JP2003527447A

JP2003527447A - 新規染料−ポリサッカライドコンジュゲート及びそれらの診断剤としての使用

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Publication number: JP2003527447A
Application number: JP2000539094A
Authority: JP
Inventors: ボジース，エルマー; ミヒャエルハイン，ハインツ; ライター，ルドルフ; ヨゼル，ハンス−ペーター
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1997-12-17
Filing date: 1998-12-17
Publication date: 2003-09-16
Also published as: EP0934986A1; US6689616B1; CA2315207A1; ES2187079T3; DE59806216D1; WO1999031183A1; ATE227324T1; EP1040168B1; EP1040168A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、特にヒトにおいて糸球体ろ過率を測定するための、新規染料−ポリサッカライド−又は−シクロサッカライド−コンジュゲート及びその診断剤としての使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、特にヒトにおいて糸球体ろ過率を測定するための、新規ポリサッカ
ライドコンジュゲート及びそれらの診断剤としての使用に関する。

【０００２】糸球体ろ過率は前臨床及び臨床状態において診断及び治療的処置のために極め
て重要である。なぜならそれは、腎機能障害の決定を許容するからである。糸球
体ろ過率（ＧＦＲ）は、ろ過だけされて、細管により分泌もされず、一次尿から
再吸収もされないいずれかの物質で測定することができる時間の単位当りの腎臓
の糸球体により生産される一次尿の量として理解される。

【０００３】用いるテスト物質のクリアランスは、糸球体ろ過率を定量するために検査され
る。クリアランスは、時間の単位（分）において腎臓により特定の（テスト）物
質が取り除かれる血漿の量（mL）をいう。このクリアランスを決定するために、現在、種々の方法が用いられている。こ
のため、内在性クレアチニンクリアランス、イヌリンクリアランス及び⁵¹Ｃｒ−
ＥＤＴＡ（Ｎａ₂ ⁵¹Ｃｒ−エチレンジアミンテトラアセテート）クリアランスが
重要になってきている。Ｘ線造影剤、例えばイオヘキソールも腎クリアランスを
測定するために用いられる。

【０００４】しかしながら、全ての列記した方法は深刻な欠点を有する。従って、クリアラ
ンスを決定するための各々の手順により、一定の血漿レベルを維持するため及び
／又は不快なカテーテル挿入により尿を収集するため及び／又はいくつかの血液
サンプルを採取するためにテスト物質を連続的に注入することが必要である。血
漿又は尿中のイヌリン濃度の測定は複雑な方法であり、比較的大きな誤差の余地
を有する。放射能標識物質の使用は生物にとって更なる負担であり、それゆえ、
出来る限り避けるべきである。

【０００５】いわゆるインプットクリアランスはクランクを決定する最もエレガントな方法
として考えられる。この場合、マーカーの排出は直接測定されず、むしろそのマ
ーカーの血漿濃度が一定に維持される。血漿濃度を一定に維持するために必要で
あるマーカーの要求される量は、腎臓により排出されるマーカーの量に、従って
クリアランスに相当する。これは、もちろん、現在放射能標識された物質によっ
てのみ達成することができる血漿濃度の連続的モニタリングを要求する。

【０００６】血漿濃度を連続的にモニターすることができるであろう非放射能標識マーカー
を用いるためにはかなりの改良があろう。更に、血液回収及び尿収集がマーカー
の濃度を決定するために要求されないであろう。それゆえ、本目的は、腎臓限外ろ過により完全に除去される非放射能標識マー
カーを見い出すことである。即ちそれは、細管により分泌も吸収もされず、その
血漿濃度は侵入的又は非侵入的方法により連続的に決定することができ、ここで
非侵入方法が好ましく、そしてその血漿濃度は特に経皮吸収測定により決定され
る。

【０００７】本発明は、全分子の血漿濃度もディテクターによる吸収測定により経皮的に測
定することができるように、染料に共有結合しているポリサッカライドを用いる
ことによりこの問題を解決する。このような化合物は既に文献に記載されている。従って、染料シバクロンブル
ーのアミロース、グルカン及びセルロースとのコンジュゲート(Anal. Biochem. 31 , 412 (1969); Acta Chem. Scand. 25，298 (1971)) ; Biochem. J. 87，90 (
1963) 、いわゆるブルーデキストラン(Anal. Biocehm. 39，202 (1971)及びアミ
ロースに連結した染料レマゾールブリリアントブルーＲ（Experientia 23，805
(1967)) がある。これら全ての染料−ポリサッカライドコンジュゲートにおいて
、ポリサッカライドはグルコース単位から構成されるポリサッカライドである。
しかしながら、これらは比較的迅速に代謝により分解され、それゆえ腎クリアラ
ンスを測定するために適さない。他方、このようなポリサッカライドは腎臓を介
しての糸球体ろ過のみによって排除されず、それゆえ、この理由のため腎クリア
ランスを測定するために適さない。

【０００８】本発明の範囲内で好ましくは用いられるポリサッカライドは、糸球体ろ過によ
って腎臓から排除されるイヌリン、レバン、アスパラゴシン、シニストリン、フ
ィブルリン、グラミニン、フレイン、ポアン、セカリン及びイリシンのようなポ
リフルクトサンである。これらは、そのいくつかは鎖の端にグルコース分子を有
する１０〜３０のフルクトース単位の鎖長を有する物質である。イヌリン型の又
はより水溶性のシニストリンのポリサッカライドが好ましくは用いられる。

【０００９】染料は、カルボキシル、ヒドロキシルスルホニル、アミノ、イソチオシアナト
又はイソシアナト基のような官能基を有するコンジュゲートの染料成分として用
いられる。これらの官能残基はポリサッカライドと直接反応させても、スペーサ
ーによりポリサッカライドに結合させてもよい。本発明に従って用いられるコンジュゲートの染料成分は、５００〜１３００nm
、好ましくは６００〜９００nmの範囲の吸収極大を有する。このために、フタロ
シアニン、フェナジン、フェノチアジン、フェノキサジン、ロダミン、アゾ、ト
リフェニルメタン及びシアニン染料並びにそれらの誘導体が特に適している。代
表的な染料は、例えばトリフェニルメタン、インドシアニン、オキサジン及びロ
ダミンである。

【００１０】従って、本発明は、一般式Ｉ：Ｆ−Ｘ−（スペーサー）_n−Ｙ−Ｅ−（ＣＨ₂）_m−ＰＳ（Ｉ）（式中、Ｆは５００〜１３００nm、好ましくは６００〜９００nmの吸収極大を
有する染料成分であり、ｎは０又は１であり、ｍは０又は１であり、ｎが０であるなら、Ｘは−ＣＯ，−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ，−ＮＨ−Ｃ＝Ｓ，−ＮＨ−
Ｃ＝ＮＨ，−ＣＯＮＨ−Ｃ＝Ｓであり、ｎが１であるなら、ＸはＮＨ，−ＣＯＮＨ，−ＳＯ₂ＮＨ，−ＮＨＣＯＮＨ，
−ＮＨＣＳＮＨであり、スペーサーは、ヒドロキシル基により任意に置換されたＣ₂−Ｃ₆アルキレン
基又は基：

【００１１】

【化３】

【００１２】（式中、ｐは０〜４でありＲ₁は水素であるか又はスルホン酸基である）であり、Ｙは原子価結合、−ＣＨ₂，−ＮＨＣＯＣＨ₂，−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ，−ＮＨ−Ｃ
＝Ｓ，−ＮＨ−Ｃ＝ＮＨであり、ＥはＯ又はＮＨであり、ＰＳはポリフルクトサンであり、そしてＥがＯでｍが０であるなら、そのポリ
サッカライドが結合している酸素原子は該ポリサッカライドの部分であり、そし
てＥがＮＨであるなら、それはアミノ化又はアミノアルキル化ポリフルクトサン
である）の化合物に関する。

【００１３】本発明の範囲内の好ましい化合物は、Ｘが−ＣＯ，−ＮＨ，−ＣＯＮＨ，−ＳＯ₂ＮＨ，−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ，−ＮＨ−
Ｃ＝Ｓであり、スペーサーがＣ₂−Ｃ₆アルキレン基又は基：

【００１４】

【化４】

【００１５】（式中、ｐは好ましくは０又は１であり、Ｒ₁は水素である）であり、ｎは０又は１であり、Ｙは原子価結合、−ＣＨ₂，−ＮＨ−ＣＯＣＨ₂，−ＮＨ−Ｃ＝Ｏであり、ｍは０又は１であり、Ｅは０又はＮＨであり、ＰＳは、好ましくは、シニストリンもしくはイヌリン残基、又はシニストリン
もしくはイヌリンのアミノ化もしくはアミノアルキル化誘導体である上述の全ての化合物である。

【００１６】特に、一般式Ｉの化合物は、Ｆがトリフェニルメタン、インドシアニン、オキ
サジン又はロダミン染料であり、Ｘが−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−基であり、スペー
サーがＣ₂−Ｃ₄残基であり、ｎが０又は１であり、ｍが０又は１であり、Ｙが
原子価結合、ＣＨ₂又は−ＮＨＣＯＣＨ₂であり、ＥがＯ又はＮＨであり、そし
てポリサッカライドがシニストリン、イヌリン又はシニストリンもしくはイヌリ
ンのアミノ化もしくはアミノアルキル化誘導体であるものが強調される。

【００１７】そのポリサッカライドは、染料と１回又は数回、反応させ、これにより異なる
占有率の程度を有することができる。水溶性を改善するために、一般式Ｉの化合物は、任意に後にポリサッカライド
単位上を誘導化することができる。このために、ポリサッカライド上の２−ヒド
ロキシプロピル又はカルボキシメチル基での誘導体が特に適切である。一般式Ｉ
の化合物は、１，４−ブタンスルホンのようなスルホンと反応させて水溶性を改
善することも過剰なアミノ基を中和することもできる。これらの物質は本発明の
対象でもある。

【００１８】一般式Ｉの物質は一般に知られている方法により、好ましくは、１．一般式II：Ｆ−Ｚ（II）（式中、Ｆは５００〜１３００nmの吸収極大を有する染料成分であり、Ｚは−ＮＣＯ，−ＮＣＳ，−ＮＣ＝ＮＨ，−ＣＯＮＣＳ又は基Ｇ−スペーサー
−ＮＣＯ，Ｇ−スペーサー−ＮＣＳ，Ｇ−スペーサー−ＮＣＮＨであり、ここで
ＧはＮＨ，−ＣＯＮＨ，−ＳＯ₂ＮＨ，−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ，−ＮＨ−ＣＳ−Ｎ
Ｈでありそしてスペーサーは上述の意味を有する）の染料誘導体を、一般式III ：ＨＯ−ＰＳ（III ）（式中、ＰＳ−ＯＨは上述のポリフルクトサンのうちの１つである）のポリフルクトサンと反応させることにより、又は２．一般式IV：Ｆ−Ｄ（IV）（式中、ＤはＮＨ₂又はＧ−スペーサー−ＮＨ₂基であり、ここでＦ₁Ｇ及び
スペーサーは上述の意味を有する）の染料誘導体を、一般式Ｖ：

【００１９】

【化５】

【００２０】（式中、ＰＳは上述の意味を有する）のポリフルクトサン誘導体と反応させることにより、又は３．一般式IV：Ｆ−Ｄ（IV）（式中、Ｆ及びＤは上述の意味を有する）の染料誘導体を、一般式VI：ＰＳ−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ（VI）（式中、ＰＳは上述の意味を有する）のポリフルクトサン誘導体と反応させることにより、又は４．一般式VII ：Ｆ−Ａ（VII ）：（式中、Ｆは上述の意味を有し、Ａは活性エステル基、例えばＮ−ヒドロキシ
スクシニミドエステル又はＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、アシル
クロライド又はスルホニルクロライド基である）の染料誘導体を、一般式VIIIａ又はVIIIｂ：Ｈ₂Ｎ−スペーサーＹ−Ｏ−ＰＳＨ₂Ｎ−（ＣＨ₂）_m−ＰＳ（VIIIａ）（VIIIｂ）（式中、スペーサー及びＰＳは上述の意味を有し、Ｙは原子価結合、−ＣＨ₂ ，−ＮＨＣＯＣＨ₂，−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ，−ＮＨ−Ｃ＝Ｓ，−ＮＨ−Ｃ＝ＮＨであ
りｍは０又は１である）のアミンと反応させることにより、調製することができる。

【００２１】一般式IIのイソシアネート誘導体は、 Chem. Pharm. Bull. 33，1164 (1985)
に記載されるように、対応するカルボン酸アジドの熱分解によりその場で調製さ
れる。一般式IIの染料−イソシアネート誘導体は、例えばMakromol. Chemie, 12 1 , 18 (1968) と同様に、一般式III のポリサッカライドと反応される。一般式IIのイソチオシアネートは、 Chem. Ber. 63, 888 (1930), J. Chem. S
oc. 125 , 1702 (1924) 又は Chem. Ber. 86, 314 (1953)と同様に、式Ｆ−ＮＨ ₂ （式中、Ｆは上述の意味を有する）のアミンから調製することができる。それ
らは、 Chem. Zentralblatt 1910, 910 又は Am. Chem. J. 22，464 又はJ. Am.
Chem. Soc. 65, 900 (1943)と同様に、一般式III のポリサッカライドと反応さ
れる。

【００２２】一般式IV（式中、ＤはＧ−スペーサー−ＮＨ₂基である）のアミンは文献にお
いて知られているか、又は知られた方法によって調製される。これにより、例え
ばＧがＣＯＮＨ又はＳＯ₂ＮＨであるなら、一般式：Ｆ−ＣＯ₂Ｈ又はＦ−ＳＯ ₃ Ｈ（式中、Ｆは上述の意味を有する）のカルボン酸又はスルホン酸は、対応す
る活性エステルを介して反応されるか、又は対応する酸クロライドは、一般式Ｈ ₂ Ｎ−スペーサー−ＮＨ₂（式中、スペーサーは上述の意味を有する）のジアミ
ンと適切な反応条件下で反応して一般式IVのアミドを形成する（これについては
、J. Med. Chem. 27，1481 (1984), J. Prakt. Chem. 130, 293 (1931), J. Med
. Chem. 34, 73 (1991) 及び Liebigs Ann. Chem. 1988，787 を参照のこと）。

【００２３】一般式Ｖのポリサッカライド誘導体は、ポリサッカライドをシアノーゲンブロ
マイドと反応させることにより調製される。このような化合物は、例えばNature 214 , 1302 (1967) 又は Eur. J. Biochem. 18, 351 (1971)に記載される。次の
一般式Ｉの化合物を形成するための一般式IVのアミン誘導体との反応は、とりわ
け、Carbohydrate Res. 20, 1 (1971)に記載される。一般式VIのポリフルクトサ
ン−酢酸はとりわけ Methods Carbohydr. Chem. ６, 384 (1972)及び Khim. Pri
r. Soedin 1969, 525 に記載される。

【００２４】一般式VIのポリフルクトサン−カルボン酸誘導体は、一般式IVのアミンと活性
化型において反応される。この場合、活性エステルは活性型として特に適してい
る。これにより、一般式VIのカルボン酸は、酢酸エチル、ジクロロメタン、テト
ラヒドロフラン又はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドのような不活性溶媒中でジシ
クロヘキシルカルボジイミドのような脱水剤の存在下でＮ−ヒドロキシスクシニ
ミド又はＮ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾールのようなアルコールと反応される
。この方法で調製された活性エステルは、次のトリエチルアミンのような有機塩
基の添加での反応に通常、用いられる。しかしながら、その反応は、特定の場合
、溶解度の理由のため好まれる水中でも極めてよく行うことができる。この場合
、Ｎ−エチル−Ｎ′（３−トリメチルアンモニオ−プロピル）カルボジイミドイ
オジドが好ましくはカルボジイミドとして用いられる。しかしながら、その反応
は、例えばＮ−ヒドロキシスクシニミドを添加することなくＮ−エチル−Ｎ′（
３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを用いても行うことができる。

【００２５】一般式VII の染料誘導体は、先の段落に記載される方法と同様に、又はその前
の段落と同様に、一般式VIIIａ及びVIIIｂのアミンと反応される。一般式VIIIａ
の化合物のいくつかは文献(Starch 48 (5), 191 (1996); J. Nucl. Med. 27, 51
3 (1986)) に記述される。しかしながら、それらは、一般式VIのポリフルクトサ
ン−酢酸を一保護化アルキレン−ジアミンと、先の段落に記載される方法と同様
に反応させることによって調製することもできる。この場合、カルボベンゾキシ
基は、水素で触媒的に直ちに開裂され得る保護基として特に適切である。

【００２６】一般式VIIIａのアミンは、ポリフルクトサンを、水素化ナトリウムと、不活性
溶媒、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で脱プロトン化し、次にそれを例
えばｐ−シアノベンジルブロマイドブアルホル化し、そしてこの方法で得られた
ニトリルを、メタノール水混合物中で濃アンモニアを添加したラネーニッケル又
はラネーコバルトの存在下で水素化することによって調製することもできる。ア
ルキル化は、例えば、２−ブロモエチルアミンで行ってＯ−アミノ−エチル−ポ
リサッカライドを得ることもできる(J. Nucl. Chem. 27, 513 (1986)) 。一般式
VIIIｂのアミンは以下の方法で調製することができる。塩基の存在下での不活性
溶媒、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中でのｐ−トルエンスルホクロライ
ドとのポリフルクトサンの反応はポリフルクトサンのｐ−トルエンスルホネート
を作り出し、その占有の程度は用いるｐ−トルエンスルホクロライドの量に依存
する。８０〜１００℃の温度でのＮ，Ｎ−ジメチル−ホルムアミドのような溶媒
中でのナトリウムアジドとのこのスルホン酸エステルの反応は対応するアジドを
作り出し、それから、炭化水素骨格上に直接、アミノ基を有する水素での触媒的
還元によりフルクトサンが形成される。このスルホン酸エステルが８０〜１００
℃の温度で例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中でナトリウムシアニドと反応
するなら、濃アンモニアの存在下でメタノール−水混合物中でのラネーニッケル
又はラネーコバルトでの接触水素化により還元されて要求される第一級アミンを
形成する対応するニトリルが得られる。この場合、炭化水素骨格はアミノメチル
基を有する。

【００２７】アミノ化又はアミノアルキル化ポリサッカライドを調製するための他の方法は
文献（例えばJ. Med. Chem. 31, 898 (1988)) に記載される。従って、ポリサッ
カライド中の１又はいくつかのヒドロキシル基は、適切な反応条件下で過ヨウ素
酸ナトリウムで酸化させてアルデビトを形成し、次にそれをアミンの存在下でシ
アノボロヒドリドで還元させてアルキル化アミンを形成することができる。この
場合、一保護化（monoprotected ）アルキレンジアミンが、好ましくはアミン成
分として用いられ、カルボベンゾキシ基が好ましくは保護基として用いられる。
次にこの保護基は溶媒として水中で一般に知られた条件下で触媒的に脱水素化す
ることができる。

【００２８】一般式Ｉの化合物は、次に、文献において知られている方法と同様に、クロロ
酢酸又はプロペンオキシドとの反応により、より水溶性の物質に変換することが
できる。これにより、ポリサッカライドのクロロ酢酸との反応は、とりわけ、Me
thods Carbohydr. Chem. 6, 384 (1972)又はMakromol. Chem. 122, 272 (1969)
に記載され、ポリサッカライドのプロペンオキシドとの反応は、Starch Chemist
ry and Technolosy, Academic Press New York (1984), R.L. Whistlerらに記載
される。

【００２９】一般式Ｉの本発明による化合物は、通常、静脈内に投与される。このため、安
定剤及び緩衝液のような注入物のための通常の添加物を含む１０〜２５％の等張
水溶液が用いられる。リン酸ナトリウム又はカリウム緩衝液が好ましくは緩衝液
として用いられる。等張溶液を得るために、塩化ナトリウム又はマンニトールが
添加される。溶液のpHは６．５〜８の間、好ましくはpH＝７〜７．５の間である
。一般式Ｉの本発明による化合物は、一回で０．１〜５ｇ、好ましくは０．２〜
２ｇの量で投与される。

【００３０】以下の例は、本発明による化合物を合成するために用いることができるいくつ
かの過程を示す。しかしながら、それらは本発明の内容を限定するものではない
。本化合物の構造は、¹Ｈ及び¹³Ｃ核磁気共鳴分光法によって確立した。更に、
調製したコンジュゲートはゲル浸透クロマトグラフィー（ＷａｔｅｒｓＣｏｍ
ｐａｎｙからのＵｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ ^TM２５０，７．８×３００mmカラ
ム；流速０．５mL／分；水）により検査した。この場合、ポリサッカライド及び
染料成分についてのλ_max値はｔと同じ時間に測定した。

【００３１】カップリングのために用いた染料

【００３２】

【化６】

【００３３】１の合成

【００３４】

【化７】

【００３５】ａ）エチルアクリレート、氷酢酸ｂ）ミヒラーケトン、ＰＯＣｌ₃ Ｎ−（２−エトキシカルボニル−エチル）−Ｎ−メチル−アニリン。Organiku
m, 1988, 17th edition, 334の方法に基づく。１．25.9ｇのＮ−（２−エトキシカルボニル−エチル）−Ｎ−メチル−アニリ
ン（１２５mmol）を、6.71ｇ（２５mmol）のミヒラーケトン及び９．２０ｇのホ
スホルオキシクロライド（６０mmol）と共に水浴中で３時間、加熱した。その混
合物を室温で一晩、撹拌し、５００mLの水を加え、それを苛性ソーダ（１００mL
の水中４００mmol）でアルカリ化した。次に１００mLの留出液を最初に蒸気で蒸
留して除いた。５０mLの水中１０ｇの苛性ソーダを加えた後、水蒸気中での蒸留
により更に１５０mLを除去した。茶色の沈殿物を吸引ろ過し、水で再び洗って、
９０℃で２０分、３００mLの１Ｎ塩酸と共に撹拌して高温ろ過した。その粗産物
を塩析し、水から再結晶化し（最初に油として沈殿させる）、塩化カルシウムで
真空下で乾燥させた。収率：８．５５ｇ（７３％）金属的緑色固体。

【００３６】１−ヒドロキシスクシニミドエステル：１．０ｇの１（１．７２mmol，１×Ｈ
Ｃｌについて計算）を２５mLの乾燥アセトニトリル中に０℃で溶かし、そして３
７５mg（２．５mmol）のＮ−ヒドロキシ−スクシニミド及び６７０mg（２．６mm
ol）のジシクロヘキシル−カルボジイミドを加えた。３０分後に冷却浴を除去し
、その混合物を２．５時間、室温で撹拌した。この方法で得られた溶液をろ過し
、更に粗形態で処理した。

【００３７】２の合成

【００３８】

【化８】

【００３９】ａ）３−（４−ヒドロキシフェニル）−プロピオン酸、ＮａＨ、ＤＭＦ２．５７３mg（３．４５mmol）の３−（４−ヒドロキシフェニル）−プロピオ
ン酸を０℃で５０mLのジメチルホルムアミド中６．９mmolの水素化ナトリウムに
加えた。その不均一な混合物を３０分、室温で撹拌し、次に２．００ｇ（３．０
０mmol）の固体ＡｌｄｒｉｃｈＩＲ７８０イオジドを加え、それを室温で一
晩、撹拌した。その全反応混合物を、シリカゲル／クロロホルムをパッキングし
たカラムに適用し、クロロホルムからクロロホルム：メタノール＝７０：３０の
移動溶媒勾配でクロマトグラフィーを行った。

【００４０】収率：１．４５ｇ（６１％）金属光沢を有する深緑色の固体２−ヒドロキシスクシニミドエステル：４１３mg（３．５９mmol）のＮ−ヒド
ロキシスクシニミドを５０mLの乾燥アセトニトリル中１．６０ｇ（２．３９mmol
）の２に加え、氷浴中で０℃に冷却した。７４１mg（３．５９mmol）のジシクロ
ヘキシルカルボジイミドを加え、その混合物を氷融浴中で一晩、撹拌した。その
反応混合物をろ過し、その溶媒を除去し、その残留物を真空下で乾燥させた。

【００４１】収率：１．４３ｇの粗産物、精製なしに更に処理した。実施例１１のＯ−アミノエチルイヌリンとのコンジュゲート１．００ｇのＯ−アミノエチルイヌリン（Ｍｒ約１７５ｎ，５．７１mmol；遊
離アミノ基の成分０．５７mmol）を２０mLの水に溶かし、アセトニトリル中の１ −ヒドロキシ−スクシニミドエステルの溶液（１０mL，０．６９mmol）（非活性
化酸に基づく含有量＝６９μmol ／mL）を３分以内に加えた。３時間後及び５時
間後に再び５mLの１−ヒドロキシスクシニミド溶液（０．３５mmol）を加え、そ
の混合物を室温で２日間、撹拌した。その溶液を減圧下で蒸留により除去し、そ
の残留物を真空下で乾燥させ、１５０mLのメタノールにとった。１５０mLのアセ
トンを加えた後に粗産物を沈殿させた。それを遠心して、アセトン中で２回、ス
ラリー化し、そして再び遠心した。精製のために、それを少量の水にとり、ろ過
し、そしてゲルカラム（ＢｉｏＲａｄＢｉｏ−Ｇｅｌ，Ｐ−２ｆｉｎｅ、カ
ラム２．５×６０cm、流速的１mL／分、溶離液：蒸留水）で２部でクロマトグラ
フィーを行った。

【００４２】収率：６３０mg、深紫色固体；及び１２分後に２０４及び５９０nmでλ_max イヌリンのアミノエチル化Ａ．ブロモエチルアミンとの反応

【００４３】

【化９】

【００４４】Ｂ．Ｎ−カルボベンゾキシ−ブロモエチルアミンを介する合成

【００４５】

【化１０】

【００４６】Ｏ−（アミノエチル）イヌリン。イヌリン（２．００ｇ、フルクトース単位を
引用して１２．３mmol）を約３０℃で乾燥ジメチルホルムアミド（３０mL）に溶
かし、水素化ナトリウム（２．２２ｇ、約４０％の油で湿潤、５５．５mmol）を
室温で加えた。３０分後にＮ−カルボベンゾキシ−２−ブロモエチルアミン（４
．７６ｇ，１８．４mmol）を加え、１００℃に加熱した。１５分以内に更なる４
．７６ｇのＮ−カルボベンゾキシ−２−ブロモエチルアミンを加え、その反応混
合物を１００℃で２．５時間、そして室温で一晩、撹拌した。氷浴中で冷却しな
がら等量の水を注意深く加え、塩化アンモニウム溶液（５mLの水中１．０７ｇ）
を加えた。その溶媒を減圧下での蒸留により除去し、その残留物を真空下で乾燥
させて２００mLの水にとった。それをジエチルエーテルと共に振とうし、その水
性相を約５mLに濃縮した（発生し得る沈殿はろ過により除去する）。

【００４７】それを、調製用ゲル浸透クロマトグラフィー（ＢｉｏＲａｄＢｉｏ−Ｇｅｌ
，Ｐ−２ｆｉｎｅ、カラム２．５×６０cm、流速約１mL／分溶離液：蒸留水
）により精製した。収率：１．７０ｇ。カルボベンゾキシ保護基の開裂：１５０mgのＮ−カルボベンゾキシ−アミノエチルイヌリンを１０mLの水にとり
、１mLのメタノール及び７５mgのパラジウム−炭素（Ｃｈｅｍｐｕｒ，Ｃ上に１
０％Ｐｄ）を加え、それを室温で２日間、標準圧力下で水素化した。ろ過により
触媒を除去し、そのろ液から溶媒を除去し、その残留物を真空下で乾燥させた。

【００４８】収率：１１１mg。実施例２ＪＡ２４３及びＯ−アミノエチルイヌリンのコンジュゲート２０mgのＯ−アミノエチルイヌリン（Ｍｒ約１７５mg，１１０μmol ）を０．
５mLの水に溶かし、５０℃に加熱した。この目的のため、１mLのアセトニトリル
中１０mgのＪＡ２４３−ヒドロキシスクシニミドエスルテ（１７．５μmol ；
ＥＰ０５４３３３３Ａ１に記載）の溶液２部を１時間の間隔で滴下して
加えた。更に３mgの固体染料−活性エステル（５．２μmol ）を４時間後に加え
、その混合物を室温で２０時間、撹拌した。その溶媒を減圧下での蒸留により除
去し、その残留物を真空下で乾燥させた。精製は、ゲル浸透クロマトグラフィー
（ＢｉｏＲａｄＢｉｏ−Ｇｅｌ，Ｐ２ｅｘｔｒａｆｉｎｅ、カラム１×２
０cm、溶離液：蒸留水）により行った。

【００４９】収率：１３mgの濃紺の固体；１２．５分後に２０４及び６６０nmのλ_max 実施例３ＪＡ１３３及びＯ−アミノエチルイヌリンのコンジュゲート７５０mgのＯ−アミノエチルイヌリン（Ｍｒ．約１７５ｎ，４．３mmol）を７
mlの水に溶かした。４mLのアセトニトリルを滴下して加えた。その透明な溶液を
４０℃に加熱して、２１０mg（０．２５mmol）の固体ＪＡ１３３−ＯＳｕを加
えた。１００μｌのＮ−メチルモルホリン及び２mLのアセトニトリルを２時間後
に加えた。その混合物を室温で２０時間、撹拌し、その間に、１３０mg（０．１
５mmol）のＪＡ１３３−ＯＳｕを３時間後に加えた。４５℃で５時間後に１０
０mg（０．１２mmol）のＪＡ１３３−ＯＳｕを再び加え、それを室温で一晩、
撹拌した。プロセッシングのため水を加え、それをクロロホルムと共に４回、振
とうした。その水溶液を３５℃で３時間、維持し、濃縮し、そしてゲルカラム（
ＢｉｏＲａｄＢｉｏ−Ｇｅｌ，Ｐ−２ｅｘｔｒａｆｉｎｅ、カラム２．５
×３５cm、流速約０．２mL／分、溶離液：蒸留水）でクロマトグラフィーを行っ
た。

【００５０】収率：４１５mg；１６分後に２０４及び６２１nmでのλ_max。実施例４２のＯ−（３−アミノプロピル）イヌリンのコンジュゲート１．００ｇのＯ−（３−アミノプロピル）イヌリン（Cosun Company Industri
al Inulin Derivatives)（カーボネート／ハイドロジェンカーボネート混合物、
占有率：０．６０アミノプロピル基／フルクトース単位）を室温で２０mLの水に
溶かし、１２．５mLのアセトニトリルを滴下して加えた。最初に１．１４ｇそし
て１時間後に更に０．１ｇの２−ヒドロキシ−スクシニミドエステルをこの溶液
に加えた。その反応混合物を一晩、撹拌し、２００mLの水を加え、そしてそれを
クロロホルムと共に３回、振とうした。その生成物をゲルカラム（ＢｉｏＲａｄ
Ｂｉｏ−Ｇｅｌ，Ｐ−２ｅｘｔｒａｆｉｎｅ、カラム２．５×２０cm、溶
離液：蒸留水）で予め精製し、次にクロマトグラフィー（同じ条件、カラム２．
５×４０cm）を行った。

【００５１】収率：６００mg 実施例５ＪＡ１３３及びＯ−（３−アミノプロピル）イヌリンのコンジュゲート７００mgのＯ−（３−アミノプロピル）イヌリンを室温で１４mLの水に溶かし
、濁りが続くまでアセトニトリルを滴下して加えた。０．５mLの水を加え、現在
透明である溶液を６９０mg（０．８２１mmol）の固体ＪＡ１３３−ＯＳＵと混
合した。その混合物を室温で一晩、撹拌し、２００mLの水を加え、それをクロロ
ホルムと共に３回、振とうした。その水性相をロータリーエバポレーターで蒸発
させ、少量の水にとり、ゲルカラム（ＢｉｏＲａｄＢｉｏ−Ｇｅｌ，Ｐ−２
ｅｘｔｒａｆｉｎｅ、ｃｏｌｕｍｎ２．５×３５cm、溶離液：蒸留水）でク
ロマトグラフィーを行った。

【００５２】収率：５５０mg 実施例６ＪＡ１３３の３ａとのコンジュゲート８μＬのＮ−エチルモルホリンを９０μＬの水及び３０μＬのアセトニトリル
中の４．４mgの３ａに加えた。８０μＬのアセトニトリル及び２４０μＬの水中
の４mgのＪＡ１３３−ＯＳｕの溶液をこれに加えた。６０μＬのアセトニトリ
ル及び１８０μＬの水中３mgのＪＡ１３３−ＯＳＵを２．５時間の間隔で６日
後に加えた。更に１日後に溶媒を除去し、それを１mLの水にとり、ゲルカラム（
ＢｉｏＲａｄＢｉｏ−Ｇｅｌ，Ｐ−２ｅｘｔｒａｆｉｎｅ、カラム２×１
３cm、溶離液：蒸留水）でクロマトグラフィーを行った。

【００５３】収率：１．５mg；２０４及び６２１nmのλ_max ３ａの合成

【００５４】

【化１１】

【００５５】ｎ＝２。１．９１ｇ（８．６７mmol）のカルボキシメチルイヌリンを１９mLの
２−モルホリノエタンスルホン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（pH４．７５）に溶
かした。３．３２ｇ（１７．３mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミドヒドロクロライド及び２．００ｇ（８．６７mmol）の
Ｎ−カルボベンゾキシ−ジアミノエタンヒドロクロライド（ＦＬＵＫＡ）を室温
で加えた。１時間後にそれを短く４０℃に加熱し、室温で一晩、撹拌した。更に
２．３９ｇ（１２．４mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル
）−カルボジイミドヒドロクロライドを加え、それを更に５時間、撹拌した。そ
の溶液を水酸化ナトリウム溶液でpH１１に調節した。その沈殿を分離し、その水
性層を８０mLのジクロロメタンと共に３回、振とうし、塩化ナトリウム水溶液（
トルエンを含む）に対して透析した。

【００５６】収率：８７０mg 保護基の開裂：３００mgのＮ−カルボベンゾキシ−保護化アミノイヌリン誘導体を５mLの水に
溶かし、５０mgの触媒（Ｃ上１０％パラジウム）を加え、それを５時間、４０mb
arで水素化した。その溶液をろ過し、凍結乾燥した。

【００５７】収率：１４３mg 実施例７ＪＡ２４３の３ａとのコンジュゲート１１μＬのＮ−エチルモルホリンを２５０μＬの水及び２５０μＬのアセトニ
トリル中６mgの３ａに加えた。各々５０μＬのアセトニトリル及び５０μＬの水
中の３．７mg及び３時間後に２．７mgのＪＡ２４３−ヒドロキシスクシニミド
エステル（ＥＰ０５４３３３３Ａ１に記載を、現在、透明であるその溶
液に滴下して加えた。８．２μＬのＮ−エチルモルホリンを加え、それを一晩、
撹拌した。その溶媒を除去した後、調製用ゲル浸透クロマトグラフィー（Ｂｉｏ
ＲａｄＢｉｏ−Ｇｅｌ，Ｐ−２ｅｘｔｒａｆｉｎｅ、カラム２×３０cm、
溶離液：蒸留水）によりその産物を単離することができた。

【００５８】収率：１．８mg；２０４及び６６０nmのλ_max 実施例８１の３ａとのコンジュゲート２５mLの水中の６００mgの３ａの溶液を１mLのＮ−エチルモルホリンと混合し
、２５mLアセトニトリル中の２．１５mmolの１−ヒドロキシスクシニミドエステ
ルを加えた。その混合物を一晩、撹拌し、更に２５mLのアセトニトリル中２．１
５mol の１−ヒドロキシスクシニミドエスルテを加えた。５時間後に、１００mL
の水を加え、それを５０℃に加熱し、室温で放置した。溶媒を除去し、残留物を
１００mLのメタノールで撹拌して取り、遠心した。その上清を捨てて、粗生成物
を２０mLの水にとり、調製用ゲル浸透クロマトグラフィーにより精製した（条件
については実施例７を参照のこと）。

【００５９】収率＝４２０mg；２０４及び５９０nmのλ_max 実施例９ＪＡ１３３の３ｂとのコンジュゲート３０mgの３ｂを０．３mLの水及び０．２mLのアセトニトリルの混合物に溶かし
、３８μＬのＮ−エチルモルホリンを加えた。この方法で得られた溶液を６０μ
Ｌの水及び４０μＬのアセトニトリル中の５mg（６μmol ）のＪＡ１３３−Ｏ
Ｓｕに室温で滴下して加えた。２．５時間後にその反応混合物を６０μＬの水及
び４０μＬのアセトニトリル中更に５mg（６μmol ）のＪＡ１３３−ＯＳｕに
滴下して加え、それを一晩、撹拌した。溶媒を除去し、残留物を真空下で乾燥さ
せた。それを０．２mLの水にとり、ゲルクロマトグラフィー（ＢｉｏＲａｄＢ
ｉｏ−Ｇｅｌ，Ｐ−２ｅｘｔｒａｆｉｎｅ、カラム２×３０cm、溶離液：蒸
留水）により精製した。

【００６０】収率：２５mg；２０４及び６２１nmのλ_max ３ｂの合成２０８mg（０．９５mmol）のカルボキシメルチイヌリンを２mLの０．２Ｍ２
−モルホリノエタンスルホン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（pH４．７５）に溶か
し、３６２mg（１．８９mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミドヒドロクロライドと混合した。そのpHを塩酸で４．７５に調
節し、２３１mg（０．９５mmol）のＮ−カルボベンゾキシ−ジアミノエタンヒド
ロクロライド（ＦＬＵＫＡ）を加え、そしてその混合物を室温で一晩、撹拌した
。そのpHを水酸化ナトリウム水溶液で４．７５に調節し、更に４時間後に中和し
た。その生成物溶液をジクロロメタンで抽出し、水に対して２日間、透析した。

【００６１】収率：１２６mg 保護基の開裂ｎ＝２と同じ手順で、１０２mgのＮ−カルボベンゾキシ−アミンから４６mgの
遊離アミンを得た。上述の化合物及び更に好ましい化合物を以下の表に列記する。

【００６２】

【化１２】

【００６３】

【化１３】

【手続補正書】

【提出日】平成１２年７月７日（２０００．７．７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【化１】（式中、ｐは０〜４でありＲ₁ は水素であるか又はスルホン酸基である）であり、Ｙは原子価結合、−ＣＨ₂ ，−ＮＨＣＯＣＨ₂ ，−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ，−ＮＨ−Ｃ
＝Ｓ，−ＮＨ−Ｃ＝ＮＨであり、ＥはＯ又はＮＨであり、ＰＳはポリフルクトサンであり、そしてＥがＯでｍが０であるなら、そのポリ
サッカライドが結合している酸素原子は該ポリサッカライドの部分であり、そし
てＥがＮＨであるなら、それはアミノ化又はアミノアルキル化ポリフルクトサン
である）の化合物。

【化２】（式中、ｐは０〜４でありＲ₁ は水素であるか又はスルホン酸基である）であり、Ｙは原子価結合、−ＣＨ₂ ，−ＮＨＣＯＣＨ₂ ，−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ，−ＮＨ−Ｃ
＝Ｓ，−ＮＨ−Ｃ＝ＮＨであり、ＥはＯ又はＮＨであり、ＰＳはポリフルクトサンであり、そしてＥがＯでｍが０であるなら、そのポリ
サッカライドが結合している酸素原子は該ポリサッカライドの部分であり、そし
てＥがＮＨであるなら、それはアミノ化又はアミノアルキル化ポリフルクトサン
である）の化合物。

【化３】（式中、ｐは０又は１であり、Ｒ₁ は水素である）であり、ｎは０又は１であり、Ｙは原子価結合、−ＣＨ₂ ，−ＮＨ−ＣＯＣＨ₂ ，−ＮＨ−Ｃ＝Ｏであり、ｍは０又は１であり、ＥはＯ又はＮＨであり、ＰＳは、シニストリンもしくはイヌリン残基、又はシニストリンもしくはイヌ
リンのアミノ化もしくはアミノアルキル化誘導体である請求項１又は２に記載の式Ｉの化合物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ハイン，ハインツミヒャエルドイツ連邦共和国，デー−64342 ゼーハイム−ユーゲンハイム，フリードリッヒ− エベルト−シュトラーセ 77 (72)発明者ライター，ルドルフドイツ連邦共和国，デー−69469 バインハイム，カイザーシュトラーセ 34 (72)発明者ヨゼル，ハンス−ペータードイツ連邦共和国，デー−82362 バイルハイム，プレーラテンベク７Ｆターム(参考） 4C085 HH13 KA26 KB79 LL11 4C090 AA02 AA09 BA42 BA43 BB15 BB34 BB52 BB77 BB92 DA12 DA25

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式Ｉ：Ｆ−Ｘ−（スペーサー）_n−Ｙ−Ｅ−（ＣＨ₂）_m−ＰＳ（Ｉ）（式中、Ｆは５００〜１３００nm、好ましくは６００〜９００nmの吸収極大を
有する染料成分であり、ｎは０又は１であり、ｍは０又は１であり、ｎが０であるなら、Ｘは−ＣＯ，−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ，−ＮＨ−Ｃ＝Ｓ，−ＮＨ−
Ｃ＝ＮＨ，−ＣＯＮＨ−Ｃ＝Ｓであり、ｎが１であるなら、ＸはＮＨ，−ＣＯＮＨ，−ＳＯ₂ＮＨ，−ＮＨＣＯＮＨ，
−ＮＨＣＳＮＨであり、スペーサーは、ヒドロキシル基により任意に置換されたＣ₂−Ｃ₆アルキレン
基又は基：【化１】（式中、ｐは０〜４でありＲ₁は水素であるか又はスルホン酸基である）であり、Ｙは原子価結合、−ＣＨ₂，−ＮＨＣＯＣＨ₂，−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ，−ＮＨ−Ｃ
＝Ｓ，−ＮＨ−Ｃ＝ＮＨであり、ＥはＯ又はＮＨであり、ＰＳはポリフルクトサンであり、そしてＥがＯでｍが０であるなら、そのポリ
サッカライドが結合している酸素原子は該ポリサッカライドの部分であり、そし
てＥがＮＨであるなら、それはアミノ化又はアミノアルキル化ポリフルクトサン
である）の化合物。
【請求項２】Ｘが−ＣＯ，−ＮＨ，−ＣＯＮＨ，−ＳＯ₂ＮＨ，−ＮＨ−
Ｃ＝Ｏ，−ＮＨ−Ｃ＝Ｓであり、スペーサーがＣ₂−Ｃ₆アルキレン基又は基：【化２】（式中、ｐは好ましくは０又は１であり、Ｒ₁は水素である）であり、ｎは０又は１であり、Ｙは原子価結合、−ＣＨ₂，−ＮＨ−ＣＯＣＨ₂，−ＮＨ−Ｃ＝Ｏであり、ｍは０又は１であり、ＥはＯ又はＮＨであり、ＰＳは、好ましくは、シニストリンもしくはイヌリン残基、又はシニストリン
もしくはイヌリンのアミノ化もしくはアミノアルキル化誘導体である請求項１に記載の式Ｉの化合物。
【請求項３】請求項１又は２に記載の化合物を含む診断剤。
【請求項４】ヒトにおいて糸球体ろ過率を測定するために用いられること
を特徴とする請求項３に記載の診断剤。
【請求項５】ヒトにおいて糸球体ろ過率を測定するための診断剤としての
請求項１又は２に記載の化合物の使用。
【請求項６】請求項１又は２に記載の染料を用いて糸球体ろ過率を測定す
るための方法であって、該染料の濃度がとびとびに又は連続的に測定されること
を特徴とする方法。
【請求項７】前記測定が、侵入的に行われないことを特徴とする請求項６
に記載の方法。