KR101756284B1 - 백삼복합방 추출물을 함유하는 염증성 질환 개선용 조성물 - Google Patents
백삼복합방 추출물을 함유하는 염증성 질환 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 염증성 질환 개선용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게 설명하면, 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있는 한편, 특히 기관지 염증 질환인 만성 기관지염(Chronic bronchitis) 및 천식(Asthma)의 개선을 위한 백삼복합방 추출물을 함유하는 염증성 질환 개선용 조성물에 관한 기술분야가 개시된다.
또한, 본 발명은 식물 종 중에서 추출한 천연 항염제로서, 백삼, 오미자, 맥문동, 길경, 감초로 구성된 백삼복합방 추출물을 유효성분으로 포함하여 세포의 생존능에 영향을 미치지 않고 산화질소(NO)를 감소시키는 효과와, 세포독성이 일어나지 않고, 약물에 대한 독성 및 부작용이 없어 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 체내에서 안정한 효과를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 식물 종 중에서 추출한 천연 항염제로서, 백삼, 오미자, 맥문동, 길경, 감초로 구성된 백삼복합방 추출물을 유효성분으로 포함하여 세포의 생존능에 영향을 미치지 않고 산화질소(NO)를 감소시키는 효과와, 세포독성이 일어나지 않고, 약물에 대한 독성 및 부작용이 없어 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 체내에서 안정한 효과를 얻을 수 있다.
Description
본 발명은 염증성 질환 개선용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게 설명하면, 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있는 한편, 특히 기관지 염증 질환인 만성 기관지염(Chronic bronchitis) 및 천식(Asthma)의 개선을 위한 백삼복합방 추출물을 함유하는 염증성 질환 개선용 조성물에 관한 기술분야이다.
염증성 질환은 염증을 주병변으로 하는 질병의 총칭으로서, 상기 염증은 외부의 물리·화학적 자극, 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염에 대한 생체의 방어 반응이다. 염증 반응은 선천성 면역 반응의 일부이며, 다른 동물에서처럼 인간의 선천성 면역 반응은 대식세포가 병원체에 특이적으로 존재하는 세포 표면의 패턴을 통해 비자기(non-self)로 인식하고 공격함으로써 시작된다. 염증 반응 시에는 염증 부위에 혈장이 축적되어 세균이 분비한 독성을 희석시키며, 혈류가 증가하고, 홍반, 통증, 부종, 발열 등의 증상이 수반되게 된다.
이러한 염증 반응에는 다양한 생화학적 현상이 관여하는데, 특히 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)와 다양한 프로스타글란딘(prostaglandins)의 생합성과 관련되는 사이클로옥시제나제(cyclooxygenase, COX)가 염증 반응의 중요한 매개체로 알려져 있다.
상기 NOS는 세 가지 이성질체가 존재하는데, 칼슘이나 카모듈린 의존성인 eNOS(내피성 NOS)와 nNOS(신경성 NOS), 그리고 LPS(lipopolysaccharide)와 같은 세균의 내독소나 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12과 같은 여러 염증성 사이토카인에 의해 유도되는 iNOS(유도성 NOS)가 있으며, L-아르기닌(L-arginine)으로부터 일산화질소(NO)를 생성한다.
eNOS나 nNOS에 의해 생성되는 일산화질소(NO)는 혈압 조절 작용, 신경 전달 작용, 학습, 기억 등과 관련된 다양한 생리 반응을 수행함으로써 인체의 항상성 유지에 중요한 역할을 하지만, iNOS에 의해 생성되는 일산화질소(NO)는 관절염, 패혈증, 조직이식거부반응, 자가면역질환, 신경세포의 사멸 등 다양한 염증성 질환에 관여하는 것으로 알려져 있다.(비특허문헌 1 및 2)
이러한 염증은 다양한 세포와 매개물질, 사이토카인들이 참여하는 복잡한 반응인 동시에 관절염, 알러지 등의 다양한 질환의 원인으로 작용하며, 최근에는 염증 관련 질환이 증가추세를 보이고 있어 치료제의 연구 및 개발도 함께 진행되고 있다.
특히, 최근 고도의 산업화에 따른 새로운 항원의 출현 및 대기오염, 중국발 황사, 미세먼지가 심각하여 기관지 염증 질환인 폐기종, 천식, 만성 기관지염 등이 급격히 증가하고 있는 추세이다.
한편, 상기 염증 반응을 감소시키기 위해 제약학적 제제를 투여하는 것은 통상적인 의료 관례이고, 이러한 특성을 가지는 물질은 항염증성으로 분류되며, 항염증성 약제는 광범위한 질병의 치료에 사용되고 있으나, 치료제로 사용되는 합성 약물들인 카르보시스테인(carbocysteine), N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine) 등은 화학적으로 불안정하며, 독성이 강하여 세포내 독성 등의 부작용 뿐만 아니라, 동일한 약제가 종종 상이한 질병의 치료에 사용되어 부작용을 공유하고 있고, 효능 역시 미비하며, 지속적인 처방에 따른 내성이 증가하는 문제도 발생하고 있다.
따라서, 염증 반응의 조절을 통하여 다양한 질병에 대한 치료가 가능할 것으로 예상되고 있지만, 부작용이 없고 우수한 항염 효능을 보유하는 물질의 필요성이 요구되고 있는 실정이며, 특히, 식물 종 중에서 항염 활성이 우수하고, 인체에 안전한 천연 항염제에 대한 연구가 요구되고 있다.
상기 식물 종 중에서 추출한 천연 항염제에 관한 일예로, 대한민국 공개특허 제2015-0142213호는 염증성 사이토카인 TNF-α의 활성을 감소 또는 억제시키는 활성이 우수하고, 세포의 생존능에 영향을 미치지 않고 산화질소(NO)를 감소시키는 효과가 우수하여 염증성 장질환의 예방 또는 치료할 수 있는 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 세포독성이 일어나지 않으며, 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 체내에서도 안정한 효과가 있는 삼백초 수용성 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환 예방 또는 치료용 조성물이 개시되어 있다.
본 발명은 상술한 종래기술에 따른 문제점을 해결하고자 안출된 기술로서, 종래의 연증성 질환을 예방 또는 치료하기 위한 합성 약물들인 카르보시스테인(carbocysteine), N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine) 등은 화학적으로 불안정하고, 독성이 강하여 세포내 독성 등의 부작용 뿐만 아니라, 동일한 약제가 종종 상이한 질병의 치료에 사용되어 부작용을 공유하고 있으며, 효능 역시 미비한 문제가 발생하여, 세포독성이 없고, NO 생성을 억제하는 백삼복합방 추출물을 함유하는 염증성 질환 개선용 조성물을 통하여 제공하는 것을 주된 목적으로 하는 것이다.
본 발명은 상기와 같은 소기의 목적을 실현하고자, 백삼(白蔘, Erycibae Caulis), 오미자(五味子, Schisandrae Fructus), 맥문동(麥門冬, Liriopis Tuber), 길경(佶梗, Platycodi Radix), 감초(甘草, Glycyrrhizae Radixet Rhizoma), 수세미오이(Smooth Loofah)를 혼합한 혼합물의 추출물을 유효성분으로 포함하되,
상기 추출물은
혼합물에 증류수를 넣고, 95~100℃의 온도에서 10시간 동안 환류 추출한 후 여과액을 100 ㎍/㎖ 이하의 농도가 되도록 감압 농축하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 백삼복합방 추출물을 함유하는 염증성 질환 개선용 조성물을 제시한다.
상기 추출물은
혼합물에 증류수를 넣고, 95~100℃의 온도에서 10시간 동안 환류 추출한 후 여과액을 100 ㎍/㎖ 이하의 농도가 되도록 감압 농축하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 백삼복합방 추출물을 함유하는 염증성 질환 개선용 조성물을 제시한다.
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상기와 같이 제시된 본 발명에 의한 백삼복합방 추출물을 함유하는 염증성 질환 개선용 조성물은 식물 종 중에서 추출한 천연 항염제로서, 백삼, 오미자, 맥문동, 길경, 감초로 구성된 백삼복합방 추출물을 유효성분으로 포함하여 세포의 생존능에 영향을 미치지 않고 산화질소(NO)를 감소시키는 효과와, 세포독성이 일어나지 않고, 약물에 대한 독성 및 부작용이 없어 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 체내에서 안정한 효과를 얻을 수 있다.
본 발명은 염증성 질환 개선용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게 설명하면, 식물 종 중에서 추출한 천연 항염제인 백삼복합방 추출물을 함유하여 세포의 생존능에 영향을 미치지 않고 산화질소(NO)를 감소시키며 세포독성이 일어나지 않는 한편, 약물에 대한 독성 및 부작용이 없어 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있을 뿐만 아니라 체내에서 안정하며 효능이 우수한 백삼복합방 추출물을 함유하는 염증성 질환 개선용 조성물에 관한 기술분야이다.
본 발명에서 사용되는 백삼복합방은 4년근 이상의 수삼(水蔘)을 원료로하여 표피를 제거한 후 건조하여 수분함량이 14% 이하가 되도록 가공한 백삼(白蔘, Erycibae Caulis)과 오미자(五味子, Schisandrae Fructus), 맥문동(麥門冬, Liriopis Tuber), 길경(佶梗, Platycodi Radix), 감초(甘草, Glycyrrhizae Radixet Rhizoma)를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 백삼복합방은 수세미오이(Smooth Loofah)를 더 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
부가하여 설명하면, 상기 백삼(白蔘)은 인삼의 잔뿌리(미(尾))를 버리고 몸통만 말린것으로서, 홈삼보다 사포닌의 함유량이 높은 것으로 알려져 있고, 상기 사포닌은 스테로이드, 스테로이드알카로이드 혹은 트리텔펜(triterpene)의 배당체로, 물에 녹아 비누식의 발포작용을 나타내는 물질의 총칭이며, 인체의 면역력을 높이는 성분으로 알려져 있다.
특히, 인삼에 함유된 사포닌 종류인 진세노사이드(ginseoside)와 엘루테로사이드(eleutheroside)가 유명하다. 부가하여 설명하면, 사포닌은 항암효과가 있다는 연구 결과가 있고, 백내장과 관련된 실험에서도 인삼 사포닌은 우수한 효과를 거둔 것으로 나타났으며, 삼에 포함된 사포닌은 여러 종류의 사포닌이 많이 함유되어 있을 뿐만 아니라 물에 잘 녹기 때문에 몸에 흡수가 잘되어 건강식품에 많이 첨가되어 식음되고 있다.
아울러, 상기 오미자(五味子)는 다양한 효능이 있는데, 그 효능으로는 대뇌피질 흥분작용, 혈압 강하작용, 거담, 진해 작용, 호흡 흥분 작용, 강심작용, 당 대사 촉진과 당분해작용, 세포 면역 기능 증강작용, 자궁 흥분 작용, 담즙 분비 촉진 작용, 위액 분비 조절 작용, 억균작용이 알려져 있다.
또한, 상기 맥문동(麥門冬)은 난과 비슷하게 생긴 관상식물의 뿌리를 일컫는 것으로서, 폐, 심, 위 삼경에 들어가 폐위의 음부족을 해결해서 진액을 만들어 건조함을 없애주기 때문에 피를 토하는 증상, 건조한 기침 및 가래 증상, 입이 마른 증상, 장이 건조해서 생긴 변비 등의 증상을 치료하는데 사용되고, 특히 호흡기 질환 즉, 기관지 염증에 효능이 있다고 알려져 있다.
또한, 상기 길경(佶梗)은 초롱꽃과의 도라지의 뿌리 또는 주피를 제거하여 만든 약재로서, 폐에 작용하여 해수와 가래가 많고 호흡이 불편한 증상을 치료하고, 폐를 맑게 하고 답답한 가슴을 풀어주며 뱃속의 찬 기운을 풀어주어 기침을 멈추고 담을 없앤다고 알려져 있다. 아울러, 인후통, 감기로 인한 기침, 가래, 코막힘, 천식, 기관지 염증, 흉막염, 두통, 오한, 편도선염 등에 사용하고, 약리작용으로 거담작용, 혈당강하작용, 콜레스테롤 강하작용, 개선균억제작용이 보고되어 있다.
또한, 상기 감초(甘草)는 글리시리진산, 글리브리딘, 사포나레틴 플라보노이드인 리쿠라시드, 플라보노이드 및 트리펜계 사포닌 등의 성분을 포함하고, 상기 성분들은 콜레스테롤을 감소시켜 동맥경화를 개선시키며, 항산화력을 발휘하여 항암효과를 가지고 있는 한편, 멜라린 생성 억제효과를 발휘하는 것으로 알려져 있다.
아울러, 상기 감초는 모든 약의 독성을 조화시켜 약효가 잘 나타나게 하며 장부의 한열과 사기를 다스리고 모든 혈맥의 소통을 잘 시키며 근육과 뼈를 튼튼하게 한다고도 알려져 있다.
또한, 상기 수세미오이는 열매의 섬유질을 수세미로 이용하여 흔히 수세미라고 줄여서 부르는 것으로서, 잦은 기침, 가래를 완화시키며 천식에 좋은 효능을 가지고 있고, 축농증, 비염 등 코관련 질환 완화에도 효능이 있다고 알려져 있다.
한편, 본 발명에서 언급되는 염증성 질환은 외부자극, 화학적 자극, 감염 및 외부 물질의 침투에 의해서 일어나는 염증 반응을 수반하고, 그 증상으로서 통증, 체온상승, 붉어짐, 종창, 기능 저하 또는 이들의 조합 반응으로 나타나는 질환을 의미한다.
염증성 질환의 예로는 지속적인 염증을 특징으로 하는 알레르기, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 죽상경화증, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 염증성 위장 질환(크론병과 궤양 결장염을 포함), 건선, 알레르기성 비염, 피부 경화증, 자기면역 갑상선 질환, 면역-매개(타입 1) 당뇨병 및 루퍼스 등과 같은 질환이 있으며, 염증을 유발하는 다른 자기면역 질환 예를 들어 중증 근육무력증, 자기면역 신경병, 자기면역간염, 자기면역 난소염, 부신의 자기면역 질환, 다발근육염, 피부근육염, 척추관절병증 등을 포함한다.
특히, 본 발명은 상기 염증성 질환 중 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 만성 기관지염 등의 기관지 염증 질환에 탁월한 효능을 발휘할 수 있다.
본 발명에서 언급되는 예방은 본 발명의 약학적 조성물의 투여에 의해 염증의 증상을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 치료는 본 발명의 약학적 조성물의 투여에 의해 염증에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
상기와 연관하여, 본 발명의 백삼복합방 추출물은 앞서 설명된 백삼 외에 오미자, 맥문동, 길경, 감초 및 수세미오이를 1:1:1:1:1:1로 혼합한 혼합물로부터 액체의 용매를 사용하여 추출된 유효성분이고, 상기 용매는 식물 종에 포함된 유효성분이 변형되거나 손상될 수 있기 때문에 증류수를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 백삼복합방 추출물을 추출하는 방법은 상기 혼합물에 증류수를 넣고, 95~100℃의 온도에서 10시간 동안 환류 추출한 후 여과액을 감압 농축하여 용액을 얻는다. 상기 농축된 용액을 동결건조하여 분말을 수득하고, 수득된 분말은 초저온 냉동고(-80℃)에서 보관하며, 이후에 설명될 실시예 및 실험예에서는 필요한 농도록 증류에서 희석해 사용한다.
아울러, 본 발명의 백삼복합방 추출물은 염증의 치료효과 여부의 지표가 되는 산화질소(NO)의 생성 및 작용을 억제할 수 있음과 동시에 세포 독성이 없어, 염증성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
부가하여 설명하면, 본 발명의 조성물은 100 ㎍/㎖ 이하의 농도로 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있고, 투여를 위하여 백삼복합방 추출물 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있고, 상기 담체, 부형제 및 희석제는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 중 어느 하나 또는 어느 하나 이상의 혼합물을 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.
보다 상세하게 설명하면, 본 발명의 약학적 조성물은 제형화 할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다.
상기 경구형 제형 중 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 이러한 고형제제는 상기 버들말즘 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조될 수 있고, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
아울러, 경구형 제형을 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 제조될 수 있다.
상기와 연관하여, 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함하고, 상기 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으며, 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
즉, 본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여, 예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용할 수 있고, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있음은 자명할 것이다.
이하, 하기 실시예(실험예)에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것이 아님은 자명할 것이다.
1. 재료 및 시험 준비
본 발명의 실험에 사용한 백삼복합방(Ginseng Complex Extract, 이하, 'GCE'라 한다.)의 구성 약재들은 (주)옴니허브에서 구입하였고, 백삼 50g, 오미자 50g, 맥문동 50g, 길경 50g, 감초 50g인 1첩을 준비한다.
1) 실험동물의 사양 및 관리
실험동물인 수컷 6주령의 BALB/c 수컷 생쥐(20∼22 g)를 ㈜라온바이오에서 공급 받았으며 실험 당일까지 충분한 고형사료 (㈜퓨리나)와 물을 공급하고 온도 22 ± 2℃, 습도 55 ± 15%, 12시간-12시간(light-dark cycle)의 환경에서 2주간 적응시킨 뒤 실험에 사용하였다.
2) 시약
사용된 시약은 dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS : Welgene, Korea), ether (Sigma Co., U.S.A.), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM : Gibco BRL Co., U.S.A.), 우태아혈청 (fetal bovine serum: FBS, Invitrogen Co., U.S.A.), formaldehyde (Sigma Co., U.S.A.), trypan blue (Sigma Co., U.S.A.), Mouse cytokine milliplex map immunoassay kit (Millipore Co., U.S.A.), Mouse Eotaxin ELISA kit (My Biosource Co., U.S.A.), Mouse OVA specific IgE ELISA kit (Biolegend Co., U.S.A.), Mouse serum Anti-OVA IgE Antibody (eBioscience Co., U.S.A.), Armenian Hamster anti Mouse CD3e PE (BD-Pharmingen CO., U.S.A.), Rat anti Mouse CD45R(B220) PE (BD-Pharmingen CO., U.S.A.), Rat anti Mouse IgE FITC (BD-Pharmingen CO., U.S.A.), Rat anti Mouse CD45 FITC (BD-Pharmingen CO., U.S.A.), Rat anti Mouse CD22 FITC (BD-Pharmingen CO., U.S.A.), Diff-Quick stain set (Sysmex Co., U.S.A), Albumin from chicken egg white (Sigma Co., U.S.A), Aluminium hydroxigen gel (Sigma Co., U.S.A) 등을 사용하였다.
3) 기기
사용된 기기는 rotary vacuum evaporator (Buchi B-480 Co., Switzerland), freeze dryer (EYELA FDU-540 Co., Japan), clean bench (Vision scientific Co., Korea), autoclave (Sanyo Co., Japan), vortex mixer (Vision scientific Co., Korea), centrifuge (Sigma Co., U.S.A.), deep-freezer (Sanyo Co., Japan), ice-maker (Vision scientific Co., Korea), plate shaker (Lab-Line Co., U.S.A.), ELISA reader (Molecular Devices Co., U.S.A.), 유세포 분석기 (Flow cytometer, Becton Dickinson, Co., U.S.A.), Luminex (Millipore Co., U.S.A.) 등을 사용하였다.
2. 실험방법
1) 시료 추출
GCE 1첩(250 g)에 DW 4.5 L를 넣어 97℃에서 10시간 동안 환류추출을 한 후 여과액을 rotary vacuum evaporator로 감압 농축하였다. 농축된 용액을 freeze dryer로 동결 건조하여 분말을 얻었고, 얻어낸 분말을 초저온 냉동고(-80℃)에서 보관하며 실험에 필요한 농도로 증류수에 희석해 사용하였다.
2) 안전성 검사
(1) 간 기능
혈청 내의 ALT 활성도를 측정하기 위해서 실험 종료 후에 심장 천자법을 이용하여 혈액을 채취하였다. 30분간 상온에서 굳힌 혈액을 3,000 rpm에서 15분간 원심분리한 뒤 혈청을 분리하여 분석하였다.
(2) 신장 기능
혈청 내에서 creatinine, BUN 활성도를 측정하기 위해 실험 종료 후 심장 천자법을 이용하여 혈액을 채취하였다. 혈액을 30분간 상온에서 굳힌 뒤 3,000 rpm에서 15분간 원심분리 후 혈청을 분리하여 분석하였다.
3) 난알부민-유도 천식 마우스 모델 제작 및 약물 처리
알레르기성 천식 동물모델을 제작하기 위해 먼저, 난알부민(ovalbumin, chicken egg albumin; OVA) 1 ㎎을 PBS와 수산화알루미늄 겔[Al(OH)3 gel]을 1:1 비율로 혼합한 용액을 0.3 ㎖씩 실험 시작일로부터 7일 간격으로 하루에 1번 0일, 7일, 14일에 마우스에게 복강으로 주사하였다. 또한 마지막 복강 주사 7일 후인 21일부터 마우스를 50x15x50 ㎝ 크기의 아크릴상자 안에 넣고 2 ㎎/㎖ OVA용액을 네블라이저(nebulizer)기기를 이용하여 격일 간격으로 1일 3회(각 15분씩 3회) 21, 23, 25, 27, 29일에 분사함으로써 호흡을 통한 천식을 유발하였다. 실험군은 아무것도 처리하지 않는 정상군과 천식 유발 후 DW만을 경구 투여하는 대조군, GCE를 100 ㎎/㎏(이하, GCE 100)과 300 ㎎/㎏(으로 제조한 약물을 경구 투여하는 실험군으로 그룹을 나누어 2주간 진행하였다.
4) 혈액 내 면역 세포 측정
실험 종료 후 심장 천자법을 이용하여 채혈한 전형을 백혈구와 호중구, 림프구, 단핵구의 함량을 분석하였다.
5) 혈청 내 cytokine 생성량 측정
실험을 종료한 후 ethyl ether로 마취한 상태에서 심장 천자법으로 채혈한 다음 15분간 3,000 rpm에서 원심 분리해서 혈청을 분리하였다. IL-1β, IL-6, TNF-α 농도를 custom-made 6-plex cytokine Milliplex panel을 이용해서 다음과 같이 측정하였다. 50배 희석한 혈청 25 ㎕씩 각 well에 분주하고 matrix buffer, assay buffer 및 antibody-immobilized beads를 각 25 ㎕ 가해 혼합한 뒤 2시간 동안 실온에서 반응시키고 2회에 걸쳐 washing 완충 용액을 이용해 세척하였다. 이에 다시 25 ㎕의 detection antibody를 가해 1시간 동안 실온에서 암소 반응시켰고 추가로 25 ㎕의 Streptavidin-Phycoerythrin을 가해 30분 동안 실온에서 반응시킨 뒤 washing 완충 용액을 이용해 2회 세척하였다. 세척 후 PBS를 150 ㎕ 넣어 5분 간 shaking한 후 Luminex를 이용해 측정하였다.
6) 혈청 내 난알부민-특이 IgE 생성량 측정
실험을 종료한 후 ethyl ether로 마취한 상태에서 심장 천자법으로 채혈한 다음 15분간 3,000 rpm에서 원심 분리해서 혈청을 분리하였다. 혈청으로부터 난알부민-특이 IgE 항체의 농도를 측정하기 위해 ELISA 방법을 수행하였다. 먼저 96-well flatbottom ELISA plate에 0.1 M sodium carbonate 용액으로 희석한 capture antibody(1:250)를 100 ㎕씩 넣은 후 4℃에서 하룻밤 반응시킨 후 washing buffer로 3회 세척하였다. 각 well에 10% fetal bovine serum(FBS)이 함유된 PBS를 넣고 실온에서 1시간 동안 정치함으로써 blocking한 후 혈청을 100 ㎕ 씩 넣어 실온에서 2시간 반응시켰다. 이를 다시 5회 washing buffer로 세척한 다음 peroxidase가 결합된 HRP-conjugated goat anti-mouse IgG 항체를 넣고 실온에서 1시간 반응시켰다. 다시 plate를 5회 세척한 다음 각 well에 기질용액인 TMB를 넣어 10분 동안 암실상태에서 반응시킴으로써 발색을 유도하였다. 반응이 끝난 후 각 well에 정지액을 50 ㎕씩 넣어 효소반응을 정지시킨 후 microplate reader의 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 혈청 내 IgE의 농도는 표준용액의 정량곡선을 기준으로 계산하였다.
7) 폐와 기관지 폐포세척액(BALF) 내 세포분리
실험 종료 후 목 부분을 해부하였다. 폐포 세척액으로부터 세포를 분리하기 위해 10% FBS/DMEM 배양액 1 ㎍/㎖을 넣은 주사기를 기관지 (trachea)에 주입시키고 끈으로 묶어 고정한 후 3회 순환 시켜 분리하고 ACK 용액을 37℃에서 5분 동안 처리하여 적혈구를 용해시켰다. 이를 다시 배지로 세척한 후 0.04% trypan blue로 염색한 후 총세포수를 측정하였다.
8) 유세포 분석
분리한 BALF 세포를 5x105 세포수로 조정한 후 4℃에서 면역 형광염색(immunofluorescence staining)을 실시하였다. 각각에 anti-CD3e-PE, anti-B220-PE, anti-IgE-FITC anti-CCR3-PE, anti-CD69-FITC, anti-CD45-FIT, anti-CD22-FITC를 넣고 30 분간 얼음에서 반응시켰다. 반응 후 3회 이상 인산완충 생리식염수로 수세한 후 flow cytometer의 Cell Quest 프로그램을 이용하여 CD3+/CD69+, CCR3+, B220+/CD22+, B220+/IgE+, B220+/CD45+ 세포수를 백분율 (%)로 분석한 후 총세포수를 적용하여 각 조직에서의 절대 세포수 (absolute number)를 산출하였다.
3. 통계처리
실험 결과는 SPSS 11.0의 unpaired student's T-test와 ANOVA를 사용하여 통계처리 하였고 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001 수준에서 그 유의성을 검정하였다.
<실험결과>
1. 안전성 검사
1) 간 기능 Alanine aminotransferase (ALT)에 미치는 영향
간 기능을 확인하기 위해 그 지표 성분인 ALT를 측정하였다. 정상군은 9.7±1.5 IU/L, 대조군은 10.0±1.0 IU/L을 나타낸 반면, GCE 100은 12.6±0.4 IU/L, GCE 300은 9.5±0.7 IU/L로 나타나, 정상군과 차이를 나타내지 않아 안전한 것으로 확인되었다(Fig. 1).
Fig. 1. Effect of GCE 100 and 300 on the ALT of serum in OVA-induced asthma mice. Asthma mice model followed by the administration of GCE 100 and 300 for 2 weeks. The results were presented by the mean ± standard deviation
Normal : Non treated BALB/c mice
Control : OVA-induced asthma mice group were treated orally with DW
GCE 100 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 100 ㎎/㎏/day
GCE 300 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 300 ㎎/㎏/day
2) 신장 기능에 미치는 영향
(1) Creatinine (Cr)
신장 기능을 확인하기 위해 그 지표 성분인 creatinine 농도를 측정하였다. 정상군은 1.0±0.1 ㎎/㎗, 대조군은 1.0±0.1 ㎎/㎗을 나타낸 반면, GCE 100은 0.9±0.1 ㎎/㎗, GCE 300은 0.9±0.1 ㎎/㎗로 나타나, 정상군과 차이를 나타내지 않아 안전한 것으로 확인되었다(Fig. 2).
Fig. 2. Effect of GCE 100 and 300 on the creatinine of serum in OVA-induced asthma mice. Asthma mice model followed by the administration of GCE 100 and 300 for 2 weeks. The results were presented by the mean ± standard deviation
Normal : Non treated BALB/c mice
Control : OVA-induced asthma mice group were treated orally with DW
GCE 100 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 100 ㎎/㎏/day
GCE 300 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 300 ㎎/㎏/day
(2) Blood urea nitrogen (BUN)
신 기능을 확인하기 위해 그 지표 성분인 BUN 농도를 측정하였다. 정상군은 37.6±3.2 ㎎/㎗, 대조군은 33.3±2..1 ㎎/㎗을 나타낸 반면, GCE 100은 36.3±2.1 ㎎/㎗, GCE 300은 34.0±2.6 ㎎/㎗로 나타나, 정상군과 차이를 나타내지 않아 안전한 것으로 확인되었다(Fig. 3).
Fig. 3. Effect of GCE 100 and 300 on the BUN of serum in OVA-induced asthma mice. Asthma mice model followed by the administration of GCE 100 and 300 for 2 weeks. The results were presented by the mean ± standard deviation
Normal : Non treated BALB/c mice
Control : OVA-induced asthma mice group were treated orally with DW
GCE 100 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 100 ㎎/㎏/day
GCE 300 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 300 ㎎/㎏/day
2. 혈액 내 면역세포에 미치는 영향
1) 백혈구
실험 종료 후 혈액 내 백혈구를 측정한 결과, 정상군은 1.4±0.2 ×103cells/㎕, 대조군은 2.8±0.3 ×103cells/㎕로 나타낸 반면, GCE 100은 2.6±0.5 ×103cells/㎕, GCE 300은 2.2±0.4 ×103cells/㎕로 나타나, GCE 100과 300은 대조군에 비해 감소하였다(Fig. 4).
Fig. 4. Effect of GCE 100 and 300 on the level of WBC in the blood of OVA-induced asthma mice. Asthma mice model followed by the administration of GCE 100 and 300 for 2 weeks. The results were represent the mean ± standard deviation.
Normal : Non treated BALB/c mice
Control : OVA-induced asthma mice group were treated orally with DW
GCE 100 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 100 ㎎/㎏/day
GCE 300 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 300 ㎎/㎏/day
2) 호중구
실험 종료 후 혈액 내 호중구를 측정한 결과, 정상군은 29.8±2.8%, 대조군은 33.3±3.2%로 나타낸 반면, GCE 100은 27.3±2.4%, GCE 300은 26.3±3.8%로 나타나, 대조군에 비해 감소하였다(Fig. 5).
Fig. 5. Effect of GCE 100 and 300 on the level of neutrophil in the blood of OVA-induced asthma mice. Asthma mice model followed by the administration of GCE 100 and 300 for 2 weeks. The results were represent the mean ± standard deviation.
Normal : Non treated BALB/c mice
Control : OVA-induced asthma mice group were treated orally with DW
GCE 100 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 100 ㎎/㎏/day
GCE 300 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 300 ㎎/㎏/day
3) 림프구
실험 종료 후 혈액 내 림프구를 측정한 결과, 정상군은 39.9±4.9%, 대조군은 65.5±4.4%로 나타낸 반면, GCE 100은 55.5±1.9%, GCE 300은 56.6±2.9%로 나타나, 대조군에 비해 감소하였다(Fig. 6).
Fig. 6. Effect of GCE 100 and 300 on the level of lymphocyte in the blood of OVA-induced asthma mice. Asthma mice model followed by the administration of GCE 100 and 300 for 2 weeks. The results were represent the mean ± standard deviation.
Normal : Non treated BALB/c mice
Control : OVA-induced asthma mice group were treated orally with DW
GCE 100 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 100 ㎎/㎏/day
GCE 300 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 300 ㎎/㎏/day
4) 단핵구
실험 종료 후 혈액 내 단핵구를 측정한 결과, 정상군은 0.9±0.1%, 대조군에서는 2.9±0.2%로 나타낸 반면, GCE 100은 2.3±0.4%, GCE 300은 2.2±0.6%로 나타나, 대조군에 비해 감소하였다(Fig. 7).
Fig. 7. Effect of GCE 100 and 300 on the level of monocyte in the blood of OVA-induced asthma mice. Asthma mice model followed by the administration of GCE 100 and 300 for 2 weeks. The results were represent the mean ± standard deviation.
Normal : Non treated BALB/c mice
Control : OVA-induced asthma mice group were treated orally with DW
GCE 100 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 100 ㎎/㎏/day
GCE 300 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 300 ㎎/㎏/day
3. 혈청 내 cytokine 생성량에 미치는 영향
1) IL-1β
실험 종료 후 혈청 내 IL-1β cytokine을 측정한 결과, 정상군은 4.6±4.6 pg/㎖, 대조군은 34.9±6.1 pg/㎖로 나타낸 반면, GCE 100은 29.6±4.7 pg/㎖, GCE 300은 13.4±1.2 pg/㎖로 나타나, GCE 300은 대조군에 비해 유의성 있게 (** : p<0.01) 감소하였다(Fig. 8).
Fig. 8. Effect of GCE 100 and 300 on the level of IL-1β in the serum of OVA-induced asthma mice. Asthma mice model followed by the administration of GCE 100 and 300 for 2 weeks. The results were represent the mean ± standard deviation. (Significance of results, ** : p<0.01 compare to control).
Normal : Non treated BALB/c mice
Control : OVA-induced asthma mice group were treated orally with DW
GCE 100 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 100 ㎎/㎏/day
GCE 300 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 300 ㎎/㎏/day
2) IL-6
실험 종료 후 혈청 내 IL-6 cytokine을 측정한 결과, 정상군은 785.9±23.3 pg/㎖, 대조군은 6356.4±210.4 pg/㎖로 나타낸 반면, GCE 100은 5573.6±121.0 pg/㎖, GCE 300은 5245.7±283.4 pg/㎖로 나타나, 대조군에 비해 감소하였다(Fig. 9).
Fig. 9. Effect of GCE 100 and 300 on the level of IL-6 in the serum of OVA-induced asthma mice. Asthma mice model followed by the administration of GCE 100 and 300 for 2 weeks. The results were represent the mean ± standard deviation.
Normal : Non treated BALB/c mice
Control : OVA-induced asthma mice group were treated orally with DW
GCE 100 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 100 ㎎/㎏/day
GCE 300 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 300 ㎎/㎏/day
3) TNF-α
실험 종료 후 혈청 내 TNF-α cytokine을 측정한 결과, 정상군은 1345.4±77.5 pg/㎖, 대조군은 9981.4±250.1 pg/㎖로 나타낸 반면, GCE 100은 7457.5±318.6 pg/㎖, GCE 300은 6998.4±106.1 pg/㎖로 나타나, GCE 100과 300은 대조군에 비해 유의성 있게 (** : p<0.01) 감소하였다(Fig. 10).
Fig. 10. Effect of GCE 100 and 300 on the level of TNF-α in the serum of OVA-induced asthma mice. Asthma mice model followed by the administration of GCE 100 and 300 for 2 weeks. The results were represent the mean ± standard deviation. (Significance of results, ** : p<0.01 compare to control).
Normal : Non treated BALB/c mice
Control : OVA-induced asthma mice group were treated orally with DW
GCE 100 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 100 ㎎/㎏/day
GCE 300 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 300 ㎎/㎏/day
4. 혈청 내 난알부민 특이-IgE 생성 억제 효과
실험 종료 후 혈청 내 난알부민 특이-IgE를 측정한 결과, 정상군은 1.7±0.6 ng/㎖, 대조군은 11.8±0.8 ng/㎖로 나타낸 반면, GCE 100은 9.4±0.4 ng/㎖, GCE 300은 7.8±0.5 ng/㎖로 나타나, GCE 100과 300은 대조군에 비해 유의성 있게 (** : p<0.01, * : p<0.05) 감소하였다(Fig. 11).
Fig. 11. Effect of GCE 100 and 300 on the level of OVA-specific IgE in the serum of OVA-induced asthma mice. Asthma mice model followed by the administration of GCE 100 and 300 for 2 weeks. The results were represent the mean ± standard deviation. (Significance of results, ** : p<0.01, * : p<0.05 compare to control).
Normal : Non treated BALB/c mice
Control : OVA-induced asthma mice group were treated orally with DW
GCE 100 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 100 ㎎/㎏/day
GCE 300 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 300 ㎎/㎏/day
5. BALF 내 총 세포수에 미치는 영향
실험 종료 후 BALF 내 총 세포수를 측정한 결과, 정상군은 0.8±0.2 ×105cells, 대조군은 6.2±0.2 ×105cells로 나타낸 반면, GCE 100은 4.5±0.7 ×105cells, GCE 300은 2.7±0.5 ×105cells로 나타나, GCE 100과 300은 대조군에 비해 유의성 있게 (** : p<0.01, * : p<0.05) 감소하였다(Fig. 12).
Fig. 12. Effect of GCE 100 and 300 on total cells in BALF of OVA-induced asthma mice. Asthma mice model followed by the administration of GCE 100 and 300 for 2 weeks. The results were expressed as mean ± standard deviation (Significance of results, ** : p<0.01, * : p<0.05 compare to control).
Normal : Non treated BALB/c mice
Control : OVA-induced asthma mice group were treated orally with DW
GCE 100 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 100 ㎎/㎏/day
GCE 300 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 300 ㎎/㎏/day
6. BALF 내 면역 세포에 미치는 영향
1) CD3+/CD69+
실험 종료 후 BALF 내 CD3+/CD69+를 측정한 결과, 정상군은 0.2±0.1 ×103cells, 대조군은 23.9±1.4 ×103cells로 나타낸 반면, GCE 100은 11.6±2.4 ×103cells, GCE 300은 7.8±1.9 ×103cells로 나타나, GCE 100과 300은 대조군에 비해 유의성 있게 (*** : p<0.001, ** : p<0.01) 감소하였다(Fig. 13).
Fig. 13. Effect of GCE 100 and 300 on CD3+/CD69+ absolute cell number in BALF of OVA-induced asthma mice. Asthma mice model followed by the administration of GCE 100 and 300 for 2 weeks. The results were expressed as mean ± standard deviation (Significance of results, *** : p<0.001, ** : p<0.01 compare to control).
Normal : Non treated BALB/c mice
Control : OVA-induced asthma mice group were treated orally with DW
GCE 100 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 100 ㎎/㎏/day
GCE 300 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 300 ㎎/㎏/day
2) CCR3+
실험 종료 후 BALF 내 CCR3+를 측정한 결과, 정상군은 0.5±0.1 ×103cells, 대조군은 30.9±3.6 ×103cells로 나타낸 반면, GCE 100은 20.4±3.3 ×103cells, GCE 300은 17.5±4.7 ×103cells로 나타나, GCE 100과 300은 대조군에 비해 유의성 있게 (** : p<0.01) 감소하였다(Fig. 14).
Fig. 14. Effect of GCE 100 and 300 on CCR3+ absolute cell number in BALF of OVA-induced asthma mice. Asthma mice model followed by the administration of GCE 100 and 300 for 2 weeks. The results were expressed as mean ± standard deviation (Significance of results, ** : p<0.01 compare to control).
Normal : Non treated BALB/c mice
Control : OVA-induced asthma mice group were treated orally with DW
GCE 100 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 100 ㎎/㎏/day
GCE 300 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 300 ㎎/㎏/day
3) B220+/CD22+
실험 종료 후 BALF 내 B220+/CD22+를 측정한 결과, 정상군은 0.6±0.1 ×103cells, 대조군은 20.4±3.1 ×103cells로 나타낸 반면, GCE 100은 8.0±0.4 ×103cells, GCE 300은 6.8±0.7 ×103cells로 나타나, GCE 100과 300은 대조군에 비해 유의성 있게 (*** : p<0.001) 감소하였다(Fig. 15).
Fig. 15. Effect of GCE 100 and 300 on B220+/CD22 absolute cell number in BALF of OVA-induced asthma mice. Asthma mice model followed by the administration of GCE 100 and 300 for 2 weeks. The results were expressed as mean ± standard deviation (Significance of results, *** : p<0.001 compare to control).
Normal : Non treated BALB/c mice
Control : OVA-induced asthma mice group were treated orally with DW
GCE 100 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 100 ㎎/㎏/day
GCE 300 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 300 ㎎/㎏/day
4) B220+/IgE
실험 종료 후 BALF 내 B220+/IgE를 측정한 결과, 정상군은 0.1±0.1 ×103cells, 대조군은 9.3±1.0 ×103cells로 나타낸 반면, GCE 100은 5.6±0.7 ×103cells, GCE 300은 4.3±0.3 ×103cells로 나타나, GCE 100과 300은 대조군에 비해 유의성 있게 (* : p<0.05) 감소하였다(Fig. 16).
Fig. 16. Effect of GCE 100 and 300 on B220+/IgE absolute cell number in BALF of OVA-induced asthma mice. Asthma mice model followed by the administration of GCE 100 and 300 for 2 weeks. The results were expressed as mean ± standard deviation (Significance of results, * : p<0.05 compare to control).
Normal : Non treated BALB/c mice
Control : OVA-induced asthma mice group were treated orally with DW
GCE 100 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 100 ㎎/㎏/day
GCE 300 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 300 ㎎/㎏/day
5) B220+/CD45+
실험 종료 후 BALF 내 B220+/CD45+를 측정한 결과, 정상군은 0.4±0.1 ×103cells, 대조군은 16.9±2.5 ×103cells로 나타낸 반면, GCE 100은 12.6±0.9 ×103cells, GCE 300은 11.8±1.1 ×103cells로 나타나, GCE 100과 300은 대조군에 비해 유의성 있게 (* : p<0.05) 감소하였다(Fig. 17).
Fig. 17. Effect of GCE 100 and 300 on B220+/CD45+ absolute cell number in BALF of OVA-induced asthma mice. Asthma mice model followed by the administration of GCE 100 and 300 for 2 weeks. The results were expressed as mean ± standard deviation (Significance of results, * : p<0.05 compare to control).
Normal : Non treated BALB/c mice
Control : OVA-induced asthma mice group were treated orally with DW
GCE 100 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 100 ㎎/㎏/day
GCE 300 : OVA-induced asthma mice group were treated orally with GCE 300 ㎎/㎏/day
1. 재료
1) 시약
사용된 시약은 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM : Gibco BRL Co., U.S.A.), fetal bovine serum(FBS : Invitrogen Co., U.S.A.), lipopolysaccharide (LPS : Sigma Co., U.S.A.), cell viability assay kit (Daeillab sevice, Korea), nitric oxide detection kit (Intron Biotechnology, Korea), mouse cytokine milliplex map immunoassay kit (Millipore Co., U.S.A.), ethanol (Merck Co., Germany), 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH, Sigma Co., U.S.A.), 2′,7′-Dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA, Sigma Co., U.S.A), Folin-Ciocalteu's phenol reagent (Merck, Germany)에서 구입하여 사용하였다.
2) 기기
본 실험에 사용된 기기는 rotary vacuum evaporator (Buchi B-480 Co., Switzerland), freeze dryer (EYELA FDU-540 Co., Japan), CO2 incubator (Forma scientific Co., U.S.A.), centrifuge (Sigma Co., U.S.A.), deep-freezer (Sanyo Co., Japan), ELISA reader (Molecular Devices Co., U.S.A.), flow cytometry system (BD biosciences, U.S.A.), Luminex (Millipore Co., U.S.A.) 등을 이용하였다.
2. 방법
1) 시료의 조제
백삼복합물(Ginseng complex extract, 이하 GCE)은 백삼, 오미자, 수세미오이, 맥문동, 도라지, 감초 각 50 g에 DW 4500 ㎖를 넣고 10시간 동안 97℃에서 추출 후 여과액을 얻었으며, 개별 추출물은 각 50g에 DW 750㎖를 넣고 동일한 조건에서 추출 후 여과액을 얻었다. 얻어진 여과액을 rotary vacuum evaporator에서 감압 농축하였다. 농축된 용액을 freeze dryer로 동결 건조하여 분말을 얻었으며, 얻어진 분말은 초저온 냉동고(-80℃)에서 보관하면서 실험에 따라 필요한 농도로 증류수에 희석하여 사용하였다.
2) 세포독성
RAW 264.7 세포는 96 well plate에 1.5×105 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양 하였다. 실험 시행 전에 새로운 배양액으로 교체하였고, 백삼복합물은 각각 1, 10, 100 (㎍/㎖)의 농도와 개별 시료는 100 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 10 ㎕의 WST solution을 첨가하여 세포배양기 (37℃, 5% CO2)에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 450 ㎚에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시 하였다.
3) 항산화 측정
(1) 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH) 소거능 측정
자유라디칼 소거 활성 시험은 안정한 자유라디칼 DPPH를 사용하는 방법으로 에탄올에 용해시킨 0.2mM의 DPPH 용액 150ul와 백삼복합물 (1, 10, 100, 1000 ㎍/㎖)과 개별 시료 100 ㎍/㎖를 100 ㎕ 혼합하고, 37℃에서 30분간 반응 시킨 후, 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료액 대신 증류수를 넣었으며, DPPH 용액대신 에탄올을 넣어 보정값을 얻었다. 자유라디칼 소거율은 아래의 식에 따라 계산하였다.
소거율 (%) = (대조군의 흡광도-시료 첨가군의 흡광도) *100
대조군의 흡광도
(2) 세포내 ROS 생성 측정
RAW 264.7 세포에서 reactive oxygen speies (ROS)를 측정하기 위하여 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA)를 이용하였다. 12 well plate에 RAW 264.7 세포를 1.5×10
cells/well이 되게 분주하였다. 24시간 동안 배양 한 후, 여기에 LPS 및 백삼복합물 (1, 10, 100 (㎍/㎖))와 개별 시료 100 ㎍/㎖의 농도로 각각의 well에 첨가한 후, 24시간 동안 37℃, 5% CO
배양기에서 배양한 후 1,200 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 모은 세포를 차가운 PBS로 2회 세척한 후 DCF-DA 10 μM이 되도록 첨가하여 15분 동안 빛이 차단된 상온에서 염색하였다. 염색 후 차가운 PBS를 넣어 1,200 rpm에서 5분간 원심분리한 다음 상청액을 제거하고 다시 PBS 400 ㎕를 부유시켜 유세포 분석기 (Flow cytometer)를 이용하여 형광강도의 세기에 따른 변화를 분석하였다.
4) 항염증 측정
(1) Nitric oxide(NO) 생성 억제 효과 측정
NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 Griess Reagent System을 이용하여 측정하였다. RAW 264.7 세포를 96well plates에 1.5×105 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양 한 후, 백삼복합물 1, 10, 100 ㎍/㎖ 농도와 개별 시료 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하고, LPS 1 ㎍/㎖을 처리하여, 다시 24시간 동안 배양하였다. N1 buffer를 50 ㎕를 각 well에 처리한 후, 10분간 상온에서 암소반응 후, N2 buffer 50 ㎕를 각 well에 처리하고, 10분간 반응시킨 후, 540nm에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite standard의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액의 NO 농도를 결정하였다.
(2) 사이토카인 생성량 측정
세포 내에서 염증성 사이토카인을 측정하기 위하여 luminex를 사용하였다. 12 well plate에 RAW 264.7 세포를 1.5×105 cells/well이 되게 분주하여 24시간 동안 배양 후 새로운 배양액으로 교체하였고, 백삼복합물을 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도와 개별 시료 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하고, LPS 1 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 세포배양기 (37℃, 5% CO2)에서 배양하였다. 원심분리 후 상청액으로 IL-1β, IL-6, TNF-α를 측정하였다.
3. 통계처리
연구 결과는 연구 결과는 SPSS 11.0의 unpaired student's T-test 및 ANOVA test를 사용하여 통계처리 하였으며 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001 수준에서 유의성을 검정하였다.
<실험결과>
1. 세포독성
백삼복합물의 RAW 264.7 세포주 세포 생존율을 측정한 결과, 대조군을 100.0±6.5% 로 나타냈을 때, 백삼복합물은 1, 10, 100, 200 (㎍/㎖) 농도에서 114.4±9.4%, 115.2±8.4%, 103.3±7.4%, 79.1±5.5%의 세포 생존율을 나타내어 100 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 안전한 것으로 나타나 100 ㎍/㎖의 농도까지 실험을 진행하였다(Fig. 1A). 또한, 개별 추출물의 100 ㎍/㎖ 농도에서 세포 생존율을 측정한 결과, 오미자, 수세미오이, 맥문동, 백삼, 감초, 도라지 추출물은 각각 120.7±3.3%, 140.9±6.8%, 119.5±1.7%, 106.2±2.2%, 102.5±4.4%, 115.4±3.7%의 세포 생존율을 나타내어 세포 증식을 한 수세미오이를 제외한 나머지 개별 추출물들은 안전한 것으로 나타났다(Fig. 1B).
Fig. 1. Effect of GCE and individual-extraction of GCE on the cell viability of RAW 264.7 cells. Cells were treated with 1, 10, 100 (㎍/㎖) of each extract for 24hr. Cell viability was determined using the WST assay. The results are expressed as mean±SD from three independent experiments. Statistical significance is based on the difference when compared with noraml cells.
(A) : Cell viability of GCE
(B) : Cell viability of included individual-extraction of GCE
2. 항산화 효능 평가
1) DPPH 라디컬 소거능에 미치는 영향
백삼복합물의 DPPH 라디컬 소거능을 측정한 결과, 백삼복합물은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 19.5±1.1%, 25.1±0.5%, 54.4±3.4%로 나타나 농도 의존적인 라디컬 소거능을 나타냈다(Fig. 2A). 또한, 오미자, 수세미오이, 맥문동, 백삼, 감초, 도라지 등 개별 추출물의 100 ㎍/㎖ 농도에서는 각각 41.5±2.6%, 50.5±5.1%, 32.2±3.1%, 39.8±5.3%, 46.6%±3.1, 30.5±0.6%의 라디컬 소거능을 나타냈다(Fig. 2B).
Fig. 2. DPPH free radical scavenging activity of GCE and individual-extraction of GCE at various concentration. Extracts were incubated with DPPH solution at 37℃ for 30 mins. Activities were determined by measurement of absorbance at 517 ㎚. The results were expressed as mean ± S.D. from three independent experiments.
(A) : DPPH free radical scavenging of GCE
(B) : DPPH free radical scavenging of included individual-extraction of GCE
2) 세포 내 reactive oxygen species(ROS)에 미치는 영향
백삼복합물의 RAW 264.7 세포 내 ROS 생성 저해 활성을 측정한 결과, 대조군을 100.0±1.0%로 나타냈을 때 정상군은 35.1±3.4%으로 나타났으며, 백삼복합물은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 98.7±0.9%, 95.3±7.5%, 60.2±5.9% 로 나타나 대조군에 비하여 100 ㎍/㎖ 농도에서 유의성 있는 (** p <0.01) 감소가 나타났다(Fig. 3A). 또한, 오미자, 수세미오이, 맥문동, 백삼, 감초, 도라지 등 개별 추출물의 100 ㎍/㎖ 농도에서는 각각 70.6±8.1%, 64.3±1.9%, 65.9±0.6%, 72.7±8.9%, 77.4%±6.9, 79.4±1.6%로 나타나 대조군에 비하여 모든 개별 추출물의 100 ㎍/㎖ 농도에서 유의성 있는 (** p <0.01, * p <0.05) 감소가 나타났다(Fig. 3B).
Fig. 3. Effect of GCE and individual-extraction of GCE on ROS production in RAW 264.7 cells. Each cell was treated with 1, 10 and 100 (㎍/㎖) of GCE extract, individual-extraction of GCE and LPS (1 ㎍/㎖) for 24hr. The ROS production was analyzed by flow cytometry(Significance of results, ** : p <0.01, * : p <0.05).
(A) : Relative ROS production of GCE
(B) : Relative ROS production of included individual-extraction of GCE
3. 항염증 효능 평가
1) Nitric oxide(NO) 생성 억제 효과
백삼복합물의 RAW 264.7 세포에서 NO 생성량을 측정한 결과, 대조군을 100.0±1.0%로 나타냈을 때 정상군은 34.4±2.0%로 나타났으며, 백삼복합물은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 93.9±10.2%, 97.8±0.7%, 80.3±6.7%로 나타나 대조군에 비하여 100 ㎍/㎖ 농도에서 유의성 있는 (* p <0.05) 감소가 나타났다(Fig. 4A). 또한, 오미자, 수세미오이, 맥문동, 백삼, 감초, 도라지 등 개별 추출물의 100 ㎍/㎖ 농도에서는 각각 97.7±0.1%, 125.1±4.7%, 88.6±3.1%, 70.4±2.8%, 73.8%±2.9, 92.2±0.1%로 나타나 대조군에 비하여 맥문동, 백삼, 감초 추출물의 100 ㎍/㎖ 농도에서 유의성 있는 (** p <0.01, * p <0.05) 감소가 나타났다(Fig. 4B).
Fig. 4. Effect of GCE and individual-extraction of GCE on NO production in RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cell was treated with 1, 10, 100 (㎍/㎖) of GCE extract, individual-extraction of GCE and LPS (1 ㎍/㎖) for 24hr. The ROS production was analyzed by flow cytometry(Significance of results, ** : p <0.01, * : p <0.05).
(A) : NO production of GCE
(B) : NO production of included individual-extraction of GCE
2) 사이토카인 생성량 측정
(1) IL-1β 생성량 측정
백삼복합물의 RAW 264.7 세포주에서 IL-1β 생성량을 측정한 결과, 대조군이 24.5±0.7 pg/㎖, 정상군이 19.5±0.7 pg/㎖로 나타났으며, 백삼복합물은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 25.5±0.7, 21.5±0.7, 21.3±0.4 (pg/㎖)로 나타났다(Fig. 5A). 또한, 오미자, 수세미오이, 맥문동, 백삼, 감초, 도라지 등 개별 추출물의 100 ㎍/㎖ 농도에서는 각각 25.5±0.7, 26.2±1.1, 23.0±0.1, 26.5±0.7, 27.2±1.1, 29.5±0.7 (pg/㎖)로 나타났다(Fig. 5B).
Fig. 5. Effect of GCE and individual-extraction of GCE on IL-1β production in RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cell was treated with 1, 10, 100 (㎍/㎖) of GCE extract, individual-extraction of GCE and LPS (1 ㎍/㎖) for 24hr.
(A) : IL-1β production of GCE
(B) : IL-1β production of included individual-extraction of GCE
(2) IL-6 생성량 측정
백삼복합물의 RAW 264.7 세포주에서 IL-6 생성량을 측정한 결과, 대조군이 2382.8±69.7 pg/㎖, 정상군이 57.0±2.1 pg/㎖로 나타났으며, 백삼복합물은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 2256.0±318.9, 2394.2±94.4, 2402.3±59.0 (pg/㎖)로 나타났다(Fig. 6A). 또한, 오미자, 수세미오이, 맥문동, 백삼, 감초, 도라지 등 개별 추출물의 100 ㎍/㎖ 농도에서는 각각 2478.0±65.1, 2535.5±321.0, 2469.0±419.0, 2480.5±111.7, 2437.8±75.3, 2519.8±43.5 (pg/㎖)로 나타났다(Fig. 6B).
Fig. 6. Effect of GCE and individual-extraction of GCE on IL-6 production in RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cell was treated with 1, 10, 100 (㎍/㎖) of GCE extract, individual-extraction of GCE and LPS (1 ㎍/㎖) for 24hr.
(A) : IL-6 production of GCE
(B) : IL-6 production of included individual-extraction of GCE
(3) TNF-α 생성량 측정
백삼복합물의 RAW 264.7 세포주에서 TNF-α 생성량을 측정한 결과, 대조군이 9563.5±56.6 pg/㎖, 정상군이 819.3±35.7 pg/㎖로 나타났으며, 백삼복합물은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 9563.5±12.0, 8335.3±135.4, 8522.5±132.2 (pg/㎖)로 나타나 대조군에 비하여 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 유의성 있는 (** p <0.01) 감소가 나타났다(Fig. 7A). 또한, 오미자, 수세미오이, 맥문동, 백삼, 감초, 도라지 등 개별 추출물의 100 ㎍/㎖ 농도에서는 각각 9318.0±316.8, 9446.8±158.7, 7833.0±131.7, 9466.8±32.2, 9493.5±354.3, 9381.0±370.5 (pg/㎖)로 나타나 대조군에 비하여 맥문동 개별 추출물에서 유의성 있는 (** p <0.01) 감소가 나타났다(Fig. 7B).
Fig. 7. Effect of GCE and individual-extraction of GCE on TNF-α production in RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cell was treated with 1, 10, 100 (㎍/㎖) of GCE extract, individual-extraction of GCE and LPS (1 ㎍/㎖) for 24hr.
(A) : TNF-α production of GCE
(B) : TNF-α production of included individual-extraction of GCE
이하, 상기와 같은 실험에 의한 결론을 도출하면 다음과 같다.
백삼복합물의 기관지 및 천식에 대한 개선 효과를 확인하고자 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포에서 다양한 농도로 항염증 및 항산화 평가를 실시한 결과 다음과 같은 결론를 얻었다.
1. 백삼복합물의 RAW 264.7 세포주에 대한 세포 독성 평가를 실시한 결과, 1, 10, 100 (㎍/㎖)의 농도에서는 100% 이상의 생존율을 나타내어 안전한 것으로 확인되었으나, 200 ㎍/㎖ 농도에서 80% 이하의 세포 생존율을 나타내었다. 따라서 백삼복합물을 100 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 실험을 진행하게 되었다(Fig. 1A).
2. 백삼복합물의 DPPH 라디컬 소거능을 측정한 결과, 백삼복합물은 1, 10, 100 (㎍/㎖)의 농도에서 농도 의존적인 라디컬 소거능을 나타냈다(Fig. 2A).
3. 백삼복합물의 RAW 264.7 세포 내 Reactive oxygen species(ROS) 생성량을 측정한 결과, 백삼복합물의 100 (㎍/㎖) 농도에서 유의성 있는 (** p <0.01) 감소가 나타났다(Fig. 3A).
4. 백삼복합물의 RAW 264.7 세포에서 Nitric oxide(NO) 생성 억제 효과를 측정한 결과, 백삼복합물의 100 ㎍/㎖ 농도에서 유의성 있는 (* p <0.05) 감소가 나타났다(Fig. 4A).
6. 백삼복합물의 사이토카인 생성량을 측정한 결과, IL-1β는 10, 100 (㎍/㎖)의 농도에서 대조군에 비해 감소를 나타내었으며, IL-6는 1 ㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 감소를 나타내었다. 또한, TNF-α는 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 (** p <0.01) 감소가 나타났다(Fig. 5A, 6A, 7A).
위 결과를 통해 백삼복합물의 100 ㎍/㎖ 농도에서 DPPH 라디컬 소거능의 증가, 항산화계의 활동을 감소시키는 활성산소종(ROS)의 유의성 있는 감소와 염증의 대표적인 매개체인 산화질소(NO) 및 사이토카인 IL-1b, TNF-α의 생성억제를 통해 항산화 및 항염증에 효과가 있는 것으로 나타났다. 즉, 백삼복합물의 가장 효과적인 농도는 100 ㎍/㎖의 농도임을 확인 할 수 있었다. 이와 같은 결과를 바탕으로 백삼복합물의 개별 추출물인 오미자, 수세미오이, 맥문동, 백삼, 감초, 도라지의 100 ㎍/㎖ 농도와 비교한 결과는 다음과 같다.
1. 개별추출물의 RAW 264.7 세포주에 대한 세포 독성 평가를 실시한 결과, 모든 개별 추출물은 100% 이상의 생존율을 나타내어 안전한 것으로 확인되었으나, 수세미오이 추출물은 세포 증식이 확인되었다(Fig. 1B).
2. 백삼복합물과 개별추출물의 DPPH 라디컬 소거능을 비교한 결과, 백삼복합물과 수세미오이 추출물이 다른 개별 추출물보다 높은 라디컬 소거능이 나타났다(Fig. 2B).
3. 백삼복합물과 개별추출물의 RAW 264.7 세포 내 Reactive oxygen species(ROS) 생성량을 비교한 결과, 백삼복합물과 개별추출물은 100 (㎍/㎖) 농도에서 모두 유의성 있는 (** p <0.01, * p <0.05) 감소를 나타냈으며 백삼복합물이 가장 뛰어난 ROS 저해능을 나타냈다(Fig. 3B).
4. 백삼복합물과 개별추출물의 RAW 264.7 세포에서 Nitric oxide(NO) 생성 억제 효과를 비교한 결과, 백삼복합물과 맥문동, 백삼, 감초 추출물의 100 ㎍/㎖ 농도에서 유의성 있는 (** p <0.01, * p <0.05) 감소가 나타났다(Fig. 4B).
6. 백삼복합물과 개별추출물의 사이토카인 생성량을 비교한 결과, IL-1β는 백삼복합물과 맥문동 추출물이 대조군에 비해 감소를 나타내었으며, IL-6는 백삼복합물과 개별 추출물에서 대조군에 비해 차이를 나타내지 않았다. 또한, TNF-α는 백삼복합물과 맥문동 추출물에서 대조군에 비해 유의성 있는 (** p <0.01) 감소가 나타났다(Fig. 5B, 6B, 7B).
위와 같은 결과를 종합해 보면, 백삼추출물은 백삼추출물을 구성하는 개별 추출물들과 비교하였을 때, 세포에 독성이 없으며 항산화 및 항염증의 기전에 효과적임을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 기관지 염증 질환인 천식뿐만 아니라, 아토피, 알레르기 질환 등 염증성 질환 개선에도 도움을 줄 수 있을 것이라 생각된다.
1. 재료
1) 시약
사용된 시약은 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM : Gibco BRL Co., U.S.A.), fetal bovine serum(FBS : Invitrogen Co., U.S.A.), lipopolysaccharide (LPS : Sigma Co., U.S.A.), human cytokine milliplex map immunoassay kit (Millipore Co., U.S.A.), human liminex kit (R&D Co., U.S.A)에서 구입하여 사용하였다.
2) 기기
본 실험에 사용된 기기는 rotary vacuum evaporator (Buchi B-480 Co., Switzerland), freeze dryer (EYELA FDU-540 Co., Japan), CO2 incubator (Forma scientific Co., U.S.A.), centrifuge (Sigma Co., U.S.A.), deep-freezer (Sanyo Co., Japan), ELISA reader (Molecular Devices Co., U.S.A.), Luminex (Millipore Co., U.S.A.) 등을 이용하였다.
2. 방법
1) 사이토카인 생성량 측정
세포 내에서 염증성 사이토카인을 측정하기 위하여 luminex를 사용하였다. 12 well plate에 A549 세포를 105 cells/well이 되게 분주하여 24시간 동안 배양 후 새로운 배양액으로 교체하였고, 백삼복합방(GCE)을 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도와 개별 시료 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하고, TNF-α (100 ng/㎖), IL-4 (100 ng/㎖), IL-1β (10 ng/㎖)를 처리하여 다시 48시간 동안 세포배양기 (37℃, 5% CO2)에서 배양하였다. 원심분리 후 상청액으로 IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ와 GM-CSF를 측정하였다.
3. 통계처리
연구 결과는 연구 결과는 SPSS 11.0의 unpaired student's T-test 및 ANOVA test를 사용하여 통계처리 하였으며 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001 수준에서 유의성을 검정하였다.
<실험결과>
1. 사이토카인 생성량 측정
(1) IL-1β 생성량 측정
백삼복합물의 A549 세포주에서 IL-1β 생성량을 측정한 결과, 대조군이 2264.7±48.4 pg/㎖, 정상군이 7.6±0.9 pg/㎖로 나타났으며, 백삼복합물은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 2151.7±124.5, 2136.3±36.3, 1668.6±239.9 (pg/㎖)로 나타났다(Fig. 1A). 또한, 감초, 길경, 맥문동, 백삼, 오미자 추출물의 100 ㎍/㎖ 농도에서는 각각 2219.9±80.3, 2266.3±223.3, 2231.5±188.4, 2170.5±182.3, 2043.9±135.5 (pg/㎖)로 나타났다(Fig. 1B).
Fig. 1. Effect of GCE and individual-extraction of GCE on IL-1β production in A549 cells. A549 cells were treated with 1㎍/㎖, 10㎍/㎖, and 100 ㎍/㎖ of GCE extract (A), individual-extraction of GCE(B), TNF-α (100 ng/㎖), IL-4 (100 ng/㎖), and IL-1β (10 ng/㎖) for 48hr.
(2) IL-6 생성량 측정
백삼복합물의 A549 세포주에서 IL-6 생성량을 측정한 결과, 대조군이 2843.0±274.4 pg/㎖, 정상군이 361.4±117.3 pg/㎖로 나타났으며, 백삼복합물은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 2398.7±105.4, 2540.4±450.2, 2272.9±302.4 (pg/㎖)로 나타났다(Fig. 2A). 또한, 감초, 길경, 맥문동, 백삼, 오미자 추출물의 100 ㎍/㎖ 농도에서는 각각 2770.5±178.1, 2543.8±462.1, 2839.9±301.0, 2198.1±258.2, 2089.1±258.2 (pg/㎖)로 나타났다(Fig. 2B).
Fig. 2. Effect of GCE and individual-extraction of GCE on IL-6 production in A549 cells. A549 cells were treated with 1㎍/㎖, 10㎍/㎖, and 100 ㎍/㎖ of GCE extract (A), individual-extraction of GCE(B), TNF-α (100 ng/㎖), IL-4 (100 ng/㎖), and IL-1β (10 ng/㎖) for 48hr.
(3) TNF-α 생성량 측정
백삼복합물의 A549 세포주에서 TNF-α 생성량을 측정한 결과, 대조군이 40773.2±2264.5 pg/㎖, 정상군이 7.2±2.0 pg/㎖로 나타났으며, 백삼복합물은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 42731.5±2187.8, 40123.3±896.4, 40417.2±1703.0 (pg/㎖)로 나타났다(Fig. 3A). 또한, 감초, 길경, 맥문동, 백삼, 오미자 추출물의 100 ㎍/㎖ 농도에서는 각각 10034.4±296.5, 39501.5±637.9, 39691.2±1356.9, 41517.7±1932.5, 41955.5±1922.2 (pg/㎖)로 나타났다(Fig. 3B).
Fig. 3. Effect of GCE and individual-extraction of GCE on TNF-α production in A549 cells. A549 cells were treated with 1㎍/㎖, 10㎍/㎖, and 100 ㎍/㎖ of GCE extract (A), individual-extraction of GCE(B), TNF-α (100 ng/㎖), IL-4 (100 ng/㎖), and IL-1β (10 ng/㎖) for 48hr.
(4) IFN-γ 생성량 측정
백삼복합물의 A549 세포주에서 IFN-γ 생성량을 측정한 결과, 대조군이 6.4±1.2 pg/㎖, 정상군이 4.1±1.5 pg/㎖로 나타났으며, 백삼복합물은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 5.7±1.2, 5.6±1.4, 5.3±0.6 (pg/㎖)로 나타났다(Fig. 4A). 또한, 감초, 길경, 맥문동, 백삼, 오미자 추출물의 100 ㎍/㎖ 농도에서는 각각 5.7±0.2, 5.7±1.0, 6.4±1.2, 5.7±1.2, 6.4±1.2 (pg/㎖)로 나타났다(Fig. 3B).
Fig. 4. Effect of GCE and individual-extraction of GCE on IFN-γ production in A549 cells. A549 cells were treated with 1㎍/㎖, 10㎍/㎖, and 100 ㎍/㎖ of GCE extract (A), individual-extraction of GCE(B), TNF-α (100 ng/㎖), IL-4 (100 ng/㎖), and IL-1β (10 ng/㎖) for 48hr.
(5) GM-CSF 생성량 측정
백삼복합물의 A549 세포주에서 GM-CSF 생성량을 측정한 결과, 대조군이 616.1±50.1 pg/㎖, 정상군이 70.0±1.0 pg/㎖로 나타났으며, 백삼복합물은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 582.2±29.3, 579.5±11.5, 512.8±7.2 (pg/㎖)로 나타났다(Fig. 5A). 또한, 감초, 길경, 맥문동, 백삼, 오미자 추출물의 100 ㎍/㎖ 농도에서는 각각 568.8±7.5, 590.3±9.7, 607.5±50.6, 601.6±16.4, 563.9±3.7 (pg/㎖)로 나타났다(Fig. 5B).
Fig. 5. Effect of GCE and individual-extraction of GCE on GM-CSF production in A549 cells. A549 cells were treated with 1㎍/㎖, 10㎍/㎖, and 100 ㎍/㎖ of GCE extract (A), individual-extraction of GCE(B), TNF-α (100 ng/㎖), IL-4 (100 ng/㎖), and IL-1β (10 ng/㎖) for 48hr.
이하, 상기와 같은 실험에 의한 결론을 도출하면 다음과 같다.
백삼복합물의 기관지 및 천식에 대한 개선 효과를 확인하고자 인간 상피세포주인 A549세포에서 다양한 농도로 사이토카인의 생성량 측정을 실시한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
1. IL-1β 생성량을 측정한 결과, 대조군에 비해 백삼복합물이 농도에 따른 감소를 나타냈고, 개별 추출물에 비해 100 ㎍/㎖ 농도에서 현저히 감소시켰다.
2. IL-6 생성량을 측정한 결과, 대조군에 비해 백삼복합물은 모든 농도에서 감소를 나타냈다. 개별 추출물 중에 오미자의 경우 백삼복합물보다 약간 더 감소를 나타냈다.
3. TNF-α 생성량을 측정한 결과, 대조군에 비하여 백삼복합물 10 pg/㎖, 100 pg/㎖의 농도에서 감소를 나타냈다. 개별 추출물 중에 감초, 길경, 맥문동의 경우 백삼복합물 100 pg/㎖의 농도에서 보다 약간 더 감소를 나타냈다.
4. IFN-γ 생성량을 측정한 결과, 대조군에 비해 백삼복합물은 모든 농도에서 감소를 나타냈으며, 백삼복합물 100 pg/㎖의 농도는 다른 개별 추출물보다 감소시키는 것을 나타냈다.
5. GM-CSF 생성량을 측정한 결과, 대조군에 비해 백삼복합물은 농도에 따른 감소를 나타냈고, 백삼복합물 100 pg/㎖의 농도는 개별 추출물보다 감소시키는 것을 나타냈다.
위와 같은 결과를 종합해 보면, 백삼추출물은 백삼추출물을 구성하는 개별 추출물들과 비교하였을 때, 사이토카인의 생성을 감소시키는데 효과적임을 확인할 수 있었다.
상기는 본 발명의 바람직한 실시예를 참고로 설명하였으며, 상기의 실시예에 한정되지 아니하고, 상기의 실시예를 통해 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명의 요지를 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변경으로 실시할 수 있는 것이다.
Claims (4)
- 백삼(白蔘, Erycibae Caulis), 오미자(五味子, Schisandrae Fructus), 맥문동(麥門冬, Liriopis Tuber), 길경(佶梗, Platycodi Radix), 감초(甘草, Glycyrrhizae Radixet Rhizoma), 수세미오이(Smooth Loofah)를 1:1:1:1:1:1의 비율로 각 50g에 증류수 4500㎖를 혼합한 혼합물로부터 용매를 사용하여 추출된 추출물을 유효성분으로 포함하되,
상기 추출물은
상기 혼합물에 증류수를 넣고, 95~100℃의 온도에서 10시간 동안 환류 추출한 후 여과액을 감압 농축하여 용액을 얻고,
상기 농축된 용액을 동결건조하여 분말을 수득하고, 수득된 분말은 -80℃의 온도로 보관하며, 100㎍/㎖ 이하의 농도로 희석해 사용하는 것을 특징으로 하는 백삼복합방 추출물을 함유하는 천식 질환 개선용 조성물. - 삭제
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| KR102297398B1 (ko) * | 2020-03-05 | 2021-09-02 | 김일웅 | 맥문동 추출물, 감초 추출물 및 아로니아 추출물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의한 기관지 염증 질환의 개선용 건강 기능 식품 조성물 |
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| KR102221389B1 (ko) * | 2020-02-28 | 2021-03-03 | 김민정 | 한방 추출물을 유효성분으로 함유하는 황사와 미세먼지에 의해 유도된 호흡기 질환 치료용 조성물 |
| KR102297398B1 (ko) * | 2020-03-05 | 2021-09-02 | 김일웅 | 맥문동 추출물, 감초 추출물 및 아로니아 추출물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의한 기관지 염증 질환의 개선용 건강 기능 식품 조성물 |
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