JP2000228981A - 放線菌由来の環状プラスミドｄｎａ - Google Patents
放線菌由来の環状プラスミドｄｎａInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ε−ポリリジン生産放線菌における遺伝子操
作を実施するための形質転換用環状プラスミド等を提供
する。 【解決手段】 ストレプトマイセス アルブラスＩＦＯ
１４１４７から核酸画分を常法により回収し、得られた
プラスミド画分を制限酵素ＨｉｎｄIII 消化してプラス
ミドｐＮＯ３３由来の断片を確認。 【効果】 本発明の新規環状プラスミドは、ε−ポリリ
ジン生産放線菌の育種改良および該菌を宿主とした各種
有用遺伝子の発現による有用物質を生産することが可能
である。
作を実施するための形質転換用環状プラスミド等を提供
する。 【解決手段】 ストレプトマイセス アルブラスＩＦＯ
１４１４７から核酸画分を常法により回収し、得られた
プラスミド画分を制限酵素ＨｉｎｄIII 消化してプラス
ミドｐＮＯ３３由来の断片を確認。 【効果】 本発明の新規環状プラスミドは、ε−ポリリ
ジン生産放線菌の育種改良および該菌を宿主とした各種
有用遺伝子の発現による有用物質を生産することが可能
である。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、ε−ポリリジン生
産能を有する放線菌由来のプラスミドＤＮＡに関する。
産能を有する放線菌由来のプラスミドＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】放線菌は、抗生物質や様々な生理活性物
質に代表されるような二次代謝産物を生産する能力を持
ち、その遺伝子的背景の解明は、工業生産の開発におい
て非常に重要である。それは、従来より行われてきた菌
株改良に理論的根拠を与え、より合理的な戦略を提供す
るからである。具体的には、抗生物質の代謝経路に関与
する遺伝子を人為的に操作することにより、最終産物の
構造を積極的に改変したり、またその生産に関与する酵
素の遺伝子発現の制御を変更することにより、生産の向
上も望める。一般的に、放線菌はしばしば遺伝学的に不
安定なことがあり、形質を支配する遺伝子を組換え操作
により安定な系に移して保存解析も可能である。このこ
とから、放線菌を宿主にした遺伝子組換え系で必須であ
るプラスミドベクターの開発が望まれている。しかし、
放線菌のプラスミドベクター系は、主に特定の菌株での
みでの開発が行われている。一方、放線菌の大きな特徴
は、菌種によりその性質が非常にことなることから、現
在汎用されている大腸菌の場合と異なって、スタンダー
ドの宿主−ベクター系では不十分であり、個々の研究対
象の菌種に合った宿主−ベクター系の開発が必要であ
る。現在までに、抗菌食品添加剤として、急速に波及し
ているε−ポリリジンは、特定の放線菌が産生している
リジンのポリマー誘導体であり、他の一般的保存剤と知
られているソルビン酸やグリシン等に比べ、その価格は
１０倍以上高価である。ε−ポリリジンの生産性を上げ
るため古典的変異剤処理により、高生産性菌株の分離を
試みて来たが、ε−ポリリジンの生産価格を飛躍的に押
し下げるまでには至っていない。そこで、遺伝子組換え
手法の導入による生産性向上が必須であると考えられ、
そのためには、ε−ポリリジンの生産菌での使用可能な
ベクター系の開発が急務である。しかし、今日まで、ε
−ポリリジンを生産する放線菌を宿主としたプラスミド
ベクターに関する研究開発は全く行われていない。
質に代表されるような二次代謝産物を生産する能力を持
ち、その遺伝子的背景の解明は、工業生産の開発におい
て非常に重要である。それは、従来より行われてきた菌
株改良に理論的根拠を与え、より合理的な戦略を提供す
るからである。具体的には、抗生物質の代謝経路に関与
する遺伝子を人為的に操作することにより、最終産物の
構造を積極的に改変したり、またその生産に関与する酵
素の遺伝子発現の制御を変更することにより、生産の向
上も望める。一般的に、放線菌はしばしば遺伝学的に不
安定なことがあり、形質を支配する遺伝子を組換え操作
により安定な系に移して保存解析も可能である。このこ
とから、放線菌を宿主にした遺伝子組換え系で必須であ
るプラスミドベクターの開発が望まれている。しかし、
放線菌のプラスミドベクター系は、主に特定の菌株での
みでの開発が行われている。一方、放線菌の大きな特徴
は、菌種によりその性質が非常にことなることから、現
在汎用されている大腸菌の場合と異なって、スタンダー
ドの宿主−ベクター系では不十分であり、個々の研究対
象の菌種に合った宿主−ベクター系の開発が必要であ
る。現在までに、抗菌食品添加剤として、急速に波及し
ているε−ポリリジンは、特定の放線菌が産生している
リジンのポリマー誘導体であり、他の一般的保存剤と知
られているソルビン酸やグリシン等に比べ、その価格は
１０倍以上高価である。ε−ポリリジンの生産性を上げ
るため古典的変異剤処理により、高生産性菌株の分離を
試みて来たが、ε−ポリリジンの生産価格を飛躍的に押
し下げるまでには至っていない。そこで、遺伝子組換え
手法の導入による生産性向上が必須であると考えられ、
そのためには、ε−ポリリジンの生産菌での使用可能な
ベクター系の開発が急務である。しかし、今日まで、ε
−ポリリジンを生産する放線菌を宿主としたプラスミド
ベクターに関する研究開発は全く行われていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者ら
は、現在工業的に製造に使用しているε−ポリリジンの
生産能を有する放線菌株ストレプトマイセス属でのさら
なる生産性向上のために、該菌株での宿主−プラスミド
ベクター系に使用可能な新規プラスミドの単離およびそ
の利用を可能とすべく鋭意研究を行った。その結果、ε
−ポリリジンを生産能を有する放線菌ストレプトマイセ
ス アルブラスの細胞内で複製可能なプラスミドを見い
出し、本発明に至った。以上の記述から明らかなよう
に、本発明の目的は、下記（１）〜（４）に示されるポ
リリジン製造用のプラスミドを提供することである。本
発明の目的は、また、下記（５）に示される形質転換体
とこれを用いたε−ポリリジンの生産能増強方法を提供
することである。
は、現在工業的に製造に使用しているε−ポリリジンの
生産能を有する放線菌株ストレプトマイセス属でのさら
なる生産性向上のために、該菌株での宿主−プラスミド
ベクター系に使用可能な新規プラスミドの単離およびそ
の利用を可能とすべく鋭意研究を行った。その結果、ε
−ポリリジンを生産能を有する放線菌ストレプトマイセ
ス アルブラスの細胞内で複製可能なプラスミドを見い
出し、本発明に至った。以上の記述から明らかなよう
に、本発明の目的は、下記（１）〜（４）に示されるポ
リリジン製造用のプラスミドを提供することである。本
発明の目的は、また、下記（５）に示される形質転換体
とこれを用いたε−ポリリジンの生産能増強方法を提供
することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は下記
（１）〜（５）の構成を有する。 （１）全長約３７ｋｂの塩基対からなり、図１に示され
る制限酵素地図で示されることを特徴とするプラスミド
ｐＮＯ３３。 （２）配列番号１で示される塩基配列の少なくとも一部
を有することを特徴とするプラスミドｐＮＯ３３。 （３）配列番号２または配列番号３で示されるアミノ酸
配列の少なくとも一部を有するタンパク質またはそれと
実質的に同等の機能を有するタンパク質をコードするプ
ラスミドｐＮＯ３３。 （４）ε−ポリリジンの生産能を有する放線菌内で安定
的に複製可能な前記（１）〜（３）に記載のプラスミド
ｐＮＯ３３。 （５）ε−ポリリジンの生産向上に関与するタンパク質
あるいはペプチド遺伝子を挿入された前記（１）〜
（３）に記載のプラスミドｐＮＯ３３。
（１）〜（５）の構成を有する。 （１）全長約３７ｋｂの塩基対からなり、図１に示され
る制限酵素地図で示されることを特徴とするプラスミド
ｐＮＯ３３。 （２）配列番号１で示される塩基配列の少なくとも一部
を有することを特徴とするプラスミドｐＮＯ３３。 （３）配列番号２または配列番号３で示されるアミノ酸
配列の少なくとも一部を有するタンパク質またはそれと
実質的に同等の機能を有するタンパク質をコードするプ
ラスミドｐＮＯ３３。 （４）ε−ポリリジンの生産能を有する放線菌内で安定
的に複製可能な前記（１）〜（３）に記載のプラスミド
ｐＮＯ３３。 （５）ε−ポリリジンの生産向上に関与するタンパク質
あるいはペプチド遺伝子を挿入された前記（１）〜
（３）に記載のプラスミドｐＮＯ３３。
【０００５】
【発明の実施の形態】以下、さらに詳細に本発明を説明
する。本発明のプラスミドｐＮ０３３は、ストレプトマ
イセス属に属するε−ポリリジンの生産菌から得られる
環状プラスミドである。具体的には、本発明のプラスミ
ドは、例えばε−ポリリジンの生産能を有するストレプ
トマイセス アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ａｌｂｕｌｕｓ）ＩＦＯ１４１４７から得ることがで
き、全長約３７ｋｂよりなり、且つ表１、表２及び図１
に示す制限酵素をもつ複製可能な環状プラスミドであ
る。
する。本発明のプラスミドｐＮ０３３は、ストレプトマ
イセス属に属するε−ポリリジンの生産菌から得られる
環状プラスミドである。具体的には、本発明のプラスミ
ドは、例えばε−ポリリジンの生産能を有するストレプ
トマイセス アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ａｌｂｕｌｕｓ）ＩＦＯ１４１４７から得ることがで
き、全長約３７ｋｂよりなり、且つ表１、表２及び図１
に示す制限酵素をもつ複製可能な環状プラスミドであ
る。
【０００６】
【表１】
【０００７】図１において、決定された制限酵素の位置
は、制限酵素HindIII の位置を起点として、時計周りの
距離は表２のとおりである。
は、制限酵素HindIII の位置を起点として、時計周りの
距離は表２のとおりである。
【０００８】
【表２】
【０００９】明らかに、本発明のプラスミドｐＮ０３３
は各種の制限酵素による切断部位を有しており、この事
実は、本プラスミドを修飾して多くの有用なベクターを
開発することを示している。また、このプラスミドある
いはその誘導プラスミドに目的とする遺伝子等、たとえ
ばε−ポリリジンの生産酵素系を組み込み、これを適当
な細菌に導入してその宿主を形質転換することも可能で
ある。
は各種の制限酵素による切断部位を有しており、この事
実は、本プラスミドを修飾して多くの有用なベクターを
開発することを示している。また、このプラスミドある
いはその誘導プラスミドに目的とする遺伝子等、たとえ
ばε−ポリリジンの生産酵素系を組み込み、これを適当
な細菌に導入してその宿主を形質転換することも可能で
ある。
【００１０】さらに、本発明により得られたプラスミド
が新規性があるかどうか判断するには、本発明のプラス
ミドｐＮ０３３部分塩基配列を決定し、既知のストレプ
トマイセス属由来のプラスミドと比較することにより、
容易に異なることが判断できる。そこで、本発明者ら
は、プラスミドｐＮ０３３由来のＤＮＡ断片を適当なプ
ラスミドにサブクローニング後、その塩基配列を決定
し、塩基配列１に示すように決定した。得られた塩基配
列１を用いて、東京大学医科学研究所ヒトゲノム解析セ
ンターおよび米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆ
ｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔ
ｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のデーターベース保有のすべでの塩
基配列に対してホモロジー検索を行った結果、塩基配列
が同一のものは検出できなかった。また、細菌由来の塩
基配列の相同性が４０％以上でかつプラスミド配列由来
の塩基配列も全く検出できなかった。すなわち、プラス
ミドｐＮ０３３部分塩基配列は、現在まで全く知られて
いない塩基配列であり、ストレプトマイセス属由来プラ
スミドｐＮ０３３は新規のプラスミドＤＮＡであること
が明らかとなった。
が新規性があるかどうか判断するには、本発明のプラス
ミドｐＮ０３３部分塩基配列を決定し、既知のストレプ
トマイセス属由来のプラスミドと比較することにより、
容易に異なることが判断できる。そこで、本発明者ら
は、プラスミドｐＮ０３３由来のＤＮＡ断片を適当なプ
ラスミドにサブクローニング後、その塩基配列を決定
し、塩基配列１に示すように決定した。得られた塩基配
列１を用いて、東京大学医科学研究所ヒトゲノム解析セ
ンターおよび米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆ
ｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔ
ｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のデーターベース保有のすべでの塩
基配列に対してホモロジー検索を行った結果、塩基配列
が同一のものは検出できなかった。また、細菌由来の塩
基配列の相同性が４０％以上でかつプラスミド配列由来
の塩基配列も全く検出できなかった。すなわち、プラス
ミドｐＮ０３３部分塩基配列は、現在まで全く知られて
いない塩基配列であり、ストレプトマイセス属由来プラ
スミドｐＮ０３３は新規のプラスミドＤＮＡであること
が明らかとなった。
【００１１】さらに、決定した塩基配列１内に、機能遺
伝子としての翻訳可能領域が存在するかどうか調べた結
果、配列２、配列３に示される翻訳可能領域が存在する
ことが明らかとなった。アミノ酸配列２は、塩基配列１
の１５７６番から１８０３番に相当する翻訳可能領域
で、７６アミノ酸残基より構成されるタンパク質様ポリ
ぺチドである。アミノ酸配列３は、塩基配列１の６４１
番から１５７６番に相当する翻訳可能領域で、３１２ア
ミノ酸残基より構成されるポリぺチド様物質である。こ
のことは、本プラスミドｐＮ０３３は、他の翻訳可能遺
伝子を組み込むことが可能であることの証明である。す
なわち、目的とする有用遺伝子，たとえばε−ポリリジ
ンの生産酵素系を組み込み、これを適当な宿主を形質転
換することにより、ε−ポリリジンの生産の増強が期待
できる。
伝子としての翻訳可能領域が存在するかどうか調べた結
果、配列２、配列３に示される翻訳可能領域が存在する
ことが明らかとなった。アミノ酸配列２は、塩基配列１
の１５７６番から１８０３番に相当する翻訳可能領域
で、７６アミノ酸残基より構成されるタンパク質様ポリ
ぺチドである。アミノ酸配列３は、塩基配列１の６４１
番から１５７６番に相当する翻訳可能領域で、３１２ア
ミノ酸残基より構成されるポリぺチド様物質である。こ
のことは、本プラスミドｐＮ０３３は、他の翻訳可能遺
伝子を組み込むことが可能であることの証明である。す
なわち、目的とする有用遺伝子，たとえばε−ポリリジ
ンの生産酵素系を組み込み、これを適当な宿主を形質転
換することにより、ε−ポリリジンの生産の増強が期待
できる。
【００１２】一方、その配列番号２および配列番号３を
用いて同様にゲノムセンターのデーターベースにホモロ
ジー検索を行った結果、特に配列番号２に関して、スト
レプトマイセス属セリカラー種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）の染色体に存在し、抗生
物質アクチノホヂン（Ａｃｔｉｎｏｒｈｏｄｉｎ）の産
生調節に関与する遺伝子ＯＲＦ−Ｄ（７５アミノ酸残
基）と約３６％の相同性が見い出された。このことは、
本発明プラスミドｐＮ０３３は、抗生物質等の二次代謝
産物に関与する調節する遺伝子として存在する可能性が
あり、産業上利用できる。
用いて同様にゲノムセンターのデーターベースにホモロ
ジー検索を行った結果、特に配列番号２に関して、スト
レプトマイセス属セリカラー種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）の染色体に存在し、抗生
物質アクチノホヂン（Ａｃｔｉｎｏｒｈｏｄｉｎ）の産
生調節に関与する遺伝子ＯＲＦ−Ｄ（７５アミノ酸残
基）と約３６％の相同性が見い出された。このことは、
本発明プラスミドｐＮ０３３は、抗生物質等の二次代謝
産物に関与する調節する遺伝子として存在する可能性が
あり、産業上利用できる。
【００１３】
【実施例】次に本発明の実施例を示すが、本発明はこれ
らの実施例に何ら限定されるものではない。
らの実施例に何ら限定されるものではない。
【００１４】実施例１ ストレプトマイセス アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ａｌｂｕｌｕｓ）ＩＦＯ１４１４７からのプラ
スミドｐＮＯ３３の単離。 ストレプトマイセス アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ａｌｂｕｌｕｓ）ＩＦＯ１４１４７の一白金耳
の灰色胞子を、５００ｍｌを坂口フラスコにいれた液体
培地（たとえば、バクトトリプトン１０ｇ、イーストエ
クストラクト５ｇ、食塩５ｇを１Ｌの水道水に溶解後、
ｐＨを７．３に調整した培地）５０ｍｌに接種し、振盪
速度１４０ｒｐｍ、３０℃で１６時間培養した。培養液
から菌体を遠心５０００ｇ集菌し、ＴＥ緩衝液（２５ｍ
Ｍトリス（ヒドロキシ）アミノメタン（以下トリス）、
２５ｍＭ ＥＤＴＡ：ｐＨ８．０）で洗浄後、溶菌液
（０．３Ｍ ショ糖、２５ｍＭトリス、２５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、２ｍｇ／ｍｌリゾチーム）で２０ｍｌに懸濁し、
４℃で５分間放置し、２％ラウリル硫酸ナトリウムと
０．３Ｎ水酸化ナトリウムからなる溶液１０ｍｌを添加
し、ゆっくり混合後、さらに４℃で５分放置した。この
溶菌液に１５ｍｌの５Ｍ酢酸アンモニウムを中和混合
し、４℃で１０分放置した後、１０分間の１２０００ｇ
での高速遠心分離し、上清を分取した。この上清に等量
のＴＥ緩衝液飽和のフェノールを加え、５分間激しく混
合し、１０分間の１２０００ｇでの高速遠心分離後、水
溶性画分を分取した。この水溶性画分に等量のクロロホ
ルムを添加後、５分間激しく混合し、１０分間の１２０
００ｇでの高速遠心分離後、水溶性画分を分取した。分
取水溶性画分に、０．１倍容の３Ｍ酢酸ナトリウムと２
倍容のエタノールを添加し、−２０℃に３０分放置後、
析出した白色沈殿物（核酸画分）を１２０００ｇでの高
速遠心により回収し、適当量のＴＥ緩衝液に溶解した。
リボ核酸除去のため、本核酸画分溶液に、最終濃度が５
０ｕｇ／ｍｌになるように、リボ核酸分解酵素を加え、
３７℃で３０分反応し、さらに、０．６倍容の２０％ポ
リエチレングリコール／５Ｍ食塩混合液を加え、４℃で
一時間放置した。生成した白色沈殿物を高速遠心により
回収し、適当量のＴＥ緩衝液に溶解し、画分にプラスミ
ド画分を得た。これを０．７％アガロースゲル電気泳動
（１００ボルト、２０分）に供し、ゲルを臭化エチジュ
ウムで染色することにより高分子核酸の存在を確認し
た。さらに、この高分子核酸画分を制限酵素ＨｉｎｄII
I （日本ジーン社製）で消化後、バイオラッド社製のパ
ルスフィールド電気泳動装置（泳動条件は、バイオラッ
ド社製により提供されている条件、２００ボルト、１６
時間）に供し、酵母染色体を分子量マーカーとして約３
７ｋｂｐのプラスミドｐＮ０３３由来のＤＮＡ断片を確
認した。
ｃｅｓ ａｌｂｕｌｕｓ）ＩＦＯ１４１４７からのプラ
スミドｐＮＯ３３の単離。 ストレプトマイセス アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ａｌｂｕｌｕｓ）ＩＦＯ１４１４７の一白金耳
の灰色胞子を、５００ｍｌを坂口フラスコにいれた液体
培地（たとえば、バクトトリプトン１０ｇ、イーストエ
クストラクト５ｇ、食塩５ｇを１Ｌの水道水に溶解後、
ｐＨを７．３に調整した培地）５０ｍｌに接種し、振盪
速度１４０ｒｐｍ、３０℃で１６時間培養した。培養液
から菌体を遠心５０００ｇ集菌し、ＴＥ緩衝液（２５ｍ
Ｍトリス（ヒドロキシ）アミノメタン（以下トリス）、
２５ｍＭ ＥＤＴＡ：ｐＨ８．０）で洗浄後、溶菌液
（０．３Ｍ ショ糖、２５ｍＭトリス、２５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、２ｍｇ／ｍｌリゾチーム）で２０ｍｌに懸濁し、
４℃で５分間放置し、２％ラウリル硫酸ナトリウムと
０．３Ｎ水酸化ナトリウムからなる溶液１０ｍｌを添加
し、ゆっくり混合後、さらに４℃で５分放置した。この
溶菌液に１５ｍｌの５Ｍ酢酸アンモニウムを中和混合
し、４℃で１０分放置した後、１０分間の１２０００ｇ
での高速遠心分離し、上清を分取した。この上清に等量
のＴＥ緩衝液飽和のフェノールを加え、５分間激しく混
合し、１０分間の１２０００ｇでの高速遠心分離後、水
溶性画分を分取した。この水溶性画分に等量のクロロホ
ルムを添加後、５分間激しく混合し、１０分間の１２０
００ｇでの高速遠心分離後、水溶性画分を分取した。分
取水溶性画分に、０．１倍容の３Ｍ酢酸ナトリウムと２
倍容のエタノールを添加し、−２０℃に３０分放置後、
析出した白色沈殿物（核酸画分）を１２０００ｇでの高
速遠心により回収し、適当量のＴＥ緩衝液に溶解した。
リボ核酸除去のため、本核酸画分溶液に、最終濃度が５
０ｕｇ／ｍｌになるように、リボ核酸分解酵素を加え、
３７℃で３０分反応し、さらに、０．６倍容の２０％ポ
リエチレングリコール／５Ｍ食塩混合液を加え、４℃で
一時間放置した。生成した白色沈殿物を高速遠心により
回収し、適当量のＴＥ緩衝液に溶解し、画分にプラスミ
ド画分を得た。これを０．７％アガロースゲル電気泳動
（１００ボルト、２０分）に供し、ゲルを臭化エチジュ
ウムで染色することにより高分子核酸の存在を確認し
た。さらに、この高分子核酸画分を制限酵素ＨｉｎｄII
I （日本ジーン社製）で消化後、バイオラッド社製のパ
ルスフィールド電気泳動装置（泳動条件は、バイオラッ
ド社製により提供されている条件、２００ボルト、１６
時間）に供し、酵母染色体を分子量マーカーとして約３
７ｋｂｐのプラスミドｐＮ０３３由来のＤＮＡ断片を確
認した。
【００１５】実施例２ プラスミドｐＮ０３３の詳細な制限酵素地図の作製。 実施例１で取得したしたプラスミドｐＮＯ３３の詳細な
制限酵素地図作製は、市販の各種制限酵素（日本ジーン
社製あるいは宝酒造社製）によってｐＮ０３３を単一消
化、二重消化、あるいは三重消化して得られたＤＮＡ断
片を０．７％のアガロースゲル電気泳動あるいはバイオ
ラッド社製のパルスフィールド電気泳動に供し、その移
動度から分子量を求めた。酵素の反応条件は、供給者に
よって決められた条件に従った。また、分子量は、ラム
ダファージＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIII で消化して得
られた分子量マーカー（日本ジーン社製）および酵母染
色体を分子量マーカー（バイオラッド社製）の標準移動
度をもとに決定した。これらの結果から、前記載の図１
であるプラスミドｐＮＯ３３の詳細な制限酵素地図を決
定した。
制限酵素地図作製は、市販の各種制限酵素（日本ジーン
社製あるいは宝酒造社製）によってｐＮ０３３を単一消
化、二重消化、あるいは三重消化して得られたＤＮＡ断
片を０．７％のアガロースゲル電気泳動あるいはバイオ
ラッド社製のパルスフィールド電気泳動に供し、その移
動度から分子量を求めた。酵素の反応条件は、供給者に
よって決められた条件に従った。また、分子量は、ラム
ダファージＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIII で消化して得
られた分子量マーカー（日本ジーン社製）および酵母染
色体を分子量マーカー（バイオラッド社製）の標準移動
度をもとに決定した。これらの結果から、前記載の図１
であるプラスミドｐＮＯ３３の詳細な制限酵素地図を決
定した。
【００１６】実施例３ プラスミドｐＮＯ３３の塩基配列の決定。 実施例１で取得したプラスミドｐＮＯ３３の塩基配列を
決定するため、プラスミドｐＮＯ３３ＤＮＡを制限酵
素, ＥｃｏＲＩまたはＳｍａＩで消化後、その断片を大
腸菌で複製可能な公知プラスミドベクターｐＧｒｅｅｎ
１９（Ｉｎｏｕｙｅら、Ｇｅｎｅ ｖｏｌ．１８９、ｐ
ｐ１５９−１６２：１９９７）あるいはｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ ＳＫ＋（ストラッテジーン社製）のＥｃｏＲ
ＩまたはＳｍａＩ部位に、常法によりサブクローン化を
行った。挿入断片の確認は、実施例１記載のプラスミド
単離法に基づきプラスミド分離し、ＥｃｏＲＩまたはＳ
ｍａＩで消化後、０．７％のアガロースゲル電気泳動法
により確認した。挿入断片の塩基配列は、ダイターミネ
ーターサイクルシークエンシング法を用い、アプライド
バイオシステム社の蛍光シークセンサー（ＡＢＩ３７
３）にて決定した。前記載の決定塩基配列番号１に基づ
き、宝酒造社製のＤＮＡＳＩＳ Ｖｅｒ．３．６遺伝子
解析ソフトウエアを使用することにより、翻訳可能領域
を検索し、前記載のアミノ酸配列番号２および前記載の
アミノ酸配列番号３を見い出した。
決定するため、プラスミドｐＮＯ３３ＤＮＡを制限酵
素, ＥｃｏＲＩまたはＳｍａＩで消化後、その断片を大
腸菌で複製可能な公知プラスミドベクターｐＧｒｅｅｎ
１９（Ｉｎｏｕｙｅら、Ｇｅｎｅ ｖｏｌ．１８９、ｐ
ｐ１５９−１６２：１９９７）あるいはｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ ＳＫ＋（ストラッテジーン社製）のＥｃｏＲ
ＩまたはＳｍａＩ部位に、常法によりサブクローン化を
行った。挿入断片の確認は、実施例１記載のプラスミド
単離法に基づきプラスミド分離し、ＥｃｏＲＩまたはＳ
ｍａＩで消化後、０．７％のアガロースゲル電気泳動法
により確認した。挿入断片の塩基配列は、ダイターミネ
ーターサイクルシークエンシング法を用い、アプライド
バイオシステム社の蛍光シークセンサー（ＡＢＩ３７
３）にて決定した。前記載の決定塩基配列番号１に基づ
き、宝酒造社製のＤＮＡＳＩＳ Ｖｅｒ．３．６遺伝子
解析ソフトウエアを使用することにより、翻訳可能領域
を検索し、前記載のアミノ酸配列番号２および前記載の
アミノ酸配列番号３を見い出した。
【００１７】実施例４ 配列番号１−３に関する遺伝子データーベース相同性の
検索。 塩基配列番号１−３に基づき、世界規模で構築されてい
る全ての遺伝子データーベースに対して、その相同性が
あるかどうか、インターネット経由でゲノムネットホー
ムページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａ
ｄ．ｊｐ／あるいはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．
ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で、解析ソフトはＦＡＳＴ
Ａ、ＢＬＡＳＴ等を用いて検索を行った。塩基配列番号
１は、全てのエントリー遺伝子配列に対して行い、アミ
ノ酸配列番号２、３は、エントリーアミノ酸配列および
エントリー遺伝子配列より翻訳されるアミノ酸配列に対
して行った。その結果、塩基配列番号１と著しく相同性
のある遺伝子配列は検出できなかった。一方、アミノ酸
配列番号２、３についても、顕著な相同性は見い出され
なかった。しかし、配列番号２に関しては、ストレプト
マイセス属セリカラー種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）の染色体に存在し、抗生物質ア
クチノホヂン（Ａｃｔｉｎｏｒｈｏｄｉｎ）の生産に関
与する遺伝子ＯＲＦ−Ｄと約３６％の相同性が見い出さ
れた。このことは、本発明プラスミド上に、抗生物質等
の二次代謝産物遺伝子が存在することを示唆し、産業上
利用できることを示している。
検索。 塩基配列番号１−３に基づき、世界規模で構築されてい
る全ての遺伝子データーベースに対して、その相同性が
あるかどうか、インターネット経由でゲノムネットホー
ムページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａ
ｄ．ｊｐ／あるいはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．
ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で、解析ソフトはＦＡＳＴ
Ａ、ＢＬＡＳＴ等を用いて検索を行った。塩基配列番号
１は、全てのエントリー遺伝子配列に対して行い、アミ
ノ酸配列番号２、３は、エントリーアミノ酸配列および
エントリー遺伝子配列より翻訳されるアミノ酸配列に対
して行った。その結果、塩基配列番号１と著しく相同性
のある遺伝子配列は検出できなかった。一方、アミノ酸
配列番号２、３についても、顕著な相同性は見い出され
なかった。しかし、配列番号２に関しては、ストレプト
マイセス属セリカラー種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）の染色体に存在し、抗生物質ア
クチノホヂン（Ａｃｔｉｎｏｒｈｏｄｉｎ）の生産に関
与する遺伝子ＯＲＦ−Ｄと約３６％の相同性が見い出さ
れた。このことは、本発明プラスミド上に、抗生物質等
の二次代謝産物遺伝子が存在することを示唆し、産業上
利用できることを示している。
【００１８】
【発明の効果】本発明のプラスミドは種々の制限酵素に
よる開裂部位を有しており、本プラスミドを修飾し、ス
トレプトマイセス属細菌に使用可能な、多くの有用なベ
クターを開発することができる。また、このプラスミド
に有用遺伝子を組込み、ストレプトマイセス属細菌に導
入して宿主を形質転換させ、有用物質の生産が可能とな
る。
よる開裂部位を有しており、本プラスミドを修飾し、ス
トレプトマイセス属細菌に使用可能な、多くの有用なベ
クターを開発することができる。また、このプラスミド
に有用遺伝子を組込み、ストレプトマイセス属細菌に導
入して宿主を形質転換させ、有用物質の生産が可能とな
る。
【配列表】
【図１】本発明のプラスミドｐＮ０３３の制限酵素地図
を示す。黒色部分は、塩基配列１の決定部分である。
を示す。黒色部分は、塩基配列１の決定部分である。
Claims (6)
- 【請求項１】 ストレプトマイセス属に属する放線菌由
来の環状プラスミドであって分子量が約３７Ｋｂｐであ
り、図１に示される制限酵素認識部位を有するプラスミ
ドｐＮ０３３。 - 【請求項２】 ストレプトマイセス属に属する放線菌由
来の環状プラスミドであって分子量が約３７Ｋｂｐであ
り、配列番号１で示される塩基配列を含むプラスミドｐ
Ｎ０３３。 - 【請求項３】 ストレプトマイセス属に属する放線菌由
来の環状プラスミドであって分子量が約３７Ｋｂｐであ
り、配列番号２または配列番号３で示されるアミノ酸配
列を有するタンパク質または該タンパク質と実質的に同
等の機能を有するタンパク質をコードするプラスミドｐ
Ｎ０３３。 - 【請求項４】 ストレプトマイセス属に属する放線菌
が、ε−ポリリジン生産能を有する請求項１、２または
３に記載のプラスミドｐＮ０３３。 - 【請求項５】 ε−ポリリジンを生産能を有する微生物
が、ストレプトマイセス アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｌｕｓ）ＩＦＯ１４１４７である
請求項１、２または３に記載のプラスミドｐＮ０３３。 - 【請求項６】 環状プラスミドｐＮ０３３由来の全部あ
るいは一部塩基配列断片を用いて構築したプラスミド。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03272999A JP4258874B2 (ja) | 1999-02-10 | 1999-02-10 | 放線菌由来の環状プラスミドｄｎａ |
| PCT/JP2000/000708 WO2000047753A1 (fr) | 1999-02-10 | 2000-02-09 | Adn plasmidique cyclique provenant d'actinomycetes |
| EP00902874A EP1158053A4 (en) | 1999-02-10 | 2000-02-09 | RING-SHAPED PLASMID DNA FROM ACTINOMYCETES |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03272999A JP4258874B2 (ja) | 1999-02-10 | 1999-02-10 | 放線菌由来の環状プラスミドｄｎａ |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008325769A Division JP2009072210A (ja) | 2008-12-22 | 2008-12-22 | 放線菌由来の環状プラスミドｄｎａ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000228981A true JP2000228981A (ja) | 2000-08-22 |
| JP4258874B2 JP4258874B2 (ja) | 2009-04-30 |
Family
ID=12366941
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03272999A Expired - Fee Related JP4258874B2 (ja) | 1999-02-10 | 1999-02-10 | 放線菌由来の環状プラスミドｄｎａ |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1158053A4 (ja) |
| JP (1) | JP4258874B2 (ja) |
| WO (1) | WO2000047753A1 (ja) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3117131A1 (de) * | 1981-04-30 | 1982-11-25 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | "plasmid psg 2 und verfahren zu seiner gewinnung" |
| JPS59143589A (ja) * | 1983-02-03 | 1984-08-17 | Sanraku Inc | プラスミドｐＯＡ１５ |
| EP0158872B1 (de) * | 1984-03-31 | 1989-01-18 | Hoechst Aktiengesellschaft | Das Streptomyceten-Plasmid pSG5, Verfahren zu seiner Gewinnung und seine Verwendung |
| JPS61124386A (ja) * | 1984-11-16 | 1986-06-12 | Tanabe Seiyaku Co Ltd | 新規プラスミド及びその製法 |
| DE3785266T2 (de) * | 1986-08-19 | 1993-08-19 | Chisso Corp | Stamm zur massenproduktion von epsilon-poly-l-lysin, methode, um diesen stamm zu gebrauchen, und methode zur herstellung von epsilon-poly-l-lysin. |
-
1999
- 1999-02-10 JP JP03272999A patent/JP4258874B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-02-09 EP EP00902874A patent/EP1158053A4/en not_active Withdrawn
- 2000-02-09 WO PCT/JP2000/000708 patent/WO2000047753A1/ja not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1158053A4 (en) | 2002-04-17 |
| WO2000047753A1 (fr) | 2000-08-17 |
| JP4258874B2 (ja) | 2009-04-30 |
| EP1158053A1 (en) | 2001-11-28 |
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