CN108047293A

CN108047293A - 一种治疗肝损伤的结香苷c药物的制备方法

Info

Publication number: CN108047293A
Application number: CN201711414678.4A
Authority: CN
Inventors: 李敏; 南彩云; 钟国跃; 朱继孝; 杨雯; 李辉虎
Original assignee: Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2017-12-25
Filing date: 2017-12-25
Publication date: 2018-05-18

Abstract

本发明公开了一种治疗肝损伤的结香苷C药物的制备方法，包括如下步骤：对滇结香花60%乙醇提取部位进行分离，得到5种宏量化合物西瑞香素、水杨酸、结香苷C、银锻苷、紫云英苷。本发明对四氯化碳引起的小鼠肝损伤具有较好的保护作用，通过调节小鼠的免疫功能，增强肝脏抗氧化能力、减少脂质过氧化物生成发挥作用，达到缓解、治疗小鼠肝损伤的效果，为开发一种新的治疗肝损伤药物，提供了实验依据。

Description

一种治疗肝损伤的结香苷C药物的制备方法

技术领域

本发明涉及一种制备方法，具体是一种治疗肝损伤的结香苷C药物的制备方法。

背景技术

肝纤维化是由肝炎病毒、酒精、药物与毒物、血吸虫、代谢和遗传、胆汁淤积、自身免疫性肝病等多种损伤因素长期慢性刺激肝脏所引发的肝脏弥漫性损伤。肝纤维化见于大多数不同病因的慢性肝脏疾病中，目前我国肝病的病因仍以乙肝病毒感染为主。持续的肝纤维化会引发多种肝脏病变晚期并发症，如门静脉高压、脑病、合成机能障碍和代谢功能受损等，并最终导致不可逆转的肝硬化和肝癌的形成。前瞻性研究表明，慢性乙型肝炎发展为肝硬化的估计年发生率为2.1%；另一项对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者进行平均9年（1～18.4年）的随访研究表明，进展为肝硬化的发生率为23%。因此抗肝纤维化是慢性乙型肝炎等慢性肝病的重要治疗措施。

根据《慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）》，“最大限度地长期抑制HBV，减轻肝细胞炎症坏死及肝纤维化，延缓和减少肝脏失代偿、肝硬化、原发性肝细胞癌及其并发症的发生，从而改善生活质量和延长存活时间”是慢性乙型肝炎治疗的总体目标。《肝纤维化中西医结合诊疗指南》指出，肝纤维化是可逆的，部分药物可促进肝纤维化逆转，尤其是中医药具有较好的综合疗效。抗肝纤维化治疗的近期目标在于抑制肝纤维化进一步发展。

针对以HSC激活为核心的纤维化形成，已探索了一些抗肝纤维化的途径，如下调HSC活化，抑制HSC增殖、收缩、促炎效应及纤维形成，刺激HSC凋亡，调节MMP及其抑制物的平衡以促进ECM降解等。但目前对于防治肝纤维化的重点研究尚处于基础研究水平，缺乏确切有效的临床药物干预肝纤维化。目前，国际上尚乏突破性临床研究报道。国内研究表明，中医药确有抗肝纤维化的独特优势。中医认为，肝纤维化的基本证候病机为正虚血瘀。正虚主要表现为气阴两虚，血瘀则主要表现为瘀血阻络。其基本证型为气阴虚损、瘀血阻络，因此基本治法为益气养阴、活血化瘀。单味中药对肝纤维化的防治作用报道较多的主要有丹参、黄芪、白术、柴胡、当归、芍药、鳖甲、苦参、莪术、银杏叶、三七、汉防己、川穹、桃仁、冬虫夏草、红花、百合、穿山甲、葛根等，多为补虚药和活血化瘀药，很多中药抑制肝纤维结缔组织的增生或促进吸收新生的肝内纤维，为防止肝纤维化的发生发展发挥作用。随着对中药成分的深入研究，中药提取物治疗肝纤维化也成为研究热点，经报道，贝母辛、柴胡皂苷、大黄素、姜黄素、苦参素、丹参素、甘草酸、粉防己碱、甘草甜素、苦参碱及氧化苦参碱、丹参单体IH764-3、丹酚酸B、牛磺酸、川芎嗪、黄颜木素、三七总皂苷、虫草多糖、鳖甲水提物、银杏叶提取物、水飞蓟素、三七总皂甙、排钱草总生物碱、灯盏细辛黄酮、田基黄苷等中药有效成分均具有一定的抑制或延缓肝纤维化作用，其中许多已制成制剂应用于临床。众多研究表明，在肝纤维化的治疗中，中药复方能有效改善患者症状、体征及肝功能，降低肝纤维化血清学指标，具有较好的保肝、抗纤维化作用。在治疗肝纤维化的中医经典方剂中，常用的有柴胡疏肝散、茵陈蒿汤、甘露消毒丹、一贯煎、小柴胡汤等。目前临床常用的中成药有复方鳖甲软肝片、扶正化瘀胶囊、安络化纤丸、大黄蛰虫丸、和络舒肝片等，复方鳖甲软肝片和扶正化瘀胶囊临床应用较多。

现有治疗肝病的中药组合物大多效果不明显，有的也会有一定的治疗效果，但大多数中草药组方存在安全可靠较差的问题，有的还有较大毒副作用。因此如何克服现有技术的不足，是目前涂料技术领域亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗肝损伤的结香苷C药物的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种治疗肝损伤的结香苷C药物的制备方法，包括如下步骤：对滇结香花60%乙醇提取部位进行分离，得到5种宏量化合物西瑞香素、水杨酸、结香苷C、银锻苷、紫云英苷。

作为本发明再进一步的方案：所述分离为化学成分分离。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明对四氯化碳引起的小鼠肝损伤具有较好的保护作用，通过调节小鼠的免疫功能，增强肝脏抗氧化能力、减少脂质过氧化物生成发挥作用，达到缓解、治疗小鼠肝损伤的效果，为开发一种新的治疗肝损伤药物，提供了实验依据。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中，一种治疗肝损伤的结香苷C药物的制备方法，包括如下步骤：对滇结香花60%乙醇提取部位进行化学成分分离，得到5种宏量化合物西瑞香素、水杨酸、结香苷C、银锻苷、紫云英苷。

下面用实验说明本发明药物的作用。

1.实验材料

1.1主要药品和试剂联苯双酯滴丸，购自浙江万邦药业股份有限公司，批号：A02151219西瑞香素、水杨酸标准品，购自南京道斯夫生物科技有限公司；紫云英苷标准品，购自成都德斯特生物技术有限公司；结香苷C、银锻苷均为实验室自制，纯度达98%；谷丙转氨酶（ALT，批号：20170614）、谷草转氨酶（AST，批号：20170614）、丙二醛（MDA，批号：20170607）、超氧化物岐化酶（SOD，批号：20170612）测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；动物组织总RNA提取试剂盒、D2000DNAMarker(天根生化科技有限公司)；反转录试剂盒（批号：0000228426）、GelRed^TM1000×inwater（Promega公司）；TapPCRGreenMix（北京鼎国生化有限公司）；TNF-α、IL-6、内参GAPDH引物，均由北京鼎国生化有限公司合成。

1.2实验仪器：高速冷冻离心机，购自美国Beckman-Coulter公司；超低温冰箱，购自美国Thermo公司；电热恒温水温箱，购自上海博迅实业有限公司；电子分析天平，购自北京赛多利斯仪器系统有限公司；紫外分光光度计UV-1800，（苏）制（05000111）号；DY89-II电动匀浆机，购自宁波新芝生物科技股份有限公司；MultiskanGO全波长酶标仪，购自美国Thermo公司；凝胶成像仪，购自美国BIO-RAD公司TKY-BMB型石蜡包埋机，购自湖北省泰康医疗设备有限公司；包埋专用冷台，购自湖北省泰康医疗设备有限公司；半自动轮转式切片机LeicaRM2245，购自北京长恒荣创科技有限公司；XI15正置显微镜，购自日本奥林巴斯有限公司；凝胶成像仪，购自美国BIO-RAD公司。

1.3实验动物130只昆明种成年雄性小鼠，等级SPF级，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2016-0002。实验室期间温度（24±2）℃，相对湿度（50±2）%。

2.实验方法

2.1小鼠分组及给药130只小鼠（雄性，20-30g）随机分成13组，每组10只。分别为空白对照组、模型组、联苯双酯组（阳性对照组）、紫云英苷低、高剂量组（ZL、ZH），西瑞香素低、高剂量组（XL、XH），结香苷C低、高剂量组（JL、JH），水杨酸低、高剂量组（SL、SH），银锻苷低、高剂量组（YL、YH）。参考文献并结合预实验确定各个给药组低、高剂量组给药剂量为50mg/kg、100mg/kg，联苯双酯组的剂量为150mg/kg。各个给药组分别混悬于0.5%的羧甲基纤维素钠溶液中，连续给药7天,空白对照组和模型组给予相应体积的生理盐水，第6天给药1h后，造模。

2.2模型建立以四氯化碳诱导小鼠急性肝损伤造模。第六天给药1h后，腹腔注射0.2%四氯化碳花生油溶液10ml/kg。空白对照组给予相应体积的花生油。造模后，禁食不禁水，16h后给药1次，1h后眼眶取血，全血5000r·min⁻¹离心5min，取血清置于4℃冰箱备用。小鼠断颈脱臼处死，并于冰台快速分离相同部位肝脏组织2份，其中一份10%甲醛固定，另一份取出后置于﹣70℃冰箱备用。

2.3生化指标的测定将离心后的血清取出，用酶标仪按试剂盒测定ALT、AST等指标。取相同部位的肝脏组织0.1g，制备成10%的肝组织匀浆，5000r·min⁻¹离心5min取上清液，采用测试盒分别测定SOD、MDA的含量。

2.4肝组织病理学检测取固定好的肝脏大叶，常规石蜡包埋、切片、HE染色，并于光镜下观察拍照。

2.5肝组织TNF-α、IL-6的mRNA表达的影响每组取15mg肝组织样品，共13组，按照RNA动物组织提取试剂盒说明书提取肝组织总RNA，1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA纯度。取4μL总RNA，进行反转录，合成cRNA。所用引物序列信息见表1。PCR反应体系总体积为50μL，GAPDH基因PCR扩增条件为94℃预变性3min、94℃变性30S、56℃退火30S、72℃延伸1min、循环28次、72℃终止10min；TNF-α基因PCR扩增条件为94℃预变性3min、94℃变性45S、60℃退火45S、72℃延伸1min、循环34次、72℃终止10min；IL-6基因PCR扩增条件为94℃预变性3min、94℃变性45S、60℃退火30S、72℃延伸1min、循环35次、72℃终止7min；PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳及BiotiumGelRed染液染色，凝胶影像分析仪分析，以GAPDH为内参对照，目的mRNA与GAPDH的RT-PCR产物的吸光度值比值作为目的mRNA相对表达量。

表1.PCR引物序列信息

Table1. InformationofPCRprimers

引物名称	正向序列	反向序列
			GAPDH	5’-GAGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’	5’-CATCACCATCTTCCAGGAGCG-3’
TNF-α	5’-GGCAGGTCTACTTTGGAGTCATTGC-3’	5’-ACATTCGAGGCTCCAGTGAATTCGG-3’
			IL-6	5’-TGGAGTCACAGAAGGAGTGGCTAAG-3’	5’-TCTGACCACAGTGAGGAATGTCCAC-3’

2.6数据处理统计学处理使用prism.6软件，one-wayANOVA检验，数据结果用均数±标准差（±s）表示。组间比较方法，t检验法，P＜0.05为具有统计学意义。

3.实验结果与分析

3.1对四氯化碳肝损伤小鼠肝组织匀浆SOD、MDA活性的影响及小鼠血清ALT、AST水平的影响与空白对照组相比较，小鼠肝组织匀浆中SOD含量明显降低，MDA含量显著上升，小鼠血清中ALT、AST水平显著增高，差异均有统计学意义（P＜0.01），表明造模成功。与模型组相比较，在小鼠肝组织匀浆中，各给药组SOD含量明显升高，MDA含量显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）；纵向比较血清中生化指标，ZH、SH、JL、JH、XH、YH各给药组ALT水平均有显著降低，差异具有显著性（P＜0.01，P＜0.05），ZL、SL、XL、YL给药组ALT水平虽有所降低，但无显著性差异（P＞0.05），ZH、SH、JL、JH、XL、XH、YH各给药组的AST含量显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05），ZL、SL、YL给药组AST含量虽有所降低，但差异不具有统计学意义（P＞0.05）。见表2

表2.不同单体化合物对CCl₄致肝损伤小鼠肝匀浆SOD、MDA活性的影响

和对小鼠血清ALT、AST水平的影响

Table2.effectsofdifferentcompoundson theactivityofSOD、MDAandthelevelsofserumALT,AST oncarbontetrachloride-inducedliverinjuryinmice

注：^※与正常组比较，^※ P＜0.05,^※※ P＜0.01；^△与模型组比较，^△ P＜0.05，^△△ P＜0.01。

3.2肝脏组织病理学变化观察正常组肝小叶结构完整，肝细胞索排列整齐，肝细胞间连接紧密，肝细胞呈现正常状态；模型组肝细胞泡样水肿，肝细胞弥漫性变性，肝窦变窄，有大量的炎性细胞浸润，甚至出现细胞坏死；阳性对照组肝细胞与模型组相比较，细胞状况明显改善，少量炎性细胞浸润；ZH、SH、JL、JH、XH、YH各给药组肝细胞结构有明显改善,肝细胞脂肪变性显著减轻,炎性细胞浸润、坏死程度明显减轻，受损面积明显变小；ZL、SL、XL、YL给药组肝细胞肝索排列紊乱，肝小叶任见大量肝细胞坏死,细胞膜溶解消失或碎裂，细胞核有明显聚集现象，与模型组对比，无明显改善。

3.3肝组织TNF-α、IL-6的mRNA表达的影响从TNF-α/GAPDH、IL-6/GAPDH的比值可以看出，CCl₄引起的小鼠急性肝损伤使TNF-α、IL-6mRNA的表达明显增加，具有统计学意义，亦能表明实验造模成功。各不同单体化合物及不同给药剂量组，对TNF-α、IL-6mRNA的表达结果显示：除ZL给药组外，其他给药组均可显著抑制TNF-αmRNA的表达，而且JL、JH、ZH组的抑制作用与阳性对照组作用相当；不同给药组对于除YL、ZL、XL组外，其他给药组均具有显著抑制IL-6mRNA的表达的作用，且JL、JH、ZH、XH给药组与阳性对照组比较无显著性差异。

CCl₄是经典的诱导肝损伤动物模型的化学物质，该动物模型具有指标明确、重复性好等优点。其诱导机制主要为当肝脏受到损伤时，肝细胞内酶大量释放到血液中，导致血内ALT、AST等酶含量明显升高，因此，血清中ALT、AST的含量高低在一定程度上反映出肝细胞损伤程度；CCl₄进入体内经肝微粒体细胞色素P₄₅₀代谢，生成自由基，可与肝细胞膜磷脂分子引起脂质过氧化作用，并形成脂质过氧化物丙二醛（MDA），SOD作为机体内天然存在的超氧自由基清除因子之一，可有效清除由CCl₄作用产生的自由基，MDA、SOD的含量高低可有效反应肝细胞的修复程度。根据本课题组前期研究，采用CCl₄肝损伤经典模型，试剂盒测定血清中ALT、AST含量及肝匀浆中MDA、SOD的含量，实验结果表明，与模型组比较，ZH、SH、JL、JH、XH组，血清中ALT、AST水平明显降低，结合各个给药组组病理切片，说明该五组给药组能增强肝细胞抗损伤能力，增加膜结构的稳定性，对肝脏有一定的保护作用，肝组织中MDA含量降低、SOD含量升高，提示该五组实验组具有增强肝脏抗氧化能力、减少脂质过氧化物生成的作用。

本发明还从TNF-αmRNA的表达水平和炎症因子IL-6mRNA的表达水平上探究滇结香花中有效部位中5种化学成分的肝保护作用及其作用机制。TNF-α是一种主要由单核巨噬细胞分泌的具有多种生物活性的多肽调节因子。CCl₄可激活枯否氏细胞产生TNF-α等促炎细胞因子，这些炎性介质的释放可活化中性粒细胞，通过自分泌或旁分泌作用激活免疫细胞和炎性反应信号通道，诱导其他炎性因子如IL-6、IL-1的表达，进一步产生氧自由基，加重炎性反应。IL-6是白介素家族的新成员，由巨噬细胞、单核细胞及淋巴细胞等炎症细胞产生的促炎症细胞因子，可使T,B细胞及NK细胞广泛激活，诱导其他炎性介质的产生，从而加剧和促进局部炎症的形成。实验结果显示，CCl₄能明显促进TNF-αmRNA和IL-6mRNA的表达(P<0.05)，结合组织病理切片及血清、血浆指标，与模型组实验小鼠比较，可知ZH、SH、JL、JH、XH、YH给药组可有效抑制TNF-α和IL-6的表达，且JL、JH、YH给药组下调TNF-αmRNA和IL-6mRNA的表达作用，与阳性对照组相比较，无显著性差异，表明有效给药组可能通过调节机体的免疫功能来治疗CCl₄引起的小鼠肝损伤。

综上，ZH、SH、JL、JH、XH、YH给药组通过降低肝匀浆中MDA的含量，提高SOD的生物活性；升高血清中ALT、AST的含量，以及抑制肝组织中TNF-α和IL-6mRNA的表达，可能是通过调节小鼠的免疫功能，增强肝脏抗氧化能力、减少脂质过氧化物生成的作用，从而达到缓解、治疗小鼠肝损伤的效果。实验数据及病理切片显示，结香苷C（JL、JH）给药组与阳性对照组实验效果相近，效果最佳，可能为主要有效成分，此研究为开发一种新的治疗肝损伤药物，提供了实验依据。

综上所述，60%乙醇提取部位对四氯化碳致急性肝损伤小鼠具有较好的保肝作用，尤其是降ALT、AST作用要优于阳性对照联苯双酯组；本次实验中所考察的单体药物均来自于该部位，结果显示ZH、SH、JL、JH、XH、YH给药组均具有良好的保肝作用。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims

1.一种治疗肝损伤的结香苷C药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：对滇结香花60%乙醇提取部位进行分离，得到5种宏量化合物西瑞香素、水杨酸、结香苷C、银锻苷、紫云英苷。

2.根据权利要求1所述的治疗肝损伤的结香苷C药物的制备方法，其特征在于，所述分离为化学成分分离。