KR102203501B1 - 홍삼, 대추 및 길경의 혼합 추출물을 포함하는 항염증 및 면역증진용 조성물 - Google Patents
홍삼, 대추 및 길경의 혼합 추출물을 포함하는 항염증 및 면역증진용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 홍삼, 대추 및 길경의 혼합 추출물을 포함하는 항염증 및 면역증진용 조성물에 관한 것으로, 염증성 인자의 발현 저해 효과가 우수하고, 면역세포의 활성 조절 효과가 우수하므로, 항염증 및 면역증진 용도로 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 홍삼, 대추 및 길경의 혼합 추출물을 포함하는 항염증 및 면역증진용 조성물에 관한 것이다.
염증(inflammation)이란 어떤 자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나로, 조직 변질, 순환장애와 삼출 및 조직 증식을 병발하는 복잡한 병변을 말하며, 다양한 화학적 매개체가 염증의 발현 기전에 관여하고 있고, 그 병인 역시 매우 복잡하다. 이러한 염증은 미세혈관이 천공되고, 혈액 성분이 틈새 공간으로 누출되며, 백혈구가 염증 조직으로 이동하는 것을 특징으로 하며, 통상적으로, 홍반, 부종, 통각과민(hyperalgesia), 통증 등의 임상적 증상들을 동반한다.
염증의 발생 원인으로 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있는데, 특히, 산화질소(nitric oxide, NO)를 발생시키는 효소인 일산화질소 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)와 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생합성에 관련된 효소들이 염증 반응을 매개하는데 있어 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다. TNF-α와 같은 사이토카인(cytokine)은 병변에서 그 발현 정도가 증가되는데, TNF-α가 인간의 염증성 피부 질환과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, TNF-α의 발현을 저해시키거나, COX-2 활성저해에 기인하는 프로스타글란딘 PGE2(Prostaglandin E2)의 생성 억제를 통해 초기 염증성 분자(proinflammatory molecule)의 증가를 수반하는 병변 과정을 조절할 수 있다.
다만, 현재 사용되는 비스테로이드성 항염증 약물(nonsteroidal antiinflammatory drug, NSAID) 등은 호흡촉진현상, 순환계 붕괴, 상복부 통증, 구토, 위장출혈, 간 손상 및 혈소판 저해 등의 부작용을 나타내기 때문에, 장기적으로 사용하기가 곤란하므로, 부작용에 대한 우려가 없는 인체에 안전한 항염제의 필요성이 대두되고 있다.
한편, 면역반응이란 숙주 내에 존재하는 자기방어체계로서, 외부로부터 침입해오는 각종 물질이나 생명체를 자기자신과 구별하여 제거하는 생물학적 현상이다. 이러한 자기방어를 위한 감시체계는 크게 두 가지 기작에 의해 이루어지는데 하나는 체액성 면역이고, 다른 하나는 세포성 면역이다. 면역증진이란 이러한 숙주의 특이 또는 비특이, 세포성 및 체액성 면역반응을 상승시키는 모든 작용을 말하며, 최근에 감염이나 종양 등의 치료에 면역증강이 이용되면서 많은 관심을 불러일으키고 있다.
즉, 면역억제 상태를 개선하고 면역활성을 증강시킴으로써, 다양한 질환의 치료에 적용이 가능하다. 다만, 현재까지 알려진 면역증강 물질은 그 자체의 독성, 면역반응의 차이 등 여러 가지 부작용으로 인하여, 현재 인간에게 사용할 수 있는 물질은 극히 제한된 실정이고, 그 효능도 매우 미미한 것으로 알려져 있다. 따라서, 부작용이 없으면서 유용한 면역 증강효과를 나타내는 천연물질의 개발의 필요성이 대두되고 있으나, 이에 대한 연구는 아직 미비한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 천연물을 이용한 항염제 및 면역증강제를 개발하기 위한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 홍삼, 대추 및 길경의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 및 면역증진용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 홍삼, 대추 및 길경의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 및 면역증진용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 홍삼, 대추 및 길경의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 및 면역증진용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 홍삼, 대추 및 길경 혼합 추출물은 동물모델에서 과도한 염증반응에 의하여 증가된 백혈구 및 림프구에 대한 감소효과, 및 호중구의 증가 효과 등 면역세포의 활성 조절 효과를 나타내고, 또한, 동물 혈액 내 염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6, TNF-α, 프로스타글란딘 E2의 수준을 효과적으로 감소시키므로, 항염증 및 면역증진 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 홍삼(red ginseng)은 인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)을 원재료로 사용한 것으로, 말리지 않은 인삼을 증기 또는 기타 방법으로 쪄서 익혀 말린 것일 수 있다. 대추(jujube)는 대추나무 Zizyphus jujuba Miller var. inermis Rehder 또는 보은대추나무 Zizyphus jujuba Miller var. hoonensis T. B. Lee(갈매나무과 Rhamnaceae)의 잘 익은 열매일 수 있다. 길경은 초롱꽃과의 도라지(Platycodon grandiflorum A. De Candolle)의 뿌리 또는 주피를 제거하여 만든 약재일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "면역증진"은 특이 또는 비특이, 세포성 및 체액성 면역반응을 상승시키는 모든 작용을 말하며, 구체적으로, 면역세포의 활성 조설 작용, 예를 들어, 백혈구 및 림프구의 감소 및 호중구의 증가인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 혼합 추출물은 증류수, C1 내지 C4의 저급 알코올, 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 아세톤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 용매로 추출될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물에 포함되는 추출물은 하기와 같이 수득될 수 있다. 홍삼, 대추 및 길경을 물로 세척하여 이물질을 제거한 후 그늘에서 건조하고, 홍삼, 대추 및 길경에 적당한 양의 용매를 첨가하여 완전히 침지되도록 하며, 이때, 홍삼, 대추 및 길경은 건조된 상태 그대로 사용하거나 분쇄하여 분말 형태로 사용할 수 있다. 홍삼, 대추 및 길경은 통상의 추출용매를 이용하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는, (a) 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예: 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), (b) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (c) 아세톤, (d) 에틸 아세테이트, (e) 클로로포름, (f) 1,3-부틸렌글리콜, (g) 헥산, (h) 디에틸에테르, (i) 부틸아세테이트 (j) 클로로포름-메탄올 또는 (k) 증류수를 이용하여 추출할 수 있고, 바람직하게는 증류수로 추출할 수 있다. 추출시 실온에서 함침하거나 가온할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 약제의 제조에 통상적으로 이용되는 것으로써, 락토오스, 덱스트로스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(22th ed., 2013)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 항염증 및 면역증진 활성을 나타내는 물질과 함께 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 항염증 및 면역증진을 위하여 단독으로, 또는 시술, 호르몬 치료, 약물치료 및/또는 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종 기제 및/또는 첨가물을 포함할 수 있으며, 그 효과를 떨어트리지 않는 범위 내에서 비이온 계면활성제, 실리콘 폴리머, 체질안료, 향료, 방부제, 살균제, 산화 안정화제, 유기 용매, 이온성 또는 비이온성 증점제, 유연화제, 산화방지제, 자유 라디칼 파괴제, 불투명화제, 안정화제, 에몰리언트(emollient), 실리콘, α-히드록시산, 소포제, 보습제, 비타민, 곤충 기피제, 향료, 보존제, 계면활성제, 소염제, 물질 P 길항제, 충전제, 중합체, 추진제, 염기성화 또는 산성화제, 또는 착색제 등 공지의 화합물을 더 포함하여 제조될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001~1000㎎/kg일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여 시 다양한 제형으로 투여될 수 있는데, 환제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 등의 고형제제 형태로 투여될 수 있으며, 여러 가지 부형제, 예를 들어, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 조성물을 분말, 과립, 정제 또는 캅셀 형태로 제형화 할 경우, 이의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 예를 들어, 락토오스, 덱스트로스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 인산칼슘, 규산칼슘, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및/또는 광물유가 사용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한, 제제화에 일반적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 포함하여 조제될 수 있으며, 상기 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트 또는 탈크 같은 윤활제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 홍삼, 상기 대추 및 상기 길경의 중량비는 3:4:3일 수 있다.
본 발명의 조성물에 유효성분으로 포함되는 홍삼, 대추 및 길경의 혼합 추출물은, 홍삼, 대추 및 길경이 3:4:3의 중량비로 혼합되어 추출될 경우, 항염증 및 면역증진 활성이 가장 우수하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 하루 총 용량 200 내지 400㎎/㎏으로 경구 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 하루 총 용량 200 내지 400㎎/㎏으로 경구 투여될 경우, 항염증 및 면역증진 활성이 가장 우수하다.
본 발명의 다른 양상은 홍삼, 대추 및 길경의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 및 면역증진용 식품 조성물을 제공한다.
전술한 내용과 중복되는 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로써 홍삼, 대추 및 길경의 혼합 추출물 외에, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함할 수 있다. 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어, 말토오스, 수크로오스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 향미제로서 천연 향미제[타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)] 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 홍삼, 대추 및 길경의 혼합 추출물 외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액 및/또는 감초 추출액 등이 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 식품 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 혼합 추출물은 증류수로 추출될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 홍삼, 상기 대추 및 상기 길경의 중량비는 3:4:3일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 하루 총 용량 200 내지 400㎎/㎏으로 경구 투여될 수 있다.
홍삼, 대추 및 길경의 혼합 추출물을 포함하는 항염증 및 면역증진용 조성물에 따르면, 염증성 인자의 발현 저해 효과가 우수하고, 면역세포의 활성 조절 효과가 우수하므로, 항염증 및 면역증진 용도로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 홍삼 추출물(RGE) 또는 홍삼 복합 추출물(RGME)로 처리된 RAW264.7 세포의 세포생존율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 3은 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 ABTS 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 4는 활성산소 생성량에 미치는 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 영향을 나타낸 그래프이다. 홍삼 복합 추출물은 100, 200㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는(*: p＜0.05, **: p＜0.01, ***: p＜0.001) 활성산소 생성량 감소 활성을 나타낸다.
도 5는 산화질소 생성량에 미치는 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 영향을 나타낸 그래프이다. 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물은 모든 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는(***: p＜0.001) 산화질소 생성량 감소 활성을 나타낸다.
도 6은 IL-1β 수준에 미치는 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 영향을 나타낸 그래프이다. 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물은 100, 200㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는(**: p＜0.01, ***: p＜0.001) IL-1β 수준 감소 활성을 나타낸다.
도 7은 IL-6 수준에 미치는 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 영향을 나타낸 그래프이다. 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물은 200㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는(*: p＜0.05, **: p＜0.01) IL-6 수준 감소 활성을 나타낸다.
도 8은 TNF-α 수준에 미치는 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 영향을 나타낸 그래프이다. 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물은 모든 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는(*: p＜0.05, **: p＜0.01, ***: p＜0.001) TNF-α 수준 감소 활성을 나타낸다.
도 9는 LPS-유도 염증 마우스 모델에서, 혈중 백혈구 수준에 대한 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 영향을 나타낸 그래프이다. RGE 200 그룹을 제외한 모든 그룹은 대조군에 비해 유의성 있는(*: p＜0.05, **: p＜0.01) 백혈구 수준 감소 활성을 나타낸다.
도 10는 LPS-유도 염증 마우스 모델에서, 혈중 림프구 수준에 대한 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 영향을 나타낸 그래프이다. 모든 그룹은 대조군에 비해 유의성 있는(**: p＜0.01, ***: p＜0.001) 림프구 수준 감소 활성을 나타낸다.
도 11은 LPS-유도 염증 마우스 모델에서, 혈중 호중구 수준에 대한 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 영향을 나타낸 그래프이다. 모든 그룹은 대조군에 비해 유의성 있는(**: p＜0.01, ***: p＜0.001) 호중구 수준 증가 활성을 나타낸다.
도 12는 LPS-유도 염증 마우스 모델에서, 혈중 IL-1β 수준에 대한 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 영향을 나타낸 그래프이다. 모든 그룹은 대조군에 비해 유의성 있는(*: p＜0.05, **: p＜0.01, ***: p＜0.001) IL-1β 수준 감소 활성을 나타낸다.
도 13은 LPS-유도 염증 마우스 모델에서, 혈중 IL-6 수준에 대한 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 영향을 나타낸 그래프이다. RGME 400 그룹은 대조군에 비해 유의성 있는(**: p＜0.01) IL-6 수준 감소 활성을 나타낸다.
도 14은 LPS-유도 염증 마우스 모델에서, 혈중 TNF-α 수준에 대한 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 영향을 나타낸 그래프이다. 모든 그룹은 대조군에 비해 유의성 있는(*: p＜0.05, **: p＜0.01, ***: p＜0.001) TNF-α 수준 감소 활성을 나타낸다.
도 15은 LPS-유도 염증 마우스 모델에서, 혈중 PEG2 수준에 대한 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 영향을 나타낸 그래프이다. 모든 그룹은 대조군에 비해 유의성 있는(*: p＜0.05, **: p＜0.01) PEG2 수준 감소 활성을 나타낸다.
도 2는 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 3은 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 ABTS 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 4는 활성산소 생성량에 미치는 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 영향을 나타낸 그래프이다. 홍삼 복합 추출물은 100, 200㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는(*: p＜0.05, **: p＜0.01, ***: p＜0.001) 활성산소 생성량 감소 활성을 나타낸다.
도 5는 산화질소 생성량에 미치는 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 영향을 나타낸 그래프이다. 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물은 모든 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는(***: p＜0.001) 산화질소 생성량 감소 활성을 나타낸다.
도 6은 IL-1β 수준에 미치는 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 영향을 나타낸 그래프이다. 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물은 100, 200㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는(**: p＜0.01, ***: p＜0.001) IL-1β 수준 감소 활성을 나타낸다.
도 7은 IL-6 수준에 미치는 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 영향을 나타낸 그래프이다. 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물은 200㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는(*: p＜0.05, **: p＜0.01) IL-6 수준 감소 활성을 나타낸다.
도 8은 TNF-α 수준에 미치는 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 영향을 나타낸 그래프이다. 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물은 모든 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는(*: p＜0.05, **: p＜0.01, ***: p＜0.001) TNF-α 수준 감소 활성을 나타낸다.
도 9는 LPS-유도 염증 마우스 모델에서, 혈중 백혈구 수준에 대한 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 영향을 나타낸 그래프이다. RGE 200 그룹을 제외한 모든 그룹은 대조군에 비해 유의성 있는(*: p＜0.05, **: p＜0.01) 백혈구 수준 감소 활성을 나타낸다.
도 10는 LPS-유도 염증 마우스 모델에서, 혈중 림프구 수준에 대한 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 영향을 나타낸 그래프이다. 모든 그룹은 대조군에 비해 유의성 있는(**: p＜0.01, ***: p＜0.001) 림프구 수준 감소 활성을 나타낸다.
도 11은 LPS-유도 염증 마우스 모델에서, 혈중 호중구 수준에 대한 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 영향을 나타낸 그래프이다. 모든 그룹은 대조군에 비해 유의성 있는(**: p＜0.01, ***: p＜0.001) 호중구 수준 증가 활성을 나타낸다.
도 12는 LPS-유도 염증 마우스 모델에서, 혈중 IL-1β 수준에 대한 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 영향을 나타낸 그래프이다. 모든 그룹은 대조군에 비해 유의성 있는(*: p＜0.05, **: p＜0.01, ***: p＜0.001) IL-1β 수준 감소 활성을 나타낸다.
도 13은 LPS-유도 염증 마우스 모델에서, 혈중 IL-6 수준에 대한 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 영향을 나타낸 그래프이다. RGME 400 그룹은 대조군에 비해 유의성 있는(**: p＜0.01) IL-6 수준 감소 활성을 나타낸다.
도 14은 LPS-유도 염증 마우스 모델에서, 혈중 TNF-α 수준에 대한 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 영향을 나타낸 그래프이다. 모든 그룹은 대조군에 비해 유의성 있는(*: p＜0.05, **: p＜0.01, ***: p＜0.001) TNF-α 수준 감소 활성을 나타낸다.
도 15은 LPS-유도 염증 마우스 모델에서, 혈중 PEG2 수준에 대한 홍삼 추출물(RGE) 및 홍삼 복합 추출물(RGME)의 영향을 나타낸 그래프이다. 모든 그룹은 대조군에 비해 유의성 있는(*: p＜0.05, **: p＜0.01) PEG2 수준 감소 활성을 나타낸다.
이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물의 염증 및 면역력 저해인자 감소 효과 확인 방법
1-1. 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물의 제조
대전한약국에서 홍삼, 대추 및 길경을 구입하여 대전대학교에서 정선 후 사용하였다. 홍삼 50g과 홍삼 복합물 50g(홍삼 15g, 대추 20g 및 길경 15g)에 각각 증류수 1ℓ를 넣어 3시간 동안 환류 추출을 진행하고, 여과액을 회전진공농축기(rotary vacuum evaporator)로 감압 농축한 다음, 농축된 용액을 동결건조기(freeze dryer, EYELA FDU-540, Japan)로 동결건조하였다. 추출에 따라, 홍삼 추출물(red ginseng extract, RGE)은 10.1g(수율 20.2%), 홍삼 복합 추출물(red ginseng mixture extract, RGME)은 11.3g(수율 22.7%)의 분말로 각각 수득되었다. 초저온 냉동고(-80℃)에서 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물을 보관하였고, 사용하기 전 증류수를 사용하여 적절한 농도로 희석하였다.
1-2. 세포 배양
10% FBS(fetal bovine serum, Gibco BRL, U.S.A.)와 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin, Sigma, U.S.A.)으로 조성된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco BRL, U.S.A.) 배지를 사용하여 37℃ 및 5% CO2 조건이 유지되는 세포배양기(Forma scientific Co., U.S.A.)에서 RAW264.7 세포를 배양하였으며, 2 내지 3일 주기로 계대 배양하여 사용하였다.
1-3. 세포생존율 측정
96 웰 플레이트에 RAW264.7 세포를 1.5×105cells/웰로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 실험을 하기 전, 새로운 배양액으로 교체하였고, 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물을 각각 50, 100, 200㎍/㎖의 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 10㎕의 EZ-Cytox(Daeilab, Korea) 용액을 첨가하여 세포배양기에서 30분 동안 반응시켰다. 반응 후, 450㎚에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 나타내었다.
1-4. 항산화 효능평가
1-4-1. DPPH 라티갈 소거능 측정
홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물을 각각 1, 10, 100, 1000㎍/㎖의 최종농도로 희석하여 시료를 준비하였다. 에탄올에 용해시킨 0.2mM의 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl, Sigma, U.S.A) 용액 150㎕와 희석한 시료를 각각 100㎕씩 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 517㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능을 평가하기 위하여, 증류수를 대조군으로 사용하였으며, 대조군 및 시료 첨가군의 흡광도를 아래의 식과 같이 계산하여 백분율로 나타내었다.
1-4-2. ABTS 라디칼 소거능 측정
홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물을 1, 10, 100, 1000㎍/㎖의 최종농도로 희석하여 시료를 준비하였다. 2.6mM 과항산칼륨(potassium persulfate, Sigma, U.S.A.) 수용액에 용해시킨 7.4mM ABTS(2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), Sigma, U.S.A.) 용액을 암실에 하루 동안 방치하여 양이온(ABTS·+)을 형성시킨 후, 10배 희석한 ABTS 용액 190㎕와 희석한 시료를 각각 10㎕ 혼합하여 상온에서 10분간 반응시킨 후, 732㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거능을 평가하기 위하여, 증류수를 대조군으로 사용하였으며, 대조군 및 시료 첨가군의 흡광도를 아래의 식과 같이 계산하여 백분율로 나타내었다.
1-4-3. 활성산소종 생성량 측정
6 웰 플레이트에 RAW264.7 세포를 2×105cells/웰로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 새로운 배양액으로 교체하였으며, 50, 100, 200㎍/㎖ 농도의 홍삼 추출물 또는 홍삼 복합 추출물과 1㎍/㎖ 농도의 LPS(lipopolysaccharide, Sigma, U.S.A.)를 함께 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 이후, 1200rpm에서 5분간 원심 분리하여 수득한 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고, DCFH-DA((2,7)-dichlorodihydrofluorescin diacettate, Sigma, U.S.A.)를 10μM이 되도록 첨가한 후, 15분 동안 상온의 암실에 방치하였다. 염색 후, 차가운 PBS를 넣어 1200rpm에서 5분간 원심분리 한 다음, 상등액을 제거하고, 다시 PBS 400㎕로 부유시켜 유세포 분석기(Becton Dickinson, U.S.A.)로 형광강도의 세기에 따른 변화를 분석하여 활성산소종(reactive oxygen species: ROS)의 생성량을 측정하였다.
1-5. 세포모델에서 항염증 효능평가
1-5-1. 산화질소 생성량 측정
Nitric oxide detection kit(Intron Biotechnology, Korea)를 사용하여 산화질소(nitric oxide: NO) 생성량을 측정하여, 세포모델에서 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물의 항염증 효능을 평가하였다.
구체적으로, 96 웰 플레이트에 RAW264.7 세포를 1.5×105cells/웰로 분주하고, 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 새로운 배양액으로 교체하였으며, 50, 100, 200㎍/㎖ 농도의 홍삼 추출물 또는 홍삼 복합 추출물과 1㎍/㎖ 농도의 LPS를 함께 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 이후, N1 buffer를 50㎕씩 각 웰에 처리하여 10분간 상온에서 반응시킨 후, N2 buffer를 50㎕씩 각 웰에 처리하고 10분 동안 반응시켰다. 반응 후, 540㎚ 파장에서 흡광도를 측정한 다음, 이를 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.
1-5-2. 사이토카인 생성량 측정
Mouse cytokine milliplex map immunoassay kit(Millipore, U.S.A.)를 사용하여 사이토카인 생성량을 측정하여, 세포모델에서 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물의 항염증 효능을 평가하였다.
구체적으로, 12 웰 플레이트에 RAW264.7 세포를 2×105cells/웰로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 새로운 배양액으로 교체하였으며, 50, 100, 200㎍/㎖ 농도의 홍삼 추출물 또는 홍삼 복합 추출물과 1㎍/㎖ 농도의 LPS를 함께 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 이후, 배양액을 1200rpm에서 5분간 원심분리하여 수득한 상등액과 standard를 96 웰 플레이트에 25㎕씩 분주하고 assay buffer, matrix buffer 및 antibody-immobilized beads를 각 25㎕씩 가하여 혼합한 후, 2시간 동안 실온에서 반응시키고, 워싱 버퍼를 이용하여 2회 세척하였다. 세척 후, 25㎕의 detection antibody을 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이후, 추가로 25㎕의 스트렙타비딘-피코에리트린(streptavidin-phycoerythrin)을 가하여 30분 동안 실온에서 반응시킨 뒤, 워싱 버퍼를 이용하여 2회 세척하였다. 세척 후, PBS 150㎕를 넣고, 5분 간 혼합한 다음, Luminex(Millipore, U.S.A.)를 이용하여 측정하고, 측정값을 절대값으로 나타내었다.
1-6. 동물모델에서 항염증 효능평가
1-6-1. 동물모델 준비
동물모델 실험을 위하여, ICR 마우스(6주령, 수컷, 23∼28ｇ)를 (주)샘타코(Korea)에서 구입하여 사용하였다. 실험동물은 1주간의 안정기를 가지면서 순화시켰다. 안정기 및 실험기간 동안, 모든 실험군 마우스가 일반 사료(Altromin, Germany) 및 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다. 1주간의 안정기 이후 7주령부터 동물모델 실험을 진행하였다. 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 22±2℃, 1일 중 12시간은 200 내지 300Lux로 조명하고, 12시간은 모든 빛을 차단하였다. 본 실험은 대전대 동물실험윤리 위원회의 승인(승인번호 DJUARB2018-015)을 받아 동물윤리준칙에 의거하여 진행하였다.
1-6-2. 급성 염증 유발 동물모델 설계
아무것도 처리하지 않는 정상군, 증류수를 투여하는 대조군, 홍삼 추출물 또는 홍삼 복합 추출물을 200, 400㎎/㎏/day로 투여하는 실험군 등 총 8개의 그룹으로 나누어, 매일 1회, 오후 2시에 200㎕씩 oral zonde를 이용하여 7일간 해당 물질을 경구 투여하였다. 7일 후, LPS 1㎎/㎏을 복강에 주사하고, 3시간 후 ethyl ether(Samchun, Korea)로 마취하여 심장 천자법으로 채혈하였다. 시료 투여량은 성인 체중 1kg당 200, 400㎎을 기준으로 하고, 마우스 체중 30g으로 계산하여 산출하였다.
1-6-3. 면역세포 측정
실시예 1-6-2에서 채혈한 혈액을 EDTA 튜브(microtainer® tube with dipotassium EDTA, BD Co., U.S.A.)에 담아 대전대학교 한방바이오 Fablab에 분석 의뢰하여, 백혈구, 호중구 및 림프구 수를 측정하였다.
1-6-4. Cytokine 생성량 측정
① IL-1β, IL-6 및 TNF-α생성량 측정
Mouse cytokine milliplex map immunoassay kit(Millipore, U.S.A.)를 사용하여 실시예 1-6-2에서 채혈한 혈액의 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 수준을 측정하였다.
구체적으로, 동물모델 실험 후, 분리한 혈청과 standard를 96 웰 플레이트에 25㎕씩 분주하고, assay buffer, matrix buffer 및 antibody-immobilized beads를 각 25㎕씩 가하여 혼합한 후, 2시간 동안 실온에서 반응시키고, 워싱 버퍼를 이용하여 2회 세척하였다. 세척 후, 25㎕의 detection antibody을 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시키고, 추가로 25㎕의 스트랩타비딘-피코에리드린을 가하여 30분 동안 실온에서 반응시킨 후, 워싱 버퍼를 이용하여 2회 세척하였다. 세척 후, PBS 150㎕를 넣고, 5분 간 혼합한 다음, Luminex를 이용하여 측정하고, 측정값을 절대값으로 나타내었다.
② Prostaglandin E2 생성량 측정
Mouse cytokine milliplex map immunoassay kit(Millipore, U.S.A.)를 사용하여 실시예 1-6-2에서 채혈한 혈액의 Prostaglandin E2(PGE2) 수준을 측정하였다.
구체적으로, 동물모델 실험 후, 분리한 혈청과 standard를 96 웰 플레이트에 150㎕씩 분주하고, primary antibody 50㎕를 넣어 1시간 동안 plate shaker를 이용하여 혼합하였다. 이후, PGE2 conjugate 50㎕를 넣고, 다시 2시간 동안 plate shaker를 이용하여 혼합하였다. 그 다음, wash buffer 400㎕를 넣고, 워싱한 후, substrate solution 200㎕를 첨가하고, 상온의 암실에서 30분 동안 반응시켰다. 마지막으로 stop solution 100㎕를 넣고, 450㎚ 파장에서 측정하였다.
1-7. 통계처리
실험 결과는 SPSS 24.0의 independent two-sample t-test를 사용하여 통계처리 하였고, p＜0.05, p＜0.01 및 p＜0.001 수준에서 유의성을 검정하였다.
<실시예 2> 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물의 세포 독성 여부 확인
홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물이 세포 독성을 나타내는지 확인하기 위하여, 실시예 1-1에서 제조한 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물을 사용하여 실시예 1-3의 방법으로 세포생존율 분석을 수행하였다.
그 결과, 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물 모두 대조군 대비 유의한 세포생존율의 차이를 보이지 않아, 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물은 세포 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다(도 1).
<실시예 3> 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물의 항산화 활성 확인
3-1. DPPH 라디갈 소거능 분석에 따른 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물의 항산화 활성 확인
홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물이 항산화 활성을 나타내는지 확인하기 위하여, 실시예 1-1에서 제조한 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물을 사용하여 실시예 1-4-1의 방법으로 항산화 활성을 평가하였다.
그 결과, 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물 모두 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거능 활성을 증가시키는 것으로 확인되어, 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물의 항산화 활성을 확인하였다(도 2).
3-2. ABTS 라디칼 소거능 분석에 따른 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물의 항산화 활성 확인
홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물이 항산화 활성을 나타내는지 확인하기 위하여, 실시예 1-1에서 제조한 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물을 사용하여 실시예 1-4-2의 방법으로 항산화 활성을 평가하였다.
그 결과, 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물 모두 농도 의존적으로 ABTS 라디칼 소거능 활성을 증가시키는 것으로 확인되어, 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물의 항산화 활성을 확인하였다(도 3).
3-3. 활성산소종 생성량 측정에 따른 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물의 항산화 활성 확인
홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물이 항산화 활성을 나타내는지 확인하기 위하여, 실시예 1-1에서 제조한 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물을 사용하여 실시예 1-4-3의 방법으로 항산화 활성을 평가하였다.
그 결과, 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물 모두 농도 의존적으로 활성산소종의 생성을 억제하는 것으로 확인되어, 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물의 항산화 활성을 확인하였다(도 4).
<실시예 4> 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물의 항염증 활성 확인
4-1. 산화질소 생성량 측정에 따른 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물의 항염증 활성 확인
홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물이 항염증 활성을 나타내는지 확인하기 위하여, 실시예 1-1에서 제조한 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물을 사용하여 실시예 1-5-1의 방법으로 항염증 활성을 평가하였다.
그 결과, 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물 모두 농도 의존적으로 산화질소의 생성을 억제하는 것으로 확인되어, 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물의 항염증 활성을 확인하였다(도 5).
4-2. 사이토카인 생성량 측정에 따른 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물의 항염증 활성 확인
홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물이 항염증 활성을 나타내는지 확인하기 위하여, 실시예 1-1에서 제조한 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물을 사용하여 실시예 1-5-2의 방법으로 항염증 활성을 평가하였다.
그 결과, 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물 모두 농도 의존적으로 IL-1β(도 6), IL-6(도 7) 및 TNF-α(도 8)의 생성을 억제하는 것으로 확인되었으며, 특히, 200㎍/㎖ 농도의 홍삼 복합 추출물의 사이토카인 억제 활성이 가장 우수한 것으로 확인되었다.
<실시예 5> 동물모델 실험을 통한 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물의 면역세포 활성 조절 및 염증성 인자 억제 활성 확인
5-1. 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물의 면역세포 활성 조절 효과 확인
홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물이 면역세포 활성 조절 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 실시예 1-6-3의 방법으로 면역세포의 수를 측정하였다.
그 결과, 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물 모두 동물모델의 백혈구(WBC)(도 9) 및 림프구(lymphocyte)(도 10)를 감소시키는 반면, 호중구(neutrophil)(도 11)를 증가시켜 면역세포 활성 조절 활성을 나타내는 것으로 확인되었으며, 그 중, 400㎍/㎖ 농도의 홍삼 복합 추출물의 면역세포 활성 조절 효과가 대체적으로 우수한 것으로 확인되었다.
5-2. 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물의 사이토카인 억제 활성 확인
홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물이 염증성 인자 억제 활성을 나타내는지 확인하기 위하여, 실시예 1-6-4의 방법으로 사이토카인 수준을 분석하였다.
그 결과, 홍삼 추출물 및 홍삼 복합 추출물 모두 동물모델의 IL-1β(도 12), IL-6(도 13), TNF-α(도 14) 및 PGE2(lymphocyte)(도 15)를 감소시켜 항염증 활성을 나타내는 것으로 확인되었으며, 그 중, 400㎍/㎖ 농도의 홍삼 복합 추출물의 사이토카인 억제 활성이 가장 우수한 것으로 확인되었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (8)
- 증류수를 용매로 추출한 홍삼, 대추 및 길경의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물로,
상기 조성물은 하루 총 용량 200 내지 400㎎/㎏으로 경구 투여되는 것인 항염증용 약학적 조성물.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 홍삼, 상기 대추 및 상기 길경의 중량비는 3:4:3인 것인 항염증용 약학적 조성물.
- 삭제
- 증류수를 용매로 추출한 홍삼, 대추 및 길경의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물로,
상기 조성물은 하루 총 용량 200 내지 400㎎/㎏으로 경구 투여되는 것인 항염증용 식품 조성물.
- 삭제
- 제 5 항에 있어서, 상기 홍삼, 상기 대추 및 상기 길경의 중량비는 3:4:3인 것인 항염증용 식품 조성물.
- 삭제
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