ITRM930840A1

ITRM930840A1 - Composizione terapeutica a base di interferone umano, impiego di interferone umano in tale composizione e relativo metodo.

Info

Publication number: ITRM930840A1
Application number: IT000840A
Authority: IT
Inventors: Ruiz Oscar Beloqui; Valtuena Jesus Prieto
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1992-12-22
Filing date: 1993-12-21
Publication date: 1995-06-21
Also published as: DE69330032T2; DE69330032D1; JP2849214B2; ZA939583B; IL108114A0; EP0675730B1; IT1261949B; RU2145235C1; GB9226729D0; WO1994014473A1; HRP931510A2; JPH08504799A; KR100309059B1; EP0675730A1; HUT72965A; AU5707694A; CA2152389A1; US5830455A; IL108114A; TW286283B

Description

DESCRIZIONE

a corredo di una domanda di Brevetto d'invenzione, avente per titolo:

"Composizione terapeutica a base di interferone una no, impiego di interferone umano in tale composizio ne e relativo metodo"

La presente invenzione si riferisce aa una combinazione terapeutica, pi? particolarmente ad _u na comoinazione terapeutica che implica l'impiego ai interferone umano.

La prima e localizzata risposta ai un anima, le ad una infezione ai origine virale consiste nei produrre l'?nterferone di linfochina. On ginariamen te ritenuti come costituiti aa una singola molecola, gli interferoni sono ora riconosciuti come una vasta famiglia di proteine, vecchie in termini di evoluzione e largamente distribuite nel regno animale. Anche se vi pu? essere una certa reattivit? incrociata limitata, gli interferoni sono generalmente spec?e-spec if?c?. Tre tipi di interferone so no stati caratter?zzat? ed originar?amente noti co me interferone di leucociti, di fibroblasti ed immu_ ni ed ora sono designati come interferoni alfa, beta e gamma,rispettiv amente

L'interferone alfa umano pu?.essere.prodotuta con molti.diversitipi di...cellule e la.HPLC..ha ri--.soito questo tipo di i nterferon in pi?.di.30 sotto tipi, .ciascuno codificato da un diverso .gene. L1 interferone-beta umano ? generalmente considerato come una singola sostanza e viene prodotto dai fibrobiasti. L ' interferone-gamma umano ? anche una singola sostanza prodotta da sottogruppi indotti da helper di T-linfociti a seguito di esposizione all'antigene oppure mediante esposizione di cellule bianche del sangue umano, T-linfociti oppure cel'lju le T-linfoblastoidi a mitogeni.

L'interferone-ai fa umano viene preparato in quantit? commerciali mediante stimolazione della li nea ai cellule linfoblastoid? umane Namalwa con il virus di Sendai per produrre una miscela naturale comprendente fino a 22 sottotipi di interierone-a_l fa, ? quali vengono quindi purificati per cromatografia fino ad una purezza del P5% e fino ad ottenere una attivit? specifica di circa

mg di proteina. Un tale prodotto, identificato come interferone aifa-N1 umano, ? disponibile in commercio con la denominazione WELLFERON (Marchio di fab brica Registrato della The Wellcome Foundation Limi ted) . L'?nterferone-beta umano naturale ? derivato dai fibroblasti diploidi umani, usualmente da tessju to neonatale, la produzione essendo indotta per esernpio mediante aggiunta di RNA sintetico a doppio filamento. L'interferone-gamma umano pu? essere pr? dotto aa rivestimenti fioccosi con un mitogeno, per esempio la Staphylococcus enterotossina A, in qualit? di agente induttore.

Gli interferoni alfa, Deta e gamma umani pos_ sono anche essere prodotti impiegando la tecnologia del DNA ricomb inante, anche se, quando prodotti per espressione del gene elevante in cellule Patte riche, gii interferoni ricombinanti possono non fivere la stessa struttura terziaria delle molecole naturali. Similmente, gli interferoni prodotti in cellule batteriche non saranno glicosilati e, anche se ci? non sembra influenzare l'attivit? biologica della molecola quando la sperimentazione viene effettuata in vitro, potreboe alterare la conformazio ne e la antigenicit? e potreobe influenzare la distribuzione nel corpo. Un tale interferone umano ricombinante prefer ibilmente possiede pi? del 90% di omologia degli amminoacidi con un interferone u mano naturale; con maggiore preferenza, una omologia del 95% ed ancora con maggiore preferenza una omologia deL 97%, ma tuttavia,con maggiore prefereri za ancora una omologia del 98%,e con preferenza ancora maggiore una omologia del 99% e con la massima preferenza una omologia del 100% Gli interferoni umani ricombinanti sono reperibili in commercio ed e sempi sono l interferone alfa-2a (RQFERQN Roche) e l interferone alfa-2b (INTRON Schering) Queste molecole differiscono da un residuo di un singolo ammino acido nella posizione 23 (lisina nel ROFERON e arginma nell INTRON)

Gli interferoni umani sono usati da alcuni anni nel trattamento della epatite ? primi esperimenti effettuati nel mezzo degli anni 1970 utilizza, vano l interferone da leucociti umani prodotto da cellule con rivestimento scamosciato lasciate aopo la produzione del plasma da sangue donato e ci? ne cessar ?amente limitava la quantit? disponibile Nei primi 1980 ? progressi effettuati nelle tecniche ai produzione hanno condotto all impiego sia dello ?nterferone- alfa umano naturale sia di quello ricom binante ovvero al trattamento della epatite cronica B Mentre questo trattamento pu? essere considerato come un trattamento di successo in molti casi gli indici di risposta al trattamento con gli interfer? ni-alfa umani da soli come giudicato dalla prolungata perdita di marcatori virali sono generalmente considerati come inferiori. al-50%. Gli interferoni beta e delta umani sono anche stati studiati per lo impiego nella epatite cr?n i ca B , ma non hanno raggi unto i l grado di trattamenti stab i l i ti-Tutti i tre tipi di interferone umano sono anche stati studiati nella terapia della epatite cronica .C,.anche,.se la bassa disponibilit? dell'interf erone-beta ha limitato il lavoro con questo tipo di interferone. Esperimenti molto estesi sono stati effettuati con l'impiego di a-interferoni a. cui ? stato fatto sopra riferimento (interferone al_ fa-2a, interferone alfa-2b ed interferone,da linfoblastoidi) ed i risultati sono stati incoraggianti per il fatto che una risposta completa si verifica in circa il 40% dei pazienti. Tuttavia, gli indici di ricaduta di circa 50% sono stati osservati 6 mesi dopo il trattamento, per cui soltanto dal 20 al 25% dei pazienti possono beneficiarne a lungo termine.

Per un riepilogo completo dell'impiego degli interferoni nel trattamento della epatite, si pu? fare riferimento al volume "Interferons in th? Treatment of Chronic Virus Infection of th? Liver" di Eddleston e Dixon, Pennine Press, 1990.

In aggiunta, gli interferoni sono stati proposti per l impiego nella terapia di numerose al_ tre condizioni che includono le affezioni virali diverse dall epatite, i disordini che implicano il sistema immunitario, incluse le condizioni autoimmu ni, ed ? cancri di vari tipi con incluso il cancro renale il cancro del seno il cancro del colon il sarcoma di Kaposi il glioma e le condizioni emato logiche maligne

Vi ? una certa evidenza particolarmenxe nel contesto di HIV per suggerire che le infezioni virali croniche possano provocare una sollecitazione ossidativa nell organismo infettato L induzione della sollecitazione ossidativa dai virus pu? ess? re dovuta ad una variet? di meccanismi comprendenti l attivazione delle cellule fagocitane dagli ?m munocomp less? la promozione della formazione dei radicali liberi dalle citochine infiammatorie (TNF alfa IL6) e la generazione di specie di ossigeno reattive per interazione diretta fra le glicoprote_? ne superficiali virali e le membrane delle cellule Sono note numerose sostanze che agiscono co me spazzatori di radicali liberi al livello della cellula o dell intero organismo Per esempio il glutatione ridotto ? un tiolo non proteico largamente distribuita, presente nella maggior parte delle cellule dei mammiferi il quale ? stato implicato in una variet? di funzioni metaboliche comprendenti le reazioni di detossificazione , contro i radicali liberi II glutatione rappresenta il meccanismo di difesa mtercel lulare principale contro la sollecitazione ossidativa ed i fattori che aumentano la formazione di radicali liberi che comportano il cori sumo di depositi di glutatione intercellulari II glutatione inoltre gioca un ruolo immunoregolatorio importante nella modulazione della attivazione dei linfociti e della loro proliferazione nella citotossicit? delle cellule T e delle interazioni macrofago- linfoc?ta

La N-acetil cisterna ? nota da molti anni co me un agente mucolitico un agente attivo sulla cor nea e come antidoto per l avvelenamento da acetaminophen II composto presenta un effetto relativamen te debolmente riducente e si ritiene che agisca co me mucolitico per il fatto che scompone ? legami bi solfuro nelle mucoproteme Vi sono stati numerosi rapporti che hanno confermato che ridotti livelli di glutatione possono essere abbassati in certe cori dizioni virali croniche, in particolare le infezioni da HIV La N-acetil cisterna ? un precursore e perci? un induttore di glutatione e la N-acetil cisterna ? stata proposta come agente terapeutico per l impiego nel caso di infezioni da HIV

Il brevetto europeo EP-A-G 269017 (Cetus) si riferisce alla combinazione di una linfochina o di citotossina e di uno spazzatore di radicali liberi o di un inibitore metabolico per il trattamento dei danni biologici agli ospiti mammiferi provo cati dalla produzione di radicali liberi Anche se la presente descrizione si riferisce per inciso agli interferoni come la linfochina e menziona anche le infezioni come una possibile causa di danneggiamento biologico la descrizione essenzialmente concerne ? radicali liberi che possono essere generati durante il trattamento del cancro I dati biologici forniti nella descrizione si riferiscono completa mente al cancro e sono considerati principalmente con la somministrazione di TNF alfa in fibrosarcoma mur?n ico

La presente invenzione si riferisce all impiego di uno spazzatore di radicali liberi o di un precursore o relativo induttore come elemento aggiuntivo alla terapia con un interferone umano Pertanto, in conformit? con un primo aspetto la presente invenzione fornisce un procedimento per il trattamento di un paziente che soffre di una condizione suscettibile di terapia con un interferone il quale consiste nella somministrazione al pa ziente di una quantit? efficace di un interferoneumano ed in cui uno spazzatore di radicali liberioppure un precursore o induttore di esso viene anche somministrato per tutta oppure per una parte della durata della somministrazione dell interferone umano

In conformit? con un altro aspetto l invenzione prevede l impiego di un interferone umano per la preparazione di un medicamento da impiegare nel trattamento di una condizione suscettibile di tera pia con un interferone con un procedimento nel qua le uno spazzatore di radicali liberi oppure un pre cursore o relativo induttore viene anche somministrato per tutta oppure per una parte della durata della somministrazione dell interferone umano

In conformit? con ancora un ulteriore aspet to, l invenzione prevede l impiego di uno spazzatore di radicali liberi oppure un relativo precursore o induttore per la preparazione di un medicamento per il trattamento di una condizione suscettibile di terapia con un interferone con un procedimento che implica la somministrazione di un interferone umano ed in cui lo spazzatone di radicali liberi oppure un relativo precursore o induttore viene an che somministrato per tutta o per una parte della durata della somministrazione dell interferone umano

La condizione suscettibile di terapia con un interferone pu? essere una qualsiasi delle condizio ni per le quali gli interferoni umani sono stati stabiliti oppure sono stati proposti come trattameli ti efficaci Tali condizioni comprendono le infezio ni virali per esempio l epatite virale le infezio ni provocate dal viruso del papilloma umano il ci. tomega lovirus e HIV le infezioni non virali come la tubercolosi e le condizioni quali l asma

La presente invenzione e part?colarmente ap plicabile all impiego degli interferoni umani nella terapia dell epatite Come gi? indicato sebbene u na tale terapia sia di considerevole vantaggio in molti casi la velocit? di risposta ? relativamente bassa e nel caso dell epatite C vi ? un sostanzia le indice di recidiva In accordo con ci?, vi ? una considerevole necessit? di miglioramento nella terapia della epatite con interferone umano per supe rare questi problemi

Esempi di interferone umano da impiegare con la presenta invenzione comprendono quelli, che sono stati precedentemente menzionati

_ In conformit? con un altro aspetto, la presente invenzione fornisce un procedimento per il tratamento di una infezione di epatite virale mediante somministrazione di un interferone umano, in cui uno spazzatore di radicali liberi oppure un relativo precursore o induttore viene anche sommini strato per tutta o per una parte della durata della somministrazione dell interferone umano

In conformit? con un ulteriore aspetto l invenzione prevede l impiego di un interferone umano per la preparazione di un medicamento destinato al trattamento di una infezione di epatite virale con un procedimento nel quale uno spazzatore di radicali lioeri oppure un relativo precursore o induttore viene anche somministrato per tutta o per una parte della durata della somministrazione dell interferone umano

In conformit? con ancora un ulteriore aspet to, l invenzione prevede l impiego di uno spazzatore di radicali liberi oppure un relativo precursore o induttore per la preparazione di un medicamento per il trattamento di una infezione di epatite vira le con un procedimento che implica la somministrazione di un interferone umano ed in cui lo spazzata re di radicali liberi oppure un relativo precursore, o induttore viene anche somministrato per tutta o per una parte della durata della somministrazione dell interferone umano

In conformit? con un ulteriore aspetto l in venzione prevede le combinazioni potenziate note anche come combinazioni sinerg?stiche di un interfero ne umano e di uno spazzatore di radicali liberi op pure un suo precursore o induttore per l impiego nel trattamento di una condizione suscettibile di terapia con un interferone Gli ingredienti attivi delle combinazioni potenziate secondo l invenzione possono essere somministrati contemporaneamente op pure sequenzialmente come formulazioni separate op pure come una singola formulazione combinata Se si ricorre ad una somministrazione sequenziale il ri tardo nella somministrazione del secondo degli ingredienti attivi non dovrebbe essere tale da per dere il beneficio di un effetto terapeutico potenziato derivante dalla combinazione degli ingredienti attivi

La presente invenzione ? applicabile al trat tamento della epatite virale in tutte le sue forme, essendo attualmente riconosciute cinque di tali forme, designate come epatite A, B C, D ed E rispettivamente

La epatite A ? una infezione virale acuta con un periodo di incubazione al disotto di 40 giorni trasmessa per la via fecale-orale II virus ? un membro della famiglia del picornavirus e consiste di una particella non inviluppata sferica di 27 nm II genoma virale ? stato sequenziato e comprende un singolo filamento di RNA contenente circa 7 480 basi

La epatite B ? una malattia virale universale e grave con una stima di piu di 200 milioni ai portatori su base mondiale Quando essa era nota co me epatite da siero la malattia veniva diagnostica ta sulla base della comparsa di sintomi da 2 a 3 me si dopo la trasfusione del sangue l iniezione di frazioni di plasma umano oppure l impiego di siringhe con aghi non sterilizzati II riconoscimento dei marcatori di siero per la epatite B ha conferma to l importanza della penetrazione attraverso la pelle ed in particolare il sangue nella trasmissione del virus Dopo la fase acuta della malattia la maggior parte dei pazienti adulti guariscono spontaneamente nel giro di alcune settimane per? una cer ta proporzione non si libera dal virus se non dopo molti mesi e diventano portatori cronici II virus della epatite B appartiene alla famiglia di virus hepadna, il cui genoma consiste di un piccolo pezzo circolare non completamente a doppio filamento di DNA che si replica mediante copiatura del suo DNA nel RNA e nella ricopiatura di RNA nel DNA impiegando la trascriptasi inversa

La epatite non-A non-B ? riconosciuta come un problema di salute internazionale sempre piu gra, ve Almeno l 80% aei casi di epatite cronica posttrasfus ?onale non-A non-B hanno dimostrato ai essere dovuti al virus ora ?aentificato come epatite C e questo virus probabilmente spiega virtualmente tutti ? casi ai epatite da trasfusione nei laborato ri clinici in cui ? prodotti del sangue vengono va lutati per l epatite B Mentre approssimativamente una met? dei casi ai infezioni acute di epatite C si risolvono spontaneamente nel corso di un periodo di alcuni mesi il resto dei casi diventano cronici ed in molti se non in tutti questi casi si verifica una epatite attiva cronica con potenzialit? di cirrosi o di carcinoma epatocellulare La strutta ra del genoma del virus di epatite C ? stata recen temente illustrata ed il virus ? stato caratterizza to come un virus di RNA a singolo filamento con del le somiglianze con i flavivirus

Il virus della epatite D ? stato riconosciuto per la prima volta nel 1977 a seguito della identificazione di un nuovo antigene in certi portatori di epatite B II virus richiede la epatite B (oppu re un virus hepadna strettamente ad essa associato) in qualit? di virus helper per la replicazione sebbene la replicazione sia sufficientemente efficiente perch? possa raggiungere un titolo piu elevato di quello del virus helper nel siero II genoma della epatite D consiste di RNA circolare chiuso covalentemente e presenta una certa somiglianza strutturale con certi viroidi circolari oppure con certi agenti simili a virus che si trovano nelle piante L infezione di epatite D ? associata ad una aggressiva affezione del fegato e viene riscontrata in pazienti con grave malattia (epatite attiva cro nica o cirrosi) piu frequentemente che non in quel li affetti da epatite persistente cronica

Il virus di epatite E e in relazione al virus che provoca la epatite A (Reyes et al Science 247 1335-1339 (1990)) e produce una forma acuta di epatite senza alcuna fase cronica II virus ? enterico portato dall acqua e normalmente trasferito per via fecale/orale Esso ? particolarmente preval?nte nel sub-continente indiano e produce un elevato indice di mortalit? nelle donne icinte.

La presente uivenziotie ? anche applicabile al trattamento del virus del papilloma umano ?l qua_ le ? l agente responsabile per le verruche non geni tali per il papilloma laringeo giovanile per il condiloma acuminato e che ? anche implicato nel cancro cervicale L invenzione e anche applicabile al trattamento di altre infezioni virali per esempio quelle provocate dal citomegalovirus umano e da HlV L invenzione e anche applicabile al trattamen to di infezioni non virali come la tuoercolosi e di condizioni come l asma

L interferone umano da impiegare in conforma l? con l invenzione pu? essere uno qualsiasi dei tre tipi a cui ? stato fatto sopra riferimento va le a dire interferone alfa interferone beta oppure lo terferone-gamma Generalmente l interferone umano sar? l interferone alfa o l interferone gamma Prie feribilmente l interferone umano ? l interferonealfa umano con maggiore preferenza interferone-al fa umano derivato da una linea di cellule umane in coltura oppure un ?nterferone-alfa umano ricombinante In conformit? con una preferita forma di realizzazione l interferone umano ? interferone al fa-2a ricombinante oppure l interferone alfa-2b, per esempio uno dei prodotti reperibili sul mercato con le denominazioni commerciali ROFERON e INTRON In conformit? con un altra forma di realizzazione particolarmente preferita l interferone umano ? IJI terferone da linfoblasto?di umani (interferone alfa N1) per esempio il prodotto aisponibile sul merca to presso la The Wellcome Foundation Lta con deno minazione commerciale WELLFERON

Il termine interferone umano deve essere interpretato in modo da includere un qualsiasi interferone di tipo naturale la cui sequenza ? stata determinata da un variante o relativo mutante umano e di un qualsiasi allele che sostanzialmente conserva la attivit? della corrispondente sequenza del tipo naturale e che possiede piu dell 30% di o filologia della sequenza con la corrispondente sequenza del tipo naturale

Gli interferoni umani possono essere formula ti per somministrazione in conformit? con l invenzione nella stessa maniera con cui essi vengono usa ti da soli nel trattamento delle condizioni in questione per esempio delie epatiti Perci? l interferone viene generalmente somministrato per via parenterale per esempio per iniezione preferibilmen ta par iniezione-sottocutanea Preferibi lmente,. Lo interferone vLene formulato come un preparato acquo so oppure come un prodotto liofilizzato destinato ad essere ricostituito con un conveniente veicolo, per esemplo acqua per iniezioni La formulazione pu? anche contenere un conveniente supporto diluente o stabilizzante per esempio un altra proteina umana come l albumina di siero umano

l interferone umano in generale sara sommine strato in conformit? con ? protocolli di trattamento gi? staoiliti per il prodotto in questione Per esempio l interferone alfa umano sia di origine linfob iasto?de sia ricombinante pu? essere somministrato come una dose compresa fra 1 e 10 Nega Unit? di interferone per giorno La dose pu? essere somministrata in 3 o piu giorni per settimana pre feribilmente 3 volte alla settimana Un preferito intervallo di dosaggio comprende da 2 a 6 Mega Unit? di interferone per giorno per 3 o piu giorni alla settimana prefer?b ?lmente 3 volte alla settimana e particolari dosi di interferone comprendono 5 Mega Unit? o con la massima preferenza 3 Mega Unit? per giorno o 3 o piu giorni per settimana preferibilmente 3 volte per settimana Nel trattamento del le epatiti, la durata della somministrazione dello interferone ? usualmente un periodo di diverse set timane per esempio da 12 a 30 settimane, in parti colare circa 24 settimane, anche se in certi casi possono essere appropriati periodi di trattamento pi? lunghi fino ad un anno o piu

Nel senso usato nella presente descrizione, il termine spazzatore di radicali liberi oppure relativo precursore o induttore significa un qualsiasi materiale che ? capace, a seguito della somministrazione ad un ospite di ridurre il livello dei radicali liberi (a cui viene anche fatto riferimento come sollecitazione ossidativa) in detto ospite Il materiale pu? effettuare questa riduzione nel livello dei radicali liberi mediante spazzamento diretto dei radicali liberi oppure mediante induzione come precursore biologico diretto oppure in altra maniera della produzione nell ospite di un materia le avente un effetto di spazzamento sui radicali li beri Alternativamente il materiale pu? ridurre il livello dei radicali liberi esercitando un effetto inibitorio nei procedimenti che portano alla genera zione di radicali liberi

I preferiti spazzatori di radicali liberi op pure relativi precursori o induttori comprendono il glutatione ed ? relativi precursori per esempio ? derivati della cisterna di ammino acido che si ri_ scontra in natura Un precursore particolarmente preferito del glutatione ? la N-acetil cisterna Come precedentemente indicato la N-acetil cisterna gi? presenta un uso farmaceutico stabilito come mucolitico e preparati farmaceutici del composto sono disponibili in commercia Altri spazzatori di radicali liberi o relativi precursori o induttori comprendono vitamina A vitamina C (acido ascorbico) vitamina E acido urico butionina solfossima die til maleato metronidazolo superossido dismutasi e metionina I materiali che inibiscono la generazione di radicali liberi comprendono gli inibitori della xantina ossidasi come allopurinolo e sono consiaerati come spazzatori di radicali liberi o re lativi precursori o induttori come viene fatto riferimento nella presente descrizione

Lo spazzatore di radicali liberi o relativo precursore o induttore dovrebbe essere somministrato in una forma ed in una dose tali che esso sia ca pace di ridurre la generazione dei radicali liberi e/o di ridurre gli effetti della generazione dei radicali liberi (sollecitazione ossidativa) nell ospi_ te La somministrazione pu? essere effettuata attra verso una qualsiasi conveniente via per esempio o rale o parenterale, a seconda della natura del materiale La somministrazione orale ? preferita, nei casi passibili

La N-acetil ciste?na ? preferibilmente formulata per somministrazione orale nella forma di com presse o granuli oppure come un preparato liquido per esempio uno sciroppo Una appropriata dose di N-acetil cisterna ? compresa nell intervallo fra 200 mg e 4 grammi per dose somministrata fino a 4 volte per giorno per esempio da 400 a 800 mg somministrati 4 volte al giorno preferibilmente 600 mg somministrati 4 volte al giorno

Anche se la terapia fornita secondo l invenzione per esempio per la epatite virale consiste della somministrazione combinata di un interferone umano e di uno spazzatore di radicali liberi o relativo suo precursore o induttore ? due medicamenti in generale saranno somministrati come preparati separati Tuttavia in certe circostanze pu? esse re vantaggioso sommin?strare i due componenti come un preparato combinato e l invenzione si estende anche a tali preparati combinati

Pertanto, in conformit? con un ulteriore aspetto, l invenzione fornisce una composizione far maceutica comprendente un interferone umano insieme con uno spazzatore di radicali liberi oppure un suo relativo precursore o induttore

In generale una qualsiasi preparazione com binata di questo genere si presenter? in una forma destinata alla somministrazione parenterale per e sempio per iniezione Un tale preparato combinato pu? essere presentato in forma liquida oppure in forma solida con l interferone umano liofilizzato e conveniente per la r?costruz?one alla forma liquida

Pu? anche essere appropriato presentare insieme ? due medicamenti in una forma conveniente per la somministrazione separata In conformit? con un altro aspetto l invenzione fornisce una confezione gemellata comprenoente in associazione per somministrazione separata un interferone umano eo uno spazzatore di radicali liberi oppure un suo relativo precursore o induttore

La presente invenzione ? particolarmente applicabile alla terapia della epatite B o della epatite C Come precedentemente indicato, la somministrazione dell interferone umano, particolarmente l interferone-alfa ricombinante o linfob lasto?de ? gi? una terapia stabilita per la epatite B In aggiunta numerosi esperimenti hanno indicato che la stessa terapia ? anche considerevol mente vantaggiosa nel trattamento della epatite C In conformit? con la presente invenzione, la terapia di pazienti che soffrono di epatite in particolare l epatite B o l epatite C con l interferone verr? eseguita essenzialmente in conformit? con ? protocolli stabiliti con l aggiunta di un trattamento con uno spazzatore di radicali liberi oppure un suo relativo precursore o induttore per tutta o per una parte della durata dell aterapia con l interferone umano

I livelli di alanina amminotransferasi del siero (ALT; sono un marcatore altamente sensibile per la disfunzione epatica Le infezioni aa epatite B e da epatite C sono ambedue caratter?zzate da aumentati livelli di ALT ed il progredire della malattia viene generalmente mom torato mediante la de terminazione del livello di ALT nel siero Come precedentemente indicato, circa il 50% o meno dei pazienti affetti da epatite B o da epatite C rispondo no al trattamento con ?nterferone-a umano, come dimostrato da un significativo clearing di marcatori virali oppure dall abbassamento dei livelli di ALT In conformit? con una forma di realizzazione dell invenzione che ? particolarmente applicabile al trattamento della epatite B o della epatite C, pi? particolarmente della epatite il trattamento con interferone umanor perticolarmente.intecferonealfa umana viene,eseguita. nella marn er? usuale,per un periodo di diverse settimane, per esempio da 12 a 30 settimane, in particolare circa 24 settimane Per pazienti che non rispondono a questo corso di trattamento iniziale con interferone umano come di mostrato dai livelli di ALT nel siero significativi mente ridotti il trattamento viene continuato con l interferone umano e con il supplementare tratta mento con spazzatone di radicali liberi oppure un suo relativo precursore o induttore preferibiimen te glutatione oppure un suo precursore o induttore piu preferibilmente N-acetil cisterna II trattamento con l interferone umano e con lo spazzatone di radicali liberi oppure un suo relativo precursore o induttore pu? essere continuato per un ulteriore pe riodo di diverse settimane per esempio da 12 a 30 settimane in particolare circa 24 settimane In conformit? con una preferita forma ai realizzazione dell invenzione questo protocollo di trattamento viene applicato al trattamento della epatite C con interferone linfoblastoide umano (interferone alfa-N1 umano)

Come anche precedentemente indicato certi Pazienti affetti da epatite B o da epatite C possono rispondere in?zialmente al trattamento con interferone umano particolarmente interferone-alf a umano, ma possono successivamente avere una recidiva Tali pazienti possono anche avvantaggiarsi da un corso combinato ai trattamento con l interferone umano e con Io spazzatore di radicali liberi oppure un suo relativo precursore o induttore, come pre cedentemente sottolineato

Dovrebbe essere compreso che le dosi cello interferone umano e dello spazzatore di radicali liberi oppure un suo relativo precursore o inauttore varieranno in dipendenza dal paziente e dalla precisa condizione della quale soffre il paziente In definitiva il trattamento verr? effettuato sotto il controllo del medico curante e sotto la sua responsabilit?

L invenzione e ulteriormente illustrata dal seguente studio pilota che non dovrebbe essere con siderato in alcun modo come una limitazione dello ambito dell invenzione

ESEMP IO

1 Introduzione

Il viruso ai epatite C (HCV) ? responsabile della maggior parte dei casi ai epatite non-A nonB post-trasfus ione e sporadica La cronicizzazione dell infezione ? molto comune e comporta la epatite cronica, la cirrosi ed in definitiva una degenerazione maligna Diversi studi controllati hanno dimo strato che l interferone alfa (IFN) ? utile nel trattamento della epatite cronica C (CHC) per? lo indice di risposta ? in media del 50% e la frequenza di recidiva, dopo la cessazione del trattamento con IFN, pu? raggiungere il 30-40% In accordo con ci? la proporzione aei pazienti con CHC che preseri tano normali livelli di transaminasi dopo la cessa_ zione del trattamento con IFN ? soltanto circa il 20-40% di tutti ? casi trattati

Il glutatione ridotto (GSH) ? un importante antiossidante nelle cellule dei mammiferi essendo implicato in una grande variet? di funzioni cellula ri ed ? stato suggerito che l esaurimento di GSH possa giocare un ruolo patogeno in alcune affezioni virali croniche per esempio l AIDS In questo studio ? livelli di GSH sono stati misurati nel plasma e nelle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) da pazienti affetti da CHC i quali non hanno fornito risposta alla terapia IFN dopo al meno 4 mesi di trattamento L effetto della N-ace til cisterna, un precursore del tiolo, ? stato anche valutata sui livelli di GSH e sulla risposta clinica e biologica alla terapia basata su IFN

2 Pazienti e procedimenti

2 1 Pazienti

Quattordici pazienti (13 maschi ed 1 femmina,, et? media 51 anni intervallo 27-71) diagnosticati come affetti da CHC mediante criteri istologici e sierologici due ai essi con associata cirrosi so no stati incorporati nello studio Tutti i pazienti erano stati sottoposti a trattamento con interferone-alfa da linfoblastoid? (Wellferon) per un perio do mimmo di 4 mesi (15 16 MU per settimana ?jn tervallo 9-21 MU per settimana) tutti ? pazienti presentavano valori anormali ai ALT (superiori a 30 IU/L) quando erano inseriti nello studio La maggior parte dei pazienti con CHC rispondenti alla somministrazione di IFN normalizzano ? livelli delle transaminasi entro ? primi 3 mesi di terapia e quelli che persistono con elevati valori di ALT do po 4 mesi di trattamento possono essere considerati come pazienti che non forniscono risposta o che non reagiscono In accordo con ci? tutti ? pazienti nello studio presente sono stati considerati come non reattivi alla terapia con IFN I pazienti nel presente studio continuavano essenzialmente lo stes so regime di trattamento con IFN a cui erano stati precedentemente sottoposti, per? si aggiungeva la somministrazione di N-acetil cisterna (NAC) per via orale 600 mg ogni 8 ore quotidianamente Nessun paziente aumentava il dosaggio dell interferone do po l aggiunta di NAC orale anche se in 3 casi la quantit? di interferone era leggermente ridotta (15 1,8 MU/settimana prima di NAC contro 115 _+ 13 MU/settimana dopo NAC)

In aggiunta 10 pazienti (8 maschi e 2 femmine et? media 32 anni intervallo 24-63) con recen te diagnosi di sofferenza da epatite cronica C ta li pazienti non essendo stati mai sottoposti a trat tamento antivirale assumevano la stessa quantit? di NAC orale ma senza interferone nel corso di un periodo di un mese

Ventisei soggetti in buona salute (14 maschi e 12 femmine et? media 43 anni intervallo fra 25 e 79) servivano come gruppo ai controllo Tutti ? pazienti avevano fornito un consenso scritto e lo studio era stato approvato dalla Locai Ethics Committee 2 2 determinazione di GSH in PBMC ed in plasma Campioni di sangue per la determinazione si_ multanea di GSH in PBMC (L-GSH) ed in plasma a scar so tenore di piastrine (P-GSH) erano ricavati da c-iascun paziente Le cellule PBMC erano asolate per centrifugazione su un dispositivo Lymphoprep (Nycomed Pharma AS, Oslo* Norvegia) e lavate per cinque volte Le cellule isolate erano devitalizzate con acido perclorico al 20% (concentrazione finale 2%) e dopo centrifugazione (1 200 g x 10 minuti alla temperatura ai 4?C) ed ? supernatanti erano immagazzinati alla temperatura di -40?C, fino al momento di uso Acido perclorico al 20% era aggiunto ai plasma a scarso contenuto piastrinico (concentrazione finale 2%) e dopo centrifugazione i supernatanti erano mantenuti alla temperatura di -40?C fino alla determinazione di GSH ;I campioni immagazzinati erano quindi scongelati ed il livello di GSH era determinato seguendo la procedura enzimatica descritta da Brigelius et al Biochem Pharmacol 32 2529-25^4 (1983) secondo le modificazioni apportate da Ferrer ea al Biochem J 264 531-534 (1990) Il GSH in presen za di GSH-S-transferas? viene coniugato con 1-clo ro-2 4-d ?n?trobenzene (CDNB)(S IGMA) e l indice di asorbimento o assorbenza del complesso viene misurato a 340 nm impiegando uno spettrofotometro Perkin-Elmer Lambda 2 I valori assoluti di GSH erano ottenuti impiegando un coefficiente di estinzione molare di ;2 3 Estrazione di RNA e di RT-PCR ;La reazione della catena della polimerasi di trascrizione inversa (RT-PCR) per HCV-RNA nel siero e per ? filamenti positivi o negativi di HCV-RNA nelle cellule PBMC era eseguita essenzialmente nella maniera descritta da Ruiz et al Hepatology 16 637-643 (1992) e da Cheng et al J hepatol nella stampa (1992) Le procedure raccomandate da Kwoks e da Higuchi, Nature 339, 237-238 (1989) per ridurre il rischio di contaminazioni erano strettamente applicate Tutte le estrazioni e le reazioni erano eseguite simultaneamente su controlli positivi e negativi Era anche inclusa una aliquota dall ultimo lavaggio delle PBMC ed il livello di PCR era sempre negativo in questi campioni ;2 4 Analisi statistica ;Tutti ? dati sono presentati come medie errore standard della media (SEM) I confronti per ? dati appaiati e non appaiati erano eseguiti applicando i test di Mann Whitney e Wilcoxon ;3 Figure ;I risultati sono descritti con riferimento ai disegni allegati, nei quali ;la Figura 1 rappresenta l effetto di IFN ( di -4 a 0 mesi) e di IFN pi? NAC ( da 0 a 6 mesi) su i l ivell i di A L T p er 14 pazienti inseriti nello stud i o , ;la Figura 2 rappresenta la rivelazione nelle PBMC dei filamenti positivi e negativi di ACV-RNA durante il trattamento con IFN e con IFN piu NAC ;la Figura 3 rappresenta la rivelazione di HCV-RNA nel siero con una diluizione del siero di 1 10 sia prima sia dopo l aggiunta di NAC al trattamento con IFN ;la Figura 4 rappresenta i livelli ai ALT nei pazienti descritti nella precedente Figura 1 quando seguiti fino a 11 mesi dopo l inizio della terapia a base ai IFN piu NAC ;4 Risultati ;I livelli medi di ALT nel siero per ? 14 pazienti inseriti nello studio sono riportati nella seguente tabella che mostra anche ? valori di L-GSH e di P-GSH ;(segue tabella) ; ;; I valori per L-GSH e P-GSH per il gruppo di controllo erano ? seguenti ;L-GSH 343 089 nMoli/106 cellule P-GSH 18 1 408 microM ;Nei pazienti affetti da epatite cronica C che non erano mai stati sottoposti a trattamento antivirale (n 10) ? livelli di GSH nel plasma (0,63 007 microM) e nelle PBMC (102 009 nMo l1/ 106 cellule) apparivano gravemente depressi in confronto con ? soggetti di controllo in buona salute (18 1 408 microM e 343 089 nMoli/106 cellule, rispettivamente, P < 001) La somministra zione di NAC durante 1 mese aumentava significativa mente ? livelli di GSH in PBMC (2,22 0,38 nMoli/ 10 cellule, P 4L 0,05) per? il livello di GSH nel plasma non era significativamente modificato (099 + 0,22 microM, n-s ) In aggiunta 1 livelli di ALT nel? siero (128 32 IU/L contro 110 4- 29 IU/-L dopo un mese di terapia con NAC) non erano neanche significativamente modificati ;Nei pazienti che non reagivano al trattamento con interferone, ? livelli di GSH nelle PBMC (1 45 0,27 nMoLi/106 cellule) e nel plasma (0,77 _+ 0,21 microM) apparivano anche significativamente depressi in confronto con ? valori di controllo (p < 001) In questi pazienti la somministrazione di NAC insieme con l interferone nel corso di un periodo di 34 mesi comportava un significativo aumento del livello di GSH nelle cellule mononuc?eari (j 32 0 18 nMol1/10? cellule p < 0 05) e nel plasma (2 40 020 microM p < 005) ;La Figura 1 e la preceaente tabella dimostra no che nei pazienti inseriti nello studio (che non reagiscono al trattamento con interferone) ? livelli di ALT non variavano significativamente nel corso dei 4 mesi della terapia con IFN (139 _ 24 contro 124 17 IU/L, n s ) Tuttavia, l aggiunta di NAC orale ocmportava una pronta e significativa di_ minuzione del livello di ALT, anche soltanto dopo un mese del trattamento combinato i valori di ALC erano significativamente diminuiti (87 9 IU/L, p < 0,05) Inoltre, la somministrazione continua di IFN e di NAC nel corso di un periodo di 5-6 mesi produceva una ulteriore diminuzione dei valori di ALT in tutti i casi (37 _+ 4 IU/L) raggiungendo va lori normali nel 41% dei casi e valori prossimi ai valori normali (massimo di 56 IU/L in un caso) nel_ la parte restante L aggiunta di NAC al regime di IFN chiaramente migliora la risposta al trattamento con IFN nel caso di pazienti precedentemente classir*rati come non reattivi alla terapia a base di IFN Come si pu? meglio vedere nella Figura 4 que sta diminuzione die valori di ALT continuava fino alle analisi piu recenti sui pazienti 11 mesi dopo I inizio della terapia combinata

La riduzione nei livelli di ALT mediante la combinazione di IFN e di NAC era accompagnata da un concomitante effetto sulla replicazione del virus Nel caso di 9 pazienti classificati come non reatti_ vi al trattamento con IFN le PBMC eranu sottoposte a saggio per la presenza sia del filamento genomico di HCV (filamento di RNA positivo) sia all intermedio replicativo del virus (filamento di RNA negativo) prima e dopo l aggiunta di NAC alla terapia Come dimostrato nella Figura 2, quando ? pazienti venivano trattati soltanto con IFN, il filamento genomi co poteva essere rivelato in 7 casi (77%), mentre l intermedio replicativo era rivelato in 3 pazienti (33%) Tuttavia dopo 4-6 mesi di terapia combinata con IFN e con NAC, il filamento positivo era rivelata soltanto in 2 casi (22%) ed il filameli to negativo di HCV-RNA non poteva essere rivelato in alcun caso

L aggiunta di NAC al regime a base di IFN era anche accompagnato dalla diminuzione dei livel_ li di HCV-RNA nel siero Come dimostrato nella Figura 3, ???? l aggiunta di NAC alla terapia era ne cessarla una aumentata concentraz?one del siero per la rivelazione ai HCV perci? prima dell aggiunta di NAC la presenza di HCV-RNA poteva essere rivelata nel 100% dei casi utilizzando una diluizione del siero di 110 mentre dopo l aggiunta di NAC alla terapia con la stessa diluizione del siero il vi_ rus era rivelato soltanto nel 70% dei pazienti

Claims

RI VENDICAZION I 1 Combinazione potenziata comprendente- un interferone umano ed uno spazzatore di radicali liberi oppure un suo relativo precursore o induttore 2 Combinazione secondo la rivendicazione 1 in cui l interferone umano e interferone-alfa umano 3 Combinazione secondo la rivenaicazione 2 in cui l ?nterferone-alfa umano ? ricombinante 4 Combinazione secondo la rivendicazione 2 in cui l interferone-alfa umano ? naturale 5 Combinazione secondo la rivendicazione 4 in cui l interferone-alfa umano naturale e interfe rone umano da linfoblastoidi 6 Combinazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5 in cui lo spazzatore di ra dicali liberi oppure un suo relativo precursore o induttore ? costituito da glutatione oppure un suo precursore o induttore 7 Combinazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5 in cui lo spazzatore di ra dicali liberi oppure un suo relativo precursore o induttore ? costituito da N-acetil cisterna 8 Combinazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7 per l impiego nel trattamento di una condizione suscettibile di terapia con un interferone 9 Combinazione secondo la rivendicazione 8, in cui la condizione ? epatite 8 oppure una infezione da epatite C 10 Impiego di un interferone umano per la preparazione di un medicamento per l impiego nel trattamento di un paziente sofferente di una condizione suscettibile di terapia con un interferone u mano con un procedimento in cui uno spazzatore di radicali liberi oppure un suo precursore o induttore viene anche sommin?strato durante il trattamento con l interferone umano 11 Impiego di uno spazzatore di radicali li beri oppure un suo precursore o induttore per la preparazione di un medicamento per il trattamento di un paziente sofferente di una condizione suscettibile di terapia con un interferone umano con un procedimento che implica il trattamento con un interferone umano e con lo spazzatore di radicali liberi oppure suo relativo precursore o induttore 12 Impiego secondo l una o l altra delle ri vendicazioni 10 e 11 in cui l interferone umano ? interferone-alfa umano 13 Impiego secondo la rivendicazione 12, in cui L- interferone-alfa umano ? scombinante 14 Impiego secondo a rivendicazione 12 in cui l interferone-alfa umano ? naturale 15 Impiego secondo la rivendicazione 14, in cui l interferone-alfa umano naturale ? interferone umano da linfoblastoidi 16 Impiego secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 10 a 15 in cui lo spazzatore di radicali liberi oppure suo precursore o induttore ? costituii da glutatione oppure un suo presursore o induttore 17 Impiego secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 10 a 15 in cui lo spazzatore di radicali liberi oppure suo precursore o induttore e costituito da N-acetil cisterna 18 Impiego secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 10 a 17 in cui la condizione e una infezione da epatite B o da epatite C 19 Impiego di un interferone umano per la preparazione di un medicamento per l impiego nel tratamento di un paziente sofferente di una condizione suscettibile di terapia con un interferone umano il quale non ha fornito alcuna reazione ad un trattamento con l interferone umano, con un procedi_ mento in cui uno spazzatore di radicali liberi oppure un suo precursore o induttore viene somministrato durante il trattamento con l interferone umano 20 Impiego di uno spazzatore di radicali li_ beri oppure un suo precursore o induttore per la preparazione di un medicamento per il trattamento di un paziente sofferente di una condizione suscettibile di terapia con un interferone umano il quale paziente non ? riuscito a reagire al trattamento con l interferone umano con un procedimento che ?m plica il trattamento con un interferone umano e con lo spazzatore di radicali liberi oppure un suo pre cursore o induttore 21 Impiego secondo l una o l altra delle ri_ vendicazioni 19 e 20 in cui il paziente ha precedentemente reagito al trattamento con l interferone umano 22 Impiego secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 19 a 21 in cui l interferone umano ? interferone-alfa umano 23 Impiego secondo la rivendicazione 22 in cui l interferone-alfa umano ? ricombinante 24 Impiego secondo la rivendicazione 22 in cui l ?nterferone-alfa umano ? naturale 25 Impiego secondo la rivendicazione 24, in cui l interferone-alfa umano naturale ? interferone umano da linfoblastoidi 26 Impiego secondu una qualsiasi delle rivendicazioni da 19 a 25 in cui lo spazzatore di ra dicali liberi oppure un suo relativo precursore o induttore ? costituito da glutatione oppure un suo precursore o induttore 27 Impiego secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 19 a 25 in cui lo spazzatore di ra dicali liberi oppure un suo relativo precursore o induttore ? costituito da N-acetil cistern a 28 Impiego secondo una qualsiasi delle ri vendicazioni da 19 a 27 in cui la cord zione ? una infezione da epatite 8 o da epatite C 29 Formulazione farmaceutica comprendente una combinazione come descritta in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7 ed un supporto farmaceuticamente accettabile 30 Confezione gemellata comprendente in assed azione ? componenti che debbono essere somministrati per generare una combinazione cosi come descritta in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7 31 Procedimento per il trattamento di un paziente sofferente di una condizione suscettibile di terapia con un interferone umano, il quale consiste nel somministrare al paziente quantit? terapeuticamente effLcaci dell interferone umano e di uno spazzatore di radicali liberi oppure un suo precursore o induttore relativo 32 Procedimento secondo la rivendicazione 31 in cui l interferone umano ? interferone-alfa umano 33 Procedimento secondo la rivendicazione 32 in cui l interferone-alfa umano ? ricombinante 34 Procedimento secondo la rivendicazione 32 in cui l interferone-alfa umano ? naturale 35 procedimento secondo la rivendicazione 34 in cui l ?nterferone-alfa umano naturale ? interferone umano da linfoblastoidi 36 Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 31 a 35 in cui lo spazzatore di radicali liberi oppure un suo precursore o induttore ? costituito da glutatione oppure un suo precursore o induttore 37 Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 31 a u5, in cui lo spazzatore di radicali liberi oppure un suo precursore o induttore ? costituito da N-acetil cisterna 38 Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 31 a 37, in cui la condizione ? una infezione di epa t ite B o di epatite C . 39. P roced imento per i l tr attamento di un p a_ ziente sofferente di una condizione suscettibil e di terapia con un interferone umano,i lquale paziente non ? riuscito a reagire al trattamento,con l'interferone umano, il quale consiste nel trattamento del paziente con quantit? efficaci dell'interferone umano ,e di uno spazzatole di radicali liberi oppure un suo precursore o induttore. 4. Procedimento secondo la rivendicazione 39, in cui il paziente ha precedentemente risposto al trattamento con l'interferone umano. 41. Procedimento secondo l'una o l'altra delle rivendicazioni 39 e 40, in cui la condizione ? una infezione di epatite B o di epatite C.