JP2000245445A - 油水分離剤及び油水分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 より優れた油水分離能を有する安価な油水分
離剤を提供すること。 【解決手段】 高分子物質ＡＰＲ−３生産能を有する微
生物をサイアミン含有培地に培養して、得られる培養物
を主成分として含有する油水分離剤、及び油水分離方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、油水分離剤及び油
水分離方法に関し、更に詳しくは、油環境汚染における
油除去処理に用いる油水分離剤及び油水分離方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】従来の油水分離剤は各種の合成高分子か
らなっており、タンカー事故等で実際の使用例もある
が、細胞毒性、特にＤＮＡ（遺伝子）毒性が高く環境生
態系並びに人の安全性に懸念が持たれているものであ
る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、上記
の問題に鑑み、人と環境生態系に優しく安全である油水
分離能を有する油水分離剤及びそれを用いる油水分離方
法を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
達成のために鋭意努力した結果、特定の微生物群が、従
来知られていない高分子物質を生産すること、又、それ
らの特定微生物群を混合して複合的培養若しくは複合培
養すると、その高分子物質が培地中に著量生産・蓄積さ
れること、そして、より優れた油水分離能活性を有する
こと等の知見を得た。本発明はこの知見に基づいて完成
された。

【０００５】すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１
１）の特性を有し、且つ油水分離能を有する高分子物質
（以下、ＡＰＲ−３という。）の生産能（以下、ＡＰＲ
−３生産能という。）を有する微生物をサイアミン含有
培地で培養して、得られる培養物を主成分とすることを
特徴とする油水分離剤を提供する。 （１）糖含有量（フェノール・硫酸法）：（６４±２）
重量％ （２）アミノ糖（エルソン・モーガン法）：検出されな
い。 （３）ウロン酸（カルバゾール・硫酸法）：検出されな
い。 （４）蛋白質（ニンヒドリン法）：検出されない。 （５）元素分析：炭素Ｃ＝（４０±２）％、水素Ｈ＝
（６±１）％、窒素Ｎ、リンＰ及び硫黄Ｓは痕跡。 （６）構成する糖及び有機酸の組成（モル比）：ガラク
トース１、グルコース（５．６±０．１）、コハク酸
（０．６±０．１）、ピルビン酸（２．５±０．１）。 （７）分子量：２×１０⁶以上。 （８）粘度（ビスメトロン回転粘度計、ＳＳ−２ロータ
ー、２５℃、回転数３〜６０ｒｐｍ、溶媒は純水、Ｈ型
ＡＰＲ−３の０．５重量％濃度溶液）：（９，０００±
１，０００）ｃＰ。 （９）溶媒溶解性：水に可溶、アルカリに易溶、メタノ
ール、エタノール及びアセトンに不溶。 （１０）比旋光度（２０℃）：−１７〜−１５° （１１）ＩＲスペクトル吸収帯（ｃｍ^−１）：２，７０
０〜３，７００、１，７３０、１，６００、１，４０
０、１，１６０。

【０００６】又、本発明は、２）培養物が、２〜２００
０μｇ／ｌのサイアミン濃度を有するサイアミン含有培
地で培養して得られる培養物である前記１）に記載の油
水分離剤を提供する。

【０００７】又、本発明は、３）ＡＰＲ−３生産能を有
する微生物が、ＡＰＲ−３生産能を有する微生物を少な
くとも１種を含む複合微生物からなり、当該複合微生物
を複合的培養若しくは複合培養する前記１）、２）に記
載の油水分離剤を提供する。

【０００８】又、本発明は、４）ＡＰＲ−３生産能を有
する微生物が、細菌である前記１）、２）又は３）に記
載の油水分離剤を提供する。又、本発明は、５）ＡＰＲ
−３生産能を有する微生物が、ブルセラ属、ザントモナ
ス属、アシネトバクター属、コマモナス属、サルモネラ
属、オーレオバクテリウム属、セルロモナス又はアグロ
バクテリウム属に属するものである前記１）、２）、
３）又は４）に記載の油水分離剤を提供する。

【０００９】又、本発明は、６）ＡＰＲ−３生産能を有
する微生物の少なくとも１種を含む複合微生物が、セル
ロモナス・セルランス、アグロバクテリウム・ツメファ
シエンス及びそれらに極めて近い種に属する細菌の少な
くとも１種を含むものである前記３）に記載のＡＰＲ−
３の油水分離剤を提供する。

【００１０】又、本発明は、７）ＡＰＲ−３生産能を有
する微生物の少なくとも１種を含む複合微生物が、セル
ロモナス・セルランスＫＹＭ−７株、アグロバクテリウ
ム・ツメファシエンス及びそれらに極めて近い種に属す
るＫＹＭ−８株の少なくとも１種を含むものである前記
３）に記載の油水分離剤を提供する。

【００１１】又、本発明は、８）ＡＰＲ−３生産能を有
する微生物の少なくとも１種を含む複合微生物が、セル
ロモナス・セルランスＫＹＭ−７株、アグロバクテリウ
ム・ツメファシエンス及びそれらに極めて近い種に属す
るＫＹＭ−８株の少なくとも１種を含み、且つブルセラ
属、ザントモナス属、アシネトバクター属、コマモナス
属、サルモネラ属、オーレオバクテリウム属及びセルロ
モナス属に属する微生物から選ばれる少なくとも１種を
含むものである前記３）に記載の油水分離剤を提供す
る。

【００１２】又、本発明は、９）ブルセラ属に属する微
生物がブルセラｓｐ．ＫＹＭ−１株、ステノトロフォモ
ナス又はザントモナスのグループに属する微生物がＫＹ
Ｍ−２株、アシネトバクター属に属する微生物がアシネ
トバクターｓｐ．ＫＹＭ−３株、コマモナス属に属する
コマモナス・テストステロニーと同種か極めて近い種に
属するＫＹＭ−４株、サルモネラ属に属する微生物がサ
ルモネラｓｐ．ＫＹＭ−５株、オーレオバクテリウム属
に属する微生物がオーレオバクテリウムｓｐ．ＫＹＭ−
６株である前記５）、又は８）に記載の油水分離剤を提
供する。

【００１３】又、本発明は、１０）前記１）〜９）の何
れか１項に記載の油水分離剤を油懸濁水と接触させるこ
とを特徴とする油水分離方法を提供する。

【００１４】

【発明の実施の形態】次に実施形態を挙げて本発明を更
に詳しく説明する。しかし、本発明はこの実施形態によ
り何ら限定されるものではない。本発明でいうＡＰＲ−
３とは、次ぎのの特質を有する高分子物質である。

【００１５】（１）糖含有量（フェノール・硫酸法）：
（６４±２）重量％ （２）アミノ糖（エルソン・モーガン法）：検出されな
い。 （３）ウロン酸（カルバゾール・硫酸法）：検出されな
い。 （４）蛋白質（ニンヒドリン法）：検出されない。 （５）元素分析：炭素Ｃ＝４０（±２）％、水素Ｈ＝６
（±１）％、窒素Ｎ、リンＰ及び硫黄Ｓは痕跡。 （６）構成する糖及び有機酸の組成（モル比）：ガラク
トース１、グルコース５．６（±０．１）、コハク酸
０．６（±０．１）、ピルビン酸２．５（±０．１）。 （７）分子量：２×１０⁶以上。 （８）粘度（ビスメトロン回転粘度計、ＳＳ−２ロータ
ー、２５℃、回転数３〜６０ｒｐｍ、溶媒は純水、Ｈ型
ＡＰＲ−３の０５重量％濃度溶液）：９，０００（±
１，０００）ｃＰ。 （９）溶媒溶解性：水に可溶、アルカリに易溶、メタノ
ール、エタノール及びアセトンに不溶。 （１０）比旋光度（２０℃）：−１７〜−１５° （１１）ＩＲスペクトル吸収帯（ｃｍ^-1）：２，７００
〜３，７００、１，７３０、１，６００、１，４００、
１，１６０。 以上の特性を有する高分子物質は現在まで知られていな
いので、当該物質は新規物質である。

【００１６】本発明において、油水分離能とは、油懸濁
水（海水も含む。）を油相と水相とに分離する能力のこ
とをいう。該油水分離能は次のようにして測定される。 Ａ）油水分離能の活性測定法 サラダ油１０ｇとノニオン系界面活性剤Ｔｗｅｅｎ８０
（和光純薬社製：ソルビタンモノオレアートのエチレン
オキシド縮合物）０．５ｇをビーカー中で２〜３分間超
音波処理してサラダ油を乳化させる。この中に撹拌しな
がら海水を加えて全量を２リットルとし、これを油懸濁
水の原水とする。

【００１７】２リットルのビーカーに原水１リットルを
移し、ｐＨを１０に調整する。この原水０．８リットル
を加圧浮上装置（宮本製作所製ＭＳ９０００）に供給す
る。更にサンプル液２０ｍｌを添加して、室温で内容物
を十分に撹拌した後、加圧水を０．３リットル添加す
る。１０〜２０分間静置後、水相のＣＯＤを重クロム酸
カリウム法で測定する。活性はそのＣＯＤ値で示され
る。そして、油水分離能は次式により計算される。 油水分離能＝（（Ａ−Ｂ）／Ａ）×１００（％）、但
し、Ａ：処理前のＣＯＤ値、Ｂ：処理後のＣＯＤ値。

【００１８】本発明の第一の特徴は、ＡＰＲ−３生産能
を有する微生物を、サイアミン含有の固体若しくは液体
の栄養培地に培養して得られる培養物を主成分として使
用する油水分離剤である。 そして、サイアミン含有培
地とは、培養開始から、即ち種培養若しくは前培養か
ら、目的の油水分離能を得るまで、固体若しくは液体の
栄養培地中にサイアミンが含有していることを意味す
る。サイアミン濃度は、２〜２０００μｇ／ｌの濃度、
好ましくは５〜１０００μｇ／ｌの濃度、より好ましく
は２〜５００μｇ／ｌ濃度で培地中に含有していればよ
い。２μｇ／ｌ以下の場合は油水分離活性が極端に低下
する。２０００μｇ／ｌ以上の場合は油水分離剤活性が
それ以上増加しないので、培地にそれ以上含有させるこ
との意味がなくなる。本発明のサイアミンとは、サイア
ミン自体、サイアミン塩酸塩等のサイアミンの各種塩
類、サイアミンの各種誘導体、サイアミン含有物などを
いう。

【００１９】ＡＰＲ−３生産能を有する微生物はＡＰＲ
−３生産能を有するものであれば、細菌、放線菌、酵
母、カビ等のどのような微生物でも使用できる。本発明
においては、特にフタル酸を資化できる特性とスライム
形成性を目安にスクリーニングして得られたが、スクリ
ーニング方法等に何ら限定されるものではない。ＡＰＲ
−３生産能を有する微生物の特徴は、ＡＰＲ−３生産能
を有する微生物の少なくとも１種を含む複数の微生物の
混合物（以下、複合微生物という。）からなるものであ
る。複合微生物は、その中の各微生物を少なくとも１種
を単離できるものでもよく、単離できないものでもよ
い。複合微生物自体がＡＰＲ−３生産能を有するもので
あればよい。又、当該複合微生物の中に本発明の微生物
以外のものが混入していても、ＡＰＲ−３の生産を阻害
しない限り、一向に差し支えない。このような複合微生
物を用いて、有用物質を生産するという発想は本発明者
らが初めて為したものである。

【００２０】ＡＰＲ−３生産能を有する微生物の中で
も、好ましいものとして細菌類を挙げることができる。
より具体的には、ブルセラ属、ステノトロフォモナス
属、ザントモナス属、アシネトバクター属、コマモナス
属、サルモネラ属、大腸菌属、オーレオバクテリウム
属、セルロモナス属及びアグロバクテリウム属に属する
微生物である。

【００２１】上記の属に属する微生物の中でも、特に好
ましい菌株として、ブルセラ属に属する微生物としてブ
ルセラｓｐ．ＫＹＭ−１株を、ステノトロフォモナス又
はザントモナスのグループに属する微生物としてＫＹＭ
−２株を、アシネトバクター属に属する微生物とそてア
シネトバクターｓｐ．ＫＹＭ−３株を、コマモナス属に
属する微生物としてコマモナス・テストステロニーと同
種かそれに極めて近い種に属するＫＹＭ−４株を、サル
モネラ属に属する微生物としてサルモネアｓｐ．ＫＹＭ
−５株を、オーレオバクテリウム属に属する微生物とし
てオーレオバクテリウムｓｐ．ＫＹＭ−６株を、セルロ
モナス属に属する微生物としてセルロモナス・セルラン
スＫＹＭ−７株を、そしてアグロバクテリウム属に属す
る微生物としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス
若しくはそれに極めて近い種に属するＫＹＭ−８株等を
挙げることができる。

【００２２】上記の微生物の中でも、ＫＹＭ−１、ＫＹ
Ｍ−２、ＫＹＭ−３、ＫＹＭ−４、ＫＹＭ−５、ＫＹＭ
−６、ＫＹＭ−７及びＫＹＭ−８の菌株番号が付された
ものは、フタル酸資化性及びスライム形成性を指標とし
て、活性汚泥及び土壌からのスクリーニングより、ＡＰ
Ｒ−３生産能を有する複合微生物として得られたもので
ある。各々、単離してその性質を調べた結果を下記の表
１〜４に示してある。各菌株は、生命工学研究所に寄託
され、ＫＹＭ−１はＦＥＲＭ Ｐ−１１３３３、ＫＹＭ
−２はＦＥＲＭ Ｐ−１１３３４、ＫＹＭ−３はＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１１３３５、ＫＹＭ−４はＦＥＲＭ Ｐ−１１
３３６、ＫＹＭ−５はＦＥＲＭ Ｐ−１１３３７、ＫＹ
Ｍ−６はＦＥＲＭ Ｐ−１１３３８、ＫＹＭ−７はＦＥ
ＲＭ Ｐ−１１３３９、ＫＹＭ−８はＦＥＲＭ Ｐ−１
６８０６の番号が付されている。

【００２３】表１

【００２４】表２

【００２５】表３

【００２６】表４

【００２７】上記のＫＹＭ菌株を、表１〜４に記載の形
態学的及び生理学的性質に基づいて、Bergey's Manual
of Systematic Bacteriology（第１巻、第２巻、第３
巻、第４巻）に記載の分類基準に従って、同定すると、
ＫＹＭ−１は、シュドモナス・ファギー（Pseudomonas
faagi）、ＫＹＭ−２は、ザントモナス・マルトフィリ
ア（Xanthomonas maltophilia）、ＫＹＭ−３は、アセ
ネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobactor ca
lcoaceticus）、ＫＹＭ−４は、ブルクホルデリア・セ
パシア（Burkholderia cepacia）、ＫＹＭ−５は、ハフ
ニア・アルベイア（Hafnia alveia）、ＫＹＭ−６は、
コリネバクテリウム・アクアチクム（Corynebacterium
aquaticum）、ＫＹＭ−７は、セルロモナス・カルタエ
（Cellulomonas cartae）、ＫＹＭ−８は、アグロバク
テリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）に
属する菌株である。尚、ブルクホルデリア・セパシア
は、旧名称シュドモナス・セパシアとされ、ハフニア・
アルベイアは、旧名称サルモネラｓｐ．とされ、そして
セルロモナス・カルタエは、旧名称オエルスコビア属と
されていた（再分類され現名称となっている）。

【００２８】しかしながら、最近、１６Ｓ ｒＤＮＡの
塩基配列の相同性から、微生物を発生系統的に同定・分
類する方法が行なわれている（日本微生物生態学会報
（Bulletin of Japanese Society of Microbial Ecolog
y）、１０巻、１１９〜１３６ページ、１９９５年、同
報、１０巻、３１〜４２ページ、１９９５年）。上記の
菌株をこの方法で解析しその結果を表５に記載した。表
５より同定・分類すると：

【００２９】表５ に属する菌株である。尚、上記の１６Ｓ ｒＤＮＡ解析
法によると、サルモネラ属と大腸菌属に属する微生物
は、同一属の微生物と見做されている。その故に本発明
で使用する微生物は、サルモネラ属又は大腸菌属のどち
らの属に属する微生物でもよい。

【００３０】以上の結果より、本発明で使用する菌株
は、ＫＹＭ−１は、ブルセラｓｐ．又はシュドモナス・
ファギー、ＫＹＭ−２は、ステノトロホモナスｓｐ．又
はザントモナス・マルトフィリア、ＫＹＭ−３は、アセ
ネトバクター・カルコアセティカス、ＫＹＭ−４は、コ
マモナス・テストステロニー又はブルクホルデリア・セ
パシア、ＫＹＭ−５は、サルモネラｓｐ．又はハフニア
・アルベイア、ＫＹＭ−６は、オーレオバクテリウムｓ
ｐ．又はコリネバクテリウム・アクアチクム、ＫＹＭ−
７は、セルロモナス・セルランス又はセルロモナス・カ
ルタエ、ＫＹＭ−８は、アグロバクテリウム・ツメファ
シエンス（Agrobacterium tumefaciens）又はアグロバ
クテリウム・リゾゲネスに属する菌株である。

【００３１】本発明において、総合的に検討した結果、
ＫＹＭ−１株は、ブルセラｓｐ．に属する菌株、ＫＹＭ
−２株は、ステノトロフォモナス又はザントモナスのグ
ループに属する菌株、ＫＹＭ−３株は、アシネトバクタ
ーｓｐ．属に属する菌株、ＫＹＭ−４株は、コマモナス
・テストステロニーと同種かそれに極めて近い種に属す
る菌株、ＫＹＭ−５株は、サルモネラ又は大腸菌のグル
ープに属する菌株（本発明においては簡便化のためサル
モネラ属という。）、ＫＹＭ−６株は、オーレオバクテ
リウムｓｐ．に属する菌株、ＫＹＭ−７株は、セルロモ
ナス・セルランス若しくはそれに極めて近い種に属する
菌株、ＫＹＭ−８株は、アグロバクテリウム・ツメファ
シエンス若しくはそれに極めて近い種に属する菌株であ
ると判断した。

【００３２】ＫＹＭ−１〜ＫＹＭ−７菌株は公知菌株で
あるが、ＫＹＭ−８菌株は新規微生物菌株である。以上
のことから、本発明の油水分離剤に使用する微生物は、
ＡＰＲ−３生産能を有する微生物であればよく、上記の
ような具体的な菌名をもって制限されるものではない。

【００３３】本発明において、好ましい実施形態とし
て、ＡＰＲ−３生産能を有する微生物を培養するにあた
り、ＡＰＲ−３生産能を有する微生物を、少なくとも１
種を含む複合微生物を複合的培養若しくは複合培養する
ことである。それ故、複合微生物とは、少なくとも上記
の属に属する微生物の中の１種を含む。その中でも特に
好ましい実施形態は、少なくともアグロバクテリウム属
に属する微生物及び／又はセルロモナス属に属する微生
物を含むものである。

【００３４】本発明における複合微生物は、ブルセラｓ
ｐ．ＫＹＭ−１株、ステノトロフォモナス又はザントモ
ナスのグループに属するＫＹＭ−２株、アシネトバクタ
ーｓｐ．ＫＹＭ−３、コマモナス・テストステロニーと
同種か極めて近いＫＹＭ−４、サルモネラ属に属するい
ずれかの微生物、オーレオバクテリウム属に属するいず
れかの微生物及びセルロモナス属に属するいずれかの微
生物からなる群から選ばれる少なくとも１種の微生物
と、アグロバクテリウム・ツメファシエンス若しくはそ
れに極めて近いＫＹＭ−８との組合せを含む。

【００３５】若しくは、ブルセラｓｐ．ＫＹＭ−１株、
ステノトロフォモナス又はザントモナスのグループに属
するＫＹＭ−２株、アシネトバクターｓｐ．ＫＹＭ−
３、コマモナス・テストステロニーと同種か極めて近い
ＫＹＭ−４、サルモネラ属に属するいずれかの微生物及
びオーレオバクテリウム属に属するいずれかの微生物か
らなる群から選ばれる少なくとも１種の微生物と、セル
ロモナス属に属するＫＹＭ−７株との組合せを含む。

【００３６】更に特に好ましい実施形態は、上記の組合
せの中でも、サルモネラ属に属するいずれかの微生物が
ＫＹＭ−５株、オーレオバクテリウム属に属するいずれ
かの微生物がＫＹＭ−６株、セルロモナス属に属するい
ずれかの微生物がＫＹＭ−７株である。

【００３７】上記の組合せの詳しい具体例として一例を
挙げるならば次の如くである。 （ａ）ＫＹＭ−８、ＫＹＭ−７ （ｂ）ＫＹＭ−８、ＫＹＭ−７、ＫＹＭ−１ （ｃ）ＫＹＭ−８、ＫＹＭ−７、ＫＹＭ−５ （ｄ）ＫＹＭ−８、ＫＹＭ−７、ＫＹＭ−５、ＫＹＭ−
４ （ｅ）ＫＹＭ−８、ＫＹＭ−７、ＫＹＭ−５、ＫＹＭ−
４、ＫＹＭ−１ （ｆ）ＫＹＭ−８、ＫＹＭ−７、ＫＹＭ−６、ＫＹＭ−
５、ＫＹＭ−４、ＫＹＭ−３、ＫＹＭ−２、ＫＹＭ−１ （ｇ）ＫＹＭ−７、ＫＹＭ−４ （ｈ）ＫＹＭ−７、ＫＹＭ−４、ＫＹＭ−１ （ｉ）ＫＹＭ−７、ＫＹＭ−５、ＫＹＭ−４、 （ｊ）ＫＹＭ−７、ＫＹＭ−５、ＫＹＭ−４、ＫＹＭ−
１

【００３８】本発明で使用する微生物の中でも、ＫＹＭ
−１株〜ＫＹＭ−８株の微生物は、単独の状態又は上記
のいずれの組合せの複合状態で、寒天培地上でスライム
を形成するフロック状態になる。そして、フロック状態
のまま、植えつぐことも、保存することもできる。又、
便利に種培養菌として用いることもできる。それで、上
記の組合せの微生物の中でも、（ｆ）、（ａ）、
（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）、
（ｉ）及び（ｊ）は各々、Ｒ−３菌、Ｒ−４菌、Ｒ−５
菌、Ｒ−６菌、Ｒ−７菌、Ｒ−８菌、Ｒ−９菌、Ｒ−１
０菌、Ｒ−１１菌及びＲ−１２菌と略称される。

【００３９】これらの菌は、寒天培地上でスライムを形
成する。しかし、このスライム形成は本発明を何ら限定
するものではない。尚、これらの組合せの菌株を用いて
培養を行なう場合は、寒天培地上でスライムを形成さ
せ、スライム形成微生物を種菌として用いると便利であ
る。

【００４０】本発明では、上記の本発明の微生物の植え
つぎ、連続植えつぎ、又は保存にあたり、使用する培地
として、寒天培地などの固体培地、又液体培地のどちら
も採用出来る。そして十分な生育量を得ることが出来
る。しかしながら、本培養におけるＡＰＲ−３の生産活
性を良好に得るには、上記の培地にもサイアミンを含有
させるのが好適である。そのサイアミンの濃度は、２〜
２０００μｇ／ｌ、好ましくは５〜１０００μｇ／ｌ、
より好ましくは５〜５００μｇ／ｌである。２μｇ／ｌ
以下の場合は、ＡＰＲ−３生産活性が極端に低下する。
２０００μｇ／ｌ以上の場合はＡＰＲ−３生産活性がそ
れ以上増加しない。それでそれ以上の含有は意味がない
ものとなる。更に良好なＡＰＲ−３生産活性を得るに
は、サイアミン含有培地で培養した菌体を、グリセロー
ル、グルコース、マルトース、トレハロース等の糖類、
又ＤＭＳＯ（ジメチルスルホオキシド）等、好ましくは
１０重量％マルトースを含む液体培地中ないし溶液中又
は緩衝液中に保存することが好適である。そしてそれら
の糖類の濃度は５〜１５重量％である。保存温度は−１
００℃〜−２０℃、好ましくは−８０℃〜−６０℃であ
る。

【００４１】本発明において微生物を培養するにあた
り、使用する培地は、本発明の微生物の液体又は固体の
栄養培地で、且つサイアミンを含有するものであればど
のようなものでもよく、特に制限されない。そして、通
常の公知の方法に従って調製することができる。例え
ば、その組成は、炭素源として、デンプン、廃糖蜜、デ
キストリン、サッカロース、マルトース、マンニット、
グルコース及びフラクトース等、窒素源として、硫安、
塩安、尿素、肉エキス、ペプトン及び酵母エキス等、無
機塩類として、リン酸塩、マグネシウム塩、食塩、鉄塩
及びマンガン塩等、ビタミン類としてサイアミン、その
他のビタミン類、酵母エキス、コーンステープリカー及
び廃糖蜜等が適当量含有していればよい。

【００４２】上記の炭素原の中でもデンプン、マンニッ
トは好ましいものとして挙げることができ、培地中に占
める量として０．０１〜３０重量％、好ましくは、０．
１〜２０重量％で使用する。ｐＨは５〜９位の範囲に調
整すればよい。固体培地又は液体培地の種類は問われな
い。尚、農産物廃棄物、食品産業廃棄物、発酵廃液及び
残渣類、都市ゴミ類等も炭素源、有機窒素源及びビタミ
ン類等として使用することができる。培養は、振盪、通
気撹拌等の操作で、２０〜４０℃で２〜１５日間行なえ
ばよい。そして回分或いは連続等の培養方法が採用でき
る。前培養なしの方法或いは前培養ありの方法等どちら
も採用できる。

【００４３】上記のようにして本発明の培養物が得られ
る。そして、本発明において、得られた培養物とは培養
液自体の他に培養液の各種処理物をも含むものとする。
例えば、培養液の濃縮物並びにその乾燥物、培養液から
菌体を除いた上澄液並びにその濃縮物並びにその乾燥
物、培養液から得られる菌体自体及びその懸濁物若しく
はその乾燥物等である。そして、本発明において得られ
た培養物をそのまま油水分離剤とすることが出来る。
又、適当な付加剤又は添加剤等を添加して、油水分離剤
とすることもできる。そして、本発明の油水分離剤を油
懸濁水に接触させると、効率よく油と水を分離すること
が出来る。

【００４４】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説
明する。尚、文中「％」とあるのは特に断りの無い限り
重量基準である。 実施例１：本発明で使用する混合菌であるＲ−３菌の培
養 本発明で使用する菌の種培養及び本培養に用いる培地の
組成（％）： デンプン＝１％ Ｋ₂ＨＰＯ₄＝０．５％ ＫＨ₂ＰＯ₄＝０．２％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ＝０．０２％ （ＮＨ_４）₂ＳＯ₄＝０．０５％ ポリペプトン（商標名）（大五栄養化学ＫＫ製）＝０．
２％ サイアミン塩酸塩＝２００μｇ／ｌ 水道水＝残り ｐＨ＝７．０（３Ｎ ＫＯＨで調整） 殺菌条件：１２１℃（達温）及び１５〜２０分間

【００４５】Ｒ−３菌を肉汁寒天平板培地に３０℃で５
日間培養した。当該菌の１白金耳を液体培地８０ｍｌ
（５００ｍｌ容振盪フラスコ）に添加し、３０℃で２日
間培養し種培養を調製した。尚、ロータリーシェイカー
を用いて当該フラスコを振盪した。当該培養液（６０ｍ
ｌ）を５リットル容ジャーファメンター（培地３リット
ル）に添加し、３０℃で３リットル／ｍｉｎの通気量
で、７日間撹拌（２００〜４００ｒｐｍ）しながら培養
した。生育度（ＯＤ３１０ｎｍにおける濁度にて測
定）、油水分離能及びカオリン凝集活性ともに３日間で
最高値に達した。培養液の粘度は最後まで増加した。生
育度１６．５（３１０ｎｍにおける濁度測定）、カオリ
ン凝集活性２７７、粘度１，２００（ｃＰ）なる培養液
を得た。尚、粘度はビスメトロン回転粘度計を用い、Ｓ
Ｓ−２ローター使用し、２５℃及び回転数３〜６０ｒｐ
ｍの条件で測定した。

【００４６】実施例２：ＡＰＲ−３の分離精製 実施例１のようにしてＲ−３菌を培養して得た培養液３
リットルを純水１２リットルで希釈し、菌体を遠心分離
（２８，０００Ｇ及び３０ｍｉｎ）で除去し、その後、
膜濃縮機を使用して２リットルまで濃縮した。当該濃縮
液に２倍容のエタノールを添加し、繊維状の沈殿物（Ａ
ＰＲ−３）を析出させた。当該沈殿物を遠心分離で採取
し、シリカゲル入りのデシケーターの中で、一晩減圧乾
燥した。９．２ｇの粗ＡＰＲ−３を得た（対デンプン収
率＝３０．５％）。

【００４７】５００ｍｇの当該粗ＡＰＲ−３を蒸溜水１
００ｍｌに溶解した。次、これに２％cetylpyridium ch
loride（ＣＰＣ）溶液５０ｍｌを撹拌しながら添加し、
数時間静置し、ＡＰＲ−３とＣＰＣの複合体の沈殿物を
形成させた。当該複合体の沈殿物を遠心分離により集
め、０．５モルの食塩水に溶解した。これに２倍容のエ
タノールを添加し、繊維状の沈殿物を得た。当該沈殿物
をエタノール及びアセトンで各々５回洗浄した後、上記
のようにして減圧乾燥した。純度検定で９８％以上のＡ
ＰＲ−３（３８０ｍｇ）のを得た（対デンプン収率＝２
１．０％）。このことから、Ｒ−３菌の培養液には約２
ｍｇ／ｍｌのＡＰＲ−３が生産されていることが分か
る。

【００４８】上記の純度検定は次のようにして行なっ
た。上記の如くして精製されたＡＰＲ−３を、０．５Ｎ
のＮａＯＨ水溶液で加水分解し、脱アセチル化した。得
られた脱アセチル化ＡＰＲ−３について、酢酸セルロー
ス膜を支持体として電気泳動を行った。その結果、当該
ＡＰＲ−３は陽極側に移動し、単一のスポットを与えた
（図１参照）。よって当該ＡＰＲ−３は純粋なものと判
断した。

【００４９】実施例３：ＡＰＲ−３の特質 上記の精製ＡＰＲ−３について分析した。 １．全糖 フェノール・硫酸法により測定した。その結果６４（±
２）％であった。 ２．アミノ糖 エルソン・モーガン法により定性分析を行った。アミノ
糖は検出されなかった。 ３．ウロン酸 カルバゾル・硫酸法により検出を試みたが、検出されな
かった。

【００５０】４．蛋白質 ニンヒドリン法により検出を試みたが、検出されなかっ
た。 ５．元素分析 炭素Ｃ＝４０（±２）％、水素Ｈ＝６（±１）％、窒素
Ｎ＝痕跡、リンＰ＝痕跡、硫黄＝痕跡。

【００５１】６．構成糖 上記の精製ＡＰＲ−３を２Ｍのトリフルオロ酢酸で４時
間加水分解した。 定性分析：当該加水分解物について、次の条件で薄層ク
ロマトグラフィーを行った。その結果、グルコース及び
ガラクトースのみが検出された。条件：プレート＝シリ
カゲル６０（０．５Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４）、展開相＝イ
ソプロピルアルコール：アセトン：０．１Ｍ乳酸（２：
２：１ 重量比）。

【００５２】定量分析：上記加水分解物について、ＴＭ
Ｓ誘導体を調製して、次の条件でガスクロマトグフィー
による分析を行った。その結果、ＡＰＲ−３は、ガラク
トース１モルに対してグルコース５．６（±０．１）モ
ルの割合で構成されていることが判明した。条件：装置
＝島津（Shimadzu）ＧＣ−１５Ａ、検出器＝ＦＩＤ、カ
ラム＝Hicap-CBPI（OV-1 chemical bonding）キャピラ
リーカラム。

【００５３】７．構成有機酸 ＡＰＲ−３を、２Ｎの硫酸溶液で１００℃で２時間加水
分解した。この加水分解物について、薄層クロマトグラ
フィーによる定性及び同定分析を次の条件で行なった。
その結果コハク酸とピルビン酸が検出された。

【００５４】定性分析：プレート＝セルロースＦ２５４
Ｓ又はシリカゲルＦ２５４、展開相＝ブタノール：ギ
酸：水（４：１．５：１ 重量比）又はアミルアルコー
ル：０．２５Ｍアンモニア（２：１ 重量比）。

【００５５】定量分析：ＡＰＲ−３を２Ｍトリフルオロ
酢酸溶液で１００℃で４時間加水分解し、その加水分解
物をメチル化した。それをガスクロマトグラフィーで定
量した。その結果、コハク酸とピルビン酸が、構成糖で
あるガラクトース１モルに対して各々０．６（±０．
１）モル及び２．５（±０．１）モル含まれていること
が分かった。

【００５６】８．分子量 脱アセチル化したＡＰＲ−３について、トヨパールＨＷ
７５Ｆゲルカラムを使用するゲルクロマトグラフィーで
ＡＰＲ−３の分子量を求めた（図２参照）。ブルーデキ
ストランよりも先にＡＰＲ−３のピークが出現するの
で、分子量は２×１０⁶以上であると判断された。

【００５７】９．比旋光度 比旋光度は−１７〜−１５°であった。 １０．ＩＲスペクトル 図３に当該スペクトルを示した。２，７００〜３，７０
０ｃｍ^-1に水酸基の吸収、１７００ｃｍ^-1及び１，１６
０ｃｍ^-1にカルボキシルエステル結合の吸収、そして
１，６００ｃｍ^-1及び１，４００ｃｍ^-1にイオン化カル
ボキシル基の吸収を示した。

【００５８】１１．溶媒に対する溶解性 水に可溶、アルカリに易溶、メタノール及びアセトンに
不溶であった。 １２．粘度特性 ビスメトロン回転粘度計で、ＳＳ−２ ローターを使用
し、２５℃及び回転数３〜６０ｒｐｍの条件で測定し
た。対照物質としてザンサンガムを用いた。ＡＰＲ−３
はＮａ型（塩）、Ｃａ型（塩）及びＨ型（フリー型）に
して測定した。ザンサンガム及びＡＰＲ−３の濃度は
０．５重量％溶液とした。その結果を図４に示した。い
ずれの型のＡＰＲ−３もザンサンガムと同様に、シュー
ドプラスチック流動特性を示した。又、ザンサンガムよ
りも高粘度であった。以上の特性を有する高分子物質
は、現在まで発見されていないので、新規物質と認定し
た。

【００５９】実施例４ 実施例１で得たＡＰＲ−３の粉末について、ＡＰＲ−３
溶液（５０ｍｇ／１ｍｌ蒸留水）を調製し、その内の２
０ｍｌを使用して、上記の油水分離能測定法により測定
し、下記表６の通りの結果を得た。

【００６０】表６ 表６から分かるように、本発明のＡＰＲ−３は油水分離
能を有することは明らかである。又、下記の比較例実験
の表７から分かるように、公知のロードコッカス・エリ
スロポレスＫＲ−２５６−２（ＦＥＲＭ Ｐ−３９２
３）のものより高活性を有する。

【００６１】比較例１ ロードコッカス・エリスロポレスＫＲ−２５６−２（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−３９２３）を、実施例１と同様な条件で培
養して得た培養液の上澄液について、膜濃縮により２５
倍の濃縮を行い、ＡＰＲ−３溶液（５０ｍｇ／１ｍｌ蒸
留水）の調製条件と同様なものにした。実施例４と同様
の条件で油水分離能を測定し、下記表７の結果を得た。

【００６２】表７

【００６３】実施例５ Ｒ−３菌をＲ−４菌に代えること、及び培地にサイアミ
ンを添加すること（以下、サイアミン含有系という。）
並びに添加しないこと（以下、サイアミン非含有系とい
う。）以外は、実施例１と同様に培養し、その培養の経
時変化を調べた。その結果を図５及び６に示した。尚、
図５はサイアミン含有系のものであり、図６はサイアミ
ン非含有系のものである。図５及び６から分かるよう
に、サイアミン非含有系では培養３日目でカオリン凝集
活性は最高値に達し、その後減少傾向を示した。又、粘
度（ｃＰ）は培養４日目で最高値に達し、その後減少傾
向を示した。しかし、サイアミン含有系では、培養３日
頃からカオリン凝集活性及び粘度（ｃＰ）の増加率が減
少するものの、カオリン凝集活性及び粘度（ｃＰ）の値
が減少することはなかった。尚、活性は培養液の上澄液
について測定した。ＡＰＲ−３生産能を有しないが、微
生物産生凝集剤を生産することが知られているロードコ
ッカス・エリスロポレスＫＲ−２５６−２（ＦＥＲＭ
Ｐ−３９２３）を対照菌株として採用し、Ｒ−４菌のサ
イアミン含有系と同様の条件で培養した。その結果を図
７に示した（比較例１参照）。図５、６及び７から分か
るように、Ｒ−４菌は、カオリン凝集活性及び粘度（ｃ
Ｐ）が格段に高い培養液を生産すること、又、サイアミ
ン含有系は、非含有系のものより培養液のカオリン凝集
活性及び粘度（ｃＰ）が高く、且つ培養の安定性が優れ
ているが分かる。尚、生育度は３１０ｎｍにおける濁度
測定によった。

【００６４】実施例６ 実施例５において、回分培養を連続的回分培養（回分培
養の培養終了時の培養液を種培養液として利用する形式
の培養方法）に変えること以外は実施例５と同様に培養
した。なお、本実施例では、連続的回分培養方法を採用
しているので、種培養は第一回目の培養においては実施
例１と同様に行い、接種も実施例１と同様に行ったが、
第二回目からは前回培養終了時の培養液を種培養として
利用した。そして接種量は１０容量％とした。そして、
５回、そして各回１０日間培養し、得た各回の培養液に
ついて油水分離能を測定した。その結果を表７に示し
た。

【００６５】表８ ＊ＣＯＤ（ｍｇ／ｌ）：原水＝１０．０００；無添加＝
４．０２０

【００６６】実施例７ Ｒ−３菌をＲ−４菌に代えること、及びサイアミンの濃
度を表９に記載のように変えること以外は、実施例１と
同様に培養を行って、表９のような結果を得た。サイア
ミン含有培地のサイアミン濃度が ２〜２０００μｇ／
ｌの範囲の場合に、粘度の高い培養液が得られることが
表９から分かる。そして２０００μｇ／ｌ以上になると
粘度はそれ以上は増加しない。本発明においては油水分
離能の増加と粘度の増加は相関する。よってサイアミン
含有培地のサイアミン濃度が ２〜２０００μｇ／ｌの
範囲の場合に油水分離能の高い培養液が得られることが
分かる。

【００６７】表９

【００６８】実施例７ Ｒ−３菌の代わりに、ＫＹＭ−１、ＫＹＭ−４、ＫＹＭ
−５、ＫＹＭ−７、ＫＹＭ−８及びそれらを図７に示し
たような組み合わせた混合菌及び混合菌であるＲ−３〜
Ｒ−１２を用いて、実施例１と同条件で培養した。そし
て、図８のような結果を得た。本実施例においては、油
水分離能が粘度と相関する故、油水分離能を粘度測定で
行った。粘度測定条件は実施例１と同様である。これか
ら、本発明の複合微生物は、ＡＰＲ−３の生産により効
果的であることが分かる。そして、ＫＹＭ−７又は／及
びＫＹＭ−８を含む複合微生物が特に効果的であること
が分かる。

【００６９】

【発明の効果】本発明の微生物菌を、サイアミン含有培
地で培養することにより得られる培養液は、サイアミン
非含有培地で培養したものより油水分離能が高い。よっ
てその培養液を主成分としてなる油水分離剤は、安価で
高活性の油水分離剤として使用できる。それ故に、環境
汚染の油水分離処理において、それらの処理を効率よく
達成することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＡＰＲ−３の電気泳動パターン。

【図２】 ＡＰＲ−３のゲルクマトグラフィーパター
ン。

【図３】 ＡＰＲ−３のＩＲスペクトル。

【図４】 ＡＰＲ−３の粘度特性。

【図５】 Ｒ−４菌における、サイアミン含有系の培養
の経時変化。

【図６】 Ｒ−４菌における、サイアミン非含有系の培
養の経時変化。

【図７】 ロードコッカス・エリスロポレスＫＲ−２５
６−２（ＦＥＲＭ Ｐ−３９２３）菌株における、サイ
アミン含有系の培養の経時変化。

【図８】 本発明のＫＹＭ−８菌、ＡＰＲ−３生産能を
有するＫＹＭ各菌及びそれらの混合菌であるＲ−３〜Ｒ
−１２菌の活性比較。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (74)上記１名の代理人 100077698 弁理士 吉田 勝広 (72)発明者 倉根 隆一郎 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 金川 貴博 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 鎌形 洋一 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 花田 智 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 蔵田 信也 東京都千代田区東神田１−９−８ 環境エ ンジニアリング株式会社内 (72)発明者 山田 一隆 東京都千代田区東神田１−９−８ 環境エ ンジニアリング株式会社内 (72)発明者 横幕 豊一 東京都千代田区東神田１−９−８ 環境エ ンジニアリング株式会社内 (72)発明者 小山 修 東京都千代田区東神田１−９−８ 環境エ ンジニアリング株式会社内 (72)発明者 古庄 健太 東京都千代田区東神田１−９−８ 環境エ ンジニアリング株式会社内 Ｆターム(参考） 4B065 AA01X AA04X AA11X AA46X BB20 CA02 CA55 4D015 BA08 BA10 CA06 CA20 DB34 EA16 4D051 AA01 AB07 EA06 EA12 EC04 EC16

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（１）〜（１１）の特性を有し、
   且つ油水分離能を有する高分子物質（以下、ＡＰＲ−３
   という。）の生産能（以下、ＡＰＲ−３生産能とい
   う。）を有する微生物をサイアミン含有培地に培養し
   て、得られる培養物を主成分とすることを特徴とする油
   水分離剤。 （１）糖含有量（フェノール・硫酸法）：（６４±２）
   重量％ （２）アミノ糖（エルソン・モーガン法）：検出されな
   い。 （３）ウロン酸（カルバゾール・硫酸法）：検出されな
   い。 （４）蛋白質（ニンヒドリン法）：検出されない。 （５）元素分析：炭素Ｃ＝（４０±２）％、水素Ｈ＝
   （６±１）％、窒素Ｎ、リンＰ及び硫黄Ｓは痕跡。 （６）構成する糖及び有機酸の組成（モル比）：ガラク
   トース１、グルコース（５．６±０．１）、コハク酸
   （０．６±０．１）、ピルビン酸（２．５±０．１）。 （７）分子量：２×１０⁶以上。 （８）粘度（ビスメトロン回転粘度計、ＳＳ−２ロータ
   ー、２５℃、回転数３〜６０ｒｐｍ、溶媒は純水、Ｈ型
   ＡＰＲ−３の０．５重量％濃度溶液）：（９，０００±
   １，０００）ｃＰ。 （９）溶媒溶解性：水に可溶、アルカリに易溶、メタノ
   ール、エタノール及びアセトンに不溶。 （１０）比旋光度（２０℃）：−１７〜−１５° （１１）ＩＲスペクトル吸収帯（ｃｍ^-1）：２，７００
   〜３，７００、１，７３０、１，６００、１，４００、
   １，１６０。
2. 【請求項２】 培養物が、２〜２０００μｇ／ｌのサイ
   アミン濃度を有するサイアミン含有培地で培養して得ら
   れる培養物である請求項１に記載の油水分離剤。
3. 【請求項３】 ＡＰＲ−３生産能を有する微生物が、Ａ
   ＰＲ−３生産能を有する微生物を少なくとも１種を含む
   複合微生物からなり、当該複合微生物を複合的培養若し
   くは複合培養する請求項１又は２に記載の油水分離剤。
4. 【請求項４】 ＡＰＲ−３生産能を有する微生物が、細
   菌である請求項１、２又は３に記載の油水分離剤。
5. 【請求項５】 ＡＰＲ−３生産能を有する微生物が、ブ
   ルセラ属、ザントモナス属、アシネトバクター属、コマ
   モナス属、サルモネラ属、オーレオバクテリウム属、セ
   ルロモナス又はアグロバクテリウム属に属するものであ
   る請求項１、２、３又は４に記載の油水分離剤。
6. 【請求項６】 ＡＰＲ−３生産能を有する微生物の少な
   くとも１種を含む複合微生物が、セルロモナス・セルラ
   ンス、アグロバクテリウム・ツメファシエンス及びそれ
   らに極めて近い種に属する細菌の少なくとも１種を含む
   ものである請求項３に記載の油水分離剤。
7. 【請求項７】 ＡＰＲ−３生産能を有する微生物の少な
   くとも１種を含む複合微生物が、セルロモナス・セルラ
   ンスＫＹＭ−７株（ＦＥＲＭ Ｐ−１１３３９）、アグ
   ロバクテリウム・ツメファシエンス及びそれらに極めて
   近い種に属するＫＹＭ−８株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６８０
   ６）の少なくとも１種を含むものである請求項３に記載
   の油水分離剤。
8. 【請求項８】 ＡＰＲ−３生産能を有する微生物の少な
   くとも１種を含む複合微生物が、セルロモナス・セルラ
   ンスＫＹＭ−７株、アグロバクテリウム・ツメファシエ
   ンス及びそれらに極めて近い種に属するＫＹＭ−８株の
   少なくとも１種を含み、且つブルセラ属、ザントモナス
   属、アシネトバクター属、コマモナス属、サルモネラ
   属、オーレオバクテリウム属及びセルロモナス属に属す
   る微生物から選ばれる少なくとも１種を含むものである
   請求項３に記載の油水分離剤。
9. 【請求項９】 ブルセラ属に属する微生物がブルセラｓ
   ｐ．ＫＹＭ−１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１１３３３）、ステ
   ノトロフォモナス又はザントモナスのグループに属する
   微生物がＫＹＭ−２株（ＦＥＲＭ Ｐ−１１３３４）、
   アシネトバクター属に属する微生物がアシネトバクター
   ｓｐ．ＫＹＭ−３株（ＦＥＲＭ Ｐ−１１３３５）、コ
   マモナス属に属するコマモナス・テストステロニーと同
   種か極めて近い種に属するＫＹＭ−４株（ＦＥＲＭ Ｐ
   −１１３３６）、サルモネラ属に属する微生物がサルモ
   ネラｓｐ．ＫＹＭ−５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１１３３
   ７）、オーレオバクテリウム属に属する微生物がオーレ
   オバクテリウムｓｐ．ＫＹＭ−６株（ＦＥＲＭ Ｐ−１
   １３３８）である請求項５、又は８に記載の油水分離
   剤。
10. 【請求項１０】 請求項１〜９の何れか１項に記載の油
    水分離剤を油懸濁水と接触させることを特徴とする油水
    分離方法。