JP2001247470A - 肝保護剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 肝毒物あるいは過剰に活性化された免疫担当
細胞から放出される炎症因子によって引き起こされる肝
障害を抑制することにより、肝疾患を予防できかつ症状
を緩和できる、天然起源物質由来成分を含有する肝保護
剤の提供。 【解決手段】 シナノキ科Tilia属の植物リンデンの地
上部の粉砕物を含有する肝保護剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、肝毒物あるいは過
剰に活性化された免疫担当細胞から放出される炎症因子
によって引き起こされる肝障害を抑制することにより、
肝疾患を予防できかつ症状を緩和できる、天然起源物質
由来成分を含有する肝保護剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】人間が経口的に摂取した物質は、消化・
吸収された後、門脈を経て肝臓へと移行する。この摂取
した物質中に人体に有害な薬物が含まれていると、それ
は肝細胞に含まれる多種多様の酵素（例えば、グルタチ
オントランスフェラーゼ、チトクロームＰ₄₅₀）などの
作用により酸化、還元、抱合などの代謝を介して解毒さ
れる。しかしながら、ハロタン、トルエン、アセトアミ
ノフェン等のように肝臓（肝細胞）に直接的な障害を与
え得る物質を摂取した場合や、または摂取した物質から
代謝過程において有害物質が産生されたり、あるいは代
謝産物が排出されず肝臓内に蓄積された場合には、肝細
胞壊死や肝線維化（すなわち、肝細胞の癒合）などの肝
障害が引き起こされることがある。

【０００３】人体に有害な薬物や毒物の具体例として
は、アルコールが挙げられ、またそれらによって引き起
こされる肝障害の例としては、肝硬変などの疾患が挙げ
られる。例えば、重度のアルコール性肝硬変患者の場
合、血液中のエンドトキシンの増加（エンドトキシン血
症）によって肝臓内の毛細管の循環機能が障害を受け、
結果として肝細胞の壊死が起こる。前記毛細管の循環機
能障害は、詳しくは、エンドトキシンがマクロファージ
や好中球を活性化した結果、これら炎症系細胞から放出
される一酸化窒素（ＮＯ）、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、血
小板活性化因子（ＰＡＦ）などが原因であると推察され
ている。

【０００４】肝障害には、上記以外に、ウィルスによっ
て誘発される肝疾患も含まれ、このうち、臨床的に現
在、最も問題となっているのはウィルス性肝炎である。
ウィルス性肝炎は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ型等に分類
される。これらのうち、Ｂ型またはＣ型のウィルス性肝
炎は慢性の経過を辿ることが多く、次第に肝硬変から肝
癌へと移行し得る。特に、Ｃ型肝炎は現在、難治性でか
つ移行率が高いとされている。Ａ型肝炎ウィルスは、通
常、感染しただけでは肝細胞に無害であるが、免疫担当
細胞（単に免疫細胞とも呼ばれる）と遭遇して異物除去
機構（いわゆる、免疫応答）を生じると、肝炎が発症す
ると考えられている。Ｂ型肝炎ウィルスも前記Ａ型肝炎
ウィルスと同様で、それ自体は肝細胞障害性を有しな
い。しかし、Ｂ型肝炎ウィルスは、一旦肝細胞に感染す
ると、細胞表面に発現されるウィルス関連タンパクがマ
クロファージやリンパ球などの免疫細胞と反応する。そ
の後、感染した肝細胞は、前記免疫細胞によって直接的
に、あるいは免疫細胞から放出されたサイトカインによ
る障害が原因となって、または他の炎症系細胞との間接
的な免疫応答などが原因となって破壊されて、肝疾患を
発症すると考えられている。

【０００５】一般に、肝障害の治療に現在用いられてい
る医療用製剤としては、肝水解物やインターフェロン
（ＩＦＮ）のような生物学的製剤や、マロチラート、グ
ルタチオン、グリチルリチンに代表される化学療法剤が
挙げられるが、いずれも種々の問題点を抱えている。例
えば、ＩＦＮは、前述のウィルス性肝炎の治療に特に多
用されるが、副作用として精神障害、間質性肺炎、血小
板や白血球の減少などが認められることがある。グリチ
ルリチン製剤の一つである強力ネオミノファーゲンシー
（登録商標；ミノファーゲン製薬本舗製）も、副腎皮質
ステロイドと類似した、投薬中止後のリバウンド現象を
引き起こすことがある。

【０００６】従来、小柴胡湯、桂枝茯苓丸などの漢方製
剤も上記目的のために使用されている。しかしながら、
最近、小柴胡湯を抗癌剤と併用した場合または肝癌患者
へ使用した場合に、間質性肺炎の発症やそれが原因とさ
れる死亡例の増加が問題となっており、現時点において
厚生省から小柴胡湯の使用制限の通達が発せられてい
る。

【０００７】上記製剤に比べて副作用が少ない天然起源
物質またはそれからの抽出物あるいは天然起源物質由来
成分を含有する肝保護剤も既にいくつか報告されてい
る。肝保護剤として従来使用されている天然起源物質ま
たはそれからの抽出物あるいは天然起源物質由来成分と
しては、人参やウコンなどのサポニンや精油成分を含有
する植物抽出物が挙げられる。また近年詳細な成分研究
がなされているものとしては、ガジュツ（ショウガ科）
の根に含まれるジアリルヘプタノイド（クルクミン）や
セスキテルペン類（ゲルマクロン、クルクメノン、フラ
ノジエンなど）がある[Matsuda H.ら著、Bioorganic &
Medicinal Chemistry Letters、8巻、第339〜344頁(199
8年)；およびダイオウ（タデ科）に含有されるスチルベ
ン類（ラポンチシン、デスオキシラポンチシン、ピセア
タンノールなど）松田久司ら著、第48回、日本薬学会近
畿支部総会大会 要旨集 第78頁(1998年)]。

【０００８】しかしながら、現在までに、シナノキ科Ti
lia属の植物に関する科学的研究はほとんど成されてお
らず、その薬理作用についての報告もなされていなかっ
た。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、これまでに
肝保護剤としての使用が知られている天然起源物質とは
異なる植物から肝保護有効成分を得ることを目的とす
る。

【００１０】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、シ
ナノキ科Tilia属の植物・リンデンの地上部の粉砕物、
特にリンデンの溶媒抽出エキスを含有する肝保護剤を提
供することを目的とする。本発明の肝保護剤は、従来か
ら食用として多用されている天然起源物質またはそれか
らの抽出物あるいは天然起源物質由来成分を主成分とす
ることから、人体に対して安全性が非常に高いことを特
徴とする。本発明は、別態様として、この肝保護剤を含
有する医薬組成物または食品も提供する。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明をさらに詳細に説明
する。本発明の第１の態様は、シナノキ科Tilia属の植
物・リンデン、特にリンデンの花を含む地上部の粉砕物
そのもの、またはその溶媒抽出エキスを含有する肝保護
剤である。本発明の肝保護剤は、前記溶媒抽出エキスか
らの分画から単離・精製されることにより得られるティ
リロサイドを含有していてもよい。

【００１２】リンデン(Linden；通称、菩提樹)を含むシ
ナノキ科の植物は、主にヨーロッパの温暖な地方に生育
する植物であって、西洋ハーブとして古くから使用され
ている。例えば、外用として、心身をリラックスさせる
ための浴剤としての利用や、洗浄・美白効果を目的とす
る、葉や花の浸出液の化粧水への配合などが挙げられ
る。一方、食用としては、リンデンの花房を煎じたお茶
（リンデンティー）が、消化促進、強壮、発汗作用を目
的に愛飲されているほか、風邪の予防、ヒステリー・不
眠症などのストレス性疾患、高血圧症や偏頭痛にも有効
であると言われている。シナノキ科のTilia属には、Til
ia x europaea L.（ティリア・エウロパエア）、T. cor
data MILL.（フユボダイジュ）、T. americana L.（ア
メリカシナノキ）、T.platyphyllos SCOP. （ナツボダ
イジュ）、T. argenteaなどが存するが、これらのう
ち、本発明に用いるリンデンは、Tilia x europaea L.
とT. argenteaに相当する。

【００１３】本発明では、リンデンの地上部を、一般の
粉砕手段を用いて、粉砕物とする。この粉砕物を、アル
コール系溶媒（好ましくはメタノールやエタノール）ま
たはこれらの水性溶媒中、室温（１０〜３０℃）におい
て２４〜４８時間冷浸抽出した後、溶媒を減圧下で蒸発
させて除去することにより、抽出エキスが得られる。抽
出効率を高めるために、加温抽出、例えば、使用される
溶媒の沸点付近の温度まで加温して抽出してもよい。溶
媒除去は、例えば４５ ℃以下の温度において減圧下
（特に９０〜７５０ｍｍＨｇ以下）で行う。

【００１４】得られたアルコール系溶媒抽出エキスは、
このまま使用することで充分な肝保護作用を有するが、
必要に応じて、更に精製することにより、前記作用をよ
り高めることができる。

【００１５】例えば、アルコール系溶媒抽出エキスを、
酢酸エチル／水（体積比＝１／１）混合液を用いて酢酸
エチル層と水層に分離し、その酢酸エチル層を４５℃以
下の温度において減圧下（特に９０〜７５０ｍｍＨｇ以
下）で溶媒を蒸発させて除去することにより、酢酸エチ
ル画分を得る方法が挙げられる。この画分は、後述の実
施例において説明するように、精製前のメタノール抽出
物と比べて、肝保護作用が強い。

【００１６】前記精製後の画分を以下の操作に付すこと
により、リンデンに含まれる有効成分の一つである、フ
ラボノイド配糖体ティリロサイドを単離することができ
る。ティリロサイドを得るための単離手段は公知であ
る。例えば、前記酢酸エチル画分を、シリカゲルカラム
クロマトグラフィーに付す。キャリヤーとして、ヘキサ
ン／酢酸エチルの混合溶媒系を、最初は溶媒比率１０：
１とし、次いで１：１に変えた後、続いてクロロホルム
／メタノールの混合溶媒系を用い、その溶媒比率を最初
５：１とした後、１：１に変えることにより、フラクシ
ョン１〜１１に分画する。この操作で得られたフラクシ
ョン９を、オクタデシルシリカゲル（ＯＤＳ）カラムを
用いる逆相カラムクロマトグラフィーにおいて、キャリ
ヤーとしてメタノール／水の混合溶媒系（メタノール：
水の溶媒比率を３：７から１：１へ変えた後、更に７：
１へ変える）を用いて精製することにより、フラボノイ
ド配糖体 ティリロサイドが単離精製できる。

【００１７】単離されたティリロサイドは、以下の化学
式を有することが知られている[ヘルハマー L.ら著、Ar
chive der Pharmazie、294巻、第686〜692頁(1961
年)]。

【化２】

【００１８】本発明の肝保護剤についての肝保護作用
は、以下に説明するin vivoまたはinvitro評価法を用い
て確認した。肝保護作用を発現する新規物質の研究で
は、ウイルス感染などの手法を用いない比較的安全でか
つ簡便なin vivoモデルとして、四塩化炭素皮下投与に
よるマウスの劇症肝炎モデルや、ラットやマウスにＤ−
ガラクトサミン (Ｄ−ＧａｌＮ)とエンドトキシンであ
るリポポリサッカライド(ＬＰＳ)を腹腔内投与すること
によって引き起こされる免疫性の肝炎モデルが適用され
る。前者は、薬物による肝障害であり、後者は、免疫系
が関与する実験モデルである。これら実験モデルにおい
てはいずれも、肝細胞破壊によりグルタミン酸−オキサ
ロ酢酸トランスアミナーゼ（通常、ＧＯＴと略され
る）、グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ
（同、ＧＰＴ）および乳酸デヒドロゲナーゼ（同、ＬＤ
Ｈ）等の肝内酵素がそれぞれ血中に放出される。放出さ
れるＧＯＴやＧＰＴは、通常値の数百から数千倍の値と
なることがある。このようなin vivoモデルでは、試料
を適当な懸濁剤で懸濁し、それを被検体（または実験動
物）に経口投与するか、あるいは生理食塩水やオリーブ
オイルに溶解した後、被検体（または実験動物）の腹腔
内へ直接注入し、一定時間経過後、血中の逸脱酵素活性
を測定することにより、判定・評価が行われる。

【００１９】また、本発明では、in vitroモデルによる
評価も行なった。比較的多数のサンプルを用いて効果を
検討したり、微量サンプルの肝保護作用を評価する場合
には、通常、ラットやマウスから得た肝細胞を培養する
in vitroモデルによる実験系が有効であると考えた。in
vitroモデルを用いた評価法では、腹腔や肝臓から分離
した免疫担当細胞であるマクロファージやクッパー細胞
を前培養し、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）を添加し
た後、放出される一酸化窒素を定量し、それに起因する
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）の産生抑制効果を調べる
ことによって、より詳細な肝保護作用の解析を行うこと
が可能である。

【００２０】本発明の肝保護剤は、有効成分としてリン
デンの地上部粉砕物またはそのアルコール系溶媒抽出エ
キスを含有する場合、年齢等によりその投与量が変化し
得るが、例えば成人の１回の服用量につき１００〜１０
００ｍｇ、好ましくは２５０〜１０００ｍｇ（または全
量の１〜１０％）の量で配合される。本発明の肝保護剤
がフラボノイド配糖体ティリロサイドを有効成分として
含有する場合、成人の１回の服用量につき１〜５００ｍ
ｇ、好ましくは１０〜２５０ｍｇ（または全量の０．０
１〜０．１％）の量で有効に配合され得る。

【００２１】本発明の肝保護剤は、第２の態様である医
薬組成物として医薬分野において常用される既知の他の
化合物、および経口投与に適した形態に成型するのに必
要な化合物を包含していてよく、例えば、乳糖、デンプ
ン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピ
ルメチルセルロース、カオリン、タルク、炭酸カルシウ
ムなどが挙げられる。

【００２２】本発明の肝保護剤を含有する医薬組成物
は、経口投与に適した形状（例えば、粉末、固形剤、液
剤）に成型されてよい。

【００２３】本発明の肝保護剤を含有する医薬組成物
は、有効成分として、前記リンデンの地上部粉砕物また
はそのアルコール系溶媒抽出エキスを、例えば成人の１
回の服用量につき、１００〜１,０００ｍｇ、好ましく
は２５０〜１,０００ｍｇの量で、または前記ティリロ
サイドを、成人の１回の服用量につき１〜５００ｍｇ、
好ましくは１０〜２５０ｍｇの量で含有し得る。本発明
の肝保護剤において、前記有効成分の含有量は、年齢等
により変化してよい。本発明の肝保護剤は、食事の際
に、１日３回程度服用するのが好ましい。

【００２４】さらに、本発明は、第３の態様として、有
効成分として前記リンデンの地上部粉砕物またはそのア
ルコール系溶媒抽出エキスまたは前記ティリロサイドか
ら成る肝保護剤を含有する食品も提供する。前記食品と
しては、例えば、タブレット、ドリンク、ガム、キャン
ディー、チュアブル、グミ、ゼリー等が挙げられる。本
発明の食品は、前記肝保護剤を、食品全重量に対し、溶
媒抽出エキスの場合、０．０５〜１０重量％の範囲の量
で、またティリロサイドの場合、０．０５〜１重量％の
範囲でそれぞれ含有し得る。

【００２５】

【実施例】以下の調製例および実施例により、本発明を
さらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定
されるものではない。以下の調製例１〜４では、先ず、
リンデン地上部の粉砕物からメタノール抽出エキスを調
製し、更にこの抽出エキスからフラボノイド配糖体ティ
リロサイド(tiliroside)を単離した。続く実施例１〜４
では、前記調製例で得られたメタノール抽出エキス、そ
の精製分画およびそれから単離されたティリロサイドの
肝保護作用をそれぞれ調べた。更に、実施例５および６
には、前記有効成分を含有する本発明の第２態様の医薬
組成物または第３態様の食品に関する具体的な製剤処方
例または配合例もそれぞれ示す。

【００２６】調製例１ ブルガリア産の乾燥リンデン（T. algenteaの花を含む
地上部）４ｋｇに、メタノール（５ｋｇ）を加えて、８
０℃で３時間加温抽出した。濾過後、残渣にメタノール
を加えて同様の操作２回繰り返し行い、得られた抽出液
を４５℃以下の温度において、減圧下（１８０ｍｍＨｇ
以下）、メタノールを留去することにより、メタノール
抽出エキス５７０ｇを得た。

【００２７】調製例２ 調製例１で得たメタノール抽出エキス５００ｇを、酢酸
エチル：水混合液[体積混合比＝１：１]を用いて分配し
た。次いで、酢酸エチル層を、４５℃以下の温度におい
て、減圧下（１８０ｍｍＨｇ以下）で酢酸エチルを完全
に留去させて、酢酸エチル系画分１４３．９ｇを得た。
分配後の水層は、等量のブタノールを加えて更なる分配
抽出を行ない、得られたブタノール層および水層につい
てそれぞれ４５℃以下の温度において、減圧下（１８０
ｍｍＨｇ以下）で各溶媒を完全に留去することにより、
ブタノール系画分１６１．３ｇおよび水系画分１９４．
８ｇをそれぞれ得た。

【００２８】調製例３ 調製例２で得た酢酸エチル系画分８０．６ｇをシリカゲ
ルカラムクロマトグラフィーに付して、１１のフラクシ
ョンに分離した。キャリヤーとして、ヘキサン／酢酸エ
チル混合溶媒（混合比を最初、１０：１とし、後に１：
１へ変える）、次いでクロロホルム／メタノール混合溶
媒（混合比を最初、５：１とし、後に１：１へ変える）
を用いた。

【００２９】調製例４ 前記調製例３で分離された１１のフラクションのうち、
活性物質含有フラクション＃９（収量＝１４．１ｇ）１
２．３ｇをさらにオクタデシルシリカゲル（ＯＤＳ）を
用いた逆相カラムクロマトグラフィーに付し、キャリヤ
ーとしてメタノール／水混合溶媒（混合比を最初、３：
７とし、次に１：１へ変えた後、更に７：１へ変える）
を用いて精製することにより、フラボノイド配糖体ティ
リロサイド（収量２７１．６ｍｇ）を単離した。単離さ
れたティリロサイドを、炭素１３（¹³Ｃ）および水素（
¹Ｈ）核磁気共鳴スペクトル、質量分析、旋光度、並び
に赤外線および紫外線吸収スペクトルによって定性分析
した。得られた各データを文献値と比較することにより
同定を行ない、ティリロサイドの化学構造を確認した。

【００３０】実施例１（in vivoでの肝保護作用試験） 調製例１および２で得られたリンデン地上部粉砕物のメ
タノール抽出エキス、および酢酸エチル系画分、ブタノ
ール系画分および水系画分（これらを以下、被験物質と
呼ぶ）についての肝保護作用を、Ｄ−ＧａｌＮ／ＬＰＳ
誘発マウスのinvivo肝障害モデルを用いて調べた。先
ず、前記メタノール抽出エキスの５．０％アラビアゴム
水性懸濁液サンプル（Ａ）、前記酢酸エチル系画分の
５．０％アラビアゴムの水性懸濁液サンプル（Ｂ）、ブ
タノール系画分の５．０％アラビアゴムの水性懸濁液サ
ンプル（Ｃ）および水系画分の５．０％アラビアゴムの
水性懸濁液サンプル（Ｄ）をそれぞれ調製した。約２０
時間絶食したｄｄＹ系雄性マウス（体重約２０ｇ）に、
上記各サンプルを１０ｍＬ／ｋｇの割合で経口投与し
た。各サンプルの投与量を以下にまとめる。

【００３１】サンプル（Ａ）：２５０、５００および
１,０００ｍｇ／ｋｇ体重 サンプル（Ｂ）：５００および１,０００ｍｇ／ｋｇ体
重 サンプル（Ｃ）：５００および１,０００ｍｇ／ｋｇ体
重 サンプル（Ｄ）：５００および１,０００ｍｇ／ｋｇ体
重

【００３２】対照群として、前記と同様の条件下のマウ
ス（体重約２０ｇ）に、上記サンプル（Ａ）〜（Ｄ）を
いずれも投与しない群を用意した。ただし、サンプル
（Ａ）に対する対照群としては８匹、およびサンプル
（Ｂ）〜（Ｄ）に対する対照群としては１０匹をそれぞ
れ用意した。

【００３３】前記サンプルをマウスに投与してから６０
分後に、Ｄ−ガラクトサミン（Ｄ−ＧａｌＮ、３５ｍｇ
／ｍＬ）およびリポポリサッカライド（ＬＰＳ、１μｇ
／ｍＬ）を含有する生理食塩水溶液を１０ｍＬ／ｋｇの
量で腹腔内投与し、更に１０時間後に眼窩静脈叢より採
血を行った。採取した血液を遠心分離に付し、血清を分
離して、血清中のグルタミン酸−オキサロ酢酸トランス
アミナーゼ活性（以下、ｓ−ＧＯＴと呼ぶ）および血清
中のグルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ活性
（以下、ｓ−ＧＰＴと呼ぶ）をそれぞれ、和光純薬社製
キット エス．ティーエーテストワコーを用いて試験し
た。結果を表１に示す。結果はいずれも、平均値と標準
誤差で表し、対照群との有意差検定にはDunnettの多重
比較検定を用いた。

【００３４】

【表１】 表１中、試験サンプル欄において（Ａ）は、調製例１で
得られたメタノール抽出エキスの５．０％アラビアゴム
の水性懸濁液サンプルを、（Ｂ）は、調製例２で得られ
た酢酸エチル系画分の５．０％アラビアゴムの水性懸濁
液サンプルを、（Ｃ）は、調製例２で得られたブタノー
ル系画分の５．０％アラビアゴムの水性懸濁液サンプル
を、および（Ｄ）は、調製例２で得られた水系画分の
５．０％アラビアゴムの水性懸濁液サンプルをそれぞれ
表し、また血清中トランスアミナーゼ活性の結果の末尾
の符号「^*」および「^**」は、Dunnettの多重比較検定で
検定した対照との有意差：ｐが０．０５および０．０１
未満であったことを表す。

【００３５】上記表１の結果より、本発明のリンデン地
上部粉砕物の抽出エキスおよびそれから調製された各溶
媒系画分がいずれも、優れたin vivoでの肝保護作用を
発現することがわかる。

【００３６】実施例２ 被験物質として、調製例１〜３で得られたメタノール抽
出エキス、酢酸エチル系画分、ブタノール系画分および
水系画分、および酢酸エチル系画分から得られたフラク
ション＃１〜＃１１をそれぞれ用い、それらのジメチル
スルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液をそれぞれ調製した。次
いで、以下の手順に従って、マウス由来肝細胞を用いた
Ｄ−ＧａｌＮ誘発肝細胞障害系により、上記各被験物質
についての肝細胞に対する直接的な保護作用を調べた。

【００３７】ｄｄＹ系雄性マウス（体重３０ｇ）をペン
トバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ、i.p.）麻酔下で開腹
し、３７℃に保温したLiver Perfusion Medium（GIBCO
BRL社製）を門脈より灌流して肝臓を脱血した。前記灌
流液を、Collagenase-Hepatocyte Qualified（GIBCO BR
L社製）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する、ｐＨ
７．５の灌流液（塩化ナトリウム：８ｇ／Ｌ、塩化カリ
ウム：０．４ｇ／Ｌ、塩化カルシウム・２水和物：０．
７４ｇ／Ｌ、リン酸２水素１ナトリウム・１水和物：７
８ｍｇ／ｍＬ、リン酸1水素２ナトリウム・１２水和
物：１５１ｇ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ２．３８ｇ／Ｌ、炭酸水
素ナトリウム：３５０ｍｇ／Ｌ、フェノールレッド：６
ｍｇ）と交換した後、さらに１０分間灌流した。この肝
臓を濾過して得られた肝実質細胞を実験に供した。前記
肝実質細胞を、１０％牛胎児血清を含むウイリアムズ培
地Ｅ（GIBCO BRL社製）に懸濁し、９６穴平底マイクロ
プレートに４×１０⁴細胞／１００μＬ／穴の割合で細
胞を播種した後、５％のニ酸化炭素存在下、３７℃にお
いて４時間培養した。その後、前記培地を、１ｍＭ Ｄ
−ＧａｌＮおよび前記被験物質（メタノール抽出エキ
ス、酢酸エチル系画分、ブタノール系画分および水系画
分、および酢酸エチル系画分から得られたフラクション
＃１〜＃１１）のＤＭＳＯ溶液をそれぞれ含有する培地
に変えた。ここで、前記被験物質のＤＭＳＯ溶液は、培
地中のＤＭＳＯ濃度が０．５％になるように添加した。
４４時間培養した後、０．５ｍｇ／ｍＬの3-(4,5-dimet
hyl-2-thiazolyl)2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromid
e（ＭＴＴ）を含有する培地と交換し、さらに４時間培
養した。培地を除去後、精製したホルマザンを０．０４
Ｎ塩酸含有−イソプロピルアルコール１００μＬ／穴で
溶解した後、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度
（測定波長５６２ｎｍ、参照波長６６０ｎｍ）を測定し
た。測定された吸光度を用い、以下の式に従って、肝細
胞の障害抑制率を算出した。

【００３８】

【数１】障害抑制率（％）＝[(Ｏ.Ｄ._Sample−Ｏ.Ｄ.
_Control)／(Ｏ.Ｄ._Normal−Ｏ.Ｄ._Control)]×１００ 式中、Ｏ.Ｄ._Normalは、被験物質を含まない培地（すな
わち、培地中に０．５％ＤＭＳＯのみを含むもの）で測
定される吸光度を示し、Ｏ.Ｄ._Controlは培地中に ０．
５％ＤＭＳＯおよび１ｍＭ Ｄ−ＧａｌＮを含有する場
合に測定される吸光度を、Ｏ.Ｄ._Sampleは培地中に被験
物質および１ｍＭ Ｄ−ＧａｌＮを含有する場合に測定
される吸光度を意味する。結果を以下の表２に示す。結
果はいずれも、平均値と標準誤差で表し、対照群との有
意差検定には、Dunnettの多重比較検定を用いた。

【００３９】

【表２】 上記表２中、障害抑制率の結果の末尾の符号「*」およ
び「**」は、Dunnettの多重比較検定で検定した対照と
の有意差：ｐが０．０５および０．０１未満であったこ
とを表す。

【００４０】上記表２の結果より、リンデン地上部粉砕
物からのメタノール溶媒抽出エキスおよびそれから分配
された酢酸エチル系画分が同程度の活性を示し、さらに
フラクション＃９と＃１０が、より強い肝保護作用を発
現することが分かる。

【００４１】実施例３ 被験物質として、調製例１〜４において得たメタノール
抽出エキス、酢酸エチル系画分、ブタノール系画分およ
び水系画分、前記酢酸エチル系画分から分配・精製され
たフラクション＃１〜＃１１、さらにはフラクション＃
９から単離されたティリロサイドを用いたこと、および
ｄｄＹ系雄性マウスをWistar系雄性ラット（体重１００
ｇ）に代えて、前記ラットから採取した肝細胞を用いた
こと以外は、実施例２と同様にして、各被験物質につい
ての肝細胞に対する直接的な保護作用を調べた。Wistar
系雄性ラット（体重１００ｇ）からの肝細胞の採取は、
実施例２と同様にして行なった。結果を表３に示す。

【００４２】

【表３】 上記表３中、障害抑制率の結果の末尾の符号「*」およ
び「**」は、Dunnettの多重比較検定で検定した対照と
の有意差：ｐが０．０５および０．０１未満であったこ
とを表す。

【００４３】上記表３の結果により、本発明のリンデン
地上部粉砕物のメタノール抽出エキスおよびそれから調
製される酢酸エチル系画分が肝保護作用を示し、更には
フラクション＃９および＃１０およびティリロサイド
が、酢酸エチル系画分よりも優れた肝保護作用を発現す
ることが分かる。

【００４４】実施例４ 被験物質として、調製例１〜３において得たメタノール
抽出エキス、酢酸エチル系画分、ブタノール系画分およ
び水系画分をそれぞれ用いて、それらのＤＭＳＯ溶液を
調製した。このＤＭＳＯ溶液を用いて、以下の手順で、
各被験物質についてのＬＰＳ誘発マウス腹腔由来マクロ
ファージからの一酸化窒素（ＮＯ）産生に対する抑制作
用を試験した。

【００４５】頚部脱臼致死させたｄｄＹ系雄性マウス
（体重３０ｇ）の腹腔内を、氷冷リン酸緩衝液（ＰＢ
Ｓ）１０ｍＬを用いて洗浄した。回収した洗液を遠心分
離に付して、腹腔滲出細胞を得た。ディフ・クイック染
色液（国際試薬社）を用いて、腹腔滲出細胞中のマクロ
ファージを染色し、同定した後、１０％ＦＣＳを含有す
るＲＰＭＩ1640培地 （GIBCO BRL社製）に懸濁した。得
られた懸濁液を９６穴マイクロプレートに、マクロファ
ージ数が５×１０⁵細胞／１００μＬ／穴になるように
播種し、５％二酸化炭素存在下において３７℃で１時間
培養した。培養後、各穴の内部をＰＢＳを用いて洗浄し
て、非付着性細胞を除去した。被験物質とＬＰＳ１０μ
ｇ／ｍＬを含む培地を加えて、２０時間培養を行った。

【００４６】２０時間後、産生された一酸化窒素（Ｎ
Ｏ）の量を測定した。ただし、培養により生成されたＮ
Ｏは、培地中で不安定であるため、代謝物であるＮＯ₂ ^-
量をグリース法にて測定した。すなわち、２０時間培養
した培養上清１００μＬに、グリース試薬（スルファニ
ルアミド：１ｇ／１００ｍＬ、N-1-ナフチルエチレンジ
アミン・２塩酸塩：０．１ｇ／１００ｍＬ、リン酸：
２．５ｇ／１００ｍＬ）１００μＬを加えて撹拌した
後、速やかに吸光度（測定波長５６２ｎｍ、参照波長６
６０ｎｍ）を測定した。標準液にはＮａＮＯ₂溶液を使
用し、絶対検量線法によりＮＯ₂ ^-量の定量を行った。本
実施例において、前記被験物質は、ＤＭＳＯに溶解した
後、培地中のＤＭＳＯ濃度が０．５％になるように添加
された。ＮＯの産生抑制率は、定量されたＮＯ₂ ^-量を用
い、以下の式に従って算出した。

【００４７】

【数２】ＮＯ産生抑制率（％）＝[(Conc._Control−Con
c._Sample）／（Conc._Control−Conc._Normal)]×１００ 式中、Conc._Normalは、被験物質を含まない培地（すな
わち、培地中に０．５％ＤＭＳＯのみを含むもの）で測
定されるＮＯ₂ ^-濃度を、Conc._Controlは、培地中に０．
５％ＤＭＳＯおよび１０μｇ／ｍＬ ＬＰＳを含有する
場合に測定されるＮＯ₂ ^-濃度を、およびConc.
_Sampleは、培地中に被験物質および１０μｇ／ｍＬ Ｌ
ＰＳを含有する場合に測定されるＮＯ₂ ^-濃度をそれぞれ
表す。結果を表４に示す。結果はいずれも、平均値と標
準誤差で表し、対照群との有意差検定には、Dunnettの
多重比較検定を用いた。

【００４８】

【表４】 上記表４中、ＮＯ産生抑制率の結果の末尾の符号「**」
は、Dunnettの多重比較検定で検定した対照との有意
差：ｐが０．０１未満であったことを表す。

【００４９】上記表４の結果により、本発明のリンデン
地上部粉砕物のメタノール抽出エキスおよびそれから分
配された酢酸エチル系画分およびブタノール系画分がい
ずれも、水系画分に比べて、マクロファージの活性化を
より抑制し、それによってＮＯの産生をも抑制し得るこ
とが分かる。

【００５０】以下の実施例５および６には、本発明の第
２態様の医薬組成物としてのチュアブル錠および第３態
様の食品としてのドリンク剤の製剤処方例および製造例
をそれぞれ示しているが、これらは例示であって、本発
明は特にこれらに制限されるものではない。実施例５（チュアブル錠の製造） 〔処方〕 組 成 配合量 調製例４のティリロサイドのブドウ糖１０倍散 10.0重量部 マルトシルシクロデキストリン 14.0重量部 コーンスターチ 11.0重量部 ブドウ糖 38.0重量部 ゼラチン 5.0重量部 香料 0.2重量部 ハッカ 3.8重量部 タイム 2.0重量部 無水リン酸水素カルシウム 15.0重量部ショ糖脂肪酸エステル 1.0重量部 合 計 100.0重量部

【００５１】〔製法〕上記組成において、香料、ハッ
カ、タイムおよびショ糖脂肪酸エステル以外の全材料
を、ミルでよく混合した後、蒸留水を加えて、成型する
のに適当な粘度まで練合する。ここに、ハッカ、タイム
およびショ糖脂肪酸エステルを加えて、さらに練合した
後、最後に香料を加え、押し出し造粒法により顆粒を作
製した。得れた顆粒を４０℃で乾燥した後、打錠機を用
いて、本発明の肝保護剤含有チュアブル錠を得た。

【００５２】実施例６（ドリンク剤の製造） 〔処方〕 組 成 配合量 実施例１の70％エタノール抽出物 2.0ｇ 乳酸カルシウム・５水和物 46.1ｇ ＤＬ−酒石酸ナトリウム 10.0ｍｇ コハク酸 1.0ｍＬ 液糖 80.0ｇ クエン酸 1.2ｇ ビタミンＣ 1.0ｇ 香料 1.0ｍＬ 塩化カリウム 0.1ｇ硫酸マグネシウム 50.0ｍｇ

【００５３】〔製法〕前記組成を全て蒸留水８００ｍＬ
に溶解し、さらに蒸留水を加えて全量１０００ｍＬとし
た。次に、溶液を０．２２μｍの除菌フィルターを用い
て滅菌した後、１００ｍＬずつ褐色びんに無菌充填する
ことにより、実施例１のエタノール抽出物を１剤あたり
２００ｍｇ含有するドリンク剤を製造した。

【００５４】

【発明の効果】本発明の肝保護剤は、毎日摂取すること
により、ウイルスおよび有害な薬物や毒物に起因する免
疫担当細胞の活性化による肝障害を予防したり、あるい
は肝障害が発症した場合には、その症状を緩和すること
ができる。本発明の肝保護剤は、シナノキ科Tilia属の
植物であるリンデンという天然起源物質、その溶媒抽出
物およびそれから単離精製される天然起源物質由来成分
ティリロサイドを有効成分として含有することから、現
在入手可能な医薬品としての肝保護剤に比べて、副作用
が少なく、人体により安全である。本発明の前記肝保護
剤を、医薬組成物または食品に含有させることにより、
日常において、より簡易に経口摂取できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 二宮 清文 大阪府大阪市中央区玉造１丁目１番30号 森下仁丹株式会社内 (72)発明者 植村 俊昭 大阪府大阪市中央区玉造１丁目１番30号 森下仁丹株式会社内 (72)発明者 吉川 雅之 大阪府箕面市粟生新家３−18−９ Ｆターム(参考） 4B018 LB08 LB10 LE01 LE02 LE05 MD15 MD42 ME14 MF01 MF02 MF08 MF10 4C057 BB02 DD03 KK08 4C086 AA01 AA02 EA11 GA02 GA17 NA14 ZA75 ZB11 4C088 AB12 AC02 BA14 CA01 CA06 NA14 ZA75 ZB11

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 シナノキ科Tilia属の植物リンデンの地
   上部の粉砕物を含有する肝保護剤。
2. 【請求項２】 リンデンの溶媒抽出エキスを含有する請
   求項１記載の肝保護剤。
3. 【請求項３】 リンデンの有効成分のひとつである式： 【化１】 で表されるフラボノイド配糖体ティリロサイドを含有す
   る請求項１記載の肝保護剤。
4. 【請求項４】 溶媒抽出エキスがアルコール系溶媒を用
   いて調製される請求項２記載の肝保護剤。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載の肝保護
   剤を含有する医薬組成物。
6. 【請求項６】 請求項１〜４のいずれかに記載の肝保護
   剤を含有する食品。