JP2001506591A

JP2001506591A - 近赤外線（ｎｉｒ線）を使用して神経変性症を診断するための光学的診断法

Info

Publication number: JP2001506591A
Application number: JP52305998A
Authority: JP
Inventors: ヨナターントゥルネル; トーマスディルクス; ヴォルフハルトゼムラー; カイリーヒャ; ビヨルンリーフケ
Priority date: 1996-11-19
Filing date: 1997-10-29
Publication date: 2001-05-22
Also published as: CA2272320A1; AU7298598A; DE19649971A1; WO1998022146A2; WO1998022146A3; EP0942756A2; US6329531B1; CN1237911A

Abstract

(57)【要約】本発明は、一般式Ｉ

Description

【発明の詳細な説明】近赤外線（ＮＩＲ線）を使用して神経変性症を診断するための光学的診断法本発明は近赤外線（ＮＩＲ線）を使用して神経萎縮症をインビボおよびインビトロで診断するための化合物、光学診断薬としての該化合物の使用、および該化合物を含む診断薬に関する。アルツハイマー症（ＡＤ）は高齢者において進行する痴呆の最も普通に現れる形である。ＡＤが現れる頻度は患者の年齢が高くなるほど増大し、85才から90才の間の年齢層では40−50％にも達する。ＡＤは、その患者が死亡したあとに脳を検査しなければ確実な診断を下すことができない。アルツハイマー患者の脳には、異栄養性軸索と”からまった”神経原線維で囲まれた神経組織と血管の周辺に特徴的な多くのアミロイド斑が認められる。また、アルツハイマー患者の脳ではシナプスの数が少ないことがわかっている。病状が進行した段階では神経構造の顕著な退化変性と脳体積の著しい減少が認められる（Wiesniewski，H．M.，Weig el，J.，Alzheimer's disease neuropathology．Current status of interpreta tion of lesion development．Ann NY Acad Sci 1992;673:270-84）。アミロイド斑はとりわけアミロイド−β−ペプチド（Ａβ）、すなわちβ−アミロイドの前駆タンパク質（ＡＰＰ）の40ないし42個のアミノ酸からなるフラグメントで構成されている(Master，C．L.，Simms，G.，Weinman，N．A.,他、Am yloid plague core protein in Alzheimer disease and Down syndrome．Proc N atl Acad Sci USA 1985，82:4245-9;Kang，J.，Lemaire，H．G.，Unterbeck，A. 他．The precursor of Alzheimer's disease amyloid A4 protein resembles a cell-surface receptor，Nature 1987，325:733-6)。斑点の数は進行した痴呆の程度と相関性は認められないが、アルツハイマー症の発現に対する早い時期に行われる比較的確実な診断方法である。このことは、ＡＤが発現するよりずっと前、すなわち、最初の臨床的な徴候が現れるより前に、Ａβの最初の沈着が起こることを仮定している(Hardy，L.，Allsop，D.，Amyloid deposition as the cent ral event in the aetiology of Alzheimer's disease．Trends Pharmacol Sci 1991，12:383-8)。しかし患者が死亡する前の早い時期にアミロイド斑を定量的に把握する方法が開発されれば、ＡＤの研究の進展とＡＤを効果的に治療するための新しい概念の発展に大きな影響を与えることになる。現時点では、ＡＤ患者の脳内のアミロイド斑を直接検出する方法は知られていない。現在、ＡＤの程度は脳の体積または脳の該当する領域（MRTおよびPET）における物質代謝の乱れに基づいて間接的に行われているに過ぎない。しかしこの方法の重大な欠点は、ＡＤを間接的にしか検出することできず、しばしばそのことが、統計的な変動が大きいことの原因になっている点である。それゆえ、アミロイド斑の直接的な検出法と比較して、この方法の検出感度は小さいものと考えられる。波長領域が600ないし1200nmの長波長光を使用する生体組織の透過および画像診断については、いくつかの方法が知られている。生体組織はこの波長領域の長波長光に対して比較的高い透過性を持っているので、診断医は、レントゲン撮影や核磁気共鳴断層撮影、あるいは超音波診断法といった近代的な画像診断法以外に、別の組織撮影法を利用することが可能になる（Haller，E．B.，Time-resol vedtransillumination and optical tomography．J．Biomed．Optics 1996，1:7 -17）。ヘモグロビン／デオキシヘモグロビンの吸収を検出することによって、哺乳動物の脳内の血流と酸素飽和度を部位ごとに表示する方法は、ずっ infrared monitoring of cerebral and myocardial oxygen sufficiency and ci rculatory parameters．Science 1977，198:1264-67;Chance，B.，Leigh，J．S. ，Miyake，H．他、Comparison of time-resolved and-unresolved measurements of deoxyglobin in brain．Proc Natl Acad Sci USA 1988，85:4971-75;Benaro n D.A．他、Optical time-of-flight and absorbance imaging of biological m edia．Science 1993，33:369A.）。近赤外線診断法では、吸収されなかった光を検出して、透過画像として表示すると共に、近赤外線を照射したあとに放射される蛍光から組織に特有の情報が得られる。近赤外線を使用する時の大きな問題は、光の散乱が大きいために光物理的な特性が異なっている場合でさえ、明確な輪郭を持つ対象とその周辺のコントラストが非常に弱いという点である。この欠点は表面からの距離が大きくなるほど顕著になり、透過撮影する時ばかりでなく蛍光を検出する時にも主要な制約要因になるものと考えられる。従って、本発明は新しい化合物を利用して、現在の技術水準における欠点を克服し、問題を解決することを基本としている。この問題は、本発明に従い、一般式Ｉで表される化合物：Ｆ_m（−Ａ_l）（−Ｂ_n）（−Ｗ_o）（Ｉ）において、Ｆは600−1200nmの領域に少なくとも１つの吸収極大を持つ色素のシグナル分子であり、Ａはβ−アミロイド斑と結合する生体分子であり、Ｂはβ−アミロイド斑と結合する色素分子であり、Ｗはβ−アミロイド斑と結合する親水性の低分子構造エレメントであり、ｍは１または２の数を表し、またはｎおよびｏがゼロである場合に、３−20 の整数を表し、ｌおよびｎは互いに独立して０、１または２を表し、ｏは、ｌ、ｎおよびｏの合計が≧１である条件の下で、０、１、２、３または４を表す一般式Ｉの化合物を使用に供することによって解決される。意外なことに、本発明に従う化合物がアミロイド斑またはアミロイド斑の成分に付加し、結合し、またはそこに濃縮され、そしてその結果検出すべきこの領域の吸収および蛍光が統一され強度を増すことが発見された。ＮＩＲを使用してβ−アミロイドの沈着をインビボで検出するためには、600 ないし1200nmの波長領域に強い吸収と大きな蛍光量子収率を持ち、β−アミロイド沈着物と選択的に結合する色素が造影剤として必要である。ポリメチン系色素は600nmないし1200nmの間に大きなモル吸光係数を持ち、かつ十分な蛍光量子収率を持つ点に特徴がある。通常、このグループの色素はその大きな光安定性が利用されている。意外なことに、正常な組織と病気の組織の識別を容易にするには、病気の組織に濃縮されるか、または病理学的に変化した組織の構成成分に選択的に結合し、特異的な吸収発光挙動を持つ蛍光色素が適していることが明らかになった。本発明においては、意外にも、一般式Ｉの本発明に従う化合物がβ−アミロイド斑に結合することが発見された。色素が光を吸収することによって起きる照射光の変化または励起光によって誘起される蛍光、または両者を検出すれば、その組織に固有の情報が得られ、それによって病理学的な変化の程度について論じることが可能になる。本発明に従えば、このような色素はβ−アミロイド斑に選択的に結合する構造と共有結合するか、またはそのような構造で置換されているシグナル分子Ｆとして使用される。一般式Ｉの本発明に従う化合物は、たとえば次のような化合物である：ａ）ｌおよびｎがゼロであって、ｍが１、そして０が１−４を表すか、またはｂ）ｎおよびｏがゼロであって、ｍが３−20、そしてｌが１−２を表すか、またはｃ）ｌおよびｏがゼロであって、ｎとｍの合計が３以下であるという条件において、ｍが１−２、そしてｎが１−２を表す。一般式Ｉにおいて、Ｆはシアニン色素、スクアリリウム色素、クロコニウム色素、メロシアニン色素またはオキソノール色素を表す、本発明に従う化合物であることが好ましい。とりわけ、一般式Ｉで表される化合物が好ましく、その一般式Ｉにおいて、Ｆは一般式II−IVで表されるシアニン色素、スクアリリウム色素またはクロコニウム色素を表し、そして式中のＲ¹−Ｒ⁴とＲ⁷−Ｒ¹⁰が互いに独立に、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素原子またはニトロ基を表すか、または−ＣＯＯＥ¹、−ＣＯＮＥ¹Ｅ²、−ＮＨＣＯＥ¹、ＮＨＣＯＮＨＥ¹、−ＮＥ¹Ｅ²、−ＯＥ¹、−ＯＳＯ₃Ｅ¹、−ＳＯ₃Ｅ¹ 、−ＳＯ₂ＮＨＥ¹、−Ｅ¹残基を表し、そしてＥ¹およびＥ²は互いに独立に、水素、または不飽和または飽和の分岐または直鎖Ｃ₁−Ｃ₅₀アルキル基を表し、その炭素鎖またはその炭素鎖の一部が場合によっては、１個または複数個の芳香環または飽和環Ｃ₅−Ｃ₆単位、またはビシクロＣ₁₀単位を形成してもよく、そしてＣ₁−Ｃ₅₀アルキル基の途中に０ないし15個の酸素原子及び／または０ないし３個のカルボニル基、及び／または０ないし５個のヒドロキシ基で置換されており、そして隣接する残基Ｒ₁−Ｒ₄及び／またはＲ₇−Ｒ₁₀は互いに結合して芳香族炭素６員環を形成してもよく、またはＡ、ＢもしくはＷとの結合を表し、Ｒ⁵およびＲ⁶は前記の意味を持つ残基−Ｅ¹か、またはＣ₁−Ｃ₄スルホアルキル鎖を表し、Ｑは以下に示すフラグメントであってそのフラグメント中のＲ¹¹は水素、フッ素、塩素、ヨウ素原子、またはニトロ基または残基−ＮＥ¹Ｅ²、−ＯＥ¹または−Ｅ¹を表し、そしてＥ¹およびＥ²は前記の意味を持ち、Ｒ¹²は水素原子または前記の意味を持つ残基Ｅ¹を表し、そしてｂは０、２または３の数を意味し、ＸおよびＹは互いに独立に０、Ｓ、−ＣＨ＝ＣＨ−または次のようなフラグメントを表し、そのフラグメント中のＲ¹³およびＲ¹⁴は互いに独立に、水素、または飽和または不飽和の分岐または直鎖のＣ₁−Ｃ₁₀アルキル鎖を表し、そのアルキル鎖には５個までの酸素原子が介在するか、及び／または５個までのヒドロキシル基で置換されていてもよく、そして残基Ｒ¹³とＲ¹⁴は互いに結合して１つの５員環または６員環を形成してもよい。そして特に、一般式Ｉで表される化合物が好ましく、その一般式ＩにおいてＦは一般式Ｖで表されるシアニン色素であって、式中のＰは整数２または３を意味し、ＸおびＹは互いに独立にＯ、Ｓ、−ＣＨ＝ＣＨ−またはＣ（ＣＨ₃）₂を表し、Ｒ¹⁹およびＲ²⁰は互いに独立に残基−ＣＯＯＥ¹、−ＣＯＮＥ¹Ｅ²、−ＮＨＣＯＥ¹、−ＮＨＣＯＮＨＥ¹、ＮＥ¹Ｅ²，−ＯＥ¹、−ＯＳＯ₃Ｈ、−ＳＯ₃Ｈ、− Ｅ¹であって、ここでＥ¹およびＥ²は、同時には水素ではないという条件の下に、前記の意味を持ち、Ｒ²¹およびＲ²²は互いに独立に、前記の意味を持つ残基−Ｅ¹、Ｃ₁−Ｃ₄スルホアルキル鎖であるか、またはＲ¹⁹、Ｒ²⁰、Ｒ²¹、Ｒ²³、Ｅ¹またはＥ²は前記の意味を持つＡ、ＢまたはＷとの結合を表す。さらに、一般式Ｉで表される化合物が好ましく、その一般式Ｉにおいて、Ｆは一般式VIで表されるシアニン色素であり、この式中のＰ、Ｘ、Ｙ，Ｒ²¹およびＲ²²は前記の意味を持ち、Ｒ²³は−ＯＥ³、−ＣＯＯＥ³、−ＣＯＮＨＥ³、−ＣＯＮＨ（ＣＨ₂）_1-6−ＮＨＥ³、−ＣＯＮＨ（ＣＨ₂）_1-6−ＯＥ³、−ＣＯＮＨ（ＣＨ₂）_1-6−ＣＯＯＥ³ またはＣＯＮＨ（ＣＨ₂)_1-6−ＣＯＮＨＥ³を表し、そしてここでＥ³は少なくとも１個の−ＯＳＯ₃Ｈ残基を持つ単糖、オリゴ糖または多糖である。さらに一般式Ｉで表される化合物が好ましく、その一般式Ｉにおいて、Ｆは一般式VIIで表されるオキソノール色素であり、この式中のＰ、Ｒ¹⁹およびＲ²⁰は前記の意味を持ち、Ｒ²⁴およびＲ²⁵は互いに独立に、１個ないし３個のヒドロキシル、カルボキシル、スルファト、スルホナト、アルキルもしくはアルコキシル、またはカルボン酸エステル残基で置換されたフェニル基を表す。本発明に従う一般式Ｉの化合物は、その式においてＡが、たとえば抗体、抗体フラグメント、特異的なペプチドおよびタンパク質、レセプター、酵素、酵素基質、ヌクレオチド、リボ核酸、デオキシリボ核酸、リポタンパク質、炭化水素、単糖、二糖、三糖、直鎖若しくは分岐オリゴ糖若しくは多糖、またはそれらの糖の誘導体、もしくはデキストランであるような化合物である。好ましいペプチドはβ−アミロイド１−40、１−42および１−43、その部分構造およびそれらの誘導体である。そして、アミノ酸であるシステインで修飾され、そのシステインのスルフヒドリル基を介してマレインイミド構造によってＦと結合したβ−アミロイドおよびβ−アミロイドの部分構造が特に好ましい。単量体アミノ糖は、たとえばグルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、グロサミン、フコサミン、３−アミノ−３−デオキシリボース、カノサミン、マイコサミン、マイカミノース、デソサミン、ロドサミン、６−アミノ−５−デオキシグルコース、ネオサミン、パロモースである。アミノ糖カルボン酸は、たとえばグルコサミン酸、グルコサミンウロン酸、ムラミン酸、トレハロースアミン、コンドロシンおよび誘導体−キトトリオースである。好ましいのは、糖アミノ基と色素のカルボキシル基の間でＦに結合してアミド基を形成した一般式Ｉの化合物である。また、Ａとして、グリコシドヒドロキシがアミノ基に変換され、色素のカルボキシル基とカップリングさせてアミド基を形成させた単糖、二糖、三糖およびオリゴ糖を含む一般式Ｉの化合物が好ましい。単糖ないしオリゴ糖としては、アルドトリオースないしアルドヘプトース、ケトトリオースないしケトヘプトース、ケトオクトースおよびケトノノース、アンヒドロ糖、シクライト、アミノ糖、ジアミノ糖、デオキシ糖、アミノデオキシ糖、モノカルボン酸糖、アミノ糖カルボン酸、アミノシクライト、単糖ないしオリゴ糖の含リン誘導体である。適当な多糖の例としては、フコインダン、アラビノガラクタン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン、ヘパリン、ヘパラン、ヘパリチン、ヒアルロン酸、ケラタン、ポリガラクトウロン酸、ポリグルクロン酸、ポリマヌロン酸、イヌリン、ポリラクトース、ポリラクトサミン、ポリイノシン酸、ポリスークロース、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、ニゲラン、プルラン、アスパラゴシン、シニストリン、シトシン、ガラクトカオロース、ルテオース、ガラクタン、マンナン、グアラン、グルコマンナン、ガラクトグルコマンナン、フェオフォマンナン、フカン、ペクチン、シクロデキストリン、および高分子化合物から化学的に及び／または酵素によって作られた誘導体、分解生成物および開裂生成物である。特に好ましい単糖、オリゴ糖および多糖は、硫酸エステル化またはポリ硫酸エステル化された構造のものである。硫酸エステル化した構造の例としては、グルコサミン−３−硫酸エステル、グルコサミン−６−硫酸エステルおよび上述の単糖、二糖、三糖ないしオリゴ糖および多糖を適当な試薬で硫酸化して得られる類似構造があげられる。硫酸化の文献としては、たとえばJaurand，G.，他、Carbohydrate Research 1994，ある。本発明に従ってβ−アミロースに選択的に結合する色素Ｂはシグナル分子に共有結合したジアゾ色素である。好適なジアゾ色素の例としては、Congo Red、一般式Ｉの好ましい化合物は、Ｂが一般式VIIIのジアゾ色素であって、式中のＲ¹⁵とＲ¹⁶は互いに独立に、１個または複数個のヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、スルホン酸基、アルキル残基に６個までの炭素原子を持つアルコキシカルボニル基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルコキシル基、またはアリール残基に９個までの炭素原子を持つアリールスルホニル基で置換されたフェニル残基またはナフチル残基、または色素Ｆを表し、Ｒ¹⁷とＲ¹⁸は互いに独立に、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スルホン酸基、６個までの炭素原子を持つアルキル残基、アルコキシル残基を表す。さらにまた、発明に従う一般式Ｉの好ましい化合物は、式中のＷが残基−ＯＳＯ₃Ｈまたは−ＳＯ₃Ｈ、60個までの炭素原子を含む非分岐、分岐、環式または多環式アルキル、アルケニル、ポリアルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリールまたはアリールアルキル残基であって、５個までのヒドロキシル基、３個までのカルボン酸基および少なくとも１個の残基−ＯＳＯ₃Ｈまたは−ＳＯ₃Ｈで置換された残基を表す。好ましい化合物は、Ｗが硫酸化された構造を意味し、そして対応するヒドロキシル化合物の硫酸化によって合成される一般式Ｉに従う化合物である。たとえば、色素のアミノ基とカルボキシル基との間で結合してアミド基が生成し、ヒドロキシル基が硫酸化されるアミノアルコールが好適である。アミノアルコールの例として、２−アミノ−１−エタノール、３−アミノ−１−プロパノール、４−アミノ−１−ブタノール、５−アミノ−１−ペンタノール、６−アミノ −１−ヘキサノール、３−アミノ−１，２−プロパンジオール、２−アミノ−１，３−プロパンジオール、３−アミノ−１，２，４−ブタントリオール、ヒドロキシアニリン、４−アミノレゾルシノールがあげられる。シグナル分子および特異的に結合する構造単位は通常の官能基を通して相互に結ばれている。このような基としては、たとえばエステル、エーテル、２級および３級アミン、アミドおよび次に示す構造である。本発明に従う一般式Ｉに従う化合物の合成は、カップリング可能な官能基（たとえばカルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基）を含むポリメチン色素の基本体を同業者に良く知られた方法で改変することによって行われる。これらの基は相応に出発化合物の構造を保持したまま、しかるべき置換基と反応させることによって改変される。ポリメチン色素の基本体は文献に既知の方法、たとえばF.M．Hamer,"The Cyan ine Dyes and Related Compounds ,"John Wiley and Sons，New York，1964;Cyto metry ，10，(1989)，3-10;11(1990)418-430;12(1990)723-730;Bioconjugate Che m .4(1993)105-11，Anal ．Biochem．217（1994）197-204;Tetrahedron 45（1989 ）4854-66，EP-0 591 820 A1，J ．Org．Chem．60（1995）2361-95に従って合成される。本発明に従う色素−生体分子付加体（一般式Ｉのｌがゼロでない場合）は、文献既知の方法に従い、色素と生体分子を反応させて合成される。色素はカップリングしうる反応基を持っているか、またはそのような反応基を in situで発生させるか、または反応に先だって活性化しなければならない。生体分子のアミノ基およびスルフヒドリル基に対する反応基としては、たとえばＮ −ヒドロキシコハク酸イミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミジルー３ −スルファート、イソチオシアナート、イソシアナート、マレイン酸イミド基、ハロゲンアセチル基、ビニルスルホン基があげられる。カップリングは主として水溶液中で行われる。その場合、反応の度合いは量論と反応時間によって制御することができる。文献：Synth ．Commun.23（1993）3078-94，DE-OS 3912046，Ca ncer Immunol．Immunother ．41（1995）257-263，Cancer Research 54(1994) 2643-49. 本発明のもう１つの目的は、本発明の一般式Ｉに従う化合物を、ＮＩＲ線を使用する神経変性症のインビボでの診断に適用することである。本発明のさらにもう１つの目的は、本発明の一般式Ｉに従う化合物をIn vitro での診断に適用することである。そのためには組織検体または生検用検体が取られ、β−アミロイド折り畳みシート構造の含有量が検査される。意外なことに、本発明に従う色素は検体に選択的に結合するので、近赤外スペクトル領域で特異的に放射される蛍光によって評価することができる。本発明のさらに別の目的は、一般式Ｉの化合物の他に通常の補助剤や支持物質と希釈剤を一緒に含み、インビボで診断するための手段でもある。本発明に従ってインビボの診断に適用する場合、１つまたは複数の該物質を硬膜下腔内、腰椎内または静脈内組織に導入し、近赤外領域の光を照射する。吸収されなかった散乱光または色素から放射される散乱蛍光線、あるいはこれら両者を同時にまたは個別に記録される。組織への照射は広い面積にわたって行い、蛍光線は局部的に分解してＣＣＤカメラで撮影して表示するか、または写し取るべき組織領域を光伝導素子（Lichtleiter）で走査して得られる信号を計算して合成画面に変換する方法が好ましい。このようにして蛍光は分光的にまたは位相選択的に、あるいはこれら両者により、静止的にまたは時間的に分解して、またはこれら両者によって評価することができる。本発明に従う化合物の特別な利点は、安定な色素を使用すれば、たとえば放射線を使用する診断方法と比べて、安定な色素を使用すれば、適用後比較的長い時間が経過した後でも色素を励起することによって蛍光シグナルを発生させ、検出が可能な点にある。分解半減期といった制約が存在しないので診断に比較的長い時間枠を使用することができる。本発明に従う応用によって、アミロイド斑をインビボで直接検出することができる非侵入的な診断法の適用が可能になる。本発明を以下の実施例によって説明する：実施例１Ｎ−（２，３−ジスルファト）プロピル−１，１’−ビス−（４−スルホブチル）インドトリカルボシアニン−５−カルボン酸アミド、トリナトリウム塩の合成１）１，１’−ビス−（４−スルホブチル）インドトリカルボシアニン−５−カルボン酸−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミジルエステル、ナトリウム塩１，１’−ビス−（４−スルホブチル）インドトリカルボシアニン−５−カルボン酸0.5g(0.7mmol)とN-ヒドロキシコハク酸イミド0.1g(0.9mmol)を無水ＤＭＦ 30mlに溶かした溶液にアルゴン下、０℃でＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド0.15g(0,75mmol)を５mlに溶解した溶液を滴下する。室温で72時間攪拌する。つづいて溶媒を高真空下、40℃で蒸発させる。約５mlまで濃縮し、残留物にジエチルエーテル200mlを加えて攪拌する。析出する沈殿から傾斜法でエーテルを除き、再度ジメチルホルムアミド５mlを加えて前記の操作をくり返す。得られる沈殿を高真空下に乾燥し、アルゴン下−20℃で保存する。収量：0.55g(97%)、濃青色の粉末。２）Ｎ−（２，３−ジヒドロキシ）プロピル−１，１’−ビス−（４−スルホブチル）−インドトリカルボシアニン−５−カルボン酸アミド、ナトリウム塩１，１’−ビス−（４−スルホブチル）インドトリカルボシアニン−５−カルボン酸−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミジルエステル0.5g(0.61mmol)をジメチルホルムアミド20mlに溶解した溶液に２−アミノメチル−５，５−ジメチル−１，３ −ジオキソラン塩酸塩0.15g(0.92mmol)とトリエチルアミン0.1g(1.1mmol)をジメチルホルムアミド20mlに溶かした溶液を加え、室温で24時間攪拌した。上と同様に処理する。粗生成物を水／メタノール／酢酸（３：１：２）の混合液30ml中、室温で18時間攪拌し、その溶液をクラマトグラフィに直接かけて精製した（Euro prep，60-30 C18，60A，20-45μ、溶離液：水／メタノール）。収量：0.25g(52% )、青色の凍結乾燥物。３）Ｎ−（２，３−ジスルファト）プロピル−１，１’−ビス−（４−スルホブチル）−インドトリカルボシアニン−５−カルボン酸アミド、トリナトリウム塩Ｎ−（２，３−ジヒドロキシ）プロピル−１，１’−ビス−（４−スルホ−ブチル）−インドトリカルボシアニン−５−カルボン酸アミド0.25g(0.32mmol)と三酸化硫黄−トリメチルアミン錯体0.22g(1.6mmol)をジメチルホルムアミド15ml 中、室温で48時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、エーテルを加えてかき混ぜ、析出した固体をクロマトグラフィによって精製した（Europrep，60-30 C18，60A ，20-45μ，溶離液：0.5NaCl溶液／メタノール）。収量：0.20 g(64%)、青色の凍結乾燥物。 λmax,吸収（H₂O）＝746nm λmax,蛍光（H₂O）＝780nm実施例２ビス−１，’１−（４−スルホブチル）インドトリカルボシアニン−５−カルボン酸−α−Ｄ−グルコサミド−３’’−硫酸、ジナトリウム塩（２）１，１’−ビス−（４−スルホブチル）インドトリカルボシアニン−５−カルボン酸0.5g(0.7mmol)とトリエチルアミン0.1g(1.0mmol)を無水ジメチルホルムアミド20mlに溶かした溶液にベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’ −テトラメチルウロニウム−テトラフルオロボラート（ＴＢＴＵ）0.23g(0.7mmo l)を加える。室温で30分間攪拌後、α−D−グルコサミン−３−スルファート0.3 6g(1.4mmol)とトリエチルアミン0.15g(1.5mmol)を無水ジメチルホルムアミド25m lに溶かした溶液を滴下する。室温でさらに３時間攪拌し、溶媒を高真空下、40 ℃で留去し、残留物にジエチルエーテルを加えてかき混ぜる。生成する固体をろ取し、ＲＰシリカゲル（Europrep，60-30 C18，60A， 20-45μ、段階溶離法：100% 0.5% NaCl溶液→90% 0.5%Na自溶液／10%メタノール →90%水／10%メタノール→50%メタノール）によるクロマトグラフィで精製し、それから凍結乾燥する。収量：0.51g(76%)、青色の凍結乾燥物 λmax,吸収（H₂O）＝745nm λmax,蛍光（H₂O）＝779nm実施例３ビス−１，１’−（４−スルホブチル）インドトリカルボシアニン−５，５’ −ジカルボン酸−ジ−α−D−グルコサミド−ジ−３’’−スルファート,トリナトリウム塩（３）合成と生成は、１，１’−ビス−（４−スルホブチル）インドトリカルボシアニン−５，５’−ジカルボン酸0.5g(0.66mmol)、トリエチルアミン0.2 g(2.0mmol)をジメチルホルムアミド25mlに溶かした溶液から出発して、TBTU0.43 g(1.32mmol)およびα−D−グルコサミン−３−スルファート0.69g(2．64mmol)とトリエチルアミン0.3g(3mmol)をジメチルホルムアミド30mlに溶かした溶液を加え、実施例２と同様に行う。収量：0.56g(66%)、青色の凍結乾燥物。 λmax,吸収（H₂O）＝754nm λmax,蛍光（H₂O）＝790nm実施例４Ｎ−コンドロシン−ビス−１，１’−（４−スルホブチル）インドトリカルボシアニン−５−カルボン酸アミド、ナトリウム塩（４）合成は、１，１’−ビス−（４−スルホブチル）インドトリカルボシアニン− ５−カルボン酸0.5g(0.7mmol)とコンドロシン0.43g(1.2mmol)から出発して、実施例２と同様に行う。反応時間は５時間である。精製はＨＰＬＣ（カラム：250 ×20mm、Nucleosil 100C18、7mm、溶離液：50mMリン酸塩緩衝液ｐＨ４／MeOH，60分で5% MeOHから95% MeOHまで）によって行い、引き続いてＲＰシリカゲルで脱塩し、凍結乾燥する。収量：0.35g(48%)、青色の凍結乾燥物。 λmax,吸収＝746nm λmax,蛍光＝779nm実施例５マルトトリオース−インドトリカルボシアニン付加体１）１−アミノ−１−デオキシマルトトリオースの合成マルトトリオース0.2ｇを飽和炭酸水素アンモニウム溶液中、30℃で７日間攪拌する。過剰の炭酸水素アンモニウムを除くため、重量が一定になるまでくり返し溶液を凍結乾燥する。２）１，１’−ビス−（４−スルホブチル）インドトリカルボシアニン−５−カルボン酸とのカップリング１，１’−ビス−（４−スルホブチル）インドトリカルボシアニン−５−カルボン酸0.1g(0．14mmol)およびトリエチルアミン15mgをジメチルホルムアミド５m lに溶かした溶液にＯ−（ベンゾトリアゾールー１ーイル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ ’−テトラメチルウロニウム＝テトラフルオロボラート（ＴＢＴＵ）0.05g(0.15 mmol)を加え、室温で30分間攪拌する。続いて１−アミノ−１−デオキシ−マルトトリオース01.4g（0.28mmol)を加え、室温でさらに５時間攪拌する。ジメチルホルムアミドを40℃で高真空下に除去した後、残留物にエーテルを加えて攪拌し、つづいて濾別したのち、クロマトグラフィによって精製する（Europrep，60-3 0 Cl8，60A，20-45μ，溶離液：水／メタノール）。凍結乾燥後の収量50%。 λmax,吸収（H₂O）＝748nm λmax,蛍光（H₂O）＝779nm実施例６ヘパリン−インドトリカルボシアニン付加体ヘパリン（低分子量、Ｍ約6000g/mol，Sigma社製）0.25ｇをNagasawa K.とIno ue Y．(Methods in Carbohydrate Chemistry Vol.III，1980，291-294)に従って部分的に脱Ｎ−スルホン化する（25゜Ｃで３時間,収量0.20g）。部分的に脱Ｎ−スルホン化した低分子ヘパリン0.10ｇにリン酸塩緩衝液（0.1M NaH₂PO₄/Na₂HPO₄，PH8.3）40ml中で１，１’−ビス−（４−スルホブチル）インドトリカルボシアニン−５−カルボン酸−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミジルエステル、ナトリウム塩（実施例１を参照）0.12g(0.15mmol)をジメチルホルムアミド４mlに溶解した溶液を加え、室温で２時間攪拌する。蒸留水を使用する限外濾過法で精製し（Centriprep 3000，アミコン社）、凍結乾燥し、高真空下、50 ℃で５時間乾燥する。硫黄含量（ICP-AES法によって定量）Ｓ（％）ヘパリン 11.55 Ｓ（％）部分脱Ｎ−スルホン化 10.02 Ｓ（％）色素でラベリング後 10.89 λmax,吸収（H₂O）＝750nm λmax,蛍光（H₂O）＝782nm 実施例７インドトリカルボシアニン−Ｃｙｓ−β−アミロイド付加体１）Ｎ−[３−（３−マレイミドベンゾイル）アミノプロピル]−ビス−１，１’ −（４−スルホブチル）インドトリカルボシアニン−５−カルボン酸アミド、ナトリウム塩１，１’−ビス−（４−スルホブチル）インドトリカルボシアニン−５−カルボン酸を文献記載の方法に従い、３−アミノプロピル−ｔ−ブチルカルバマートと反応させ、続いてトリフルオロ酢酸で酸分解しアミノ基を遊離させ、それから３−マレイミド安息香酸クロリドと反応させて前記の化合物に変換する。２ａ）Ｃｙｓ−β−アミロイド（１−40）のラベリングすべての溶媒はアルゴンを飽和させて酸素を除く。凍結乾燥したＣｙｓ−β−アミロイド（１−40）10mgをリン酸塩緩衝液ｐＨ7. 8／ＤＭＦ（２：１混合物）１mlに溶解し、Ｎ−［３−（３−マレインイミドベンゾイル）アミノプロピル］−ビス−１，１’−（４−スルホブチル）インドトリカルカルボシアニン−５−カルボン酸アミド、ナトリウム塩10mgを混合する。室温で３時間攪拌し、水５mlを加えて希釈し、溶液を凍結乾燥する。ＨＰＬＣ（カラム：メルクSelect B、５μ；溶離液：水+0.05%トリフルオロ酢酸、アセトニトリル）によって精製し生成物４mgを得る。 λmax,吸収（H₂O）＝747nm λmax,蛍光（H₂O）＝780nm ２ｂ）Ｃｙｓ−β−アミロイド（12−20）のラベリング反応は２ａ）と同様に行う。Ｃｙｓ−β−アミロイド（12-20）５mgに色素15mg を加え、室温で2.5時間攪拌する。HPLCで精製した後、生成物６mgを得る。実施例８：蛍光の検出によってβＡ４ペプチドへの色素構造の結合を測定するための結合アッセー１）βＡ４ペプチドを被覆した膜の調製とβＡ４と結合する色素構造でのインキュベーション結合アッセーはβＡ４ペプチドを被覆したニトロセルロース膜（セルロースニトラート製のメンブランフィルタＣＮ；0.4μm、Schleicher & Schuell社製）で行った。膜の被覆はドット−ブロットチャンバー（Stratagene社製）中で行った。膜とブロッテイングろ紙（GB002、Schleicher & Schuell社製）を水で湿らせ、 TBST緩衝液（20mM Tris/HCl pH7.6；127mM NaCl；0.1％ Tween 20；0.01% NaN₃ ）で平衡化させた。βＡ４ペプチドの水溶液（２mg/ml）からTBST緩衝液中の10 、５および2.5μgを膜につけた。15分間インキュベーションしたのち、膜を通してペプチド溶液を吸引し、それからTBST緩衝液0.2mlを噴霧した。ドット−ブロットチャンバーから膜を取り出し、37℃で30分間乾燥させた。乾燥した膜は、色素とインキュベーションする前に、穏やかに振とうしながら TBST-Block緩衝液（TBST、上を参照；５％粉末ミルク）と２時間インキュベートし、それからTBST緩衝液で５分間洗った。色素とのインキュベーションは、膜を色素の0.0005−0.05%TBST溶液中で穏やかに振とうして行った。それから膜をTBST緩衝液で５回洗い、室温で乾燥後、装着した。２）蛍光の検出による評価レーザーで誘起される蛍光は、実験的な蛍光画像形成システムで検出する。励起は、波長740nmの単色光を使い、光伝導システムを通して光線を出力し、当該セルロース膜の均質な照射することによって行った。反射した励起光はカットフィルターでカットし、740nmより上のレーザー誘起蛍光をＣＣＤカメラ（Charge Coupled Device、電荷結合素子）で撮影し、そのデータを白黒の画像として保存する。図１から２に膜の蛍光の撮影例を示してある。図１：ビス−１，１’−（４−スルホブチル）インドトリカルボシアニン、ナトリウム塩（0.005%）とインキュベートした当該セルロース膜の蛍光の撮影励起波長740nm、検出波長＞780nm １：2.5μg β−アミロイド（１−42）２：５μg β−アミロイド（１−42）３：10μg β−アミロイド（１−42）４：当該セルロース膜に対する結合特性が似ているコントロール（比較対照用）ペプチド図２：４−［５−［３−カルボキシ−３−ヒドロキシ−１−（４−スルホフェニル）− １Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２，４−ペンタジエニリデン］−４，５−ジヒドロ−５−オキソ−１−（４−スルホニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸、ジカリウム塩（0.005%溶液）とインキュベートした当該セルロース膜の蛍光の撮影励起波長650nm；検出波長＞680nm ５：2.5μg β−アミロイド（１−42）６：５μg β−アミロイド（１−42）７：10μg β−アミロイド（１−42）８：当該セルロース膜に対する結合特性が似ている比較対照用ペプチド

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｈ 5/06 Ｃ０７Ｈ 5/06 Ｃ０７Ｋ 14/00 Ｃ０７Ｋ 14/00 16/00 16/00 Ｃ０８Ｂ 37/00 Ｃ０８Ｂ 37/00 ＺＣ０９Ｂ 56/16 Ｃ０９Ｂ 56/16 (72)発明者ディルクストーマスドイツ連邦共和国デー・16540 ホーネンノイエンドルフケーテ―コルヴィッツ ―シュトラーセ 25 (72)発明者ゼムラーヴォルフハルトドイツ連邦共和国デー・13467 ベルリンヤーンシュトラーセ 17 (72)発明者リーヒャカイドイツ連邦共和国デー・14169 ベルリンアルゲンティーニッシェアレー 179 (72)発明者リーフケビヨルンドイツ連邦共和国デー・14109 ベルリンケーニッヒシュトラーセ 25

Claims

【特許請求の範囲】１．一般式Ｉの化合物Ｆ_m（−Ａ_l）（−Ｂ_n）（−Ｗ_o）（Ｉ）において、Ｆは少なくとも600ないし1200nmの領域に吸収極大を持つ色素のシグナル分子、Ａはβ−アミロイド斑に結合する生体分子、Ｂはβ−アミロイド斑に結合する色素、そしてＷはβ−アミロイド斑に結合する親水性の低分子の構造エレメントであり、ｍは数１または２を表し、またはｎとｏがゼロを意味する条件の下で、整数３ −20を表し、ｌおよびｎは互いに独立に、数０、１または２を表し、そしてｏは、ｌ、ｎおよびｏの合計が≧１であるという条件の下で、整数０、１、２、３または４を表す化合物、および生理的に許容されるこれらの塩。２．一般式ＩにおいてＦがシアニン色素、スクアリリウム色素、クロコニウム色素、メロシアニン色素またはオキソノール色素を表すことを特徴とする請求項１に記載の化合物。３．一般式ＩにおいてＦが一般式II−IVで表されるシアニン色素、スクアリリウム色素またはクロコニウム色素を表し、これらの式においてＲ¹ないしＲ⁴およびＲ⁷ないしＲ¹⁰は互いに独立して、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素原子またはニトロ基を表すか、または残基−ＣＯＯＥ¹、−ＣＯＮＥ¹Ｅ² 、−ＮＨＣＯＥ¹、−ＮＨＣＯＮＨＥ¹、−ＮＥ¹Ｅ²，−ＯＥ¹、ＯＳＯ₃Ｅ¹、− ＳＯ₃Ｅ¹−ＳＯ₂ＮＨＥ¹，−Ｅ¹を表し、そしてＥ¹およびＥ²は互いに独立して、水素原子、飽和または不飽和の分岐または直鎖のＣ₁−Ｃ₅₀アルキル鎖を表し、場合によって、当該アルキル鎖またはその１部が１個または複数個の芳香環か、または飽和環式Ｃ₅−Ｃ₆単位または二環式Ｃ₁₀単位を形成してもよく、そして、Ｃ₁−Ｃ₅₀アルキル鎖に０ないし15個の酸素原子または０個ないし３個のカルボニル基、もしくはこれら両者が介在するか、または当該アルキル鎖上に置換基として０個ないし５個の水酸基を持つか、または両者を含み、また場合によっては、隣接する残基Ｒ₁−Ｒ₄またはＲ₇−Ｒ₁₀、またはこれら両者は互いに連結して６員環の芳香族炭素環を形成することも可能であり、または、Ｒ₁ないしＲ₄およびＲ₇ないしＲ₁₀は互いに独立してＡ，ＢまたはＷとの結合を表し、Ｒ⁵およびＲ⁶は互いに独立して、上述の意味を持つ残基Ｅ¹を表すか、またはＣ₁−Ｃ₄スルホアルキル鎖を表し、Ｑは次のフラグメントを表し、そしてこれらのフラグメントにおいて、Ｒ¹¹は水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素原子またはニトロ基または残基−ＮＥ¹Ｅ²、−ＯＥ¹または−Ｅ¹を表し、そしてＥ¹およびＥ²は前記の意味を持ち、Ｒ¹²は水素原子を表すか、または前記の意味を持つ残基Ｅ¹を表し、ｂは数０、２または３を意味し、ＸおよびＹは互いに独立して、Ｏ、Ｓ、−ＣＨ＝ＣＨ−または次のフラグメントを意味し、そしてこのフラグメントにおいて、Ｒ¹³およびＲ¹⁴は互いに独立に、水素、飽和または不飽和の分岐または直鎖のＣ₁−Ｃ₁₀アルキル鎖を表し、そして当該アルキル鎖上には５個までの酸素原子が介在し、及び／または置換基として５個までのヒドロキシル基を持ち、そして残基Ｒ¹³およびＲ¹⁴は互いに連結して５員環または６員環を形成することが可能であることを特徴とする請求項１または２に記載の化合物。４．一般式ＩにおいてＦは一般式Ｖで表されるシアニン色素であって、Ｐは整数２または３を意味し、ＸおよびＹは互いに独立に、Ｏ、Ｓ、−ＣＨ＝ＣＨまたはＣ（ＣＨ₃）₂を表し、Ｒ¹⁹およびＲ²⁰は互いに独立に、残基−ＣＯＯＥ¹、−ＣＯＮＥ¹Ｅ²、−ＮＨＣＯＥ¹、−ＮＨＣＯＮＨＥ¹、−ＮＥ¹Ｅ²、−ＯＥ¹、−ＯＳＯ₃Ｈ、−ＳＯ₃ Ｈ、−Ｅ¹を表し、そしてＥ¹およびＥ²は、同時には水素原子ではないという条件の下で、前記の意味を持ち、Ｒ²¹およびＲ²²は互いに独立に、前記の意味を持つ残基−Ｅ¹を表すか、Ｃ₁− Ｃ₄スルホアルキル鎖を表すか、またはＲ¹⁹、Ｒ²⁰、Ｒ²¹，Ｒ²²、Ｅ¹またはＥ² は前記の意味を持つＡ、ＢまたはＷとの結合を表すことを特徴とする請求項１または２に記載の化合物。５．一般式Ｉにおいて、Ｆは一般式VI で表されるシアニン色素であって、Ｐ、Ｘ、Ｙ、Ｒ²¹およびＲ²²は前記の意味を持ちＲ²³は−ＯＥ³、−ＣＯＯＥ³、−ＣＯＮＨＥ³、−ＣＯＮＨ（ＣＨ₂）_1-6ＮＨＥ³、−ＣＯＮＨ（ＣＨ₂）_1-6−ＯＥ³、−ＣＯＮＨ（ＣＨ₂）_1-6−ＣＯＯＥ³ または−ＣＯＮＨ（ＣＨ₂）_1-6−ＣＯＮＨＥ³を表し、そしてＥ³は少なくとも１個の−ＯＳＯ₃Ｈ残基を持つ単糖、オリゴ糖または多糖を表すことを特徴とする請求項１または２に記載の化合物。６．一般式ＩにおいてＦは一般式VII で表されるオキソノール色素を意味し、Ｐ，Ｒ¹⁹およびＲ²⁰は前記の意味を持ち、Ｒ²⁴およびＲ²⁵は互いに独立して、１個ないし３個のヒドロキシル、カルボキシル、スルファート、スルホナート、アルキルまたはアルコキシ、またはカルボン酸エステル残基で置換されたフェニル環を表すことを特徴とする請求項１または２に記載の化合物。７．一般式Ｉにおいて、Ａは抗体、抗体フラグメント、特異的なペプチドおよびタンパク質、レセプター、酵素、酵素基質、ヌクレオチド、リボ核酸、デオキシリボ核酸、リポタンパク質、炭水化物、単糖、二糖または三糖、直鎖または分岐オリゴ糖または多糖、または糖の誘導体を表すか、またはデキストランを表すことを特徴とする前記請求項の少なくとも１つに記載の化合物。８．一般式Ｉにおいて、Ｂは一般式VIIIで表されるジアゾ色素であり式中のＲ¹⁵およびＲ¹⁶は互いに独立に、１個または複数個のヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、スルホン酸基、アルキル残基に６個までの炭素原子を持つアルコキシカルボニル基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルコキシル基、またはアリール残基に９個までの炭素原子を持つアリールスルホニル基で置換されたフェニル残基またはナフチル残基、または色素Ｆを表し、Ｒ¹⁷およびＲ¹⁸は互いに独立に、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スルホン酸基、６個までの炭素原子を持つアルキル残基、アルコキシル残基を表すことを特徴とする前記の請求項の少なくとも１つに記載の化合物。９．一般式ＩにおいてＷは、残基−ＯＳＯ₃Ｈまたは−ＳＯ₃Ｈ、60個までの炭素原子を含む非分岐、分岐、環式または多環式アルキル、アルケニル、ポリアルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリールまたはアリールアルキル残基であって、５個までのヒドロキシル基、３個までのカルボン酸基および少なくとも１個の−ＯＳＯ₃Ｈまたは−ＳＯ₃Ｈで置換された残基を表すことを特徴とする前記請求項の少なくとも１つに記載の化合物。 10．Ｆは、互いに独立に、エステル基、エーテル基、２級または３級アミノ基、アミド基、または次にあげる１つの基を通してＡ、Ｂ及び／またはＷと結合していることを特徴とする前記請求項の少なくとも１つに記載の化合物。 11．ＮＩＲ線を使用して神経変性症をインビボで診断するために請求項１に記載の化合物の利用。 12．ＮＩＲ線を使用して神経変性組織をインビトロで診断するための請求項１に記載の化合物の利用。 13．請求項１に記載の化合物の他に通常の支持物質と希釈剤を同時に含むことを特徴とする、ＮＩＲ線を使用して神経変性症をインビボで診断するための光学診断法。