 8 loci HLA. Em algumas concretizações, a etapa de determinar a atribuição de HLA compreende tipificar todos os loci de HLA conhecidos. Em algumas concretizações, a etapa de determinar a atribuição de HLA compreende tipificar menos do que todos os loci de HLA conhecidos.
[0057] Em geral, tipificar mais loci HLA é preferível para a prática da invenção, uma vez que quanto mais loci de HLA são tipificados, mais provável é a linhagem de células T alogênicas selecionada de ter uma atividade mais elevada em relação a outras linhagens de células T alogênicas que possuem alelos de HLA ou combinações de alelo HLA em comum com o paciente ou as células doentes no paciente.
5.1.3. Geração de Representação de Atividade para selecionar linhagens de células T
[0058] A Representação de Atividade identifica uma pluralidade de alelos HLA e opcionalmente combinações de alelos HLA, e divulga indicações de atividades relativas de linhagens de células T (i) cada uma reconhecendo, pelo menos, um epítopo de um antígeno do agente patogênico ou câncer (do paciente), e (ii) restritas a diferentes dos alelos HLA ou combinações de alelos de HLA na pluralidade. Na Representação da Atividade, cada alelo HLA ou combinação de alelos HLA identificado está associado com a respectiva indicação de atividade relativa da linhagem de células T restrita ao alelo HLA ou combinação de alelos HLA, as atividades relativas sendo medidas relativas de atividade conhecida contra o agente patogênico ou contra o câncer exibida pelas linhagens de células T.
[0059] As atividades relativas das linhagens de células T podem ser obtidas por qualquer método in vitro, ex vivo ou in vivo conhecido no estado da técnica.
[0060] Em concretizações preferidas, as atividades relativas são medidas como as eficácias clínicas in vivo das linhagens de células T no tratamento de pacientes com o agente patogênico ou câncer. Em aspectos específicos de tais concretizações, as atividades relativas podem ser medidas como a percentagem de pacientes que têm ou suspeitos de ter o agente patogênico ou câncer que alcançam uma remissão completa (RC) depois do tratamento com as linhagens de células T. Em concretizações específicas, as atividades relativas são medidas como a percentagem de pacientes que têm ou suspeitos de ter o agente patogênico ou câncer que alcançam uma remissão completa (CR) ou parcial (PR) após o tratamento com as linhagens de células T.
[0061] Em algumas concretizações, as atividades relativas são medidas como a percentagem de células produtoras de células CD3+ produtoras de interferon-Y derivadas a partir de cada uma das linhagens de células T por estimulação com células apresentadoras de antígeno que apresentam um ou mais peptídeos que apresentam a antigenicidade do agente patogênico ou câncer. Em concretizações específicas, em que o antígeno é de CMV ou EBV, as atividades relativas são medidas por métodos modificados a partir de ou tal como descrito em Koehne, G., et al., Blood, 2002. 99: 1730-1740 or Waldrop, S.L., et al., J Clin Invest, 1997. 99: 1739-1750.
[0062] Em algumas concretizações, as atividades relativas são medidas como a percentagem de células que expressam um antígeno do patógeno ou câncer que são submetidas a lise por exposição a cada uma das linhagens de células T num ensaio de citotoxicidade realizado de acordo com métodos conhecidos no estado da técnica.
[0063] De acordo com a presente invenção, as atividades relativas não são medidas como as afinidades de ligação do epítopo reconhecido pela respectiva linhagem de células T em relação ao alelo HLA que apresenta o epítopo.
[0064] Em alguns aspectos, a Representação de Atividade é uma lista da pluralidade de alelos HLA e combinações de alelos de HLA opcionalmente classificados pelas atividades relativas. Em algumas concretizações, a etapa de selecionar uma linhagem de células T alogênicas é realizada ao descer a lista de uma pluralidade de alelos de HLA e combinações de alelos HLA opcionalmente classificados pelas atividades relativas, com a classificação mais alta na lista sendo uma indicação da maior atividade relativa, e determinar o alelo HLA ou combinação de alelo HLA de melhor classificação que é conhecido por ser em comum com o paciente ou as células doentes do paciente, e a escolha de uma linhagem de células T alogênicas restrita a aquele alelo HLA ou combinação de alelos HLA. A título de exemplo, numa concretização específica, a representação de atividade é uma lista, como mostrado na Tabela 6.
[0065] Em alguns aspectos, a Representação de Atividade é uma base de dados (por exemplo, tabela) listando a pluralidade de alelos HLA e combinações de alelos HLA, opcionalmente, cada um associado com uma pontuação indicativa de atividade relativa. Em algumas concretizações, a etapa de selecionar uma linhagem de células T alogênicas é realizada passando pelo perfil do banco de dados da pluralidade de alelos HLA e combinações de alelos HLA, opcionalmente, cada um associado com uma pontuação indicativa de atividade relativa, com o maior número de pontos na base de dados sendo uma indicação da maior atividade relativa, e a determinação dos alelos HLA ou combinação de alelos HLA de pontuação mais alta que é conhecida por ser em comum com o paciente ou as células doentes do paciente, e a escolha de uma linhagem de células T alogênicas restrita a esse alelo HLA ou combinação de alelos HLA. Numa concretização específica, a etapa de selecionar uma linhagem de células T alogênicas usando uma Representação de Atividade, que é uma tal base de dados, pode ser efetuada ao primeiro filtrar para fora (excluindo) todos os alelos HLA e combinações de alelos HLA no banco de dados que não são em comum com o paciente ou as células doentes do paciente, e, em seguida, determinar entre os restantes, o alelo HLA ou combinação de alelos HLA associada com a indicação de atividade relativa mais elevada, e, em seguida, a escolher uma linhagem de células T alogênicas restrita a esse alelo HLA ou combinação de alelos HLA.
[0066] Em alguns aspectos, a Representação da Atividade é um gráfico de dispersão. Em certas concretizações, um primeiro eixo do gráfico de dispersão representa diferentes dos alelos HLA e, opcionalmente, combinações de alelos HLA na pluralidade de alelos HLA e opcionalmente combinações de alelos HLA. Em certas concretizações, um segundo eixo do gráfico de dispersão representa as atividades relativas. Numa concretização específica, o segundo eixo do gráfico de dispersão representa a percentagem de células CD3+ secretoras de interferon-Y derivadas a partir de cada linhagem de células T para as quais uma indicação de atividade relativa é revelada na Representação de Atividade, após estimulação com células apresentadoras de antígeno apresentando um ou mais peptídeos de um ou mais antígenos que apresentam a antigenicidade do agente patogênico ou câncer. Em uma concretização particular, a estimulação é com células apresentadoras de antígenos que são autólogas à respectiva linhagem de células T e são carregadas com um ou mais peptídeos que apresentam a antigenicidade do patógeno ou câncer, como a indicação da referida atividade relativa. A título de exemplo, numa concretização específica, a Representação de Atividade é um gráfico de dispersão, como mostrado na Figura 1.
[0067] Em algumas concretizações, a Representação de Atividade é armazenada numa base de dados.
[0068] Em várias concretizações, o método de escolha de uma linhagem de células T alogênicas é implementado por computador. Em algumas concretizações, o método de escolha de uma linhagem de células T alogênicas é implementado por computador utilizando um sistema de computador, tal como descrito na Seção 5.6. Em algumas concretizações, os métodos de seleção de uma linhagem de células T alogênicas é implementado por computador utilizando um meio legível por computador, tal como descrito na Seção 5.6.
[0069] Dados adicionais podem ser usado para atualizar uma Representação de Atividade, uma vez que os dados adicionais estão disponíveis.
5.2. Usos terapêuticos de linhagens de células T selecionadas
[0070] Além disso, são aqui proporcionados métodos de tratamento de um paciente humano tendo ou suspeito de ter um agente patogênico ou câncer, compreendendo: (a) selecionar uma linhagem de células T alogênicas para administração terapêutica para o paciente de acordo com qualquer um dos métodos de seleção de uma linhagem de células T alogênicas conforme descrito na Seção 5.1; e (b) administrar uma população de células T derivadas a partir da linhagem de células T alogênicas selecionada para o paciente. Assim, em um paciente tendo um câncer, a invenção fornece um método de tratar o câncer; em um paciente com um agente patogênico, a invenção proporciona um método de tratamento de uma doença, distúrbio ou condição associada com a presença do agente patogênico.
[0071] Em certas concretizações, a administração é por infusão de uma população de células T derivadas a partir da linhagem de células T alogênicas selecionada. Em algumas concretizações, a administração é por infusão intravenosa de bolus de uma população de células T derivadas a partir da linhagem de células T alogênicas selecionada. A quantidade a ser administrada pode ser determinada com base na condição do paciente e do conhecimento do médico. Em certas concretizações, a administração compreende a administração de, pelo menos, cerca de 1 x 105células T/kg/dose/semana para o paciente, em que a população de células T é derivada da linhagem de células T alogênicas selecionada. Em algumas concretizações, a administração compreende a administração de cerca de 1 x 106a 2 x 106células T/kg/dose/semana para o paciente, em que a população de células T é derivada da linhagem de células T alogênicas selecionada. Em algumas concretizações, a administração compreende a administração de cerca de 1 x 106células/kg/dose/semana para o paciente, em que a população de células T é derivada da linhagem de células T alogênicas selecionada. Em algumas concretizações, a administração compreende a administração de cerca de 2 x 106 células T/kg/dose/semana para o paciente, em que a população de células T é derivada da linhagem de células T alogênicas selecionada. Em certas concretizações, os regimes de dosagem acima descritas são efetuados durante pelo menos 3 semanas, de tal modo que pelo menos 3 doses são administradas. Em algumas concretizações, os regimes de dosagem acima descritos são efetuados durante 3 semanas, de tal forma que 3 doses são administradas. Em algumas concretizações, os regimes de dosagem acima descritas são efetuados durante 6 semanas, de tal modo que 6 doses são administradas. Em certas concretizações, os regimes de dosagem acima descritos são efetuados durante 3 semanas, de tal forma que 3 doses são administradas, seguida pela administração de uma população de células T derivadas a partir da linhagem de células T alogênicas selecionada por um outro regime de dosagem por pelo menos uma semana, em que o segundo regime de dosagem é de cerca de 1x107células T/kg/dose/semana. Em certas concretizações, os regimes de dosagem acima descritos são efetuados durante 3 semanas, de tal forma que 3 doses são administradas, seguida pela administração de uma população de células T derivadas a partir da linhagem de células T alogênicas selecionada por um outro regime de dosagem por três semanas, em que o segundo regime de dosagem é de cerca de 1x107 células T/kg/dose/semana. Em certas concretizações, em que o paciente tem um câncer, 5 infusões repetidas de doses de cerca de 1 x 108a 1 x 109células T/kg/dose/semana são administradas.
5.3. Seleção de doador de células T para terapia celular adotiva
[0072] São também aqui proporcionados métodos de seleção de um doador de células T alogênicas do qual deriva uma linhagem de células T alogênicas para administração terapêutica a um paciente humano tendo ou suspeito de ter um agente patogênico ou câncer.
5.3.1. Seleção de doador de células T com base na Representação de Atividade
[0073] Em vários aspectos, os métodos de seleção de um doador de células T alogênicas do qual deriva uma linhagem de células T alogênicas para administração terapêutica a um paciente humano tendo ou suspeito de ter um agente patogênico ou câncer compreendem: seleção de um doador de célula T alogênica ao paciente, usando uma Representação de Atividade que: (i) identifica uma pluralidade de alelos HLA e opcionalmente combinações de alelos HLA, e (ii) revela indicações de atividades relativas de linhagens de células T, cada uma reconhecendo, pelo menos, um epítopo de um antígeno do patógeno ou câncer, e restrita a diferentes dos alelos HLA ou combinações de alelos HLA na pluralidade; em que na representação, cada alelo HLA ou combinação de alelos HLA identificado está associado com a respectiva indicação de atividade relativa da linhagem de células T restrita ao alelo HLA ou combinação de alelo HLA, as atividades relativas sendo medidas relativas de atividade conhecida contra o agente patogênico ou contra o câncer exibido pelas linhagens de células T; em que (A) o doador de células T selecionado tem pelo menos um alelo HLA ou combinação de alelo HLA em comum com o paciente ou células doentes (por exemplo, do câncer ou associada com a presença do agente patogênico) no paciente; e (B) um do pelo menos um do alelo HLA ou combinação de alelo HLA em comum com o paciente ou as células doentes no paciente está associado na representação com uma indicação da maior atividade relativa entre os alelos HLA e combinações de alelos HLA na Representação de Atividade que são conhecidos por serem em comum com o paciente ou as células doentes no paciente e não são de outra forma desqualificados. Um alelo HLA ou combinação de alelos HLA é considerado “desqualificado” se a linhagem de células T restrita a aquele alelo HLA ou combinação de alelos HLA é conhecida por ser inadequada para administração terapêutica por qualquer razão. Por exemplo, se as atividades relativas na Representação de Atividade se baseiam em ensaios in vitro ou ex vivo e for conhecido que a atividade relativa in vivo de uma linhagem de células T restrita a um alelo HLA particular ou combinação de alelos HLA não se correlaciona com o ensaio relativo in vitro ou ex vivo utilizado para gerar a Representação de Atividade, de tal modo que a mais alta atividade relativa na Representação de Atividade não é a mais alta em relação à atividade in vivo, o alelo HLA particular ou combinação de alelos HLA (para os quais tal linhagem de células T está restrita) podem ser considerados desqualificados. Por exemplo, tem-se observado que a atividade in vivo contra a infecção por CMV em pacientes humanos para linhagens de células T restritas ao HLA-B35 é clinicamente ineficaz (portanto, atividade in vivo relativamente insignificante), embora a percentagem de células T CD3+ secretoras de interferon-Y derivadas a partir de linhagens de células T restritas ao HLA-B35 indica uma atividade relativa muito maior; assim, no contexto do tratamento de infecções por CMV, se um doador de células T possuindo o HLA-B35 é tentativamente selecionado, preferencialmente HLA-B35 poderia ser “de outra forma desqualificado”. Numa concretização específica relacionada, o alelo HLA ou combinação de alelos HLA serão considerados desqualificados se a(s) linhagem(s) de célula T restrita ao alelo HLA ou combinação de alelos HLA é conhecida por ser clinicamente ineficaz no tratamento de pacientes com o agente patogênico ou câncer.
[0074] Em outra concretização, o método proporcionado pela invenção é um método de seleção de um doador candidato de células T alogênicas de quem deriva uma linhagem de células T alogênicas para administração terapêutica a um paciente humano tendo ou suspeito de ter um agente patogênico ou câncer que compreende: seleção de um doador de células T alogênicas ao paciente, usando uma Representação de Atividade que: (i) identifica uma pluralidade de alelos HLA e combinações de alelos HLA, opcionalmente, e (ii) revela indicações de atividades relativas de linhagens de células T, cada uma reconhecendo pelo menos um epítopo de um antígeno do patógeno ou câncer, e restrita a diferentes dos alelos HLA ou combinações de alelos HLA na pluralidade; em que na representação, cada alelo HLA ou combinação de alelo HLA identificado está associado com a respectiva indicação de atividade relativa da linhagem de células T restrita ao alelo HLA ou combinação de alelo HLA, as atividades relativas sendo medidas relativas de atividade conhecida contra o agente patogênico ou contra o câncer exibido pelas linhagens de células T; em que (A) o doador de células T selecionado tem pelo menos um alelo HLA ou combinação de alelos HLA em comum com o paciente ou células doentes (por exemplo, do câncer ou associada com a presença do agente patogênico) no paciente; e (B) um do pelo menos um de alelo HLA ou combinação de alelos HLA em comum com o paciente ou as células doentes no paciente está associado na representação com uma indicação da maior atividade relativa entre os alelos HLA e combinações de alelos HLA na Representação de Atividade que são conhecidos por serem em comum com o paciente ou as células doentes do paciente.
[0075] Em certas concretizações, os métodos compreendem ainda, antes da etapa de seleção, uma etapa de gerar a Representação de Atividade. Métodos que podem ser usados para gerar a Representação da Atividade estão descritos na Seção 5.1.3. Em certas concretizações, os métodos compreendem ainda, antes da etapa de geração, uma etapa de medir as atividades relativas. Em certas concretizações, os métodos compreendem ainda, antes da etapa de seleção, uma etapa de verificação da atribuição de HLA do paciente ou as células doentes do paciente. Em certas concretizações, os métodos compreendem ainda, antes da etapa de seleção, uma etapa de verificação da atribuição de HLA para o doador de células T. Em certas concretizações, os métodos compreendem ainda, antes da etapa de seleção, uma etapa de determinar a atribuição de HLA do paciente ou as células doentes do paciente e a atribuição de HLA para o doador de células T.
[0076] Em concretizações específicas, o doador de células T selecionado tem pelo menos um alelo HLA ou combinação de alelos HLA que é em comum com o paciente ou as células doentes no paciente, em que um de pelo menos um alelo de HLA ou da combinação de alelo HLA é associado a uma indicação da maior atividade relativa entre os alelos HLA e combinações de alelos HLA do paciente (e não são de outra forma desqualificados como descrito acima). Em um aspecto preferido de tais concretizações, as atividades relativas são eficácias clínicas in vivo das linhagens de células T no tratamento de pacientes com o agente patogênico ou câncer.
[0077] Em concretizações específicas dos métodos aqui descritos, o pelo menos um epítopo é pelo menos um epítopo imunodominante.
[0078] Em certas concretizações dos métodos da invenção, o doador de células T selecionado tem pelo menos um alelo HLA ou combinação de alelos HLA em comum com o paciente ou células doentes (por exemplo, do câncer ou associadas com a presença do agente patogênico) no paciente. Em algumas concretizações, o paciente é um receptor de transplante. Numa concretização específica em que o paciente é um receptor de transplante, o(s) alelo(s) HLA (s) ou combinação(s) de alelo HLA que são em comum com o paciente ou as células doentes (por exemplo, cancerosas ou infectadas com um agente patogênico) no paciente se referem ao alelo HLA(s) ou combinação(s) de alelo HLA que são em comum com o paciente antes e/ou após o transplante. Em algumas concretizações, as células doentes no paciente são derivadas do transplante dado ao paciente e, assim, expressam os alelos HLA do transplante; numa tal concretização, determinar a atribuição de HLA das células doentes no paciente pode ser realizado ao tipificar os alelos HLA no transplante dado ao paciente. Em outras concretizações, as células doentes no paciente não são derivadas do transplante dado ao paciente, e, portanto, têm a atribuição de HLA do paciente antes do transplante. Em concretizações específicas, o transplante é um HSCT ou transplante de órgãos sólidos.
[0079] Linhagens de células T para a geração de uma Representação de Atividade podem ser feitas como descrito na Seção 5.1.1.
[0080] A etapa de determinar a atribuição de HLA pode ser realizada como descrito na Seção 5.1.2. Em geral, a tipificação de mais loci HLA é preferível para a prática da invenção, uma vez que quanto mais loci de HLA que são tipificados, mais provável é de o doador de células T selecionado derivar uma linhagem de células T alogênicas possuindo a atividade mais elevada em relação a outras linhagens de células T alogênicas derivadas de outros doadores de células T que têm pelo menos um alelo HLA ou combinação de alelos HLA em comum com o paciente ou as células doentes no paciente.
5.3.1.1. Geração de Representação de Atividade para a Seleção de Doadores
[0081] A Representação de Atividade pode ser a mesma como discutida na Seção 5.1.3, e feita como aí descrito.
[0082] Em alguns aspectos, a Representação de Atividade é uma lista de uma pluralidade de alelos HLA e combinações de alelos HLA opcionalmente classificados pelas atividades relativas. Em algumas concretizações, a etapa de seleção de um doador de células T alogênicas é realizada ao descer a lista de uma pluralidade de alelos HLA e combinações de alelos HLA opcionalmente classificados pelas atividades relativas, com a classificação mais alta na lista sendo uma indicação da maior atividade relativa, e determinar o alelo HLA ou combinação de alelos HLA de melhor classificação que é conhecido por ser em comum com o paciente ou as células doentes no paciente, e escolher um doador de células T alogênicas que tem que alelo HLA ou combinação de alelos HLA. A título de exemplo, numa concretização específica, a Representação de Atividade é uma lista como mostrado na Tabela 6.
[0083] Em alguns aspectos, a Representação de Atividade é uma base de dados (por exemplo, tabela) listando a pluralidade de alelos HLA e combinações de alelos HLA, opcionalmente, cada um associado com uma pontuação indicativa de atividade relativa. Em algumas concretizações, a etapa de selecionar um doador de células T alogênicas é realizada ao passar pelo perfil do banco de dados da pluralidade de alelos HLA e combinações de alelos HLA, opcionalmente, cada um associado com uma pontuação indicativa de atividade relativa, com o maior número de pontos na base de dados sendo uma indicação da maior atividade relativa, e determinar o alelo HLA ou combinação de alelos HLA de maior pontuação que é conhecido por ser em comum com o paciente ou as células doentes no paciente, e a escolher um doador de células T alogênicas que tem esse alelo HLA ou combinação de alelos HLA. Numa concretização específica, a etapa de seleção de um doador de células T alogênicas usando uma Representação de Atividade, que é uma tal base de dados, pode ser efetuada ao primeiro filtrar para fora (excluindo) todos os alelos HLA e combinações de alelos HLA no banco de dados que não são em comum com o paciente ou as células doentes no paciente, e, em seguida, determinar entre os restantes, o alelo HLA ou combinação de alelos HLA associado com a indicação de atividade relativa mais elevada, e, em seguida, escolher um doador de células T alogênicas que tem aquele alelo HLA ou combinação de alelos HLA.
[0084] Em alguns aspectos, a Representação da Atividade é um gráfico de dispersão. Em certas concretizações, um primeiro eixo do gráfico de dispersão representa diferentes dos alelos HLA e opcionalmente combinações de alelos HLA na pluralidade de alelos HLA e opcionalmente combinações de alelos HLA. Em certas concretizações, um segundo eixo do gráfico de dispersão representa as atividades relativas. Numa concretização específica, o segundo eixo do gráfico de dispersão representa a percentagem de células CD3+secretoras de interferon-y derivadas a partir de cada linhagem de células T para as quais uma indicação de atividade relativa é revelada na Representação de Atividade, após estimulação com células apresentadoras de antígeno apresentando um ou mais peptídeos de um ou mais antígenos que apresentam a antigenicidade do agente patogênico ou câncer. Em uma concretização particular, a estimulação é células que apresentam antígenos são autólogas à respectiva linhagem de células T e são carregadas com um ou mais peptídeos que apresentam a antigenicidade do agente patogênico ou câncer, como a indicação da referida atividade relativa. A título de exemplo, em concretizações específicas, a representação de atividade é um gráfico de dispersão como mostrado na Figura 1.
[0085] Em algumas concretizações, a Representação de Atividade é armazenada numa base de dados.
[0086] Em várias concretizações, o método de seleção de um doador de células T alogênicas, tal como aqui descrito, é implementado por computador. Em algumas concretizações, o método de seleção de um doador de células T alogênicas, tal como aqui descrito, é implementado por computador utilizando um sistema de computador tal como descrito na Seção 5.6. Em algumas concretizações, os métodos de seleção de um doador de células T alogênicas como descrito na Seção 5.3.1 é implementado por computador utilizando um meio legível por computador, tal como descrito na Seção 5.6.
[0087] Os dados adicionais podem ser usados para gerar uma Representação de Atividade uma vez que os dados adicionais estão disponíveis.
5.3.2. Seleção de doador de células T baseado em Representação de Frequência
[0088] Em vários aspectos, os métodos de seleção de um doador de células T alogênicas do qual deriva uma linhagem de células T alogênicas para administração terapêutica a um paciente humano tendo ou suspeito de ter um agente patogênico ou câncer compreendem: seleção de um doador de célula T alogênica ao paciente que tem em comum um ou mais alelos HLA com o paciente ou as células doentes (por exemplo, do câncer ou associadas com a presença do agente patogênico) no paciente, usando uma representação (daqui em diante “Representação de Frequência”) que (i) identifica uma pluralidade de alelos HLA, e (ii) divulga indicações de frequências relativas de geração de linhagens de células T, cada uma reconhecendo, pelo menos, um epítopo de um antígeno do agente patogênico ou câncer, e restrita a diferentes dos referidos alelos HLA na pluralidade; em que na representação, cada alelo HLA identificado está associado com a respectiva indicação de frequência relativa de geração das referidas linhagens de células T restritas ao alelo HLA, em que: o doador de célula T selecionado tem pelo menos um alelo HLA em comum com o paciente ou as células doentes no paciente que está associado na representação com uma indicação de frequência mais elevada de geração do que alelos HLA do doador que não são em comum com o paciente ou as células doentes no paciente.
[0089] Em outra concretização, o método proporcionado pela invenção é um método de seleção de um doador candidato de células T alogênicas de quem deriva uma linhagem de células T alogênicas para administração terapêutica a um paciente humano tendo ou suspeito de ter um agente patogênico ou câncer que compreende: seleção de uma doador de células T alogênicas ao paciente que tem em comum um ou mais alelos HLA com o paciente ou as células doentes (por exemplo, do câncer ou relacionadas com a presença do agente patogênico) no paciente, usando uma Representação de Frequência que (i) identifica uma pluralidade de alelos HLA, e (ii) divulga indicações de frequências relativas de geração de linhagens de células T, cada uma reconhecendo, pelo menos, um epítopo de um antígeno do agente patogênico ou o câncer, e restrita a diferentes dos referidos alelos HLA na pluralidade; em que na representação cada alelo HLA identificado está associado com a respectiva indicação de frequência relativa de geração das referidas linhagens de células T restritas ao alelo HLA, em que: o doador de célula T selecionado tem pelo menos um alelo HLA em comum com o paciente ou células doentes no paciente que está associado na representação com uma indicação de frequência mais elevada de geração do que alelos HLA do doador que não são em comum com o paciente ou as células doentes no paciente.
[0090] Em certas concretizações, os métodos compreendem ainda, antes da etapa de seleção, uma etapa de gerar a Representação de Frequência. Métodos que podem ser usados para gerar a Representação de Frequência são descritos a seguir. Em certas concretizações, os métodos compreendem ainda, antes da etapa de geração, uma etapa de medir as frequências relativas. Em certas concretizações, os métodos compreendem ainda, antes da etapa de seleção, uma etapa de verificação da atribuição de HLA para o paciente ou as células doentes no paciente. Em certas concretizações, os métodos compreendem ainda, antes da etapa de seleção, uma etapa de verificação da atribuição de HLA para o doador de células T. Em certas concretizações, os métodos compreendem ainda, antes da etapa de seleção, uma etapa de determinar a atribuição de HLA para o paciente ou as células doentes no paciente e a atribuição de HLA para o doador de células T.
[0091] Em concretizações específicas dos métodos aqui descritos, o pelo menos um epítopo é pelo menos um epítopo imunodominante.
[0092] Em certas concretizações dos métodos da invenção, o doador de células T selecionado tem pelo menos um alelo HLA em comum com o paciente ou células doentes (por exemplo, do câncer ou associadas com a presença do agente patogênico) no paciente que está associado na Representação de Frequência com uma indicação de frequência mais elevada de geração do que alelos HLA do doador que não são em comum com o paciente ou as células doentes do paciente. Em algumas concretizações, o paciente é um receptor de transplante. Numa concretização específica em que o paciente é um receptor de transplante, o(s) alelo HLA(s) que são em comum com o paciente ou as células doentes (por exemplo, cancerosas ou infectadas com um agente patogênico) no paciente referem-se a alelos HLA (s) que são em comum com o paciente antes e/ou após o transplante. Em algumas concretizações, as células doentes no paciente são derivadas do transplante dado ao paciente e, assim, expressam os alelos HLA do transplante; numa tal concretização, determinar a atribuição de HLA das células doentes no paciente pode ser realizado ao tipificar os alelos HLA no transplante dado ao paciente. Em outras concretizações, as células doentes no paciente não são derivadas do transplante dado ao paciente, e, portanto, têm a atribuição de HLA do paciente antes do transplante. Em concretizações específicas, o transplante é um HSCT ou transplante de órgãos sólidos.
[0093] As linhagens de células T para a geração de uma Representação de Frequência podem ser produzidas tal como descrito na Seção 5.1.1.
[0094] A etapa de determinar a atribuição de HLA pode ser realizada como descrito na Seção 5.1.2. Em geral, a tipificação de mais loci de HLA é preferível para a prática da invenção.
[0095] A etapa de determinar a atribuição de HLA pode ser realizada como descrito na Seção 5.1.2. Geração de Representação de Frequência para selecionar doadores
[0096] A Representação de Frequência identifica uma pluralidade de alelos HLA, e divulga indicações de frequências relativas de geração de linhagens de células T (i) cada uma reconhecendo, pelo menos, um epítopo de um antígeno do agente patogênico ou câncer (do paciente), e (ii) restrita a diferentes dos alelos HLA. Na Representação de Frequência, cada alelo HLA identificado está associado com a respectiva indicação de frequência relativa de geração das linhagens de células T restritas aos alelos HLA.
[0097] Em alguns aspectos, a Representação de Frequência é uma lista de uma pluralidade de alelos HLA classificados pelas frequências relativas. Em algumas concretizações, a etapa de selecionar um doador de células T alogênicas é realizada ao descer a lista de uma pluralidade de alelos HLA classificados pelas frequências relativas, com a mais alta posição na lista sendo uma indicação da maior frequência relativa, e escolhendo um doador de células T alogênicas que tem pelo menos um alelo HLA em comum com o paciente ou as células doentes no paciente que está associado na lista com um grau mais elevado do que os alelos HLA do doador que não são em comum com o paciente ou células doentes no paciente.
[0098] Em alguns aspectos, a Representação de Frequência é um banco de dados (por exemplo, tabela) listando a pluralidade de alelos HLA, cada um associado com um resultado indicativo da frequência relativa. Em algumas concretizações, a etapa de selecionar um doador de células T alogênicas é realizada ao passar pela base de dados relacionando os alelos HLA, cada um associado com um resultado indicativo da frequência relativa, com o maior número de pontos na base de dados sendo uma indicação da maior frequência relativa, e escolher um doador de células T alogênicas que tem pelo menos um alelo HLA em comum com o paciente ou as células doentes no paciente que está associado no banco de dados com uma pontuação mais elevada do que os alelos HLA do doador que não são em comum com o paciente ou as células doentes do paciente.
[0099] Em algumas concretizações, a Representação de Frequência é armazenada numa base de dados.
[0100] Em várias concretizações, o método de seleção de um doador de células T alogênicas como descrito nesta divulgação é implementado por computador. Em algumas concretizações, o método de seleção de um doador de células T alogênicas como descrito nesta divulgação é implementado por computador utilizando um sistema de computador, tal como descrito na Seção 5.6. Em algumas concretizações, os métodos de seleção de um doador de células T alogênicas como descrito nesta divulgação são implementado por computador utilizando um meio legível por computador, tal como descrito na Seção 5.6.
[0101] Dados adicionais podem ser usados para atualizar uma Representação de Frequência assim que os dados adicionais estão disponíveis.
5.4. Obtenção de linhagens de células T
[0102] Também são aqui descritos métodos de obtenção de uma linhagem de células T alogênicas para administração terapêutica a um paciente humano tendo ou suspeito de ter um agente patogênico ou câncer, que compreende: (a) selecionar um doador de células T alogênicas de acordo com um método tal como descrito na Seção 5.3; e (b) determinar uma linhagem de células T alogênicas do doador de células T alogênicas selecionado, cuja linhagem de célula T alogênica reconhece pelo menos um epítopo de um antígeno ou o patógeno ou câncer.
5.5. Pacientes
[0103] O paciente referido no presente relatório descritivo é um paciente humano.
[0104] Em várias concretizações, o paciente tem sido o receptor de um transplante. Numa concretização específica, o transplante é um HSCT. Em certas concretizações, o HSCT é um transplante de medula óssea (BMT). Em certas concretizações, o HSCT é um transplante de células estaminais do sangue periférico (PBSCT). Em certas concretizações, o HSCT é um transplante de sangue do cordão umbilical (CBT). Numa concretização específica, o transplante é um transplante de órgão sólido.
[0105] Em várias concretizações, o paciente não tem sido o receptor de um transplante. Numa concretização específica, o paciente não tem sido um receptor de HSCT. Numa concretização específica, o paciente não tem sido um receptor de transplante de órgão sólido.
[0106] Em diversos aspectos, o paciente tem ou é suspeito de ter um agente patogênico. Numa concretização específica, o paciente tem o patógeno. Numa concretização específica, o paciente é seropositivo para o patógeno, e tem sintomas de uma infecção pelo agente patogênico. O agente patogênico pode ser um vírus, bactéria, fungo, helmintos ou protista. Em certas concretizações, o agente patogênico é um vírus.
[0107] Em algumas concretizações, o vírus é o citomegalovírus (CMV). Em concretizações específicas, o paciente tem ou é suspeito de ter uma infecção por CMV subsequente ao paciente ter sido submetido a um transplante. Em concretizações particulares, o antígeno de CMV é CMV pp65. Em concretizações particulares, o antígeno de CMV é CMV IE1.
[0108] Em algumas concretizações, o vírus é o vírus de Epstein-Barr (EBV). Em concretizações particulares, o antígeno de EBV é EBNA1, EBNA2, EBNA3A, EBNA3B, EBNA3C, LMP1 ou LMP2.
[0109] Em algumas concretizações, o vírus é polioma vírus BK (BKV), vírus John Cunningham (JCV), vírus do herpes, adenovírus (ADV), o vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus influenza, vírus Ebola, poxvírus, rabdovírus ou paramixovírus. Em concretizações particulares, o vírus é BKV. Em concretizações particulares, o vírus é JCV. Em concretizações particulares, o vírus é ADV. Em concretizações particulares, o vírus é herpesvírus humano-6 (HHV-6) ou herpesvírus humano-8 (HHV-8).
[0110] Numa concretização, o paciente tem uma infecção viral que não é sensível à terapia medicamentosa antiviral (de molécula pequena).
[0111] Em diversos aspectos, o paciente tem ou suspeita possuir um câncer. Numa concretização específica, o paciente tem um câncer. O câncer pode incluir um câncer do sangue, mama, pulmão, ovário, estômago, pâncreas, laringe, esôfago, testículos, fígado, parótidas, trato biliar, cólon, reto, colo do útero, útero, endométrio, rim, bexiga, próstata, tireoide, cérebro ou pele. Em algumas concretizações, o câncer é um câncer do sangue. Em concretizações específicas, o câncer é uma doença linfoproliferativa. Em outras concretizações, o câncer é um câncer do cérebro.
[0112] Em algumas concretizações, o câncer é câncer WT1- positivo. Em concretizações específicas, o antígeno do câncer é WT1.
[0113] Em algumas concretizações, o câncer é o distúrbio linfoproliferativo de pós-transplante EBV-positivo (EBV-PTLD). Em concretizações específicas, o antígeno de um EBV-PTLD é EBNA1, EBNA2, EBNA3A, EBNA3B ou EBNA3C. De acordo com outras concretizações específicas, o antígeno é LMP1 ou LMP2.
[0114] Em algumas concretizações, o câncer é o carcinoma nasofaríngeo EBV-positivo. Em concretizações específicas, o antígeno do carcinoma nasofaríngeo EBV-positivo é EBNA1, LMP1 ou LMP2.
[0115] Um antígeno de um câncer, como aqui descrito, pode ser um antígeno específico do câncer ou associado a um câncer, e, portanto, pode ser um peptídeo ou uma proteína cuja expressão é maior no tecido de câncer ou células de câncer do que em tecidos não-cancerosos ou células não-cancerosas ou um peptídeo ou uma proteína que é expressa exclusivamente em tecido de câncer ou células de câncer em relação a tecidos não-cancerosos ou células não-cancerosas.
5.6. Sistemas de Computador e Meio legível por Computador
[0116] Em várias concretizações, um sistema de computador ou meio legível por computador é configurado para realizar qualquer um dos métodos de seleção de uma linhagem de células T alogênicas, e qualquer um dos métodos de seleção de um doador de células T alogênicas como descrito nesta divulgação.
[0117] Também são aqui fornecido sistemas de computador para selecionar uma linhagem de células T alogênicas para administração terapêutica a um paciente humano tendo ou suspeito de ter um agente patogênico ou câncer. Numa concretização específica, um tal sistema de computador compreende: uma unidade de processamento central; uma memória, acoplada à unidade de processamento central, a memória armazenando instruções para realizar a(s) etapa(s) de qualquer um dos métodos de seleção de uma linhagem de células T alogênicas ou qualquer um dos métodos de seleção de um doador de células T alogênicas como descrito nesta divulgação. Em algumas concretizações, o sistema de computador compreende, ainda, um dispositivo de exibição em comunicação operativa com a unidade de processamento central.
[0118] Também são aqui proporcionados meios legíveis por computador tendo instruções executáveis por computador para executar a(s) etapa(s) de qualquer um dos métodos de seleção de uma linhagem de células T alogênicas ou qualquer um dos métodos de seleção de um doador de células T alogênicas como descrito nesta divulgação.
[0119] Em algumas concretizações, carregados em um sistema de computador ou meio legível por computador estão componentes de software que são padrão no estado da técnica. Os componentes de software em conjunto fazem com que o sistema computador funcione de acordo com um método de seleção de uma linhagem de células T alogênicas ou os métodos de seleção de um doador de células T alogênicas como descrito nesta divulgação. Em algumas concretizações, carregados no sistema de computador ou meio legível por computador estão componentes de software que são padrão no estado da técnica, e um ou mais produtos de programas de computador que são especiais para a presente invenção. Em concretizações específicas, os um ou mais produtos de programas de computador fazem com que um sistema de computador funcione de acordo com um método de seleção de uma linhagem de células T alogênicas ou os métodos de seleção de um doador de células T alogênicas como descrito nesta divulgação. Em concretizações específicas, os um ou mais produtos de programas de computador que são especiais para a presente invenção e os componentes de software que são padrão no estado da técnica em conjunto fazem com que o sistema de computador funcione de acordo com um método de seleção de uma linhagem de células T alogênicas ou os métodos de seleção de uma doador de células T alogênicas tal como aqui descrito.
[0120] Em certas concretizações, o sistema de computador ou meio legível por computador é configurado para selecionar uma linhagem de células T alogênicas para administração terapêutica para o paciente para eficácia alta e consistente. Em certas concretizações, o sistema de computador ou meio legível por computador é configurado para selecionar um doador de células T alogênicas do qual deriva uma linhagem de células T alogênicas para administração terapêutica ao paciente para eficácia alta e consistente.
6. EXEMPLO
[0121] Determinadas concretizações aqui proporcionadas são ilustradas pelo exemplo não limitativo seguinte, que demonstra uma tecnologia que permite a seleção otimizada de células T específicas do CMVpp65 terapeuticamente ativas a partir de linhagens de células T derivadas de doador terceiro parcialmente correspondido de HLA de banco para o tratamento de infecções por CMV baseado na hierarquia de alelos HLA partilhados por doador e o receptor que apresenta os peptídeos virais imunodominantes.
6.1. Métodos: 6.1.1. Estabelecimento de Banco de CTL de CMV:
[0122] Todos os produtos celulares foram processados na unidade GMP do Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) sob procedimentos padrão de operação (SOPs) e protocolos em conformidade com a FDA.
6.1.1.1. Geração de monócitos ativados por citocinas autólogos (CAMS):
[0123] Células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram isoladas a partir do sangue de doadores seropositivos por centrifugação em gradiente de densidade usando Ficoll Hypaque.
[0124] PBMC a uma concentração de 107/ml em suspensão em RPM-1640 com 1% de soro autólogo foram deixadas aderir em placas de 6 cavidades de cultura de tecidos a 37° C durante 2 horas após o que as células mononucleares não aderentes foram suavemente removidas. Os monócitos aderentes cultivados com 2 mL de IMDM isento de soro por poço e suplementados com GM- CSF 2000 UI (50μl) e IL-4 1000 U (25 μl) de IL-4 em dias alternados até ao dia 5. No dia 5, o fator de necrose tumoral α (SIGMA, St. Louis) foi adicionado para atingir uma concentração final de 10 ng/mL, interleucina-1β a 400 IU/mL, (R&D Systems, Inc, Minneapolis, MN EUA) a 1000 UI/mL e prostaglandina-E2 (Calbiochem, La Jolla, CA EUA) a 25 mm/ml para induzir a maturação final do CAMS. No dia 7 os CAMS maduros foram coletados, caracterizados quanto à sua expressão de HLA de classe II, CD14 e moléculas co-estimuladoras por FACS contadas, aliquotadas e usadas para sensibilização de linhagens de células T tal como detalhado abaixo.
6.1.2. Geração de linhagens celulares de linfócitos B transformados autólogos (BLCL):
[0125] EBV-BLCLs a partir de cada doador foram gerados por infecções de PBMC com EBV estirpe B95.8 como anteriormente descrito (Koehne, G., et al, Blood, 2000. 96:109-117; Koehne, G., et al, Blood, 2002. 99:1730-1740). As células foram mantidas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA EUA) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS), e aciclovir.
1.1.1.3. Geração de células T específicas de CMVpp65:
[0126] As células T foram enriquecidas a partir de linfócitos do sangue periférico separadas a partir de PBMCs por depleção de monócitos aderentes seguido pela depleção de células assassinas naturais, utilizando separação imunomagnética das células CD56+ com microesferas pré- revestidas de CD56 imunomagnéticas (Miltenyi Biotech Inc.). As células T purificadas foram depois co-cultivadas com CAMS autólogos irradiados carregados com um conjunto de grau GMP de pentadecapeptídeos sobrepostos (PL CAMs) como anteriormente descrito (Trivedi, D., et al, Blood, 2005, 105:2793-2801). As células T foram cultivadas durante um período de 28-40 dias na presença de IL-2 (5-40U/ml), e re-estimuladas semanalmente com CAMS carregados com peptídeo autólogo irradiado, a uma razão efetor para estimulador de 20:1 tal como anteriormente descrito (Trivedi, D., et al, Blood, 2005, 105:2793-2801).
6.1.2. Caracterização de células T específicas de CMVpp65: 6.1.2.1. Análise tetrâmero:
[0127] A proporção de células T específicas de epítopo de CMVpp65 foi quantificada utilizando tetrâmeros HLA-peptídeo utilizando tetrâmeros MHC-peptídeo de CMVpp65 comercialmente disponíveis para HLA A0201, A2402 e B0702 carregando sequências peptídicas NLVPMVATV, QYDPVAALF e TPRVTGGGAM respectivamente (Beckman Coulter, Inc. Fullerton, CA). As células T foram incubadas com FITC CD3, CD8 PE, CD4 PerCP (BD Bioscience, San Jose, CA) e complexo tetramérico conjugado APC durante 20 minutos em gelo, lavadas e depois analisadas por FACS (BD LSR II). Os dados foram analisados usando software FlowJo (Tree Star Inc, Ashland, OR). Determinou-se a proporção de células T CD4 e CD8+ nas culturas, assim como a percentagem de células CD3+, e células-T CD8+ que se ligam aos tetrâmeros HLA-peptídeo.
6.1.2.2. Repertório TCR Vβ
[0128] Células-T tetrâmero+ de pepetídeo-HLA de CMV foram analisadas para repertório de TCRVβ através de citometria de fluxo utilizando o kit comercialmente disponível contendo anticorpos para 24 subfamílias da região Vβ do TCR humano (IO Test® Beta Mark, Beckman Coulter, Inc., França) de acordo com procedimentos fornecidos pelo fabricante (Wei, S., et al, Immunogenetics, 1994, 40:27-36).
6.1.2.3. Quantificação de células T CMV-específicas e produtoras de IFN-Y alorreativa
[0129] No início e em vários pontos no desenvolvimento de cada linhagem de células T específica de CMV, os linfócitos T do doador a uma concentração de 1 x 106/ml foram misturados com CAMS autólogos que foram carregadas com o conjunto de peptídeos CMVpp65 (20 μg/ml) a uma razão de célula efetora- estimuladora de 5:1. Tubos de controle contendo células efetoras PBMCs e não carregados com qualquer peptídeo foram criados em paralelo. Brefeldina A foi adicionada a amostras de estimuladas de peptídeos e não estimuladas a uma concentração de células de 10 μg/ml. Os tubos foram incubados durante a noite durante 16 horas numa incubadora a 5% de CO2 umidificada a 37° C.
[0130] Alíquotas da massa não estimulada e das culturas estimuladas foram transferidas para tubos para a coloração com anticorpos monoclonais. As células foram coradas com 5 μL de anti-CD3 monoclonal marcado com aloficocianina (APC) e 10 μl de proteína clorofila peridin anti-CD8 (PerCP) ou PerCP anti- CD4 (BD Biosciences, San Jose, CA) e foram incubadas durante 20 minutos à temperatura ambiente no escuro. As células foram lavadas com 2 mL de solução salina de fosfato tamponada (PBS)- albumina de soro bovina (BSA)-azida (AZ) (PBS + BSA a 0,5% + AZ a 0,1%). As células foram centrifugadas, o sobrenadante descartado e 100 μL de reagente A (Reagentes A & B de Permeabilização Celular Fix & Perm; Caltag Laboratories, Burlingame, CA) foram adicionados a cada tubo para fixar as células. Estas células foram então incubadas durante 15 minutos. As células foram lavadas com PBS + BSA + AZ, e 100 μl de reagente B (Caltag Laboratories) foram adicionados para a permeabilização. A coloração intracelular foi realizada por adição de 10 μl de anticorpo monoclonal de isotiocianato de fluoresceína de controle de isótopo de IgG1 de camundongo (FITC) ou FITC IFN-Y (BD PharMingen, San Diego, CA). As células foram incubadas durante 20 minutos à temperatura ambiente, no escuro, lavadas duas vezes, e adicionalmente fixadas em formalina a 1%.
[0131] As células coloridas e fixadas foram subsequentemente adquiridas utilizando um citômetro de fluxo LSR II com três lasers para capacidade de 10 cores (BD Biosciences), e analisadas utilizando o software FlowJo. As células foram primeiro identificadas por dispersão de luz para a frente e lateral e, em seguida, selecionando a população das células CD3+ em um APC de CD3 contra um gráfico de pontos de dispersão lateral. Vinte a Cinquenta mil eventos foram adquiridos na população selecionada combinada. Para a identificação adicional das células, a seleção de população nas células CD3+CD8+ ou CD3+CD4+ foi realizada. Marcadores de quadrante foram estabelecidos com base na análise dos tubos de controle e de isotipo e de controle não estimulados.
6.1.3. Estabelecendo a hierarquia: quantificar respostas de célula T CD8+ antivirais a diferentes epítopos de CMVpp65 6.1.3.1. Mapeamento de Epítopos Utilizando uma Biblioteca de Peptídeos de 15 aa de Sobreposição
[0132] Respostas de células T a peptídeos específicos dentro de CMV pp65 foram identificadas e quantificadas através da medição do número de células T positivas para IFNY geradas por estimulação secundária com APCs autólogas carregadas com os peptídeos ou conjunto de peptídeos (PL) de interesse, de acordo com a técnica de Waldrop (Waldrop, S.L., et al., J Clin Invest, 1997. 99: 1739-1750) como mofidicado por Koehne et al (Koehne, G., et al., Blood, 2002. 99: 1730-1740). Uma rede de conjuntos de peptídeos de sobreposição permitiu a identificação de epítopos específicos que induzem respostas de células-T. PBMCs carregadas com peptídeo que eram autólogas ao doador das células T, CAMS que eram autólogos ao doador das células T ou BLCL que era autólogo ao doador das células T foi mapeamento de epítopos.
6.1.3.2. Atividade Citotóxica In vitro
[0133] Todas as linhagens de células T foram avaliadas quanto à sua capacidade para lisar alvos carregados com CMVpp65 usando um ensaio de liberação de 51Cromo padrão, como descrito anteriormente (Koehne, G., et al, Blood, 2002. 99:1730-1740; Trivedi, D., et al., Blood, 2005. 105:2793 2801). Os alvos utilizados em todas as experiências consistiram em um painel de EBV-BLCL, cada um compartilhando com as células T de um determinado doador um único alelo HLA. Estas células foram carregadas, como especificado para um dado experimento, com o conjunto completo de peptídeos CMVpp65 ou sub-conjuntos específicos seus, pentadecapeptídeos individuais ou um nonâmero de CMV pp65 conhecido por ser apresentado por esse alelo (por exemplo NLVPMVATV para HLA A0201, QYDPVAALF para HLA A2402 e TPRVTGGGAM e RPHERNGFTV para HLA B0702) (Trivedi, D., et al, Blood, 2005, 105:2793-2801; Hasan, AN, et al, J Immunol, 2009. 183:2837-2850). Os alvos carregados com peptídeos não apresentados pelo alelo HLA compartilhado foram usados como controles. A restrição de HLA foi identificada pela reatividade contra alvos pulsados com um epítopo de peptídeo identificado apresentado em um alelo HLA compartilhado específico, e ausência de reatividade contra o peptídeo carregado em ou EBV BLCL carregando outros alelos compartilhados ou EBV BLCL totalmente incompatíveis.
6.2. Dados: 6.2.2. Grau GMP de Banco de CTL de CMV gerado a partir de uma população de doadores genotipicamente heterogênea herdando uma matriz diversificada de alelos HLA
[0134] Um total de 119 linhagens CTL específicas de CMVpp65 foram geradas ao longo de um período de 7 anos desde o início do ensaio clínico usando células T específicas de CMVpp65 derivadas de doador para o tratamento de viremia por CMV em receptores de HSCT alogênico.
[0135] O conjunto de doadores usados para a geração de linhagens de CTL herdou 180 diferentes alelos HLA que eram representativos dos alelos HLA comuns prevalentes na população multiétnica de Nova Iorque. A distribuição dos alelos HLA no conjunto de CTL de doador também estreitamente se correlacionou com as frequências de alelos HLA representadas em cada uma das populações étnicas incluindo Caucasianos, Asiáticos e Negros, exceto para HLA A0201 e B0702, que foram super-representadas; 33% vs 25% e 21% vs. 8,7%, respectivamente (Tabela 1). A ordem da frequência de alelos HLA herdados de classe I dentre os 119 doadores foi como se segue: A0201 (n=39), A0301 (n= 28), B0702 (n=25), B 44 (n=24), HLA B 0801 (n=22), B 3501-11 (n=19), A1101 (n=16), A2402 (n=14), B 1501-17 (n=14), B 1801-07 (n=12), A 3201-03 (n =11), A3301-04 (n=10), B 4001-06 (n=9), e A2601 (n=9), B 5701 (n=9). Outros alelos HLA de classe I foram representados em frequências mais baixas, tais como HLA B 5201 (n = 8), B 3801 (n = 6), A6801-09 (n = 5), B 5801 (n = 5). Para os alelos HLA de classe II, houve 6 alelos HLA DRB1 que foram altamente representados, como esperado a partir de suas frequências mais altas na população em geral (Tabela 1). Em ordem de frequência, estes incluíram DRB1 1501-08, 0401-32, 0301-13, 0701-04, 1101-20, 1301-34.
[0136] Tabela 1. Frequências de alelos HLA na população em geral e caracterização das 119 linhagens de CTL específicas de CMVpp65.
Figure img0001
Figure img0002
6.2.3. Respostas de Células T específicas de CMVpp65 são Dominadas por epítopos apresentados por um número limitado de alelos HLA Classe I e Classe II
[0137] Em 103 das 119 linhagens de CTL (87%), as respostas de células T imunodominantes foram restritas por alelos HLA de classe I, e em 16 linhagens de CTL, por alelos HLA de classe II. Em 54% das linhagens de CTL, as respostas de células T imunodominantes foram restringidas por 3 alelos HLA de classe I; A0201 (25%), B 0702 (21%) e B3501-11 (8%). Outros alelos que apresentam epítopos imunodominantes incluíram HLA A 2402, B 4001, B 4006, B 4202, B 4204, B 4402, B 4403, DRB1 0401 e 0404, DRB1 1101, DRB1 1202. Assim, apesar da ampla matriz de alelos HLA de classe I e classe II representados neste banco, apenas 19 destes alelos apresentaram epítopos que desencadeiam respostas de células T imunodominantes. Além disso, as respostas de células T de qualquer nível detectável eram específicas para epítopos apresentados por apenas 49 dos 180 alelos HLA herdados por doadores no banco.
6.2.4. Os alelos HLA apresentando Epítopos imunodominantes existem em uma ordem hierárquica dentro de Indivíduos Co-herdando haplótipos específicos
[0138] A avaliação de linhagens de células T no banco também demonstrou que epítopos apresentados por alelos HLA específicos foram consistentemente dominante, tal como medido por quantificações de células T IFNY+ específicas de epítopo e determinação da sua restrição de HLA. Estudos anteriores mostraram evidência de que epítopos de CMVpp65 apresentados por HLA B0702 são dominantes em pacientes co-herdando HLA A0201 e B0702 (Lacey, SF, et al, Hum Immunol, 2003. 64:440 452). Na série deste exemplo, HLA B0702 foi consistentemente o alelo restringindo as respostas de células T imunodominantes em todos os 25 doadores no banco que herdam este alelo (100%), incluindo 9 que co-herdaram HLA A0201. Assim, as respostas restritas por HLA B0702 foram dominantes independentemente dos outros alelos HLA de classe I e de classe II herdados.
[0139] Por outro lado, em 30 dos 39 doadores (77%) herdando HLA A0201, a resposta de células T imunodominante foi restrita por HLA A0201. Os 9 doadores restantes eram aqueles que co- herdaram HLA A0201 e B0702, e em cada um desses 9 doadores, a resposta de células T imunodominante foi restrita por HLA B 0702. Assim, HLA A0201 foi o alelo restringindo a resposta de células T imunodominante quando co-herdado com qualquer outro alelo HLA de classe I ou de classe II, exceto quando co- herdado com HLA B0702. Por exemplo, dentre 22 doadores que herdam alelos HLA B44, apenas 4 induziram respostas dominantes restritas por este alelo. Quando estes alelos (B4401, B4402, B4403) foram co-herdados com HLA A0201, em 11 de 12 tais doadores (91,6%), as respostas de CTL imunodominantes foram restritas por HLA A0201; o outro doador também co-herdou HLA B0702 e induziu uma resposta restrita de HLA B0702.
[0140] Uma outra característica marcante das respostas de células T em doadores que herdam HLA B 0702 ou A0201 foi o fato de que as respostas observadas foram exclusivamente dirigidas contra epítopos apresentados por estes alelos. Em contraste, nas linhagens de células T em que as respostas aos epítopos imunodominantes foram restringidas por outros alelos HLA, populações subdominantes de células T específicas para outros epítopos e restritas por outros alelos HLA foram frequentemente observadas. Esta análise permitiu o reconhecimento de um agrupamento hierárquico de alelos HLA que apresentam os epítopos imunodominantes, como mostrado na Figura 1.
[0141] A hierarquia de alelos HLA que apresentam epítopos imunodominantes foi exclusivamente baseada no seu nível de atividade funcional em resposta à estimulação com peptídeo. Não houve correlação entre a afinidade do peptídeo para a ligação de HLA e a sua capacidade para desencadear respostas de células T imunodominantes (Tabela 2).
[0142] Tabela 2. Caracterização de alelos HLA que apresentam epítopos imunodominantes.
Figure img0003
Figure img0004
6.2.5. O Repertório de Epítopo e alelos HLA Constituindo o Banco de CTL de CMV podem ser utilizados para o tratamento de uma população de pacientes diversa
[0143] Um repertório muito limitado de epítopos CMVpp65 imunodominantes que desencadeiam respostas de células T foi descoberto dentro das 119 linhagens de CTL que constituem o banco GMP, que foram apresentados por um número limitado de alelos HLA. Dado que as respostas de células T são definidas por tal especificidade fina; para as células T específicas de antígeno serem clinicamente eficazes na configuração de terceiros, as células T selecionadas teriam de ser responsivas a epítopos apresentados por um alelo HLA partilhado pelo paciente. Dentro destes parâmetros, analisou-se a proporção de pacientes etnicamente diversos que poderiam ser potencialmente tratados usando CTLs a partir deste banco.
[0144] Uma série de transplantes esgotados de células T consecutivos executados no centro do câncer do Memorial Sloan- Kattering ao longo dos últimos 3-5 anos a partir de doadores que ou foram correspondidos em HLA ou HLA não coincidentes relacionados ou não relacionados, bem como doadores de sangue do cordão, foi avaliada. Numa série de 239 transplantes relacionados ou não relacionados de HLA idêntico no centro, em 86% dos casos uma linhagem de CTL com uma resposta de células T de CMV restrita por um alelo HLA partilhado com o paciente e correspondente a 1-2 alelos HLA adicionais foram capazes de ser identificados. Da mesma forma, em uma série de 137 transplantes incompatíveis de HLA, e 70 transplantes de sangue do cordão, uma linhagem de CTL restringida de forma adequada em 93% e 81% dos casos, respectivamente, foi capaz de ser identificada. Assim, apesar da ampla representação de alelos HLA neste banco de CTL, as células T restringidas por um repertório limitado de alelos HLA puderam ser identificadas e utilizadas para o tratamento da maioria dos pacientes deste grupo diverso etnicamente.
6.2.6. Atividade clínica dos CTLs de CMV selecionados para o tratamento do Doador de Transplante ou um doador Terceiros usando o critério de restrição de HLA e epítopo recém-definido
[0145] Um total de 54 pacientes avaliáveis receberam CTLs de CMV como tratamento de infecção clínica ou viremia persistente que não responderam a drogas antivirais. Destes, 19 receberam células T específicas de CMVpp65 do seu doador HCT (NCTO1646645) e 35 a partir de células T a partir de um doador terceiro de alelo HLA combinado >2. Os resultados estão resumidos na Tabela 3 e Tabela 4. Nesta análise, CR é definida como a eliminação da infecção clínica e/ou alívio de CMV detectável a partir do sangue. PR é definida como uma redução de CMV no sangue> 2log10. SD é definido como pacientes com um estado clínico estável e uma redução de CMV de <2log10. POD é definida como uma progressão contínua de viremia e doença clínica.
[0146] Tabela 3. Respostas por restrição de HLA de células T específicas de CMVpp65 administradas.
Figure img0005
[0147] Tabela 4. Alelos HLA imunodominantes detectados em outras células T específicas de CMVpp65 administradas
Figure img0006
[0148] Como pode ser visto, de 19 pacientes que receberam as células T específicas para um epítopo de CMVpp65 apresentado por HLA A201, 14 alcançaram CR ou PR. De 9 tratados com células T específicas para um epítopo imunodominante apresentado por HLA B0702, 8 alcançaram um CR. Da mesma forma, as células T imunodominantes restritas por HLA A2402 (N = 2) e B0801 (N = 3) induziram RCs em cada um dos 5 casos tratados.
[0149] Em contraste, 7/7 receptores de células T específicas de CMVpp65 para um epítopo imunodominante apresentado por uma variante alélica de HLA B35 falharam a responder. Da mesma forma, as células T imunodominantes específicas para epítopos de A2601 (N = 3), A2407 (N = 1) e B5001 (N = 1) não conseguiram eliminar a infecção ou reduzir a viremia.
[0150] Estes resultados potenciais fornecem evidência de que epítopos imunodominantes apresentados por alelos HLA específicos induzem as células T que tinham melhor atividade terapêutica in vivo.
[0151] Os pacientes que receberam transplantes de doadores que também concordaram em ter suas células T específicas de CMVpp65 incluídas no banco para uso em outros indivíduos do que para quem eles também doaram um HCT de HLA compatível também foram examinados retrospectivamente. A razão foi a de que os transplantes esgotados de célula T de tais doadores, que contêm geralmente 2-8 x 103células T/kg de peso do receptor, proporcionaria também um pequeno número de células T específicas de CMV imunodominantes, uma vez que a frequência de células T específicas de IFNY+ CMV no sangue em doadores seropositivos estava na gama de 0,1-1% de células T circulantes. Os resultados desta primeira análise são apresentados na Tabela 5.
[0152] Tabela 5. Análise da reativação de CMV, doença e resposta final para terapia dirigida por CMV em pacientes que receberam transplantes de doadores de HLA compatível que também contribuíram com as células para o banco como doadores terceiros.
Figure img0007
[0153] Mais uma vez, como pode ser visto nos pacientes tratados com células T específicas de CMVpp65, receptores de transplantes de doadores que partilham os alelos HLA B0702 e A0201 tiveram um baixo risco de desenvolvimento de doença de CMV, e virema consistentemente responderam ao tratamento, enquanto que aqueles que receberam enxertos de doadores que não possuem estes alelos, tiveram uma incidência significativa de infecção evidente. Isto foi de novo particularmente observado em pacientes portadores de variantes de HLA B35 que não tinham tanto HLA B0702 ou A0201.
[0154] Os dados clínicos nos permitiu determinar uma hierarquia de certos alelos HLA que apresentam epítopos imunodominantes de CMVpp65 que desencadeiam respostas de células T específicas de peptídeo (ver Tabela 6), um exemplo de uma Representação de Atividade.
[0155] Tabela 6. Hierarquia de alelos HLA que apresentam epítopos imunodominantes de CMVpp65 desencadeando respostas de células T específicas do peptídeo.
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aclassificação mais alta corresponde a uma maior eficácia clínica da linhagem de células T restringidas pelo alelo HLA no tratamento de pacientes com infecção por CMV ou de viremia persistente que não conseguiram responder a drogas antivirais
[0156] Os nossos dados indicaram que as variantes de HLA-B35 não devem ser utilizadas (e, portanto, seriam consideradas “desqualificadas” dentre os alelos HLA na representação).
6.3. Os dados sugerem que:
[0157] 1. Um repertório limitado de epítopos de CMVpp65 desencadeia respostas de células T citotóxicas específica de CMV funcionais e um total de 49 alelos HLA dentre 181 alelos representados dentro deste banco de CTL apresenta estes epítopos de CMVpp65imunodominantes.
[0158] 2. Os epítopos peptídicos identificados puderam ser utilizados para o desenvolvimento de uma vacina de polipeptídeo eficaz ou usados como um conjunto de peptídeos limitado para a geração de CTLs de CMV altamente funcionais no futuro para a imunoterapia adotiva.
[0159] 3. A incorporação da análise de hierarquia de HLA na seleção de linhagens de CTL para o tratamento deve promover uma eficácia maior e mais consistente de tratamento de CTL de terceiros.
6.4. Resumo dos resultados clínicos e experimentais
[0160] As células T específicas de vírus adotivamente transferidas, para serem eficazes, devem ser específicas para um epítopo peptídico viral que é expresso ambos por células hospedeiras infectadas pelo vírus e apresentadas por um alelo HLA expresso pelas células hospedeiras infectadas e as células T do doador através das quais as células T do doador de HLA restrito reconhecem o epítopo viral.
[0161] Após a resolução da infecção primária com CMV, o repertório inicialmente amplo de células T responsivas se contrai, tal que as células T específicas para apenas um número limitado de epítopos imunodominantes são sustentadas. Como resultado, as linhagens de células T específicas de CMVpp65 se expandiram a partir de latentemente infectadas, doadores normais seropositivos de CMV são geralmente específicos para apenas 1-2 peptídeos de CMVpp65 imunodominantes apresentados por apenas 1-2 alelos HLA expressos pelo doador.
[0162] Verificou-se que há uma hierarquia de alelos HLA que apresentam epítopos imunodominantes de CMVpp65 que desencadeiam respostas de células T específicas do peptídeo, que leva à expansão preferencial de células T específicas de CMVpp65 apresentadas pelos alelos HLA específicos sobre todos os outros herdados e expressos. Esta hierarquia não é baseada na afinidade de ligação do peptídeo ao alelo que se apresenta. Como um resultado desta hierarquia de restrição HLA:
[0163] 1. Os epítopos imunodominantes indutores de células T específicas de CMVpp65 detectados em linhagens de células T expandidas in vitrosão apresentados apenas por um número limitado de alelos HLA.
[0164] 2. Além disso, entre os indivíduos que herdam dois ou mais alelos HLA deste repertório limitado de alelos HLA que apresentam epítopos de peptídeos imunodominantes, determinados alelos HLA (por exemplo, HLA B0702 ou HLA A0201) apresentam de forma consistente os epítopos que provocam respostas para a exclusão dos outros.
[0165] Os primeiros resultados de ensaios de fase II indicam ainda que, para pacientes com infecção por CMV ou de viremia persistente que tenham falhado a terapia antiviral, que são depois tratados com células T específicas de CMVpp65 derivadas do doador terceiros que são restritas por um alelo HLA expresso por células infectada no hospedeiro, estes pacientes que recebem as células T específicas de CMVpp65 que são restritas pelos mesmos alelos HLA de topo na hierarquia (por exemplo, HLA B0702 ou HLA A0201) respondem de forma consistente, enquanto que o tratamento com células T específicas de CMVpp65 restritas por alelos HLA inferiores na hierarquia pode limpar a infecção, as respostas são menos consistentes.
7. Incorporação por referência
[0166] Várias publicações são aqui citadas, a divulgação das quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

Claims (20)

1. Método de seleção de uma linhagem de células T alogênicas para administração terapêutica a um paciente humano possuindo ou suspeito de possuir um patógeno ou câncer, caracterizado pelo fato de que compreende: selecionar uma linhagem de células T alogênicas para o paciente que reconhece pelo menos um epítopo de um antígeno do patógeno ou do câncer, utilizando uma representação que (i) identifica uma pluralidade de alelos HLA e opcionalmente combinações de alelos HLA e (ii) revela indicações de atividades relativas de linhagens de células T, cada uma reconhecendo pelo menos um epítopo de um antígeno do patógeno ou câncer e restrita a diferentes dos alelos HLA ou combinações de alelos HLA na pluralidade; em que na representação cada alelo HLA identificado ou combinação de alelos HLA está associado com a respectiva indicação de atividade relativa da linhagem de células T restrita ao alelo HLA ou combinação de alelos HLA, as atividades relativas sendo medidas relativas de atividade conhecida contra o patógeno ou contra o câncer exibido pelas linhagens de células T; em que (A) a linhagem de células T selecionada tem em comum com o paciente ou células doentes no paciente o alelo HLA ou a combinação do alelo HLA identificada pela representação para a qual o reconhecimento da linhagem de células T é restrito; e (B) o alelo HLA ou combinação de alelos HLA, ao qual a linhagem de células T selecionada é restrita, está associado na representação com uma indicação da atividade relativa mais elevada entre os alelos HLA e as combinações de alelos HLA na representação que são conhecidas por serem em comum com o paciente ou com as células doentes no paciente e não são de outra forma desqualificadas.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende, antes da etapa de seleção, uma etapa de verificação da atribuição de HLA do paciente ou das células doentes no paciente.
3. Método de seleção de um doador de células T alogênicas de quem deriva uma linhagem de células T alogênicas para administração terapêutica a um paciente humano possuindo ou suspeito de possuir um patógeno ou câncer, caracterizado pelo fato de que compreende: selecionar um doador de células T alogênicas para o paciente, utilizando uma representação que (i) identifica uma pluralidade de alelos HLA e opcionalmente combinações de alelos HLA, e (ii) revela indicações de atividades relativas de linhagens de células T, cada uma reconhecendo pelo menos um epítopo de um antígeno do patógeno ou câncer, e restrita a diferentes dos alelos HLA ou combinações de alelos HLA na pluralidade; em que na representação cada alelo HLA identificado ou combinações de alelos HLA está associado com a respectiva indicação de atividade relativa da linhagem de células T restrita ao alelo HLA ou combinação de alelos HLA, as atividades relativas sendo medidas relativas de atividade conhecida contra o patógeno ou contra o câncer exibido pelas linhagens de células T; em que (A) o doador de células T selecionado tem pelo menos um alelo HLA ou combinação de alelos HLA em comum com o paciente ou células doentes no paciente; e (B) um dos pelo menos um alelo HLA ou combinação de alelos HLA em comum com o paciente ou as células doentes no paciente está associado na representação com uma indicação da atividade relativa mais elevada entre os alelos HLA e combinações de alelos HLA na representação que são conhecidos como sendo em comum com o paciente ou com as células doentes do paciente e não são de outra forma desqualificadas.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende, antes da etapa de seleção, uma etapa de verificação da atribuição de HLA do paciente ou das células doentes no paciente e da atribuição de HLA para o doador de células T.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende, antes da etapa de seleção, uma etapa de geração da representação.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a representação é uma lista da pluralidade de alelos HLA e opcionalmente combinações de alelos HLA classificados pelas atividades relativas.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que as atividades relativas são eficácias clínicas in vivo das linhagens de células T no tratamento de pacientes com o patógeno ou câncer.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o paciente tem ou é suspeito de possuir um agente patogênico, em que as linhagens de células T reconhecem pelo menos um epítopo de um antígeno do patógeno e em que as atividades relativas são medidas relativas de atividade conhecida contra o patógeno.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o vírus é CMV ou EBV.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o paciente tem ou é suspeito de ter um câncer, em que a linhagem de células T reconhece pelo menos um epítopo de um antígeno do câncer, e em que as atividades relativas são medidas relativas de atividade conhecida contra o câncer.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o antígeno é WT1.
12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o câncer é um transtorno linfoproliferativo pós-transplante positivo a EBV.
13. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende, antes da etapa de geração, uma etapa de medição das atividades relativas.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que as atividades relativas são eficácias clínicas in vivo das linhagens de células T no tratamento de pacientes com o patógeno ou câncer.
15. Sistema de computador para selecionar uma linhagem de células T alogênicas ou um doador de células T alogênicas a partir de quem deriva uma linhagem de células T alogênicas para administração terapêutica a um paciente humano possuindo ou suspeito de possuir um patógeno ou câncer, caracterizado pelo fato de que compreende: uma unidade de processamento central; uma memória, acoplada à unidade de processamento central, a memória armazenando instruções para executar as etapas do método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.
16. Meio legível por computador que possui instruções executáveis por computador caracterizado pelo fato de que é para executar as etapas do método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.
17. Uso de uma população de células T, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento para o tratamento de um paciente humano possuindo ou suspeito de possuir um patógeno ou câncer, em que a população de células T é derivada de uma linhagem de células T alogênicas selecionadas de acordo com o método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2 ou conforme definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 14.
18. Uso, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o agente patogênico é um vírus, uma bactéria, um fungo, um helminto ou um protista.
19. Uso, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer do sangue, ou um câncer da mama, do pulmão, do ovário, do estômago, do pâncreas, da laringe, do esôfago, dos testículos, do fígado, da parótida, do trato biliar, do cólon, do reto, do colo do útero, do útero, do endométrio, do rim, da bexiga, da próstata, da tireoide, do cérebro ou da pele, ou um distúrbio linfoproliferativo, ou um distúrbio linfoproliferativo pós-transplante positivo ao EBV, ou um carcinoma nasofaríngeo positivo ao EBV.
20. Método para a obtenção de uma linhagem de células T alogênicas para administração terapêutica a um paciente humano possuindo ou suspeito de possuir um patógeno ou câncer, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) selecionar um doador de células T alogênicas de acordo com o método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 3 ou 4, ou conforme definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 14; e (b) derivar uma linhagem de células T alogênicas a partir do doador de células T alogênicas selecionado, cuja linhagem de células T alogênicas reconhece pelo menos um epítopo de um antígeno do patógeno ou câncer.
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