JP2000500982A

JP2000500982A - 植物におけるデンプン合成の変更

Info

Publication number: JP2000500982A
Application number: JP9520774A
Authority: JP
Inventors: レウィスキーリング，ピーター; エリザベスナイト，マリー
Original assignee: ゼネカリミテッド
Priority date: 1995-12-06
Filing date: 1996-12-04
Publication date: 2000-02-02
Also published as: WO1997020936A1; GB9524938D0; AU1037197A; EP0865494A1; AU725926B2; CA2238399A1

Abstract

(57)【要約】デンプン合成経路に対する変更を有する植物（特に、穀類植物）が、配列番号１または配列番号２または配列番号３の配列を有する可溶性デンプンシンターゼ酵素を特定するDNAを含む。挿入される遺伝子は、センスまたはアンチセンスの構築物内に挿入され得る。挿入された遺伝子により導入される改変により、デンプンまたは異なる微細構造（例えば、分枝の異なるパターン）を有するデンプンを産生する能力が、より増強し得るか、または減少し得る。

Description

【発明の詳細な説明】植物におけるデンプン合成の変更本発明は、植物におけるデンプンの産生を導く生合成経路の改変に関する。用語「改変」により、本発明者らは、植物が産生するデンプンの正常な量または質からの変化を意味する。さらに詳細には、本発明は、可溶性デンプンシンターゼ酵素のいくつかの形態をコードするDNAの単離、精製、および特徴付け、ならびにデンプン産生を改変するための植物ゲノムの遺伝子的変更を介したそれらのDN Aの使用に関する。本発明はまた、デンプンを産生する改良された能力（これは、構造的に改変されたデンプンを産生する改良された能力を含む）を有する新規な植物に関する。本発明者らの以前の研究は、発達しているデンプン貯蔵組織におけるデンプン合成の代謝経路の新たな理解に導いた（Keelingら，1988，Plant Physiology，8 7; 311-319; Keeling，1989，C.D.Boyer，J.C.ShannonおよびR.C.Harrison編;63 -78頁，Plant Physiologyの第４回Annual Penn Stateシンポジウムで発表）。デンプンは、葉における光合成の間の重要な炭素固定の最終産物であり、種子および果実における重要な貯蔵産物である。経済的な点からみると、３種の穀類作物（コムギ、イネ、およびトウモロコシ）の食用部分により提供されるデンプンは、カロリーとして計算すると世界の食物の約３分の２を提供する。デンプンは、光合成細胞内の色素体区画である葉緑体で、または非光合成細胞内のアミロプラストで合成される。葉におけるデンプン生合成の生化学的経路は、よく特徴づけられている（図１）。対照的に、貯蔵器官におけるデンプン生合成の経路はほとんど知られていない。遺伝子発現の制御のための２つの主要な方法が知られている。これらは、当該分野において「アンチセンスダウンレギュレーション」および「センスダウンレギュレーション」すなわち「コサプレッション」と呼ばれる。これらの両方法は、標的遺伝子発現の阻害を導く。過剰発現は、選択された遺伝子の１つ以上の余分なコピーの挿入により達成される。他のより少なく使用される方法は、遺伝子制御エレメント（プロモーターおよび制御配列）の変更を含み、挿入された遺伝子のより多いまたはより少ない発現を達成する。アンチセンスダウンレギュレーションにおいて、標的遺伝子の全てまたは一部に相補的なDNAは、逆方向でおよびその翻訳開始シグナルを伴うことなくゲノムに挿入される。最も単純な理論は、以下である：転写可能であるが翻訳可能でないこのようなアンチセンス遺伝子は、内因性遺伝子から転写されたmRNA産物と配列が相補的であるmRNAを産生する：次いで、アンチセンスmRNAは、天然に産生された「センス」mRNAと結合し、天然のmRNAのタンパク質への翻訳を阻害する二重鎖を形成する。挿入されたアンチセンス遺伝子が、内因性遺伝子配列と長さが等しい必要はない：フラグメントで十分である。フラグメントのサイズは、特に重要ではないようである。40またはそのようなヌクレオチドくらいの小ささのフラグメントが効果的であることが報告されている。一般的に、50ヌクレオチドの領域内のある部分が、阻害効果を得るために十分であると認められる。しかし、より少数のヌクレオチドが非常によく作用し得ることが言われるべきである：完全長の等価物までのより多数のヌクレオチドは確実に作用する。50ヌクレオチドの下流のどこかに都合の良い制限酵素切断部位が存在するフラグメント長を単に使用することは、通常である。遺伝子のフラグメントのみが必要とされるという事実は、遺伝子の全てを配列決定する必要がないことを意味する。それはまた、一般的にcDNAで十分であり、これは全てのゲノム配列を単離する必要性を除去することを意味する。アンチセンスフラグメントは、標的遺伝子の内因性相補鎖と正確に同じである必要はない。単に、標的遺伝子の阻害を達成するために十分な配列の類似性がなければならない。これはアンチセンス技術の重要な特徴である。なぜなら、ある植物種由来の配列の使用が、別の植物種に効果的であることを可能にし、そして目的の個々の種それぞれのためのアンチセンスベクターを構築する必要性を除去するからである。ある種から単離した配列は別の種に効果的であるが、一方の種と他方の種との間の配列類似性の程度が、効果を得るには不十分である例外を見出すことは希ではない。そのような場合では、種特異的ホモログを単離する必要があり得る。アンチセンスダウンレギュレーション技術は、当該分野において十分に確立されている。それは、いくつかの教科書および数百の学術雑誌の対象である。主要な特許の参考文献は、Calgene Incの名における欧州特許第240,208号である。アンチセンス技術の操作性を疑う理由は存在しない。それは世界中の研究室において十分に確立され、日常的に使用され、そして使用される製品は販売されている。過剰発現およびダウンレギュレーションの両方は、「センス」技術により達成される。標的遺伝子の完全長のコピーをゲノムに挿入した場合、次いで表現型の範囲（range）（標的遺伝子を過剰発現している表現型もあれば、過小発現している表現型もある）が得られる。次いで、この方法により作製された植物の集団はスクリーニングされ、そして個々の表現型が単離される。アンチセンスを用いた場合のように、挿入された配列は翻訳開始シグナルを欠如している。アンチセンスとの別の類似性は、挿入された配列が完全長のコピーである必要はないことである。実際に、過剰発現の表現型および過小発現の表現型の分布は、過小発現に有利に傾くことが見出され、そしてこれは、遺伝子の阻害が所望の効果である場合に利点となる。過剰発現については、挿入されたコピー遺伝子がその翻訳開始コドンを保有することが好ましい。コサプレッションの主要な特許の参考文献は、DNA Plant Technology Incの名における欧州特許第465,572号である。この技術の操作性を疑う理由は存在しない。それは世界中の研究室で十分に確立され、日常的に使用され、そして使用される製品は販売されている。センスおよびアンチセンス遺伝子調節は、BirdおよびRayによりBiotechnology and Genetic Engineering Reviews 9: 207-227(1991)に概説される。トマトにおける選択された遺伝子を制御するためのこれらの技術の使用は、Grayら,PlantMo lecular Biology,19: 69-87(1992)により記載される。記載された任意の方法による遺伝子制御は、形質転換による、センスまたはアンチセンス配列（適切なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む終結配列を伴う）の標的植物種のゲノムへの挿入、それに続く形質転換体の完全な植物への再生を必要とする。形質転換の方法は、大部分の植物種について存在するか、または利用可能な方法の適応により得られ得ることを言うことは、おそらく正しい。双子葉植物のために、最も広範に使用されている方法は、アグロバクテリウム媒介性形質転換である。これは、最もよく知られ、最も広範に研究され、それ故に全ての形質転換方法の中で最もよく理解されている。根粒細菌（rhizobacteri um）であるAgrobacterium tumefaciensまたは関連するAgrobacterium rhizogene sは、天然で、細菌により感染された植物において病気の症状（クラウンゴールまたは毛状根腫瘍）の形成を引き起こす特定のプラスミドを含む。病原性のアグロバクテリウムにより利用される機構の一部は、右側および左側の境界領域に結合するプラスミドDNAの断片が、感染植物のゲノムに安定に転移されることである。従って、外来DNAは、通常T領域中に存在する遺伝子を置換して、いわゆる「転移」領域（T領域）に挿入される場合、その外来遺伝子は植物ゲノムに転移される。雑誌論文、教科書、および特許において数百の参考文献が存在し、そして方法論が十分に確立されている。アグロバクテリウムの有効性は微生物の宿主範囲に限定され、従って双子葉植物種に多少限定される。重要な穀類作物を含む一般的な単子葉植物種は、アグロバクテリウムの方法による形質転換を受け入れない。DNAを単子葉植物細胞の核に直接挿入するための種々の方法が公知である。衝撃法（ballistic method）では、高密度な金属（通常は、金またはタングステン）の微粒子が、それらが侵入する細胞である標的細胞へ高速で発射され、これは、細胞壁にDNAが侵入し得る孔を開ける。DNAは微粒子にコートされ得るか、または培養培地へ添加され得る。マイクロインジェクションでは、DNAは、注入により超微細な中空の針（hollo w needle）を介して個々の細胞へ挿入される。単子葉植物および双子葉植物の両方に適用可能な別の方法は、液体中に標的細胞の懸濁液を作製する工程、微細な針様物質（例えば、炭化ケイ素物または窒化ケイ素物「ホイスカー（whisker）」）を添加する工程、ならびに細胞およびホイスカーが衝突し、そして液体中に存在するDNAが細胞に侵入するように撹拌する工程を包含する。次いで、要約すれば、センスおよびアンチセンス技術の両方に対する要求は公知であり、そして必要とされる配列が導入され得る方法は公知である。次いで、残りは、その調節が所望の効果を有すると予測される遺伝子を同定し、それらを単離するか、または十分に有効な長さのフラグメントを単離し、キメラ遺伝子を構築し（ここで、有効なフラグメントはプロモーターと終結シグナルとの間に挿入される）、そして形質転換により構築物を標的植物種の細胞に挿入することである。次いで、完全な植物が形質転換された細胞から再生される。本発明の目的は、可溶性デンプンシンターゼをコードするDNAを提供することである。本発明の更なる目的は、デンプンを産生する増強された能力および改変された微細構造のデンプンを産生する能力を有する新規な植物を提供することである。本発明によると、プラスミドpSSS6、pSSS10.1、およびpSSS6.31における挿入物の配列、ならびにデンプンを産生する生物体のゲノムに挿入された場合に、デンプンの合成が改変されるような十分な類似性を有する配列を有するcDNAが提供される。プラスミドpSSS6は、ブタペスト条約の条件の下にNational Collections of I ndustrial and Marine Bacteria Limited，23，St Machar Drive，Aberdeen AB1 2RYへ1994年６月13日に、受託番号40651で寄託された。プラスミドpSSS6.31およびpSSS10.1は、ブタペスト条約の条件の下にNational Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited，23，St Machar Dr ive, Aberdeen AB1 2RYへ1994年８月22日に、それぞれ、受託番号NCIMB 40679および40680で寄託された。本発明はまた、配列番号１、配列番号２、および配列番号３の配列を有する可溶性デンプンシンターゼをコードするcDNAを提供する。本発明はまた、センスまたはアンチセンスの方向で１つ以上の上記DNAの１つ以上のコピーを含む形質転換植物を提供する。以下の記述は、トウモロコシから可溶性デンプンシンターゼをコードする遺伝子の単離の方法を記載する。これらのDNAは、対応するゲノム配列の単離のために使用され得る。次いで、c DNAまたは遺伝子のいずれかが、デンプン収量の増加を導く研究において使用され得る。１つの可能な適用は、形質転換された作物植物においてSSSの遺伝子用量を増加してデンプン生合成の最終的な調節へのSSSの寄与を決定するための、および植物により合成されるデンプンのレベルを変更するためのこれらの配列の使用であり得る。SSS遺伝子の更なるコピーの導入は、アミロプラストにおいてより高いレベルの酵素を産生するはずである。増加された遺伝子発現はまた、エンハンサー配列の複数のコピーをSSS遺伝子の5'非転写領域に導入することにより誘発され得る。酵素がデンプンの生合成の律速である場合、次いでデンプンの生合成の速度が形質転換された植物において増加することが期待される。本発明により、タンパク質の操作を介して胚乳酵素の速度論的な特性を改変することもまた可能である。明らかに、他の多くのパラメーターもまた、改良され得る。本発明は、現在、例示のために、以下の実施例により、および添付の図面を参考にして記載される：図１は、葉におけるデンプンおよびグルコースの生合成経路に関与する反応を示す。使用した略語は、以下である：G-3-P、グリセルアルデヒド-3-リン酸；DH AP、ジヒドロキシアセトンリン酸；Pi、オルトリン酸；PPi、無機ピロリン酸。反応は以下の酵素により触媒される。１）ホスホグリセリン酸キナーゼ／グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ２）トリオース−リン酸イソメラーゼ３）アルドラーゼ４）フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ５）へキソースリン酸イソメラーゼ６）ホスホグルコムターゼ７）ADP-グルコースピロホスホリラーゼ８）デンプンシンターゼ９）UDP-グルコースピロホスホリラーゼ 10）スクロースリン酸シンターゼ 11）スクロースホスファターゼ 12）オルトリン酸／トリオースリン酸トランスロケーター 13）無機ピロフォスファターゼ図２は、提唱された小麦の胚乳におけるデンプン生合成の代謝経路（Keeling ら、1988）を示す。使用される略語は、図１と同じである。反応は、以下の酵素により触媒される。１）スクロースシンターゼ２）UDP-グルコースピロホスホリラーゼ３）へキソキナーゼ４）ホスホグルコムターゼ５）へキソース−リン酸イソメラーゼ６）ATP依存性ホスホフルクトキナーゼ７）PPi依存性ホスホフルクトキナーゼ８）アルドラーゼ９）トリオースーリン酸イソメラーゼ 10）へキソースーリン酸トランスロケーター 11）ADP-グルコースピロホスホリラーゼ 12）デンプンシンターゼ 13）スクロースリン酸シンターゼ 14）スクロースホスファターゼ可溶性デンプンシンターゼまたは分枝酵素（branching enzyme）の使用標準的なクローニング技術を使用して、SSS遺伝子を単離し得る。遺伝子の供給源は、トウモロコシのUS yellow-dentトウモロコシ株であり、これから酵素蛋白を精製した。トウモロコシ株由来の胚乳を、活性形態のSSSを維持する緩衝液中でホモジナイズした。トウモロコシ由来のSSSの精製を硫酸アンモニウム沈殿、DEAE-セルロースクロマトグラフィー、ゲル濾過、フェニルSuperose、およびMono-Qカラムを用いたFP LCの組み合わせにより達成した。これは、５％までの収量で数百倍の精製を生じる。SSSポリペプチドは、分子量76kDaの単一のサブユニットであった。他のSSS ポリペプチドは、分子量が約60kDa、70kDa、および105kDaで近交系のUS dentに存在する。 SSS Iの硫酸アンモニウム沈殿を、10〜35％硫酸アンモニウムを使用して、最もよく達成する。これは半透明のSSSが濃縮されたぺレットを産生し、次いでそれを透析し、さらにDEAE-セルロースイオン交換クロマトグラフィー（2.5×５cm カラム）を使用して分画する。SSSを、150mlのKClの勾配（０〜0.6M）を用いて溶出し、そして画分を回収する。これらの工程は、比活性を12倍まで増強する。 DEAEのピーク画分を硫酸アンモニウム(40％)を用いた沈殿により濃縮し、そして得られたペレットを緩衝液に溶解し、そして緩衝液で平衡化したSephacryl S-20 0カラム(2.5×100cm)で分画し、そして画分を回収した。これらの工程は、比活性を８倍まで増大する。フェニル-Superoseカラムを硫酸アンモニウムを含む緩衝液で平衡化した。SSS Iは結合せず、そして通過した画分中に存在した。これらの工程は、比活性を２倍まで増大する。最終的に、Mono-Qカラムを緩衝液で平衡化し、そしてフェニル-Superoseを通過した画分で充填した。12mlの０〜0 .5M KClの直線勾配を使用してカラムから酵素を溶出させ、画分を回収した。これらの工程は、比活性を５倍まで増大した。最終の精製工程において、SSS調整物をSDS PAGEゲルにロードした。SSSポリペプチドに対応するバンドを切り出して、そして溶出させる。ポリペプチドを、標準的なアミノ酸配列決定技術を使用して配列決定する。抗体産生のための純粋な抗原を生成するために、本発明者らは、SSSタンパク質の単離の出発点としてデンプン顆粒を使用することを決定した。穀粒を、Wari ngブレンダーで粉砕することにより緩衝液中でホモジナイズした。ホモジネートを、ミラクロス(miracloth)を通して濾過し、遠心分離した。上清および白色のデンプンのペレットに重層する変色した物質を捨てた後に、ぺレットを緩衝液を用いて２回洗浄し、そして遠心分離した。デンプンを最終時に冷却したアセトンを用いて洗浄し、続いて遠心分離し、-20℃で保存する前に気流下で乾燥した。ブロモフェノルブルーを欠く50mlSDS-PAGEサンプル緩衝液（２％SDS、５％2-メルカプトメタノール、10％グリセロール、および62.5mM Tris/HCl(pH6.8)）中で 1.4gのデンプンを10分間煮沸することにより、顆粒タンパク質を抽出した。冷却し、そして25,000g、４℃で15分間遠心分離をした後に、上清を等量の30％TCAと混合し、そして４℃で１時間放置した。溶液を再び遠心分離し、そして1.4mlのS DS-PAGEサンプル緩衝液に再懸濁する前に、ペレットを10mlのアセトンを使用して２回洗浄した。SDS-PAGEによる顆粒由来のタンパク質の分離に続き、SSSタンパク質（例えば、60kDa、76kDaなど）のバンドを電気溶出(electroelute)し、そして抗原（New Zealand白兎に４週間の間隔で50μg用量を３回）として使用して、ウサギの中にポリクローナル抗体を生成させた。次いで、抗体を、SSSポリペプチドに対する特異性について試験した。抗体は単一特異性であり、徹底的な酵素活性の分析および発現の研究を可能にした。 N末端アミノ酸配列もまた、ポリペプチドから得た。これらのタンパク質は、( i)従来の手段により精製されそして配列決定されたSSSのN末端配列が顆粒由来のタンパク質と同一であった、および(ii)プロテアーゼ消化物が、これも同一であるペプチドマップを示したことに基づいて、可溶性タンパク質と同一であることが示された。トウモロコシSSSポリペプチドのアミノ酸配列決定により、以下の部分的な配列を得た。 N末端... C V A E L S R E G P A P R 内部配列: ＫＮＹＡＮＡＦＹＴＥＴＨＩＥＬＧＧＹＩＹＧＱＮＤＭＦＶＶＮＮＤＨＡＳＬＶＰＶＬＬＡＡＫＹＩＲＥＶＴＴＡＥＧＧＳＧＬＮＥＬＬＧＫＩＤＮＴＶＶＶＡＳＥＱＤＳＹ抗体を使用して、インビトロでの転写／翻訳系におけるSSSのmRNA由来のクローンについてトウモロコシ胚乳cDNAライブラリーをスクリーニングし得る。合成オリゴを構築し、そして使用してトウモロコシ胚乳cDNAライブラリーをスクリーニングし得る。このSSSの配列を、Dryら(1991，Plant Journal 2: 193-202)により公表されたエンドウマメのSSS IおよびSSS IIのアミノ酸配列、またはBabaら( 1993，Plant Physiology 103，565-573)により公表されたイネのSSSと比較し得る。興味深いことに、イネのSSSから得られたクローンは、正確に同定されていない。N末端配列AELSREGは、イネのクローンの移行ペプチド配列の一部であることが述べられている。この誤りは、イネの穀粒からのタンパク質の単離の問題（おそらく、タンパク質の一部が単離の前に切断された）により生じたに違いない。本発明者らのN末端配列を使用すると、イネのクローンの補正された分子量は約69kDaであり、Babaらにより示唆された55kDaまたは57kDaではない。 cDNAライブラリースクリーニングおよびSSS cDNAクローンの単離 RNAを、果皮および胚の除去の後に、21 DAP胚乳（近交系B73から得た）より抽出した。ライブラリーは、約900,000の組換えクローンからなる。顆粒結合デンプンシンターゼのプローブをPCRを用いて作製し、これを使用してライブラリーのアリコート（約500,000の組換え体）をスクリーニングした。このスクリーニングにより、約200のポジティブシグナルを得た。多数の単離および配列決定は、それらが完全長のGBSS cDNAクローンであることを示した。精製したSSSタンパク質から得られたN末端配列に対するオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用してGBSSのスクリーニングに使用したライブラリーのアリコートと同じライブラリーのアリコートをスクリーニングした。ポジティブシグナルは得られなかった。次いで、ADP-ADPG結合領域および以下の配列（エンドウマメのSSS、イネのSSS、およびトウモロコシのGBSSについて公表された配列の比較に基づく）に対する長いオリゴヌクレオチドプローブを合成した。オリゴヌクレオチドの配列は、GGT/C GGA/G CTA/T GGAGATGTTTGTGGA/T TCACTC CCAATTGCTCTT/G GCTCTTCGTGGA/T CATCGTGTG/T ATGGTTGTである。 15の強いシグナルが得られ、全てを選び取り、２回の精製の後にこれらの中の 10のプラークを精製した。10の全ての制限分析は、それらが２つのクラスに分類されることを示した。配列分析は、両方のクラスがデンプンシンターゼであることを示した。トウモロコシ実生ライブラリー(Clontech)のスクリーニングは、クローンの一つのクラスのみ由来の5'プローブを用いてポジティブシグナルを示した。近交系W64A由来のcDNAライブラリーをスクリーニングして、N末端配列との比較により判断して完全長のクローンを単離した。 cDNAクローンの特徴付け単離したcDNAを配列決定し、本明細書中で配列番号１、配列番号２、および配列番号３として示した。比較のために、推定アミノ酸配列を、タンパク質から直接的に得られた配列と共にここに示す。クローンSSS6.31は、これらの内部配列を一つも含まない。ADPGおよびADPの結合部位についてのモチーフ（デンプンシンターゼの活性部位の部分と考えられる）は、全てのクローンの5'末端付近に見出され、そしてオリゴヌクレオチドプローブが基づく高度に保存された配列が続く。高度に保存されたドメインSRFEPCGL NQLYAMXYGTXXXXXXXGGLRDTVは、SSS10.52内に存在するが、EPCモチーフがAGモチーフで置換されているという点においてSSS6.31内でわずかに変更されている。 Escherichia coli BL21(DE3)におけるトウモロコシのデンプンシンターゼの発現。これらのSSSクローンをE.coliにトランスフェクトした。SSS活性を測定し、以下の表に報告する。＊１単位活性を、5mg/mLのグリコーゲンをプライマーとして使用して、25℃で１分間あたりにa-1,4グルカンヘ取り込まれる1mmolのグルコースとして定義する。形質転換のための遺伝子構築物遺伝子構築物は、アミロプラスト内における正確な局在化を確保するためにアミロプラスト移行ペプチドの存在を必要とする。葉緑体の移行ペプチドは類似の配列を有することが考えられるが、他の潜在的な供給源（例えば、ADPGピロホスホリラーゼに結合した移行ペプチド）が利用可能である（Plant Mol.Biol.Repor ter(1991)9,104-126）。他の潜在的な移行ペプチドは、小サブユニットRUBISCO 、アセトラクテート(acetolactate)シンターゼ、グリセルアルデヒド-3P-デヒドロゲナーゼおよび硝酸レダクターゼの移行ぺプチドである。例えば、多く遺伝子型由来の小サブユニットRUBISCOの移行ペプチドのコンセンサス配列は、以下の配列を有し： MASSMLSSAAV³/₄ATRTNPAQAS MVAPFTGLKSAAFPVSRK QNLDITSIASNGGRVQC そして、トウモロコシの小サブユニットRUBISCOは、次の配列を有する： MAPTVMMASSAT-ATRTNPAQAS AVAPFQGLKSTASLPVARR SSRSLGNVASNGGRIRC。トウモロコシ由来の葉のデンプンシンターゼの移行ペプチドは、次の配列を有する： MA ALATSQLVAT RAGLGVPDAS TFRRGAAQGL RGARASAAAD TLSMRTASARAAPRHQQQARR GGR FPSLVVC。トウモロコシ由来の葉のグリセルアルデヒド-3P-デヒドロゲナーゼの移行ペプチドは、次の配列を有する： MAQILAPS TQWQMRITKT SPCATPITSK MWSSLVMKQT KKVAHSAKFRVMAVNSENGT。コムギ由来のADPGピロホスホリラーゼ由来の推定上の移行ペプチドは、以下の配列を有する RASPPSESRA PLRAPQRSAT RQHQARQGPR RMC。しかし、周知の構成的なプロモーター（例えば、CaMV35S）のうちの１つを用いて構成的に遺伝子を発現することは可能であるが、植物全体にわたるデンプンの蓄積の増加をもたらす生化学的な不利があり得る。胚乳における蓄積は非常に好ましい。本発明における使用に可能なプロモーターには、デンプンシンターゼ遺伝子のプロモーター、結合(bound)デンプンシンターゼ遺伝子、胚乳hsp70遺伝子、ADPG ピロホスホリラーゼ遺伝子、およびスクロースシンターゼ遺伝子が挙げられる。形質転換（i）遺伝子の余分なコピーの挿入上記のように単離したトウモロコシのゲノムDNAを、引き続いて、トウモロコシの近交系または集団のプロトプラストまたは他の組織のいずれかに形質転換し得る。現存の遺伝子プロモーターは、余分な遣伝予が正しい発育時間で発達している胚乳内でのみ発現することを確保する。同様に、タンパク質配列は、酵素がアミロプラストに挿入されることを確保する。トランスジェニックトウモロコシ植物を再生し、そしてこれらの植物の胚乳を増加したSSS酵素活性について試験する。穀粒もまた、異なる温度での増大したデンプン合成速度について試験する。次いで、植物を育種プログラムに入れ、通常の至適を超える温度で、より高いデンプン合成速度を有する新規なトウモロコシのハイブリッドを作製する。（ii）SSSを特定する遺伝子の挿入これもまた、標準的なクローニング技術により達成する。温度安定性の形態の SSS遺伝子の供給源は、デンプンまたはグリコーゲンを生成し得る任意の生物である。上記のように、潜在的なドナー生物をスクリーニングし、そして同定する。その後に２つのアプローチがある：（a）上記のようなプロトコルを使用する、酵素精製および抗体／配列作製を介するアプローチ。（b）異種のプローブとしてSSS cDNAを使用して、関連する生物由来のライブラリー内のSSSのゲノムDNAを同定するアプローチ。遺伝子の形質転換、植物の再生、および試験プロトコルは上記のようである。この場合においては、形質転換のための遺伝子構築物を作製する必要がある。ここで遺伝子構築物は、正しい発育時に胚乳内での発現を確保するために、トウモロコシの胚乳SSSまたは別のトウモロコシの胚乳のデンプン合成経路酵素（例えば、ADPGピロホスホリラーゼ）由来の調節配列を含む、形質転換のための遺伝子構築物を作製する必要がある。植物を形質転換するために使用される遺伝子構築物は、正しい発育時に胚乳内での発現を確保するために、トウモロコシの胚乳SSSまたは別のトウモロコシの胚乳のデンプン合成経路酵素（例えば、ADPGピロホスホリラーゼ）由来の調節配列を必要とする。さらに、遺伝子構築物はまた、正しい発育時にアミロプラストの発現を確保するために、例えば、トウモロコシの胚乳SSSまたは別のトウモロコシの胚乳のデンプン合成経路酵素（例えば、ADPGピロホスホリラーゼ）由来の適切なアミロプラスト移行ぺプチド配列の調節配列を必要とする。タンパク質の遺伝子操作技術をまた使用して、より高い活性の至適温度を付与するためにSSS酵素のアミノ酸配列を改変し得る。SSSの遺伝子を、生存に対してこれらの酵素に依存する細菌内にクローニングし得る。評価される温度での生存している細菌の選択は、変異した耐熱性の酵素形態の単離を可能にする。改変された遺伝子を用いたトウモロコシの形質転換を、上記のように行う。（iii）酵素SSSのアイソフォームの活性比の変化これもまた、標準的なクローニング技術により達成する。SSS遺伝子の供給源は、上記のプロトコルを用いるトウモロコシである。次いで、SSS酵素のアイソフォームの余分な遺伝子のコピーの挿入により、および／またはアンチセンス遺伝子構築物の挿入により、植物を形質転換する。遺伝子プロモーターおよび他の調節配列もまた、レシピエント植物における増加した酵素量を達成するために改変され得る。（iv）デンプンの微細構造の変化をもたらす活性を有するSSSを特定する遺伝子（単数または複数）の挿入これもまた、標準的なクローニング技術により達成する。SSSの特別な形態の供給源は、デンプンを生成し得る任意の生物である。潜在的なドナー生物を上記のようにスクリーニングし、そして同定する。その後に、２つのアプローチがある：（a）上記のようなプロトコルを使用する、酵素精製および抗体／配列作製を介するアプローチ。（b）SSS cDNAを異種のプローブとして使用して、関連する生物由来のライブラリー内のSSSのゲノムDNAを同定するアプローチ。遺伝子の形質転換、植物の再生、および試験プロトコルは上記のようである。この場合においては、形質転換のための遺伝子構築物を作製する必要がある。ここで遺伝子構築物は、正しい発育時に胚乳内での発現を確保するために、トウモロコシの胚乳SSSまたは別のトウモロコシの胚乳のデンプン合成経路酵素（例えば、ADPGピロホスホリラーゼ）由来の調節配列を含む。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ナイト，マリーエリザベスイギリス国アールジー11 ６ティーゼットバークシャー，クロウソーン，ヒースランズパーク，グリーンフィンククローズ 14

Claims

【特許請求の範囲】１．プラスミドpSSS6、pSSS10.1、およびpSSS6.31内の挿入物の配列、ならびにデンプンを産生する生物のゲノムに挿入された場合に、デンプンの合成を改変させるような十分な類似性を有する配列を有する可溶性デンプンシンターゼを特定するcDNA。２．ブタペスト条約の条件の下にNational Collections of Industrial and Mar ine Bacteria Limited，23，St Machar Drive，Aberdeen AB1 2RYへ1994年６月1 3日に受託番号40651で寄託された、プラスミドpSSS6の挿入物のcDNA。３．ブタペスト条約の条件の下にNational Collections of Industrial and Mar ine Bacteria Limited，23，St Machar Drive，Aberdeen AB1 2RYへ1994年８月2 2日に受託番号NCIMB 40679で寄託された、プラスミドpSSS6.31の挿入物のcDNA。４．ブタペスト条約の条件の下にNational Collections of Industrial and Mar ine Bacteria Limited，23，St Machar Drive，Aberdeen AB1 2RYへ1994年８月2 2日に受託番号NCIMB 40680で寄託された、プラスミドpSSS10.1の挿入物のcDNA。５．配列番号１、または配列番号２、または配列番号３の配列を有する可溶性デンプンシンターゼをコードするcDNA。６．請求項５に記載の１つ以上の前記cDNAの１つ以上のコピーを、センスまたはアンチセンス方向で含む、形質転換植物。７．改変されたデンプンを合成する能力を有する植物を産生する方法であって、ここで、請求項５に記載の可溶性デンプンシンターゼを特定する１つ以上のドナー遺伝子をレシピエント植物のゲノムに安定に組み込む工程を包含する、方法。８．前記レシピエント植物がイネ科である、請求項７に記載の方法。９．前記レシピエント植物がトウモロコシ種である、請求項８に記載の方法。１０．請求項６に記載の植物の種子。