JP2000253774A - タウ蛋白のリン酸化が亢進された実験用マウス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】タウ蛋白のリン酸化が亢進された実験用マウス
の作製。 【解決手段】野生型マウスまたはトランスジェニックマ
ウスに絶食刺激を与えることにより、あるいはインスリ
ンシグナル伝達系に作用する薬物を投与して、タウ蛋白
のリン酸化を亢進させる。 【効果】本発明の実験用マウスは、アルツハイマー病の
治療薬となり得る、タウ蛋白のリン酸化を抑制する薬剤
のスクリーニングに使用可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、タウ蛋白のリン酸
化が亢進された実験用マウスに関する．さらに詳しく
は、本発明は、モデル動物として有用な、絶食刺激によ
りあるいはインスリンシグナル伝達系に作用する薬物を
投与して得られるタウ（Ｔａｕ）蛋白のリン酸化が亢進
された実験用マウスおよびタウ蛋白のリン酸化を抑制す
る薬剤をスクリーニングするための該実験用マウスの使
用に関する。

【０００２】

【従来の技術】アルツハイマー病の病理学的特徴の一つ
は神経原線維変化（NFT）と痴呆を呈することである。
ヒトのタウ蛋白は、微小管関連タンパク質の一種であ
り、５０〜６５ｋＤａの６種類のアイソフォームからな
り、アルツハイマー病で見られる異常繊維のペードヘリ
カルフィラメントの主要構成成分である。リン酸化した
タウ蛋白は、神経原繊維変化の構成成分となり、脳神経
細胞死を引き起こす。脳神経の軸索に存在するタウ蛋白
をリン酸化する酵素がタウ蛋白キナーゼ（TPK）であ
る。タウ蛋白キナーゼには、TPKIとTPKIIの2種類があ
る。TPKIは、タウ蛋白のリン酸化以外に、PDHを阻害す
ることで神経細胞に損傷を与えることが予想されてい
る。しかしながら、タウ蛋白とアルツハイマー病との関
連性の解析に適した実験動物モデルが存在しないため
に、アルツハイマー病の発症原因の解明やアルツハイマ
ー病の治療薬開発などに関する研究が妨げられていた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】タウ蛋白のリン酸化の
亢進は、アルツハイマー病の発症原因の一つであると予
想される．従って、タウ蛋白のリン酸化を亢進させるこ
とのできるモデルマウスは、アルツハイマー病の病態モ
デルとしてアルツハイマー病発症原因の解明、アルツハ
イマー病発症を阻止したり、アルツハイマー病発症に伴
う神経細胞死等を阻止する病態機序の解明や、アルツハ
イマー病の治療薬となり得るタウ蛋白のリン酸化を抑制
する薬剤のスクリーニングに有用であると考えられる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記した
課題を解決するために鋭意検討した結果、絶食刺激によ
りあるいはインスリンシグナル伝達系に作用する薬物を
投与したりすること等により、タウ蛋白のリン酸化が亢
進された実験用マウスが作成できることを見出し、本発
明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の発明
を包含する。（１）タウ蛋白のリン酸化が亢進された実
験用マウス、（２）絶食刺激により得られる１項に記載
のマウス、（３）絶食刺激が間隔を置いて複数回繰り返
される２項に記載のマウス、（４）インスリンシグナル
伝達系に作用する薬物を投与して得られる１項に記載の
マウス、（５）薬物がストレプトゾトシン、トルブタミ
ド、ウォルトマンニン、LY294002またはPD98059である
４項に記載のマウス。（６）異常リン酸化タウ蛋白を凝
集させる刺激をさらに加えることによりタウ蛋白のリン
酸化が亢進された２−５項のいずれかにに記載のマウ
ス、（７）マウスが野生型マウスである１−６項のいず
れかに記載のマウス、（８）マウスがトランスジェニッ
クマウスである１−６項のいずれかに記載のマウス、
（９）タウ蛋白キナーゼ遺伝子が導入されている８項に
記載のトランスジェニックマウス、（１０）タウ蛋白の
リン酸化を抑制する薬剤をスクリーニングするための１
−９項のいずれかに記載のマウスの使用、および（１
１）薬剤がアルツハイマー病治療薬である１０項に記載
の使用。

【０００５】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の絶食刺激によりあるいはインスリンシグナル伝
達系に作用する薬物を投与したりすること等により、タ
ウ蛋白のリン酸化が亢進された実験用マウスは、ＴＰＫ
Ｉを過剰発現し、アルツハイマー病の病態モデルとして
有用である。絶食刺激によりタウ蛋白のリン酸化が亢進
された本発明の実験用マウスは、例えば２〜3日間の絶
食刺激を与えることにより作製される。好ましくは、こ
の絶食刺激を繰り返し与えることにより、タウ蛋白のリ
ン酸化がより亢進される。具体的には、毎週２〜3日間
の絶食刺激を複数回、好ましくは8回程度、約２ケ月に
わたり絶食刺激を繰り返す。

【０００６】インスリンシグナル伝達系に作用する薬物
を投与することにより、タウ蛋白のリン酸化が亢進され
た実験用マウスを得ることができる。このようなインス
リンシグナル伝達系に作用する薬物の例としては、膵B
細胞破壊剤であるストレプトゾトシン（２−デオキシ−
２−［（メチルニトロソアミノ）カルボニル］アミノー
Ｄ−グルコピラノース）、インスリン分泌促進剤である
トルブタミド、糸状菌の産生する二次代謝産物であっ
て、ステロール様構造を有し、ＰＩ３Ｋ（ホスファチジ
ルイノシトール３−キナーゼ）特異的阻害薬であるウォ
ルトマンニン（ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）、同じくＰＩ３
キナーゼの阻害薬であるＬＹ２９４００２，ＭＡＰ（マ
イトジェンアクチベーテッド・プロテイン）キナーゼ系
阻害薬であるＰＤ９８０５９等が挙げられる。

【０００７】さらにまた、異常リン酸化タウ蛋白を凝集
させる刺激をさらに加えることによりタウ蛋白のリン酸
化がより亢進される。このような刺激は、ステアリン酸
アルミニウム、アルミニウムマルトール（３−ヒドロキ
シー２−メチルー４−ピロン）等の有機アルミニウム化
合物、アルミニウム錯体等をマウスの腹内に投与するこ
とにより行われる。絶食刺激が付与されるマウスは、野
生型マウス、トランスジェニックマウス（遺伝子移入マ
ウス）のどちらでもよい。

【０００８】このようなトランスジェニックマウスの例
として、好ましくはCaMKIIαプロモータ等のプロモータ
の制御下にあるTPKI遺伝子を含有するＤＮＡを受精卵ま
たは初期胚の時期に導入して得られる形質転換マウスが
挙げられる。具体的には、CaMKIIαプロモータの下流に
マウスTPKIｃDNAを含有する単離ＤＮＡ（導入遺伝子）
をマイクロマニュピュレータを用いて1細胞期の受精卵
の雄性前核中へ顕微鏡下微量注入し、生き残った受精卵
を仮親の卵管に移植してトランスジェニックマウスを作
製する。上記した単離ＤＮＡとしては、CaMKIIαプロモ
ータの下流にβ―グロビン スプライシング イントロ
ン２、５´非翻訳領域および３´非翻訳領域を含むTPKI
ｃDNAならびにSV40ポリAを含有するものが挙げられ
る。受精卵細胞段階におけるTPKI ｃDNAの導入は、対
象マウスの生殖細胞および体細胞のすべてにおいて該ｃ
ＤＮＡが過剰に存在するように確保される。トランスジ
ェニック後の作製マウスの生殖細胞において該ｃＤＮＡ
が過剰に存在することにより、作製マウスの子孫がその
生殖細胞および体細胞のすべてに該ｃＤＮＡを過剰に有
する。該ｃＤＮＡを受け継いだこの種のマウスの子孫
は、その胚芽細胞および体細胞のすべてにＴＰＫＩを過
剰に含有する。

【０００９】導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモ
ザイゴート（ホモ接合体）マウスを取得し、その雌雄の
マウスを交配することによりすべての子孫が該ｃＤＮＡ
を安定に保持し、また該ｃＤＮＡを過剰に有する事を確
認して、通常の飼育環境で繁殖継代することができる。
トランスジェニックマウスが有する内在性の遺伝子とは
異なる外来性遺伝子であるＴＰＫＩ遺伝子をマウスまた
はその先祖の受精卵に導入する際に使用される受精卵
は、雄マウスと雌マウスを交配させることによって得ら
れる。受精卵は、自然交配によっても得られるが、雌マ
ウスの性周期を人工的に調節後、雄マウスを交配させる
のが好ましい。本発明のトランスジェニックマウスの作
製には、上記したＤＮＡ微量注入法が最も一般的である
が、その他、上記ＤＮＡを含有するウイルスベクターを
用いる方法およびＥＳ細胞を用いる方法も使用できる。
ウイルスベクター法によれば、透明帯を除去した４〜８
細胞期胚にウイルスベクターを感染後、胚盤胞まで発生
させて偽妊娠させた代理母の子宮に戻す。ＥＳ細胞（ｅ
ｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、胚性幹細胞）
を経由する方法では、ＤＮＡを導入したＥＳ細胞からキ
メラマウスを経て、トランスジェニックマウスを作製す
る。

【００１０】ＴＰＫＩは、インスリンによって抑制され
るので、絶食によりインスリン濃度を低下させることに
よりＴＰＫＩを活性化させ、同時に他のストレス応答蛋
白キナーゼを活性化させることにより、タウ蛋白のリン
酸化を亢進させると考えられる。本発明のマウスでは、
ＴＰＫＩ遺伝子が高発現されており、その遺伝子の機能
を促進することにより、アルツハイマー病の病理学的特
徴の一つである神経原線維変化および痴呆を呈するアル
ツハイマー病を発症することがあり、その病態モデルと
して使用することが可能である。具体的には、本発明の
マウスを用いて、アルツハイマー病の病態機序の解明、
治療方法の検討およびその治療薬の開発を目的としたア
ルツハイマー病治療薬のスクリーニングを行うことが可
能である。

【００１１】すなわち、本発明のトランスジェニックマ
ウスは、マウス脳内に形成される、アルツハイマー病に
特有のタウ蛋白キナーゼＩを阻害する能力に関する薬剤
の効果の検定に使用される。たとえば、検定しようとす
る薬剤は、本発明のマウスではないマウス群および本発
明のマウス群に経口、腹腔内、皮下、血管内，脳室内ま
たは脳実質内に絶食あるいはインスリンシグナル伝達系
に作用する薬物の投与に先立ちあるいは同時に投与され
る。上記薬剤は、マウスの脳内においてタウ蛋白キナー
ゼＩに影響を及ぼすのに十分な時間連続的に投与するこ
とができる。薬剤投与後、コントロールのマウスおよび
本発明のマウスから、その脳あるいはその一部の組織を
取り出し、そこに含まれるタウ蛋白のリン酸化状態を分
析定量化して、タウ蛋白のリン酸化を阻害し、またはそ
の脱リン酸化を促進するパラメータを比較することによ
り、タウ蛋白リン酸化阻害薬をスクリーニングすること
ができる。

【００１２】

【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的
に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのも
のであり、本発明の技術的範囲を制限するものではな
い。 〔実施例１〕導入遺伝子の構築と材料 プラスミドｐＮＮ２７９は、通産省工業技術院生命工学
工業技術研究所生体機能制御研究室の岡部繁男博士から
供給を受けた。プラスミドｐＫＣＲＨ２は、東京大学医
学部三品昌美教授から供給を受けた。使用したアダプタ
ーを以下に示す。 （ＮｏｔＩ）ＳａｃＩＩ アダプター（配列番号１） ＧＧＣＣＣＣＧＣＧＧ ＧＧＣＧＣＣＣＣＧＧ （ＢａｍＨＩ）ＳａｃＩＩ アダプター（配列番号２） ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＧ ＧＧＣＧＣＣＣＴＡＧ −ＢｂｅＩ−ＳｔｕＩ− アダプター（配列番号３） ＡＧＣＴＧＧＣＧＣＣＡＡＡＴＡＧＧＣＣＴ ＣＣＧＣＧＧＴＴＴＡＴＣＣＧＧＡＴＣＧＡ （ＫｐｎＩ）ＳｆｉＩ アダプター（配列番号４） ＧＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＧＴＡＣ ＣＡＴＧＣＣＧＧＧＣＣＣＧＣＣＧＧ

【００１３】導入遺伝子は、図1に示すようにして構築
した。すなわち、プラスミドｐＮＮ２７９のＮｏｔＩ部
位に上記ＳａｃＩＩアダプターを挿入し、次いでＣａｍ
−ＫＩＩαプロモータ断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａ
ｃＩＩを用いて切り出した。プラスミドｐＫＣＲＨ２の
ＢａｍＨＩ部位に上記ＳａｃＩＩアダプターを挿入し、
次いでＨｉｎｄＩＩＩ部位に −ＢｂｅＩ−ＳｔｕＩ−
アダプターを挿入した。新たに生じたＢｂｅＩおよび
ＳｔｕＩ部位にマウスＴＰＫｃＤＮＡ（ＢｂｅＩ〜Ｓｔ
ｕＩ）を挿入し、β―グロビンイントロン２、マウスＴ
ＰＫＩｃＤＮＡ、β―グロビンポリＡ付加シグナルおよ
びＳＶ４０ポリＡ付加シグナルからなる断片（ＳａｃＩ
Ｉ〜ＢｓｍＩ）を含有するＤＮＡ断片を作製した。Ｃａ
ｍ−ＫＩＩαプロモータ断片を含有する上記ＨｉｎｄＩ
Ｉ−ＳａｃＩＩ断片およびマウスＴＰＫＩｃＤＮＡを含
有するＳａｃＩＩ−ＢｓｍＩ断片をプラスミドｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）のＨｉｎｄＩＩ〜ＣｌａＩ部
位に挿入してプラスミド４を構築した。ただし、Ｂｓｍ
Ｉ部位およびＣｌａＩ部位は、Ｔ４ポリメラーゼを用い
て平滑末端とした。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）
のＫｐｎＩ部位には、上記ＳｆｉＩアダプターが挿入し
てあり、導入遺伝子をＳｆｉＩとＮｏｔＩで切り出せる
ようにした。切り出した導入遺伝子は、精製後、約２ｎ
ｇ／μｌの濃度となるようにＰＢＳに溶解した。

【００１４】トランスジェニックマウスの作成 Ｃ５７ＢＬ／６とＣ３Ｈとの交配により、交雑群（Ｂ６
Ｃ３Ｆ１）を作成した。Ｂ６Ｃ３Ｆ１♀×Ｂ６Ｃ３Ｆ１
♂より得た受精卵を改良ホイッテン（Ｗｈｉｔｔｅｎ）
培養液（ＮａＣｌ ６４０ｍｇ／ｄｌ、ＫＣｌ ３５．
６ｍｇ／ｄｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄ １６．２ｍｇ／ｄｌ、Ｍｇ
ＳＯ₄７Ｈ₂Ｏ ２９．４ｍｇ／ｄｌ、ＮａＨＣＯ₃ １９
０．０ｍｇ／ｄｌ、グルコース １００．０ｍｇ／ｄ
ｌ、ピルビン酸ナトリウム ２．５ｍｇ／ｄｌ、乳酸カ
ルシウム ４６．０ｍｇ／ｄｌ、ストレプトマイシン
５．０ｍｇ／ｄｌ、ペニシリンＧ ５０００単位／ｄ
ｌ、フェノールレッド ０．００１％、β―メルカプト
エタノール １０μＭ，ＥＤＴＡ・２Ｎａ ５０μＭお
よびＢＳＡ ３００ｍｇ／ｄｌを含む）中に入れ、上記
導入遺伝子を受精卵の前核に注入した。この受精卵を改
良ホイッテン培養液中で一晩培養し、２細胞にまで発育
したものを偽妊娠したＩＣＲ♀（ｄａｙｌ）の卵管に移
植した。４１匹のマウスが生まれ、サザンブロット解
析、ＰＣＲにより、導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）
の有無を確認した結果、Ｎｏ．３、６、８、９および３
４の５匹に導入遺伝子の挿入を認めた。

【００１５】サザンブロット解析 マウスの尾を約１．５ｃｍ切り、テイル（Ｔａｉｌ）緩
衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０，１００ｍＭ
ＥＤＴＡ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１％（ｗ／ｖ）ＳＤ
Ｓ、 ２ｍｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫ）３００μｌ中
で５５℃、一晩反応させ、組織を溶かした後、フェノー
ル抽出３回、クロロホルム抽出２回、エタノール沈殿を
行ってゲノムＤＮＡを精製した。得られたゲノムＤＮＡ
８μｇを制限酵素Ｘｍｎで消化し、その全量を１％アガ
ロースで泳動した後、ナイロンメンブレーンにブロット
した。図２に示したＴＰＫＩｃＤＮＡ中のＸｍｎＩ〜Ｂ
ｌｎＩの９４１ｂｐ断片をベーリンガー・マンハイム社
のＤＩＧ ＤＮＡラベリングキットを使用して、Ｄｉｇ
標識し、これをプローブとしハイブリダイゼション液
（７％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ，５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミ
ド、５×ＳＳＣ，２％ブロッキング試薬（ベーリンガー
・マンハイム社）、５０ｍＭ ＰＢＳ ｐＨ７．０，
０．１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシン ナトリ
ウム塩）中、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行
った。その後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ，６８
℃、１５分２回洗浄し、アルカリホスファターゼ標識坑
Ｄｉｇ抗体を反応させ、さらにアルカリホスファターゼ
の基質であるＣＳＰＤ（ベーリンガー・マンハイム社）
を反応させ、X線フィルムに感光させた。図２には、サ
ザンブロットの結果、トランスジェニックマウスで予想
されるバンドの長さ、ＰＣＲに用いたプライマーの位置
を示してある．図２に示されるように、サザンブロット
において、トランスジェニックマウスでは、長さ３．５
Ｋのバンドが出ることが予想される。図３にサザンブロ
ットの結果を示す。最初の６匹のマウスを調べた結果、
Ｎｏ．３および６のマウスがトランスジェニックマウス
であることが判明した。なお、導入遺伝子１コピーから
１００コピーに相当する量のプラスミド４も同様にして
ＸｍｎＩで消化し、泳動分離した。図３より、Ｎｏ．３
のマウスには、約１０コピー、Ｎｏ．６のマウスには、
約３０コピーの導入遺伝子が挿入されていることが分か
った。

【００１６】ＰＣＲ 上記したようにしてマウスの尾から抽出したゲノムＤＮ
Ａ０．５μｇを使用して、２．５単位ｒＴａｑ（ＴＯＹ
ＯＢＯ），３ｍＭ ＭｇＣｌ₂，０．２ｍＭｄＮＴＰ
ｓ、５０ｐｍｏｌプライマーＰ３（ＴＡＧＡＣＣＴＣＡ
ＴＣＴＴＴＣＴＴＣＴＣＧＣＣ（配列番号５））、５０
ｐｍｏｌプライマーＰ４（ＣＡＣＣＣＴＴＴＴＴＣＴＣ
ＣＴＣＴＴＣＣＡＧ（配列番号６））、５０ｍＭ ＫＣ
ｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３（２５
℃）、０．１％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，全
容量５０μｌの反応液中で、９４℃１０分、（９４℃３
０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒）３０回、７４℃１
０分の条件下ＰＣＲを行った。なお、トランスジェニッ
クマウスでは、約６６０ｂｐのＰＣＲ産物の生成が予想
される。図４にＰＣＲ産物の泳動分離の結果を示す。Ｎ
ｏ．２〜６までのマウスがサザンの結果と一致した。さ
らに、Ｎｏ．８、９および３４のマウスがトランスジェ
ニックマウスであることが分かった。

【００１７】脳および海馬からの全ＲＮＡの抽出 マウスから取り出した脳または氷上でＰＢＳ（ホスフェ
ート・バッファード・生理食塩水）中で脳から抽出した
海馬を用い、全ＲＮＡを抽出した。抽出に使用した方法
は、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉの酸グ
アニジウム・チオシアネートーフェノールークロロホル
ム法を改変したものである。すなわち、組織１ｇ当た
り、１０ｍｌ（４Ｍ グアニジウム チオシアネート、
２５ｍＭクエン酸ナトリウム ｐＨ７．０，０．５％
（ｗ／ｖ）サルコシル、０．１Ｍメルカプトエタノー
ル）を加え、氷上でホモジナイズし、次いで１ｍｌの２
Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ４．０を加え、さらに１０ｍ
ｌ 水―飽和フェノールと２ｍｌクロロホルムを加え
て、振盪した。１０、０００ｇ、１０分遠心後、水相を
分離し、１０ｍｌのイソプロパノールを加えて撹拌し、
３，０００ｇ、１０分遠心し、ＲＮＡをペレットとした
後、２ｍｌ ４Ｍ ＬｉＣｌに溶かした。３，０００
ｇ、１０分遠心後、ペレットを再び２ｍｌ（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５，１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％
（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム）に溶かし、２ｍｌ
のクロロホルムを加え、振盪後、３，０００ｇ、１０分
遠心し、水相を分離した。これに０．２ｍｌ クエン酸
ナトリウム ｐＨ５．０と２ｍｌイソプロパノールを加
え、撹拌、遠心してＲＮＡをペレットとして回収した。
ペレットは、７０％エタノールで洗浄後、任意の量のＤ
ＥＰＣ処理水に溶かした。

【００１８】ＲＴ−ＰＣＲ Ｎｏ．３，６，８，９および３４の各ラインのトランス
ジェニックマウスと野生型マウス（生後６週〜９週）の
全脳より、上記のようにして抽出した全ＲＮＡ約４μｇ
を用い、ＴＯＹＯＢＯの「ＲＴ−ＰＣＲ ｈｉｇｈ−ｐ
ｌｕｓ」キットを使用してＲＴ−ＰＣＲを行った。アニ
ーリングは、６０℃で１分３０秒行った。プライマーと
しては、プライマーＰ５（ＴＧＴＴＡＡＣＡＴＧＴＴＡ
ＴＧＴＣＴＣＡＴＡＧＴＧＣ（配列番号７））およびプ
ライマーＰ６（ＧＴＧＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴＡＴ
ＴＴＧＴＡＡＣＣ（配列番号８））を使用したので、Ｒ
ＮＡへの転写が起これば、約６６０ｂｐのＲＴ−ＰＣＲ
産物の生成が予想される。また、コントロールとして、
Ｇ３ＰＤＨに対するＲＴ−ＲＣＲも行った。使用したプ
ライマーは、プライマーＦ（ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴ
ＧＣＣＡＴＣＡＣ（配列番号９））およびプライマーＲ
（ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ（配列番
号１０））であり、ＲＴ−ＰＣＲ産物は４５０ｂｐと予
想される。図５に、得られたＲＴ−ＰＣＲ産物を泳動分
離した結果を示す。図５の写真からは、Ｎｏ．３，６お
よび８の各ラインで導入遺伝子の転写が認められた。図
６に導入遺伝子由来ＲＮＡの配列の領域を示す。

【００１９】ノザンブロット解析 Ｎｏ．３，６および８の各ラインの海馬から抽出した全
ＲＮＡ２５μｇを１７％（ｖ／ｖ）ホルマリン入りアガ
ロースゲルで電気泳動した後、ナイロンメンブレーンに
ブロットした．図２に示したＴＰＫＩｃＤＮＡ中のＸｍ
ｎＩ〜ＢｌｎＩの９４１ｂｐ断片をベーリンガー・マン
ハイム社のＤＩＧ ＤＮＡラベリングキットを使用し
て、Ｄｉｇ標識し、これをプローブとしハイブリダイゼ
ション液（７％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ，５０％（ｖ／ｖ）ホ
ルムアミド、５×ＳＳＣ，２％ブロッキング試薬（ベー
リンガー・マンハイム社）、５０ｍＭ ＰＢＳ ｐＨ
７．０，０．１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシン
ナトリウム塩）中、４２℃で一晩ハイブリダイゼーシ
ョンを行った。その後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤ
Ｓ，６８℃、１５分２回洗浄し、アルカリホスファター
ゼ標識坑Ｄｉｇ抗体を反応させ、さらにアルカリホスフ
ァターゼの基質であるＣＳＰＤ（ベーリンガー・マンハ
イム社）を反応させ、X線フィルムに感光させた。

【００２０】ウエスタンブロット解析 マウスから取り出した脳または氷上でＰＢＳ（ホスフェ
ート・バッファード・生理食塩水）中で脳から抽出した
海馬にその重量の９倍量の４℃サンプルバッファー（６
２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８，１０％（ｗ／ｖ）
グリセリン、０．７Ｍ β―メルカプトエタノール、
２．３％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ，１００μＭオルトバナジウ
ム酸塩、１μＭ オカダ酸、１ｍＭ ＰＭＳＦ（フェニ
ルメチルスルホニルフルオリド）、１ｍＭ ＥＧＴＡ、
１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、ホモジナイズした。その
後、３分間沸騰し、１２，０００ｇで５分遠心し、不溶
成分を取り除いた。こうして得られるサンプルを３〜５
μｌ、１０％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル（０．
１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）で電気泳動後、ナイロンメンブ
レーンにブロットした。

【００２１】メンブレーンは、３％スキムミルク／ＰＢ
Ｓでブロックした後、１次抗体／ＰＢＳを室温で２時間
反応させた。使用した１次抗体は、タウ蛋白の１９９位
のセリンのリン酸化を認識する坑ＰＳ１９９抗体（ウサ
ギ血清）、タウ蛋白の３９６位のセリンのリン酸化を認
識する坑ＰＳ３９６抗体（ウサギ血清）、タウ蛋白の４
１３位のセリンのリン酸化を認識する坑ＰＳ４１３抗体
（ウサギ血清）、ＡＴ８（ＩＮＮＯＧＥＮＥＴＩＣＳ
社、タウ蛋白の２０２位のリン酸化セリンを含む部分を
認識する）、抗ＴＰＫＩモノクローナル抗体であるＴ１
−７，抗Ｇ３ＰＤＨモノクローナル抗体（ＣＨＥＭＩＣ
ＯＮ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ社）である。メンブ
レーンを洗浄後、２次抗体としてビオチニル化抗ウサギ
ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）およびビオチニル化坑マウスＩｇＧ
（Ｈ＋Ｌ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
社）をＰＢＳ中にて、室温で１時間反応させた。その後
で、アビジン：ビオチニル化パーオキシダーゼ コンプ
レックス（ＶＥＣＴＡＳＴＡＴＩＮ ＡＢＣ ＫＩＴ，
Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を結合さ
せ、パーオキシダーゼの基質である４−クロロー１−ナ
フトールを反応させて発色させた。

【００２２】ＲＮＡレベルで外来性ＴＰＫＩの発現が認
められたＮｏ．３，６および８のラインのトランスジェ
ニックマウス（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ）の
全脳抽出物をウエスタンブロットで解析すると、野生型
（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）マウスに比し、ＴＰＫＩの発現
は１〜３割増加しただけであったが、海馬におけるＴＰ
ＫＩの発現を調べると、Ｎｏ．３とＮｏ．６のトランス
ジェニックマウスでは比較的強い発現が認められ、Ｎ
ｏ．８のトランスジェニックマウスでは弱い発現が認め
られた（図７参照）。なお、コントロールとしては、同
腹仔（Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ）を用いた。タウ（Ｔａ
ｕ）蛋白の３９６位のセリンのリン酸化には、明確な差
は認められなかった（図８参照）。図７および８におい
て、Ｇ３ＰＤＨ（グリセルアルデヒドー3−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ）は、各レーンに泳動した蛋白量の標準化
のために使用した。

【００２３】図９および１０に２日間の絶食による海馬
でのタウ蛋白のリン酸化に対する効果を示す．野生型
（６ケ月）のマウスは、２日間の絶食で海馬におけるタ
ウ蛋白のリン酸化（セリン３９６）に大きな変化はなか
った（図９参照）。野生型（１２週）のマウスは、２日
間の絶食で２匹中１匹にセリン３９６のリン酸化が強く
認められたが、他の１匹は弱いリン酸化しか認められな
かった（図１０参照）。ラインＮｏ．３のトランスジェ
ニックマウス（１２週）は、２日間の絶食で２匹中２匹
に海馬において中程度のタウ蛋白のリン酸化（セリン３
９６）が認められた（図１０参照）。

【００２４】図１１〜１４に３日間の絶食による海馬で
のタウ蛋白のリン酸化に対する効果を示す．Ｎｏ．３の
トランスジェニックマウスのライン（１０週）は、３日
間の絶食で海馬におけるタウ蛋白のリン酸化（セリン３
９６）が亢進したが、同様の変化が野生型でも認められ
た（図１１参照）。Ｎｏ．６のラインも６ケ月のトラン
スジェニックマウスにおいて、３日間の絶食で海馬にお
けるタウ蛋白のリン酸化（セリン３９６、セリン２０
２、セリン２０５およびセリン４１３）が亢進したが、
同様な変化が野生型でも認められた（図１２から１４参
照）。以上の結果をまとめて表１に示す。

【００２５】

【表１】

【００２６】

【発明の効果】本発明のマウスは、絶食によりインスリ
ン濃度が低下して、ＴＰＫＩが活性化され、また同時に
他のストレス応答蛋白キナーゼも活性化されて、タウ蛋
白のリン酸化が亢進している。本発明のマウスは、絶食
刺激を繰り返し与えることにより、あるいは異常リン酸
化タウと凝集させるような刺激をさらに加えることによ
り、神経原線維変化や痴呆の程度が増強され、アルツハ
イマー病を発症する可能性があり、その疾患モデルとし
て利用可能である。たとえば、本発明のマウスを用い
て、アルツハイマー病の病態機序の解明およびその治療
方法を検討できる。

【００２７】

【配列表フリーテキスト】 配列番号１−１０：合成ＤＮＡ 配列番号１：鎖の数：二本鎖 配列の特徴 存在位置：１．．４ 他の情報：相補鎖が存在しない。 存在位置：１０ 他の情報：相補鎖は、３‘→５’方向にこの位置からのびる １本鎖ＤＮＡ「３‘−ｃｃｇｇ−５’」を有する 配列番号２：鎖の数：二本鎖 配列の特徴 存在位置：１．．４ 他の情報：相補鎖が存在しない。 存在位置：１０ 他の情報：相補鎖は、３‘→５’方向にこの位置からのびる １本鎖ＤＮＡ「３‘−ｃｔａｇ−５’」を有する 配列番号３：鎖の数：二本鎖 配列の特徴 存在位置：１．．４ 他の情報：相補鎖が存在しない。 存在位置：２０ 他の情報：相補鎖は、３‘→５’方向にこの位置からのびる １本鎖ＤＮＡ「３‘−ｔｃｇａ−５’」を有する 配列番号４：鎖の数：２本鎖 配列の特徴 存在位置：１４．．１７ 他の情報：相補鎖が存在しない。 存在位置：１ 他の情報：相補鎖は、５‘→３’方向にこの位置からのびる １本鎖ＤＮＡ「５‘−ｇｔａｃ−３’」を有する

【００２８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 三菱化学株式会社（Mitsubishi Chemical Corporation） <120> タウ蛋白のリン酸化が亢進された実験用マウス（Experimental Mouse in which phosphorylation of tau protein is accelerated） <130> J03131 <140> <141> 1999-03-12 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> Complement((1)..(4)) <223> Complementary strand is absent. From location No. 10, complemntary strand which is 3'-ccgg-5' is extended into 3' to 5' direction. <400> 1 ggccccgcgg 10 <210> 2 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:syntheticDNA <220> <221> misc_feature <222> Complement((1)..(4)) <223> Complementary strand is absent. From location No. 10, complementary strand which is 3'-ctag-5' is extended into 3' to 5' direction. <400> 2 gatcccgcgg 10 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> Complement((1)..(4)) <223> Complementary strand is absent. From location No.20, complementary strand which is 3'-tcga-5' is extended into 3' to 5' direction. <400> 3 agctggcgcc aaataggcct 20 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> Complement((14)..(17)) <223> Complementary strand is absent. From location No. 1, complementary strand which is 5'-gtac-3' is extended into 5' to 3' direction. <400> 4 ggcccgggcg gccgtac 17 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 5 tagacctcat ctttcttctc gcc 23 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 6 cacccttttt ctcctcttcc ag 22 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 7 tgttaacatg ttatgtctca tagtgc 26 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 8 gtgatgctat tgctttattt gtaacc 26 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 9 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 10 tccaccaccc tgttgctgta 20

【図面の簡単な説明】

【図１】導入遺伝子（１８Ｋ）の構築を表す図である。

【図２】サザンブロットの結果、トランスジェニックマ
ウスで予想されるバンドの長さ、ＰＣＲに用いたプライ
マーの位置を示す図である。

【図３】トランスジェニックマウスのゲノムＤＮＡのサ
ザンブロットの結果を示す図である。

【図４】配列番号５および６で示されるプライマーを用
いて得られる,トランスジェニックマウスのゲノムＤＮ
ＡのＰＣＲ産物のサザンブロットの結果を示す図であ
る。

【図５】トランスジェニックマウスのラインＮｏ．３，
６，８，９および３４および野生型マウスの全ＲＮＡを
配列番号７および８で表されるプライマーを用いて得ら
れるＲＴ−ＰＣＲ産物のイムノブロットを示す。同じ
く、コントロールとしてＧ３ＰＤＨ（グリセルアルデヒ
ドー３−リン酸デヒドロゲナーゼ）を配列番号９および
１０で表されるプライマーを用いて得られるＲＴ−ＰＣ
Ｒ産物のイムノロットを示す。

【図６】導入遺伝子由来のＲＮＡの領域を表す図であ
る。

【図７】トランスジェニックマウス（Ｎｏ．３，６およ
び８）の海馬におけるＴＰＫＩの発現を示すイムノブロ
ットである。

【図８】トランスジェニックマウス（Ｎｏ．３，６およ
び８）の海馬におけるタウ蛋白のリン酸化を示すイムノ
ブロットである。

【図９】野生型マウス（６ケ月）の２日間絶食による海
馬でのタウ蛋白の３９６位のセリンのリン酸化を示すイ
ムノブロットである。

【図１０】トランスジェニックマウス(１２週)および野
生型マウス（１２週）の２日間絶食による海馬でのタウ
蛋白の３９６位のセリンのリン酸化を示すイムノブロッ
トである。

【図１１】トランスジェニックマウス(１０週)および野
生型マウス（１０週）の３日間絶食による海馬でのタウ
蛋白の３９６位のセリンのリン酸化を示すイムノブロッ
トである。

【図１２】野生型マウス（６ケ月）の３日間絶食による
海馬でのタウ蛋白の３９６位のセリンのリン酸化を示す
イムノブロットである。

【図１３】野生型マウス（６ケ月）の３日間絶食による
海馬でのタウ蛋白の２０２位および２０５位のセリンの
リン酸化を示すイムノブロットである。

【図１４】野生型マウス（６ケ月）の３日間絶食による
海馬でのタウ蛋白の４１３位のセリンのリン酸化を示す
イムノブロットである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 濱中 裕喜 東京都町田市南大谷11号 株式会社三菱化 学生命科学研究所内 (72)発明者 石黒 幸一 東京都町田市南大谷11号 株式会社三菱化 学生命科学研究所内 (72)発明者 佐野 弓子 東京都町田市南大谷11号 株式会社三菱化 学生命科学研究所内 (72)発明者 佐藤 尚武 東京都町田市南大谷11号 株式会社三菱化 学生命科学研究所内 (72)発明者 藤田 忍 東京都町田市南大谷11号 株式会社三菱化 学生命科学研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA10 BA80 CA04 DA02 EA04 GA11 HA01 4B065 AA91X AA91Y AA93Y AB01 AC20 BA02 CA29 CA44 CA46

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 タウ蛋白のリン酸化が亢進された実験用
   マウス。
2. 【請求項２】 絶食刺激により得られる請求項１に記載
   のマウス
3. 【請求項３】 絶食刺激が間隔を置いて複数回繰り返さ
   れる請求項２に記載のマウス。
4. 【請求項４】 インスリンシグナル伝達系に作用する薬
   物を投与して得られる請求項１に記載のマウス。
5. 【請求項５】 薬物がストレプトゾトシン、トルブタミ
   ド、ウォルトマンニン、LY294002またはPD98059である
   請求項４に記載のマウス。
6. 【請求項６】 異常リン酸化タウ蛋白を凝集させる刺激
   をさらに加えることによりタウ蛋白のリン酸化が亢進さ
   れた請求項２−５のいずれかに記載のマウス。
7. 【請求項７】 マウスが野生型マウスである請求項１−
   ６のいずれかに記載のマウス。
8. 【請求項８】 マウスがトランスジェニックマウスであ
   る請求項１−６のいずれかに記載のマウス。
9. 【請求項９】 タウ蛋白キナーゼ遺伝子が導入されてい
   る請求項８に記載のトランスジェニックマウス。
10. 【請求項１０】 タウ蛋白のリン酸化を抑制する薬剤を
    スクリーニングするための請求項１−９のいずれかに記
    載のマウスの使用。
11. 【請求項１１】 薬剤がアルツハイマー病治療薬である
    請求項１０に記載の使用。