WO1998022146A2 - Optische diagnostika zur diagnostik neurodegenerativer krankheiten mittels nahinfrarot-strahlung (nir-strahlung) - Google Patents

Optische diagnostika zur diagnostik neurodegenerativer krankheiten mittels nahinfrarot-strahlung (nir-strahlung) Download PDF

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Wolfhard Semmler
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders

Definitions

  • NIR radiation near-infrared radiation
  • the invention relates to compounds for in vivo and in vitro diagnosis of neurodegenerative diseases by means of near infrared radiation (NIR radiation), the use of these compounds as optical diagnostics and diagnostic agents containing these compounds.
  • NIR radiation near infrared radiation
  • AD Alzheimer's disease
  • the incidence of AD increases with the age of the patient and reaches values of 40% -50% in the age group between 85 and 90 years.
  • AD can only be diagnosed post mortem with certainty by examining the brains of the patients during an autopsy.
  • the brains of Alzheimer's patients contain many characteristic amyloid plaques in the neural tissue and in the vicinity of blood vessels, which are surrounded by dystrophied neurites and neurofibrillary "tangles". Furthermore, the brains of Alzheimer's patients have a small number of synapses.
  • amyloid plaques consist inter alia of the amyloid- ⁇ -peptide (Aß), a fragment of the ⁇ -amyloid precursor protein (APP) consisting of 40 to 42 amino acids (Master, CL, Simms, G., Weinman, NA, et al. Amyloid plaque core protein in Alzheimer's disease and Down syndrome. Proc Natl Acad Sei USA 1985, 82: 4245-9; Kang, J., Lemaire, HG, Unterbeck, A. et al. The precursor of Alzheimer's disease amyloid A4 protein resembles a cell-sur- face receptor. Nature 1987, 325: 733-6).
  • the number of plaques does not correlate with the degree of advanced dementia, but is an early and reliable diagnostic for the occurrence of Alzheimer's disease. This leads to the hypothesis that the first deposits of Aß take place long before the manifestation of AD and before the first clinical symptoms appear (Hardy, L., Allsop, D., Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer ' s disease. Trends Pharmacol Sci 1991, 12: 383-8).
  • a method that quantitatively records the amyloid plaques early before the patient's death would have a major impact on further research into AD and on the development of new effective therapy concepts against AD.
  • AD amyloid plaques
  • the extent of AD is today only indirectly diagnosed on the basis of brain volume or brain areas affected by metabolic disorders (MRI and PET).
  • MRI and PET metabolic disorders
  • the serious disadvantage of these methods is the only indirect detection of AD, which is often associated with high statistical fluctuation ranges of the results.
  • the sensitivity of these methods to detection of direct detection of amyloid plaques can therefore be assessed as low.
  • both the detection of the non-absorbed radiation in the form of a transmission display and the fluorescence radiation emitted after irradiation with near-infrared light can provide tissue-specific information.
  • the object of the invention is therefore to provide new compounds which overcome the disadvantages of the prior art.
  • F is a dye signal molecule which has at least one absorption maximum in the range from 600 to 1200 nm
  • A is a biomolecule which binds to ⁇ -amyloid plaques
  • B is a dye which binds to ⁇ -amyloid plaques
  • W is a to ⁇ -amyloid -Plaques-binding hydrophilic, low-molecular structural element
  • n and o stands for an integer 3 - 20
  • n and n independently of one another represent a number 0, 1 or 2
  • o represents an integer 0, 1, 2, 3 or 4, with the proviso that the sum of 1, n and o is> 1
  • the compounds according to the invention attach to the amyloid plaques or constituents of the amyloid plaques, bind or accumulate there and thus to unify and Increase the absorption and fluorescence of these areas to be detected.
  • the in vivo detection of ⁇ -amyloid deposits using NIR radiation requires dyes as contrast agents which have a high absorption and fluorescence quantum yield in the wavelength range from 600 to 1200 nm and bind selectively to ⁇ -amyloid deposits.
  • Dyes from the class of the polymethines have absorption and fluorescence properties which are characterized by high molar absorption coefficients between 600 and 1200 nm and sufficient fluorescence quantum yields. Dyes in this class generally have high photostability.
  • fluorescent dyes are suitable for improving the differentiation between normal and diseased tissue, which accumulate in the diseased tissue or selectively bind to pathologically changed tissue components and have a specific absorption and emission behavior.
  • the compounds of the general formula I according to the invention bind to the ⁇ -amyloid plaques.
  • the change in the (scattered) incident light caused by absorption of the dye and / or the fluorescence induced by the excitation radiation is detected and provides the actual tissue-specific information which enables a statement about the degree of the pathogenic change.
  • such dyes are used as signal molecules F which are covalently linked to ⁇ -amyloid Structures that bind plaques are linked or are substituted with such structures.
  • Compounds of the general formula I according to the invention are those in which, for example, a) 1 and n are zero, m is one and o is 1-4, or b) n and o are zero, m is 3-20 and 1 is 1- 2 stands, or c) 1 and o mean zero, m stands for 1-2 and n stands for 1-2, provided that the sum of n and m is less than or equal to 3.
  • Preferred compounds of general formula I according to the invention are those in which F represents a cyanine, squarilium, croconium, merocyanine or oxonol dye.
  • R 1 to R 4 and R 7 to R 10 independently of one another for a fluorine, chlorine, bromine, iodine atom or a nitro group or for a radical -COOE 1 , -CONE 1 E 2 , -NHCOE 1 , -NHCONHE 1 , -NE ⁇ 2 , -OE 1 , -OSO3E 1 , -SO3E 1 , -SO2NHE 1 , -El, where E 1 and E 2 independently of one another represent a hydrogen atom, a saturated or unsaturated, branched or straight-chain Ci-Cso- alkyl chain, whereby the chain or parts of this chain against appropriate, one or more aromatic or saturated cyclic C5-C6 or bicyclic C can form 1 0 units, and wherein the C ⁇ _-C50-alkyl chain from 0 to 15 oxygen atoms and / or is interrupted by 0 to 3 carbonyl groups and / or is substituted by 0 to 5
  • R5 and R ⁇ independently of one another represent a radical -E 1 with the meaning given above or for a C ⁇ _- C4-sulfoalkyl chain, Q is a fragment
  • R 11 represents a hydrogen, fluorine, chlorine, bromine, iodine atom or a nitro group or a radical -NE ⁇ -E 2 , -OE 1 or -E 1 , where E 1 and E 2 have the meaning given above, stands,
  • R 12 represents a hydrogen atom or a radical E 1 with the meaning given above,
  • b represents a number 0, 2 or 3
  • R 1 ⁇ unc R14 independently of one another represent hydrogen, a saturated or unsaturated, branched or straight-chain Ci - Cio-alkyl chain which can be interrupted by up to 5 oxygen atoms and / or can be substituted by up to 5 hydroxyl groups, and the radicals R 1 ⁇ unc R 14 can be linked to form a 5- or 6-membered ring,
  • p is an integer 2 or 3
  • R 1 ⁇ and d R 2 0 independently of one another are a radical -COOE 1 , -CONE ⁇ 2 , -NHCOE 1 , -NHCONHE 1 , -NE ⁇ 2 , -OE 1 , -OS03H, - SO3H, -E ⁇ -, whereby E ⁇ and E 2 have the meaning given above, with the proviso that E 1 and E 2 are not simultaneously hydrogen atoms,
  • R 21 and R 22 independently of one another for a radical -E 1 with the meaning given above, for a C 1 -C 4 sulfoalkyl chain
  • R 19 , R 20 , R 21 , R 22 , E 1 or E 2 represent a bond to A, B or W with the meaning given above, represents.
  • E 3 represents a mono-, oligo- or polysaccharide with at least one radical -OSO3H,
  • R and R have the meaning given above, R and R independently of one another represent a phenyl ring which is monosubstituted to trisubstituted by hydroxyl, carboxy, sulfate, sulfonate, alkyl or alkoxy or carboxylic acid ester radicals,
  • Compounds of general formula I according to the invention are those in which A is, for example for antibodies, antibody fragments, specific peptides and proteins, receptors, enzymes, enzyme substrates, nucleotides, ribonucleic acids, deoxyribonucleic acids, lipoproteins, carbohydrates, mono-, di- or trisaccharides, linear or branched Oligosaccharides or polysaccharides or
  • Preferred peptides are the ⁇ -amyloid 1-40, 1-42 and 1-43, as well as partial structures and derivatives thereof.
  • the ⁇ -amyloids and partial structures of the ⁇ -amyloids which are modified with the amino acid cysteine are particularly preferred, the binding to the F taking place via the sulfhydryl group of the cysteine using a maleimido structure.
  • Monomeric aminosugars are, for example, glucosamine,
  • Amino sugar carboxylic acids are, for example, glucosamic acid, glucosaminuronic acid, muramic acid, trehalosamine, chondrosine and derivatives, chitotriose.
  • Preferred compounds of general formula I are those in which the bond to F between the amino group of the sugar and carboxy group of the dye to form an amide group.
  • Mono- to oligomeric saccharides are aldo- and ketotrioses to aldo- and ketoheptoses, ketooctoses and ketononoses, anhydro sugars, cyclites, amino and diamino sugars, deoxy sugars, aminodeoxy sugars, monocarboxylic acids, amino sugar carboxylic acids, aminocyclites, phosphorus-containing derivatives Mono- to oligomers.
  • polysaccharides are fucoidan, arabinogalactan, chondroitin and sulfates, dermatan, heparin, heparan, heparitin, hyaloronic acid, keratan, polygalacturonic acid, polyglucuronic acid, polymannuronic acid, inulin, polylactose, polylactosamine, aminosucoseopin, polyinosysyl acid, polyinosysyl acid, polyinosysyl acid, polyinosysyl acid, polyinosysyl acid, polyinosysyl acid, polyinosysyl acid, polyinosysyl acid, polyinosysyl acid, polyinosysyl acid, polyinosysyl acid, polyinosysyl acid, polyinosysyl acid, polyinosysyl acid, polyinosysyl acid, polyinosysyl acid, polyinosy
  • Particularly preferred mono-, oligo- and polysaccharides are sulfated or polysulfated structures.
  • Sulfated structures are, for example, glucosamine-3-sulfate, glucosamine-6-sulfate and those structures which are formed by sulfating with suitable reagents Mono-, di-, tri- to oligo- and polysaccharides described above can be obtained
  • Dye structures B are diazo dyes that are covalently bound to the signaling molecules. Suitable diazo dyes are, for example, Congo red, Chrysamine G, Evans
  • Preferred compounds of the general formula I are those in which B is a diazo dye of the general formula VIII
  • R! 5 and R! independently of one another with one or more hydroxy, carboxy, amino, sulfonic acid, alkoxycarbonyl, alkylamino, dialkylamino, alkoxy, with up to 6 carbon atoms in the alkyl radical, or arylsulfonyl groups with up to 9 carbon atoms in the aryl radical, substituted phenyl or naphthyl radical, or for a dye F, R 17 and R 18 independently of one another represent a hydroxyl, carboxy, sulfonic acid, alkyl, alkoxy radical having up to 6 carbon atoms.
  • Preferred compounds of the general formula I according to the invention are also those in which W represents a radical -OSO3H or -SO3H, an unbranched, branched, cyclic or polycyclic alkyl, alkenyl, polyalkenyl, alkynyl, aryl, Alkylaryl or arylalkyl radical with up to 60 carbon atoms, which is substituted with up to 5 hydroxyl groups, up to 3 carboxylic acid groups and at least one radical -OSO3H or -SO3H.
  • Preferred compounds according to the general formula I are those in which W denotes a sulfated structure which can be prepared by sulfating corresponding hydroxyl compounds.
  • Amino alcohols are suitable, for example, where the linkage has taken place between the amino group and the carboxy group of the dye to form an amide group and the hydroxyl groups are sulfated.
  • Examples of amino alcohols are 2-amino-1-ethanol, 3-amino-1-propanol, 4-amino-1-butanol, 5-amino-1-pentanol, 6-amino-1-hexanol, 3-amino-1, 2-propanediol, 2-amino-l, 3-propanediol, 3-amino-1, 2, 4-butanetriol, hydroxyaniline, 4-aminoresorcinol.
  • the signal molecule and the specifically binding structural unit are connected to one another via conventional functional groups.
  • groups are esters, ethers, secondary and tertiary amines, amides and the structures listed below
  • the compounds of the general formula I according to the invention are prepared by modifying polymethine dye base bodies which contain couplable functionalities (for example carboxyl, amino, hydroxyl groups) by the processes known to the person skilled in the art.
  • couplable functionalities for example carboxyl, amino, hydroxyl groups
  • the dye-biomolecule adducts according to the invention are prepared by reacting the dye with a biomolecule A using methods known from the literature.
  • the dyes must have reactive groups that can be coupled, or the dye must be activated by generating these groups in situ or beforehand.
  • Groups reactive towards amino and sulfhydryl groups of a biomolecule are, for example, N-hydroxysuccinimidyl esters, N-hydroxysuccinic acid imidyl ester 3 sulfate, isothiocyanates, isocyanates, maleimide, haloacetyl, vinyl sulfone groups.
  • the coupling is preferably carried out in an aqueous medium.
  • the degree of loading can be controlled by the stoichiometry and reaction time.
  • Literature Synth. Co mun. 23 (1993) 3078-94,
  • Another object of the present invention is the use of compounds of general formula I according to the invention for the in vivo diagnosis of neurodegenerative diseases by means of NIR radiation.
  • Another object of the present invention is the use of compounds of general formula I according to the invention for in vitro diagnostics.
  • tissue samples or biopsy samples are obtained and examined for their content of ⁇ -amyloid sheet structures.
  • the dyes of the invention bind selectively to the samples to be examined and allow an evaluation based on the specifically emitted fluorescence in the near-infrared spectral range.
  • the present invention further also relates to diagnostic agents for in vivo diagnostics, which contain compounds of the general formula I together with the customary auxiliaries and carriers and diluents.
  • one or more of the substances are added to the tissue when used for in vivo diagnostics, and light from the near-infrared spectral range is input. shine.
  • the non-absorbed, scattered light and / or the scattered fluorescent radiation emitted by the dye are registered simultaneously / individually.
  • Preferred are the methods in which the tissue is irradiated over a large area and the fluorescence radiation is displayed locally resolved by recording with a CCD camera or the tissue areas to be imaged are scanned with a light guide and the signals obtained are converted into a synthetic image by calculation.
  • the fluorescence can be evaluated spectrally and / or phase-selectively as well as stationary and / or time-resolved.
  • the particular advantage of the compounds according to the invention is that when stable dyes are used, the fluorescence signal can be generated and detected even after longer periods after application by excitation of the dye. There is a longer time window for diagnosis, as there are no limitations, for example due to decay half-lives.
  • the use according to the invention provides a non-invasive diagnostic method which enables the direct detection of the amyloid plaques in vivo.
  • the preparation is carried out analogously to Example 2, starting from 0.5 g (0.7 mmol) of 1,1 'bis (4-sulfo-butyl) indotricarbocyanine-5-carboxylic acid using 0.43 g (1.2 mmol) Chondrosin.
  • the reaction time is 5 hours.
  • the purification is carried out by means of HPLC (column: 250x20 mm, Nucleosil 100C18, 7 mm, eluent 50 mM phosphate buffer pH4 / MeOH, 5% to 95% MeOH in 60 min) with subsequent desalination on RP silica gel and freeze drying. Yield: 0.35 g (48%), blue lyophilisate
  • 0.2 g of maltotriose is stirred in 5 ml of a saturated ammonium bicarbonate at 30 ° C. for 7 days. To remove excess ammonium bicarbonate, the solution is repeatedly lyophilized to constant weight.
  • a solution of 0.1 g (0.14 mmol) of 1,1 'bis (4 -sulfobutyl) indotricarbocyanine-5-carboxylic acid and 15 mg of triethylamine in 5 ml of dimethylformamide is mixed with 0.05 g (0.15 mmol) O- (benzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N' -tetramethyl-uronium tetrafluoroborate (TBTU) are added and the mixture is stirred at room temp. for 30 min. touched. Then 0.14 g (0.28 mmol) of 1-amino-1-deoxy-maltotriose are added and a further 5 h at room temperature. touched.
  • TBTU tetramethyl-uronium tetrafluoroborate
  • heparin low molecular weight, M approx. 6000 g / mol, Sigma
  • sulfated 25 ° C for 3 h; yield 0.20 g
  • 0.10 g of partially de-N-sulfated, low molecular weight heparin are dissolved in 40 ml of phosphate buffer (0.1 M ⁇ aH 2 P0 4 / Na 2 HP0 4 , pH 8.3) with a solution of 0.12 g (0.15 mmol) of 1,1'-bis (4-sulfo-butyl) indotricarbocyanine-5-carboxylic acid-N-hydroxysuccinimidyl ester, sodium salt (see Example 1) in 4 ml of dimethylformamide and 2 h at room temperature. touched. It is cleaned by means of ultrafiltration with dist. Water (Centriprep 3000, Amicon), freeze-drying and 5-hour. Drying at 50 ° C in a high vacuum.
  • phosphate buffer 0.1 M ⁇ aH 2 P0 4 / Na 2 HP0 4 , pH 8.3
  • the binding assay was carried out on ⁇ A4-peptide-coated nitrocellulose membranes (cellulose nitrate membrane filter CN; 0.4 ⁇ m, from Schleicher & Schuell).
  • the membrane was coated in a dot blot chamber (from Strategagen).
  • the membrane and the blotting paper (GB002, from Schleicher & Schuell) were moistened with water and in TBST buffer (20 mM Tris / HCl pH7, 6; 127 M NaCl; 0.1% Tween 20; 0.01% NaN 3 ) equilibrated.
  • the laser-induced fluorescence images are carried out on an experimental fluorescence imaging system.
  • the excitation took place with monochromatic laser light with a wavelength of 740 nm by coupling out the radiation via an optical fiber system and homogeneous illumination of the cellulose membranes.
  • the reflected excitation light is blocked by an edge filter, the laser-induced fluorescent light above 740 nm is recorded with a CCD camera (Charge Coupled Device) and the data is saved as black and white images.
  • 1 to 2 show examples of fluorescence images of the membranes.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Verbindungen der allgemeinen Formel (I): Fm(-A1) (-Bn) (-Wo), worin F ein Farbstoff-Signalmolekül ist, welches mindestens ein Absorptionsmaximum im Bereich von 600 bis 1200 nm aufweist; A ein an β-Amyloid-Plaques bindendes Biomolekül ist; B ein an β-Amyloid-Plaques bindender Farbstoff ist; W ein an β-Amyloid-Plaques bindendes hydrophiles, niedermolekulares Strukturelement ist; sowie die Verwendung dieser Verbindungen zur In-vivo- und In-vitro-Diagnostik neurodegenerativer Krankheiten, wie der Alzheimerschen Krankheit, mittels Nahinfrarot-Strahlung (NIR-Strahlung) als Konstrastmittel in der Fluoreszenz- und Transilluminationsdiagnostik im NIR-Bereich und diese Verbindungen enthaltende diagnostische Mittel.

Description

Optische Diagnostika zur Diagnostik neurodegenerativer Krankheiten mittels Nahinfrarot-Strahlung (NIR-Strahlung)
Die Erfindung betrifft Verbindungen zur In-vivo- und In- vitro-Diagnostik neurodegenerativer Krankheiten mittels Nahinfrarot -Strahlung (NIR-Strahlung) , die Verwendung dieser Verbindungen als optische Diagnostika und diese Verbindungen enthaltende diagnostische Mittel .
Die Alzheimersche Krankheit (AD) ist die häufigste Form der fortgeschrittenen Demenz bei älteren Menschen. Die Häufigkeit des Auftretens der AD steigt mit dem Alter der Patienten und erreicht Werte von 40%-50% in der Alters- gruppe zwischen 85 und 90 Jahren. Die AD kann nur post mortem durch die Untersuchung der Gehirne der Patienten bei einer Autopsie mit Sicherheit diagnostiziert werden. Die Gehirne der Alzheimer-Patienten enthalten viele charakteristische Amyloid-Plaques im neuronalen Gewebe und in der Umgebung von Blutgefäßen, die von dystrophierten Neuriten und neurofibrilliären "Tangles" umgeben sind. Ferner weisen die Gehirne der Alzheimer Patienten eine geringe Zahl von Synapsen auf. Im fortgeschrittenen Stadium der Krankheit ist eine weitreichende Degeneration neuronaler Strukturen und eine signifikante Abnahme des Gehirnvolumens festzustellen (Wiesniewski, H.M., Weigel, J., Alzheimer' s disease neuropathology. Current Status of Interpretation of lesion development . Ann NY Acad Sei 1992, 673:270-84)
Die Amyloid-Plaques bestehen unter anderem aus dem Amy- loid-ß-Peptid (Aß) , einem aus 40 bis 42 Aminosäuren bestehenden Fragment des ß-Amyloid Vorläuferproteins (APP) (Master, C.L., Simms, G., Weinman, N.A. , et al . Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syn- drome . Proc Natl Acad Sei USA 1985, 82:4245-9; Kang, J., Lemaire, H.G., Unterbeck, A. etal . The precursor of Alzheimer' s disease amyloid A4 protein resembles a cell-sur- face receptor. Nature 1987, 325:733-6). Die Zahl der Plaques korreliert nicht mit dem Grad der fortgeschritte- nen Demenz, ist aber ein frühes und sicheres Diagnostikum für das Auftreten der Alzheimerschen Krankheit. Dies führt zur Hypothese, daß die ersten Ablagerungen von Aß lange vor der Manifestation der AD stattfinden und bevor die ersten klinischen Symptome auftreten (Hardy, L., All- sop, D., Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer' s disease. Trends Pharmacol Sei 1991, 12 :383-8) .
Eine Methode, die aber die Amyloid-Plaques quantitativ vor dem Tod des Patienten frühzeitig erfaßt, hätte großen Einfluss auf die weitere Erforschung der AD und auf die Entwicklung von neuen wirksamen Therapiekonzepten gegen die AD.
Zum gegenwärtigen Zeitpunkt existiert kein direkter Nachweis der Amyloid-Plaques in den Gehirnen der AD-Patien- ten. Das Ausmaß der AD wird heute nur indirekt anhand des Gehirnvolumens oder von Stoffwechselstörungen betroffener Gehirnbereiche (MRT und PET) diagnostiziert. Der gravie- rende Nachteil dieser Methoden ist aber der nur indirekte Nachweis der AD, welcher oft mit hohen statistischen Schwankungsbreiten der Ergebnisse verbunden ist. Die Nachweisempfindlichkeit dieser Methoden gegenüber einem direkten Nachweis der Amyloid-Plaques ist daher als ge- ring einzuschätzen.
Es sind mehrere Verfahren zur Durchstrahlung und bildgebenden Diagnose von biologischen Geweben mit langwelligen Licht des Wellenlängenbereiches von 600 bis 1200 nm (Nah- Infrarot-Diagnostik) bekannt. Da biologisches Gewebe eine relativ hohe Durchlässigkeit für langwelliges Licht die- ses Spektralbereiches besitzt, steht dem Diagnostiker hiermit neben den modernen bildgebenden Verfahren, wie Röntgen, Magnetresonanztomographie oder Ultraschalldiagnostik, ein weiteres Verfahren zur bildlichen Gewebedar- Stellung zur Verfügung (Haller, E.B. Time-resolved tran- sillumination and optical tomography. J Biomed Optics 1996, 1:7-17) . Die Verwendung von NIR-Strahlung zur ortsabhängigen Aufzeichnung von Blutfluß und Oxygenierungs- grad im Gehirn von Säuglingen durch die Detektion der Ab- Sorption von Hämoglobin/Deoxyhämoglobin ist ein seit Jahren bekanntes und angewandtes Verfahren (Jöbsis, F.F., Noninvasive infrared monitoring of cerebral and myocar- dial oxygen sufficiency and circulatory parameters . Science 1977, 198:1264-67; Chance, B., Leigh, J.S., Miyake, H. et al . Comparison of time-resolved and - unresolved measurements of deoxyglobin in brain. Proc Natl Acad Sei USA 1988, 85:4971-75; Benaron D.A. et al . Optical time-of-flight and absorbance imaging of biological media. Science 1993, 33: 369A.).
In der Nah- Infrot -Diagnostik kann sowohl die Detektion der nicht absorbierten Strahlung in Form einer Transmissionsdarstellung als auch die nach Bestrahlung mit nahinfrarotem Licht emittierte Fluoreszenzstrahlung gewebe- spezifische Informationen liefern.
Das wesentliche Problem bei der Nutzung von nahinfraroter Strahlung ist die starke Steuung des Lichtes, so daß selbst bei unterschiedlichen photophysikalischen Eigen- Schäften von einem scharf begrenzten Objekt und seiner
Umgebung sich dieses Objekt nur unscharf abzeichnet. Das Problem nimmt mit wachsender Entfernung des Objektes von der Oberfläche zu und kann als hauptsächlicher limitierender Faktor sowohl bei der Transillumination als auch bei der Detektion von Fluoreszenzstrahlung angesehen werden. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, neue Verbindungen zur Verfügung zu stellen, welche die Nachteile des Standes der Technik überwinden.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß Verbindungen der allgemeinen Formel I
Fm(-Al) (-Bn) (- 0) ( I )
worin
F ein Farbstoff -Signalmolekül ist, welches mindestens ein Absorptionsmaximum im Bereich von 600 bis 1200 nm aufweist , A ein an ß-Amyloid-Plaques bindendes Biomolekül ist, B ein an ß-Amyloid-Plaques bindender Farbstoff ist, W ein an ß-Amyloid-Plaques bindendes hydrophiles, niedermolekulares Strukturelement ist,
m für die Zahl 1 oder 2 steht oder, mit der Maßgabe, daß n und o Null bedeuten, für eine ganze Zahl 3 - 20 steht ,
1 und n unabhängig voneinander für eine Zahl 0, 1 oder 2 stehen, o für eine ganze Zahl 0, 1, 2, 3 oder 4 steht, mit der Maßgabe, daß die Summe aus 1, n und o > 1 ist
sowie deren physiologisch verträgliche Salze.
zur Verfügung gestellt werden.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß sich die erfindungsgemäßen Verbindungen an die Amyloid-Plaques oder Bestandteile der Amyloid-Plaques lagern, binden oder dort anreichern und damit zu einer Vereinheitlichung und Erhöhung der Absorption und Fluoreszenz dieser zu detektierenden Areale führen.
Die In-vivo-Detektion von ß-Amyloid-Ablagerungen unter Verwendung von NIR-Strahlung erfordert Farbstoffe als Kontrastmittel, die im Wellenlängenbereich von 600 bis 1200 nm eine hohe Absorption und Fluoreszenzquantenausbeute besitzen und selektiv an ß-Amyloid-Ablagerungen binden.
Farbstoffe aus der Klasse der Polymethine besitzen Ab- sorptions- und Fluoreszenzeigenschaften, die durch durch hohe molare Absorptionskoeffizienten zwischen 600 und 1200 nm und hinreichende Fluoreszenzquantenausbeuten cha- rakterisiert sind. Farbstoffe dieser Klasse verfügen in der Regel über eine hohe Photostabilität.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß zur Verbesserung der Differenzierung zwischen normalem und erkranktem Ge- webe Fluoreszenzfarbstoffe geeignet sind, die sich im erkrankten Gewebe anreichern oder an pathologisch veränderten Gewebebestandteilen selektiv binden und ein spezifisches Absorptions- und Emissionsverhalten besitzen.
In der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise gefunden, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I an die ß-Amyloid-Plaques binden. Die durch Absorption des Farbstoffes bewirkte Änderung des (gestreuten) eingestrahlten Lichtes und/oder die durch die Anregerstrahlung induzierte Fluoreszenz wird detek- tiert und liefert die eigentlichen gewebespezifischen Informationen, die eine Aussage über den Grad der patho- genen Veränderung ermöglichen.
Erfindungsgemäß werden solche Farbstoffe als Signalmoleküle F verwendet, die kovalent mit selektiv an ß-Amyloid- Plaques bindende Strukturen verknüpft bzw. mit derartigen Strukturen substituiert sind.
Erfindungsgemäße Verbindungen der allgemeinen Formel I sind solche, in denen beispielsweise a) 1 und n Null bedeuten, m für eins und o für 1-4 steht, oder b) n und o Null bedeuten, m für 3-20 und 1 für 1-2 steht, oder c) 1 und o Null bedeuten, m für 1-2 und n für 1-2 steht, unter der Maßgabe, daß die Summe aus n und m kleiner gleich 3 ist.
Bevorzugt sind erfindungsgemäße Verbindungen der allge- meinen Formel I, in denen F für einen Cyanin- , Squa- rilium-, Croconium- , Merocyanin- oder Oxonolfarbstoff steht .
Besonders bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel I, in denen F für einen Cyanin-, Squarilium- oder Croconiumfarbstoff der allgemeinen Formeln II - IV
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000009_0001
worin
R1 bis R4 und R7 bis R10 unabhängig voneinander für ein Fluor-, Chlor-, Brom-, Iodatom oder eine Nitro- gruppe oder für einen Rest -COOE1, -CONE1E2, -NHCOE1, -NHCONHE1, -NE^2, -OE1, -OSO3E1, -SO3E1, -SO2NHE1, -El, wobei E1 und E2 unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom, eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder geradkettige Ci-Cso-Alkyl- kette, wobei die Kette oder Teile dieser Kette gegenbenenfalls eine oder mehrere aromatische oder gesättigte zyklische C5-C6- oder bizyklische C10 -Einheiten formen können, steht, und wobei die Cτ_-C50-Alkylkette von 0 bis 15 Sauerstoffatomen und/oder von 0 bis 3 Carbonylgruppen unterbrochen ist und/oder mit 0 bis 5 Hydroxygruppen substituiert ist, stehen, und wobei jeweils benachbarte Reste Ri - R4 und/oder R7 - Rio unter Bildung eines sechgliedrigen aromatischen Kohlenstoffringes miteinander verknüpft sein können, oder für eine Bindung an A, B oder W stehen,
R5 und R^ unabhängig voneinander für einen Rest -E1 mit der oben angegebenen Bedeutung oder für eine Cτ_- C4-Sulfoalkylkette stehen, Q ein Fragment
R11 R11
I I
Figure imgf000010_0001
worin
R11 für ein Wasserstoff-, Fluor-, Chlor-, Brom-, Iodatom oder eine Nitrogruppe oder einen Rest -NE^-E2, -OE1 oder -E1, wobei E1 und E2 die oben angegebene Bedeutung haben, steht,
R12 für ein Wasserstoffatom oder einen Rest E1 mit der oben angegebenen Bedeutung steht,
b eine Zahl 0, 2 oder 3 bedeutet, darstellt ,
X und Y unabhängig voneinander O, S, -CH=CH- oder ein Fragment
C^R14 worin
R1^ unc R14 unabhängig voneinander für Wasserstoff, eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder geradkettige Ci - Cio-Alkylkette, die durch bis zu 5 Sauerstoffatome unterbrochen und/oder mit bis zu 5 Hydroxygruppen substituiert sein kann, stehen, und wobei die Reste R1^ unc R14 unter Ausbildung eines 5- oder 6-gliedrigen Ringes miteinander verknüpft sein können, bedeuten,
steht .
Insbesondere bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel I, in denen F einen Cyaninfarbstoff der allgemeinen Formel V
Figure imgf000011_0001
worin p eine ganze Zahl 2 oder 3 bedeutet,
X und Y unabhängig voneinander für O, S, -CH=CH- oder C(CH3)2 stehen,
R1^ und R20 unabhängig voneinander einen Rest -COOE1, -CONE^2, -NHCOE1, -NHCONHE1, -NE^2 , -OE1, -OS03H, - SO3H, -E^-, wobei E^ und E2 die oben angegebene Bedeutung haben, mit der Maßgabe, daß E1 und E2 nicht gleichzeitig Wasserstoffatome sind, darstellen,
R21 und R22 unabhängig voneinander für einen Rest -E1 mit der oben angegebenen Bedeutung, für eine C1-C4- Sulfoalkylkette
oder R19, R20, R21, R22, E1 oder E2 für eine Bindung an A, B oder W mit der oben angegebenen Bedeutung stehen, darstellt .
Insbesondere bevorzugt sind ferner Verbindungen der allgemeinen Formel I, in denen F einen Cyaninfarbstoff der allgemeinen Formel VI
Figure imgf000012_0001
worin p, X, Y, R21 und R22 die oben angegebene Bedeutung haben,
R23 für -OE3, -COOE3, -CONHE3, -CONH (CH2 ) ι_6-NHE3 , - CONH(CH2)ι-6-OE3, -CONH (CH2 ) ι-6-COOE3 oder - CONH (CH2) 1-6 -CONHE3 steht, worin
E3 für ein Mono-, Oligo- oder Polysaccharid mit mindestens einem Rest -OSO3H steht,
darstellt .
Insbesondere bevorzugt sind außerdem Verbindungen der allgemeinen Formel I, in denen F einen Oxonolfarbstoff der allgemeinen Formel VII,
Figure imgf000012_0002
worin
R und R die oben angegebene Bedeutung haben, R und R unabhängig voneinander für einen einfach bis dreifach mit Hydroxy- , Carboxy- , Sulfat-, Sulfo- nat, Alkyl- oder Alkoxy- oder Carbonsäureesterresten substituierten Phenylring stehen,
darstellt .
Erfindungsgemäße Verbindungen der allgemeinen Formel I sind solche, in denen A beispielsweise für Antikörper, Antikörperfragmente, spezifische Peptide und Proteine, Rezeptoren, Enzyme, Enzymsubstrate, Nukleotide, Ribonukleinsäuren, Desoxyribonukleinsäuren, Lipoproteine, Kohlenhydrate, Mono-, Di- oder Trisaccharide, lineare oder verzweigte Oligo- oder Polysaccharide oder
-saccharidderivate oder für ein Dextran steht.
Bevorzugte Peptide sind das ß-Amyloid 1-40, 1-42 und 1- 43, sowie Teilstrukturen und Derivate derselben. Beson- ders bevorzugt sind die ß-Amyloide und Teilstrukturen der ß-Amyloide, die mit der Aminosäure Cystein modifiziert sind, wobei die Bindung zum F über die Sulfhydrylgruppe des Cysteins mittels einer Maleimidostruktur erfolgt.
Monomere Aminozucker sind beispielsweise Glucosamin,
Galaktosamin, Mannosamin, Gulosamin, Fucosamin, 3-Amino- 3-desoxy-ribose, Kanosamin, Mycosamin, Mycaminose, Desos- amin, Rhodosamin, 6-Amino-6-desoxy-glucose, Neosamin, Pa- romose . Aminozucker-carbonsäuren sind beispielsweise Glucosamin- säure, Glucosaminuronsäure, Muraminsäure , Trehalosamin, Chondrosin und -derivate, Chitotriose.
Bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel I, in denen die Bindung an F zwischen Aminogruppe des Zuckers und Carboxygruppe des Farbstoffes unter Bildung einer Amidgruppe erfolgt ist.
Bevorzugt sind außerdem Verbindungen der allgemeinen For- mel I mit Mono-, Di-, Tri- und Oligosacchariden für A, dessen glycosidische Hydroxygruppe in eine Aminogruppe übergeführt wurde, wobei die Kopplung an eine Carboxygruppe des Farbstoffes F unter Bildung einer Amidgruppe erfolgt ist .
Mono- bis oligomere Saccharide sind Aldo- und Ketotriosen bis Aldo- und Ketoheptosen, Ketooktosen und Ketononosen, Anhydrozucker , Cyclite, Amino- und Diaminozucker , Desoxy- zucker, Aminodesoxyzucker, Monocarbonsäurezucker, Amino- zucker-carbonsäuren, Aminocyclite, Phosphor-enthaltende Derivate der Mono- bis Oligomere.
Beispiele für geeignete Polysaccharide sind Fucoidan, Arabinogalactan, Chondroitin und -sulfate, Dermatan, He- parin, Heparan, Heparitin, Hyaloronsäure, Keratan, Poly- galacturonsäure, Polyglucuronsäure, Polymannuronsäure, Inulin, Polylactose, Polylactosamin, Polyinosinsäure, Po- lysucrose, Amylose Amylopektin, Glycogen, Nigeran, Pullulan, Asparagosin, Sinistrin, Sitosin, Galactocaolose , Lu- teose, Galactan, Mannane, Guaran, Glucomannane , Galacto- glucomannane, Phsophomannane , Fucane, Pektine, Cyclodex- trine und die chemisch und/oder enzymatisch hergestellten Derivate, Abbau- und Spaltprodukte der hochmolekularen Verbindungen .
Besonders bevorzugte Mono- , Oligo- und Polysaccharide sind sulfatierte bzw. polysulfatierte Strukturen.
Sulfatierte Strukturen sind bespielsweise Glucosamin-3 - sulfat, Glucosamin-6-sulfat und solche Strukturen, die sich durch Sulfatierung mit geeigneten Reagenzien aus den oben beschriebenen Mono-, Di-, Tri- bis Oligo-, sowie Po- lysacchariden erhalten lassen
Sulfatierungen beispielsweise nach Jaurand, G., et al . , Carbohydrate Research 1994, 255:295-301; Böcker, T., et al . , Carbohydrate Research, 1992, 230: 245-256.
Erfindungsgemäß selektiv an ß-Amyloid-Plaques bindende
FarbstoffStrukturen B sind Diazofarbstoffe, die kovalent an die Signalmoleküle gebunden sind. Geeignete Diazofarb- Stoffe sind beispielsweise Kongorot, Chrysamin G, Evans
® Blue, Chicago Sky Blue 6B, Direct Red -Farbstoffe, Direct
Yellow -Farbstoffe, Ponceau -Farbstoffe, Reactive Black
5, Calcion.
Bevorzugte Verbindungen der allgemeinen Formel I sind solche, in denen B einen Diazofarbstoff der allgemeinen Formel VIII
Figure imgf000015_0001
worin
R!5 und R! unabhängig voneinander für einen mit einer oder mehreren Hydroxy- , Carboxy- , Amino-, Sulfon- säure-, Alkoxycarbonyl- , Alkylamino-, Dialkylamino- , Alkoxy- , mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen im Alkylrest, oder Arylsulfonylgruppen, mit bis zu 9 Kohlenstoff- atomen im Arylrest, substituierten Phenyl- oder Naph- thylrest , oder für einen Farbstoff F, steht, R17 und R18 unabhängig voneinander für einen Hydroxy-, Carboxy- , Sulfonsäure- , Alkyl-, Alkoxyrest, mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, stehen, darstellt .
Bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen der allgemeinen Formel I sind ferner solche, in denen W für einen Rest -OSO3H oder -SO3H, einen unverzweigten, verzweigten, cy- clischen oder polycyclischen Alkyl-, Alkenyl-, Polyalke- nyl-, Alkinyl-, Aryl-, Alkylaryl- oder Arylalkylrest mit bis zu 60 C-Atomen, welcher mit bis zu 5 Hydroxygruppen, bis zu 3 Carbonsäuregruppen und mindestens einem Rest -OSO3H oder -SO3H substituiert ist, steht.
Bevorzugt sind solche Verbindungen nach der allgemeinen Formel I, in denen W eine sulfatierte Struktur bedeutet, die sich durch Sulfatierung entsprechender Hydroxyverbin- dungen darstellen läßt.
Geeignet sind beispielsweise Aminoalkohole, wobei zwischen Aminogruppe und Carboxygruppe des Farbstoffes unter Bildung einer Amidgruppe die Verknüpfung erfolgt ist und die Hydroxygruppen sulfatiert sind. Beispiele für Aminoalkohole sind 2-Amino-l-ethanol , 3 -Amino-1-propanol, 4- Amino-1-butanol , 5-Amino-l-pentanol, 6-Amino-l-hexanol , 3-Amino-l, 2-propandiol, 2-Amino-l , 3-propandiol , 3-Amino- 1, 2 , 4-butantriol, Hydroxyaniline, 4-Aminoresorcin.
Signalmolekül und spezifisch bindende Struktureinheit sind über übliche funktioneile Gruppen miteinander verbunden. Solche Gruppen sind beispielsweise Ester, Ether, sekundäre und tertiäre Amine , Amide und im folgenden aufgeführte Strukturen
Figure imgf000017_0001
Die Darstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I erfolgt durch Modifikation von Poly- methinfarbstoff-Grundkörpern, welche koppelbare Funktionalitäten (z. B. Carboxyl-, Amino- , Hydroxylgruppen) enthalten, nach den dem Fachmann bekannten Verfahren.
Diese Gruppen werden entsprechend unter Erhalt der Struktur der Ausgangsverbindungen, in an sich bekannter Weise durch Reaktion mit entsprechenden Substituenten modifiziert .
Die Synthese der Polymethinfarbstoff-Grundkörper erfolgt nach literaturbekannten Methoden, beispielsweise F.M. Ha- mer in The Cyanine Dyes and Related Compounds, John Wiley and Sons, New York, 1964; Cytometry. 10, (1989), 3-10; 11 (1990) 418-430; 12 (1990) 723-30; Bioconiugate Chem . 4 (1993) 105-11, Anal. Biochem. 217 (1994) 197-204, Tetrahedron 45 (1989) 4845-66, EP-0 591 820 AI, . Org . Chem . 60 (1995) 2361-95.
Die Darstellung der erfindungsgemäßen Farbstoff-Biomole- kül-Addukte (1 ungleich Null in der allgemeinen Formel I) erfolgt durch Umsetzung des Farbstoffes mit einem Biomolekül A nach literaturbekannten Methoden. Die Farbstoffe müssen dazu koppelbare Reaktivgruppen besitzen bzw. muß der Farbstoff durch Generierung dieser Gruppen in-situ oder zuvor aktiviert werden. Gegenüber Amino- und Sulfhy- drylgruppen eines Biomoleküls reaktive Gruppen sind beispielsweise N-Hydroxysuccinimidylester, N-Hydroxy-succin- imidylester-3 -sulfat , Isothiocyanate, Isocyanate, Male- imid- , Halogenacetyl- , Vinylsulfongruppen . Die Kopplung erfolgt vorzugsweise in wäßrigem Medium. Der Beladungs- grad ist dabei durch die Stöchiometrie und Reaktionszeit steuerbar. Literatur: Synth. Co mun. 23 (1993) 3078-94,
DE-OS 3912046, Cancer Immuno1. Immunother. 41 (1995) 257- 263, Cancer Research 54 (1994) 2643-49.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I zur In-vivo-Diagnostik neurodegenerativer Krankheiten mittels NIR-Strahlung .
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I zur In-vitro-Diagnostik.
Dazu werden Gewebeproben oder Biopsieproben gewonnen und auf ihren Gehalt an ß-Amyloid-Faltblattstrukturen untersucht werden.
Überraschenderweise binden die erfindungsgemäßen Farbstoffe selektiv an die zu untersuchenden Proben und erlauben eine Auswertung anhand der spezifisch emittierten Fluoreszenz im nahinfraroten Spektralbereich.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner auch diagnostische Mittel zur In-vivo-Diagnostik, welche Verbindungen der allgemeinen Formel I zusammen mit den üblichen Hilfs- und Trägerstoffen sowie Verdünnungsmitteln enthalten.
Erfindungsgemäß wird dem Gewebe bei der Verwendung zur In-vivo-Diagnostik eine oder mehrere der Substanzen, vor- zugsweise intrathekal, intralumbal oder intravenös, zugeführt und Licht aus nahinfraroten Spektralbereich einge- strahlt. Das nicht absorbierte, gestreute Licht und/oder die vom Farbstoff emittierte, gestreute Fluoreszenzstrahlung werden gleichzeitig/einzeln registriert. Bevorzugt sind die Methoden, bei denen das Gewebe großflächig be- strahlt und die Fluoreszenzstrahlung örtlich aufgelöst durch Aufnahme mit einer CCD-Kamera dargestellt wird oder die abzubildenden Gewebeareale mit einem Lichtleiter abgerastert und die erhaltenen Signale rechnerisch in ein synthetisches Bild umgesetzt werden. Darüberhinaus kann die Fluoreszenz spektral und/oder phasenselektiv sowie stationär und/oder zeitaufgelöst ausgewertet werden.
Der besondere Vorteil der erfindungsgemäßen Verbindungen beispielsweise gegenüber radiodiagnostischen Verfahren liegt darin, daß bei Verwendung stabiler Farbstoffe das Fluoreszenzsignal auch nach längeren Zeiträumen nach Applikation durch Anregung des Farbstoffes erzeugt und de- tektiert werden kann. Es steht ein längeres Zeitfenster für die Diagnose zur Verfügung, da Limitationen bei- spielsweise durch Zerfallshalbwertszeiten nicht vorhanden sind.
Mit der erfindungsgemäßen Verwendung wird eine nicht in- vasive diagnostische Methode zur Verfügung gestellt, die den direkten Nachweis der Amyloid-Plaques in-vivo ermöglicht .
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 :
Darstellung von N- (2 , 3-Disulfato) propyl-1 , 1 ' -Bis- (4-Sul- fobutyl) indotricarbocyanin-5-carbonsäureamid, Trinatriumsalz 1) 1,1' -Bis- (4-sulfobutyl) indotricarbocyanin- 5 -carbonsäure-N-hydroxysuccinimidylester, Natriumsalz
Zu einer Lösung von 0,5 g (0,7 mmol) 1 , 1 ' -Bis- (4-sulfo- butyl) indotricarbocyanin- 5-carbonsäure und 0,1 g (0,9 mmol) N-Hydroxysuccinimid in 30 ml wasserfreiem DMF werden bei 0 °C unter Argon 0,15 g (0,75 mmol) N,N' -Dicyclo- hexylcarbodiimid in 5 ml getropft . Es wird 72 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das Lösemittel im Hochvakuum bei 40 °C bis auf ca. 5 ml abgedampft und der Rückstand mit 200 ml Diethylether verrührt. Nach Dekantieren des Ethers vom ausgefallenen Niederschlag wird erneut mit 5 ml Dimethylformamid versetzt und der beschriebene Vorgang wiederholt . Der erhaltene Niederschlag wird im Hochvakuum getrocknet und bei -20 °C unter Argon aufbewahrt . Ausbeute: 0,55 g (97%), tiefblaues Pulver
2) N- (2, 3-Dihydroxy)propyl-l, 1 ' -bis- (4 -sulfobutyl) - indotricarbocyanin- 5 -carbonsäureamid, Natriumsalz
0,5 g (0,61 mmol) 1 , 1 ' -Bis- (4-sulfobutyl) indotricarbocyanin- 5 -carbonsäure-N-hydroxy-succinimidylester in 20 ml Dimethylformamid werden mit einer Lösung von 0,15 g (0,92 mmol) 2-Aminomethyl-5, 5-dimethyl-l, 3 -dioxolan-hydrochlo- rid und 0,1 g (1,1 mmol) Triethylamin in 20 ml Dimethyl- formamid versetzt und 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Aufarbeitung erfolgt wie oben beschrieben. Das Roh- produkt wird in 30 ml Wasser/MeOH/Essigsäure (3:1:2) 18 h bei Raumtemperatur gerührt und die Lösung direkt einer chromatographischen Reinigung unterzogen (Europrep, 60-30 C18, 60A, 20-45 μ, Laufmittel : Wasser / Methanol). Ausbeute: 0,25 g (52%), blaues Lyophilisat 3 ) N- ( 2 , 3 -Disulfato) propyl - l , 1 ' -bis - (4 - sulf obutyl ) - indotricarbocyanin- 5 -carbonsäureamid , Trinatriumsalz
0,25 g (0,32 mmol) N- (2 , 3 -Dihydroxy) ropyl- 1 , 1 ' -Bis- (4 - sulfo-butyl) indotricarbocyanin-5-carbonsäureamid werden zusammen mit 0,22 g (1,6 mmol) Schwefeltrioxid-Trimethyl- amin-Komplex in 15 ml Dimethylformamid 48 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird eingedampft, mit Ether verrührt und der ausgefallene Feststoff chroma- togaphisch gereinigt (Europrep, 60-30 C18, 60A, 20-45 μ, Laufmittel: 0,5-proz. NaCl-Lösung/Methanol) . Ausbeute: 0,20 g (64%), blaues Lyophilisat
Figure imgf000021_0001
λmax, Absorption ( H 20 ) = 74 6 nm λmax , Fluoreszenz ( H20 ) = 78 0 nm
Beispiel 2 :
Bis-1 , 1 ' - (4 -Sulfobutyl) indotricarbocyanin- 5-carbonsäure- α-D-glucosamid-3 ' ' -sulfat , Dinatriumsalz (2)
Zu einer Lösung von 0,5 g (0,7 mmol) 1 , 1 ' -Bis- (4-sulfo- butyl) indotricarbocyanin-5-carbonsäure und 0,1 g (1,0 mmol) Triethylamin in 20 ml wasserfreiem Dimethylformamid werden 0,23 g (0,7 mmol) Benzotriazol-1-yl-N, N, N' , N ' - tetramethyluronium-tetrafluoroborat (TBTU) gegeben. Nach 30 min Rühren bei Raumtemp. werden eine Lösung von 0,36 g (1,4 mmol) α-D-Glucosamin-3 -sulfat und 0,15 g (1,5 mmol) Triethylamin in 25 ml wasserfreiem Dimethylformamid zugetropft. Es wird weitere 3 h bei Raumtemp. gerührt, das Lösemittel im Hochvakuum bei 40°C abgedampft und der Rückstand mit Diethylether verrührt. Der gebildete Feststoff wird abfiltriert und chromatographisch an RP-Kie- selgel Europrep, 60-30 C18, 60A, 20-45 μ, Stufengradient 100% 0,5-proz. NaCl-Lsg. -> 90% 0,5-proz. NaCl-Lsg / 10% Methanol -> 90% Wasser / 10% Methanol -> 50% Methanol) gereinigt und abschließend gefriergetrocknet. Ausbeute: 0,51 g (76%), blaues Lyophilisat
Figure imgf000022_0001
λ,max, Absorption !H?0) 745 nm λ-max, Fluoreszenz (H20) - 779 nm
Beispiel 3 :
Bis-1 , 1 ' - (4-Sulfobutyl) indotricarbocyanin- 5 , 5 ' -dicarbon- säure-di-α-D-glucosamid-di-3 ' ' -sulfat , Trinatriumsalz ( 3 [
Die Darstellung und Reinigung erfolgt analog Beispiel 2 ausgehend von 0,5 g (0,66 mmol) 1 , 1 ' -Bis- (4-sulfo- butyl) indotricarbocyanin-5 , 5 ' -dicarbonsäure, 0,2 g (2,0 mmol) Triethylamin in 25 ml Dimethylformamid, Zugabe von 0,43 g (1,32 mmol) TBTU sowie 0,69 g (2,64 mmol) α-D- Glucosamin-3-sulfat und 0,3 g (3 mmol) Triethylamin in 30 ml Dimethylformamid. Ausbeute: 0,56 g (66%), blaues Lyophilisat
Figure imgf000023_0001
max, Absorption (H,0) 754 nm max, Fluoreszenz (H20) = 790 nm
Beispiel 4 :
N-Chondrosin-Bis-1, 1 ' - (4-Sulfobutyl) indotricarbocyanin- 5- carbonsäureamid, Natriumsalz (4)
Die Darstellung erfolgt analog Beispiel 2 ausgehend von 0,5 g (0,7 mmol) 1, 1 ' -Bis- (4-sulfo-butyl) indotricarbocyanin- 5 -carbonsäure unter Verwendung von 0,43 g (1,2 mmol) Chondrosin. Die Reaktionszeit beträgt 5 h. Die Reinigung erfolgt mittels HPLC (Säule: 250x20 mm, Nucleosil 100C18, 7 mm, Eluens 50 mM Phospat-Puffer pH4 / MeOH, 5% auf 95% MeOH in 60 min) mit anschließender Entsalzung an RP-Kieselgel und Gefriertrocknung. Ausbeute: 0,35 g (48%), blaues Lyophilisat
Figure imgf000023_0002
λmaχ, Absorption (H20) = 746 nm
^max, Fluoreszenz (H20) = 779 nm
Beispiel 5 : Maltotriose-Indotricarbocyanin-Addukt
1) Darstellung von 1-Amino-l-deoxy-Maltotriose
0,2 g Maltotriose werden in 5 ml einer gesättigten Ammo- niumhydrogencarbonat 7 Tage bei 30°C gerührt. Zur Entfernung überschüssigen Ammoniumhydrogencarbonats wird die Lösung bis zur Gewichtskonstanz mehrfach lyophilisier .
2) Kopplung mit 1 , 1 ' -Bis- (4-sulfobutyl) indotricarbocyanin- 5 -carbonsäure
Eine Lösung von 0,1 g (0,14 mmol) 1 , 1 ' -Bis- (4 -sulfo- butyl) indotricarbocyanin- 5 -carbonsäure und 15 mg Triethylamin in 5 ml Dimethylformamid wird mit 0,05 g (0,15 mmol) O- (Benzotriazol-1-yl) -N,N,N' ,N' -tetramethyl-uroni- umtetrafluoroborat (TBTU) versetzt und 30 min bei Raumtemp. gerührt. Anschließend werden 0,14 g (0,28 mmol) 1- Amino-1-deoxy-Maltotriose zugegeben und weitere 5 h bei Raumtemp. gerührt. Nach Entfernen des Dimethylformamids bei 40°C im Hochvakuum wird der Rückstand mit Ether verrührt, abfiltriert und chromatographisch gereinigt (Europrep, 60-30 C18, 60A, 20-45 μ, Laufmittel: Wasser / Methanol) . Ausbeute nach Gefriertrocknung 50%.
Figure imgf000024_0001
λmaχ, Absorption (H 20) = 748 nm λmaχ, Fluoreszenz (H20) = 779 nm Beispiel 6 :
Heparin- Indotricarbocyanin-Addukt
0,25 g Heparin (niedermolekular, M ca. 6000 g/mol, Fa. Sigma) werden in Anlehnung an Nagasawa K. und Inoue Y. (Methods in Carbohydrate Chemistry Vol. III, 1980, 291- 294) partiell de-N-sulfatiert (25°C für 3 h ; Ausbeute 0,20 g) . 0,10 g partiell de-N-sulfatiertes, niedermolekulares Heparin werden in 40 ml Phosphatpuffer (0,1 M ΝaH2P04/ Na2HP04, pH 8,3) mit einer Lösung von 0,12 g (0,15 mmol) 1,1' -Bis- (4-sulfo-butyl) indotricarbocyanin- 5 -carbonsäure- N-hydroxysuccinimidylester, Natriumsalz (siehe Beispiel 1) in 4 ml Dimethylformamid versetzt und 2 h bei Raumtemp. gerührt. Es erfolgt eine Reinigung mittels Ultrafiltration mit dest. Wasser (Centriprep 3000, Fa. Ami- con) , Gefriertrocknung und 5-stdg. Trocknung bei 50°C im Hochvakuum .
Schwefelgehalt (Bestimmung mittels ICP-AES)
S(%) Heparin 11,55
S(%) partiell de-N-sulfatiert 10,02
S(%) nach Labeling mit Farbstoff 10,89
λmax, bsorption (H20) = 750 nm λmax, Fluoreszenz (H20) = 782 nm
Beispiel 7:
Indotricarbocyanin-Cys-ß-Amyloid-Addukte
1) Darstellung von N- [3 - (3-Maleimidobenzoyl) aminopropyl] - bis-1 , 1 ' - (4-sulfobutyl) indotricarbocyanin-5-carbonsäu- reamid, Natriumsalz 1,1' -Bis- (4-sulfobutyl) indotricarbocyanin-5-carbonsäure wird in Anlehnung an bekannte Literaturverfahren durch Umsetzung mit 3 -Aminopropyl-t-butylcarbamat , Freisetzung der Aminogruppe durch saure Spaltung mit Trifluoressig- säure und Umsetzung mit 3 -Maleimidobenzoesäurechlorid in o. g. Verbindung übergeführt.
2a) Labeling von Cys-ß-Amyloid (1-40]
Alle Lösungsmittel sind durch Sättigung mit Argon vom Sauerstoff befreit.
10 mg lyophilisiertes Cys-ß-Amyloid (1-40) werden in 1 ml Phosphatpuffer pH 7,8 / DMF (2 : 1-Gemisch) gelöst und mit 10 mg N- [3- (3-Maleimidobenzoyl) aminopropyl] -bis-1, 1 ' - (4 - sulfobutyl) indotricarbocyanin-5-carbonsäureamid, Natriumsalz versetzt. Es wird 3 h bei Raumtemp. gerührt, mit 5 ml Wasser verdünnt und die Lösung lyophilisiert . Reinigung mittels HPLC (Säule: Merck Select B, 5 μ; Lauf- mittel : Wasser + 0,05% Trifluoressigsäure, Acetonitril) ergibt 4 mg Produkt .
Figure imgf000026_0001
IIGLM VGGW
λmaX ι Absorption (H20 ) = 747 nm λmaχ, Fluoreszenz ( H20 ) = 780 nm
2b) Labeling von Cys-ß-Amyloid (12-20] Die Umsetzung wird analog 2a) durchgeführt. 5 mg Cys-ß- Amyloid (12-20) werden mit 10 mg Farbstoff versetzt und 2,5 h bei Raumtemp. gerührt. Man erhält 6 mg Produkt nach Reinigung durch HPLC .
Figure imgf000027_0001
Beispiel 8
Bindungsassay zur Messung der Bindung der Farbstoff-Kon- strukte an ßA4-Peptid durch Fluoreszenzdetektion
1) Herstellung der ßA4-Peptid-beschichteten Membranen und Inkubation mit ßA4 -bindenden Farbstoff-Konstrukten
Der Bindungsassay erfolgte an ßA4-Peptid-beschichteten Nitrocellulosemembranen (Cellulosenitrat-Membranfilter CN; 0,4 μm, Fa. Schleicher&Schuell) . Die Beschichtung der Membran erfolgte in einer Dot-Blot-Kammer (Fa. Strata- gene) . Die Membran und das Blotting Papier (GB002, Fa. Schleicher&Schuell) wurde mit Wasser befeuchtet und in TBST-Puffer (20 mM Tris/HCl pH7 , 6 ; 127 M NaCl ; 0,1% Tween 20; 0,01% NaN3) äquilibriert . Aus einer Lösung von ßA4-Peptid in Wasser (2 mg/ml) wurden 10, 5 und 2,5 μg Peptid in 0,2 ml TBST-Puffer auf die Membran appliziert. Nach 15 min. Inkubation wurde die Peptidlösung durch die Membran gesaugt, mit 0,2 ml TBST- Puffer nachgespült, die Membran aus der Dot-Blot -kammer entfernt und 30 min bei 37°C getrocknet. Vor der Inkubation mit Farbstoffen wurde die getrocknete Membran unter leichtem Schütteln für zwei Stunden mit TBST-Block-Puffer (TBST, s. o . ; 5% Milchpulver) inkubiert und anschließenden 5 min mit TBST-Puffer gewaschen. Die Inkubation mit Farbstoffen erfolgte durch leichtes Schütteln der Membranen in 0,0005 - 0,05 %igen Lösungen des Farbstoffes in TBST. Danach wurde fünfmal mit TBTS- Puffer gewaschen, die Membran bei Raumtemp. getrocknet und eingeschweißt .
2) Auswertung mittels Fluoreszenzdetektion
Die laserinduzierten Fluoreszenzaufnahmen werden an einem experimentellen Fluoreszenzbildgebungssystem durchgeführt. Die Anregung erfolgte mit monochromatischen Laserlicht der Wellenlänge 740 nm durch Auskopplung der Strahlung über ein Lichtleitersystem und homogene Ausleuchtung der Cellulosemembranen . Das reflektierte Anregungslicht wird durch einen Kantenfilter abgeblockt, das laserinduzierte Fluoreszenzlicht oberhalb 740 nm mit einer CCD-Kamera (Charge Coupled Device) aufgenommen und die Daten als Schwarz-Weiß-Bilder gespeichert. In Fig. 1 bis 2 sind Beispiele für Fluoreszenzaufnahmen der Membranen gezeigt.
Fig. 1:
Fluoreszenzaufnahme der Cellulosemembran nach Inkubation mit Bis-1 , 1' - (4-Sulfobutyl) indotricarbocyanin, Natriumsalz (0, 005% Lsg. ) . Anregungswellenlänge 740 nm, Detektion > 780 nm 1: 2,5 μg ß-Amyloid (1-42 ) 2 : 5 μg ß-Amyloid ( 1-42 ) 3: 10 μg ß-Amyloid ( 1-42 ) 4 : Kontrollpeptide mit ähnlichen Bindungseigenschaften an die Cellulosemembran Fig. 2:
Fluoreszenzaufnahme der Cellulosemembran nach Inkubation mit 4- [5- [3-Carboxy-3-hydroxy-l- (4-sulfophenyl) -lH-pyra- zol-4-yl] -2, 4-pentadienyliden] -4 , 5-dihydro-5-oxo-l- (4- sulfobutyl) -lH-pyrazol-3-carbonsäure, Dikaliumsalz (0, 005% Lsg. )
Anregungswellenlänge 650 nm, Detektion > 680 nm 5: 2,5 μg ß-Amyloid (1-42 ) 6 : 5 μg ß-Amyloid (1-42 ) 7: 10 μg ß-Amyloid ( 1-42 )
8 : Kontrollpeptide mit ähnlichen Bindungseigenschaften an die Cellulosemembran

Claims

Patentansprüche
1. Verbindungen der allgemeinen Formel I
Fm(-Al) (-Bn) (-W0) ( I )
worin
F ein Farbstoff-Signalmolekül ist, welches mindestens ein Absorptionsmaximum im Bereich von 600 bis 1200 nm aufweist,
A ein an ß-Amyloid-Plaques bindendes Biomolekül ist, B ein an ß-Amyloid-Plaques bindender Farbstoff ist, W ein an ß-Amyloid-Plaques bindendes hydrophiles, niedermolekulares Strukturelement ist,
m für die Zahl 1 oder 2 steht oder, mit der Maßgabe, daß n und o Null bedeuten, für eine ganze Zahl 3 - 20 steht , 1 und n unabhängig voneinander für eine Zahl 0, 1 oder 2 stehen, o für eine ganze Zahl 0, 1, 2, 3 oder 4 steht, mit der Maßgabe, daß die Summe aus 1, n und o > 1 ist
sowie deren physiologisch verträgliche Salze.
2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel I
F für einen Cyanin-, Squarilium-, Croconium- , Merocyanin- oder Oxonolfarbstoff steht.
3. Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel I
F für einen Cyanin-, Squarilium- oder Croconiumfarb- stoff der allgemeinen Formeln II - IV
Figure imgf000031_0001
worin
R1 bis R4 und R7 bis R10 unabhängig voneinander für ein Fluor-, Chlor-, Brom-, Iodatom oder eine Nitro- gruppe oder für einen Rest -COOE1, -CONE1^2, -NHCOE1, -NHCONHE1, -NE^2, -OE1, -OSO3E1, -SO3E1, -SO2NHE1, -El, wobei E1 und E2 unabhängig voneinander für ein Wasserstof atom, eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder geradkettige Ci-Cso-Alkyl- kette, wobei die Kette oder Teile dieser Kette gegenbenenfalls eine oder mehrere aromatische oder gesättigte zyklische C5-C6- oder bizyklische Cio -Einheiten formen können, steht, und wobei die Ci-Cso-Alkylkette von 0 bis 15 Sauerstoffatomen und/oder von 0 bis 3 Carbonylgruppen unterbrochen ist und/oder mit 0 bis 5 Hydroxygruppen substitu- iert ist, stehen, und wobei jeweils benachbarte Reste Ri - R4 und/oder R7 - Rχo unter Bildung eines sechgliedrigen aromatischen Kohlenstoffringes miteinander verknüpft sein können, oder für eine Bindung an A, B oder W stehen,
R^ und R^ unabhängig voneinander für einen Rest -E1 mit der oben angegebenen Bedeutung oder für eine Ci- Cj-Sulfoalkylkette stehen,
Q ein Fragment
R11 R11
I I
CH- C= CH— = CH- C= C— C= CH"
'-(CH2)b-'
Figure imgf000032_0001
worin
R11 für ein Wasserstoff-, Fluor-, Chlor-, Brom- Iodatom oder eine Nitrogruppe oder einen Rest -NE^2, -OE1 oder -E1, wobei E1 und E2 die oben angegebene Bedeutung haben, steht,
R12 für ein Wasserstoffatom oder einen Rest E1 mit der oben angegebenen Bedeutung steht,
b eine Zahl 0, 2 oder 3 bedeutet, darstellt ,
X und Y unabhängig voneinander 0 , S , - CH=CH- oder ein Fragment
Figure imgf000033_0001
worin
R1^ und R^4 unabhängig voneinander für Wasserstoff, eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder geradkettige Ci - Cio-Alkylkette, die durch bis zu 5 Sauerstoffatome unterbrochen und/oder mit bis zu 5 Hydroxygruppen substituiert sein kann, stehen, und wobei die Reste R1^ uncj R14 unter Ausbildung eines 5- oder 6-gliedrigen Ringes miteinander verknüpft sein können, bedeuten,
steht
4. Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn- zeichnet, daß in der allgemeinen Formel I
F einen Cyaninfarbstoff der allgemeinen Formel V
Figure imgf000033_0002
worin p eine ganze Zahl 2 oder 3 bedeutet,
X und Y unabhängig voneinander für O, S, -CH=CH- oder C(CH3)2 stehen, R19 und R20 unabhängig voneinander einen Rest -COOE1, -CONE^2, -NHCOE1, -NHCONHE1, -NE^-E2 , -OE1, -OSO3H, -SO3H, -E1, wobei E1 und E2 die oben angegebene Bedeutung haben, mit der Maßgabe, daß E1 und E2 nicht gleichzeitig Wasserstoffatome sind, darstellen,
R21 und R22 unabhängig voneinander für einen Rest -E1 mit der oben angegebenen Bedeutung, für eine C1-C4-Sulfoalkylkette
oder R19, R20, R21, R22, E1 oder E2 für eine Bindung an A, B oder W mit der oben angegebenen Bedeutung stehen,
darstellt .
5. Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel I F einen Cyaninfarbstoff der allgemeinen Formel VI
Figure imgf000034_0001
worin p, X, Y, R21 und R22 die oben angegebene Bedeutung haben,
R23 für -OE3, -COOE3, -CONHE3, -CONH (CH2 ) 1-6- NHE3, -CONH(CH2)ι-6-OE3, -CONH (CH2) 1-6-COOE3 oder -CONH(CH2) 1-6-CONHE3 steht, worin E3 für ein Mono-, Oligo- oder Polysaccharid mit mindestens einem Rest -OSO3H steht, darstellt .
Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel I F einen Oxonolfarbstoff der allgemeinen Formel VII,
Figure imgf000035_0001
worin p, R ,1"9 und R ,20 die oben angegebene Bedeutung haben,
R und R unabhängig voneinander für einen einfach bis dreifach mit Hydroxy- , Carboxy- , Sulfat- , Sulfonat, Alkyl- oder Alkoxy- oder Carbonsäureesterresten substituierten Phenylring stehen,
bedeutet
7. Verbindungen nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel I A für Antikörper, Antikörperfragmente, spezifische Peptide und Proteine, Rezeptoren, Enzyme, Enzymsubstrate, Nukleotide, Ribonukleinsäuren, Desoxyribonukleinsäuren, Lipoproteine, Kohlenhydrate, Mono-, Di- oder Trisaccharide, lineare oder verzweigte Oligo- oder Polysaccharide oder -saccharidderivate oder für ein Dextran steht .
8. Verbindungen nach mindestens einem der voranstehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel I
B einen Diazofarbstoff der allgemeinen Formel VIII
Figure imgf000036_0001
worin
R1^ und R1^ unabhängig voneinander für einen mit einer oder mehreren Hydroxy- , Carboxy- , Amino-,
Sulfonsäure- , Alkoxycarbonyl- , Alkylamino-, Dial- kylamino-, Alkoxy- , mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen im Alkylrest, oder Arylsulfonylgruppen, mit bis zu 9 Kohlenstoffatomen im Arylrest, substitu- ierten Phenyl- oder Naphthylrest , oder für einen Farbstoff F, steht ,
R1"7 und R1^ unabhängig voneinander für einen Hydroxy-, Carboxy-, Sulfonsäure-, Alkyl-, Alkoxy- rest, mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, stehen, darstellt .
9. Verbindungen nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in der allge¬ meinen Formel I
W für einen Rest -OSO3H oder -SO3H, einen unverzweigten, verzweigten, cyclischen oder polycyclischen Alkyl-, Alkenyl-, Polyalkenyl- , Alkinyl-, Aryl-, Alky- laryl- oder Arylalkylrest mit bis zu 60 C-Atomen, welcher mit bis zu 5 Hydroxygruppen, bis zu 3 Carbonsäuregruppen und mindestens einem Rest -OSO3H oder - SO3H substituiert ist, s teht .
10. Verbindungen nach mindestens einem der voranstehnden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß F mit A, B und/oder W, unabhängig voneinander, über eine Ester-, Ether-, sekundäre oder tertiäre Aminogruppe, Amidgruppe oder über eine Gruppe
Figure imgf000037_0001
o -s---
II -s-
II o verknüpft ist
11. Verwendung von Verbindungen nach Anspruch 1 zur In- vivo-Diagnostik neurodegenerativer Krankheiten mit- tels NIR-Strahlung.
12. Verwendung von Verbindungen nach Anspruch 1 zur In- vitro-Diagnostik neurodegenerativer Gewebe mittels NIR-Strahlung.
13. Optisches Diagnostikum zur In-vivo-Diagnostik neurodegenerativer Krankheiten mittels NIR-Strahlung, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine Verbindung nach Anspruch 1 zusammen mit den üblichen Hilfs- und Trägerstoffen sowie Verdünnungsmitteln enthält.
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