JP2000515391A

JP2000515391A - バイオリアクター

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Publication number: JP2000515391A
Application number: JP10550484A
Authority: JP
Inventors: アミオト，ブルース・ピー
Original assignee: エクスコープ・メディカル・インコーポレーテッド
Priority date: 1997-05-22
Filing date: 1998-05-13
Publication date: 2000-11-21
Also published as: ATE231181T1; US5955353A; DE69810740T2; AU7494798A; EP0915965B1; CA2262812A1; NZ333786A; AU738641B2; EP0915965A1; CA2262812C; WO1998053046A1; DE69810740D1

Abstract

(57)【要約】生活動物細胞を標準動物組織の密度に近似する密度で含有するバイオリアクターを開示する。細胞装填中にバイオリアクターを通る流体の流れを制御するフロー・レストリクターを備えることによって、高い細胞装填が達成される。このバイオリアクターの製造方法と使用方法をも開示する。

Description

【発明の詳細な説明】バイオリアクター発明の分野本発明はバイオリアクターの分野である。さらに詳しくは、本発明は、標準動物組織の密度に近似する密度で動物細胞を装填されたバイオリアクターに関する。背景中空ファイバー・バイオリアクター・カートリッジは典型的に、多数の中空ファイバー又はフィラメントを含有する、しばしば円筒形の形状のハウジングを包含する。フィラメントはフィラメント壁を通しての分子輸送を可能にする材料から形成される。このような材料は典型的にポリスルホン、酢酸セルロース等を包含する。カートリッジは通常、２つのスペース：フィラメント内スペース（フィラメントの内腔によって画定）とフィラメント外スペース（フィラメントの外面とカートリッジ・ハウジングの内面とによって画定）とを画定する。フィラメント内スペースは少なくともフィラメント入口ポートとフィラメント出口ポートとに連通するフィラメント流路を画定し、フィラメント外スペースは少なくともハウジング入口ポートとハウジング出口ポートとに連通するフィラメント外流路を画定する。これらの流路間の連絡はフィラメントの壁を通しての分子輸送に限定される。生細胞を含有するバイオリアクターの使用は当該技術分野で公知である。典型的に、細胞はフィラメント外スペースに装填され、しばしば、支持マトリックス内に含まれる又は包まれる。肝細胞を含めた、非常に多くの種類の細胞が用いられている。１つの使用形式では、例えば血液のような、処理すべき生物学的流体がフィラメント流路を通って循環される。バイオリアクターが人工肝臓として作用すべきである場合は、細胞はしばしばブタから回収された肝細胞である。血液はフィラメントを通って流れるので、フィラメント壁を横切って分子輸送が生じて、それによって血液から汚染物が除去される。このような系はしばしば、血液が患者から、バイオリアクターへ、そして再び患者へと移動するように設計される。必要な場合には、典型的ではないとしても、フィラメントを通る血液流と同時に、細胞のための養分溶液(nutrient solution)をフィラメント外流路に通して循環させることができる。これらの流れは向流、並流又は逆流(crosscurrent)のいずれの流動でもよい。上述した種類のバイオリアクターに関して存在する１つの問題は、充分な細胞均等性と細胞装填密度(cell loading density)とを有するバイオリアクターを構築することが非常に困難であることである。したがって、一般に用いられる種類のバイオリアクターは、低密度でリアクターに接種され、集密(confluence)まで増殖させられた細胞を包含する。或いは、細胞はカプセル封入されるか又はバイオキャリヤーに付着されてから、バイオリアクター内部に注入される。これらの態様の各々では、約１０⁵細胞／ｍｌより大きい細胞密度を得ることが非常に困難であることが判明している。得られたバイオリアクターは正常な動物組織の細胞密度よりも数桁小さい細胞密度を有するので、理想的とは言い難い結果が得られているに過ぎない。上述したように、バイオリアクターに高い細胞密度までに装填することが非常に困難であることが判明している。この困難さの根拠は次の通りである。バイオリアクター・カートリッジは数千の中空フィラメントを含み、これらのフィラメントは円筒形束を作って、カートリッジ・ハウジングに挿入される。輸送膜(tra nsport membrane)の面積を最大にするために、フィラメントを非常に高い充填密度でハウジングに装填する。得られるフィラメント外スペースは緻密に充填されたフィラメント間の数千の非常に小さい、狭い通路を含む。得られる形状はフィラメント外流路を通して粘稠な流体を押し出すことを非常に困難にする。粘度の低い流体を用いることができるが、このような流体はしばしば、臨床的設定において使用可能であるデバイスを製造するほど充分に高い細胞密度を提供しない。しかし、標準動物組織の細胞密度（即ち、１０⁸細胞／ｍｌ）に近似する細胞密度を与えることができる流体は、フィラメント外スペースに充分に侵潤することができないという欠点を有する。特に、このような高密度流体の使用は、しばしば流れシャント(flow shunt)を生じ易く、この流れシャントでは流体が直接ハウジングの内壁に沿って流れるので、有効フィラメント外スペースの約１０〜２０％のみの細胞装填を生じるに過ぎない。したがって、生活動物細胞を標準動物組織の密度に近似する密度に維持することができるバイオリアクターの必要性が存在する。簡単であり、均一な細胞分布を生じるやり方で、高い細胞密度で充填されるのに適合するバイオリアクターの必要性も存在する。発明の概要本発明は、生きている動物細胞の均一な高密度装填を助けるフロー・レストリクターを包含するバイオリアクターに関する。さらに詳しくは、本発明は中心軸を画定する細長いハウジングを有するバイオリアクターに関する。多数の細長い中空フィラメントが中心軸に実質的に平行なハウジング内に配置される。これらのフィラメントはハウジング内のフィラメント外スペースを画定し、フィラメント壁を横切る分子輸送を可能にする材料から形成される。例えば肝細胞のような細胞が標準組織の密度に近似する密度でフィラメント外スペース中に存在する。バイオリアクターにはさらに、それぞれが中空フィラメントを通して連通してフィラメント流路を形成する、フィラメント入口ポート及びフィラメント出口ポートと、それぞれがフィラメント外スペースを通して連通してフィラメント外流路を形成する、ハウジング入口ポート及びハウジング出口ポートとが備えられる。一方の流路内の物質が他方の流路内に中空フィラメント壁を通しての分子輸送によってのみ入ることができるように、フィラメント外流路はフィラメント流路とは単離される。さらに、デバイスには、フィラメント外流路の端から端まで実質的に均一な流れを維持するためにフィラメント外流路中に配置されたフロー・レストリクターが備えられる。フロー・レストリクターは先行技術のバイオリアクターに関連した流れシャントを軽減又は除去するために有用であることが判明している。特に、大きい均一な流れ抵抗をフィラメント外流路に、好ましくはハウジング出口ポートに少なくとも隣接して与えるならば、プラグ流れに近い状態をフィラメント外流路に得ることができる。このような流れ状態はフィラメント外スペースにおける均一で高密度の細胞装填を容易にする。フロー・レストリクターは好ましくは、ハウジング出口ポートとハウジング出口ポートに隣接するフィラメント外スペースを通る流体の流れを制限するような形式でフィラメント外スペースに配置されヒドロゲルプラグである。プラグは好ましくは、フィラメント外スペースにゲル化可能な物質を導入して、この物質をハウジング出口ポートに隣接する位置に移動させて、この物質をゲル化させることによって、現場で形成される。このプラグはフィラメント外スペースにのみ配置されるので、このプラグは中空フィラメントを通る流れは制限せず、したがって、臨床使用中に処理すべき多量の流体をデバイスに貫通させることを可能にする。図面の簡単な説明図１は、本発明のバイオリアクターの概略図である。図２は、バイオリアクターにフロー・レストリクターを配置する方法の１実施態様の概略図である。図３Ａと図３Ｂとは、バイオリアクターにフロー・レストリクターを配置する方法の第２実施態様の概略図である。図４は、バイオリアクターに生細胞を装填する方法の概略図である。図５は、本発明のバイオリアクターの使用方法の概略図である。図６は、培養段階中の生細胞を装填したバイオリアクターを維持する方法の概略図である。図７は、処理された試験対象と処理されない試験対象との生存差を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットである。図８は、処理された試験対象と処理されない試験対象との頭蓋内圧対時間を示すプロットである。図９は、処理された試験対象と処理されない試験対象との大脳潅流圧(cerebra l perfusion pressure)対時間を示すプロットである。図１０は、処理された試験対象と処理されない試験対象とにおけるアンモニアレベルを示すプロットである。図１１は、処理された試験対象と処理されない試験対象とにおける分枝鎖アミノ酸レベルの芳香族アミノ酸レベルに対する比率を示すプロットである。図１２は、本発明のバイオリアクターに関するｉｎｖｉｖｏ酸素消費速度を示すプロットである。詳細な説明本発明のバイオリアクターを図１に概略的に示す。図１では、バイオリアクター１０は多数の中空フィラメント１４を含有するハウジング１２を包含する。ハウジング１２は中心軸を画定し、フィラメント１４はそれらが中心軸に平行に一般的に伸びるような形式でハウジング内に配置される。ハウジングは非限定的にアクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリスルホン、スチレン−アクリロニトリル等を包含する、非常に多様な生体適合性材料のいずれかから形成することができる。デバイス内部を目視可能にするために透明であるハウジング材料が好ましい。さらに、以下で考察する光活性なプロセス(photoactive process)をデバイスの製造に用いる予定である場合には、透明なハウジングの使用が製造プロセスを非常に簡単にする。フィラメント１４は中心内腔を有する中空チューブである。典型的に、フィラメントは約２１０〜２５０μのオーダーの外径を有するが、約１〜２ｍｍ程度の太い外径を有するフィラメントも同様に用いることができる。これらのフィラメントは典型的に、約１９０〜２２０μのオーダーの内腔直径を有するが、約８００〜１８００μまでの直径も用いることができる。ハウジングは典型的に約２０〜３０ｃｍの範囲内の長さを有し、約１６〜２６ｃｍの範囲内の長さを有するフィラメントを収容する。ハウジングは典型的に約５〜１０ｃｍの内径を有し、約１０，０００〜２０，０００本のフィラメントを収容することを可能にする。もちろん、上記寸法は基準としてのみ提供され、発明の範囲を限定する意味ではないことが認識される。これらのフィラメントは生体適合性材料から形成されるので、これらのフィラメントを通して分子輸送が生ずることができる。例えば、フィラメントはポリスルホン、酢酸セルロース等から形成することができる。他のフィラメント材料はポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、エチレンポリビニルアルコールコポリマー（ＥＶＡＬ）並びに血液透析等の膜の製造に通常用いられる他の材料を包含する。フィラメントの内腔は、フィラメント入口ポート１８とフィラメント出口ポート２０とに連通する、矢印１６によって示されるフィラメント流路を画定する。フィラメント入口ポートとフィラメント出口ポートとは好ましくはハウジング１２の両端部に密封的に配置される末端キャップ２２内に配置される。フィラメント１４の外面とハウジング１２の内面との間のスペースを本明細書ではフィラメント内スペース２４と呼ぶ。フィラメント外スペース２４は、ハウジング入口ポート２８とハウジング出口ポート３０とに連通する、矢印２６によって示されるフィラメント外流路を画定する。ハウジング入口ポートとハウジング出口ポートとは好ましくはハウジング１２の両端部に隣接して配置される。図１に示される、フィラメント入口ポート及びフィラメント出口ポートと、ハウジング入口ポート及びハウジング出口ポートとの配置が、フィラメント流路とフィラメント外流路との関係に向流の流れを確立するような配置であることが認められる。フィラメント入口ポート１８が出口として役立ち、フィラメント出口ポート２０が入口として役立ち、それによってフィラメント流路１６の方向を逆にして、フィラメント流路とフィラメント外流路との関係に並流の流れを確立することが可能であることを認識すべきである。以下で詳細に考察するように、フィラメント外スペース２４は標準動物組織の密度に近似する密度で存在する生細胞を含有する。例えば肝細胞のようなある種の細胞に関して、例えばコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等のような細胞外マトリックスが細胞をより良好に支持するために用いられることが認められる。このような状況では、細胞外マトリックスに細胞を混合して、細胞自体の注入と同時に細胞外マトリックスをリアクターに注入することができる。フロー・レストリクター３２は少なくともハウジング出口ポートに隣接して配置される。このレストリクターは典型的に生体適合性ヒドロゲルを含む。以下で詳細に考察するように、レストリクターは現場で種々な方法を用いて形成することができる。レストリクターはフィラメント外流路において部分的なバリヤーとして役立ち、このようなものとして、フィラメント外スペースにプラグ流れ状態を確立する。このような状態はフィラメント外スペースにおける均一で高密度の細胞装填の生成を非常に容易にすることが判明している。本明細書で用いるかぎり、“少なくともハウジング出口ポートに隣接して”なる用語は、フロー・レストリクターがハウジング出口を通る流体の流れを制限するような形式で、フロー・レストリクターが配置されることを意味するように意図される。このような配置は簡単には該ポートが存在するハウジングの領域内に位置することができるか、又はハウジング入口ポート２８方向に短い距離延びて、フィラメント外スペースに達する、より大きい領域を包含することができる。上述したように、フロー・レストリクター３２は非常に多様な生体適合性ヒドロゲルのいずれかから形成することができる。これらは非限定的にコラーゲン、アガロース、アルギン酸カルシウム、酢酸キトサン、ポリアクリルアミド及びこれらの組合せを包含する。ヒドロゲルが少なくとも約９０％の水と約１０％未満のポリマーとを含むことが好ましい。一般に、フロー・レストリクターは好ましくは、緩和な条件下で、約５０℃未満の温度において有機溶媒を用いずにゲル化する生体適合性ヒドロゲルを含む。光活性化、水性触媒作用等を包含する種々な方法によって形成されるゲルを用いることができる。コラーゲンの場合には、ゲルは好ましくは、例えば、ＣｏｌｌａｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）から入手可能なＶｉｔｒｏｇｅｎ−１００のような、Ｉ型ウシコラーゲンから形成される。この物質はストックの３．０ｍｇ／ｍｌ溶液として入手され、組織培養培地によって１：１０に希釈された場合にもゲル化可能性を維持することが判明している。アガロースは寒天の精製形であり、例えばＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のような、非常に多様な供給源から入手可能である。アガロースは典型的に粉末状で得られ、これは水又は組織培養培地の適温の溶液(warm solution)中に溶解することができる。アガロースは約０．１〜３．０％ｗ／ｖの濃度において室温でゲル化する。アルギン酸カルシウムは、非常に多様な濃度で生成されうる生体適合性ヒドロゲルである。約１．０〜４．０％の濃度が肝細胞を含めた哺乳動物細胞を上首尾に被包しうることが知られる。アルギン酸カルシウムは、塩化カルシウムに暴露されたアルギン酸ナトリウム、水溶性液体先駆体から製造される。酢酸キトサンは、ホスフェートを含まない組織培養培地又は生理食塩水溶液を混合されて、非常に多様な濃度で用いられうる。この溶液にトリポリホスフェート溶液を混合すると、生体適合性ヒドロゲルが形成される。ポリアクリルアミドは、それらが電気泳動ゲルを形成する能力に関して周知である。このゲル化能力も、例えば本発明のフロー・レストリクターのような、フロー・レストリクター用途にそれらを非常に適したものにする。フロー・レストリクターは多様な方法を用いて現場で形成することができる。図２に示すような１つの方法では、プラグを形成するゲル化可能な物質をハウジング中の所望の位置に単に注入することによって、プラグを形成するゲル化可能な物質を導入して、位置決めすることができる。図２では、バイオリアクター１０が、例えば滅菌した水又はＷｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地（Ｇｉｂｃｏ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹから入手可能）のような、滅菌した流体培地の溜め(res ervoir)４０及びポンプ４２と共に流体回路中に配置される。この回路は、無菌流体がフロー・レストリクターの形成中にバイオリアクター１０のフィラメント流路を通って循環するのを可能にする。ゲル化可能な物質をその流体先駆体形で含有するシリンジ・ポンプ(syringe pump)４４は、バイオリアクターのハウジング出口ポート３０と流体連通して配置される。このシリンジ・ポンプは、ゲル化時に、少なくともハウジング出口ポート３０に隣接して、所望の寸法のフロー・レストリクターを形成するような量のゲル化可能な物質を含有する。シリンジ・ポンプの作動時に、ゲル化可能な物質はハウジング出口ポート３０を通ってハウジングに入らされ、重力によって下方に流れて、フィラメント外スペースにおいてハウジング出口ポートに隣接して液体スラグ(liquid slug)を形成する。次に、この液体スラグはゲル化して、フロー・レストリクターを形成する。ゲル化可能な物質のハウジング中への導入前に、導入中に又は導入後に、滅菌した流体はフィラメント流路を通って循環することができる。フィラメント外スペースにおけるヒドロゲル・プラグの形成前に例えばグリセリン又はイソプロピルミリステートのような、好ましくない物質をファイバーから、このような循環を用いてすすぎ洗いすることができる。さらに、ゲル化可能な物質の温度を変えてゲル化を行う場合には、フィラメント流路回路中の滅菌した流体の温度を制御して、ゲル化プロセスを活性化し、調節することができる。この方法の１実施態様の詳細な説明を実施例１に与える。さらに、実施例１はコラーゲン・プラグの形成に関するものであると認められるが、この方法が他のヒドロゲル・プラグの形成にも適用可能性を有するように意図されることを理解すべきである。したがって、アルギン酸塩、キトサン、ポリアクリルアミド及び他の二部ヒドロゲル(two part hydrogel)を含むプラグも同様に考慮される。例えば、アルギン酸塩の場合には、アルギン酸ナトリウム溶液をコラーゲン溶液の代わりに用いることができ、付加的な塩化カルシウムをＷｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地に加えることが考えられる。したがって、１実施態様では、このヒドロゲルはフィラメント外スペース中にゲル化可能なポリマーを導入して、フィラメント流路を通してゲル化触媒を循環させることによって生成することができる任意のヒドロゲルであるように意図される。もちろん、このような系では、ゲル化可能なポリマーはフィラメント壁を通過不能でなければならないが、触媒は通過可能性を有さなければならない。代替え手段として、ゲル化可能な物質を遠心分離を利用して、バイオリアクター内に位置決めすることができる。図３Ａと３Ｂに示す、この方法では、複数個のバイオリアクター１０を遠心機５０内に配置する。遠心機内に配置する前に、フィラメント内スペースを２００〜３００ｍｍＨｇに加圧して、フィラメント内アクセスポートを密封して、フィラメント内スペースをヒドロゲル注入中に圧縮された状態で維持させる。これは、ヒドロゲルがゲル化する機会を有する前に、ヒドロゲルがその液体状態でフィラメント壁を横切ってフィラメント内腔に入るのを阻止する。遠心機５０は一般に、駆動モーター５２と、回転シャフト５４と、バスケット５６とを有するものとして示される。シャフト５４によって回転するネスト(nest)５８はバイオリアクターを保持するために用いられる。このネスト５８上には、ハウジング出口ポート３０を介してバイオリアクターと流体連通するポッティング・ボート(potting boat)６０が配置される。インゼクター６２を用いて、ゲル化可能な物質６４をポッティング・ボート６０に注入する、ゲル化可能な物質６４はポッティング・ボート６０からバイオリアクターに入る。使用中に、遠心機を作動させて、ネストと取り付けバイオリアクターとを約２５０〜５００回転／分で回転させる。長さと、直径と、フィラメント充填密度とは、想像される数多くのバイオリアクター形態の中で変化するので、各バイオリアクター種類と各ヒドロゲル先駆体とに対する最適回転速度を見いだすためにはある程度の実験が必要である。ゲル化可能な物質６４はインゼクターから回転ポッティング・ボートに注入される。ゲル化可能な物質は回転のために、ポッティング・ボートの中央からその端部方向に外方へ流動させられる。次に、ゲル化可能な物質はポッティング・ボートを出て、それぞれのハウジング出口ポートからバイオリアクターのフィラメント外スペースに入る。この場合にも、回転の結果として、ゲル化可能な物質は外方に移動させられ、それによって、ハウジング出口ポートに隣接したバイオリアクターの端部を充填する。この方法では、ヒドロゲル形成は、例えば高温アガロースを注入し、それを冷却して、遠心機の停止前に硬化させることによる、又は例えばポリアクリルアミドのような、予備触媒作用を受けて(precatalyzed)、まだプレゲル化時間(pregelling time)を有するヒドロゲルを用いることによるような、温度変化の結果として生ずる筈である。遠心分離の使用は、ゲル化可能な物質の粘度が非常に高くて、重力が図２におけるようなこの物質の適切な位置決めを妨げる状況において特に望ましい。プラグが形成されたならば、バイオリアクターは生細胞と、必要な場合には、それらの支持マトリックスとを挿入されることができる状態である。１つの好ましい実施態様では、生細胞は例えば肝細胞のような生きている哺乳動物細胞を含む。細胞は好ましくはバイオリアクター中に、少なくとも約１０⁷細胞／ｍｌの装填密度で、より好ましくは少なくとも約１０⁸細胞／ｍｌの装填密度で導入される。必ずしも必要ではないが、細胞は例えばコラーゲンマトリックス等のようなゲルマトリックス中に維持されるか又は被包されることができる。このような場合には、細胞支持マトリックスは、必ずしも必要ではないが、フロー・レストリクターの形成に用いられるものと同じゲルであることができる。肝細胞の使用を本明細書を通して詳述するが、本発明がこの特定の細胞種類に用いるように限定されることは意図されないことを認識すべきである。むしろ、一次細胞及び形質転換細胞の両方の非常に多様な細胞のいずれをも本発明の系に用いることができ、このような細胞は、非限定的に、ハイブリドーマ、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、べビー・ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、内皮細胞、上皮細胞及び線維芽細胞を包含する。図４に示した、１つの好ましい実施態様では、フロー・レストリクターの位置決めに用いた方法と同様な方法を用いて、生細胞を、バイオリアクターに導入する。さらに詳しくは、バイオリアクター１０を例えばＷｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地のような、低温の滅菌した流体培地の溜め７０とポンプ７２と共に流体回路に配置する。この回路は、バイオリアクター中への細胞の導入中に、低温の滅菌した流体をバイオリアクター１０のフィラメント流路に通して循環させることを可能にする。図２に示した方法と同様に、低温の滅菌した流体をポンプ７２によって溜め７０からフィラメント入口ポート１８中へ、フィラメント流路に沿って、フィラメント出口ポート２２から、溜めに戻るように循環させることができる。これらの工程の主要な目的は、細胞が装填される間、バイオリアクターを低温（約４〜１０℃）に維持することである。或いは、細胞装填操作を例えば冷蔵庫又は低温室中のような制御された冷却環境(chilled environment)において行うことができる。フィラメント流路を通る低温の滅菌した流体の循環が進行している間に、フィラメント外スペースに細胞と、必要な場合には、細胞支持マトリックスとが次のように装填される。細胞を含有する溜め８０を用意する。この溜めを好ましくは冷却して、細胞の生存能力の維持を助ける。溶液は溜め８０からモーター８４によって駆動されるポンプ８２によって移される。細胞含有溶液はハウジング入口ポート２８を通ってバイオリアクター１０に入る。溶液は次にフィラメント外スペースを満たす。より多くの溶液がバイオリアクターに供給されるように、溶液の一部をフロー・レストリクター３２とハウジング出口ポート３０とを通過させる。フロー・レストリクターは好ましくは、細胞によって置換される流体を退出させながら、細胞を捕捉し、細胞がフィラメント外スペースから退出するのを防止するためのフィルターとして役立つ。圧力パルスとプラグを横切る差圧とを減ずることによって装填プロセスを容易にするために、同じモーター８４に接続した第２ポンプヘッド８６を用いて、バイオリアクターのフィラメント外スペース中に供給される細胞量と同じ量の流体を同時に抜き出すことができる。バイオリアクターを出る流体は廃棄物受器(waste receptacle)８８に運ばれる。フロー・レストリクター３２はヒドロゲルであるので、それを通る流体の流動を妨げて、そのレストリクション(restriction)を横切る有意な圧力低下を生じることは明らかである。このレストリクションはまた、フィラメント外スペースにおける圧力上昇をも生じて、これがこのスペースを通してのプラグ流れ状態に寄与する。プラグ流れ状態の結果、細胞含有溶液はフィラメント外スペース全体に均一に分散して、フィラメント外スペースに通して細胞を均一に分配する。この結果、シャント流れは回避され、緻密で均一な細胞装填が生成される。如何に多くの細胞含有溶液を用いるべきかを測定するために、１つの好ましい実施態様では、この量はフロー・レストリクターの容積を減じたフィラメント外スペースの容積であると定める。したがって、フィラメント外スペースが約１４０ｍｌの容積を有し、レストリクターが約４０ｍｌの容積を占めるリアクターでは、１００ｍｌの細胞含有溶液が用いられる。本発明に用いる細胞が新たに単離された肝細胞である場合には、肝臓の酵素消化の外傷から肝細胞を回復させるために１６〜２４時間の培養期間が与えられる。しかし、細胞を増殖させて、フィラメント外スペースを満たすのではなく、本発明で用いる培養段階の目的は、細胞を生きている状態でかつ生産力ある状態に維持させる、ｐＨ、温度及び培地組成の自然の生理的様状態(natural physiolog ic-like conditions)を確立しながら、細胞を回復させることである。得られる細胞装填バイオリアクターは非常に多くの用途を提供する。例えば、細胞が肝細胞である場合には、バイオリアクターを用いて、完全又は部分的な肝不全を受けた患者を、肝機能が回復するまで又は適当な移植片(transplant)が与えられうるまで維持することができる。バイオリアクターは人工肝臓として作用して、血液を精製する。細胞がバイオリアクターにひと度装填されたならば、バイオリアクターを幾つかの種類の培養回路のいずれかに入れることができる。このような培養回路の例は、米国特許第３，８３３，３９３号(Ｋｎａｚｅｋ)、米国特許第４，２２０，７２５号（Ｋｎａｚｅｋ）及び米国特許第４，８０４，６２８号（Ｃｒａｃａｕｅｒ）に記載される。細胞が生物学的産物を分泌するように遺伝的に変化させられている場合には、本発明を用いて、細胞分泌産物の回収を殆ど直ちに開始することが可能である。このことは、細胞が増殖分割を受けて、リアクターを満たしてから、有用な量の生物学的産物を分泌するまでに数日間又は数週間を待つことがしばしば必要である慣用的な系と対照的であると考えられる。バイオリアクターが肝細胞を含有して、血液精製に用いられる系を図５に概略的に示す。図５では、患者１００から血液が血液ポンプ１０２によって取り出され、ヘパリン・ポンプ１０６によって取り出されたヘパリン１０４を混合される。圧力モニター装置１０８は安全デバイスである。この患者、患者の血液アクセス部位又は患者から導かれるチューブに問題が生じた場合には、負圧の上昇が検出され、これを用いて、アラームを始動させることができる。次に、ヘパリン添加血液は血液加温器１１０で所望の温度に加熱され、酸素供給器１１２に導入される。酸素供給器１１２は酸素供給源１１４と、二酸化炭素供給源１１６と、窒素供給源１１８とが備えられ、これらの各々は、所望の血中ガス含量と血液ｐＨとが得られ、維持されうるように、フロー・コントローラー（それぞれ、１２０、１２２及び１２４）によって調節される。酸素供給器は圧力と温度モニター装置と、当該技術分野で一般的に用いられる、他の血液処理サブシステムとを包含する。酸素供給血液はｐＨプローブ１２６によってモニターされ、次に、バイオリアクター１０のフィラメント流路に通される。血液はフィラメント流路を通過するにしたがって、肝臓によって通常除去される種類の非常に多くの不純物が、フィラメント壁を通って肝細胞にまで拡散される。肝細胞はｉｎｖｉｖｏで通常生ずる種類の肝機能を血液に施す。このプロセス中に、肝細胞は、フィラメント外流路を通って移動する栄養培地によって維持されることができる。栄養培地は栄養物溜め(nutrient reservoir)によって与えられ、この溜めは栄養物溜め中に残留する栄養物(nutrient)量を知るために圧力モニターサブシステムを包含する。使用済み栄養培地はバイオリアクターを出て、培地廃棄物受器１３０まで移動する。しかし、特に患者の治療中の循環栄養溶液の使用は全く任意であり、行われる必要がないことを認識すべきである。バイオリアクターを出る処理済み血液は空気／泡検出器を通って患者に戻される。図５に述べ、示す種類の系が完全又は部分的な肝不全を受けた患者を、適当なドナー肝臓が見つかるまで、又は患者の肝臓が受容される機能を回復するまで、維持することができると考えられる。この後者の場合には、数日間又は数週間の過程にわたる数回の断続的な処理が必要であると考えられる。このことは患者の肝臓が正常な機能に回復するため、又は移植のために充分なドナー器官を位置付けるために充分な時間を提供するという利点を与える。もちろん、本発明のバイオリアクターが肝機能を厳密に限定するように意図されるのではなく、むしろ、このようなリアクターが、生細胞を標準動物組織の密度及び機能に近似する密度及び機能に維持するための体外系を与えることが望ましい幅広い範囲の臨床用途に適合しうることを認識すべきである。実施例実施例１：肝細胞バイオリアクターにおけるコラーゲン・ヒドロゲル・プラグの形成この実施例において、参照番号は図面、特に図１と２の参照番号を意味する。１リットルのフィルター滅菌Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地（ｐＨ７．４０、４℃ ）を溜め４０に導入した。滅菌したチューブを用いて、溜めをポンプ４２に、ポンプから、バイオリアクターの１つのフィラメント・ポートに接続した。他の滅菌したチューブをバイオリアクターの他方のフィラメント・ポートから一時的な滅菌廃棄物受器に接続した。約４５ｍｌの滅菌Ｖｉｔｒｏｇｅｎ−１００を滅菌６０ｍｌシリンジによって取り出し、このシリンジを滅菌チューブを介してハウジング入口ポート２８に連結した。滅菌疎水性エアフィルターと、血圧計とをハウジング出口ポート３０に連結した。血圧計は、バイオリアクターの無菌性を維持するために、フィルターを通してフィラメント外スペースと連通するように配置した。フィラメント外スペースを約２００〜３００ｍｍＨｇ圧に加圧して、ポンプ４２を始動させた。約５００ｍｌのＷｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地をバイオリアクターに通して流動させて、滅菌廃棄物受器中に流入させてから、他の工程を行った。これは、フィラメントをすすぎ洗いして、それらの内部からグリセリン又は他の好ましくない汚染物を除去するために行った。次に、ポンプを停止して、リアクターから出口チューブをクランプして、滅菌廃棄物受器から溜め４０に移した。フィラメント外スペースを次に減圧して、周囲気圧に維持した。コラーゲン充填シリンジを次にシリンジ・ポンプ４４に配置して、約４０ｍｌのＶｉｔｒｏｇｅｎ−１００をバイオリアクターのフィラメント外スペース中に押し出した。コラーゲンは約４０ｍｌ／時の速度でバイオリアクター中に押し出された。コラーゲンがバイオリアクター中に押し出されたならば、シリンジをフィラメント外入口ポートに接続させるチューブをクランプオフした(clamped off )。他方のフィラメント外ポートも血圧計上でニードル弁を閉じることによって閉鎖した。内腔内の(intralumenal)出口チューブのクランプを外して、内腔内の循環ポンプを約３０ｍｌ／分の流速度で作動させた。Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地（ｐＨ７．４）がフィラメントを通って流れるにつれて、フィラメント外スペース中のコラーゲンのｐＨは約２．０から中性まで上昇された。このようにする中に、コラーゲンはゲル化された。ゲル化の初期段階中に、フィラメント外流路内の圧力は血圧計のニードル弁の調節によって厳密に制御された。この厳密な制御は、培地がフィラメント流路からフィラメント壁を通ってフィラメント外スペース中に入りうる状態である限外濾過を避けるために必要であった。この状態はフィラメント外スペース中のヒドロゲル溶液量を希釈して、変化させるので好ましくない。これは、フィラメント外スペース内のコラーゲン溶液のレベルを細心に観察して、上述したように、このスペース中の圧力を調節することによって達成された。如何なる特定の理論にも縛られるのを望む訳ではないが、主として、コラーゲン溶液中の塩酸がＷｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地中に存在する炭酸水素ナトリウムによって中和されるときに発生するＣＯ₂ガスの結果として、圧力が上昇することが考えられる。Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地を約３０ｍｌ／分の速度で約３０〜４５分間循環させた後に、フィラメント内循環ポンプの速度を約６０ｍｌ／分に約３０分間倍加し、溜め４０を３７℃の水浴に入れた。フィラメント内循環ポンプの速度を、約２４０ｍｌ／分の流速度に達するまで、３０分間毎に倍加した。この時点において、コラーゲンのゲル化が実質的に完了した。コラーゲン・プラグによって占有されていない、フィラメント外スペースの残部を、フィラメント外スペースを排気することによってＷｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地によって、限外濾過によって、培地が疎水性エアフィルターに達するまで満たさせた。次に、培地を数時間循環させて、コラーゲン・プラグが完全に硬化することを保証し、残留塩酸を中和させた。実施例２：肝細胞の回収と単離７〜１２ｋｇの雄ブタ（ＭｉｄｗｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈＳｗｉｎｅ，Ｇｉｂｂｏｎ，ＭＮ）から二工程コラゲナーゼ方法を用いて、ブタ肝細胞を回収した。動物をケタミンによって筋肉内麻酔し、挿管し(intubated)、無菌で準備して、滅菌した布で覆った。腹部に入る正中線切開を用いた。横隔膜上の肝臓下の下大静脈（ＩＶＣ）と肝臓上のＩＶＣとを単離して、巻いた(encircled)。次に、先天性三主徴(protal triad)を解剖して、ライゲートし、肝動脈と門脈以外の、全ての構造を分割し、肝動脈と門脈とは単離して、輪にして巻いた。ヘパリンを３００Ｉ．Ｕ．／ｋｇで投与した。３分間後に、滅菌シリコーンチューブによって蠕動ポンプに連結させたカニューレを手術領域に挿入した。次に、肝動脈をライゲートし、分割して、門脈にカニューレを挿入した。５リットルのＰＥＲ− Ｉ溶液（カルシウムを含まないヒドロキシエチルピペラジン−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝化溶液（１４３ｍＭＮａＣｌ、６．７ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍｇ％エチレングリコール−ビス−アミノエチルエーテル(ＥＧＴＡ)、ｐＨ７．４）を、１リットル／ｋｇ体重の速度で、シリコーン酸素供給器と熱交換器（ＡｖｅｃｏｒＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）とに通して灌流させ、直接門脈に達しさせ、血液を洗い出させた。次に、肝上ＩＶＣをライゲートし、分割して、肝臓下ＩＶＣを分割して、灌流液を流出させた。初期灌流中に、肝臓を滅菌したトレイ上に移した。次に、２リットルのＰＥＲＩＩ［ＨＥＰＥＳ緩衝化溶液（６７ｍＭＮａＣｌ、６．７ｍＭＫＣｌ、４．８ｍＭＣａＣｌ₂、１００ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６）と、１ｇ／リットルのＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ−Ｄ(ＢｏｅｈｒｉｎｇＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ)］を肝臓に通して、ＰＥＲ−Ｉと同じ流速度で１０〜１５分間、触診と目視検査とによって測定して、肝臓が軟質になり、充分に消化されるまで再循環させた。肝臓を層流のフード(laminar flow hood)まで取り出して、被膜を全ての葉上で切開した。次に、肝臓を５℃のＷｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地中で穏やかに撹拌しながら、刃先が鈍い道具によって(bluntly)、骨格だけにして、肝細胞を遊離させた。細胞を負荷した培地を、組織断片を除去するために単層の滅菌ガーゼを含有するＢｕｃｈｎｅｒロートに通して、滅菌２５０ｍｌ遠心分離管中に濾過した、この遠心分離管は５００〜７００ＲＰＭにおいて５分間回転して、軟質細胞ペレットを形成した。このペレットを新鮮な培地中に再懸濁させて、さらに２回遠心分離した。肝細胞の生存能力と細胞数とを血球計とＴｒｙｐａｎＢｌｕｅ色素排除法とを用いて評価した。実施例３：バイオリアクター装填約１００ｍｌの肝細胞ペレットを滅菌２５０ｍｌポリエチレンボトルに移した。２５ｍｌのＶｉｔｒｏｇｅｎ−１００を細胞に加え、ボトルを穏やかに旋回させて、コラーゲンと細胞とを混合した。１００ｍｌのこの溶液を２つの６０ｃｃシリンジ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ，ＮＪ）の各々に５０ｍｌずつピペットで量り入れ、図４に示した回路と同様な回路に接続させた。細胞を低温に維持するために、これらのシリンジを氷上に置いた。細胞装填ポンプ８４を１００ｍｌ／時の速度にセットして、細胞をフィラメント外スペースに１時間にわたって注入した。細胞装填中にバイオリアクターを低温に維持するためにフィラメント内ポンプ７２を３００ｍｌ／分の流速度にセットした。肝細胞溶液の全てをフィラメント外スペース中に押し出した後に、滅菌キャップをポートの全てに被せ、バイオリアクターをＣＯ₂と湿度とが調節されたインキュベーターに移した。実施例４：バイオリアクター培養バイオリアクター製造の培養段階中に用いた流体回路の例を図６に概略的に示す。肝細胞含有バイオリアクターを培養回路に入れ、約１８時間インキュベーター中に維持して、細胞を休止させた(allow the cells to rest)。この時間中に、細胞を回収のストレスから回復させ、細胞対細胞の接触を再確立させ、細胞の局所環境(local environment)を再モデル化することができる。インキュベーターＣＯ₂は５．５％に、温度は３７℃に、湿度は７０〜８０％に維持した。バイオリアクターを図６に示したような種類の回路中に維持した。フィラメント内回路は、表１に示すような組成を有するＷｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地を含有する１リットル溜め１５０から構成される：７００〜９００ｍｌ／分で作動する蠕動ポンプ１５２を用いて、培地を１リットル溜め１５０からシリコーン膜酸素供給器１５４を介して取り出され、この酸素供給器において培地は酸素供給され、７．２にｐＨ調節される。酸素供給器による酸素供給とｐＨ調節とが、エアポンプ（ＭＥＤＯＵＳＡ，ＨａｎｏｖｅｒＰａｒｋ，ＩＬ）（図示せず）を用いて、インキュベーター・ガスを酸素供給器のガス路に通して循環させることによって、達成された。酸素供給器から、培地をバイオリアクター１０の内腔内スペース中に供給され、次に、バイオリアクターの内腔内スペースの出口１８から１リットル溜め１５０に戻される。サンプル点Ｓ₁とＳ₂とを用いて、ｐＨと酸素含量との血中ガス分析のためにバイオリアクターの前後で定期的に培地を取り出した。肝臓損傷イヌに連結するためにバイオリアクターを取り出すまで、再循環を維持した。バイオリアクターのフィラメント外側には、表２に示す組成を有する培地の５００ｍｌ溜め１５６を包含する第２循環路が存在した：バイオリアクターをインキュベーター中に設置した後１２時間まで、フィラメント外培地の循環は始動させなかった。循環速度は３０ｍｌ／時であり、これを肝臓損傷イヌに用いるためにバイオリアクターを取り出すまで続けた。実施例５：イヌの肝臓損傷とバイオリアクター治療バイオアーティフィシャル(bioartificial)肝臓として用いるための肝細胞含有バイオリアクターの評価を、Ｓｉｅ１ａｆｆ等（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２１：(３)，１９９５）が述べているモデルと同様な、致死イヌガラクトサミン肝不全モデルを用いて行った。Ｓｉｅｌａｆｆが公表しているようなプロトコールからの改変は、麻酔薬としてのイソフルオランによるハロタンの置換と、動物を予防的に(proactively)管理するためのより頻繁な実験室試験とを包含した。さらに、供給源動物(source animal)は、Ｓｉｅｌａｆｆ研究で報告された雑種犬の代わりに、目的−繁殖され(purpose-bred)、健康な(well-conditioned)猟犬であった。これらの変更の結果として、動物は報告されたよりも多少長く生存し、その結果として、これらの研究は６０時間まで延長された。Ｄ−ガラクトサミン（１．５ｇ／ｋｇ体重）を摂取したイヌは２４時間かけて肝不全に進行させられ、この時点でバイオアーティフィシャル肝臓による血液灌流を開始した。この血管アクセス・デバイスは、Ｄ−ガラクトサミンを投与する前に、右内頚静脈中に手術によって移植された二重内腔カテーテルであった。治療目的は、動物が６０時間の試験期間を終了して又はこの試験期間の終了に達して、選択的に安楽死させられるまでできるだけ高い流速度で血液灌流することであった。実際に、初期流速度は典型的に２００ｍｌ／分を越えた。この速度は、動物が徐々に浮腫を形成するようになり、血管アク七スの開存性(potency) が劣化するに従って低下した。カテーテルが凝固して破壊したことはなかった。幾つかの試験では、血液流速度がイヌに投与後５０時間で又は連続血液灌流の２６時間後に、１００ｍｌ／分未満に低下した。４匹の動物をこの方法で、６０〜８０ｇの一次ブタ肝細胞を装填したバイオリアクターを用いて治療した。動物を対照動物(control subject)と同じ介入スケジュール(intervention schedule)に従って管理した。４匹の治療した動物のうちの２匹は試験期間の終了時まで生存した。これとは対照的に、治療しなかった動物のいずれも試験期間の終了時まで生存しなかった。この生存率の差は図７にＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットの形式で示される。データ・セットに含まれる５匹の非治療対照動物と４匹の治療動物とをＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存統計によって評価した。サンプルサイズと、試験の任意の停止条件とのために、結果は統計的有意性（ｐ＝０．０６）に達しない。動物にＬＡＤＤ硬膜上方頭蓋内圧モニターを装着した。これらの動物を試験を通して連続的にモニターしたが、データは毎時間記録した。４匹の治療動物の各々の結果は、これらのデータの平均値と共に、図８に示す。バイオアーティフィシャル肝臓で支持された動物は対照動物が示したパターンと類似した振動性(osc illatory)ＩＣＰパターンを示した。前記と同様に、選択したサンプリング間隔は担当スタッフが観察したＩＣＰのサージ変化を不明瞭にする。５匹の対照動物と４匹の治療動物との平均読み取り値を図８において比較する。データ・セット中に存在する多様な混乱ファクター(confounding factors)のために、統計的検定はこれらのデータに適用しなかった。これらのファクターは、治療動物に明らかに必要であったよりも、頻繁にかつ侵襲性の医学的介入（管理ガイドライン下で容認される）が非治療動物において生じたという事実を包含する。長く生存した非治療動物は試験において早期に終了した(expiring)ものよりも平均して低いＩＣＰ値を有するので、バイアス(bias)も導入される。入手可能な、ＩＣＰデータと平均動脈圧（ＭＡＰ）の両方によって、これらの試験動物における脳灌流圧（ＣＰＰ）を算出することが可能である。図９に示すように、治療動物におけるＣＰＰは、非治療動物におけると同様に低下する。さらに、低い値を有する動物は短い生存時間を有するように思われる。治療イヌと非治療イヌとのＣＰＰ値の算術平均値を図９に一緒に示す。両方の動物群には、脳への血流低下が存在する。薬物の投与後３０〜４０時間における非治療動物のＣＰＰの上昇は、非治療集団における血圧低下を矯正するためのより大きく侵襲性の介入によると考えられる。図１０に示すように、動脈アンモニア・レベルの上昇は治療動物においては緩和である。この効果は４０時間と４８時間とにおいては、非治療動物からのデータにおける大きな分散のために、統計的に有意ではない。５６時間目におけるデータの収斂(convergence)は、確実な(sicker)非治療動物、より高いアンモニア値を有する動物がより短い生存時間を有するという事実の結果である。図１１に示すように、治療動物と非治療動物との両方における分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）の芳香族アミノ酸（ＡＡＡ）に対する比率は低下する。この差は４８時間目に統計的有意性に達する。中間値は得られず、この変化の大きさが有意義な患者の利益を生じるほど充分であるかどうかは不明である。イヌに接続する前後のバイオリアクターの酸素消費速度を図１２に示す。同等性本発明の範囲及び要旨から逸脱しない、本発明の種々な改変及び変更が当業者に明らかであろう。本発明が本明細書に記載された例示的実施態様及び実施例によって不当に制限されないことと、このような実施例及び実施態様が例としてのみ提示されるにすぎず、本発明の範囲は次のように本明細書に述べる請求の範囲によってのみ限定されるように意図されることを理解すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．下記要素：（ａ）中心軸を画定する細長いハウジングと；（ｂ）中心軸に実質的に平行なハウジング内にそれぞれ配置され、ハウジング内のフィラメント外スペースをそれぞれ画定する多数の細長い中空フィラメントであって、各々がこれを通る分子輸送を可能にする材料から形成される上記中空フィラメントと；（ｃ）ハウジング内に配置され、フィラメント外スペースを占有し、生細胞を含む細胞集団と；（ｄ）中空フィラメントを通して連通して、フィラメント流路を形成する、フィラメント入口ポートとフィラメント出口ポートと；（ｅ）細胞集団を通して連通して、フィラメント外流路を画定する、ハウジング入口ポートとハウジング出口ポートであって、フィラメント外流路がフィラメント流路から、一方の流路中の物質が他方の流路内に中空フィラメントを構成する材料を通しての分子輸送によってのみ入ることができるように単離されている、上記ハウジング入口ポートとハウジング出口ポートと；（ｆ）フィラメント外流路を通して実質的に均一な流れを維持するためにフィラメント外流路中に配置されたフロー・レストリクターとを含むバイオリアクター。２．細胞が哺乳動物細胞である、請求項１記載のバイオリアクター。３．細胞が少なくとも約１０⁷細胞／ｍｌの密度で存在する、請求項１記載のバイオリアクター。４．細胞が少なくとも約１０⁸細胞／ｍｌの密度で存在する、請求項１記載のバイオリアクター。５．細胞が肝細胞である、請求項２記載のバイオリアクター。６．細胞が肝細胞である、請求項３記載のバイオリアクター。７．細胞が肝細胞である、請求項４記載のバイオリアクター。８．フロー・レストリクターがヒドロゲルを含む、請求項１記載のバイオリアクター。９．フロー・レストリクターがコラーゲン、アガロース、アルギン酸カルシウム、酢酸キトサン、ポリアクリルアミド、又はこれらの組合せから選択される物質を含む、請求項１記載のバイオリアクター。１０．フィラメントがポリスルホン、酢酸セルロース、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート、又はエチレンポリビニルアルコールコポリマーから製造されるフィラメントから選択される、請求項１記載のバイオリアクター。１１．生物学的流体の処理方法であって、（ａ）下記要素（ｉ）中心軸を画定する細長いハウジングと；（ii）中心軸に実質的に平行なハウジング内にそれぞれ配置され、ハウジング内のフィラメント外スペースをそれぞれ画定する多数の細長い中空フィラメントであって、各々がこれを通る分子輸送を可能にする材料から形成される上記中空フィラメントと；（iii）ハウジング内に配置され、フィラメント外スペースを占有し、生物学的流体を処理することができる生細胞を含む細胞集団と；（iv）中空フィラメントを通して連通して、フィラメント流路を形成する、フィラメント入口ポートとフィラメント出口ポートと；（ｖ）細胞集団を通して連通して、フィラメント外流路を画定する、ハウジング入口ポートとハウジング出口ポートであって、フィラメント外流路がフィラメント流路から、一方の流路中の物質が他方の流路内に中空フィラメントを構成する材料を通しての分子輸送によってのみ入ることができるように単離されている、上記ハウジング入口ポートとハウジング出口ポートと；（vi）フィラメント外流路を通して実質的に均一な流れを維持するためにフィラメント外流路中に配置されたフロー・レストリクターとを含むバイオリアクターを用意する工程と；（ｂ）生物学的流体をフィラメント流路に沿って移動させる工程とを含む上記方法。１２．細胞のための養分を含有する流体をフィラメント外流路に沿って移動させる工程をさらに含む、請求項１１記載の方法。１３．細胞が哺乳動物細胞である、請求項１１記載の方法。１４．細胞が少なくとも約１０⁷細胞／ｍｌの密度で存在する、請求項１１記載の方法。１５．細胞が少なくとも約１０⁸細胞／ｍｌの密度で存在する、請求項１１記載の方法。１６．細胞が肝細胞である、請求項１３記載の方法。１７．細胞が肝細胞である、請求項１４記載の方法。１８．細胞が肝細胞である、請求項１５記載の方法。１９．フロー・レストリクターがヒドロゲルを含む、請求項１１記載の方法。２０．フロー・レストリクターがコラーゲン、アガロース、アルギン酸カルシウム、酢酸キトサン、ポリアクリルアミド、又はこれらの組合せから選択される物質を含む、請求項１１記載の方法。２１．フィラメントがポリスルホン、酢酸セルロース、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート、又はエチレンポリビニルアルコールコポリマーから製造されるフィラメントから選択される、請求項１１記載の方法。２２．フィラメント流路とマトリックス流路とが並流の流れを有する、請求項１２記載の方法。２３．フィラメント流路とマトリックス流路とが向流の流れを有する、請求項１２記載の方法。２４．生物学的流体が血液を含む、請求項１１記載の方法。２５．生物学的流体が血液を含む、請求項１６記載の方法。２６．フロー・レストリクターを有するバイオリアクターの製造方法であって、（ａ）中空フィラメント・バイオリアクター・カートリッジを用意する工程であって、該カートリッジがそれぞれがハウジング内に中心軸に実質的に平行に配置されて、ハウジング内にフィラメント外流路を画定する多数の細長い中空フィラメントを含有するハウジングを含み、該中空フィラメントの各々がこれを通る分子輸送を可能にする材料から形成されており、該ハウジングが、中空フィラメントを通して連通して、フィラメント流路を形成する、フィラメント入口ポート及びフィラメント出口ポートと、細胞集団を通して連通して、フィラメント外流路を画定する、ハウジング入口ポート及びハウジング出口ポートとをさらに含み、該フィラメント外流路が該フィラメント流路から、一方の流路中の物質が他方の流路内に中空フィラメントを構成する材料を通しての分子輸送によってのみ入ることができるように単離されている上記工程と；（ｂ）ある量のゲル化可能な物質をハウジング中に、その物質が少なくともハウジング出口ポートに隣接して配置されるようたやり方で導入する工程であって、該量が、ゲル化時に生成したゲルが、ハウジング出口ポートを通って流れる流体を制限するほど充分に、フィラメント外スペースの部分を占有するような量である上記工程とを含む上記方法。２７．滅菌流体がフィラメント流路を通って流れるときに、ゲル化可能な物質をゲル化する工程をさらに含む、請求項２６記載の方法。２８．ゲル化が温度変化によって制御される、請求項２６記載の方法。２９．ゲル化が、滅菌流体の温度を変えることによって制御される、請求項２６記載の方法。３０．ゲルが重力によってハウジング出口ポートに少なくとも隣接して位置決めされる、請求項２６記載の方法。３１．ゲルが遠心分離によってハウジング出口ポートに少なくとも隣接して位置決めされる、請求項２６記載の方法。３２．ゲルがコラーゲン、アガロース、アルギン酸カルシウム、酢酸キトサン、ポリアクリルアミド、又はこれらの組合せから選択される物質を含む、請求項２６記載の方法。３３．生成するゲルがフィラメント外流路を通る実質的に均一な流れを維持するために充分な、フィラメント外スペースの部分を占有する、請求項２６記載の方法。３４．下記要素：（ａ）中心軸を画定する細長いハウジングと；（ｂ）中心軸に実質的に平行なハウジング内にそれぞれ配置され、ハウジング内のフィラメント外スペースをそれぞれ画定する多数の細長い中空フィラメントであって、各々がこれを通る分子輸送を可能にする材料から形成される上記中空フィラメントと；（ｃ）中空フィラメントを通して連通して、フィラメント流路を形成する、フィラメント入口ポートとフィラメント出口ポートと；（ｄ）フィラメント外スペースを通して連通して、フィラメント外流路を画定する、ハウジング入口ポートとハウジング出口ポートであって、フィラメント外流路がフィラメント流路から、一方の流路中の物質が他方の流路内に中空フィラメントを構成する材料を通しての分子輸送によってのみ入ることができるように単離されている、上記ハウジング入口ポートとハウジング出口ポートと；（ｅ）フィラメント外流路を通して実質的に均一な流れを維持するためにフィラメント外流路中に配置されたフロー・レストリクターとを含むバイオリアクター。３５．フロー・レストリクターがヒドロゲルを含む、請求項３４記載のバイオリアクター。３６．フロー・レストリクターがコラーゲン、アガロース、アルギン酸カルシウム、酢酸キトサン、ポリアクリルアミド、又はこれらの組合せから選択される物質を含む、請求項３４記載のバイオリアクター。３７．フィラメントがポリスルホン、酢酸セルロース、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート、又はエチレンポリビニルアルコールコポリマーから製造されるフィラメントから選択される、請求項３４記載のバイオリアクター。３８．請求項１記載のバイオリアクターを含む体外回路。３９．細胞が肝細胞である、請求項３８記載の体外回路。