DE202014008232U1

DE202014008232U1 - Eine doppelt markierte Sonde für die molekulare Bildgebung und deren Verwendung

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Publication number: DE202014008232U1
Application number: DE201420008232
Authority: DE
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ; Universitaet Heidelberg
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 2013-10-17
Filing date: 2014-10-16
Publication date: 2015-03-06
Anticipated expiration: 2024-10-17
Also published as: US11020493B2; US20190365931A1; US20150110715A1; US10406246B2

Abstract

Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon mit einer chemischen Struktur, die Folgendes umfasst: (A) ein Motiv, das spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindet, wobei das Motiv ein Prostata-spezifisches Membranantigen-bindendes Motiv umfasst, umfassend ein Glutamat-Harnstoff-Lysin-Motiv gemäß folgender Formel:worin die Wellenlinie die Konjugationsstelle an die Chelator-Einheit von Radiometallen (B) anzeigt; (B) eine Chelator-Einheit von Radiometallen, worin die Chelator-Einheit von Radiometallen eine 68Ga-Chelator-Einheit ist; und (C) eine Farbstoff-Einheit, wobei die Farbstoff-Einheit eine Fluoreszenzfarbstoff-Einheit mit einem Emissionsmaximum im Bereich von 400 nm bis 1000 nm ist; wobei die Verbindung eine Molekülmasse von nicht mehr als 5 kDa hat und wobei die Verbindung folgende chemische Struktur hat (A)-(B)-(C), worin ”–” eine Bindung über ein Spacer-Molekül oder eine direkte Bindung sein kann.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon mit einer chemischen Struktur, umfassend: (A) ein spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindendes Motiv; (B) eine Chelator-Einheit von Radiometallen; und (C) eine Farbstoff-Einheit; wobei diese Verbindung eine Molekülmasse von nicht mehr als 5 kDa besitzt. Ferner betrifft die Erfindung eine solche Verbindung für die medizinische Verwendung.
Im Verlauf der letzten Jahre hat die molekulare Bildgebung zunehmend an Bedeutung für die Diagnose von Neoplasie, insbesondere Krebs, gewonnen. Ärzte werden dadurch in die Lage versetzt, wertvolle Informationen über die Größe, die Stelle und die Form einer neoplastischen Stelle zu erhalten.
Um neoplastisches Gewebe in vivo sichtbar zu machen, hat man eine Vielzahl von Techniken entwickelt. Beispielsweise sind Magnetresonanztomographie (MRT), Radiographie (insbesondere Computertomographie (CT)), Fluoreszenz-vermittelte molekulare Tomographie (FMT) und Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Verfahren, die heute regelmäßig zur Lokalisierung einer Neoplasie verwendet werden.
Diese Verfahren bergen jedoch immer noch schwerwiegende Nachteile. Während MRT eine hohe Auflösung der Visualisierung erreicht und Messungen ohne jede Anfärbung ermöglicht, macht es MRT vergleichsweise schwierig, wenn nicht sogar unmöglich, zuverlässig zwischen gesundem und neoplastischem Gewebe zu unterscheiden. Radiographie, wie CT, erzielt ebenfalls eine vergleichsweise hohe Auflösung, versagt aber, wie MRT, dabei, deutlich zwischen erkranktem und gesundem Gewebe zu unterscheiden und erfordert darüber hinaus oft unerwünschte hohe Dosen an Kontrastmitteln. FMT wiederum ermöglicht den Nachweis eines spezifisch angefärbten Gewebes, birgt aber in der Regel eine schlechte Auflösung und ermöglicht nur Nachweise von Neoplasie, die sich nahe der äußeren Oberfläche des Körpers des Patienten befindet, und ermöglicht außerdem nicht die Visualisierung des umliegenden Gewebes, was es für den Untersucher schwierig macht, diagnostische Schlussfolgerungen abzuleiten und über weitere Behandlungsstrategien zu entscheiden. PET ermöglicht den Nachweis von Neoplasie im Inneren des gesamten Körpers des Patienten, zeigt jedoch lediglich ein Neoplasma selbst und zeigt, wie FMT, nicht die Lokalisierung eines Neoplasmas im dessen Gewebekontext.
MRT und PET werden regelmäßig miteinander kombiniert, manchmal in einem einzigen Gerät, um einen eindeutigen Nachweis von Neoplasie und des umgebenden Gewebes zu ermöglichen. Dies ermöglicht die genaue Lokalisierung eines Neoplasmas in seinem Gewebekontext und zeigt weiterhin die Gestalt und Größe eines Neoplasmas.
Die Geräte für MRT und PET sind jedoch ziemlich groß und umfassen Teile, die den Körper des Patienten umgeben und dadurch gleichzeitige chirurgische Eingriffe behindern. Wenn molekulare Bildgebung mithilfe von MRT und/oder PET einmal abgeschlossen ist, muss der Chirurg, der das neoplastische Gewebe entfernen will, die Position, Größe und Gestalt des neoplastischen Gewebes im Körper des Patienten abschätzen, indem er das durch die molekulare Bildgebung erhaltene Bild auf den Körper des Patienten geistig projiziert. Mit anderen Worten, ist der Chirurg, während er die Operation durchführt, nicht in der Lage, das neoplastische Gewebe im Körper des Patienten visuell zu sehen, da das neoplastische Gewebe oft nicht oder nur geringfügig anders erscheint als das umgebende nicht-neoplastische Gewebe. Zum Beispiel sind Lymphknoten, die neoplastische Zellen enthalten, in der Regel nicht von ihren gesunden Gegenstücken zu unterscheiden. Der Chirurg muss sich somit entweder die jeweilige Lokalisierung des neoplastischen Gewebes, das er zuvor mittels molekularer Bildgebung gesehen hat, merken oder von Zeit zu Zeit seine Aufmerksamkeit von dem Körper des Patienten abschweifen lassen und sich den durch die molekulare Bildgebung erhaltenen Ergebnissen zuwenden, um diese Ergebnisse geistig auf den Körper des Patienten zu projizieren.
Dieses Verfahren hat den hauptsächlichen Nachteil, dass der Chirurg nie ganz sicher sein kann, dass er das gesamte neoplastische Gewebe entfernt hat. Daher werden oft relativ große Teile des Gewebes entfernt, einschließlich großer Mengen an gesundem Gewebe. Und andererseits verbleiben oft restliche Teile von neoplastischem Gewebe weiterhin im Patienten.
Daher hat man Verbindungen entwickelt, die eine an neoplastische Zellen bindende zelluläre Bindungsstelle tragen (z. B. ein Prostata-spezifisches Membranantigen (PSMA)), ein Fluorophor und einen Chelator, insbesondere einen 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure (DOTA)-Chelator (Banerjee et al., 2011; WO 2010/108125 ). Hier ist sowohl der Chelator als auch das Fluorophor jeweils über unabhängige Spacer an ein gemeinsames Molekülgrundgerüst konjugiert, das an die zelluläre Bindungsstelle konjugiert ist.
Dieser Ansatz birgt jedoch den erheblichen Nachteil, dass die Flexibilität bei der Verwendung verschiedener Farbstoffe begrenzt ist. Tatsächlich hat man festgestellt, dass die Verwendung von Chelatoren, wie DOTA, erhebliche Nachteile birgt, wie verringerte Bindung an eine Zielstruktur, wenn sie nicht mit bestimmten Fluorophorstrukturen, wie IRDye800CW, wie von Banerjee et al. verwendet, kombiniert werden. Daher werden die im Stand der Technik bekannten Strukturen nicht auf modulare Weise verwendet. Insbesondere sind die damit konjugierten Farbstoffe nicht frei wählbar und mehrere im Stand der Technik regelmäßig und vorzugsweise verwendete Fluorophore sind mit dieser Strategie nicht einsetzbar.
Weiterhin kennt man Zellen anfärbende Strukturen, umfassend ein Fluorophor, einen Chelator und ein Motiv, das an zelluläre Marker bindet, die in verschiedenen Zellpopulationen vorhanden sind (vgl. Seibold et al., 2014). Diese Strukturen umfassen jedoch kein Motiv, das spezifisch an Zellmembranen neoplastischer Zellen bindet, sondern eher an zelluläre Strukturen, die in verschiedenen Zelltypen, einschließlich nicht-neoplastischer physiologischer Zellen, vorhanden sind. Außerdem ist in diesen von Seibold et al. gezeigten Strukturen die Bindungsstelle nicht auf modulare Weise frei wählbar, sondern vielmehr in die Struktur auf sehr komplexe Weise integriert.
Angesichts des Vorstehenden besteht immer noch ein ungedeckter Bedarf an Verbindungen, die in vivo eine molekulare Bildgebung in einem Patienten sowie Bildgebung während einer Operation ermöglichen, die leicht auf modulare Weise zu synthetisieren und in Bezug auf die Auswahl des Farbstoffs weitgehend flexibel sind.
Überraschenderweise hat man eine Verbindung gefunden, die in vivo molekulare Bildgebung in einem Patienten und ebenso Bildgebung während einer Operation ermöglicht. Diese Verbindung ist bimodal und umfasst somit eine Chelator-Einheit von Radiometallen, die das Komplexieren eines Radiometalls ermöglicht, das durch Nachweisen seiner Radioaktivität nachweisbar ist, und eine Farbstoff-Einheit, die anhand ihrer sichtbaren Eigenschaften nachweisbar ist. Der Chelator ist hierbei, gegebenenfalls über Spacer, mit einer Farbstoff-Einheit an einer ersten Stelle des Chelators konjugiert und gleichzeitig mit einem spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindenden Motiv an einem anderen Stelle des Chelators bzw. der Chelatoren konjugiert, so dass eine Struktur (A)-(B)-(C) hergestellt wird.
Allgemein gesagt, hat eine solche Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon eine chemische Struktur, umfassend:

(A) mindestens ein spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindendes Motiv;
(B) mindestens eine Chelator-Einheit von Radiometallen und
(C) mindestens eine Farbstoff Einheit, wobei die Verbindung eine Molekülmasse von nicht mehr als 5 kDa besitzt, stärker bevorzugt hat eine solche Verbindung oder pharmazeutisch annehmbares Salz davon eine chemische Struktur, umfassend:
(A) ein spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindendes Motiv;
(B) eine Chelator-Einheit von Radiometallen und
(C) eine Farbstoff Einheit, wobei diese Verbindung eine Molekülmasse von nicht mehr als 5 kDa besitzt.

Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon mit einer chemischen Struktur, die Folgendes umfasst:

(A) ein Motiv, das spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindet, wobei das Motiv ein Prostata-spezifisches Membranantigen-bindendes Motiv umfasst, umfassend ein Glutamat-Harnstoff-Lysin-Motiv gemäß folgender Formel:
worin die Wellenlinie die Konjugationsstelle an die Chelator-Einheit von Radiometallen (B) anzeigt;
(B) eine Chelator-Einheit von Radiometallen, worin die Chelator-Einheit von Radiometallen eine ⁶⁸Ga-Chelator-Einheit ist; und
(C) eine Farbstoff-Einheit, wobei die Farbstoff-Einheit eine Fluoreszenzfarbstoff-Einheit mit einem Emissionsmaximum im Bereich von 400 nm bis 1000 nm ist; wobei die Verbindung eine Molekülmasse von nicht mehr als 5 kDa hat und wobei die Verbindung folgende chemische Struktur hat (A)-(B)-(C), worin ”–” eine Bindung über ein Spacer-Molekül oder eine direkte Bindung sein kann.

Die Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung hat vorzugsweise die Molekülstruktur (A)-(B)-(C), worin ”–” eine Bindung über ein Spacer-Molekül ist.
Diese Verbindung ermöglicht zum Beispiel einen Positronen-Emissions-Tomographie(PET)-Scan sowie Fluoreszenz-Bildgebung.
Wie hier verwendet, kann der Begriff ”pharmazeutisch annehmbares Salz” im weitesten Sinne als jede beliebige geladene Form der Verbindung der vorliegenden Erfindung verstanden werden. Je nach der chemischen Struktur der Verbindung und der Umgebung, in der sie gelöst ist, kann die Verbindung zum Beispiel einen oder mehrere geladene Rest(e) umfassen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Carboxylatanion-Rest(en), primäre(m/n) Ammoniumkation(en), sekundäre(m/n) Ammoniumkation-Rest(en), tertiäre(m/n) Ammoniumkation-Rest(en), primäre(m/n) Phosphatanion-Rest(en), sekundäre(m/n) Phosphatanion-Rest(en), Sulfatanion-Rest(en), Sulfitanion-Rest(en) und (einem) Alkoxid-Rest(en), jedoch nicht darauf beschränkt. Die Gegenionen können alle Ionen sein, von denen im Stand der Technik bekannt ist, dass sie pharmazeutisch annehmbar sind, wie z. B. Acetat, Fettsäurecarboxylat, Chlorid, Natriumionen, Kaliumion, Magnesiumion, Calciumion, Aluminiumion, Lithiumion, Ammonium, Phosphat, Hydroxyl, Proton und Fluoridion.
Wie er in der gesamten vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann der Begriff ”Motiv” im weitesten Sinne als ein Molekülstrukturmuster verstanden werden, das spezifische Bindung an Zellmembranen von neoplastischen Zellen ermöglicht.
Wie in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet, kann der Begriff ”neoplastische Zelle” im weitesten Sinne als beliebige Zelle verstanden werden, die ein anomales Wachstum und/oder anomale Teilungsrate aufweist, einschließlich auch metaplastischer und dysplastischer Zellen. In der Regel neigt eine neoplastische Zelle dazu, einen als Neoplasie bekannten Zellhaufen zu bilden. Das Wachstum neoplastischer Zellen ist in der Regel weniger oder nicht mit den darum herum befindlichen normalen Geweben koordiniert. Das Wachstum einer neoplastischen Zelle bleibt vorzugsweise auf die gleiche übermäßige Weise sogar nach Aufhören der Stimuli bestehen. Neoplastische Zellen können eine gutartige Neoplasie, eine prämaligne Neoplasie (Carcinoma in situ) oder eine maligne Neoplasie (Krebs) bilden. Neoplasie kann auch anhand der Internationalen Klassifikation von Krankheiten Bd. 10 (ICD-10-Nomenklatur) in der Version von 2013, d. h. als ein beliebiger pathologischer Zustand nach den ICD-10-Klassen C00-D48, charakterisiert werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst Krebs auch Metastasen.
Krebs ist im Sinne der vorliegenden Erfindung jede maligne Neoplasie. Zum Beispiel kann der Krebs ein Karzinom (z. B. Prostatakarzinom, Brustkarzinom, Lungenkarzinom, Pankreaskarzinom, Leberkarzinom oder Kolonkarzinom), ein Sarkom (z. B. Sarkom in Knochen, Knorpel, Fett und/oder Nervengewebe oder ein mesenchymales Sarkom), ein Lymphom, eine Leukämie, Keimzellen- (z. B. Hoden- oder Eierstockkrebs (Seminom bzw. Dysgerminom)) oder ein Blastom, z. B. Leberblastom) sein.
Das Motiv bindet an seine Zielstruktur, die auf der Oberfläche von neoplastischen Zellen vorhanden ist, mit einer höheren Affinität als an andere molekulare Strukturen.
Die Zielstruktur ist vorzugsweise typisch für neoplastische Zellen. Daher kann die Zielstruktur vorzugsweise ausschließlich oder in höherer lokaler Konzentration im Vergleich zu normalen, d. h. nicht-neoplastischen Zellen, auf der Oberfläche von neoplastischen Zellen gefunden werden. Entsprechend ist die lokale Konzentration der Zielstruktur, die durch das Motiv (A) gemäß der vorliegenden Erfindung erkannt wird, an der Zellmembran von neoplastischen Zellen vorzugsweise mindestens 2-fach, stärker bevorzugt mindestens 5-fach, noch stärker bevorzugt mindestens 10-fach, noch stärker bevorzugt mindestens 100-fach, noch stärker bevorzugt mindestens 500-fach höher im Vergleich zu den entsprechenden normalen, d. h. nicht-neoplastischen Zellen.
Vorzugsweise bindet das Motiv an seine Zielstruktur auf neoplastischen Zellen mit einer mindestens 5-fach höheren, stärker bevorzugt mindestens 10-fach höheren, noch stärker bevorzugt mindestens 20-fach höheren, noch stärker bevorzugt mindestens 50-fach höheren, insbesondere mindestens 100-fach höheren Affinität als andere molekulare Strukturen mit der gleichen Ladung und Hydrophobie in vergleichbaren chemischen Umgebungen. Vorzugsweise bindet das Motiv an die Zielstruktur auf Zellmembranen von neoplastischen Zellen mit einer Dissoziationskonstante von nicht mehr als 10 μM, stärker bevorzugt nicht mehr als 5 μM, noch stärker bevorzugt nicht mehr als 1 μM, noch stärker bevorzugt nicht mehr als 100 nM, insbesondere nicht mehr als 50 nM.
Vorzugsweise umfasst das Motiv mindestens eine natürlich vorkommende Aminosäure-Einheit, stärker bevorzugt mindestens zwei natürlich vorkommende Aminosäure-Einheiten.
Wie sie in der gesamten vorliegenden Erfindung verwendet werden, können die Begriffe ”Einheit”, ”Rest” und ”Rest” in Zusammenhang mit einer chemischen Struktur im weitesten Sinne austauschbar als Teil eines Moleküls verstanden werden, der eng an die anderen Teile des Moleküls, insbesondere über eine kovalente Bindung, gebunden ist. Ferner können die Begriffe ”konjugiert an” und ”gebunden an”, wie sie hier verwendet werden, als synonym verstanden werden.
Vorzugsweise umfasst das Motiv mindestens eine nicht-proteinogene Amidbindung, stärker bevorzugt mindestens zwei nicht-proteinogene Amidbindungen. Stärker bevorzugt umfasst das Motiv mindestens eine natürlich vorkommende Aminosäure-Einheit, die über eine nicht-proteinogene-Amidbindung konjugiert ist, noch stärker bevorzugt mindestens zwei natürlich vorkommende Aminosäure-Einheiten, die über nicht-proteinogene Amidbindungen konjugiert sind.
Vorzugsweise umfasst das spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindende Motiv nicht mehr als 20 Aminosäure-Einheiten, stärker bevorzugt nicht mehr als zehn Aminosäure-Einheiten, noch stärker bevorzugt nicht mehr als fünf Aminosäure-Einheiten, noch stärker bevorzugt nicht mehr als vier Aminosäure-Einheiten, insbesondere nicht mehr als drei Aminosäure-Einheiten.
Vorzugsweise umfasst das Motiv weiterhin mindestens eine Harnstoff-Einheit, stärker bevorzugt mindestens eine Harnstoff-Einheit, die kovalent an zwei Aminosäuren über die Bildung von Amidbindungen gebunden ist.
Das spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindende Motiv (A) kann kovalent oder nicht-kovalent (z. B. über Komplexbildung) mit der Chelator-Einheit von Radiometallen (B) und/oder der Farbstoff-Einheit (C) verknüpft sein. Vorzugsweise ist es kovalent an die Chelator-Einheit von Radiometallen (B) und/oder die Farbstoff-Einheit (C), stärker bevorzugt an die Chelator-Einheit von Radiometallen (B), konjugiert. Eine solche kovalente Konjugation an eine Chelator-Einheit von Radiometallen (B) kann die Bildung einer kovalenten Bindung direkt zwischen dem Motiv (A) und dem Chelator (B) sein oder kann eine kovalente Bindung über einen Spacer sein. In diesem Zusammenhang hat ein Spacer vorzugsweise eine Länge von nicht mehr als 5 nm, vorzugsweise von nicht mehr als 2 nm, insbesondere von nicht mehr als 1 nm. Das Motiv kann vorzugsweise an die Chelator-Einheit von Radiometallen (B) über die epsilon-Aminogruppe einer Lysin-Einheit konjugiert werden.
Der Begriff ”Chelator-Einheit”, wie er im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann im weitesten Sinne als jede beliebige Einheit verstanden werden, die in der Lage ist, einen Komplex mit dem Radiometall ⁶⁸Ga unter geeigneten Bedingungen zu bilden. Hier können die Begriffe ”Chelator-Einheit”, ”Chelator”, ”chelatisierende Einheit”, ”sequestrierende Einheit” und ”komplexierende Einheit” als synonym verstanden werden. Die Chelator-Einheit ist vorzugsweise eine organische Einheit. Komplexieren durch Chelatbildung beinhaltet vorzugsweise die Bildung oder das Vorhandensein von zwei oder mehr getrennten koordinativen Bindungen zwischen einem mehrzähnigen (mehrfach bindungsfähigen) Liganden und einem einzigen zentralen Radiometall. Es wird auch auf die allgemeine Definition der International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) der Chelatbildung, in ihrem weitesten Sinne interpretiert, hingewiesen. Chelator-Einheiten, wie hier verwendet, tragen in der Regel mindestens zwei Heteroatome, die eine Wechselwirkung mit einem Radiometall ermöglichen. Vorzugsweise hat die Chelator-Einheit mindestens drei, insbesondere mindestens vier Heteroatome, die eine Wechselwirkung mit einem Radiometall ermöglichen.
Ein Radiometall, wie im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet, kann im weitesten Sinne als jedes radioaktive Metall oder radioaktive Metallion, d. h. ein Metall oder Metallionen, das radioaktive Emission ausstrahlt, verstanden werden. Es kann ein Metall oder Metallion sein, das üblicherweise radioaktiv ist, oder ein radioaktives Isotop eines Metalls, das auch nicht-radioaktive Isotope besitzt. Zum Beispiel kann ein Radiometall ein radioaktives Isotop von Gallium (Ga) (z. B. ⁶⁸Ga), Kupfer (z. B. ⁶⁴Cu), Zirkonium (z. B. ⁸⁹Zr), Scandium (z. B. ⁴⁴Sc), Rubidium (z. B. ⁸²Rb), Kobalt (z. B. ⁶⁰Co), Strontium (z. B. ⁹⁰Sr) oder Technetium (z. B. ^99mTc) sein. Vorzugsweise ist das Radiometall ein radioaktives Isotop von ⁶⁸Ga, ⁶⁴Cu, ⁸⁹Zr, ⁴⁴Sc, ^99mTc oder ⁸²Rb, stärker bevorzugt ⁶⁸Ga, ⁶⁴Cu, ⁸⁹Zr, ⁴⁴Sc oder ⁸²Rb, noch stärker bevorzugt ⁶⁸Ga oder ⁶⁴Cu, insbesondere ⁶⁸Ga. Der Fachmann wird mehrere Beispiele für Chelator-Einheiten kennen, die zum Komplexieren jedes der vorstehend genannten Radiometalle geeignet sind, und kann die Chelator-Einheit entsprechend auswählen. Zum Beispiel kann eine Chelator-Einheit, die zum Komplexieren von ^99mTc oder ⁸²Rb geeignet ist, sich von der zum Komplexieren von ⁶⁸Ga oder ⁶⁴Cu geeigneten unterscheiden oder nicht.
Vorzugsweise ist das Radiometall derart, dass es eine Halbwertszeit von nicht mehr als vier Tagen, stärker bevorzugt von nicht mehr als einem Tag, noch stärker bevorzugt nicht mehr als 12 Std., noch stärker bevorzugt nicht mehr als 6 Std., noch stärker bevorzugt nicht mehr als 3 Std., noch stärker bevorzugt nicht mehr als 2,5 Std., noch stärker bevorzugt nicht mehr als 120 min, noch stärker bevorzugt nicht mehr als 100 min, noch stärker bevorzugt nicht mehr als 80 min, insbesondere nicht mehr als 70 min hat.
Das Radiometall kann aus jeder für diesen Zweck geeigneten Quelle erhalten werden. Das Radiometall kann aus der Natur erhalten und isoliert oder künstlich erzeugt werden, wie z. B. ⁶⁸Ga aus einem Gallium-68-Generator. Der Fachmann weiß, wie das jeweilige Radiometall zu erhalten ist.
Wie in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet, können die Begriffe ”Farbstoff-Einheit”, ”Markierung” und ”Färbung” im weitesten Sinne austauschbar, als eine beliebige Einheit verstanden werden, die eine sichtbare Färbung bereitstellt. Vorzugsweise kann die Farbstoff-Einheit eine Fluoreszenzfarbstoff-Einheit und/oder eine chromatische Einheit sein. Die Farbstoff-Einheit ist eine Fluoreszenzfarbstoff-Einheit.
Eine Fluoreszenzfarbstoff-Einheit, wie hier verwendet, kann im weitesten Sinne als eine beliebige Farbstoff-Einheit, die Fluoreszenznachweis ermöglicht, verstanden werden. Vorzugsweise erfolgt ein solcher Fluoreszenznachweis im Bereich von 400 bis 1000 nm, d. h. im sichtbaren Spektrum und im nahen Infrarot(NIR)-Spektrum, insbesondere im Bereich von 400 bis 800 nm, d. h. im sichtbaren Spektrum. Vorzugsweise ist das von der Fluoreszenzfarbstoff-Einheit emittierte Fluoreszenzsignal gut von der Autofluoreszenz der Neoplasie und des umgebenden Gewebes unterscheidbar. Zahlreiche Fluoreszenzfarbstoff-Einheiten sind im Stand der Technik bekannt und für einen Durchschnittsfachmann leicht ersichtlich. Viele Fluoreszenzfarbstoffe sind im Handel mit aktivierten Gruppen erhältlich, die man für eine Umsetzung mit Protein-Seitenketten oder anderen Verbindungen, wie der Verbindung der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise über den Spacer y der Verbindung der vorliegenden Erfindung, verwendet, wodurch insbesondere die Gruppe e', wie hierin definiert, gebildet wird.
Vorzugsweise ist die Fluoreszenzfarbstoff-Einheit in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein kleinmolekularer Farbstoff, d. h. eine Fluoreszenzfarbstoff-Einheit mit einer Molekülmasse (MW) von nicht mehr als 1000 Da, vorzugsweise nicht mehr als 750 Da, insbesondere nicht mehr als 500 Da. Zum Beispiel ein Indocyanin-Grün(ICG)-Farbstoff (z. B. eine von einer Sulfo ICG-Einheit stammende Farbstoff-Einheit), eine Fluoreszenzfarbstoff-Einheit kann ein Farbstoff des Fluorescein-Typs sein (der z. B. von Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Carboxyfluorescein oder Fluorescein stammt), ein Farbstoff des Rhodamin-Typs (der z. B. von Rhodamin G, Rhodamin oder Tetramethylrhodamin (TAMRA) stammt), ein Cyanin-Farbstoff (der z. B. von Sulfocy5, Cyanin 5.5, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy7.5, einem Alexa Fluor-Farbstoff (z. B. Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 750) stammt, eine von DyLight (z. B. DyLight 750, DyLight 800) stammende Farbstoff-Einheit, eine von einem FluoProbe-Farbstoff stammende Farbstoff-Einheit, eine von einem Sulfo-Cy-Farbstoff, einem Seta-Farbstoff oder S0387 stammende Farbstoff-Einheit), ein Infrarot-Farbstoff (der z. B. von IRDye 800CW, IRDye 800RS, IRDye 800, IRDye 700, IRDye 700DX, IRDye 680 oder IRDye 680LT stammt), eine von 5-Aminolävulinsäure (5-ALA) stammende Farbstoff-Einheit, ein Phenoxacin-Farbstoff (der z. B. von Nilrot oder Nilblau stammt), eine von einem Allophycocyanin-Farbstoff stammende Farbstoff-Einheit, eine von einem Berberin-Farbstoff stammende Farbstoff-Einheit, eine von Chinin oder einem Fluoreszenz-Chinin-Derivat stammende Farbstoff-Einheit, eine von Cumarin stammende Farbstoff-Einheit, eine von 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) stammende Farbstoff-Einheit, eine von Epicocconon stammende Farbstoff-Einheit, 5-({2-[(Iodacetyl)amino]ethyl}amino)naphthalin-1-sulfonsäure (IAEDANS), ein Atto-Farbstoff (der z. B. von ATTO 390, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 520, ATTO 532, ATTO 550, ATTO 565, ATTO 590, ATTO 594, ATTO 610, ATTO 611X, ATTO 620, ATTO 633, ATTO 635, ATTO 637, ATTO 647, ATTO 647N, ATTO 655, ATTO 665, ATTO 680, ATTO 700, ATTO 725, ATTO 740 stammt), ein Visen-Farbstoff (der z. B. von VivoTag680, VivoTag750 stammt) oder eine von einem HOECHST-Farbstoff stammende Farbstoff-Einheit).
Weitere Beispiele für Farbstoff-Einheiten des Rhodamin-Typs, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, können diejenigen sein, die von den von Kolmakov et al. (vgl. Kolamkov et al., 2012; Kolmakov et al., 2014) gezeigten Fluorophoren herrühren können, wie z. B. darin gezeigtes KK114 oder Abberior Star 635 P.
Zusätzlich oder alternativ kann die Farbstoff-Einheit auch chromatisch sein, d. h. eine Farbwahrnehmung hervorrufen, wenn sie durch ein beliebiges Licht belichtet wird. Eine solche chromatische Wirkung kann hervorgerufen werden durch Absorption von Licht aus einem oder mehreren bestimmten Wellenlängenbereich(en) im sichtbaren Bereich (d. h. in (einem) Bereich(en) von etwa 400 nm bis etwa 800 nm), und/oder durch Emittieren von Licht eines bestimmten Wellenlängenbereichs oder mehrerer bestimmter Wellenlängenbereiche im sichtbaren Bereich. Vorzugsweise unterscheidet sich die Farbe von der Neoplasie und dem umgebenden Gewebe, die untersucht werden sollen. Daher ist eine Farbstoff-Einheit, wenn sie nicht für den Fluoreszenznachweis bestimmt ist, vorzugsweise nicht rot oder braun, sondern vorzugsweise eher blau oder grün. Wenn die Farbstoff-Einheit für den Fluoreszenznachweis vorgesehen ist, spielt der Unterschied in der Farbe in der Regel eine untergeordnete Rolle, solange die Fluoreszenz gegenüber dem Autofluoreszenz-Hintergrund nachweisbar ist. Vorzugsweise ist die chromatische Farbstoff-Einheit in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein kleinmolekularer Farbstoff, d. h. eine Farbstoff-Einheit mit einer Molekülmasse (MW) von nicht mehr als 1000 Da, vorzugsweise nicht mehr als 750 Da, insbesondere nicht mehr als 500 Da.
Die Farbstoff-Einheit (C) kann kovalent oder nicht-kovalent (z. B. über Komplexbildung) mit dem spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindenden Motiv (A) und/oder der Chelator-Einheit von Radiometallen (B) verknüpft sein. Vorzugsweise ist sie kovalent an das mindestens eine spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindende Motiv (A) und/oder die Chelator-Einheit von Radiometallen (B), stärker bevorzugt an die Chelator-Einheit von Radiometallen (B), konjugiert. Eine solche kovalente Konjugation an eine Chelator-Einheit von Radiometall (B) kann die Bildung einer kovalenten Bindung direkt zwischen der Farbstoff-Einheit (C) und der Chelator-Einheit von Radiometallen (B) oder eine kovalente Bindung über einen Spacer sein. Vorzugsweise hat ein Spacer eine Länge von nicht mehr als 5 nm, vorzugsweise von nicht mehr als 2 nm, insbesondere von nicht mehr als 1 nm.
Dementsprechend ist der molekulare Abstand zwischen dem spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindenden Motiv (A) und der Farbstoff-Einheit (C) vorzugsweise nicht länger als 20 nm, stärker bevorzugt nicht länger als 10 nm, insbesondere nicht länger als 5 nm.
Dies kann es, je nach den chemischen Eigenschaften der Fluoreszenzfarbstoff-Einheit/-Einheiten in der Verbindung der vorliegenden Erfindung und dem Vorhandensein von (einem) Fluorophor(en) und/oder Quenchern auf der Oberfläche der Zielzellen, d. h. der Zellmembranen der entsprechenden neoplastischen Zellen, auch ermöglichen, Effekte, wie Fluoreszenz-Energietransfer (FRET) und/oder Fluoreszenzlöschung nach der Bindung der Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung an diese Zellmembranen zu beobachten. Zusätzlich oder alternativ ermöglicht das Vorhandensein der Fluoreszenzfarbstoff-Einheit/-Einheiten auch die Durchführung weiterer Untersuchungsmethoden, die auf Fluoreszenz basieren, wie z. B. Fluoreszenzerholung nach Photobleichen (FRAP), Fluoreszenzverlust bei Photobleichen (FLIP). Diese Verfahren können Informationen über die Mobilität der Verbindung oder des Salzes davon, die/das an die Zellmembranen einer neoplastischen Zelle gebunden oder daran angelagert ist, liefern.
Vorzugsweise hat die Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung eine Molekülmasse (MW) von nicht mehr als 4 kDa, stärker bevorzugt nicht mehr als 3,5 kDa, noch stärker bevorzugt nicht mehr als 3 kDa, insbesondere nicht mehr als 2,5 kDa.
Vorzugsweise beträgt die Stöchiometrie von (A):(B):(C)1:1:1. Die vorliegende Erfindung betrifft daher eine Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon mit einer chemischen Struktur, die Folgendes umfasst:

(A) ein spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindendes Motiv;
(B) eine Chelator-Einheit von Radiometallen; und
(C) eine Farbstoff-Einheit; wobei die Verbindung eine Molekülmasse von nicht mehr als 5 kDa, vorzugsweise nicht mehr als 4 kDa, stärker bevorzugt nicht mehr als 3,5 kDa, noch stärker bevorzugt nicht mehr als 3 kDa, insbesondere nicht mehr als 2,5 kDa hat.

Vorzugsweise sind (B) und (C) miteinander über ein Spacer-Molekül konjugiert.
Stärker bevorzugt sind auch (A) und (B) miteinander über einen Spacer-Molekül konjugiert.
Dementsprechend sind in einer bevorzugten Ausführungsform (B) und (C) und (A) und (B) miteinander über ein Spacer-Molekül konjugiert.
Folglich hat in einer bevorzugten Ausführung die Verbindung folgende chemische Struktur (A)-x-(B)-y-(C), wobei x und y unabhängig voneinander jeweils ein Spacer-Molekül darstellen.
Es wird ebenfalls offenbart, dass alternativ die Molekülstruktur einer solchen Verbindung aus einer beliebigen der folgenden Molekülstrukturen ausgewählt werden kann: (A)-(C)-(B) oder (B)-(A)-(C), worin ”–” eine direkte Bindung oder eine Bindung über ein Spacer-Molekül sein kann. Die Spacer-Moleküle können ebenfalls die hierin definierten sein, also jeweils x oder y.
Das spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindende Motiv (A) ist ein Motiv, das spezifisch an Zellmembranen kanzeröser Zellen bindet, wobei das Motiv vorzugsweise ein Prostata-spezifisches Membranantigen(PSMA)-bindendes Motiv umfasst.
Hier können die Begriffe ”Prostata-spezifisches Membranantigen”, ”Prostata-spezifisches Membranantigen-bindendes Motiv” und ”PSMA-bindendes Motiv” als synonym verstanden werden.
Allgemein gesagt, wird offenbart, dass das spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindende Motiv (A) ein PSMA-bindendes Motiv mit der folgenden Struktur ist:
worin Z¹, Z² und Z³ jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, umfassend -C(O)OR¹, -SO₂R¹, -SO₃R¹, -SO₄R¹, -PO₂R¹, -PO₃R¹ und -PO₄R¹R², wobei R¹ und R² unabhängig voneinander H oder ein C_1-4-Alkylrest sind;
wobei a' für einen Rest -[CH₂]_o- steht, wobei o eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist,
wobei o vorzugsweise 3 oder 4 ist, wobei o insbesondere 4 ist,
wobei b' für einen Rest steht, der aus der Gruppe ausgewählt ist, umfassend -NH-, -C(O)- und -O-, wobei b' insbesondere -NH- ist, und
worin die Wellenlinie die Konjugationsstelle an die Chelator-Einheit von Radiometallen (B) anzeigt, die vorzugsweise über ein Spacer-Molekül x konjugiert ist.
Wie in der gesamten vorliegenden Anmeldung verwendet, können die Begriffe ”Alkyl”, ”Alkylrest” und ”Alkylgruppe” und ”Alkyl-Einheit” als eine geradkettige oder verzweigte gesättigte Kohlenwasserstoffkette verstanden werden. ”Geradkettig” kann auch als ”unverzweigt” oder ”linear” bezeichnet werden. Vorzugsweise ist das Alkyl eine gerade Kette.
”C_1-4-Alkylrest” bedeutet eine Alkylkette mit 1-4 Kohlenstoffatomen, z. B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sek.-Butyl oder tert.-Butyl. Vorzugsweise ist ein C_1-4-Alkylrest eine geradkettiges Alkyl, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die Methyl, Ethyl, n-Propyl und n-Butyl umfasst.
Wie vorstehend erwähnt, ist das spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindende Motiv (A) ein PSMA-bindendes Motiv mit der folgenden Struktur:
worin die Wellenlinie die Konjugationsstelle an die Chelator-Einheit von Radiometallen (B) anzeigt, die vorzugsweise über ein Spacer-Molekül x konjugiert ist.
Die Spacer x und y können beliebige Spacer sein, die für solche Sonden in vivo oder in vitro verwendbar sind. In diesem Zusammenhang hat ein Spacer vorzugsweise eine Länge von nicht mehr als 5 nm, vorzugsweise von nicht mehr als 2 nm, insbesondere von nicht mehr als 1 nm.
Der Spacer x ist vorzugsweise flexibel und trägt vorzugsweise keine aromatischen Reste, wenn die Chelator-Einheit von Radiometallen (B) aromatische Einheiten trägt.
In einer bevorzugten Ausführungsform trägt der Spacer x die folgende Struktur: -[b''-c-b''']_n-b''''-d¹ worin b'' aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus -C(O)-, -NH- und -O-, und worin b' von (A) und b'' des Spacers x zusammen eine Amidgruppe oder eine Estergruppe bilden; vorzugsweise ist b'' -C(O)- und b'' und b' bilden zusammen eine Amidgruppe;
worin c für einen Rest steht, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem C_1-8-Alkylen, worin eine oder mehrere -CH₂-Einheiten gegebenenfalls durch -O- ersetzt sein können, vorzugsweise ist c frei von jeglicher Ersetzung;
worin c vorzugsweise ein Rest ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem unsubstituierten C_1-8-Alkylen, -CH₂-(O-CH₂-CH₂)₂-CH₂-, -(CH₂)₂-(O-CH₂-CH₂)₂-, -(CH₂)₃-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-, -CH₂-O-(CH₂)₆-, -(CH₂)₂-O-(CH₂)₅-, -(CH₂)₃-O-(CH₂)₄-, -(CH₂)₄-O-(CH₂)₃-, -(CH₂)₅-O-(CH₂)₂-, -(CH₂)₆-O-CH₂-, -CH₂-(O-CH₂-CH₂)₂-, -(CH₂)₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-, -CH₂-O-(CH₂)₅-, -(CH₂)₂-O-(CH₂)₄-, -(CH₂)₃-O-(CH₂)₃-, -(CH₂)₄-O-(CH₂)₂-, -(CH₂)₅-O-CH₂-, -CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-, -CH₂-O-(CH₂)₄-, -(CH₂)₂-O-(CH₂)₃-, -(CH₂)₃-O-(CH₂)₂-, -(CH₂)₄-O-CH₂-, -CH₂-O-(CH₂)₃-, -(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-, -(CH₂)₃-O-CH₂-, -CH₂-O-(CH₂)₂-, -(CH₂)₂-O-CH₂- und -CH₂-O-CH₂-, insbesondere ein Rest, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Butylenrest, einem Pentylenrest oder einem Hexylenrest;
worin b''' aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus -NH-, -C(O)- und -O-;
worin b'''' aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus -C(O)-, -NH- und -O-;
und wobei b''' und b'''' oder b' und b'''' zusammen eine Amidgruppe oder eine Estergruppe bilden, worin b''' insbesondere -NH- ist und b''' und b'''' zusammen eine Amidgruppe bilden;
worin d¹ -[CH₂]_p- ist, wobei p 1 oder 2, insbesondere 2, ist; und
wobei n 0 oder 1 ist.
Wie er in der gesamten vorliegenden Anmeldung verwendet wird, bedeutet der Begriff ”Alkylen” eine geradkettige oder verzweigte gesättigte Kohlenwasserstoffkette, worin zwei Einheiten eines Moleküls über den Alkylenrest verbunden sind. ”Geradkettig” kann auch als ”unverzweigt” oder ”linear” bezeichnet werden. Jeder Wasserstoff eines Alkylen-Kohlenstoffatoms kann durch einen Substituenten ersetzt sein (d. h. kann substituiert oder unsubstituierter sein) oder nicht, wie noch weiter erläutert wird.
”C_1-8-Alkylenrest” bedeutet eine Alkylenkette mit 1-8 Kohlenstoffatomen, z. B. -CH₂-, -CH₂-CH₂-, -CH(CH₃)-, -CH₂-CH₂-CH₂-, -CH(C₂H₅)-, -C(CH₃)₂-, -CH₂-C(CH₃)₂-, -C(CH₂-CH₃)₂-, -CH(CH₂-CH₃)-, -CH₂-CH(CH₃)(CH₂-CH₃)-, -CH(CH₃)(CH₂-CH₃)-, (CH₂)₄-, -(CH₂)₅-, -(CH₂)₆-, -(CH₂)₇-, -(CH₂)₈- usw., wenn zwei Einheiten eines Moleküls durch die Alkylengruppe verbunden sind.
Vorzugsweise ist in Zusammenhang mit dem Rest c des Spacers x ein C_1-8-Alkylenrest vorzugsweise ein geradkettiger, d. h. unverzweigter, C_1-8-Alkylenrest, d. h. ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -CH₂-, -CH₂-CH₂-, -(CH₂)₃-, (CH₂)₄-, -(CH₂)₅-, -(CH₂)₆-, -(CH₂)₇- und -(CH₂)₈-, in denen gegebenenfalls eine oder mehrere -CH₂-Einheiten durch -O- ersetzt sein können. Beispiele sind vorstehend gezeigt.
In einer stärker bevorzugten Ausführungsform birgt der Spacer x die folgende Struktur: -[C(O)-(CH₂)_Q-NH]_n-C(O)-(CH₂)_p-, worin q eine ganze Zahl von 1 bis 8, vorzugsweise 4, 5, oder 6, insbesondere 5, ist;
worin n 0 oder 1 ist und
worin p 1 oder 2, insbesondere 2, ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform birgt der Spacer x die folgende Struktur: -[C(O)-(CH₂)₅-NH]_n-C(O)-(CH₂)₂-, worin n 0 oder 1 ist.
Der Spacer y ist vorzugsweise eher hydrophil.
In einer bevorzugten Ausführungsform birgt der Spacer y die folgende Struktur: d²e-[f-e']_m-, worin d² -[CH₂]_r- ist, worin r 1 oder 2, insbesondere 2, ist und
wobei e aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus -C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -C(O)-O-, -O-C(O)-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(S)-NH-,
worin eine der Wellenlinien die Konjugationsstelle an d² anzeigt und die andere Wellenlinie die Konjugationsstelle an f anzeigt, wobei e insbesondere -C(O)-NH- ist;
wobei jedes f unabhängig für einen Rest steht, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem C_1-10-Alkylen, worin eine oder mehrere -CH₂-Einheiten gegebenenfalls durch -O- oder -NH- ersetzt sein können, und wobei f nicht substituiert oder mit einer oder mehreren Gruppen substituiert ist, die unabhängig voneinander aus der aus -NH₂, -COOH und R³ bestehenden Gruppe ausgewählt werden,
wobei R³ aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus -(CH₂)₂-COOH, -(CH₂)₄-NH₂, -(CH₂)₄-N⁺(CH₃)₃ + X^–, -CH₂-COOH, -CH₂-SH, -CH₂-SO₃H und
wobei X^– ein pharmazeutisch annehmbares negativ geladenes Gegenion ist;
insbesondere ein Rest, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus -(CH₂)₂-(O-CH₂-CH₂)₂-, -CH₂-(O-CH₂-CH₂)₂-CH₂- und -(CH₂)₃-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-; wobei f vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus -CH₂-(OCH₂-CH₂)₂-CH₂-, -(CH₂)₂-(O-CH₂-CH₂)₂-, -(CH₂)₂-(CH₂-CH₂-O)₂-(CH₂)₂-, -(CH₂)₃-(CH₂-CH₂-O)₂-CH₂-, -(CH₂-CH₂-O)₃-CH₂-, -(CH₂)₂-(CH₂-CH₂-O)₂-CH₂-, -(CH₂)₂-(CH₂-CH₂-NH)₂-(CH₂)₂-, -(CH₂)₃-(CH₂-CH₂-NH)₂-CH₂-, -(CH₂-CH₂-NH)₃-CH₂-, -(CH₂)₂-(CH₂-CH₂-NH)₂-CH₂-, -(CH₂)₃-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-, -CH₂-O-(CH₂)₆-, -(CH₂)₂-O-(CH₂)₅-, -(CH₂)₃-O-(CH₂)₄-, -(CH₂)₄-O-(CH₂)₃-, -(CH₂)₅-O-(CH₂)₂-, -(CH₂)₆-O-CH₂-, -CH₂-(O-CH₂-CH₂)₂-, -(CH₂)₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-, -CH₂-O-(CH₂)₅-, -(CH₂)₂-O-(CH₂)₄-, -(CH₂)₃-O-(CH₂)₃-, -(CH₂)₄-O-(CH₂)₂-, -(CH₂)₅-O-CH₂-, -CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-, -CH₂-O-(CH₂)₄-, -(CH₂)₂-O-(CH₂)₃-, -(CH₂)₃-O-(CH₂)₂-, -(CH₂)₄-O-CH₂-, -CH₂-O-(CH₂)₃-, -(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-, -(CH₂)₃-O-CH₂-, -CH₂-O-(CH₂)₂-, -(CH₂)₂-O-CH₂-, -CH₂-O-CH₂-, -(CH₂)₃-(O-CH₂-CH₂)₂-CH₂-, -(CH₂)₂-(O-CH₂-CH₂)₂-(CH₂)₂, -CH₂-(O-CH₂-CH₂)₂-(CH₂)₃, -CH₂-(O-CH₂-CH₂)₃-, -(CH₂)₂-(O-CH₂-CH₂)₂-CH₂-, -CH₂-(O-CH₂-CH₂)₂-(CH₂)₂- und -(CH₂)₃-(O-CH₂-CH₂)₂-, CH₂-(NH-CH₂-CH₂)₂-CH₂-, -(CH₂)₂-(NH-CH₂-CH₂)₂-, -(CH₂)₃-NH-CH₂-CH₂-NH-CH₂-, -CH₂-NH-(CH₂)₆-, -(CH₂)₂-NH-(CH₂)₅-, -(CH₂)₃-NH-(CH₂)₄-, -(CH₂)₄-NH-(CH₂)₃-, -(CH₂)₅-NH-(CH₂)₂-, -(CH₂)₆-NH-CH₂-, -CH₂-(NH-CH₂-CH₂)₂-, -(CH₂)₂-NH-CH₂-CH₂-NH-CH₂-, -CH₂-NH-(CH₂)₅-, -(CH₂)₂-NH-(CH₂)₄-, -(CH₂)₃-NH-(CH₂)₃-, -(CH₂)₄-NH-(CH₂)₂-, -(CH₂)₅-NH-CH₂-, -CH₂-NH-CH₂-CH₂-NH-CH₂-, -CH₂-NH-(CH₂)₄-, -(CH₂)₂-NH-(CH₂)₃-, -(CH₂)₃-NH-(CH₂)₂-, -(CH₂)₄-NH-CH₂-, -CH₂-NH-(CH₂)₃-, -(CH₂)₂-NH-(CH₂)₂-, -(CH₂)₃-NH-CH₂-, -CH₂-NH-(CH₂)₂-, -(CH₂)₂-NH-CH₂-, -CH₂-NH-CH₂-, -(CH₂)₃-(NH-CH₂-CH₂)₂-CH₂-, -(CH₂)₂-(NH-CH₂-CH₂)₂-(CH₂)₂, -CH₂-(NH-CH₂-CH₂)₂-(CH₂)₃, -CH₂-(NH-CH₂-CH₂)₃-, -(CH₂)₂-(NH-CH₂311 > -CH₂)₂-CH₂-, -CH₂-(NH-CH₂-CH₂)₂-(CH₂)₂-, -(CH₂)₃-(NH-CH₂-CH₂)₂-, -CH₂-O-(CH₂)₈-, -(CH₂)₂-O-(CH₂)₇-, -(CH₂)₃-O-(CH₂)₆-, -(CH₂)₄-O-(CH₂)₅-, -(CH₂)₅-O-(CH₂)₄-, -(CH₂)₆-O-(CH₂)₃-, -(CH₂)₇-O-(CH₂)₂-, -(CH₂)₃-O-CH₂-, -CH₂-O-(CH₂)₇-, -(CH₂)₂-O-(CH₂)₆-, -(CH₂)₃-O-(CH₂)₅-, -(CH₂)₄-O-(CH₂)₄-, -(CH₂)₅-O-(CH₂)₃-, -(CH₂)₆-O-(CH₂)₂-, -(CH₂)₇-O-CH₂-, -CH₂-NH-(CH₂)₈-, -(CH₂)₂-NH-(CH₂)₇-, -(CH₂)₃-NH-(CH₂)₆-, -(CH₂)₄-NH-(CH₂)₅-, -(CH₂)₅-NH-(CH₂)₄-, -(CH₂)₆-NH-(CH₂)₃-, -(CH₂)₇-NH-(CH₂)₂-, -(CH₂)₈-NH-CH₂-, -CH₂-NH-(CH₂)₇-, -(CH₂)₂-NH-(CH₂)₆-, -(CH₂)₃-NH-(CH₂)₅-, -(CH₂)₄-NH-(CH₂)₄-, -(CH₂)₅-NH-(CH₂)₃-, -(CH₂)₆-NH-(CH₂)₂-, -(CH₂)₇-NH-CH₂-, -CH(NH₂)-CH₂-, -CH₂-CH(NH₂)-, -CH(COOH)-CH₂-, -CH₂-CH(COOH)- und -CH(R³)-,
wobei jedes e' unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer chemischen Bindung, -NH-C(O)-, -C(O)-NH-, -C(O)-O- und -O-C(O)-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(S)-NH-, -C(O)-N(CH₃)-, -N(CH₃)-C(O)-, -NH-C(S)-, -C(S)-NH-,
wobei eine der Wellenlinien die Konjugationsstelle an f anzeigt und die andere Wellenlinie die Konjugationsstelle an die Farbstoff-Einheit (C) anzeigt, wobei e' insbesondere -NH-C(O)- ist; und
wobei m eine ganze Zahl von 0 bis 8 angibt.
Daher kann die Farbstoff-Einheit (C) auf verschiedenerlei Weise konjugiert werden. Hiermit geben die nachstehend aufgeführten Beispiele für (C) jeweils die aufgeführten Farbstoff-Einheiten (C) selbst an, d. h. ohne die funktionelle Gruppe ihres Vorläufers, die an die Chelator-Einheit von Radiometallen (B) über den Spacer y konjugiert wird und damit einen Teil von e' des Spacers y bildet. Mit anderen Worten, kann die Farbstoff-Einheit (C) (ein) beliebige(s) zusätzliche(s) Atom(e) oder (einen) beliebige(n) zusätzliche(n) Linker enthalten, die notwendig oder geeignet sind, eine Farbstoff-Einheit (C) an den Rest der Verbindung, insbesondere den Spacer y, anzuheften. Zum Beispiel können Verknüpfungsgruppen, die Alkylen- (z. B. unverzweigtes oder verzweigtes C_1-10-Alkylen), Arylen- (z. B. ein C₆- oder C₁₀-Arylen (z. B. C₆H₄ oder C₁₀H₆), eine Kombination von Alkylen- und Arylen- oder Alkylen- oder Arylengruppen mit Heteroatomen (die potenziell funktionelle Gruppen bilden, wie z. B. eine Amidgruppe, eine Estergruppe, ein Amin, eine Carboxylgruppe, eine Carbonylgruppe, eine Isothiocyanatgruppe, eine Isocyanatgruppe, eine Maleinimidgruppe, eine Azidgruppe, eine Succinimidylgruppe, eine Carbonatgruppe, eine Carbamatgruppe usw.) gegebenenfalls in einer Farbstoff-Einheit (C) vorhanden sein, solange der Linker die gewünschten Spektraleigenschaften der Farbstoff-Einheit (C), insbesondere die Fluoreszenz der Farbstoff-Einheit (C), nicht stört.
Daher kann eine Farbstoff-Einheit (C) von dem entsprechenden Farbstoff stammen, der mit dem Rest der Verbindung, insbesondere dem Spacer y, durch alle im Stand der Technik bekannte Mittel konjugiert werden kann. Die Konjugationsstelle zwischen dem Rest der Verbindung, insbesondere an den Spacer y, und einer Farbstoff-Einheit (C) kann auch an einer solchen Konjugationsstelle beteiligte Reste von funktionellen Gruppen umfassen, die von dem Vorläufer-Farbstoff stammen, von dem die Farbstoff-Einheit (C) stammt. Vorzugsweise ist eine solche Konjugationsstelle als e' definiert, wie hierin definiert. Daher bildet die Konjugationsstelle einen Teil des Spacers y und die von einem bestimmten Farbstoff stammende Farbstoff-Einheit (C), die die Struktur des Farbstoffs ohne die an einer solchen Bindung beteiligte(n) funktionelle(n) Gruppe(n) hat, bildet vorzugsweise einen Teil von e'.
Folglich bedeutet in Zusammenhang mit einer Farbstoff-Einheit der Begriff ”stammend von” einer bestimmten Farbstoff-Einheit, dass die Farbstoff-Einheit aus der Reaktion des freien (ungebundenen) Farbstoffs durch eine funktionelle Gruppe des Farbstoffs oder eine Modifikation davon hervorgeht. Übliche Modifikationen können aktivierte funktionelle Gruppen des freien Farbstoffs, die Einführung einer funktionellen Gruppe (z. B. direkt oder über einen Spacer) in den freien Farbstoff oder der Linker sein. In der Verbindung der vorliegenden Erfindung können die Reste einer solchen funktionellen Gruppe einen Teil des Restes e', wie hierin definiert, bilden.
Eine Gegenion, wie hier verwendet, kann ein beliebiges pharmazeutisch annehmbares Ion sein, das für die Neutralisierung der Ladung eines Restes oder der Verbindung der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Es sollte selbstverständlich sein, dass ein einzelnes Gegenion nicht notwendigerweise die gleiche Wertigkeit hat wie ein geladener Rest oder eine geladene Verbindung der vorliegenden Erfindung. Auch zwei oder mehr Gegenionen können dazu verwendet werden, eine Verbindung zu neutralisieren, die eine höhere Ladungsvalenz als +1 oder –1 trägt. Ebenso kann umgekehrt auch ein einzelnes Gegenion, das eine Ladung mit einer höheren Wertigkeit als +1 oder –1 trägt, zum Neutralisieren von mehr als einer Verbindung verwendet werden. Vorzugsweise ist das Gegenion in wässrigen Flüssigkeiten gut löslich.
Ein pharmazeutisch annehmbares negativ geladenes Gegenion X^– kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung jede beliebige Ladungsvalenz haben. Daher kann X^– zum Beispiel eine Ladung von –1, –2, –3 oder –4, vorzugsweise von –1 oder –2, besitzen. Ladung kann gegebenenfalls auch von Ionenstärke bzw. pH abhängen. X^– kann ein beliebiges pharmazeutisch annehmbares negativ geladenes Ion sein. Das Ion ist vorzugsweise derart gut löslich in wässrigen Flüssigkeiten. Zum Beispiel kann X^– aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus einem Halogenidanion (z. B. F^– oder Cl^–), Acetat, Phosphat, Hydrogenphosphat und einem pharmazeutisch annehmbaren Carboxylat (z. B. einem Fettsäurecarboxylat) besteht. Ferner sollte selbstverständlich sein, dass das Gegenion in der Regel von den umgebenden Flüssigkeiten abhängt, wie diejenigen, die in dem Puffer, in dem die Verbindung gelöst ist, und den Körperflüssigkeiten nach Injektion in vivo enthalten sind. In vivo ist extrazellulär eines der hauptsächlichen, aber nicht das einzige negativ geladene Gegenionen Cl^–.
”C_1-10-Alkylenrest” bedeutet eine Alkylenkette mit 1-10 Kohlenstoffatomen, wenn zwei Einheiten eines Moleküls durch die Alkylengruppe verknüpft sind. Vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise, ist der C_1-10-Alkylenrest in Zusammenhang mit dem Rest f des Spacers y ein geradkettiger, d. h. unverzweigter, C_1-10-Alkylenrest, in dem gegebenenfalls ein oder mehrere Wasserstoff(e) substituiert ist/sind und/oder in dem gegebenenfalls eine oder mehrere -CH₂-Einheiten durch -O- oder -NH- ersetzt sind. Beispiele sind vorstehend gezeigt.
In einer stärker bevorzugten Ausführungsform trägt der Spacer y eine der folgenden Strukturen:
-(CH₂)_t-C(O)-NH-(CH₂)_u-(O-CH₂-CH₂)_v-(CH₂)_w-e'- oder
-(CH₂)_t-C(O)-NH-(CH₂-CH₂-O)_v-CH₂-e'-,
worin t 1 oder 2, insbesondere 2, ist;
worin u eine ganze Zahl von 1 bis 10, vorzugsweise von 1 bis 3, insbesondere 2, ist;
worin v eine ganze Zahl von 0 bis 3, insbesondere 2, ist;
worin w eine ganze Zahl von 0 bis 2, insbesondere 0, ist.
In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform trägt der Spacer y eine der folgenden Strukturen:
-(CH₂)₂-C(O)-NH-(CH₂)₂-(O-CH₂-CH₂)₂-e'-(CH₂)₂-C(O)-NH-(CH₂)₂-(O-CH₂-CH₂)₂-NH-C(O)-CH₂-(O-CH₂-CH₂)_n'-O-CH₂-e'-,
-(CH₂)₂-C(O)-NH-(CH₂)₂-(O-CH₂-CH₂)₂-NH-[C(O)-CH((CH₂)₂COOH)-NH]_n''-C(O)-CH((CH₂)₂COOH)-e'-,
-(CH₂)₂-C(O)-NH-(CH₂)₂-(O-CH₂-CH₂)₂-NH-[C(O)-CH((CH₂)₄NH₂)₄-NH]_n''-C(O)-CH((CH₂)₄NH₂)-e'- oder
-(CH₂)₂-C(O)-NH-(CH₂)₂-(O-CH₂-CH₂)₂-NH-[C(O)-CH((CH₂)₄N⁺(CH₃)₃)-NH]_n''-C(O)-CH((CH₂)₄N⁺(CH₃)₃)-e'-+ X^–,
worin n' eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist;
worin n'' eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist;
worin X^– ein pharmazeutisch annehmbares negativ geladenes Gegenion ist und
worin jedes e' unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer chemischen Bindung, -NH-C(O)-, -C(O)-NH-, -C(O)-C- und -O-C(O)-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(S)NH-, -C(O)-N(CH₃)-, -N(CH₃)-C(O)-, -NH-C(S)-, -C(S)-NH-,
wobei eine der Wellenlinien die Konjugationsstelle an f anzeigt und die andere Wellenlinie die Konjugationsstelle an die Farbstoff-Einheit (C) anzeigt, wobei e' insbesondere -NH-C(O)- ist.
Die Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon kann vorzugsweise ein oder mehrere Radiometall(e) (einschließlich ⁶⁸Ga) komplexieren und kann dadurch einen Verbindung-Radiometall-Komplex bilden oder kann alternativ nicht komplexiert sein. Offensichtlich ist zum Nachweis eines Radioaktivitätssignals die Verbindung oder das Salz davon vorzugsweise mit mindestens einem Radiometall komplexiert, wohingegen es zum Nachweis eines Fluoreszenzsignals optional ist, ob die Verbindung oder das Salz davon ein Radiometall komplexiert oder nicht. Folglich kann in Zusammenhang mit dem Nachweis eines Radioaktivitätssignals der Begriff ”Verbindung” derart verstanden werden, dass die Verbindung vorzugsweise mindestens ein Radiometall komplexiert.
Wie vorstehend erwähnt, ist die Chelator-Einheit von Radiometallen (B) ein Chelator, der zur Komplexierung von ⁶⁸Ga geeignet ist, insbesondere zur Komplexierung von ⁶⁸Ga in wässriger Umgebung geeignet ist.
Gallium-68 (⁶⁸Ga) hat eine Halbwertszeit von etwa 68 Minuten und ist somit für längere Transporte eher ungeeignet. Daher kann es in der Regel nahe der Stelle erzeugt werden, an der es mit der Verbindung der vorliegenden Erfindung oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon komplexiert wird und einem Patienten in vivo und/oder einer Probe in vitro verabreicht wird.
Deshalb ist in einer bevorzugten Ausführungsform die Chelator-Einheit von Radiometallen (B) eine ⁶⁸Ga-Chelator-Einheit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
wobei in jeder der Strukturen eine der Wellenlinien die Konjugationsstelle an das Motiv (A), das spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindet, vorzugsweise über einen Spacer x, wie hier definiert, anzeigt und die andere Wellenlinie die Konjugationsstelle an die Farbstoff-Einheit (C), vorzugsweise über den Spacer y, wie hier definiert, anzeigt,
wobei die ⁶⁸Ga-Chelator-Einheit insbesondere Folgende ist
Wenn dieser Chelator verwendet wird, ist b'''' vorzugsweise -C(O)-, d¹ und d² sind vorzugsweise jeweils -(CH₂)₂- und e ist vorzugsweise -C(O)-NH oder -C(O)-O-. Daher ist die Chelator-Einheit mit zwei Einheiten -C(O)-(CH₂)₂-# konjugiert, wobei diese an der durch ”#” angegebenen Position mit den Bindungsstellen der vorstehend genannten Chelator-Einheit, die durch die Wellenlinien gekennzeichnet sind, konjugiert werden. Dann wird dieser Rest auch als HBED-CC bezeichnet.
Man wird erkennen, dass mehrere dieser ”⁶⁸Ga-Chelator-Einheiten”, die vorstehend beispielhaft aufgeführt sind, auch als Strukturen dienen können, die ein oder mehrere andere Radiometall(e), wie z. B. ⁶⁴Cu, insbesondere in wässriger Umgebung mit annähernd neutralem pH, komplexieren.
Vorzugsweise löscht weder das spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindende Motiv (A) noch das komplexierte Radiometall oder die Chelator-Einheit von Radiometallen (B) die Intensität des Fluoreszenzsignals, das von der Farbstoff-Einheit (C) bei ihrem Emissionsmaximum in einer wässrigen Umgebung mit etwa neutralem pH (d. h. pH 6–8, insbesondere 6,5–7,5) erhältlich ist, um mehr als 50%.
Die Farbstoff-Einheit (C) kann eine im Stand der Technik bekannte Farbstoff-Einheit sein. Vorzugsweise ist sie geeignet zum Emittieren von Licht in einer wässrigen Umgebung mit etwa neutralem pH, d. h. pH 6–8, insbesondere 6,5–7,5, insbesondere pH 7,0–7,5.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Farbstoff-Einheit (C) eine Fluoreszenzfarbstoff-Einheit mit einem Emissionsmaximum im Bereich von 400 nm bis 1000 nm, wobei die Farbstoff-Einheit eine Einheit eines Fluoreszenzfarbstoffs ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
einem Indocyanin-Grün(ICG)-Farbstoff, der insbesondere von Sulfo-Indocyanin-Grün (Sulfo ICG) stammt;
einem Farbstoff des Fluorescein-Typs, der vorzugsweise von Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Carboxyfluorescein oder Fluorescein stammt, insbesondere von FITC stammt;
einem Farbstoff des Rhodamin-Typs, der insbesondere von Rhodamin G stammt; einem Cyanin-Farbstoff, der vorzugsweise von Sulfocy5, Cyanin 5.5, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy7.5, einem Alexa Fluor-Farbstoff, DyLight, einem FluoProbe-Farbstoff, einem Sulfo-Cy-Farbstoff oder einem Seta-Farbstoff stammt, insbesondere von Cy5, Alexa 488 oder Alexa 547 stammt;
einem Infrarot-Farbstoff, der insbesondere von IRDye 800CW, IRDye 800RS, IRDye 800, IRDye 700, IRDye 700DX, IRDye 680 oder IRDye 680LT stammt;
einem Phenoxacin Farbstoff, der insbesondere von Nilrot oder Nilblau stammt einer von einem Allophycocyanin-Farbstoff stammenden Farbstoff-Einheit;
einer von einem Berberin-Farbstoff stammenden Farbstoff-Einheit;
einer von Chinin oder einem Fluoreszenz-Chinin-Derivat stammenden Farbstoff-Einheit;
einer von Cumarin stammenden Farbstoff-Einheit;
einer von 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) stammenden Farbstoff-Einheit;
einer von Epicocconon stammenden Farbstoff-Einheit;
einer von 5-({2-[(Iodacetyl)amino]ethyl}amino)naphthalin-1-sulfonsäure (IAEDANS) stammenden Farbstoff-Einheit;
einem Atto-Farbstoff, der vorzugsweise von ATTO 647, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 520, ATTO 532, ATTO 550, ATTO 565, ATTO 590, ATTO 594, ATTO 610, ATTO 611X, ATTO 620, ATTO 633, ATTO 635, ATTO 637, ATTO 647N, ATTO 655, ATTO 665, ATTO 680, ATTO 700, ATTO 725, ATTO 740, ATTO 390, ATTO 425, ATTO 465, insbesondere ATTO 647 oder ATTO 488 stammt;
einem Visen-Farbstoff, der insbesondere von VivoTag680 oder VivoTag750 stammt; und
einer von einem HOECHST-Farbstoff stammenden Farbstoff-Einheit.
Weitere Beispiele für Farbstoff-Einheiten des Rhodamin-Typs, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, können diejenigen sein, die von den von Kolmakov et al. (vgl. Kolamkov et al., 2012; Kolmakov et al., 2014) gezeigten Fluorophoren, wie z. B. darin gezeigtem KK114 oder Abberior Star 635 P, herrühren können.
Es wird darauf hingewiesen, dass diese hier aufgeführten Beispiele für eine Farbstoff-Einheit (C) die Molekülstrukturen der Farbstoff-Einheiten (C) selbst angeben, d. h. ohne die funktionelle Gruppe von deren Vorstufe, die an die Chelator-Einheit von Radiometallen (B) über den Spacer y konjugiert wird und damit einen Teil von e' des Spacers y bildet.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Farbstoff-Einheit (C) ein Fluoreszenzfarbstoff, der aus der Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus:
einem Indocyanin-Grün(ICG)-Farbstoff, insbesondere Sulfoindocyanin-Grün (Sulfo ICG),
einem Farbstoff des Fluorescein-Typs, insbesondere FITC,
einem Cyanin-Farbstoff, insbesondere Sulfo Cy5 oder Cyanin 5.5,
einem Atto-Farbstoff, insbesondere ATTO 647N,
Alexa 488,
einem Infrarot-Farbstoff, insbesondere IRDye 800CW.
In einer sehr stark bevorzugten Ausführungsform ist die Farbstoff-Einheit (C) eine Fluoreszenzfarbstoff-Einheit, ausgewählt aus der Gruppe, die aus den folgenden Strukturen besteht:

wobei X^– ein pharmazeutisch annehmbares negativ geladenes Gegenion ist;
wobei Y⁺ ein pharmazeutisch annehmbares positiv geladenes Gegenion ist; und
wobei die Wellenlinie die Konjugationsstelle an den Rest der Verbindung der vorliegenden Erfindung angibt.
Ein pharmazeutisch annehmbares negativ geladenes Gegenion X^– kann im weitesten Sinne wie vorstehend dargelegt verstanden werden.
Ebenso kann auch ein pharmazeutisch annehmbares positiv geladenes Gegenion Y⁺ einen beliebige Wertigkeit haben. Y⁺ kann daher zum Beispiel eine Ladung von +1, +2, +3 oder +4, vorzugsweise von +1 oder +2, haben. Y⁺ kann ein beliebiges pharmazeutisch annehmbares positiv geladenes Ion sein. Das Ion ist vorzugsweise ein solches, das gut löslich in wässrigen Flüssigkeiten ist. Zum Beispiel kann Y⁺ aus der Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus einem Kation eines Alkalimetalls (z. B. Na⁺, K⁺, Li⁺), einem Kation eines Erdalkalimetalls (z. B. Mg²⁺, Ca²⁺), Al³⁺, NH₄ ⁺, H⁺ und einem Kation eines organisch gebundenen Amins. Ferner ist selbstverständlich, dass das Gegenion in der Regel von den umgebenden Flüssigkeiten abhängt, wie diejenigen, die in dem Puffer, in dem die Verbindung gelöst ist, und den Körperflüssigkeiten nach Injektion in vivo enthalten sind. In vivo ist extrazellulär eines der hauptsächlichen, aber nicht das einzige positiv geladene Gegenion Na⁺.
Vorzugsweise zeigt die Wellenlinie die Konjugationsstelle an den Spacer y an. Stärker bevorzugt zeigt die Wellenlinie die Konjugationsstelle an e' an.
Wie vorstehend erwähnt, kann die Verbindung ein Spacer-Molekül umfassen oder nicht. Vorzugsweise umfasst sie mindestens ein Spacer-Molekül. Wie hier verwendet, ist ein Spacer im weitesten Sinne jedes beliebige Molekül, das einen größeren Abstand der Komponenten (A), (B) und (C) voneinander ermöglicht. Da der Spacer vorzugsweise ein flexibler Spacer sein kann, wird deutlich, dass Molekülbewegung, insbesondere in einer wässrigen Umgebung, den Abstand der Reste (A), (B) und (C) zueinander verändern kann. Die Länge des Spacers definiert jedoch den maximalen Abstand zwischen diesen Resten. Der bzw. die Spacer kann/können vorzugsweise das Fluoreszenzsignal im Wesentlichen nicht löschen, das von der Farbstoff-Einheit (C) bei ihrem Emissionsmaximum in einer wässrigen Umgebung mit etwa neutralem pH-Wert (d. h. pH 6–8, insbesondere 6,5–7,5) erhältlich ist. Daher sind die Spacer möglichst frei von aromatischen-Einheiten.
In einer bevorzugten Ausführungsform hat die Verbindung die folgende Molekülstruktur: (A)-(B)-Spacer-(C), hat vorzugsweise die folgende Molekülstruktur: (A)-Spacer-(B)-Spacer-(C), wobei:

(A) ein Prostata-spezifisches Membranantigen(PSMA)-bindendes Motiv betrifft, das folgendes Strukturmotiv umfasst
wobei das Motiv an (B) über den epsilon-Aminorest der Lysin-Einheit konjugiert ist;
(B) eine ⁶⁸Ga-Chelator-Einheit, insbesondere eine ⁶⁸Ga-Chelator-Einheit, betrifft, die folgendes Motiv umfasst
(C) eine Farbstoff-Einheit mit einem Emissionsmaximum im Bereich von 400 nm bis 1000 nm betrifft; und der Spacer eine Molekülstruktur umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Polyethylenglykol (PEG)-, Alkylen-, Peptid- oder Peptidomimetikum-Spacer, wobei der Spacer vorzugsweise eine Länge von 0,5 bis 10 nm besitzt, wobei der Spacer insbesondere einen PEG-Spacer umfasst, der nicht mehr als 2 bis 10 aufeinander folgende PEG-Monomere umfasst.

Gegebenenfalls kann eine PEG-Einheit substituiert sein. Vorzugsweise kann eine PEG-Einheit nicht substituiert sein. Dann kann zum Beispiel Wasserstoff durch ein Heteroatom oder eine funktionelle Gruppe ersetzt sein. Zum Beispiel kann ein Wasserstoffatom durch -NH₂, -SH, -OH oder durch ein Halogen ersetzt sein. Vorzugsweise kann ein PEG-Monomer eine -O-CH₂-CHR^a-Einheit sein, worin R^a H sein kann (dann ist die PEG-Einheit eine nicht substituierte PEG-Einheit), oder -NH₂, -SH oder -OH (dann ist die PEG-Einheit eine substituierte PEG-Einheit). Hier umfasst PEG vorzugsweise mindestens zwei Reste -O-CH₂-CH₂- und nicht mehr als 10 Reste -O-CH₂-CH₂-. Ein Alkylen ist in diesem Zusammenhang vorzugsweise ein C_1-10-Alkylen, ein Peptid oder ein Peptidomimetikum, das vorzugsweise von ein bis zehn Aminosäure-Einheiten und/oder Analoga davon umfasst.
”C_1-10-Alkyl-Rest” bedeutet eine Alkylkette mit 1-10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise eine gerade Alkylkette. Vorzugsweise ist ein C_1-10-Alkylrest ein geradkettiger.
In einer stärker bevorzugten Ausführungsform hat die Verbindung die folgende Molekülstruktur: (A)-x-(B)-y-(C), worin:

(A) ein Prostata-spezifisches Membranantigen(PSMA)-bindendes Motiv betrifft, das folgendes Strukturmotiv umfasst
worin das Motiv an (B) über den Spacer x über den epsilon-Aminorest der Lysin-Einheit konjugiert ist;
(B) eine ⁶⁸Ga-Chelator-Einheit betrifft, insbesondere eine ⁶⁸Ga-Chelator-Einheit, die folgendes Motiv umfasst
(C) eine Farbstoff-Einheit mit einem Emissionsmaximum im Bereich von 400 nm bis 1000 nm betrifft; und wobei der Spacer y eine Molekülstruktur umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus Polyethylenglykol (PEG) mit zwei bis 10 aufeinander folgenden PEG-Einheiten, einem C_1-10-Alkylen, einem Peptid oder Peptidomimetikum, umfassend ein bis zehn Aminosäure-Einheiten und/oder Analoga davon, und einer Kombination von zwei oder mehr davon, wobei der Spacer vorzugsweise eine Länge von 0,5 bis 10 nm hat, wobei der Spacer insbesondere einen PEG-Spacer umfasst, der 2 bis 10 aufeinander folgende PEG-Monomere umfasst.

In einer stärker bevorzugten Ausführungsform hat die Verbindung die folgende Molekülstruktur: (A)-x-(B)-y-(C), wobei:

(A) ein Prostata-spezifisches Membranantigen(PSMA)-bindendes Motiv betrifft, das folgendes Strukturmotiv umfasst
worin das Motiv an (B) über den Spacer x über der epsilon-Aminorest der Lysin-Einheit konjugiert ist; X für die Struktur steht -[C(O)-(CH₂)₅-NH]_n-C(O)-(CH₂)₂-, worin n 0 oder 1 ist;
(B) eine ⁶⁸Ga-Chelator-Einheit betrifft, insbesondere eine ⁶⁸Ga-Chelator-Einheit, die folgendes Motiv umfasst
y für eine der folgenden Strukturen steht: -(CH₂)_t-C(O)-NH-(CH₂)_u-(O-CH₂-CH-)_v-(CH₂)_w-e'- oder -(CH₂)_t-C(O)-NH-(CH₂-CH₂-O)_v-CH₂-e'-, worin t 1 oder 2, insbesondere 2, ist; worin u eine ganze Zahl von 1 bis 10, vorzugsweise von 1 bis 3, insbesondere 2, ist; worin v eine ganze Zahl von 0 bis 3, insbesondere 2, ist; worin w eine ganze Zahl von 0 bis 2, insbesondere 0, ist, wobei y insbesondere für folgende Struktur steht: -(CH₂)₂-C(O)-NH-(CH₂)₂-(O-CH₂-CH₂)₂-e'-; und
(C) eine Farbstoff-Einheit mit einem Emissionsmaximum im Bereich von 400 nm bis 1000 nm betrifft.

Folglich hat in einer sehr stark bevorzugten Ausführungsform die Verbindung die folgende chemische Struktur:
wobei n 0 oder 1 angibt;
worin jedes e' unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer chemischen Bindung, -NH-C(O)-, -C(O)-NH-, -C(O)-O- und -O-C(O)-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(S)NH-, -C(O)-N(CH₃)-, -N(CH₃)-C(O)-, -NH-C(S)-, -C(S)-NH-,

wobei eine der Wellenlinien die Konjugationsstelle an f anzeigt und die andere Wellenlinie die Konjugationsstelle an die Farbstoff-Einheit (C) anzeigt, wobei e' insbesondere -NH-C(O)- ist; und
worin (C) die Farbstoff-Einheit (C) angibt, die vorzugsweise ein Emissionsmaximum im Bereich von 400 nm bis 1000 nm besitzt, insbesondere ein Fluoreszenzfarbstoff ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Indocyanin-Grün(ICG)-Farbstoff, insbesondere Sulfo-Indocyanin-Grün (Sulfo ICG), einem Farbstoff des Fluorescein-Typs, insbesondere FITC, einem Cyanin-Farbstoff, insbesondere SulfoCy5 oder Cyanin 5.5, Alexa 488, einem Atto-Farbstoff, insbesondere ATTO 647N, und einem Infrarot-Farbstoff, insbesondere IRDye 800CW.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform hat die Verbindung eine der folgenden chemischen Strukturen: PSMA-Ahx-HBED-CC-FITC:
PSMA-Ahx-HBED-CC-Alexa 488:
PSMA-Ahx-HBED-CC-Cvanin 5.5:
PSMA-Ahx-HBED-CC-Sulfocy5:
PSMA-Ahx-HBED-CC-ATTO647N:
PSMA-Ahx-HBED-CC-ICG:
PSMA-Ahx-HBED-CC-IRdye800CW:
wobei X^– ein pharmazeutisch annehmbares negativ geladenes Gegenion ist und wobei Y⁺ ein pharmazeutisch annehmbares positiv geladenes Gegenion ist.
Ein pharmazeutisch annehmbares negativ geladenes Gegenion X^– und ein pharmazeutisch annehmbares positiv geladenes Gegenion Y⁺ kann jeweils im weitesten Sinne wie vorstehend erläutert verstanden werden.
In einer alternativen besonders bevorzugten Ausführungsform hat die Verbindung die folgende chemische Struktur (PSMA-HBED-CC-FITC):
Vorzugsweise bergen die Aminosäure-Einheiten (d. h. die Glutamat-Einheit und die Lysin-Einheit), die in dem spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindenden Motiv enthalten sind, die L-Konfiguration.
Die Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch rationale chemische Synthese erhalten werden.
Folglich wird weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon offenbart, umfassend die folgenden Schritte:

(i) Bereitstellen mindestens eines spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindenden Motivs (A), worin alle reaktiven Einheiten außer einer geschützt sind;
(ii) Umsetzen des mindestens einen Motivs mit mindestens einer Chelator-Einheit von Radiometallen (B);
(iii) Umsetzen der aus Schritt (ii) erhaltenen Verbindung mit einer von:
(a) mindestens einer aktivierten Farbstoff-Einheit (C),
(b) mindestens einer Spacer-konjugierten Farbstoff-Einheit (C), wobei der Spacer aktiviert ist, oder
(c) mindestens (einem) Spacer-Molekül(en), das/die anschließend mit mindestens einer aktivierten Farbstoff-Einheit (C) umgesetzt wird/werden;
(iv) Entfernen der Schutzgruppen von der in Schritt (iii) erhaltenen Verbindung; und
(v) Isolieren der in Schritt (iv) erhaltenen Verbindung oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon.

Weiterhin offenbart wird auch ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung mit der Formel (A)-(B)-(C) oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, worin ”–” eine Bindung über ein Spacer-Molekül oder eine direkte Bindung, vorzugsweise eine Bindung über ein Spacer-Molekül, sein kann, wobei diese Verbindung die Molekülstruktur (A)-x-(B)-y-(C) hat, wobei x und y jeweils unabhängig voneinander ein Spacer-Molekül sind, umfassend die folgenden Schritte:

(i) Bereitstellen mindestens eines spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindenden Motivs (A), das gegebenenfalls mit einem Spacer x oder einem Teil davon konjugiert ist, worin alle reaktiven Einheiten außer einer geschützt sind;
(ii) Umsetzen des mindestens einen Motivs mit mindestens einer Chelator-Einheit von Radiometallen (B), die gegebenenfalls mit einem Spacer x oder einem Teil davon und/oder einem Spacer y oder einem Teil davon konjugiert ist;
(iii) Umsetzen der aus Schritt (ii) erhaltenen Verbindung mit einer von:
(a) mindestens einer aktivierten Farbstoff-Einheit (C),
(b) mindestens einer Spacer-konjugierten Farbstoff-Einheit (C), wobei der Spacer aktiviert ist, oder
(c) mindestens (einem) Spacer-Molekül(en) y oder Teilen davon, das/die anschließend mit mindestens einer aktivierten Farbstoff-Einheit (C) umgesetzt wird/werden;
(iv) Entfernen der Schutzgruppen von der in Schritt (iii) erhaltenen Verbindung; und
(v) Isolieren der in Schritt (iv) erhaltenen Verbindung oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon.

Hier können auch die Definitionen, wie vorstehend dargelegt, insbesondere die Definitionen von (A), (B), (C), x und y, gelten.
Vorzugsweise sind das spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindende Motiv (A), die Chelator-Einheit von Radiometallen (B), die Farbstoff-Einheit (C), der Spacer x und/oder der Spacer y definiert, wie vorstehend dargelegt.
Stärker bevorzugt sind das spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindende Motiv (A), die Chelator-Einheit von Radiometallen (B), die Farbstoff-Einheit (C), der Spacer x und der Spacer y definiert, wie vorstehend dargelegt.
Wenn zum Beispiel das Bindungsmotiv ein PSMA-bindendes Motiv ist, kann das darin enthaltene Glu-Harnstoff-Lys-Motiv mittels Durchführen einer Isocyanat-Reaktion des geschützten Glu mit Harz-immobilisiertem Lysin erhalten werden.
Das erhaltene Produkt kann dann mit einem bi-aktivierten TFP-Ester von N,N-Bis(2-hydroxybenzyl)ethylendiamin-N,N-diessigsäure (HBED-CC) und 2,2'-(Ethylendioxy)bis(ethylamin) unter Herstellung des Vorläufers für die Farbstoff-Konjugation umgesetzt werden. Dann kann ein reaktiver Fluoreszenzfarbstoff, wie z. B. Fluoresceinisothiocyanat (FITC), konjugiert werden. Dies wird in den Beispielen weiter veranschaulicht.
Das Verfahren kann zu jeder beliebigen Verbindung oder jedem beliebigen Salz davon führen, die/das mindestens ein spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindendes Motiv (A), mindestens eine Chelator-Einheit von Radiometallen (B) und mindestens eine Farbstoff-Einheit (C) umfasst.
Vorzugsweise sind das spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindende Motiv (A), die Chelator-Einheit von Radiometallen (B) und/oder die Farbstoff-Einheit (C) wie vorstehend definiert.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können durch ein Verfahren, wie hierin offenbart, erhältlich sein.
Folglich kann eine Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon durch das vorstehende Verfahren erhältlich sein.
Vorzugsweise umfasst die durch das Verfahren erhältliche Verbindung das spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindende Motiv (A) und die Chelator-Einheit von Radiometallen (B) und gegebenenfalls die Farbstoff-Einheit (C), wie vorstehend definiert. Alternativ oder zusätzlich umfasst die durch das Verfahren erhältliche Verbindung das spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindende Motiv (A) und die Farbstoff-Einheit (C) und gegebenenfalls die Chelator-Einheit von Radiometallen (B), wie vorstehend definiert. Alternativ oder zusätzlich umfasst die durch das Verfahren erhältliche Verbindung die Farbstoff-Einheit (C) und die Chelator-Einheit von Radiometallen (B) und gegebenenfalls umfasst die durch das Verfahren erhältliche Verbindung das spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindende Motiv (A), wie vorstehend definiert.
Besonders bevorzugt umfasst die durch das Verfahren erhältliche Verbindung das spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindende Motiv (A), die Chelator-Einheit von Radiometallen (B) und die Farbstoff-Einheit (C) sind wie vorstehend definiert.
Die Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung kann im Wesentlichen rein sein oder kann ein Teil einer Zusammensetzung sein, die weiterhin ein Radiometall und einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Träger umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine Zusammensetzung, umfassend:

(a) die Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, wie vorstehend definiert;
(b) ein Radiometall, insbesondere ⁶⁸Ga, und gegebenenfalls
(c) einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Träger.

Ein pharmazeutisch annehmbarer Träger kann jedes Mittel sein, das pharmazeutisch annehmbar und zu der mit dem Radiometall komplexierten Verbindung (dem Verbindung-Radiometall-Komplex) hinzufügbar ist.
Zum Beispiel kann ein pharmazeutisch annehmbarer Träger ein Lösungsmittel ohne oder mit geringer Toxizität, wie z. B. Wasser, einen wässrigen Puffer (z. B. einen Hepes-, Tris- oder Phosphat-Puffer, einen Phosphatpuffer), ein pharmazeutisch annehmbares organisches Lösungsmittel (z. B. Dimethylsulfoxid (DMSO), Ethanol, Pflanzenöl, Paraffinöl) oder eine Kombination von zwei oder mehreren davon umfassen.
Ferner kann der pharmazeutisch annehmbare Träger ein oder mehrere Detergenzien, ein oder mehrere Schaummittel (z. B. Natriumlaurylsulfat (SLS)/Natriumdoceylsulfat (SDS)), ein oder mehrere Färbemittel (z. B. TiO₂, Lebensmittelfarbe), ein oder mehrere Vitamine, ein oder mehrere Salze (z. B. Natrium-, Kalium-, Calcium-, Zinksalze), ein oder mehrere Feuchthaltemittel (z. B. Sorbit, Glycerin, Mannit, Propylenglycol, Polydextrose), ein oder mehrere Enzyme, ein oder mehrere Konservierungsmittel (z. B. Benzoesäure, Methylparaben), ein oder mehrere strukturgebende Mittel (z. B. Carboxymethylcellulose (CMC), Polyethylenglykol (PEG), Sorbit), einen oder mehrere Emulgatoren, einen oder mehrere Füllstoffe, ein oder mehrere Überzugsmittel, ein oder mehrere Trennmittel, ein oder mehrere Antioxidantien, einen oder mehrere Kräuter- und Pflanzenauszüge, ein oder mehrere Stabilisierungsmittel, ein oder mehrere Polymere (z. B. Hydroxypropylmethacrylamid (HPMA), Polyethylenimin (PEI), Carboxymethylcellulose (CMC), Polyethylenglykol (PEG)), ein oder mehrere Aufnahme-Mediatoren (z. B. Polyethylenimin (PEI), Dimethylsulfoxid (DMSO), ein in Zellen eindringendes Peptid (cell penetrating peptide, CPP), eine Proteintransduktionsdomäne (PTD), ein antimikrobielles Peptid usw.) einen oder mehrere Antikörper, einen oder mehrere Süßstoffe (z. B. Acesulfam, ein Acesulfamsalz (z. B. Acesulfam-Kalium (Acesulfam-K), Aspartam, Cyclamat, Saccharin, ein Saccharin-Salz (z. B. Saccharin-Natrium (Saccharin-Na)), Alitam, Neotam, Sucralose, Dulcin, Salz von Aspartam-Acesulfam, Sorbit, Stevia, Glycerin, Inulin, Mannit, Isomalt, Maltit, Maltooligosaccharid, Lactitol, Xylit, Glucin, Neohesperidin-Dihydrochalcon, P-4000, Brazzein, Curculin, Erythrit, Glycyrrhizin, hydrierte Stärkehydrolysate, Luo Han Guo, Mabinlin, Miraculin, Monatin, Monellin, Osladin, Pentadin, Tagatose, Thaumatin), einen oder mehrere Gegenfärbe-Farbstoffe (z. B. Fluorescein, Fluorescein-Derivate, Cy-Farbstoffe, Alexa Fluor-Farbstoffe, Rhodamin, Quantenpunkte usw.), einen oder mehrere homöopathische Inhaltsstoffe, eine oder mehrere gustatorische Substanzen und/oder einen oder mehrere Düfte enthalten. Die diagnostische Zusammensetzung wird in der Regel durch Zusammenbringen der vorstehend genannten Komponente mit einer anderen auf eine beliebige im Stand der Technik bekannte Weise hergestellt. Vorzugsweise wird die diagnostische Zusammensetzung so hergestellt, dass die vorstehend genannten Komponenten vor der Verabreichung an eine Patienten miteinander in Kontakt gebracht werden.
Das Radiometall kann kommerziell von erhalten werden, kann aus der Natur erhalten werden oder kann aus einem Zyklotron erhalten werden. Vorzugsweise wird das Radiometall aus einem Gallium-68-Generator oder einem Zyklotron erhalten, insbesondere aus einem Gallium-68-Generator oder einem Zyklotron, der/das in der Nähe der Stelle lokalisiert ist, an der die Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung gemischt wird und an der gegebenenfalls auch die Diagnose in vivo oder in vitro durchgeführt wird. Besonders bevorzugt wird das Radiometall ⁶⁸Ga aus einem Gallium-68-Generator erhalten, somit einer Vorrichtung, die dazu verwendet wird, das Positronen-emittierende Isotop ⁶⁸Ga von Gallium aus einer Quelle von zerfallendem Germanium-68 zu extrahieren. Von dem Ausgangsisotop ⁶⁸Ge ist bekannt, dass es eine Halbwertzeit von 271 Tagen hat und somit an die Stelle transportiert werden kann, an der sich der Gallium-68-Generator befindet.
Eine solche Zusammensetzung kann zum Diagnostizieren einer Neoplasie in einem Patienten, insbesondere von kanzerösem Gewebe oder Gewebe, bei dem die Gefahr besteht, dass es kanzerös wird, in einem Patienten in vivo als auch in Gewebekultur in vitro verwendet werden.
Folglich wird auch ein Verfahren zum Diagnostizieren eines Neoplasmas in einem Patienten offenbart, der daran leidet oder bei dem die Gefahr dafür besteht, umfassend die Verabreichung ausreichender Mengen der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung an diesen Patienten.
In Zusammenhang mit dem Diagnoseverfahren gelten ebenfalls die Definitionen der Begriffe, wie sie vorstehend in Zusammenhang mit der Verbindung, dem Verbindung-Radiometall-Komplex oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon angegeben sind.
Wie hier verwendet, kann der Begriff ”Patient” im weitesten Sinne als eine Person oder ein Individuum verstanden werden, an die/das die Verbindung oder der Verbindung-Radiometall-Komplex der vorliegenden Erfindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon verabreicht wird, unabhängig davon, ob es sich um einen Menschen oder ein Tier handelt und ob klinische Symptome auftreten oder nicht auftreten. Vorzugsweise ist der Patient ein Säuger, einschließlich Mensch, stärker bevorzugt ein Mensch, ein Hund, ein Pferd, ein Rind, ein Schwein, ein Maultier, ein Esel, ein Schaf, eine Ziege oder ein Kamel. Besonders bevorzugt ist der Patient ein menschlicher Patient.
Ein an Neoplasie leidender Patient kann im weitesten Sinne als jeder Patient mit einem Neoplasma verstanden werden. Hier birgt der an Neoplasie leidende Patient nicht unbedingt irgendwelche klinischen Symptome. Der Patient kann sich eines Neoplasmas bewusst sein oder kann sich nicht bewusst sein, dass er ein Neoplasma hat. Ebenso kann sich der Arzt des Patienten über das Vorhandensein eines Neoplasmas im Klaren sein oder kann sich darüber nicht im Klaren sein. Der Patient kann gegebenenfalls auch unter Schmerzen, einem Gefühl von Druck und/oder gastrointestinaler und/oder urinaler Dysfunktion leiden.
Der Begriff ”Patient, bei dem die Gefahr dafür besteht” kann im weitesten Sinne als jeder Patient verstanden werden, bei dem sich potenziell ein Neoplasma entwickeln könnte. Insbesondere kann der Patient in einem Alter sein, kann unter Bedingungen leben, einer medikamentösen Behandlung ausgesetzt sein, das/die die Genexpression beeinflusst/beeinflussen, und/oder kann eine genetische Erbanlage haben, die mit einem erhöhten Risiko der Entwicklung eines Neoplasma einhergeht. Zum Beispiel kann der Patient, bei dem die Gefahr dafür besteht, älter als 40 Jahre, vorzugsweise älter als 45 Jahre, stärker bevorzugt älter als 50 Jahre, noch stärker bevorzugt älter als 60 Jahre, noch stärker bevorzugt älter als 70 Jahre, insbesondere älter als 80 Jahre sein. Alternativ oder zusätzlich kann der Patient übergewichtig sein. Alternativ oder zusätzlich kann der Patient eine Familiengeschichte haben, in der Krebs vergleichsweise häufig ist, wobei insbesondere Familienmitglieder ersten Grades an Krebs leiden.
Die Verbindung, der Verbindung-Radiometall-Komplex oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon kann dem Patienten durch jedes beliebige Mittel verabreicht werden. Sie/er/es wird vorzugsweise in das Gewebe von Interesse (d. h. das neoplastische Gewebe und/oder Gewebe, bei dem die Gefahr besteht, dass es neoplastisch ist) oder in ein Blutgefäß über eine Spritze oder einen Tropf injiziert. Alternativ kann sie/er/es auch intraperitoneal injiziert oder kann oral, nasal, respiratorisch, topisch oder subkutan verabreicht werden.
Zum Beispiel kann die Verbindung, der Verbindung-Radiometall-Komplex oder das pharmazeutisch annehmbare Salz davon intravenös (i. v.), intraperitoneal (i. p.), intraarteriell (i. a.), Intramuskulär (i. m.) oder subkutan (s. c.) injiziert werden. Der Verbindung, der Verbindung-Radiometall-Komplex oder das pharmazeutisch annehmbare Salz davon kann oral, z. B. als ein Pulver, eine Tablette, eine Pille, eine Kapsel, ein Kaukapsel, Sirup, Saft, Gel, Flüssigkeit oder Paste aufgenommen werden. Alternativ kann die Verbindung, der Verbindung-Radiometall-Komplex oder das pharmazeutisch annehmbare Salz davon nasal (intranasal) (z. B. als Spray oder Aerosol), perkutan (z. B. als Creme, Spray oder Salbe und/oder über ein beschichtetes Pflaster) und/oder respiratorisch (z. B. durch Inhalation eines Aerosols oder eines Sprays) aufgenommen werden. Es sollte selbstverständlich sein, dass die Verbindung, der Verbindung-Radiometall-Komplex oder das pharmazeutisch annehmbare Salz davon lokal oder systemisch verabreicht werden kann.
Ausreichende Mengen der Verbindung, des Verbindung-Radiometall-Komplexes oder des pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, die für die Behandlung geeignet sind, können von den physikalisch-chemischen und pharmakologischen Eigenschaften der Verbindung pharmazeutisch annehmbarer Salze davon (z. B. der Bioverfügbarkeit, Ladung, Lipophilie, Molekülmasse usw.), dem Weg der Verabreichung (z. B. mit oder ohne einen First-Pass-Effekt), der Körpermasse des Patienten, dem Stoffwechsel des Patienten (z. B. der Rate des Stoffwechsels und der Ausscheidung der Verbindung, des Verbindung-Radiometall-Komplexes oder des pharmazeutischen Salzes davon) und der Genauigkeit der eingesetzten Analysegeräte abhängen (d. h. Analysegeräte mit höherer Empfindlichkeit können in der Regel geringere Mengen der Verbindung, des Verbindung-Radiometall-Komplexes oder des pharmazeutischen Salzes davon erfordern).
Durch die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung nachweisbare Neoplasie kann eine beliebige, im Stand der Technik bekannte Neoplasie sein.
Vorzugsweise ist die Neoplasie Krebs, insbesondere Prostatakrebs.
Prostatakrebs, wie hier verwendet, kann im weitesten Sinne als jede Form von Krebs verstanden werden, die sich in der Prostata, d. h. einer Drüse im männlichen Reproduktionssystem, entwickelt. Vorzugsweise ist Prostatakrebs Prostatakarzinom.
Ein Patient mit einem Risiko der Entwicklung von Prostatakrebs kann gegebenenfalls einen oder mehrere Risikofaktoren haben, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
einer auffälligen Familiengeschichte (z. B. mit einem Verwandten ersten Grades (Vater oder Bruder), der an Prostatakrebs leidet);
einem genetischen Risiko-Hintergrund (z. B. eine oder mehrere Mutationen im BRCA1- und/oder BRCA2-Gen, einer oder mehreren Mutationen im hereditären Prostatakrebsgen 1 (HPC1), einer oder mehreren Mutationen im Androgenrezeptor, einer oder mehreren Mutationen im Vitamin D-Rezeptor, einer Fusion von Genen der TMPRSS2-ETS-Familie (insbesondere TMPRSS2-ERG oder TMPRSS2-ETV1/49), einem Verlust eines oder mehrerer Krebs-Suppressor-Gene (z. B. im p53-Gen, PTEN (Gen), KAI1, E-Cadherin und/oder CD44);
niedrigeren Blutspiegeln von Vitamin D;
erhöhten Blutspiegeln von Testosteron und/oder
Auftreten einer Infektion oder Entzündung der Prostata (Prostatitis) (z. B. Infektionen mit Chlamydien, Gonorrhoe, Xenotropem MuLV-related Virus (XMRV) HPV-16, HPV-18, HSV-2 und/oder Syphilis).
Wie bereits vorstehend erwähnt, kann die Diagnose des Patienten das Ablesen des radioaktiven Signals beinhalten, das von dem komplexierten Radiometall auftritt, und/oder des Fluoreszenzsignals, das von dem Fluoreszenzfarbstoff auftritt. Beide Signale können den Nachweis der Lokalisierungen und/oder der Größe eines Neoplasmas ermöglichen.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren mindestens die folgenden Schritte:

(i) Verabreichen der Zusammensetzung an einen Patienten;
(ii) Nachweisen des radioaktiven Signals des Radiometalls, wobei Schritt (ii) vorzugsweise durch dreidimensionale Bildgebung, die insbesondere Positron-Emissions-Tomographie (PET) umfasst, durchgeführt wird.

Wie im gesamten Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet, kann der Begriff ”dreidimensionale Bildgebung” im weitesten Sinne als jedes beliebige Verfahren verstanden werden, das eine Bestimmung der Lokalisierung des Komplexes des Verbindung-Radiometall-Komplexes in einem dreidimensionalen Objekt ermöglicht. Ein solches Verfahren kann zum Beispiel Positronen-Emissions-Tomographie (PET), Magnetresonanztomographie (MRT), Radiographie (insbesondere Computertomographie), Einzelphotonen-Emissionscomputertomographie (SPECT) oder eine Kombination von zwei oder mehreren davon sein.
Sehr stark bevorzugt beinhaltet das Verfahren Positronen-Emissions-Tomographie (PET).
PET kann im weitesten Sinne als ein Verfahren verstanden werden, das auf dem Nachweis von Paaren von Gammastrahlen/Photonen basiert, die in entgegengesetzte Richtungen emittiert werden, wobei die Emission der Gammastrahlen/Photonen durch das Annihilationsereignis verursacht wird, das durch die Verbindung eines im Körper des Patienten oder der Probe vorhandenen Elektrons mit einem beim Zerfall des Radiometalls emittierten Proton hervorgerufen wird. Dreidimensionale Bilder einer Tracerkonzentration innerhalb des Körpers oder der Probe können dann mittels Computeranalyse konstruiert werden. PET stellt eine nukleares medizinisches bildgebendes Verfahren dar, das die Herstellung einer dreidimensionalen Bildrekonstruktion und damit eine Visualisierung von Form, Größe und Lokalisation von Neoplasie ermöglicht.
Dem Fachmann ist bekannt, wie man solche Messungen durchführt und dass PET sehr gut mit anderen bildgebenden Verfahren, wie z. B. dreidimensionalem Fluoreszenznachweis (z. B. durch Fluoreszenz-vermittelte molekulare Tomographie (FMT)), CT oder MRT, kombiniert werden kann. Ein solcher kombinatorischer Nachweis kann gleichzeitig oder anschließend durchgeführt werden und kann mit demselben Gerät oder anderen Geräten durchgeführt werden.
Eine Kombination von zwei oder mehreren bildgebenden Verfahren kann ein Übereinanderlegen der aus solchen Verfahren erhaltenen Daten ermöglichen und ermöglicht das Kombinieren eines Bildes mit hoher Auflösung (z. B. aus MRT oder CT) mit einem Verfahren, das es ermöglicht, die Aggregation des Verbindung-Radiometall-Komplexes der vorliegenden Erfindung in einem bestimmten Bereich darzustellen. Solche Ergebnisse können eine besonders präzise Bestimmung von neoplastischem Gewebe in einem Patienten gestatten.
Bevor sie dem Patienten verabreicht wird, kann die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in der Regel durch Mischen des Verbindung-Radiometall-Komplexes pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon mit dem Radiometall (unter Bildung eines Komplexes) und gegebenenfalls einem pharmazeutisch annehmbaren Träger hergestellt werden. Daher kann das Verfahren gegebenenfalls weiterhin den vorhergehenden Schritt des Beimischens der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen.
Wie vorstehend erwähnt, ist ein Vorteil der Verbindung, des Verbindung-Radiometall-Komplexes oder des pharmazeutischen Salzes davon der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit, Neoplasie in vivo und in vitro mithilfe des Nachweises zweier unterschiedlicher Signale, d. h. (i) von dem Radiometall ausgehender radioaktiver Strahlung und (ii) von der Farbstoff-Einheit ausgehender Fluoreszenz, zu diagnostizieren.
Dies ermöglicht es, in einem Schritt die genaue Lokalisierung eines Neoplasmas im gesamten Körper des Patienten oder zumindest in einem größeren Teil davon durch Nachweisen des radioaktiven Signals, insbesondere mithilfe von PET-Bildgebung, zu bestimmen. In einem weiteren Schritt kann die Fluoreszenz nachgewiesen werden. Dies kann ebenfalls im ganzen Körper des Patienten oder zumindest in einem größeren Teil davon durchgeführt werden, kann aber auch durchgeführt werden, wenn der Körper des Patienten geöffnet ist, d. h. wenn das Gewebe von Interesse während einer Operation freigelegt ist.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren weiterhin:

(iii) Nachweisen der Farbstoff-Einheit (C), was vorzugsweise molekulare Bildgebung umfasst.

Man wir jedoch erkennen, dass alternativ gegebenenfalls auch entweder das eine oder das andere Nachweisverfahren verwendet werden kann, d. h. nur das Radioaktivitätssignal von dem Radiometall oder nur das Fluoreszenzsignal von der Farbstoff-Einheit nachgewiesen werden kann. Wird nur das Fluoreszenzsignal nachgewiesen, ermöglicht dies, das Radiometall wegzulassen, was die Handhabung einfacher machen und die Kosten senken kann, aber in der Regel die Nachweisflexibilität und Datengenauigkeit verringern kann.
In der gesamten vorliegenden Erfindung kann der Begriff ”molekulare Bildgebung” in Zusammenhang mit dem Nachweis der Farbstoff-Einheit im weitesten Sinne als ein beliebiges Verfahren verstanden werden, das die Lokalisierung der Farbstoff-Einheit und somit der Verbindung (oder ihres komplexierten Radiometalls) gemäß der vorliegenden Erfindung in einem Objekt von Interesse ermöglicht. Molekulare Bildgebung kann in diesem Zusammenhang auch als ”Fluoreszenz-vermittelte molekulare Bildgebung”, abgekürzt ”FMI”, bezeichnet werden. Wie in Zusammenhang mit dem Nachweis der Farbstoff-Einheit verwendet, kann der Nachweis visuell oder auf eine Geräte-unterstützte Weise durchgeführt werden.
Vorzugsweise betrifft molekulare Bildgebung den Nachweis von Fluoreszenz im Körper eines Patienten oder in einer Zellkultur in einer Auflösung (d. h. der nächsten Annäherung von Objekten, die noch voneinander unterscheidbar sind), die es ermöglicht, die Lokalisierung der Verbindung in dem Objekt von Interesse nachzuweisen. Folglich kann im Körper eines Patienten die nächste Annäherung von Objekten, die noch durch molekulare Bildgebung voneinander unterscheidbar sind, vorzugsweise weniger als 1 cm, stärker bevorzugt weniger als 5 mm, insbesondere weniger als 2 mm betragen. In Zellkultur kann die nächste Annäherung von Objekten, die noch durch molekulare Bildgebung voneinander unterscheidbar sind, vorzugsweise weniger als 2 mm, stärker bevorzugt weniger als 1 mm, insbesondere weniger als 0,5 mm betragen oder sogar im mikroskopischen Bereich liegen, d. h. weniger als 0,1 mm betragen. Wenn sie im Körper eines Patienten durchgeführt wird, kann molekulare Bildgebung zum Beispiel Fluoreszenz-vermittelte molekulare Tomographie (FMT), optische Bildgebung oder Zwei-Photonen-Fluoreszenznachweis sein. Wenn sie in Zellkultur durchgeführt wird, kann die molekulare Bildgebung zum Beispiel auf Fluoreszenzmikroskopie, konfokaler Mikroskopie (z. B. Laser-Scanning-Mikroskopie (LSM)), Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie, Fluoreszenz-Energie-Transfer (FRET) basierende Verfahren, Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) oder Fluoreszenz-Kreuzkorrelations-Spektroskopie (FCCS) sein. Die Bildgebung kann gegebenenfalls weiter mit anderen Bildgebungsverfahren, wie z. B. Positronen-Emissions-Tomographie (PET), Magnetresonanztomographie (MRT), Radiographie (z. B. Computertomographie) oder Ultraschall-Tomographie (UT), kombiniert werden.
Der Schritt (iii) des Nachweises der Farbstoff-Einheit (C), der vorzugsweise molekulare Bildgebung umfasst, kann anschließend an Schritt (ii) des Nachweises des radioaktiven Signals des Radiometalls, gleichzeitig mit Schritt (ii) oder vor Schritt (ii) durchgeführt werden.
Vorzugsweise erfolgt Schritt (iii) im Anschluss an Schritt (ii).
Vor dem Nachweis der Farbstoff-Einheit kann der Fachmann entweder die Verbindung oder den Verbindung-Radiometall-Komplex der vorliegenden Erfindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon an den Patienten ein weiteres Mal verabreichen oder das Fluoreszenzsignal verwenden, das von der Verbindung, dem Verbindung-Radiometall-Komplex oder dem Salz davon erhältlich ist, die vor dem vorhergehenden Nachweisen des Radioaktivitätssignals, wie insbesondere PET-Scan, einmal verabreicht wurden.
Beide Strategien haben einige besondere Vorteile. Verabreichung der Verbindung, des Verbindung-Radiometall-Komplexes oder des Salzes davon ein weiteres Mal vor dem Nachweis des Fluoreszenzsignals ermöglicht es, deren Konzentrationsbereich zu optimieren, um ein qualitativ gutes Fluoreszenzsignal zu erhalten. Außerdem kann eine lokale Verabreichung an das neoplastische Gewebe und dessen offengelegte umliegende Gewebe ermöglicht werden. Eine solche weitere Verabreichung kann vorzugsweise Verabreichung der Verbindung, des Verbindung-Radiometall-Komplexes oder des Salzes davon ohne das Radiometall sein.
Andererseits verhindert die Verabreichung der Verbindung, des Verbindung-Radiometall-Komplexes oder des Salzes davon vor dem Nachweis nur des Radioaktivitätssignals, insbesondere, wenn es nur einmal verabreicht wird, dass der Patient zu oft behandelt wird und kann die Patienten-Compliance verbessern. Ferner können niedrigere Dosen der Verbindung, des Verbindung-Radiometall-Komplexes oder des Salzes davon unerwünschte mögliche Nebenwirkungen davon verhindern. In diesem Fall kann es von Vorteil sein, wenn die Halbwertszeit des Radiometalls nicht zu lang ist, weil dann, wenn der chirurgische Eingriff anschließend an die vorherige molekulare Bildgebung über den Nachweis des Radioaktivitätssignals erfolgt, die Radioaktivität des Radiometalls auf einen niedrigen und somit harmlosen Spiegel angeklungen sein kann, wenn der chirurgische Eingriff tatsächlich stattfindet.
Der das neoplastische Gewebe entfernende Fachmann, in der Regel ein Chirurg, kann gegebenenfalls Licht emittieren, von dem die Farbstoff-Einheit während der Operation angeregt wird, und damit das neoplastische Gewebe, das entfernt werden soll, sichtbar machen. Dies kann in Intervallen durchgeführt werden oder kann kontinuierlich durchgeführt werden. Anregungslicht kann von einer Standardlampe, von einer Operationslampe und/oder von einer, von dem Chirurgen und/oder (einer) beliebigen anderen anwesenden Person(en) getragenen Stirnlampe herrühren. Die Wellenlänge des Lichts kann entweder derart sein, dass sie die Farbstoff-Einheit effizient anregt, insbesondere eine Wellenlänge nahe dem Anregungsmaximum, oder das Doppelte der Wellenlänge, die effizient die Farbstoff-Einheit anregt (für Doppel-Photon-Anregung), insbesondere die doppelte Wellenlänge nahe dem Anregungsmaximum. Vorzugsweise wird Schritt (iii) während der Operation durchgeführt, wobei das kanzeröse Gewebe zumindest teilweise offengelegt ist.
Wie vorstehend erwähnt, basiert das Verfahren zum Stellen einer Diagnose bei dem Patienten in vivo auf der Verwendung der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, somit auf der Verbindung, dem Verbindung-Radiometall-Komplex oder dem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon, die/der/das das entsprechende Radiometall komplexiert hat, und gegebenenfalls weiterhin einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst. Dies stellt die erste und ebenso eine spezifische medizinische Verwendung davon dar.
Daher betrifft die Erfindung unter einen weiteren Aspekt die Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, wie vorstehend dargelegt, für die Verwendung als Medikament, insbesondere für die Verwendung als Diagnostikum.
Unter einem zweiten weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, wie vorstehend dargelegt, für die Verwendung bei einem Verfahren zum Diagnostizieren eines Neoplasmas in einem Patienten, der daran leidet oder bei dem die Gefahr dafür besteht.
In Zusammenhang mit der Zusammensetzung für die Verwendung gelten ebenfalls die Definitionen der Begriffe, wie sie in Zusammenhang mit der Verbindung, dem Verbindung-Radiometall-Komplex oder dem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon vorstehend und dem diagnostischen Verfahren vorstehend angegeben sind.
Wie vorstehend erwähnt, ist in einer bevorzugten Ausführungsform die Neoplasie Krebs, insbesondere Prostatakrebs.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren die folgenden Schritte:

(i) Verabreichen der Zusammensetzung an einen Patienten;
(ii) Nachweisen des radioaktiven Signals des Radiometalls, insbesondere ⁶⁸Ga wobei Schritt (ii) vorzugsweise durch dreidimensionale Bildgebung, insbesondere mithilfe von Positronen-Emissions-Tomographie (PET), durchgeführt wird.

Wie vorstehend erwähnt, umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform das Verfahren weiterhin:

(iii) Nachweisen der Farbstoff-Einheit (C), vorzugsweise durch molekulare Bildgebung, wobei Schritt (iii) insbesondere anschließend an Schritt (ii) durchgeführt wird.

Wie vorstehend erwähnt, kann die Verbindung oder der Verbindung-Radiometall-Komplex gemäß der vorliegenden Erfindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon auch zum Nachweisen eines Neoplasmas in vitro, wie in Zellkultur oder in von einem Patienten entnommenen Zellen, verwendet werden. In diesem Zusammenhang kann der Verwender der Verbindung, des Verbindung-Radiometall-Komplexes gemäß der vorliegenden Erfindung oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon auch mit der Verbindung oder dem Salz davon in Form eines Kits beliefert werden.
Daher betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Kit, umfassend:

(a) die Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, wie vorstehend angegeben, oder die Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, wie vorstehend angegeben; und
(b) eine Gebrauchsanweisung.

In Zusammenhang mit dem Kit gelten ebenfalls die Definitionen der Begriffe, wie sie in Zusammenhang mit der Verbindung oder dem pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon vorstehend, dem diagnostischen Verfahren und der Zusammensetzung für die Verwendung, wie vorstehend angegeben, dargelegt sind.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann der Begriff ”Kit” im weitesten Sinne als eine Zusammenstellung von verschiedenen Produkten verstanden werden, die für die Durchführung des Nachweises eines Neoplasmas verwendet werden können. Das Kit kann die Verbindung oder Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Träger, eine Gebrauchsanweisung, Spritzen, Nadeln, usw. umfassen, aber nicht darauf beschränkt,. Gegebenenfalls kann die Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon oder die Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung gelöst sein, kann getrocknet sein oder kann gefriergetrocknet sein. Vorzugsweise enthält das Kit der Erfindung eine gefriergetrocknete, etikettierte Form der Verbindung oder Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, einen Puffer, um diese zu lösen, eine Injektions- oder Infusionsvorrichtung zum Mischen der Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon mit den Puffer und zum Verabreichen des Gemischs an einen Patienten.
Die Gebrauchsanweisung kann Anweisungen darüber enthalten, wie die Verbindung oder Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zu lagern ist (z. B. Temperatur, Luftfeuchtigkeit, Haltbarkeitsdauer usw.), welche Radiometalle zu verwenden sind, und gegebenenfalls, woher sie zu erhalten sind, wie die Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon mit dem entsprechenden Radiometall zu komplexieren ist (z. B. Pufferbedingungen) und/oder wie die Verbindung oder Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zum Nachweisen eines Neoplasmas in vivo oder in vitro zu verwenden ist (z. B. vorgeschlagene Mengen/Konzentrationen, empfohlene Nachweistechniken usw.).
Wenn die radioaktive Halbwertzeit des Radiometalls ausreichend lang ist, kann das Kit auch ein oder mehrere Radiometall(e) umfassen, das/die dafür geeignet ist/sind, durch die Verbindung der vorliegenden Erfindung komplexiert zu werden.
Das Kit kann auch für und in vitro-Nachweis und Untersuchung von Neoplasie verwendet werden.
Folglich wird weiterhin ein Verfahren zum Nachweis von neoplastischen Zellen in einer Probe in vitro offenbart, umfassend die folgenden Schritte:

(i) Bereitstellen von Zellen, die neoplastisch sind oder bei denen die Gefahr besteht, dass sie neoplastisch sind, insbesondere kanzerös sind oder Gefahr laufen, kanzerös zu sein;
(ii) Verabreichen der Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, wie vorstehend angegeben, oder der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, wie vorstehend angegeben, an die Zellen;
(iii) Nachweisen der Fluoreszenz und/oder des radioaktiven Signals der Zellen.

In Zusammenhang mit dem vorliegenden in vitro-Verfahren gelten ebenfalls die Definitionen der Begriffe, wie sie in Zusammenhang mit der Verbindung oder dem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon, dem diagnostischen Verfahren, der Zusammensetzung für die Verwendung und dem Kit, wie vorstehend dargelegt, angegeben sind.
Die Zellen, die neoplastisch sind oder Gefahr laufen, neoplastisch zu sein, können isoliert, d. h. vereinzelte Zellen, sein oder können Zellen sein, die immer noch in ihrem physiologischen Kontext, d. h. in ihrem Gewebe, das auch andere Zelltypen umfassen kann, vorliegen. Die Zellen können als eine Gewebeprobe aus einem Patienten entnommen werden, der an einem Neoplasma leidet oder bei dem das Risiko der Entwicklung einer Neoplasie besteht, oder können aus einer Gewebekultur erhalten werden. Die in vitro-Probe, wie sie in diesem Zusammenhang verwendet wird, kann auch ein Teil eines oder sogar ein ganzer toter Körper eines Patienten oder eines Labortieres (z. B. Maus, Ratte, Kaninchen usw.) sein.
Wenn sie gezüchtet werden, können die Zellen unter geeigneten Bedingungen, d. h. in der Regel bei etwa 37°C, bei einem pH-Wert von etwa 6,5 bis 7,5, insbesondere pH 7,0 bis 7,5, mit geeigneten Nährstoffen, Vitaminen, Mineralien und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren gezüchtet werden. Der Fachmann ist in der Lage, eine geeignete Standard-Zellkulturtechnik, die für die Zellen von Interesse geeignet ist, auszuwählen.
Gegebenenfalls können die Zellen während der gesamten Durchführung des in vitro-Verfahrens lebensfähig sein. Alternativ können die Zellen auch vor dem Schritt (ii) der Verabreichung der Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon oder der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung zu den Zellen oder vor Schritt (iii) des Nachweises der Fluoreszenz und/oder des radioaktiven Signals der Zellen, fixiert werden (z. B. in Ethanol, Aceton oder einem anderen Fixierungsmittel).
Die Zellen können gegebenenfalls auch mit anderen Farbstoffen (z. B. DAPI oder HOECHST-Farbstoff zum Anfärben des Kerns und/oder einem markierten Antikörper zum Anfärben einer anderen Struktur von Interesse) gegengefärbt werden.
Bei dem vorliegenden in vitro-Verfahren kann die Verbindung oder Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon an die Zellen durch Herstellen eines Puffers, der die Verbindung, Zusammensetzung oder das Salz davon umfasst, und Hinzufügen desselben zu den Zellen verabreicht werden. Alternativ kann die Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon oder die Zusammensetzung auch an einen Patienten in vivo verabreicht werden und anschließend kann eine Zell- und/oder Gewebeprobe aus dem Patienten entnommen und in vitro untersucht werden.
Das vorliegende in vitro-Verfahren ermöglicht insbesondere den aufeinander folgenden und gleichzeitigen Nachweis des Radioaktivitätssignals von dem Radiometall und des Fluoreszenzsignals von der Farbstoff-Einheit. Es wird jedoch darauf hingewiesen, dass alternativ gegebenenfalls auch entweder das eine oder das andere Nachweisverfahren verwendet werden kann, d. h. nur das Radioaktivitätssignal von dem Radiometall oder nur das Fluoreszenzsignal von der Farbstoff-Einheit nachgewiesen werden kann. Wird nur das Fluoreszenzsignal nachgewiesen, dann kann das Radiometall weggelassen werden, was die Handhabung leichter machen und Kosten verringern kann, aber auch in der Regel die Nachweisflexibilität und Datengenauigkeit verringern kann.
Je nach dem eingesetzten Nachweisverfahren können vor der Durchführung von Schritt (iii) die Zellen gegebenenfalls mit frischen Puffer oder Zellkulturmedium gewaschen werden, um den Überschuss an ungebundener Verbindung oder Verbindung-Radiometall-Komplex zu entfernen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung zeigen neoplastische Zellen in der Regel höhere Färbungsraten als entsprechende nicht-neoplastische Zellen desselben Zelltyps.
Die Zellen können vorzugsweise aus einem Patienten, insbesondere einem Menschen, entnommen werden.
Vorzugsweise werden die Zellen aus einem Patienten entnommen, der an einem Neoplasma, vorzugsweise Krebs, insbesondere Prostatakrebs, leidet oder bei dem die Gefahr dafür besteht.
Der Nachweis kann durch beliebige im Stand der Technik bekannte Mittel durchgeführt werden.
Vorzugsweise enthält Schritt (iii) das Nachweisen von Fluoreszenz über mikroskopische Bildgebung, insbesondere konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (LSM) oder Zwei-Photonen-Mikroskopie.
Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (LSM) oder Zwei-Photonen-Mikroskopie können hier den Nachweis der Verbindung oder des Verbindung-Radiometall-Komplexes gemäß der vorliegenden Erfindung oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon an der Zelloberfläche von Zellen auf mikroskopischer Ebene ermöglichen. Daher können vergleichsweise kleine lokale Zunahmen an bestimmten Membranstellen nachweisbar sein.
Vorzugsweise enthält Schritt (iii) das Nachweisen von Fluoreszenz über ein Durchflusszytometer und oder Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS).
Nachweis über ein Durchflusszytometer kann eine Quantifizierung der Fraktion der neoplastischen Zellen im Verhältnis zur Fraktion der nicht-neoplastischen Zellen in einer Probe ermöglichen. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) kann weiterhin das Isolieren einer Zellpopulation von Interesse, wie z. B. der Fraktion der neoplastischen Zellen, der Fraktion eines bestimmten Zelltyps (der gegebenenfalls durch Gegenfärbung mit einem Antikörper, der für ein Membranprotein der Zellen typisch ist, identifiziert wird) oder der Fraktion der neoplastischen Zellen eines bestimmten Zelltyps, ermöglichen.
Vorzugsweise enthält Schritt (iii) das Nachweisen von Radioaktivität durch Gammazählung.
Wie im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet, kann der Begriff ”Gammazählung” im weitesten Sinne als ein beliebiges Verfahren verstanden werden, das auf der Quantifizierung von Gammastrahlung basiert. Der Fachmann kennt verschiedene Verfahren, die auf Gammazählung basieren, und weiß, wie diese durchzuführen sind. Zum Beispiel kann Gammazählung in Zusammenhang mit einem Radiobindungsassay und/oder in einem Radioimmunassay (RIA) verwendet werden. Das Ablesen kann durch direkte Gammazählung oder durch indirekte Gammazählung, wie Szintillationszählung, insbesondere Flüssigszintillationszählung, durchgeführt werden. Gammazählung kann Quantifizierung der Fraktion eines bestimmten Zelltyps ermöglichen. Ferner kann Gammazählung in Kombination mit einem vorherigen Schritt der Isolation einer bestimmten Zellfraktion, z. B. mithilfe von FACS (vgl. vorstehend), auch Informationen über die Fraktion einer spezifischen Zellenpopulation von Interesse liefern.
Wie vorstehend erwähnt, können der Nachweis der Fluoreszenz und der Nachweis eines radioaktiven Signals (insbesondere der Gammastrahlung) der Zellen miteinander kombiniert werden. Alternativ kann nur die Fluoreszenz nachgewiesen werden oder nur das radioaktive Signal kann nachgewiesen werden.
In jedem Fall können bei der Analyse der Daten die Zellen, die unterschiedliche Intensitäten der Fluoreszenz und/oder des radioaktiven Signals zeigen, in verschiedene Fraktionen gruppiert werden. Dies wird in der Regel dadurch durchgeführt, dass ein bestimmter Schwellenwert festgelegt wird. Wie vorstehend erwähnt, zeigen gemäß der vorliegenden Erfindung neoplastische Zellen in der Regel höhere Färbungsraten und somit eine höhere Signalintensität im Vergleich zu entsprechenden nicht-neoplastischen Zellen des gleichen Zelltyps.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren weiterhin die Schritte:

(iv) Bestimmen:
(a) der Anzahl an Zellen oberhalb eines Fluoreszenz- und/oder radioaktiven Signals, das auf eine neoplastische Zelle, insbesondere eine kanzeröse Zelle, hindeutet, und
(b) der Anzahl der Zellen unterhalb eines Fluoreszenz- und/oder radioaktiven Signals, das auf eine nicht-neoplastischen Zelle hindeutet; und
(v) Bestimmen des Verhältnisses von (a):(b) und Beurteilen der Schwere der Neoplasie bei dem Patienten, von dem die Zellen entnommen wurden.

Die Anzahl an Zellen oberhalb eines Fluoreszenz- und/oder radioaktiven Signals, das auf eine neoplastische Zelle hindeutet, also oberhalb einer bestimmten Schwelle, zeigt eine höhere Signalintensität im Vergleich zu entsprechenden nicht-neoplastischen Zellen des gleichen Zelltyps. Der Fachmann erkennt, dass die Signalintensität, die die Schwelle darstellt, von den untersuchten Zellen und dem Nachweisverfahren abhängt. Sie kann bestimmt werden durch Messung:

(a) des Signals, das von Zellen erhalten wird, von denen bekannt ist, dass sie neoplastisch sind; und
(b) des Signals, das von entsprechenden Zellen erhalten wird, von denen bekannt ist, dass sie gesund, d. h. nicht-neoplastisch, sind. Hier liefert (a) in der Regel eine höhere gemessene Intensität als (b). Die Schwelle kann zwischen den zwei für (a) und (b) gemessenen Intensitäten festgelegt werden.

Das kann es ermöglichen, die Beurteilung der Schwere eines Neoplasmas in einem Patienten zu bestimmen. Eine hohe Fraktion von Zellen, für die festgestellt wird, dass sie neoplastische Zellen sind, kann auf eine schwere Neoplasie hindeuten. Deshalb ist eine vergleichsweise hohe Fraktion der Zellen des untersuchten Gewebes neoplastisch, somit ist das Neoplasma vergleichsweise weit ausgebreitet. Im Gegensatz dazu kann eine niedrige Fraktion auf eine weniger schwere Neoplasie hindeuten und das Fehlen neoplastischer Zellen kann auf die Abwesenheit eines Neoplasmas in der untersuchten Gewebeprobe hindeuten.
Folglich kann die Verbindung oder der Verbindung-Radiometall-Komplex gemäß der vorliegenden Erfindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon auch zur Untersuchung der Schwere eines Neoplasmas in einer Probe in vitro verwendet werden.
Daher wird hier die Verwendung der Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, wie vorstehend angegeben, oder der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, wie vorstehend angegeben, für die Untersuchung der Schwere eines Neoplasmas in einer Probe in vitro offenbart, wobei die Probe Zellen umfasst, die neoplastisch sind oder Gefahr laufen, neoplastisch zu sein, insbesondere kanzerös sind oder Gefahr laufen, kanzerös zu sein, und die mit der Verbindung oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon oder der Zusammensetzung in Kontakt gebracht werden.
In Zusammenhang mit dieser Verwendung gelten ebenfalls die Definitionen der Begriffe, wie sie vorstehend in der gesamten Erfindung angegeben sind.
Vorzugsweise umfasst die Beurteilung der Schwere eines Neoplasmas das Bestimmen des Verhältnisses

(a) der Anzahl an Zellen oberhalb eines Fluoreszenz- und/oder radioaktiven Signals, das auf eine neoplastische Zelle, insbesondere eine kanzeröse Zelle, hindeutet, und
(b) der Anzahl an Zellen unterhalb eines Fluoreszenz- und/oder radioaktiven Signals, das auf eine nicht-kanzeröse Zelle hindeutet.

Die folgenden Figuren und Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, aber nicht den durch die Patentansprüche verliehenen Schutzumfang einschränken.
Figuren
1 zeigt das Grundprinzip der Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung. 1A zeigt die Verbindung in ihrer nicht-komplexierten Form. Das spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindende Motiv (A) ermöglicht die Bindung an die zelluläre Zielstruktur auf neoplastischen Oberflächen (schwarz auf der linken Seite) und die Farbstoff-Einheit (C) emittiert nach Anregung Fluoreszenzlicht. 1B zeigt die ein Radiometall komplexierende Verbindung. Hier werden außerdem nach Zerfall des Radiometalls Positronen emittiert. Wenn diese auf ein Elektron in der Probe treffen, werden Photonen in zwei Richtungen quer zueinander emittiert, die nachgewiesen werden können.
2 zeigt beispielhaft eine Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung. 2A zeigt die Verbindung in ihrer nicht-komplexierten Form. 2B zeigt die das Radiometall ⁶⁸Ga komplexierende Verbindung. Die Aminosäure-Einheiten (d. h. die Glutamat-Einheit und die Lysin-Einheit) bergen vorzugsweise die L-Konfiguration.
3 zeigt beispielhaft die Synthese von Glu-Harnstoff-Lys-HBED-CC-PEG₂-Fluorescein. Hier steht a für Triphosgen, DIPEA, CH₂Cl₂, 0°C; b steht für H-Lys(Alloc)-2CT-Harz, CH₂Cl₂; c steht für Pd[P(C₆H₅)₃]₄, Morpholin, CH₂Cl₂; d steht für Hexafluorisopropanol/CH₂Cl₂; e steht für (HBED-CC)TFP₂, DIPEA, DMF; f steht für 1,8-Diamino-3,6-dioxaoktan; g steht für Fluoresceinisothiocyanat (Isomer I), DIPEA, DMF; und h steht für TFA.
4 zeigt den Vergleich von Glu-Harnstoff-Lys-HBED-CC-Fluorescein mit den Referenzen Glu-Harnstoff-Lys-HBED-CC, beide mit ⁶⁸Ga markiert, im Hinblick auf ihre spezifischen Zelloberflächenbindungs- und Internalisierungseigenschaften an LNCaP-Zellen. Die spezifische Aufnahme in Zellen wurde durch Blockieren mit 500 μM 2-PMPA ermittelt. Die Werte sind ausgedrückt als % der an 10⁶ Zellen gebundenen angewendeten Radioaktivität. Die Daten sind als Mittelwert ± SD (n = 3) ausgedrückt.
5 zeigt die Organverteilung eine Stunde nach Injektion von 0,06 nmol des PSMA-Inhibitors Glu-Harnstoff-Lys entweder mit [⁶⁸Ga]HBED-CC oder [⁶⁸Ga]HBED-CC-Fluorescein. Die Daten sind als durchschnittliche % ID/g Gewebe ± SD (n = 3) ausgedrückt.
6 zeigt die Synthese von Glu-Harnstoff-Lys-HBED-CC-PEG₂-NH₂ als Vorläufer für die Konjugation verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe. Hier steht a. für Triphosgen, DIPEA, CH₂Cl₂, 0°C; b. steht für H-Lys (Alloc)-2CT-Harz, CH₂Cl₂; c. steht für Pd[P(C₆H₅)₃]₄, Morpholin, CH₂Cl₂; d. steht für Hexafluorisopropanol/CH₂Cl₂; e. steht für (HBED-CC)TFP₂, DIPEA, DMF; und f. steht für 1,8-Diamino-3,6-dioxaoktan.
7 zeigt die Synthese von Glu-Harnstoff-Lys-HBED-CC-PEG₂-Fluorescein. Hier steht g. für Fluoresceinisothiocyanat (Isomer I), DIPEA, DMF; und h. steht für TFA.
8 zeigt den Vergleich von Glu-Harnstoff-Lys-HBED-CC-Fluorescein mit den Referenzen Glu-Harnstoff-Lys-HBED-CC, beide mit ⁶⁸Ga markiert, im Hinblick auf ihre spezifischen Zelloberflächenbindungs- und Internalisierungseigenschaften an LNCaP-Zellen. Die spezifische Aufnahme in Zellen wurde durch Blockieren mit 500 μM 2-PMPA ermittelt. Die Werte sind ausgedrückt als % der an 10⁶ Zellen gebunden angewendeten Radioaktivität. Die Daten sind als Mittelwert ± SD (n = 3) ausgedrückt.
9 zeigt die Organverteilung eine Stunde nach der Injektion von 0,06 nmol des PSMA-Inhibitors Glu-Harnstoff-Lys entweder mit [⁶⁸Ga]HBED-CC oder [⁶⁸Ga]HBED-CC-Fluorescein. Die Daten sind als durchschnittliche % ID/g Gewebe ± SD (n = 3) ausgedrückt.
10 zeigt PET-Bildgebungsexperimente in LNCaP-Tumor-tragenden nude-Mäusen 1 Stunde nach der Injektion von 10 MBq der dargestellten ⁶⁸Ga-markierten Verbindungen. Wenn aromatische Gruppen im Linker-Teil des Moleküls vollständig fehlen, kann der Tumor nicht visualisiert werden. Der Pfeil und der Kreis in der Mitte des gestrichelten weißen Kreuzes zeigen den Tumor. In der HBED-CC-Struktur ist der Tumor besonders gut sichtbar.
11 zeigt vergleichende PET-Bildgebung von ⁶⁸Ga-markierten PSMA-HBED-CC-Konjugaten. Die PET-Bildgebung zeigt eine vergleichbare Verteilung von Radioaktivität und Tumor-Aufnahme für PSMA-Ahx-HBED-CC, PSMA-HBED-CC-FITC und PSMA-Ahx-HBED-CC-Cyanin 5.5 1 Stunde nach Injektion in LNCaP-Tumor-tragende nude-Mäuse.
12 zeigt die vergleichende Organverteilung 1 Stunde nach der Injektion einer von Banerjee et al. (Banerjee et al., 2011, Angew Chem Int Ed Engl. 50(39): 9167–9170, Seite 6, Schema 1, Endprodukt) veröffentlichten Referenzverbindung und der entsprechenden Verbindung ohne den Fluoreszenzfarbstoff IRDye800CW, die eine freie Aminogruppe der Lysyl-Einheit trägt, an die der Farbstoff IRDye800CW gebunden werden kann, und PSMA-Ahx-HBED-CC-FITC. Wie ersichtlich ist, war die Tumor-Aufnahme unter Verwendung von PSMA-Ahx-HBED-CC-FITC deutlich verbessert.
Beispiele
Beispiel 1
Materialien und Verfahren
Die Analyse der synthetisierten Moleküle wurde unter Verwendung von Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC; Chromolith RP-18e, 100 × 4,6 mm; Merck, Darmstadt, Deutschland) mit einem linearen A-B-Gradienten (0% B bis 100% B in 6 min) bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 4 ml/min (Analyse) oder 6 ml/min (Reinigung) durchgeführt. Lösungsmittel A bestand aus 0,1%igem wässrigem TFA und Lösungsmittel B war 0,1% TFA in CH₃CN. Das HPLC-System (L6200 A; Merck-Hitachi, Darmstadt, Deutschland) war mit einem UV- und einem Gamma-Detektor (Bioscan; Washington, USA) ausgestattet. Die UV-Absorption wurde jeweils bei 214 nm gemessen. Die Massenspektrometrie wurde mit einem MALDI-MS Daltonics Microflex-System (Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland) durchgeführt. ⁶⁸GA (Halbwertszeit 68 min; β⁺ 89%; E_β+ max. 1,9 MeV) wurde aus einem ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-Generator auf der Basis eines Pyrogallol-Harz-Trägers (Schuhmacher et al. 1981) erhalten.
Synthese
Ein beispielhaftes Syntheseprotokoll für die Herstellung einer doppelt markierten Sonde für die molekulare Bildgebung ist beispielhaft in 3 dargestellt.
Zum Synthetisieren des Pharmakophors Glu-Harnstoff-Lys wurde das Isocyanat der Glutamyl-Einheit (in 3 als 1 angegeben) in situ durch Hinzufügen eines Gemischs von 3 mmol Bis(tert.-butyl)-L-glutamat-Hydrochlorid (Bachem, Schweiz) und von 1,5 ml N-Ethyldiisopropylamin (DIPEA) in 200 ml trockenem CH₂Cl₂ zu einer Lösung von 1 mmol Triphosgen in 10 ml CH₂Cl₂ bei 0°C über 4 Std. hergestellt. Nach Rühren des Reaktionsgemischs für eine weitere Stunde bei 25°C wurden 0,5 mmol eines Harz-immobilisierten (2-Chlortrityl-Harz, Merck, Darmstadt) ε-Allyloxycarbonyl-geschützten Lysins in 4 ml DCM hinzugefügt und für 16 Std. unter schwachem Rühren umgesetzt, was zu der als 3 in 3 angegebenen Verbindung führte. Das Harz wurde abfiltriert und die Allyloxy-Schutzgruppe wurde unter Verwendung von 100 mg Tetrakis(triphenyl)palladium(0) (Sigma-Aldrich, Deutschland) und 400 μl Morpholin in 4 ml CH₂Cl₂ für 3 Stunden entfernt, was zu der als 4 in 3 angegebenen Verbindung führte. Verbindung 4 wurde von dem Harz durch Umsetzung mit 4 ml eines 30%igen 1,1,1-3,3,3-Hexafluorisopropanols (HFIP) in CH₂Cl₂ für zwei Stunden bei Umgebungstemperatur abgespalten, was das tert.-Butyl-geschützte rohe Produkt 5 ergab, das über RP-HPLC gereinigt wurde.
Der bis-aktivierte Ester (HBED-CC)TFP₂ wurde synthetisiert, wie zuvor beschrieben (Schäfer et al. 2012). Der Vorläufer für die Konjugation des Farbstoffs wurde durch Umsetzen von 66 mg (0,08 mmol) des bis-aktivierten Esters (HBED-CC)TFP₂ mit 39 mg (0,072 mmol) des TFA-Salzes von Bis(tert.butyl)-Glu-Harnstoff-Lys (5) in 1 ml trockenem DMF und 25 μl DIPEA bei Raumtemperatur synthetisiert. Nach 4 Stunden wurden 75 μl 1,8-Diamino-3,6-dioxaoktan (0,52 mmol) hinzugefügt und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 16 Stunden lang durchgeführt. Nach Verdampfung des Lösungsmittels wurde das als 6 in 3 angegebene rohe Produkt über RP-HPLC (Gradient: 10% CH₃CN bis 40% CH₃CN in 10,5 min, Durchfluss 6 ml/min; Nachweis bei 214 nm) gereinigt. (Ausbeute: 32 mg; 34%). (berechn. 1076,24; gefunden: 1077,2 (M+H⁺)).
Die Konjugation von Fluorescein wurde durch Umsetzen von 6 mg des als 6 in 3 angegebenen HBED-CC-Konjugats (0,005 mmol) mit 2,3 mg (0,006 mmol) Fluoresceinisothiocyanat (Isomer I) in 1 ml trockenem DMF, das mit 15 μl DIPEA angereichert wurde, bei Raumtemperatur für 16 Stunden durchgeführt. Nach Verdampfung des Lösungsmittels wurde das Produkt 7 über RP-HPLC (Gradient: 15% CH₃CN bis 51% CH₃CN in 9,2 min, Durchfluss 6 ml/min; Nachweis bei 214 nm) isoliert. (Ausbeute: 4,2 mg; 57%): (berechn. 1465,62; gefunden: 1466,4 (M+H⁺)). Die Abspaltung der verbleibenden Schutzgruppen erfolgte unter Verwendung von TFA. (berechn. 1353,4; gefunden: 1354,3 (M+H⁺)).
⁶⁸Ga-Markierung
Die Konjugate (0,1–1 nmol in 0,1 M HEPES-Puffer, pH = 7,5, 100 μl) wurden zu einem Gemisch von 10 μl HEPES-Lösung (2,1 M) und 40 μl [⁶⁸Ga]Ga³ ⁺-Eluat (25-60 MBq) hinzugefügt. Der pH-Wert der Markierungslösung wurde mit 30%igem NaOH auf 4,2 eingestellt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 80°C für 2 Minuten inkubiert. Die radiochemische Ausbeute (RCY) wurde über analytische RP-HPLC bestimmt.
Zellkultur
Für Bindungsstudien und in vivo-Experimente wurden LNCaP-Zellen (metastasierende Läsion von menschlichem Prostata-Adenokarzinom, ATCC CRL-1740) in RPMI-Medium, das mit 10% fötalem Kälberserum und Glutamax (PAA, Österreich) angereichert war, gezüchtet. Während der Zellkultur wurden die Zellen bei 37°C in einem Inkubator mit befeuchteter Luft, die mit 5% CO₂ äquilibriert war, gezüchtet. Die Zellen wurden unter Verwendung von Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (Trypsin-EDTA; 0,25% Trypsin, 0,02% EDTA, alle von PAA, Österreich) geerntet und mit PBS gewaschen.
Zellbindung und Internalisierung
Der kompetitive Zellbindungsassay und Internalisierungsexperimente wurden durchgeführt, wie zuvor beschrieben (Eder et al. 2012). Kurz gesagt, wurden die entsprechenden Zellen (10⁵ pro Vertiefung) mit dem Radiometall (⁶⁸Ga-markiertes [Glu-Harnstoff-Lys(Ahx)]₂-HBED-CC (Schäfer et al. 2012)) in Anwesenheit von 12 verschiedenen Konzentrationen des Analyten (0–5000 nM, 100 μl/Vertiefung) inkubiert. Nach der Inkubation wurde unter Verwendung eines Multisieb-Vakuum-Verteilers (Millipore, Billerica, MA) gewaschen. Zellgebundene Radioaktivität wurde unter Verwendung eines Gamma-Zählgeräts (Packard Cobra II, GMI, Minnesota, USA) gemessen. Die 50%ige inhibitorische Konzentration (IC50) wurde berechnet, indem die Daten unter Verwendung eines nichtlineare-Regression-Algorithmus (GraphPad Software) angepasst wurden. Experimente wurden dreimal durchgeführt.
Um die spezifische Aufnahme in Zellen und die Internalisierung zu bestimmen, wurden 10⁵ Zellen in mit Poly-L-Lysin beschichtete Zellkulturplatten mit 24 Vertiefungen 24 Std. vor der Inkubation überimpft. Nach Waschen wurden die Zellen mit 25 nM der radioaktiv markierten Verbindungen für 45 min bei 37°C bzw. bei 4°C inkubiert. Die spezifische zelluläre Aufnahme wurde durch kompetitive Blockierung mit 2-(Phosphonomethyl)pentandisäure (500 μM Endkonzentration, PMPA, Axxora, Lörrach, Deutschland) bestimmt. Die zelluläre Aufnahme wurde durch 4-maliges Waschen mit 1 ml eiskaltem PBS beendet. Die Zellen wurden anschließend zweimal mit 0,5 ml Glycin-HCl in PBS (50 mM, pH = 2,8) für 5 min inkubiert, um die an die Oberfläche gebundene Fraktion zu entfernen. Die Zellen wurden mit 1 ml eiskaltem PBS gewaschen und unter Verwendung von 0,3 N NaOH (0,5 ml) lysiert. Die oberflächengebundene und die internalisierte Fraktion wurden in einem Gamma-Zählgerät gemessen. Die Aufnahme in Zellen wurde als Prozent der an 10⁶ Zellen gebundenen ursprünglich zugegebenen Radioaktivität [% ID/10⁶ Zellen] berechnet.
Biodistribution
7 bis 8 Wochen alte männliche BALB/c-nu/nu-Mäuse (Charles River Laboratories) wurden subkutan in den rechten Truncus mit 5 × 10⁶ LNCaP-Zellen (in 50% Matrigel; Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) beimpft. Man ließ die Tumoren bis auf eine Größe von etwa 1 cm³ heranwachsen. Die radioaktiv markierten Verbindungen wurden in die Schwanzvene (etwa 1 MBq pro Maus; 0,06 nmol) injiziert. 1 Std. nach der Injektion wurden die Tiere geopfert. Organe von Interesse wurden herausgeschnitten, trocken getupft und gewogen. Die Radioaktivität wurde unter Verwendung eines Gamma-Zählgeräts gemessen und als % ID/g berechnet.
Ergebnisse
In vitro-Zellbindungseigenschaften
Ein kompetitiver in vitro-Zellbindungsassay wurde durchgeführt, um das Bindungspotenzial, ausgedrückt als IC₅₀-Werte von Glu-Harnstoff-Lys-HBED-CC-Fluorescein im Vergleich zu der Referenz Glu-Harnstoff-Lys(Ahx)-HBED-CC, zu bestimmen. Die IC₅₀-Werte von Glu-Harnstoff-Lys-HBED-CC-Fluorescein und Glu-Harnstoff-Lys(Ahx)-HBED-CC betrugen 11,14 ± 1,16 nM bzw. 9,82 ± 1,26 nM, was darauf hinweist, dass die PSMA-Spezifität durch die Konjugation von Fluorescein nicht beeinträchtigt war.
Die Funktionalität des dualen Bildgebungsmittels Glu-Harnstoff-Lys-HBED-CC-Fluorescein wurde zusätzlich auf zellulärer Basis durch Analysieren der Internalisierung und Zelloberflächenbindungseigenschaften untersucht (4). Glu-Harnstoff-Lys-HBED-CC-Fluorescein wurde von LNCaP-Zellen spezifisch internalisiert, wie die kompetitive Blockierung mit dem PSMA-Inhibitor 2-PMPA zeigt (P < 0,001). Das Zellaufnahme- und Internalisierungsprofil wurde im Laufe der chemischen Kombination von Glu-Harnstoff-Lys-HBED-CC und Fluorescein nicht erheblich verändert, was darauf hinweist, dass der Farbstoff an dieser Position keinen Einfluss auf die Zellbindungseigenschaften des PSMA-bindenden Moleküls hat.
Organverteilung

Um die Funktionalität des Moleküls in vivo zu zeigen, wurden Organverteilungsstudien mit Tumor-tragenden Xenotransplantaten durchgeführt. 5 und Tabelle I zeigen, dass die Tumoraufnahme des Farbstoff-Konjugats Glu-Harnstoff-Lys-HBED-CC-Fluorescein in PSMA-positive LNCaP-Tumoren (10,86 ± 0,94% ID/g) höher war als diejenige der nicht-konjugierten Referenz Glu-Harnstoff-Lys(Ahx)-HBED-CC (4,89 ± 1,34% ID/g). Ferner waren die Verteilungsprofile beider Verbindungen, Glu-Harnstoff-Lys-HBED-CC-Fluorescein und Glu-Harnstoff-Lys(Ahx)-HBED-CC, in gesunden Organen vergleichbar, was auf eine ähnliche Hintergrundaktivität beider Verbindungen in vivo hindeutet. So sind die in vivo-Tumor-Ansteuerungseigenschaften von Glu-Harnstoff-Lys-HBED-CC-Fluorescein zumindeste vergleichbar mit der Referenz Glu-Harnstoff-Lys(Ahx)-HBED-CC. Tabelle I. Oranverteilung der markierten Sonden 1 Std. nach der Injektion.

	Glu-Harnstoff-Lys-HBED-CC			Glu-Harnstoff-Lys-HBED-CC-Farbstoff
	Mittelwert	SD	N	Mittelwert	SD	N
Blut	0,53	0,04	3	1,34	0,40	3
Herz	0,83	0,08	3	2,22	0,68	3
Lunge	2,36	0,27	3	3,09	1,07	3
Milz	17,88	2,87	3	45,24	13,48	3
Leber	1,43	0,19	3	1,71	0,54	3
Niere	139,44	21,40	3	138,18	39,08	3
Muskel	1,00	0,24	3	1,84	1,06	3
Darm	1,14	0,46	3	0,81	0,23	3
Gehirn	0,40	0,19	3	0,31	0,22	3
Tumor	4,89	1,34	3	10,86	0,94	3

Diskussion
Da die Zellbindungseigenschaften durch die Konjugation des Farbstoffs nicht beeinflusst wurden, können Glu-Harnstoff-Lys-HBED-CC-Farbstoff-Konjugate, wie beispielhaft dargestellt, ein Werkzeug darstellen, die intrazelluläre Verteilung von ⁶⁸Ga-markiertem Glu-Harnstoff-Lys(Ahx)-HBED-CC zu verfolgen. Eine Organverteilungsstudie zeigte, dass die absolute Tumoraufnahme und die Tumor-zu-Hintergrund-Verhältnisse zumindeste vergleichbar mit nicht-konjugiertem Glu-Harnstoff-Lys(Ahx)-HBED-CC waren, das vor kurzem viel versprechende Ergebnisse als neuer klinischer PET-Tracer für die Diagnose von rezidivierendem Prostatakrebs lieferte (Afshar-Oromieh et al. 2013, Afshar-Oromieh et al. 2014). Folglich kann dieser Tracer, an klinisch relevante Farbstoffe konjugiert, als ein multimodales Bildgebungsmittel dienen, das eine Stadienbestimmung mittels PET-Bildgebung einerseits und Fluoreszenzsignale, wie z. B. intraoperative Fluoreszenzsignale, andererseits bietet, was dazu beitragen könnte, zwischen Neoplasie und gesundem Gewebe während der Operation zu unterscheiden.
Beispiel 2
Synthesen des bevorzugten Vorläufers
Zum Synthetisieren des Pharmakophors Glu-Harnstoff-Lys wurde das Isocyanat der Glutamyl-Einheit 1 in-situ durch Hinzufügen eines Gemischs von 3 mmol Bis(tert.-butyl)-L-glutamat-Hydrochlorid (Bachem, Schweiz) und von 1,5 ml N-Ethyldiisopropylamin (DIPEA) in 200 ml trockenem CH₂Cl₂ zu einer Lösung von 1 mmol Triphosgen in 10 ml CH₂Cl₂ bei 0°C über 4 Std. hergestellt. Nach Rühren des Reaktionsgemischs für eine weitere Stunde bei 25°C wurden 0,5 mmol eines Harz-immobilisierten (2-Chlortrityl-Harz, Merck, Darmstadt) ε-Allyloxycarbonyl-geschützten Lysins in 4 ml DCM hinzugefügt und für 16 Std. unter leichtem Rühren umgesetzt, was zu Verbindung 3 führte. Das Harz wurde abfiltriert und die Allyloxy-Schutzgruppe wurde unter Verwendung von 100 mg Tetrakis(triphenyl)palladium(0) (Sigma-Aldrich, Deutschland) und 400 μl Morpholin in 4 ml CH₂Cl₂ für 3 Stunden entfernt, was zu 4 führte. Verbindung 4 wurde von dem Harz durch Umsetzung mit 4 ml eines 30%igen 1,1,1-3,3,3-Hexafluorisopropanols (HFIP) in CH₂Cl₂ für zwei Stunden bei Umgebungstemperatur abgespalten, was das tert.-Butyl-geschützte rohe Produkt 5 ergab, das über RP-HPLC gereinigt wurde. Der bis-aktivierte Ester (HBED-CC)TFP₂ wurde synthetisiert, wie zuvor beschrieben (Schäfer et al. 2012). Der Vorläufer für die Konjugation des Farbstoffs wurde durch Umsetzen von 66 mg (0,08 mmol) des bis-aktivierten Esters (HBED-CC)TFP₂ mit 39 mg (0,072 mmol) des TFA-Salzes von Bis(tert.butyl)-Glu-Harnstoff-Lys (5) in 1 ml trockenem DMF und 25 μl DIPEA bei Raumtemperatur synthetisiert. Nach 4 Stunden wurden 75 μl 1,8-Diamino-3,6-dioxaoktan (0,52 mmol) hinzugefügt und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 16 Stunden lang durchgeführt. Nach Verdampfung des Lösungsmittels wurde das rohe Produkt 6 über RP-HPLC (Gradient: 10% CH₃CN bis 40% CH₃CN in 10,5 min, Durchfluss 6 ml/min; Nachweis bei 214 nm) gereinigt. (Ausbeute: 32 mg; 34%). (berechn. 1076,24; gefunden: 1077,2 (M+H⁺)).
Dieses Verfahren ist weiterhin in 6 dargestellt.
Um den am stärksten bevorzugten Aminohexansäure-Spacer zwischen dem Bindungsmotiv und dem Chelator HBED-CC einzuführen, wird Verbindung 4 mit 2 mmol der Fmoc-geschützten 6-Aminohexansäure (Sigma-Aldrich, Deutschland), 1,96 mmol HBTU (Merck, Darmstadt, Deutschland) und 2 mmol N-Ethyldiisopropylamin in einem Endvolumen von 4 ml DMF umgesetzt.
Beispiel PSMA-HBED-CC-FITC
Die Konjugation von Fluorescein wurde durch Umsetzen von 6 mg des HBED-CC-Konjugats 6 (0,005 mmol) mit 2,3 mg (0,006 mmol) Fluoresceinisothiocyanat (Isomer I) in 1 ml trockenem DMF, das mit 15 μl DIPEA angereichert wurde, bei Raumtemperatur für 16 Stunden durchgeführt. Nach Verdampfung des Lösungsmittels wurde das Produkt 7 über RP-HPLC (Gradient: 15% CH₃CN bis 51% CH₃CN in 9,2 min, Durchfluss 6 ml/min; Nachweis bei 214 nm) isoliert. (Ausbeute: 4,2 mg; 57%): (berechn. 1465,62; gefunden: 1466,4 (M+H⁺)). Die Abspaltung der verbleibenden Schutzgruppen erfolgte unter Verwendung von TFA. (berechn. 1353,4; gefunden: 1354,3 (M+H⁺)). Dies ist weiterhin in 7 dargestellt.
Analog wurden andere Fluoreszenzfarbstoffe konjugiert, wie z. B. Alexa 488, Cy5.5, SulfoCy5, ATTO647N, ICG und IRdye800CW. Dann wird eine entsprechende aktivierte Form des jeweiligen Fluoreszenzfarbstoffs anstelle von FITC verwendet. Analog werden auch Farbstoffe des Rhodamin-Typs, wie die von Kolmakov et al. (vgl. Kolamkov et al., 2012; Kolmakov et al., 2014) gezeigten, wie z. B. die darin gezeigten KK114 oder Abberior Star 635 P, konjugiert.
Beispiele für die dadurch erhältlichen Strukturen sind die folgenden: PSMA-Ahx-HBED-CC-FITC:
PSMA-Ahx-HBED-CC-Alexa 488:
PSMA-Ahx-HBED-CC-Cyanin 5.5:
PSMA-Ahx-HBED-CC-Sulfocy5:
PSMA-Ahx-HBED-CC-ATTO647N:
PSMA-Ahx-HBED-CC-ICG:
PSMA-Ahx-HBED-CC-IRdye800CW:
worin X^– ein pharmazeutisch annehmbares negativ geladenes Gegenion ist und worin Y⁺ ein pharmazeutisch annehmbares positiv geladenes Gegenion ist.
Hier hängt das jeweilige Gegenion von den verwendeten umgebenden Flüssigkeiten ab, wie denjenigen, die in dem Puffer, in dem die Verbindung gelöst ist, und den Körperflüssigkeiten nach Injektion in vivo enthalten sind. In vivo ist extrazellulär eines der hauptsächlichen, aber nicht das einzige positiv geladene Gegenion Na⁺ und eines der hauptsächlichen, aber nicht das einzige negativ geladene Gegenion, ist Cl^–.
⁶⁸Ga-Markierung
Die Konjugate (0,1–1 nmol in 0,1 M HEPES-Puffer, pH = 7,5, 100 μl) wurden zu einem Gemisch von 10 μl HEPES-Lösung (2,1 M) und 40 μl [⁶⁸Ga]Ga³⁺-Eluat (25-60 MBq) hinzugefügt. Der pH-Wert der Markierungslösung wurde unter Verwendung von 30%igem NaOH auf 4,2 eingestellt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 80°C für 2 Minuten inkubiert. Die radiochemische Ausbeute (RCY) wurde über analytische RP-HPLC bestimmt.
Zellkultur
Für Bindungsstudien und in vivo-Experimente wurden LNCaP-Zellen (metastasierende Läsion von menschlichem Prostata-Adenokarzinom, ATCC CRL-1740) in RPMI-Medium, das mit 10% fötalem Kälberserum und Glutamax (PAA, Österreich) angereichert war, gezüchtet. Während der Zellkultur wurden die Zellen bei 37°C in einem Inkubator mit befeuchteter Luft, die mit 5% CO₂ äquilibriert war, gezüchtet. Die Zellen wurden unter Verwendung von Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (Trypsin-EDTA; 0,25% Trypsin, 0,02% EDTA, alle von PAA, Österreich) geerntet und mit PBS gewaschen.
Zellbindung und Internalisierung
Der kompetitive Zellbindungsassay und Internalisierungsexperimente wurden durchgeführt, wie zuvor beschrieben (Eder et al. 2012). Kurz gesagt, wurden die entsprechenden Zellen (10⁵ pro Vertiefung) mit dem Radioliganden (⁶⁸Ga-markiertes [Glu-Harnstoff-Lys(Ahx)]₂-HBED-CC (Schäfer et al. 2012)) in Anwesenheit von 12 verschiedenen Konzentrationen des Analyten (0–5000 nM, 100 μl/Vertiefung) inkubiert. Nach der Inkubation wurde unter Verwendung eines Multisieb-Vakuum-Verteilers (Millipore, Billerica, MA) gewaschen. Zellgebundene Radioaktivität wurde unter Verwendung eines Gamma-Zählgeräts (Packard Cobra II, GMI, Minnesota, USA) gemessen. Die 50%ige inhibitorische Konzentration (IC50) wurde berechnet, indem die Daten unter Verwendung eines nichtlineare-Regression-Algorithmus (GraphPad Software) angepasst wurden. Experimente wurden dreimal durchgeführt. Um die spezifische Aufnahme in Zellen und die Internalisierung zu bestimmen, wurden 10⁵ Zellen in Poly-L-Lysin-beschichtete Zellkulturplatten mit 24 Vertiefungen 24 Std. vor der Inkubation überimpft. Nach Waschen wurden die Zellen mit 25 nM der radioaktiv markierten Verbindungen für 45 min bei 37°C bzw. bei 4°C inkubiert. Die spezifische zelluläre Aufnahme wurde durch kompetitive Blockierung mit 2-(Phosphonomethyl)pentandisäure (500 μM Endkonzentration, PMPA, Axxora, Lörrach, Deutschland) bestimmt. Die zelluläre Aufnahme wurde durch 4-maliges Waschen mit 1 ml eiskaltem PBS beendet. Die Zellen wurden anschließend zweimal mit 0,5 ml Glycin-HCl in PBS (50 mM, pH = 2,8) für 5 min inkubiert, um die oberflächengebundene Fraktion zu entfernen. Die Zellen wurden mit 1 ml eiskaltem PBS gewaschen und unter Verwendung von 0,3 N NaOH (0,5 ml) lysiert. Die oberflächengebundene und die internalisierte Fraktion wurden in einem Gamma-Zählgerät gemessen. Die Aufnahme in Zellen wurde als Prozent der an 10⁶ Zellen gebundenen ursprünglich zugegebenen Radioaktivität [% ID/10⁶ Zellen] berechnet.
Biodistribution
7 bis 8 Wochen alte männliche BALB/c-nu/nu-Mäuse (Charles River Laboratories) wurden subkutan in den rechten Truncus mit 5 × 10⁶ LNCaP-Zellen (in 50% Matrigel; Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) beimpft. Man ließ die Tumoren bis auf eine Größe von etwa 1 cm³ heranwachsen. Die radioaktiv markierten Verbindungen wurden in die Schwanzvene (etwa 1 MBq pro Maus; 0,06 nmol) injiziert. 1 Std. nach der Injektion wurden die Tiere geopfert. Organe von Interesse wurden herausgeschnitten, trocken getupft und gewogen. Die Radioaktivität wurde unter Verwendung eines Gamma-Zählgeräts gemessen und als % ID/g berechnet.
Ergebnisse
PSMA-HBED-CC-FITC
In vitro-Zellbindungseigenschaften
Ein kompetitiver in-vitro-Zellbindungsassay wurde durchgeführt, um das Bindungspotenzial, ausgedrückt als IC₅₀-Werte, von Glu-Harnstoff-Lys-HBED-CC-Fluorescein im Vergleich zu der Referenz Glu-Harnstoff-Lys(Ahx)-HBED-CC zu bestimmen. Die IC₅₀-Werte von Glu-Harnstoff-Lys-HBED-CC-Fluorescein und Glu-Harnstoff-Lys(Ahx)-HBED-CC betrugen 11,14 ± 1,16 nM bzw. 9,82 ± 1,26 nM, was darauf hindeutet, dass die PSMA-Spezifität durch die Konjugation von Fluorescein nicht beeinträchtigt wurde.
Die Funktionalität des dualen Bildgebungsmittels Glu-Harnstoff-Lys-HBED-CC-Fluorescein wurde zusätzlich auf zellulärer Basis durch Analysieren der Internalisierung und der Zelloberflächenbindungseigenschaften untersucht (8). Glu-Harnstoff-Lys-HBED-CC-Fluorescein wurde von LNCaP-Zellen spezifisch internalisiert, wie die kompetitive Blockierung mit dem PSMA-Inihibor 2-PMPA zeigt (P < 0,001). Das Zellaufnahme- und Internalisierungsprofil wurde im Laufe der chemischen Kombination von Glu-Harnstoff-Lys-HBED-CC und Fluorescein nicht erheblich verändert, was darauf hindeutet, dass der Farbstoff an dieser Position keinen Einfluss auf die Zellbindungseigenschaften des PSMA-bindenden Moleküls hat.
Organverteilung

Um die Funktionalität des Moleküls in vivo zu zeigen, wurden Organverteilungsstudien mit Tumor-tragenden Xenotransplantaten durchgeführt. 9 und Tabelle II zeigen, dass die Tumoraufnahme des Farbstoff-Konjugats Glu-Harnstoff-Lys-HBED-CC-Fluorescein in PSMA-positive LNCaP-Tumoren (10,86 ± 0,94% ID/g) höher war als diejenige der nicht-konjugierten Referenz Glu-Harnstoff-Lys(Ahx)-HBED-CC (4,89 ± 1,34% ID/g). Ferner waren die Verteilungsprofile beider Verbindungen, Glu-Harnstoff-Lys-HBED-CC-Fluorescein und Glu-Harnstoff-Lys(Ahx)-HBED-CC, in gesunden Organen vergleichbar, was auf eine ähnliche Hintergrundaktivität beider Verbindungen in vivo hindeutet. So sind die in vivo-Tumor-Ansteuerungseigenschaften von Glu-Harnstoff-Lys-HBED-CC-Fluorescein zumindest vergleichbar mit der Referenz Glu-Harnstoff-Lys(Ahx)-HBED-CC. Tabelle II. Organverteilungsdaten 1 Std. nach Injektion

Diskussion
Da die Zellbindungseigenschaften durch die Konjugation des Fluoreszenzfarbstoffs nicht beeinflusst wurden, könnte Glu-Harnstoff-Lys-HBED-CC-Fluorescein ein Werkzeug darstellen, die intrazelluläre Verteilung von ⁶⁸Gamarkiertem Glu-Harnstoff-Lys(Ahx)-HBED-CC zu verfolgen. Eine Organverteilungsstudie zeigte, dass die absolute Tumoraufnahme und die Tumor-zu-Hintergrund-Verhältnisse zumindest vergleichbar mit nicht-konjugiertem Glu-Harnstoff-Lys(Ahx)-HBED-CC waren, das vor kurzem vielversprechende Ergebnisse als neuer klinischer PET-Tracer für die Diagnose von rezidivierendem Prostatakrebs lieferte (Afshar-Oromieh et al. 2013, Afshar-Oromieh et al. 2014). Folglich kann dieser Tracer, an klinisch relevante Farbstoffe konjugiert, als ein multimodales Bildgebungsmittel dienen, das eine Stadienbestimmung mittels PET-Bildgebung einerseits und intraoperative Fluoreszenzsignale andererseits bietet, was dazu beitragen könnte, zwischen Prostatakrebs und gesundem Gewebe während der Operation zu unterscheiden.
Beispiel 3
Es wurde herausgefunden, dass der Chelator HBED-CC (N,N'-Bis-[2-hydroxy-5-(carboxyethyl)benzyl]ethylendiamin-N,N'-diessigsäure), ein azyklisches Komplexierungsmittel darstellt, das insbesondere eine effiziente radioaktive Markierung mit ⁶⁸Ga sogar bei Umgebungstemperatur gestattet (Eder et al., 2010; Eder et al., 2008). Es stellt sich heraus, dass durch Kombination von HBED-CC mit dem PSMA-Inhibitor Glu-Harnstoff-Lys ein vorteilhafter aromatischer Teil in den Radiotracer eingeführt wird, von dem sich herausstellte, dass er für eine nachhaltige Wechselwirkung mit den PSMA-Rezeptor, wahrscheinlich mit der akzessorischen hydrophoben Tasche der PSMA-Bindungsstelle, nützlich war (Eder et al., 2012; Kularatne et al., 2009; Liu et al., 2008). Tatsächlich hat man in einer präklinischen Studie gezeigt, dass der Ersatz von HBED-CC durch DOTA (1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure) zu einem Molekül führte, das nicht in der Lage war, den Tumor überhaupt abzubilden (Eder et al., 2012). Dies ist in 10 dargestellt, wobei der Tumor (in einem LNCaP-Tumormodell in Balb/c-nu/nu-nude-Mäusen) durch den Pfeil angedeutet wird. Daher sind HBED-CC-Konjugate besonders vorteilhaft.
Beispiel 4
Die ⁶⁸Ga-markierten Verbindungen PSMA-HBED-CC-FITC (die vorstehend abgebildete Verbindung), PSMA-Ahx-HBED-CC-Cyanin 5.5 (die vorstehend dargestellte Verbindung, deren Masse mittels Massenspektrometrie zu M (berechnet) = 1642,98; M (gefunden) = 1642,7 bestimmt wurde) und PSMA-Ahx-HBED-CC (die entsprechende Verbindung ohne Cyanin 5.5) und wurden in einen LNCaP-Tumor tragende nude-Mäuse injiziert. Eine Stunde nach der Injektion wurde μPET-Bildgebung durchgeführt.
Es konnte gezeigt werden, dass alle drei Verbindungen eine vergleichbare Verteilung der Radioaktivität und der Tumoraufnahme zeigten (vgl. 11). Daher konnte nachgewiesen werden, dass die Konjugation der Fluoreszenzfarbstoffe und die Einfügung eines Spacers die Verteilung der Radioaktivität und die Tumor-Aufnahme von PSMA-HBED-CC-Konjugaten nicht signifikant beeinflussen.
Beispiel 5
PSMA-Ahx-HBED-CC-FITC (wie vorstehend gezeigt) wurde mit einer von Banerjee et al. veröffentlichten Referenz-Verbindung (Banerjee et al., 2011, Angew Chem Int Ed Engl. 50(39): 167–9170, Seite 6, Schema 1, Endprodukt) und der entsprechenden Verbindung ohne den Fluoreszenzfarbstoff IRDye800CW, die eine freie Aminogruppe der Lysyl-Einheit birgt, an die der Farbstoff IRDye800CW gebunden werden kann, verglichen. Diese Verbindungen wurden in LNCaP-Tumor-tragende nude-Mäuse injiziert.
Es konnte gezeigt werden, dass die Tumoraufnahme unter Verwendung von PSMA-Ahx-HBED-CC-FITC deutlich verbessert war (vgl. 12). Das Fehlen des Fluoreszenzfarbstoffs der von Banerjee et al. veröffentlichten Referenzverbindung führte zu einer signifikant verringerten Nieren-, Milz- (beide Organe exprimieren PSMA) und Tumor-Aufnahme von 0,71 ± 0,03% ID/g (vgl. 12).
Somit bestätigt diese Organverteilungsstudie, dass die Verwendung verzweigter Verbindungen signifikante Nachteile birgt, wie verringerte Bindung an die Zielstruktur, wenn diese Verbindungen nicht, wie die von Banerjee et al. veröffentlichte Referenzverbindung, mit den besonderen Fluorophor-Strukturen, wie IRDye800CW, kombiniert werden. Daher sind die aus Banerjee et al. bekannten Strukturen nicht auf modulare Weise verwendbar. Insbesondere sind die damit konjugierten Farbstoffe nicht frei wählbar und mehrere Fluorophore, die man im Stand der Technik regelmäßig und vorzugsweise verwendet, sind mit den verzweigten Verbindungen, wie den von Banerjee et al. (Banerjee et al. (2011) und WO 2010/108125 gezeigten, nicht verwendbar, insbesondere dann nicht, wenn der Chelator DOTA ist.
Bezugszeichenliste

1: Zielstruktur auf Membran von neoplastischen Zellen
2: anregendes Licht
3: Fluoreszenz
4: Radiometall
5: Positron
6: Gammastrahlung/Photonenemission

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 2010/108125 [0008, 0242]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Seibold et al., 2014 [0010]
vgl. Kolamkov et al., 2012 [0037]
Kolmakov et al., 2014 [0037]
Kolamkov et al., 2012 [0082]
Kolmakov et al., 2014 [0082]
Banerjee et al., 2011, Angew Chem Int Ed Engl. 50(39): 9167–9170, Seite 6, Schema 1, Endprodukt [0207]
Schuhmacher et al. 1981 [0208]
Schäfer et al. 2012 [0211]
Eder et al. 2012 [0215]
Schäfer et al. 2012 [0215]
Afshar-Oromieh et al. 2013 [0221]
Afshar-Oromieh et al. 2014 [0221]
Schäfer et al. 2012 [0222]
Kolamkov et al., 2012; Kolmakov et al., 2014 [0226]
Eder et al. 2012 [0231]
Schäfer et al. 2012 [0231]
Afshar-Oromieh et al. 2013, Afshar-Oromieh et al. 2014 [0236]
Eder et al., 2010 [0237]
Eder et al., 2008 [0237]
Eder et al., 2012 [0237]
Kularatne et al., 2009 [0237]
Liu et al., 2008 [0237]
Eder et al., 2012 [0237]
Banerjee et al., 2011, Angew Chem Int Ed Engl. 50(39): 167–9170, Seite 6, Schema 1, Endprodukt [0240]
(Banerjee et al. (2011) [0242]

Claims

Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon mit einer chemischen Struktur, die Folgendes umfasst: (A) ein Motiv, das spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindet, wobei das Motiv ein Prostata-spezifisches Membranantigen-bindendes Motiv umfasst, umfassend ein Glutamat-Harnstoff-Lysin-Motiv gemäß folgender Formel:
worin die Wellenlinie die Konjugationsstelle an die Chelator-Einheit von Radiometallen (B) anzeigt; (B) eine Chelator-Einheit von Radiometallen, worin die Chelator-Einheit von Radiometallen eine ⁶⁸Ga-Chelator-Einheit ist; und (C) eine Farbstoff-Einheit, wobei die Farbstoff-Einheit eine Fluoreszenzfarbstoff-Einheit mit einem Emissionsmaximum im Bereich von 400 nm bis 1000 nm ist; wobei die Verbindung eine Molekülmasse von nicht mehr als 5 kDa hat und wobei die Verbindung folgende chemische Struktur hat (A)-(B)-(C), worin ”–” eine Bindung über ein Spacer-Molekül oder eine direkte Bindung sein kann.
Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach Anspruch 1, wobei (B) und (C) sowie (A) und (B) aneinander über ein Spacer-Molekül konjugiert sind.
Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach Anspruch 1, wobei die Verbindung die folgende Molekülstruktur hat: (A)-x-(B)-y-(C), wobei x und y unabhängig voneinander jeweils für ein Spacer-Molekül stehen.
Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach Anspruch 3, wobei der Spacer x die folgende Struktur trägt: -[b''-c-b''']_n-b''''-d ¹- worin b'' aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus -C(O)-, -NH- und -O- und worin b' von (A) und b'' des Spacers x zusammen eine Amidgruppe oder eine Estergruppe bilden; worin c für einen Rest steht, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem C_1-8-Alkylen, worin eine oder mehrere -CH₂-Einheiten gegebenenfalls durch 15 -O- ersetzt sein können; worin b''' aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus -NH-, -C(O)- und -O-; worin b'''' aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus -C(O)-, -NH- und -O-; und wobei b''' und b'''' oder b' und b'''' zusammen eine Amidgruppe oder eine Estergruppe bilden; worin d¹ -[CH₂]_p- ist, wobei p 1 oder 2 ist; und wobei n 0 oder 1 ist.
Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach Anspruch 3, wobei der Spacer x die folgende Struktur trägt: -[C(O)-(CH₂)_q-NH]_n-C(O)-(CH₂)_p-, worin q eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist; worin n 0 oder 1 ist und worin p 1 oder 2 ist.
Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach Anspruch 3, wobei der Spacer x die folgende Struktur trägt: -[C(O)-(CH₂)₅-NH]_n-C(O)-(CH₂)₂-, worin n 0 oder 1 ist.
Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach Anspruch 3, wobei der Spacer y die folgende Struktur trägt: d²e-[f-e']_m-, worin d² -[CH₂]_r- ist, worin r 1 oder 2 ist; und wobei e aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus -C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -C(O)-O- und -O-C(O)-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(S)-NH-,
worin eine der Wellenlinien die Konjugationsstelle an d² anzeigt und die andere Wellenlinie die Konjugationsstelle an f anzeigt, wobei jedes f unabhängig für einen Rest steht, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem C_1-10-Alkylen, worin eine oder mehrere -CH₂-Einheiten gegebenenfalls durch -O- oder -NH- ersetzt sein können, und wobei f nicht substituiert oder mit einer oder mehreren Gruppen substituiert ist, die unabhängig voneinander aus der aus -NH₂, -COOH und R³ bestehenden Gruppe ausgewählt werden, wobei R³ aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus -(CH₂)₂-COOH, -(CH₂)₄-NH₂, -(CH₂)₄-N⁺(CH₃)₃ + X^–, -CH₂-COOH, -CH₂-SH, -CH₂-SO₃H und
wobei X^– ein pharmazeutisch annehmbares negativ geladenes Gegenion ist; wobei jedes e' unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer chemischen Bindung, -NH-C(O)-, -C(O)-NH-, -C(O)-O- und -O-C(O)-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(S)-NH-, -C(O)-N(CH₃)-, -N(CH₃)-C(O)-, -NH-C(S)-, -C(S)-NH-,
wobei eine der Wellenlinien die Konjugationsstelle an f anzeigt und die andere Wellenlinie die Konjugationsstelle an die Farbstoff-Einheit (C) anzeigt; und wobei m eine ganze Zahl zwischen 0 und 8 angibt.
Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach Anspruch 7, wobei der Spacer y eine der folgenden Strukturen trägt: -(CH₂)_t-C(O)-NH-(CH₂)_u-(O-CH₂-CH₂)_v-(CH₂)_w-e'- oder -(CH₂)_t-C(O)-NH-(CH₂-CH₂-O)_v-CH₂-e'-, worin t 1 oder 2 ist; worin u eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist; worin v eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist; worin w eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist und worin e' wie in Anspruch 7 definiert ist.
Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach Anspruch 3, wobei der Spacer y eine der folgenden Strukturen trägt: -(CH₂)₂-C(O)-NH-(CH₂)₂-(O-CH₂-CH₂)₂-e'- -(CH₂)₂-C(O)-NH-(CH₂)₂-(O-CH₂-CH₂)₂-NH-C(O)-CH₂-(O-CH₂-CH₂)_n-O-CH₂-e'-, -(CH₂)₂-C(O)-NH-(CH₂)₂-(O-CH₂-CH₂)₂-NH-[C(O)-CH((CH₂)₂COOH)-NH]_n''-C(O)-CH((CH₂)₂COOH)-e'-, -(CH₂)₂-C(O)-NH-(CH₂)₂-(O-CH₂-CH₂)₂-NH-[C(O)-CH((CH₂)₄NH₂)-NH]_n''-C(O)-CH((CH₂)₄NH₂)-e'- oder -(CH₂)₂-C(O)-NH-(CH₂)₂-(O-CH₂-CH₂)₂-NH-[C(O)-CH((CH₂)₄N⁺(CH₃)₃)-NH]_n''-C(O)-CH((CH₂)₄N⁺(CH₃)₃)-e'-+X^–, worin n' eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; worin n'' eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist; worin X^– ein pharmazeutisch annehmbares negativ geladenes Gegenion ist und worin jedes e' unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer chemischen Bindung, -NH-C(O)-, -C(O)-NH-, -C(O)-O- und -O-C(O)-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(S)NH-, -C(O)-N(CH₃)-, -N(CH₃)-C(O)-, -NH-C(S)-, -C(S)-NH-,
wobei eine der Wellenlinien die Konjugationsstelle an f anzeigt und die andere Wellenlinie die Konjugationsstelle an die Farbstoff-Einheit (C) anzeigt.
Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach Anspruch 1, wobei die Chelator-Einheit von Radiometallen (B) eine ⁶⁸Ga-Chelator-Einheit ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
wobei in jeder der Strukturen eine der Wellenlinien die Konjugationsstelle an das Motiv (A), das spezifisch an Zellmembranen von neoplastischen Zellen bindet, vorzugsweise über einen Spacer x, wie hier definiert, anzeigt und die andere Wellenlinie die Konjugationsstelle an die Farbstoff-Einheit (C), vorzugsweise über den Spacer y, wie hier definiert, anzeigt, wobei die ⁶⁸Ga-Chelator-Einheit insbesondere Folgende ist
Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach Anspruch 1, wobei die Farbstoff-Einheit (C) eine Fluoreszenzfarbstoff-Einheit ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: einem Indocyanin-Grün(ICG)-Farbstoff, der insbesondere von Sulfo-Indocyanin-Grün (Sulfo ICG) stammt; einem Farbstoff des Fluorescein-Typs, der vorzugsweise von Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Carboxyfluorescein oder Fluorescein stammt, insbesondere von FITC stammt; einem Farbstoff des Rhodamin-Typs, der insbesondere von Rhodamin G stammt; einem Cyanin-Farbstoff, der vorzugsweise von Sulfocy5, Cyanin 5.5, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy7.5, einem Alexa Fluor-Farbstoff, DyLight, einem FluoProbe-Farbstoff, einem Sulfo-Cy-Farbstoff oder einem Seta-Farbstoff stammt, insbesondere von Cy5, Alexa 488 oder Alexa 547 stammt; einem Infrarot-Farbstoff, der insbesondere von IRDye 800CW, IRDye 800RS, IRDye 800, IRDye 700, IRDye 700DX, IRDye 680 oder IRDye 680LT stammt; einem Phenoxacin-Farbstoff, der insbesondere von Nilrot oder Nilblau stammt; einer von einem Allophycocyanin-Farbstoff stammenden Farbstoff-Einheit; einer von einem Berberin-Farbstoff stammenden Farbstoff-Einheit; einer von Chinin oder einem Fluoreszenz-Chinin-Derivat stammenden Farbstoff-Einheit; einer von Cumarin stammenden Farbstoff-Einheit; einer von 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) stammenden Farbstoff-Einheit; einer von Epicocconon stammenden Farbstoff-Einheit; einer von 5-({2-[(Iodacetyl)amino]ethyl}amino)naphthalin-1-sulfonsäure (IAEDANS) stammenden Farbstoff-Einheit; einem Atto-Farbstoff, der vorzugsweise von ATTO 647, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 520, ATTO 532, ATTO 550, ATTO 565, ATTO 590, ATTO 594, ATTO 610, ATTO 611X, ATTO 620, ATTO 633, ATTO 635, ATTO 637, ATTO 647N, ATTO 655, ATTO 665, ATTO 680, ATTO 700, ATTO 725, ATTO 740, ATTO 390, ATTO 425, ATTO 465, insbesondere ATTO 647 oder ATTO 488 stammt; einem Visen-Farbstoff, der insbesondere von VivoTag680 oder VivoTag750 stammt; und einer von einem HOECHST-Farbstoff stammenden Farbstoff-Einheit.
Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach Anspruch 11, wobei die Farbstoff-Einheit (C) eine Fluoreszenzfarbstoff-Einheit ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: einem Indocyanin-Grün(ICG)-Farbstoff, einem Farbstoff des Fluorescein-Typs, einem Cyanin-Farbstoff, einem Atto-Farbstoff und einem Infrarot-Farbstoff.
Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach Anspruch 1, wobei die Farbstoff-Einheit (C) eine Fluoreszenzfarbstoff-Einheit ist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus folgenden Strukturen besteht:

wobei X^– ein pharmazeutisch annehmbares negativ geladenes Gegenion ist; wobei Y⁺ ein pharmazeutisch annehmbares positiv geladenes Gegenion ist; und wobei die Wellenlinie die Konjugationsstelle an den Rest der Verbindung angibt.
Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach Anspruch 1, wobei die Verbindung die folgende Molekülstruktur hat: (A)-(B)-Spacer-(C), worin das an das Prostata-spezifische Membranantigen (PSMA) bindende Motiv (A) an (B) über den epsilon-Aminorest der Lysin-Einheit konjugiert ist; und der Spacer eine Molekülstruktur umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Polyethylenglykol (PEG)-, Alkylen-, Peptid- und Peptidomimetikum-Spacer.
Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach Anspruch 3, wobei die Verbindung die folgende Molekülstruktur hat: (A)-x-(B)-y-(C), wobei das an das Prostata-spezifische Membranantigen (PSMA) bindende Motiv (A) an (B) über den Spacer x über den epsilon-Aminorest der Lysin-Einheit konjugiert ist; und wobei der Spacer y eine Molekülstruktur umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Polyethylenglykol (PEG) mit zwei bis 10 aufeinanderfolgenden PEG-Einheiten, einem C_1-10-Alkylen, einem Peptid oder Peptidomimetikum, umfassend von eins bis zehn Aminosäure-Einheiten, und/oder Analoga davon und einer Kombination von zwei oder mehreren davon.
Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach Anspruch 7, wobei die Verbindung die folgende Molekülstruktur hat: (A)-x-(B)-y-(C), worin: (A) sich auf das an das Prostata-spezifische Membranantigen (PSMA) bindende Motiv bezieht, das an (B) über den Spacer x über den epsilon-Aminorest der Lysin-Einheit konjugiert ist; x für die Struktur -[C(O)-(CH₂)₅-NH]_n-C(O)-(CH₂)₂- steht, worin n 0 oder 1 ist; y für eine der folgenden Strukturen steht: -(CH₂)_t-C(O)-NH-(CH₂)_u-(O-CH₂-CH₂)_v-(CH₂)_w-e'- oder -(CH₂)_t-C(O)-NH-(CH₂-CH₂-O)_v-CH₂-e'-, worin t 1 oder 2 ist; worin u eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist; worin v eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist; worin w eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist; und (B) und (C) wie in Anspruch 1 definiert sind.
Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach Anspruch 1, wobei diese Verbindung die folgende chemische Struktur hat:
worin n für 0 oder 1 steht; wobei jedes e' unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer chemischen Bindung, -NH-C(O)-, -C(O)-NH-, -C(O)-O- und -O-C(O)-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(S)-NH-, -C(O)-N(CH₃)-, -N(CH₃)-C(O)-, -NH-C(S)-, -C(S)-NH-,
wobei eine der Wellenlinien die Konjugationsstelle an f anzeigt und die andere Wellenlinie die Konjugationsstelle an die Farbstoff-Einheit (C) anzeigt; und wobei (C) die Farbstoff-Einheit (C) angibt.
Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach Anspruch 1, wobei die Verbindung eine der folgenden chemischen Strukturen hat: PSMA-Ahx-HBED-CC-FITC:
PSMA-Ahx-HBED-CC-Alexa 488:
PSMA-Ahx-HBED-CC-Cyanin 5.5:
PSMA-Ahx-HBED-CC-SulfoCy5:
PSMA-Ahx-HBED-CC-ATTO647N:
PSMA-Ahx-HBED-CC-ICG:
PSMA-Ahx-HBED-CC-IRdye800CW:
wobei X^– ein pharmazeutisch annehmbares negativ geladenes Gegenion ist und wobei Y⁺ ein pharmazeutisch annehmbares positiv geladenes Gegenion ist.
Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach Anspruch 1, wobei diese Verbindung die folgende chemische Struktur hat:
Zusammensetzung, umfassend: (a) die Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach Anspruch 1; (b) ein Radiometall, insbesondere ⁶⁸Ga, und gegebenenfalls (c) einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Träger.
Zusammensetzung nach Anspruch 20 für die Verwendung als Diagnostikum.
Zusammensetzung nach Anspruch 20 für die Verwendung bei einem Verfahren zum Diagnostizieren eines Neoplasmas in einem Patienten, der daran leidet oder einem Risiko dafür ausgesetzt ist.
Zusammensetzung für die Verwendung nach Anspruch 22, wobei die Neoplasie Krebs ist.
Zusammensetzung für die Verwendung nach Anspruch 22, die folgende Schritte umfasst: (i) Verabreichen der Zusammensetzung an einen Patienten, (ii) Nachweisen des radioaktiven Signals des Radiometalls.
Zusammensetzung für die Verwendung nach Anspruch 24, die zudem umfasst (iii) Nachweisen der Farbstoff-Einheit (C).
Kit, umfassend: (a) die Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach Anspruch 1 und (b) eine Gebrauchsanweisung.