JP2009072210A - 放線菌由来の環状プラスミドdna - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 ストレプトマイセス アルブラスIFO14147から核酸画分を常法により回収し、得られたプラスミド画分を制限酵素HindIII 消化してプラスミドpNO33由来の断片を確認。
【効果】 本発明の新規環状プラスミドは、ε−ポリリジン生産放線菌の育種改良および該菌を宿主とした各種有用遺伝子の発現による有用物質を生産することが可能である。
【選択図】なし
Description
一般的に、放線菌はしばしば遺伝学的に不安定なことがあり、形質を支配する遺伝子を組換え操作により安定な系に移して保存解析も可能である。このことから、放線菌を宿主にした遺伝子組換え系で必須であるプラスミドベクターの開発が望まれている。しかし、放線菌のプラスミドベクター系は、主に特定の菌株でのみでの開発が行われている。一方、放線菌の大きな特徴は、菌種によりその性質が非常にことなることから、現在汎用されている大腸菌の場合と異なって、スタンダードの宿主−ベクター系では不十分であり、個々の研究対象の菌種に合った宿主−ベクター系の開発が必要である。
現在までに、抗菌食品添加剤として、急速に波及しているε−ポリリジンは、特定の放線菌が産生しているリジンのポリマー誘導体であり、他の一般的保存剤と知られているソルビン酸やグリシン等に比べ、その価格は10倍以上高価である。ε−ポリリジンの生産性を上げるため古典的変異剤処理により、高生産性菌株の分離を試みて来たが、ε−ポリリジンの生産価格を飛躍的に押し下げるまでには至っていない。そこで、遺伝子組換え手法の導入による生産性向上が必須であると考えられ、そのためには、ε−ポリリジンの生産菌での使用可能なベクター系の開発が急務である。しかし、今日まで、ε−ポリリジンを生産する放線菌を宿主としたプラスミドベクターに関する研究開発は全く行われていない。
その結果、ε−ポリリジンを生産能を有する放線菌ストレプトマイセス アルブラスの細胞内で複製可能なプラスミドを見い出し、本発明に至った。
以上の記述から明らかなように、本発明の目的は、下記(1)〜(4)に示されるポリリジン製造用のプラスミドを提供することである。本発明の目的は、また、下記(5)に示される形質転換体とこれを用いたε−ポリリジンの生産能増強方法を提供することである。
(1)全長約37kbの塩基対からなり、図1に示される制限酵素地図で示されることを特徴とするプラスミドpNO33。
(2)配列番号1で示される塩基配列の少なくとも一部を有することを特徴とするプラスミドpNO33。
(3)配列番号2または配列番号3で示されるアミノ酸配列の少なくとも一部を有するタンパク質またはそれと実質的に同等の機能を有するタンパク質をコードするプラスミドpNO33。
(4)ε−ポリリジンの生産能を有する放線菌内で安定的に複製可能な前記(1)〜(3)に記載のプラスミドpNO33。
(5)ε−ポリリジンの生産向上に関与するタンパク質あるいはペプチド遺伝子を挿入された前記(1)〜(3)に記載のプラスミドpNO33。
具体的には、本発明のプラスミドは、例えばε−ポリリジンの生産能を有するストレプトマイセス アルブラス(Streptomyces albulus)IFO14147から得ることができ、全長約37kbよりなり、且つ表1、表2及び図1に示す制限酵素をもつ複製可能な環状プラスミドである。
このことは、本プラスミドpNO33は、他の翻訳可能遺伝子を組み込むことが可能であることの証明である。すなわち、目的とする有用遺伝子,たとえばε−ポリリジンの生産酵素系を組み込み、これを適当な宿主を形質転換することにより、ε−ポリリジンの生産の増強が期待できる。
ストレプトマイセス アルブラス(Streptomyces albulus)IFO14147からのプラスミドpNO33の単離。
ストレプトマイセス アルブラス(Streptomyces albulus)IFO14147の一白金耳の灰色胞子を、500mlを坂口フラスコにいれた液体培地(たとえば、バクトトリプトン10g、イーストエクストラクト5g、食塩5gを1Lの水道水に溶解後、pHを7.3に調整した培地)50mlに接種し、振盪速度140rpm、30℃で16時間培養した。
培養液から菌体を遠心5000g集菌し、TE緩衝液(25mMトリス(ヒドロキシ)アミノメタン(以下トリス)、25mM EDTA:pH8.0)で洗浄後、溶菌液(0.3M ショ糖、25mMトリス、25mM EDTA、2mg/mlリゾチーム)で20mlに懸濁し、4℃で5分間放置し、2%ラウリル硫酸ナトリウムと0.3N水酸化ナトリウムからなる溶液10mlを添加し、ゆっくり混合後、さらに4℃で5分放置した。
この溶菌液に15mlの5M酢酸アンモニウムを中和混合し、4℃で10分放置した後、10分間の12000gでの高速遠心分離し、上清を分取した。この上清に等量のTE緩衝液飽和のフェノールを加え、5分間激しく混合し、10分間の12000gでの高速遠心分離後、水溶性画分を分取した。この水溶性画分に等量のクロロホルムを添加後、5分間激しく混合し、10分間の12000gでの高速遠心分離後、水溶性画分を分取した。
分取水溶性画分に、0.1倍容の3M酢酸ナトリウムと2倍容のエタノールを添加し、−20℃に30分放置後、析出した白色沈殿物(核酸画分)を12000gでの高速遠心により回収し、適当量のTE緩衝液に溶解した。リボ核酸除去のため、本核酸画分溶液に、最終濃度が50ug/mlになるように、リボ核酸分解酵素を加え、37℃で30分反応し、さらに、0.6倍容の20%ポリエチレングリコール/5M食塩混合液を加え、4℃で一時間放置した。
生成した白色沈殿物を高速遠心により回収し、適当量のTE緩衝液に溶解し、画分にプラスミド画分を得た。これを0.7%アガロースゲル電気泳動(100ボルト、20分)に供し、ゲルを臭化エチジュウムで染色することにより高分子核酸の存在を確認した。さらに、この高分子核酸画分を制限酵素HindIII (日本ジーン社製)で消化後、バイオラッド社製のパルスフィールド電気泳動装置(泳動条件は、バイオラッド社製により提供されている条件、200ボルト、16時間)に供し、酵母染色体を分子量マーカーとして約37kbpのプラスミドpNO33由来のDNA断片を確認した。
プラスミドpNO33の詳細な制限酵素地図の作製。
実施例1で取得したプラスミドpNO33の詳細な制限酵素地図作製は、市販の各種制限酵素(日本ジーン社製あるいは宝酒造社製)によってpNO33を単一消化、二重消化、あるいは三重消化して得られたDNA断片を0.7%のアガロースゲル電気泳動あるいはバイオラッド社製のパルスフィールド電気泳動に供し、その移動度から分子量を求めた。
酵素の反応条件は、供給者によって決められた条件に従った。また、分子量は、ラムダファージDNAを制限酵素HindIII で消化して得られた分子量マーカー(日本ジーン社製)および酵母染色体を分子量マーカー(バイオラッド社製)の標準移動度をもとに決定した。これらの結果から、前記載の図1であるプラスミドpNO33の詳細な制限酵素地図を決定した。
プラスミドpNO33の塩基配列の決定。
実施例1で取得したプラスミドpNO33の塩基配列を決定するため、プラスミドpNO33DNAを制限酵素, EcoRIまたはSmaIで消化後、その断片を大腸菌で複製可能な公知プラスミドベクターpGreen19(Inouyeら、Gene vol.189、pp159−162:1997)あるいはpBluescript SK+(ストラッテジーン社製)のEcoRIまたはSmaI部位に、常法によりサブクローン化を行った。
挿入断片の確認は、実施例1記載のプラスミド単離法に基づきプラスミド分離し、EcoRIまたはSmaIで消化後、0.7%のアガロースゲル電気泳動法により確認した。挿入断片の塩基配列は、ダイターミネーターサイクルシークエンシング法を用い、アプライド バイオシステム社の蛍光シークセンサー(ABI373)にて決定した。前記載の決定塩基配列番号1に基づき、宝酒造社製のDNASIS Ver.3.6遺伝子解析ソフトウエアを使用することにより、翻訳可能領域を検索し、前記載のアミノ酸配列番号2および前記載のアミノ酸配列番号3を見い出した。
配列番号1−3に関する遺伝子データーベース相同性の検索。
塩基配列番号1−3に基づき、世界規模で構築されている全ての遺伝子データーベースに対して、その相同性があるかどうか、インターネット経由でゲノムネットホームページ(http://www.genome.ad.jp/あるいはhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/)で、解析ソフトはFASTA、BLAST等を用いて検索を行った。塩基配列番号1は、全てのエントリー遺伝子配列に対して行い、アミノ酸配列番号2、3は、エントリーアミノ酸配列およびエントリー遺伝子配列より翻訳されるアミノ酸配列に対して行った。その結果、塩基配列番号1と著しく相同性のある遺伝子配列は検出できなかった。
一方、アミノ酸配列番号2、3についても、顕著な相同性は見い出されなかった。しかし、配列番号2に関しては、ストレプトマイセス属セリカラー種(Streptomyces coelicolor)の染色体に存在し、抗生物質アクチノホヂン(Actinorhodin)の生産に関与する遺伝子ORF−Dと約36%の相同性が見い出された。このことは、本発明プラスミド上に、抗生物質等の二次代謝産物遺伝子が存在することを示唆し、産業上利用できることを示している。
Claims (1)
- 環状プラスミドpNO33由来の全部あるいは一部塩基配列断片を用いて構築したプラスミド。
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