KR20140086329A - 생리활성성분이 강화된 흑대추의 제조방법 - Google Patents

생리활성성분이 강화된 흑대추의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 건대추를 고온 숙성하는 단계를 포함하는 흑대추의 제조방법, 대추에서 항당뇨 또는 항염증 생리활성성분을 강화시키는 방법 및 흑대추 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 또는 염증 개선용 기능성 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의하면 비교적 고온에서 대추를 단시간 숙성시킴으로써 생리활성성분이 강화되고, 관능성이 증진된 흑대추를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 종래의 흑대추 제조방법에 비해 제조 기간이 단축되며 대추의 항당뇨 및 항염증의 생리활성을 향상시킬 수 있다.

Description

생리활성성분이 강화된 흑대추의 제조방법{Method for Preparing Black Jujube Enriched with Physiological Active Ingredients}
본 발명은 생리활성성분이 강화된 흑대추의 제조방법에 관한 것이다.
경제수준의 향상으로 삶의 질이 높아지면서 건강에 대한 관심이 증대되고 있으며, 식품에서도 천연 소재에 대한 관심과 기능성 식품에 대한 연구가 고조되고 있다(1). 대추(Ziziphus jujube Miller)는 예로부터 한방 약재로서 또는 과실의 한 종류로서 널리 이용되어 왔으며, 최근 건강에 대한 관심이 높아짐에 따라 약용과 기능성 식품으로서 인기가 커지고 있다. 대추는 타원형의 열매를 맺는데 껍질이 얇고 녹색을 띠나 익으면서 적갈색으로 변화하고 과육은 향기가 별로 없지만 단맛이 강하고 산미가 있어 상쾌한 느낌을 준다. 대추에 가장 많이 들어 있는 성분은 당질로서 생과는 24-31％, 건과는 58-65％ 정도가 단당류와 다당류이며, 일반 과종에 비하여 월등히 높다고 보고되었다(2). 약용 성분으로는 각종 스테롤(sterol), 알칼로이드(alkaloid), 사포닌(saponin), 비타민(vitamin), 세로토닌(serotonin), 유기산(organic acid), 지방산(fatty acid), 폴리페놀(polyphenol), 플라보노이드(flavonoid) 및 아미노산(amino acid) 등이 보고되고 있으며(3, 4), 그 외 트리테르페노이드(triterpenoid)(5), c-GMP(6)등의 물질이 함유되어 있다는 연구 보고가 있고, 약리 작용으로는 메탄올 추출물의 간 보호 효과(7), 암세포 증식 억제 효과(8), 항산화 효과(9) 등이 보고되고 있다. 생대추는 저장성이 낮기 때문에 주로 건조하여 건대추로 많이 사용이 되고 있고 건조 방법은 건대추의 품질에 큰 영향을 미치게 되므로 대추가 생산되는 대부분의 나라에서는 주로 일광건조를 시키고 있으나 우기가 되거나 일조량이 낮을 경우에는 건조 도중 부패되거나 연화되어 품질에 손상이 되거나 미생물이 번식하여 위생적으로 불량하게 되는 경우가 많다. 따라서 대추를 효과적으로 가공하고 유통시키기 위해 대추의 저장성 및 기능성을 증대시킬 연구가 필요한 실정이다.
최근, 우리나라에서는 마늘의 냄새와 맛을 조절하기 위한 방법으로 열처리 방법을 이용하여 마늘 자체 성분과 효소 등에 의해 마늘 인편이 내부까지 모두 흑색으로 변화시켜 흑마늘을 제조하고 있다(10). 고온 항온기에서 일정시간 숙성시킬 경우 점도가 높아지고 단맛과 신맛이 조화를 이루어 가공되지 않은 상태의 마늘보다 관능적인 면에서 우수하지만 제조 과정 중에 일어나는 이화학적인 변화나 생리활성에 대한 연구는 부족한 실정이다. 흑대추를 제조함에 있어 대추 성분에 의한 갈변은 홍삼과 비교해 볼 때 아미노-카르보닐(amino-carbonyl) 반응에 의한 것으로 추정하고 있다. 갈변 반응 생성물이 리덕톤(reductone)의 수소 공여능에 의한 지질의 항산화 활성(11), 갈변 반응 분획물의 항돌연변이원성 및 항산화성에 관한 연구(12) 등이 있으며, 갈변 반응으로 생성된 멜라노이딘(melanoidine)은 중성 pH에서 강한 항산화 작용을 가지며 환원성 성분에 의한 라디칼 소거 작용, 과산화물 분해 작용 및 중합물의 급속봉쇄작용 등의 기능성이 인정되고 있다(13). 갈변물질의 항산화성은 갈변 반응 초기에 형성되는 물질에 기인한다는 보고가 있는가 하면 갈변도가 증가할수록 항산화 활성이 증가한다는 보고(14)도 있어 갈변 반응에 의한 항산화 활성은 아직도 많은 연구 과제를 남기고 있다.
한편, 산화질소(Nitric oxide, NO)는 여러 조직과 세포들에서 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)에 의해 합성되며 혈관확장, 신경전달, 혈액응고, 면역기능 조절 등의 역할을 하는 것으로 알려져 있다. NOS는 크게 cNOS와 iNOS의 두 가지 그룹으로 나눌 수 있다. 즉, 신경(neuronal), 혈관내피(endothelial) NOS는 cNOS에 속하며 이는 Ca2+-칼모둘린(calmodulcin) 의존성이며 평상시에도 지속적으로 NO를 분비하고 있어 항상성을 조절한다. 이와 반면에 유도성(inducible NOS, iNOS)는 IFN-γ, 인터루킨(interleukin)-1, TNF(tumor necrosis factor)-α등의 사이토카인(cytokine)이나 박테리아의 LPS(lipopolysaccharide)에 의해서 활성화되며 연개 반응을 통해 장시간 동안 대량의 NO를 생성하게 된다. 이 NO는 대식세포(macrophage)의 세포독성활성(cytotoxic activity)에 큰 영향을 미치므로 미생물이나 종양세포로부터 숙주를 방어하는 중요한 역할을 하고 있다. 하지만, 과 생성된 NO에 의해서 류마티스 관절염 같은 염증반응이 악화시키므로 유해한 작용을 나타내게 된다. 위와 같이 자극된 iNOS는 대식세포(macrophage)와 간세포(hepatocytes)에 존재하게 되며, 염증이 다른 병원균들과 관여하는 동안 NO 생성은 현저하게 증가하고, 세포독성을 나타나게 된다. 더욱이 정상적인 NO의 자유 라디칼(free radical)과 과산화질소를 생성하기 위한 산소(oxygen)와의 커다란 반응으로 산화력의 상실을 야기할 수 있는 강력한 전-산화제 분자(pro-oxidant molcule)인 NO를 만든다. 그러므로 염증성 자극의 반응에서 NO 생성의 저해는 염증성 질병에서 치료적 방법으로 사용될 수 있다. 자유 라디칼 및 다른 반응성 산소종들은 음식물내의 외인성 화합물 또는 인체내에서의 내인성 대사 과정에 의해 생성된다. 라디칼들은 생분자들을 산화시켜 산화적 손상(oxidative damage)을 일으켜 세포 사멸이나 조직 손상에 이르게 할 수 있다. 아테롬성 동맥 경화증(atherosclerosis), 암(cancer), 기종(emphysema), 간경변(cirrhosis) 및 관절염(arthritis)이 산화적 손상과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 산화적 손상은 인간 질병에서 매우 중요한 병리학적 역할을 하며 항산화 보충제 또는 항산화물질을 포함하는 식품의 섭취는 인체에서 산화적 손상을 감소시키기 때문에 매우 중요하다. 최근 들어, 비타민 C, E, 세사몰(sesamol) 및 카르노스산(carnosic acid) 등과 같은 식품내의 천연 항산화물질이 소비자들에게 제공되어 왔다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 건대추의 생리활성물질을 증진시킴과 동시에 섭취 및 저장이 용이한 새로운 식품형태를 제조하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 건대추를 고온에서 숙성처리하면 대추의 생리활성 중에서 α-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해 활성 및 항염증 활성이 향상되고, 동시에 관능성도 우수해짐으로써 새로운 기능성 식품으로서 활용이 가능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 건조한 대추를 고온에서 숙성시키는 단계를 포함하는 흑대추의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 건조한 대추를 고온에서 숙성시키는 단계를 포함하는 대추에서 알파-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해 활성 및 항염증 활성을 갖는 생리활성성분을 강화시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 고온 숙성은 75-85℃의 온도에서의 숙성이다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면, 상기 고온은 77-83℃의 온도이다.
본 발명의 다른 구현예에 의하면, 상기 고온은 80℃의 온도이다.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 방법에서 숙성은 24-72 시간 행한다.
본 발명의 다른 구현예에 의하면, 상기 방법에서 숙성은 48시간 행한다.
본 발명의 다른 구현예에 의하면, 상기 숙성은 밀폐된 용기에서 행한다.
본 발명의 다른 구현예에 의하면, 상기 숙성은 밀폐된 용기에서 습화된 조건하에서 행한다.
본 발명의 다른 구현예에 의하면, 상기 숙성은 밀폐된 용기에서 80-95％의 습도하에서 행한다.
본 발명에서 고온에서 밀폐된 용기내의 습화된 조건하에서 대추를 숙성시키면 대추가 갖는 항산화 활성, 항염증 활성 및 항당뇨 활성이 보다 향상된다.
본 발명이 하기 구체적인 일 실시예에 따르면, 본 발명의 건대추의 고온 숙성 과정에 의해 대추가 가지는 α-글루코시다아제(α-glucosidase) 효소의 저해 활성 및 산화질소(NO, nitric oxide) 생성 저해 활성이 증가된다.
α-글루코시다아제(α-glucosidase)는 녹말이나 이당류에서 1,4-알파 결합으로 연결된 글루코오스 잔기의 1,4-알파 결합을 끊어 글루코오스로 유리시키는 작용을 하는 효소이다. α-글루코시다아제의 활성 억제자는 장내에서의 글루코오스의 흡수를 저해함으로써 고혈당에 의한 당뇨증상을 치료 또는 개선하는 것으로 알려져 있다.
산화질소(Nitric oxide, NO)는 여러 조직과 세포들에서 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)에 의해 합성되며 혈관확장, 신경전달, 혈액응고, 면역기능 조절 등의 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, cNOS와 iNOS의 두 가지 그룹으로 나눌 수 있다. 유도성(inducible NOS, iNOS)는 IFN-γ, 인터루킨(interleukin)-1, TNF(tumor necrosis factor)-α등의 사이토카인(cytokine)이나 박테리아의 LPS(lipopolysaccharide)에 의해서 활성화되며 연개 반응을 통해 장시간 동안 대량의 NO를 생성하게 된다. 과-생성된 NO에 의해서 류마티스 관절염 같은 염증 반응이 악화되므로 유해한 작용이 나타나게 된다. 위와 같이 자극된 iNOS는 대식세포(macrophage)와 간세포(hepatocytes)에 존재하게 되며, 염증이 다른 병원균들과 관여하는 동안 NO 생성은 현저하게 증가하고, 세포독성을 나타나게 된다. 따라서, 다양한 염증성 자극의 반응에서 NO 과생성의 저해는 염증 및 염증성 질환의 치료적 방법으로 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 의하면, 본 발명의 건대추의 고온 숙성 과정에 의해 신맛과 단맛이 적절하게 조화되어 관능성이 향상된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 방법에 의해 제조된 흑대추의 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 개선용 기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 방법에 의해 제조된 흑대추의 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 개선용 기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 흑대추 추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 분리할 수 있다.
본 발명의 흑대추 추출물을 추출하기 위한 추출 용매로는 추출공정에서 일반적으로 사용할 수 있는 용매를 사용할 수 있으며, 둘 이상의 서로 다른 용매를 순차적으로 사용하여 추출할 수도 있다. 본 발명의 추출용매는 바람직하게는, 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올), 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄(CH2Cl2), 클로로포름, 헥산(Hexane) 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 흑대추 추출물 이외에 감미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 감미제로서 천연 감미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 감미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다.
본 발명의 기능성 식품 조성물에 의해 개선이 가능한 염증 또는 염증성 질환으로는 예를 들어, 부비동염(sinusitis), 비염(rhinitis), 결막염(conjunctivitis), 천식(asthma), 피부염(dermatitis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease), 염증성 콜라겐 혈관 질환(inflammatory collagen vascular diseases), 사구체신염(glomerulonephritis), 염증성 피부 질환(inflammatory skin diseases) 및 유육종증(sarcoidosis) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상술한 본 발명의 특징과 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 건대추를 고온 숙성하는 단계를 포함하는 흑대추의 제조방법를 제공한다.
(ⅱ) 본 발명의 건대추를 고온 숙성하는 단계를 포함하는 대추에서 알파-글루코시다아제 저해 활성 및 항염증 활성을 갖는 생리활성성분을 강화시키는 방법을 제공한다.
(ⅲ) 본 발명은 상기 흑대추의 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 또는 염증 개선용 기능성 식품 조성물을 제공한다.
(ⅳ) 본 발명의 방법에 의하면 비교적 고온에서 대추를 단시간 숙성시켜 생리활성성분이 증진되고 관능성이 향상된 흑대추를 제조할 수 있다.
(ⅴ) 본 발명의 방법은 종래의 흑대추 제조방법에 비해 제조 기간이 단축되며 대추의 항당뇨 및 항염증의 생리활성성분을 강화시킬 수 있다.
본 발명은 건대추를 고온 숙성하는 단계를 포함하는 흑대추의 제조방법, 대추에서 항당뇨 또는 항염증 생리활성성분을 강화시키는 방법 및 흑대추 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 또는 염증 개선용 기능성 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의하면 비교적 고온에서 대추를 단시간 숙성시킴으로써 생리활성성분이 강화되고, 관능성이 증진된 흑대추를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 종래의 흑대추 제조방법에 비해 제조 기간이 단축되며 대추의 항당뇨 및 항염증의 생리활성을 향상시킬 수 있다.
도 1은 상이한 숙성기간에 따른 건대추 및 숙성 흑대추의 외관을 비교한 결과이다. A: 건대추; B: 숙성 대추(24 hr), C; 숙성 대추(48 hr), D; 숙성 대추(72 hr)
도 2는 숙성기간에 따른 흑대추의 α-글루코시다아제 저해 활성을 3.33 mg/mL의 농도에서 측정한 결과이다. 측정에 사용한 모든 시료의 농도는 3.33 mg/mL이다. 데이터는 평균ㅁ표준편차(n=3)으로 표시하였다. 상이한 문자로 표시한 평균값은 Duncan's multiple range test에 의해 통계적으로 유의성 있는 상이한 값을 나타낸다(p<0.05).
도 3은 LPS-자극된 Raw 264.7 세포에서 흑대추 추출물이 NO 생성에 미치는 영향을 측정한 결과이다. Raw 264.7 세포(1 X 105 세포/웰) LPS (100 ng/mL)의 존재하에서 100 μg/mL의 흑대추 추출물과 함께 24시간 배양하였다. 세포로부터 생성된 배양상층액내의 NO의 양은 Griess 시약으로 측정하였다. 측정값은 3회 실험의 평균ㅁSD 값으로 표시하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험 재료 및 방법
1. 실험 재료
본 실험에 사용한 대추는 경상북도 경산에 소재하고 있는 대흥대추농산에서 건대추를 구입하였으며, 모든 시료는 흐르는 물에 깨끗이 씻은 후 물기를 제거하고 실온에서 24시간 건조 시킨 후 100g 단위로 소포장 하여 -75℃ 초저온냉동고(deep freezer, DF8517, Ilsin Co. Ltd., Dongduchun, Korea)에서 보관하면서 사용하였다. 용매인 에탄올(ethanol)은 Duksan 화학(Ansan, Korea)에서 구입하였으며, HPLC에 사용된 용매는 HPLC 등급용 용매(J.T. Baker, Philipsburg, NJ, USA)를 사용하였다. DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), ABTS[2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)], α-글루코시다아제 효소액 및 p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside은 Sigma사(St. Loouis, Mo, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
2. 흑대추의 제조
건조 저장된 대추를 스테인레스망이 있는 내열성 플라스틱 밀폐 용기에 담고, 대추가 건조되지 않도록 물 100 mL을 용기에 넣은 다음 80℃에서 24시간에서 72시간까지 고온 숙성시켰다. 숙성 과정 중 물을 모두 소비하면 50 mL씩 첨가해주어 수분을 지속적으로 공급시켜주었고 제조된 흑대추는 100g 단위로 소포장하여 냉동보관하면서 사용하였다.
3. 수분함량, 당도 및 색도
대추와 흑대추의 수분 함량은 적외선 수분측정기(FD-720, KETT Electric Laboratory, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였고, 수분활성도는 수분활성도 측정기(AQS-2-TC, Nagy, Germany)를 이용하여 측정하였으며, 시료를 측정용 용기에 일정량을 넣고 수분활성도를 측정하였다. 당도는 전자 당도계(Refractomer Pocket PAL-3, Atago, Tokyo, Japan)을 이용하여 측정하였다. 색도는 건대추와 흑대추 5g 에 증류수 20 mL을 가하여 상온에서 30분간 교반 추출하여 1,000 X g에서 15분간 원심 분리하여 상등액을 취한 다음 상등액 1 mL을 스크류 캡 테스트 튜브(screw cap test tube)의 캡(PYREX, 직경 13 mm)에 담아 색채계(Color Reader, CR-10, MINOLTA, Osaka, Japan)를 이용하여 L(lightness), a(redness), b(yellowness) 값을 측정하였다. 이때 사용한 표준 백색판은 L=97.37, a=0.12, b=1.82이었으며, ΔE값은 백색판의 L, a, b값과 L, a, b 값과의 차이 값을 이용하여 계산하였다.
Figure pat00001

4. pH 및 적정산도 측정
pH는 각 시료 10g을 균질화하여 100 mL로 만든 다음 원심 분리한 상층액을 pH 미터(Digital pH meter 420A+, Thermo Orion. Beverly, MA., USA)를 이용하여 측정하였고, 적정 산도는 상층액 10 mL를 취하여 pH가 8.3에 도달할 때까지 0.1N-NaOH로 적정에 사용된 소비량을 타르타르산(tartaric acid) 함량(％)으로 환산하여 계산하였다.
5. HPLC ( High performance liquid chromatography )를 이용한 유리당 정량 분석
숙성 기간에 따른 흑대추 추출물의 유리당 함량 측정은 HPLC(Knauer Co., Berlin, Germany)를 이용하여 측정하였다. 동결 건조한 시료 2 g에 증류수 18 mL 가하여 상온에서 30분간 교반 추출하여 원심분리(10,000 rpm, 15 min)한 후 상등액을 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 시료로 사용하였다. HPLC 분석 시 검출기는 RI(refractive index)를 이용하였으며, 당분석 전용 컬럼(Shodex, Tokyo, Japan)을 이용하여 이동상을 75％ 아세토니트릴(acetonitrile)로 유속은 1.0 mL/min의 속도로 흘려주었다(15).
6. HPLC를 이용한 비휘발성 유기산 정량 분석
숙성 기간에 따른 흑대추 추출물의 유기산 함량 측정은 HPLC(Knauer Co., Berlin, Germany)를 이용하여 측정하였다. 동결 건조한 시료 2 g에 증류수 18 mL 가하여 상온에서 30분간 교반 추출하여 원심분리(10,000 rpm, 15 min)한 후 상등액은 여과지(Advantec 5A, Tokyo, Japan)을 이용하여 여과하였다. 여과액은 Sep-pak plus C18 카트리지(55-105 ㎛, Waters Co., Milford, USA)을 이용하여 색소 및 지방질을 제거하고 0.45 ㎛ 시린지 필터(syringe filter)를 통과한 것을 시료로 사용하였다. 분석에 사용된 컬럼은 Hypersil Gold aQ C18 (Thermo Co., Waltham, USA)이며 용매로는 20 mM의 H3PO4를 이용하여 분당 1 mL의 속도로 흘려주면서 UV 210 nm에서 검출하여 분석하였다(16).
7. 생대추와 흑대추의 추출물 제조
숙성시키지 않은 건대추와 숙성시킨 흑대추는 각각 씨를 제거하고 동결건조를 해주어 분말화 시킨 뒤 20 g씩 취하여 70％ 에탄올(Ethanol)과 증류수를 각각 200 mL씩 가하였다. 추출은 진탕 배양기(SI-900R, JEIO TECH Co., Daejeon, Korea)를 이용하여 25℃에서 120 rpm의 속도로 3회 반복하여 추출하였다. 추출물을 여과지(Advantec No.5)를 이용하여 여과하고 회전감압농축기(EYELA, Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 농축한 후 동결 건조하여 시료로 사용하였다.
8. 총 폴리페놀 함량 측정
폴리페놀 함량은 AOAC 법에 의해 측정하였다(17). 농도별로 희석한 용액 1 mL을 취하여 10％(w/v) Na2CO3 용액 1 mL을 가하여 3분간 방치한 후, 50％ Folin-Ciocalteu 시약 1 mL을 가하여 반응시켜 750 nm에서 측정하였다. 표준 곡선은 증류수로 갈산(gallic acid) 0.1％(w/v)를 제조한 후 최종 농도가 0, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL 용액이 되도록 제조하고, 이를 일정량 취하여 위와 같은 방법으로 750 nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다.
9. DPPH 자유 라디칼 소거 활성 측정
흑대추 추출물의 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼에 대한 소거활성은 Blois의 방법(18)에 따라 측정하였다. 시료를 각각의 용매에 녹여 농도별로 희석한 희석액 160μL과 에탄올에 녹인 0.15 mM DPPH 용액 40μL를 가하여 실온에서 30분 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 추출물의 유리라디칼 소거활성은 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도를 1/2로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 IC50 값으로 나타내었다. 이 때 상대 활성의 비교를 위하여 대조군으로 BHT, BHA, Vit-c를 사용하였다.
10. ABTS 라디칼-소거 활성 측정
ABTS 라디칼을 이용한 항산화력 측정은 ABTS + cation decolorization assay 방법(19)에 의하여 시행하였다. 7 mM ABTS [2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6- sulfonic acid)]와 2.45 mM 포타슘 퍼설페이트(potassium persulfate)를 최종농도로 혼합하여 실온인 암소에서 24시간 동안 방치하여 ABTS+을 형성시킨 후 732 nm에서 흡광도 값이 0.70(ㅁ0.02)이 되게 포스페이트 완충 식염수(phosphate buffer saline, PBS, pH 7.4)로 희석하였다. 희석된 용액 990 ㅅL에 시료 10 ㅅL를 가하여 정확히 1분 동안 방치한 후 흡광도를 측정하였다. 상대 활성 비교를 위한 대조군으로는 Vit-C와 trolox를 사용하였다.
11. α-글루코시다아제 저해활성 측정
숙성 시간에 따른 흑대추 추출물을 농도별로 희석하여 0.75 U/mL의 α-글루코시다아제 효소액 50 ㅅL, 50 mM 포타슘 퍼설페이트 완충액(pH 6.5)에 넣고 혼합한 후 2 mM p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside를 가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 0.5 M Na2CO3를 가하여 반응을 정지시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정하여 효소 반응으로 생성된 니트로페닐(nitrophenyl)의 함량을 정량하여 각추출물을 처리하지 않은 대조구와 비교하여 효소 활성을 계산하였다(20).
12. 산화질소(Nitric oxide, NO) 생성 억제 측정
Raw 264.7 세포로부터 생성되는 활성질소종인 산화질소(NO, nitric oxide)의 양은 세포 배양액 중 존재하는 NO2-형태를 Griss Reagent 반응을 이용하여 측정하였다. 먼저 Raw 264.7 세포를 1 X 105 cells/mL로 96-웰 플레이트에 분주한 후 시료를 다양한 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하고, 100 ng/mL의 LPS를 첨가하여 24 시간 배양하여 세포를 활성화시켰다. 이후 세포 배양 상등액 100 μL과 동량의 Griss 시약(1％ sulfanilamide, 0.1％ naphtylethylendiamine in 2.5％ phosphoric acid)을 혼합하여 10분간 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO의 농도(μM)는 소디엄 나이트레이트(sodium nitrate, NaNO2)를 사용하여 얻은 표준곡선과 비교하여 산출하였다.
13. 통계 처리
모든 자료는 평균ㅁ표준편차로 나타내었으며, 유의성 검사는 SPSSTM version 19.0(SPSS Inc., Chicago, USA)을 이용하여 one-way ANOVA를 실시하였고, 통계적 유의성은 Duncan's multiple comparison test로 검증하였다. p<0.05 이상일 때만 통계적 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
14. 관능평가
숙성 기간을 달리하여 제조한 흑대추에 대해 계명대학교 식품가공학과 전공 학생 및 연구원을 대상으로 관능검사를 실시하였다. 이들에게 관능검사에 필요한 훈련과정을 거치게 한 후 최종 47명을 관능요원으로 선발하여 색(color), 향(flavor), 신맛(sourness), 단맛(sweetness), 점성(viscosity), 전반적인 기호도(overall acceptability)에 대하여 5점 채점법으로 '5점 매우 좋다, 1점 매우 나쁘다'로 평가하였고, 실험결과는 평균과 오차범위를 구하였다.
실험 결과
1. 숙성 기간에 따른 흑대추의 이화학적 특성
식품 내의 수분함량은 식품의 성징, 외관, 관능적 품질 등에 크게 영향을 미치고 식품의 텍스처(texture)에 중요한 역할을 할 뿐만 아니라 화학적, 미생물학적 변질과 부패의 원인이 되기도 하므로 중요한 항목이다(21). 흑대추의 숙성 기간에 따른 수분함량의 변화는 아래 표 1과 같다. 숙성 기간이 길어질수록 흑대추의 수분 함량이 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 실제 육안으로나 관능적 평가를 했을 시에도 숙성시간이 증가함에 따라 대추가 물러지고 수분 함량이 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 이는 대추가 유통을 위해 어느 정도 수분이 제거된 상태였다가 고온에서 일정한 수분을 제공받으며 숙성되어가면서 대추의 과육이 수분을 흡수하였을 것이라 추측된다. 건대추의 당도는 10.37ㅀBrix 였으나 동결 건조하여 수분 함량을 동일하게 하여 측정하였을 때 77.89ㅀBrix로 나타났고 흑대추로 변화할수록 당도가 소량 증가하여 72 시간 숙성 시 당도가 81.75ㅀBrix로 나타났다. 이는 흑대추의 제조 과정 중에 다당류들이 분해되어 덱스트린이나 단당류로 변화되는 현상에서 기인한 것으로 추측된다(22). 숙성과정 동안 pH는 감소하고 산도는 증가하는 것으로 나타났다(표 1). 건대추의 pH는 5.28로 약산성을 나타내었지만 숙성기간이 길어질수록 감소하여 숙성 72 시간에는 3.87로 나타났는데, 이는 숙성기간 중 휘발성 유기산류가 소실되었기 때문이라고 생각된다. 하지만, 숙성하는 과정 동안 비휘발성 유기산류가 생성됨에 따라 총 산도는 증가하면서 맛은 새콤, 달콤해지고 조직감은 부드러워지는 것으로 나타났다.
건대추가 흑대추로 변화하는 과정에는 대추에 함유된 당분과 아미노산의 아미노-카보리 반응으로 갈변화가 일어난다. 따라서, 건대추를 일정한 조건에서 흑대추로 만드는 과정은 미생물의 생육이 거의 불가능하기 때문에 흑대추 제조는 발효에 의한 갈변이 아니고 숙성에 의해서 이루어지게 된다(23). 흑대추는 숙성 기간이 길어질수록 색깔이 흑갈색 또는 흑색으로 짙어지는 경향을 볼 수 있었다(도 1 참조).
건조 대추와 흑대추의 색도 변화를 측정한 결과는 표 2와 같다. 건대추의 명도(L) 값은 19.68로 나온 것에 비해 숙성 시간이 길어질수록 감소하여 72시간째 14.23으로 나타났다. 건조 대추의 적색도(a) 값과 황색도(b) 값 역시 각각 2.45, 3.87 이었으나 24시간 숙성 뒤부터 1.18과 0.77로 현저하게 값이 낮아지고 그 뒤로도 값이 유의적으로 감소하는 것을 관찰하였다. 일반적인 건대추의 색도는 건대추의 L, a, b값이 각각 19.74, 3.85, 4.42 이라고 보고되었다(24).
Figure pat00002
Figure pat00003
2. 숙성 기간에 따른 흑대추의 유리당 및 비휘발성 유기산 함량
숙성 기간에 따른 동결 건조된 흑대추의 유리당 함량 변화를 표 3에 나타내었다. 건대추에서의 유리당은 프럭토오스(fructose), 글루코오스(glucose)와 수크로오스(sucrose)의 3종이 검출되었으나 숙성 24시간 이후로부터는 수크로오스는 소실되고 2종만 검출되었다. 흑대추가 건대추보다 프럭토오스와 글루코오스 함량이 높고 수크로오스가 검출되지 않은 것은 흑대추의 제조 중에 수크로오스가 분해되어 일어나는 현상인 것으로 생각되며 생성된 프럭토오스와 글루코오스가 흑대추의 달콤한 맛을 내는데 결정적인 역할을 하는 것으로 사료된다. 흑대추의 총 유리당 함량은 370.10 mg/g 이였으나 숙성을 72시간 한 흑대추의 총 유리당 함량은 439.20 mg/g으로 증가한 것으로 나타났다. 건대추의 숙성과정 중 비휘발성 유기산의 함량변화를 표 4에 나타내었다. 건대추 중의 유기산은 6종이 검출되었고, 옥살산(oxalic acid) 함량이 436.08 mg/100g으로 가장 높고, 구연산(citric acid) 198.92 mg/100g, 젖산(lactic acid) 40.27 mg/100g, 피루브산(pyruvic acid) 22.03 mg/100g 순으로 함량이 높았다. 이들 유기산은 숙성 기간이 길어질수록 함량이 모두 증가하는 것으로 나타났다.
Figure pat00004
Figure pat00005
3. 숙성기간에 따른 흑대추 추출물의 총 폴리페놀 함량
폴리페놀 화합물은 식물계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물의 하나로서 항산화 작용, 항혈전 작용, 고지혈증 및 지방간 억제 작용 등의 활성을 가진다(27). 숙성 기간에 따른 건대추와 흑대추 추출물의 폴리페놀 함량은 표 5와 같다. 건대추의 에탄올 추출물에서 7.74 mg/g, 물 추출물에서 8.12 mg/g으로 나타났고 숙성에 의해 함량이 증가되어 에탄올 추출물에서는 72시간 숙성 조건에서 13.79 mg/g으로 가장 높은 폴리페놀 함량을 보였고, 물 추출물에서는 48시간 숙성 시 16.82 mg/g로 가장 높은 함량을 보였다. 에탄올 추출물보다는 물 추출물에서 함량이 전반적으로 높았으며 숙성 기간에 따른 큰 차이는 없었다. 건대추를 일정한 온도에서 숙성시키면 총 폴리페놀 함량이 증가되는 것은 대추 내 일부 성분이 이들 화합물로 전환되었거나 고온 처리 과정에서 폴리페놀성 화합물의 추출이 용이하기 때문인 것으로 사료된다.
Figure pat00006
4. 숙성기간에 따른 흑대추 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성
DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)는 아스코르브산(ascorbic acid), 토코페롤(tocopherol), 폴리히드록시(polyhydroxy) 방향족 화합물, 방향족 아민에 의해서 환원되어 짙은 자색이 탈색됨으로써 항산화 물질의 전자 공여능을 측정할 때 사용되고 있다(30). 전자 공여능 항산화 물질의 특징은 히드록시(hydroxy)기를 하나 이상 함유하고 있는 환(ring) 구조와 메틸기나 비극성 탄화수소 사슬 구조와 같은 비극성기를 가지고 있는 것이다. 식품에 함유되어 있는 폴리페놀계 물질이 이와 같은 분자 구조적 특징을 측정하는 대표적인 항산화 물질이다. DPPH 자유 라디칼(free radical) 소거 활성법을 이용한 건대추와 흑대추 추출물의 항산화력을 측정한 결과를 표 6에 나타내었다. 건대추 추출물의 IC50 값은 약 1 mg/mL정도인 것으로 나타났으나 숙성이 되어 흑대추가 되면 DPPH 라디칼 소거 활성이 증가하여 72시간 숙성 흑대추의 에탄올 추출물은 0.54 mg/mL, 물 추출물은 0.56 mg/mL으로 나타났다. 건대추에 비해 흑대추의 DPPH 라디칼 소거 활성이 높은 것은 숙성 과정에서 폴리페놀과 플라보노이드 함량의 증가와 갈변 물질의 생성에 기인한 것으로 사료된다.
Figure pat00007
5. 숙성기간에 따른 흑대추 추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성
ABTS와 포타슘 퍼설페이트(potassium persulfate)를 암소에 방치하여 ABTS+이 생성되면 시료의 항산화력에 의해 ABTS+이 소거되어 라디칼 특유의 청록색이 탈색되는데 이를 흡광도 값으로 나타내어 ABTS+의 소거 활성을 측정할 수 있다(32). 숙성 기간에 따른 건대추와 흑대추의 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정한 결과는 표 7과 같다. DPPH 라디칼 소거 활성과 유사한 결과가 나타났으며 숙성 기간이 길어질수록 활성이 증가하는 것으로 나타나 건대추 물 추출물의 IC50 값이 약 2 mg/mL인 것에 비해 72 시간 동안 숙성한 흑대추의 물 추출물의 IC50 값은 약 0.5 mg/mL로 나타났다.
Figure pat00008
6. 숙성기간에 따른 흑대추 추출물의 α- 글루코시다아제 저해 활성
당뇨병은 암 및 순환기 질환과 더불어 3대 질병의 하나로 지목되고 있다. α-글루코시다아제는 소장의 미세융모막(brush-border membrane)에 존재하는 소화효소로서 이당류나 다당류 형태의 탄수화물을 소화 흡수되기 위한 상태인 단당류로 가수분해하는 역할을 한다. α-글루코시다아제 저해제는 탄수화물 식이 후 혈당상승을 억제 할 수 있다(35). 숙성기간에 따른 흑대추의 α-글루코시다아제 저해 활성을 3.33 mg/mL의 농도에서 측정한 결과는 도 2와 같다. α-글루코시다아제 저해 활성은 전체적으로 물 추출물보다 70％ 에탄올 추출물에서 우수하였고 건대추의 물 추출물과 70％ 에탄올 추출물에서 활성이 각각 17.04％, 65.7％로 나타났다. 숙성 시간이 증가할수록 활성이 높아지는 경향이 나타나 숙성을 72시간 한 흑대추의 에탄올 추출물은 저해율이 80.69％로 나타났다. 당뇨병에서는 포도당과 자가산화, 단백질의 당화 등에 의해 자유 라디칼(free radical)을 생성하거나 다양한 산화적 스트레스와 조직의 산화적 손상이 유발될 수 있다(38). 따라서 α-글루코시다아제 저해 활성과 항산화 활성이 동시에 높을 때 당뇨병에 더욱 효과적이라고 추정되어 항산화 활성이 당뇨병 완화에 간접적인 도움을 줄 수 있을 것이라 사료된다.
7. NO 생성 억제 활성
내독소로 잘 알려진 리포폴리사카라이드(LPS, lipopolysaccharide)는 그람-음성균의 세포외막에 존재하며, Raw 264.7과 같은 대식세포 또는 단핵구에서 TNF-α, IL-6와 같은 친염증성 사이토카인들을 증가시키는 것으로 알려져 있다(59). 초기 염증반응에 관여하는 염증매개물질인 친염증성 사이토카인들의 형성은 포스포리파아제(phospholipase) A2의 활성으로 인해 아라키돈산(arachidonic acid)가 프로스타글란딘(prostaglandin)으로 바뀌는 과정 및 NO 등을 대량 생성함으로써 염증 매개에 큰 역할을 한다. LPS에 의해 활성화된 Raw 264.7 세포에 숙성 기간에 따른 흑대추 추출물을 100 μg/mL의 농도로 처리하여 NO 생성을 측정하였다(도 3). NO 생성 측정 결과, LPS 처리군에 비해 발효시간이 증가하면서 소거능이 높아짐을 확인하였다. 또한 에탄올 추출물이 물 추출물보다 No 소거능이 높은 것으로 나타났다.
8. 관능평가 결과
숙성기간에 따른 흑대추의 관능평가를 실시한 결과는 아래 표 8과 같다. 숙성기간 48시간째 전체적인 기호도가 가장 우수하였으며 특히 숙성 되면서 유기산등이 생성되면서 새콤한 맛이 나타나 숙성 48 시간에 단맛과 신맛의 비율이 가장 적절한 것으로 판단되었다.
Figure pat00009
고찰
건대추를 일정기간 숙성시켜 제조한 새로운 유형의 가공품인 흑대추의 이화학적 성분 분석과 항산화 활성을 평가하였다. 숙성 기간에 따른 흑대추 자체의 수분 함량은 증가하는 경향을 보였고 당도 역시 소량 증가하는 경향을 보였다. 숙성하는 동안 흑대추의 pH는 감소하여 산성화되었고 총 산도는 비휘발성 유기산류의 생성에 따라 증가하였다. 건 대추에서 흑대추로 변화되면서 색상은 붉은색에서 검은색으로 변해가 L, a, b 값이 모두 감소하였고 △E 값 역시 감소하였다. 건대추에서 유리당은 프럭토오스, 글루코오스, 수크로오스 3종이 검출되었으나 숙성 24 시간째 부터 수크로오스가 분해되어 글루코오스와 프럭토오스가 검출되었다. 숙성 기간에 따라 총 유리당 함량이 증가되는 경향을 보였다. 건대추에서의 유기산은 6종이 검출되었고 옥살산(oxalic acid) 함량이 436.08 mg/100g으로 가장 높았으며, 다음 순으로 구연산(citric acid)가 198.08 mg/100g으로 높았다. 숙성 기간이 증가될수록 검출된 모든 유기산의 함량은 증가하는 것으로 나타났다. 총 폴리페놀 함량은 건대추의 에탄올과 물 추출물에서 각각 7.74 mg/g과 8.12 mg/g으로 나타났고 숙성에 의해 함량이 증가되었고, 48시간 숙성한 흑대추의 물 추출물에서 16.82 mg/g으로 가장 높게 나타났다. 항산화 활성을 DPPH 라디칼 소거 활성법과 ABTS 라디칼 소거 활성법으로 측정하였다. 그 결과 숙성 기간에 따라 항산화 활성이 증가하였고 에탄올 추출물과 물 추출물은 비슷한 활성을 보였다. 72 시간 동안 숙성한 흑대추의 DPPH 라디칼과 ABTS 라디칼 소거 활성의 IC50값은 각각 0.54 mg/mL과 0.59 mg/mL로 나타났다. 건대추와 흑대추 추출물의 α-글루코시다아제 저해 활성을 3.33 mg/mL의 농도에서 측정한 결과 에탄올 추출물이 물 추출물 보다 활성이 우수하였고 숙성 기간에 따라 활성이 증가하는 경향을 보였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (11)

  1. 건조한 대추를 고온에서 숙성시키는 단계를 포함하는 흑대추의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 고온은 75-85℃의 온도인 것을 특징으로 하는 흑대추의 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 숙성은 24-72 시간 숙성시키는 것을 특징으로 하는 흑대추의 제조방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 숙성은 밀폐된 용기에서 행하는 것을 특징으로 하는 흑대추의 제조방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 흑대추는 신맛과 단맛의 적절하게 조화되어 관능성이 향상된 것임을 특징으로 하는 방법.
  6. 건조한 대추를 고온에서 숙성시키는 단계를 포함하는 대추에서 알파-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해 활성 및 항염증 활성을 갖는 생리활성성분을 강화시키는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 고온은 75-85℃의 온도인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 숙성은 48-72 시간 숙성시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 6 항에 있어서, 상기 숙성은 밀폐된 용기에서 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 흑대추의 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 개선용 기능성 식품 조성물.
  11. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 흑대추의 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 개선용 기능성 식품 조성물.
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