SI9300671A - Terapevtska kombinacija, ki vsebuje humani interferon, uporabna za zdravljenje virusnih in nevirusnih infekcij - Google Patents

Abstract

Predloženi izum se nanaša na terapevtsko kombinacijo, bolj posebno na kombinacijsko terapijo, ki vključuje uporabo humanega interferona. Terapija vključuje zdravljenje stanj, dovzetnih za zdravljenje s humanim interferonom, s komibnacijo humanega interferona in prostega radikalskega odstranjevalca ali njegovega predhodnika ali induktorja.

Description

The Wellcome Foundation Limited

Terapevtska kombinacija, ki vsebuje humani interferon, uporabna za zdravljenje virusnih in nevirusnih infekcij

Predloženi izum se nanaša na terapevtsko kombinacijo, bolj posebno na kombinirano terapijo, ki vključuje uporabo humanega interferona.

Prvi in lokalizirani odziv živali na virusno infekcijo je, da proizvede limfokinski interferon. Provotno je bilo mišljeno, da so interferoni enojne molekule, sedaj pa so prepoznani kot velika družina proteinov, stara glede evolucije in široko razširjena v živalskem stvarstvu. Čeprav lahko pride do nekaterih omejenih navzkrižnih reaktivnosti, so interferoni na splošno specifični za vrste. Trije tipi interferona so bili označeni, originalno znani kot levkocit, fibroblast in imunski interferon, sedaj pa so določeni kot interferoni a, β oz. -7.

Humani interferon a lahko proizvajajo mnogi različni celični tipi in HPLC loči ta tip interferona v preko 30 podtipov, vsakega kodiranega z različnim genom. Za humani interferon β na splošno smatrajo, da je enojna substanca, narejena iz fibroblastov. Humani interferon 7 je prav tako enojna substanca, narejena iz skupin limfocitov T, induciranih s pomočnikom pri izpostavitvi antigenu ali z izpostavitvijo humanih belih krvnih celic, limfocitov T ali limfoblastoidnih celic T mitogenom.

Humani interferon a izdelujejo v tržnih količinah s stimuliranjem Namalwa humane limfoblastoidne celične linije s Sendai virusom, da nastane naravna zmes iz do 22 podtipov interferona a, katere nato očistijo s kromatografijo do 95 % čistote in specifične aktivnosti pribl. 100 χ 10⁶ IU/mg proteina. Tak produkt, identificiran kot humani interferon α-Nl, je tržno dosegljiv pod imenom WELLFERON (zaščitena blagovna znamka od The Wellcome Foundation Limited). Naravni humani interferon β je izveden iz humanih diploidnih fibroblastov, navadno iz neonatalnega tkiva, pri čemer je produkcija inducirana npr. z dodajanjem sintetične dvojnoverižne RNA. Humani interferon 7 lahko naredijo iz rumenkasto bele plasti kože, sestavljene iz levkocitov, z mitogenom, kot npr. Staphylococcus enterotoksinom A kot induktorjem.

Humane interferone a, β in 7 lahko proizvedejo tudi z uporabo rekombinantne DNA tehnologije, čeprav je možno, da rekombinantni interferoni, proizvedeni z ekspresijo relevantnega gena v bakterijskih celicah, nimajo enake terciarne strukture kot naravne molekule. Podobno interferoni, proizvedeni v bakterijskih celicah, niso glikozilirani in čeprav to ne vpliva na biološko aktivnost molekule pri testiranju in vitro, le-to lahko spremeni konformacijo in antigenost in lahko vpliva na porazdelitev v telesu. Tak rekombinantni humani interferon ima prednostno več kot 90 % aminokislinsko homologijo z naravnim humanim interferonom; bolj prednostno 95 %, še bolj prednostno 97 %, še bolj prednostno 98 %, še bolj prednostno 99 % in najbolj prednostno 100 % homologijo. Rekombinantni humani interferoni so dosegljivi na tržišču in primera sta interferon a-2a (ROFERON - Roche) in interferon a-2b (INTRON -Schering). Te molekule se razlikujejo po enojnem aminokislinskem preostanku v legi 23 (lizin v ROFERONU in arginin v INTRONU).

Humane interferone uporabljajo že nekaj let pri zdravljenju hepatitisa. Prve poskuse v sredini sedemdesetih let, kjer so uporabljali levkocitni interferon, proizveden iz celic iz rumenkasto bele plasti kože, sestavljene iz levkocitov, so opustili po produkciji plazme iz darovane krvi in to je neizogibno omejilo razpoložljivo količino. V začetku osemdesetih let so napredki v proizvodnih tehnikah pripeljali do uporabe tako naravnega kot tudi rekombinantnega humanega interferona a oz. zdravljenja kroničnega hepatitisa B. Medtem kot zdravljenje lahko smatramo kot uspešno v mnogih primerih, pa so odzivne vrednosti pri zdravljenju samo s humanimi interferoni a, sodeč po trajni izgubi virusnih markerjev, na splošno ocenjene, da so manjše kot 50 %. Humana interferona β in δ so tudi raziskali za uporabo pri kroničnem hepatitisu B, vendar se zdravljenja niso uveljavila.

Vsi trije tipi humanega interferona so bili raziskani tudi v terapiji kroničnega hepatitisa C, čeprav je majhna razpoložljivost interferona β omejila delo s tem tipom interferona. Precej obširne poskuse so izvedli z uporabo a interferonov, na katere se sklicujemo zgoraj (Interferon a-2a, interferon a-2b in limfoblastoidni interferon) in rezultati so bili vzpodbujajoči v tem, da je do popolnega odziva prišlo pri 40 % pacientov. Vendar so 6 mesecev po zdravljenju ocenili, da se je približno 50 % pacientom vrnilo prvotno stanje, tako da je imelo samo 20 do 25 % pacientov dolgotrajno korist.

Za popolen pregled uporabe interferonov pri zdravljenju hepatitisa, navajamo knjigo Interferon in the Treatment of Chronic Virus Infection of the Liver; Eddleston and Dixon, Pennine Press, 1990.

Poleg tega so bili interferoni namenjeni za uporabo v terapiji številnih drugih stanj, ki vključujejo virusne bolezni, drugačne kot hepatitis, motnje, ki vključujejo imunski sistem, vključno avtoimunska stanja in raznih vrst rakov, vključno renalnega raka, raka dojke, raka debelega črevesa, Kaposijevega sarkoma, glioma in malignih hematoloških stanj.

Glede na dokaze, posebno v zvezi s HIV, navajamo, da kronične virusne infekcije lahko povzročijo oksidativni stres v inficiranem organizmu. Do indukcije oksidativnega stresa z virusi lahko pride zaradi raznih mehanizmov, ki vključujejo aktivacijo fagocitnih celic z imunskimi kompleksi, promocijo tvorbe prostih radikalov s proinflamacijskimi citokini (TNFa, IL6) in generiranje reaktivnih oksigenskih vrst z direktno interakcijo med virusnimi površinskimi glikoproteini in celičnimi membranami.

Znane so številne substance, ki delujejo kot prosti radikalski odstranjevalci na nivoju celice ali celotnega organizma. Npr. reduciran glutation je široko porazdeljen neproteinski tiol, prisoten v večini celic sesalca, ki je vključen v razne metabolične funkcije, ki vključujejo detoksifikacijske reakcije za proste radikale. Glutation je glavni intracelični obrambni mehanizem proti oksidativnemu stresu in faktorji, ki povečujejo tvorbo prostih radikalov, vodijo do porabe intraceličnih glutationskih zalog. Glutation ima tudi imunoregulacijsko vlogo pri moduliranju limfocitne aktivacije in proliferacije, citotoksičnosti T celic in makrofagnih-limfocitnih interakcij.

N-acetil cistein je znan že mnogo let kot mukolitik, kornealno zdravilo in kot antidot za acetaminofensko zastrupitev. Spojina ima relativno blag redukcijski učinek in smatrajo, da deluje mukolitično pri cepljenju disulfidnih vezi v mukoproteinih. V številnih poročilih je navedeno, da je reducirane glutationske nivoje možno znižati v nekaterih kroničnih virusnih stanjih, zlasti HIV infekcijah. N-acetil cistein je predhodnik in torej induktor glutationa in je namenjen kot terapevtsko sredstvo za uporabo v primeru HIV infekcije.

EP-A-0 269 017 (Cetus) se nanaša na kombinacijo limfokina ali citotoksina in prostega radikalskega odstranjevalca ali metaboličnega inhibitorja za zdravljenje biološke poškodbe pri gostiteljih sesalcih, povzročenih s prosto radikalsko produkcijo. Čeprav se opis mimogrede nanaša na interferone kot limfokine in tudi omenja infekcije kot možen vzrok za biološko poškodbo, pa se le-ta v bistvu nanaša na proste radikale, ki se lahko generirajo med zdavljenjem raka. Biološki podatki, navedeni v opisu, se v celoti nanašajo na raka in zadevajo v glavnem dajanje TNFa glodalcem s fibrosarkomom.

Predloženi izum se nanaša na uporabo prostega radikalskega odstranjevalca ali njegovega predhodnika ali induktorja kot dodatka k terapiji s humanim interferonom.

Torej v skladu z enim vidikom predloženi izum zagotavlja postopek za zdravljenje pacienta, ki trpi zaradi stanja, dovzetnega za terapijo z interferonom, ki obsega dajanje pacientu učinkovite količine humanega interferona in pri čemer dajemo tudi prosti radikalski odstranjevalec ali njegov predhodnik ali induktor med vsem ali samo delom trajanja dajanja humanega interferona.

V skladu z drugim vidikom, predloženi izum zagotavlja uporabo humanega interferona za izdelavo zdravila za uporabo pri zdravljenju stanja, dovzetnega za terapijo z interferonom, po postopku, kjer dajemo tudi prosti radikalski odstranjevalec ali njegov predhodnik ali induktor med vsem ali samo delom trajanja dajanja humanega interferona.

V skladu z drugim vidikom predloženi izum zagotavlja tudi uporabo prostega radikalskega odstranjevalca ali njegovega predhodnika ali induktorja za izdelavo zdravila za zdravljenje stanja, dovzetnega za terapijo z interferonom, po postopku, ki vključuje dajanje humanega interferona in kjer dajemo tudi prosti radikalski odstran5 jevalec ali njegov predhodnik ali induktor med vsem ali samo delom trajanja dajanja humanega interferona.

Stanje, dovzetno za terapijo z interferonom je lahko katerokoli od stanj za katera so se humani interferoni že uveljavili ali so bili predlagani kot učinkoviti za zdravljenje. Taka stanja vključujejo virusne infekcije, kot npr. virusni hepatitis, infekcije povzročene s humanim papiloma virusom, citomegalovirusom in HIV, nevirusne infekcije, kot npr. tuberkulozo in stanja, kot npr. astmo.

Predloženi izum je posebno uporaben za uporabo humanih interferonov v terapiji hepatitisa. Kot že omenjeno, čeprav je taka terapija precej koristna v mnogih primerih, pa je odzivna stopnja relativno nizka in v primeru hepatitisa C obstaja znatna stopnja vrnitve prvotnega stanja. Torej, obstaja precejšnja potreba po izboljšavah v terapiji hepatitisa s humanim interferonom, ki bi premagale te probleme.

Primeri humenega interferona za uporabo v smislu izuma vključujejo tiste, omenjene pred tem.

V skladu z drugim vidikom predloženi izum zagotavlja postopek za zdravljenje virusne hepatitisne infekcije z dajanjem humanega interferona, kjer dajemo tudi prosti radikalski odstranjevalec ali njegov predhodnik ali induktor med vsem ali samo delom trajanja dajanja humanega interferona.

V skladu z nadaljnjim vidikom, predloženi izum zagotavlja uporabo humanega interferona za izdelavo zdravila za zdravljenje virusne hepatitisne infekcije po postopku, kjer dajemo tudi prosti radikalski odstranjevalec ali njegov predhodnik ali induktor med vsem ali samo delom trajanja dajanja humanega interferona.

V skladu z nadaljnjim vidikom predloženi izum zagotavlja tudi uporabo prostega radikalskega odstranjevalca ali njegovega predhodnika ali induktorja za izdelavo zdravila za zdravljenje virusne hepatitisne infekcije po postopku, ki vključuje dajanje humenega interferona in kjer dajemo tudi prosti radikalski odstranjevalec ali njegov predhodnik ali induktor med vsem ali samo delom trajanja dajanja humanega interferona.

V skladu z nadaljnjim vidikom predloženi izum zagotavlja okrepljene kombinacije, tudi znane kot sinergistične kombinacije, humanega interferona in prostega radikalskega odstranjevalca ali njegovega predhodnika ali induktorja za uporabo pri zdravljenju stanja, dovzetnega za terapijo z interferonom. Aktivne sestavine okrepljenih kombinacij v smislu izuma lahko dajemo sočasno ali zaporedno kot ločene formulacije ali kot posamezno kombinirano formulacijo. Če je dajanje zaporedno, zaostanek v dajanju drugih aktivnih sestavin ne sme biti takšen, da bi izgubili korist okrepljenega terapevtskega učinka kombinacije aktivnih sestavin.

Predloženi izum je uporaben za zdravljenje virusnega hepatitisa v vseh njegovih oblikah petih tipov, ki so sedaj prepoznani in označeni kot hepatitis A, B, C, D oz. E.

Hepatitis A je akutna virusna infekcija z inkubacijsko dobo pod 40 dni, ki se prenaša po fekalno-oralni poti. Virus je član pikoma virusne družine in sestaja iz 27 nm okroglega delca brez ovojnice. Virusni genom ima določeno sekvenco in obsega enojno verižno RNA, ki vsebuje pribl. 7480 baz.

Hepatitis B je univerzalna in serijska bolezen za katero je ocenjeno, da ima v svetu nad 200 nosilcev. Ko je bila znana kot serumski hepatitis, so to bolezen diagnosticirali na osnovi pojava simptomov 2 do 3 mesece po transfuziji krvi, injiciranju frakcij humane plazme ali uporabi nesteriliziranih igel injekcij. Prepoznanje serumskih markerjev za hepatitis B je potrdilo pomembnost kožne penetracije in posebno krvi v prenašanju virusa. Po akutni fazi bolezni je večina odraslih pacientov okrevala spontano v nekaj tednih, vendar pa sorazmeren del pacientov tudi po mnogih mesecih ni odpravil virusa in so postali kronični nosilci. Virus hepatitisa B spada k družini hepadna virusov, katerih genom sestaja iz majhnega nepopolno dvojno verižnega okroglega koščka DNA, ki replicira s kopiranjem svojo DNA v RNA in nato s ponovnim kopiranjem RNA v DNA z reverzno transkriptazo.

Ne-A, ne-B hepatitis je spoznan kot vedno bolj resen mednaroden zdravstven problem. Za vsaj 80 % primerov kroničnega potransfuzijskega ne-A, ne-B hepatitisa je dokazano, da nastane zaradi virusa, sedaj indentificiranega kot hepatitis C in za ta virus lahko smatramo, daje dejanski v vseh primerih postransfuzijskega hepatitisa v kliničnih določitvah, kjer so krvni produkti selekcionirani za hepatitis B.

Medtem, ko se pribl, polovica primerov infekcij akutnega hepatitisa C razreši spontano v nekaj mesecih, pa ostali postanejo kronični in v mnogih, če ne vseh takih primerih, je potencialna posledica kroničnega aktivnega hepatitisa ciroza in hepatocelični karcinom. Struktura virusnega genoma hepatitisa C je bila nedavno pojasnjena in virus je označen kot enojnoverižni RNA virus s podobnostmi flavi virusom.

Virus hepatitisa D je bil prvič prepoznan 1977 leta po identifikaciji novega antigena v določenih nosilcih hepatitisa B. Za virus je potreben hepatitis B (ali bližnji sorodni hepadna virus) kot virus pomočnik za repliciranje, čeprav je replikacija zadosti učinkovita, da lahko doseže višji titer kot virus pomočnik v serumu. Genom hepatitisa D sestaja iz kovalentno zaprte obročne DNA in ima nekatere strukturne podobnosti z določenimi obročnimi viroidi ali virusu podobnimi agensi, ugotovljenimi v rastlinah. Infekcija hepatitisa D je povezana z agresivno boleznijo jeter in jo bolj pogosto ugotovijo v pacientih z resno boleznijo (kronični aktivni hepatitis ali ciroza) kot pri tistih s kronično vztrajnim hepatitisom.

Virus hepatitisa E je soroden z virusom, ki povzroča hepatitis A (Reyes et al., Science 247, 1335-1339 (1990)) in proizvaja akutno obliko hepatitisa brez kronične faze. Virus je enteričen, vodno prenesljiv in se normalno prenaša po fekalni/oralni poti. Posebno je razširjen na indijski podcelini in povzroča visoko stopnjo umrljivosti pri nosečih ženskah.

Predloženi izum je uporaben tudi za zdravljenje humanega papiloma virusa, ki je agens, odgovoren za negenitalne bradavice, juvenilni laringalni papilom, rtaste bradavice in je vpleten v cervikalnem raku. Predloženi izum je uporaben tudi za zdravljenje drugih virusnih infekcij, kot npr. tistih, povzročenih s humanim citomegalovirusom in HIV. Predloženi izum je tudi uporaben za zdravljenje nevirusnih infekcij, kot npr. tuberkuloze in stanj, kot npr. astme.

Humani interferon za uporabo v smislu izuma je lahko katerikoli od zgoraj navedenih treh tipov, npr. interferon a, interferon β ali interferon γ . Na splošno je humani interferon interferon a ali interferon γ. Prednosten humani interferon je humani interferon a, bolj prednostno humani interferon a, izveden iz humane celične linije v kulturi ali rekombinantni humani interferon cc. V skladu z eno prednostno izvedbo je humani interferon rekombinantni interferon a-2a ali interferon a-2b, npr. eden od produktov, ki jih prodajajo pod blagovnima znamkama ROFERON in INTRON. V skladu z drugo posebno prednostno izvedbo je humani interferon humani limfoblastoidni interferon (interferon α-Nl), npr. produkt, ki ga izdeluje The Wellcome Foundation Ltd. pod blagovno znamko WELLFERON.

Izraz humani interferon je predviden, da vključuje katerikoli interferon divjega tipa, katerega sekvenca je bila določena za človeka, in katerokoli njegovo alelo, varianto ali mutanto, ki v bistvu ohrani aktivnost ustrezne sekvence divjega tipa in, ki ima več kot 80 % sekvenčno homologijo z ustrezno sekvenco divjega tipa.

Humane interferone lahko formuliramo za dajanje v smislu izuma na enak način kot za uporabo samo pri zdravljenju omenjenega stanja, npr. hepatitisa. Torej interferon na splošno dajemo parenteralno, npr. z injekcijo, prednostno subkutano injekcijo. Prednostno je interferon formuliran kot vodni pripravek ali kot liofiliziran produkt, narejen za rekonstitucijo s prikladnim nosilcem, npr. vodo za injekcijo. Formulacija lahko vsebuje tudi prikladno razredčilo za nosilec ali stabilizator, npr. drugačen humani protein, kot npr. humani serumski albumin.

Humani interferon na splošno dajemo v skladu s predpisi zdravljenja, ki so že uveljavljeni za omenjeni produkt. Npr. humani interferon a, bodisi limfoblastoidni ali rekombinantni, lahko dajemo v dozi od 1 do 10 mega enot interferona na dan. Dozo lahko damo v 3 ali več dneh na teden, prednostno 3x na teden. Prednostno območje doze je 2 do 6 mega enot interferona na dan, v 3 ali več dneh na teden, prednostno 3x na teden, in posebne doze interferona so 5 mega enot ali bolj prednostno 3 mega enote na dan ali 3 ali več dni na teden, prednostno 3x na teden. Pri zdravljenju hepatitisa traja dajanje interferona navadno več tednov, npr. 12 do 30 tednov, posebno približno 24 tednov, čeprav v nekaterih primerih lahko ustrezajo na daljša obdobja zdravljenja do 1 leta ali več.

Kot uporabljamo tukaj, izraz prosti radikalski odstranjevalec ali njegov predhodnik ali induktor, pomeni katerokoli snov, ki je sposobna pri dajanju gostitelju, znižati nivo prostih radikalov (imenovano tudi oksidativni stres) v gostitelju. Snov lahko povzroči znižanje nivoja prostih radikalov z direktnim odstranjevanjem prostih radikalov ali z induciranjem, bodisi kot direktni biološki predhodnik ali s produkcijo v gostitelju snovi, ki ima odstranjevalni učinek za proste radikale. Alternativno, snov lahko zniža nivo prostih radikalov z uveljavljanjem inhibicijskega učinka v procesih, ki vodijo do generiranja prostih radikalov.

Prednostni prosti radikalski odstranjevalci ali njihovi predhodniki ali induktorji vključujejo glutation in njegove predhodnike, kot npr. derivate naravnega aminokislinskega cisteina. Posebno prednosten predhodnik glutationa je N-acetil cistein. Kot je prikazano zgoraj ima N-acetil cistein že ustaljeno farmacevtsko uporabo kot mukolitik in farmacevtski pripravki spojine so tržno dosegljivi. Drugi prosti radikalski odstranjevalci ali njihovi predhodniki ali induktorji vključujejo vitamin A, vitamin C (askorbinska kislina), vitamin E, sečno kislino, butionin sulfoksim, dietilmaleat metronidazol, superoksidno dizmutazo in metionin. Snovi, ki inhibirajo generiranje prostih radikalov, vključujejo inhibitorje ksantinske oksidaze, kot npr. alopurinol in jih smatramo, da so prosti radikalski odstranjevalci ali njihovi predhodniki ali induktorji, kot jih navajamo tukaj.

Prosti radikalski odstranjevalec ali njegov predhodnik ali induktor naj bi dajali v taki obliki in dozi, ki je sposobna zniževanja prostega radikalskega generiranja in/ali blaženja učinkov prostega radikalskega generiranja (oksidativni stres) v gostitelju. Dajanje lahko izvedemo na katerikoli prikladen način, npr. oralno ali parenteralno, odvisno od narave snovi. Oralno dajanje je prednostno, kjer je možno.

N-acetil cistein prednostno formuliramo za oralno dajanje v obliki tablet ali granul ali tekočega pripravka, npr. sirupa. Ustrezna doza N-acetil cisteina je v območju 200 mg do 4 g na dozo za dajanje do 4 x na dan, npr. 400 do 800 mg za dajanje 4 x na dan, prednostno 600 mg za dajanje 4 x na dan.

Čeprav terapija, zagotovljena v skladu s predloženim izumom, npr. za virusni hepatitis, sestaja iz kombiniranega dajanja humanega interferona in prostega radikalskega odstranjevalca ali njegovega predhodnika ali induktorja, dve zdravili na splošno dajemo kot ločene pripravke. Vendar je v nekaterih okoliščinah lahko prednostno, da dajemo dve komponenti kot kombiniran pripravek in izum obsega tudi take kombinirane pripravke.

Torej v skladu z nadaljnjim vidikom predloženi izum zagotavlja farmacevtski sestavek, ki obsega humani interferon skupaj s prostim radikalskim odstranjevalcem ali njegovim predhodnikom ali induktorjem.

Na splošno je katerikoli tak kombiniran pripravek v obliki, namenjeni za parenteralno dajanje, npr. z injekcijo. Tak kombiniran pripravek je lahko v tekoči obliki ali v trdni obliki z liofiliziranim humanim interferonom, prikladni za rekonstitucijo v tekočo obliko.

Primerno je tudi, da nudimo dve zdravili skupaj v prikladni obliki za ločeno dajanje. V skladu z drugim vidikom izum zagotavlja dvojni zavojček, ki vsebuje, v zvezi z ločenim dajanjem, humani interferon in prosti radikalski odstranjevalec ali njegov predhodnik ali induktor.

Predloženi izum je posebno uporaben v terapiji hepatitisa B ali hepatitisa C. Kot je navedeno zgoraj, je dajanje humanega interferona, posebno rekominantnega ali limfoblastoidnega interferona a že ustaljena terapija za hepatitis B. Poleg tega je iz številnih poskusov razvidno, da je enaka terapija tudi precej koristna pri zdravljenju hepatitisa C. V skladu s predloženim izumom, terapijo pacientov, ki trpijo zaradi hepatitisa in posebno hepatitisa B ali hepatitisa C, z interferonom izvedemo v bistvu v skladu z uvedenimi predpisi, z dodatnim zdravljenjem s prostim radikalskim odstranjevalcem ali njegovim predhodnikom ali induktorjem med vsem ali samo delom trajanja terapije s humanim interferonom.

Nivoji serumske alaninske aminotransferaze (ALT) so visoko senzitivni markerji za jetrno disfunkcijo. Obe infekciji, hepatitis B in hepatitis C sta označeni s povišanimi ALT nivoji in napredovanje bolezni na splošno nadzorjujemo z določanjem serumske ALT. Kot je navedeno zgoraj, se samo približno 50 % ali manj pacientov s hepatitisom B ali hepatitisom C odziva na zdravljenje s humanim interferonom a, kot je dokazano z znatnim čiščenjem virusnih markerjev ali znižanjem ALT nivojev.

V skladu z eno izvedbo izuma, kije posebno uporabna za zdravljenje hepatitisa B ali hepatitisa C, bolj posebno hepatitisa C, zdravljenje s humanim interferonom, posebno humanim interferonom a, izvedemo na običajen način v obdobju nekaj tednov, npr. 12 do 30 tednov in posebno približno 24 tednov. Za paciente, ki se ne morejo odzvati na začetni potek zdravljenja s humanim interferonom, kar dokazujejo znižani nivoji serumske ALT, nadaljujemo zdravljenje s humanim interferonom in z dodatnim zdravljenjem s prostim radikalskim odstranjevalcem ali njejgovim predhodnikom ali induktorjem, prednostno glutationom ali njegovim predhodnikom ali induktorjem, najbolj prednostno z N-acetil cisteinom. Zdravljenje s humanim interferonom in prostim radikalskim odstranjevalcem ali njegovim predhodnikom ali induktorjem lahko nadaljujemo nadaljnje obdobje nekaj tednov, npr. 12 do 30 tednov in posebno približno 24 tednov. V skladu s prednostno izvedbo izuma je ta predpis zdravljenja uporaben za zdravljenje hepatitisa C s humanim limfoblastoidnim interferonom (humani interferon a-Nl).

Kot je tudi prikazano zgoraj, se določeni pacienti s hepatitisom B ali hepatitisom C lahko na začetku odzovejo na zdravljenje s humanim interferonom, posebno humanim interferonom a, vendar se jim kasneje lahko stanje vrne v prvotno. Za takšne paciente je lahko koristen kombiniran potek zdravljenja s humanim interferonom in prostim radikalskim odstranjevalcem ali njegovim predhodnikom ali induktorjem kot je navedeno zgoraj.

Razumljivo je, da doze humanega interferona in prostega radikalskega odstranjevalca ali njegovega predhodnika ali induktorja variirajo, odvisno od pacienta in preciznosti stanja zaradi katerega pacient trpi. Končno, zdravljenje kontrolira spremljajoči zdravnik in zanj odgovarja.

Predloženi izum je nadalje ponazorjen z naslednjo pilotno študijo, ki naj ne bi na noben način omejevala obsega izuma.

PRIMER

1. Uvod

Virus hepatitisa C (HCV) je odgovoren za večino primerov postransfuzijskega in sporadičnega ne-A, ne-B hepatitisa. Nastajanje kroničnosti infekcije je zelo običajna in vodi do kroničnega hepatitisa, ciroze in končno maligne degeneracije. Iz raznih kontrolnih študij je razvidno, da je a interferon (IFN) koristen pri zdravljenju kroničnega hepatitisa C (CHC), vendar so odzivne vrednosti v povprečju 50 % in frekvenca vrnitev v protno stanje po ukinitvi IFN lahko doseže 30-40 %. Skladno je sorazmerni del pacientov s CHC, ki vzdržujejo normalne transaminazne nivoje po ukinitvi IFN, samo približno 20-40 % vseh zdravljenih primerov.

Reduciran glutation (GSH) je pomemben antioksidant v celicah sesalcev, ki je vključen v velik izbor celičnih funkcij in smatramo, da ima lahko deplecija GSH patogensko vlogo v nekaterih kroničnih virusnih boleznih, kot npr. AIDS-u. V tem študiju smo GSH nivoje izmerili v plazmi in v perifernih krvnih mononuklearnih celicah (PBMC) od pacientov s CHC, ki se niso mogli odzvati IFN terapiji po najmanj 4 mesecih zdravljenja. Učinek N-acetil cisteina, prekurzorja tiola, smo tudi določili na GSH nivojih ter pri kliničnem in virološkem odzivu na IFN terapijo.

2. Pacienti in postopki

2.1 Pacienti pacientov (13 moških in 1 ženska, povprečna starost 51 let, območje 27-71), diagnosticiranih, da trpijo zaradi CHC po histoloških in seroloških kriterijih, dva od njih z združeno cirozo, je sodelovalo pri študiju. Vse paciente smo zdravili z α-limfoblastoidnim interferonom (Wellferon) minimalno obdobje 4 mesece (15 ±1,6 MU na teden, območje 9-21 MU na teden); pri vseh pacientih so bile vidne nenormalne ALT vrednosti (nad 30 IU/L) pri vključitvi v študij. Večini pacientov s CHC, odzivajočih na IFN so se transaminazni nivoji normalizirali v prvih 3 mesecih terapije in tiste, ki so vztrajali z visokimi ALT vrednostmi po 4 mesecih zdravljenja, lahko smatramo za neodzivne. Torej smo za vse paciente v tem študiju smatrali, da so neodzivni na IFN. Pacienti so v temu študiju nadaljevali v bistvu z enakim IFN režimom, kot so ga imeli prej, le z oralnim dodajanjem N-acetil cisteina (NAC), 600 mg, vsakih 8 ur na dan. Nobenemu pacientu nismo povečali doziranje interferona po dodatku oralnega NAC, čeprav se je v treh primerih količina interferona rahlo znižala (15 ± 1,8 MU/teden pred NAC proti 11,5 ± 1,3 MU/teden po NAC.

Poleg tega je 10 pacientov (8 moških in 2 ženski, povprečna starost 32 let, območje 24-63), z nedavno določitvijo bolezni, da trpijo zaradi kroničnega hepatitisa C, ki niso nikoli prejemali antivirusnega zdravljenja, prejelo enako količino oralnega NAC, vendar brez interferona, v obdobju 1 meseca.

zdravih oseb (14 moških in 12 žensk, povprečna starost 43 let, območje od 25 do 79) je bilo za kontrolno skupino. Vsi pacienti so dali pismeno privoljenje in Študij je bil odobren od krajevnega etičnega odbora.

2.2 Določitev GSH v PBMC in plazmi

Od vsakega pacienta smo dobili vzorce krvi za simultane določitve GSH v PBMC (L-GSH) in v plazmi, revni s ploščicami (P-GSH). PBMC smo izolirali s centrifugiranjem na limfoprepu (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norveška) in petkrat izprali. Izolirane celice smo ubili z 20 % perklorovo kislino (2 % končna koncentracija) in po centrifugiranju (1200 g, 10 minut pri 4°C) supernatante shranili pri -40°C do uporabe. 20 % perklorovo kislino smo dodali k plazmam revnim s ploščicami (2 % končna koncentracija) in po centrifugiranju supernatante hranili pri -40°C do določitve GSH.

Shranjene vzorce smo odtajali in GSH določili po encimatskem postopku, ki so ga opisali Brigellus et al., Biochem Pharmacol., 32, 2529-2534 (1983) in kot so ga modificirali Ferrer et al., Biocehm. J. 264, 531-534 (1990). GSH v prisotnosti GSHS-transferaze smo konjugirali z l-kloro-2,4-dinitrobenzenom (CDNB)(SIGMA) in izmerili absorbanco kompleksa pri 340 nm z uporabo Perkin-Elmerjevega Lambda 2 spektrofotometra. Absolutne vrednosti GSH smo dobili z uporabo molskega ekstinkcijskega koeficienta 9,6 χ 10³.

2.3 Ekstrakcija RNA in RT-PCR

Polimerazna verižna reakcija z reverzno transkripcijo (RT-PCR) za HCV-RNA v serumu in tako za pozitivne kot tudi za negativne verige HCV-RNA v PBMC smo izvedli v bistvu tako, kot opisujejo Ruiz et al., Hepatology, 16, 637-643 (1992) in Cheng et al., J. Hepatol., v tisku (1992). Striktno smo uporabili postopke, ki jih priporočata

Kwoks in Higuchi, Nature, 339, 237-238 (1989), za znižanje tveganja kontaminacij. Vse ekstrakcije in reakcije smo izvedli simultano v pozitivnih in negativnih kontrolah. Alikvot od zadnjega izpiranja PBMC smo tudi vključili in PCR je bila vedno negativna v teh vzorcih.

2.4 Statistična analiza

Vsi podatki so predloženi kot srednje vrednosti ± standardna napaka srednje vrednosti (SEM). Primerjave za parne in neparne podatke izvedemo z uporabo Mann Whitneyjevih in Wilcoxonovih testov.

3. Slike

Rezultati so opisani s sklicevanjem na spremljajoče risbe, pri čemer:

slika 1 prikazuje učinek IFN (-4 do 0 mesecev) in IFN plus NAC (0 do 6 mesecev) na ALT nivoje za 14 pacientov, ki so sodelovali v študiju;

slika 2 prikazuje detekcijo v PBMC-jih pozitivnih in negativnih verig HCV-RNA med zdravljenjem z IFN in z IFN plus NAC;

slika 3 prikazuje detekcijo HCV-RNA v serumu pri serumski razredčitvi 1:10 tako pred kot tudi po dodatku NAC k zdravljenju z IFN;

slika 4 prikazuje ALT nivoje v pacientih, opisanih v sliki 1 zgoraj, ki so se odzvali 11 mesecev po začetku terapije z IFN plus NAC.

4. Rezultati

Srednje vrednosti serumskih ALT nivojev za 14 pacientov, ki so sodelovali v študiju, so razvidne iz naslednje tabele, ki prikazuje tudi L-GSH in P-GSH.

TABELA

Mesec	Srednja vrednost ALT (IU/L)	L-GSH (nmol/lo6 celic)	P-GSH (μΜ)
-4	139 ± 24	-	-
0	124 ± 24	1,45 ± 0,27	0,77 ± 0,21
+ 1-2	87 ±9	-	-
+3-4	53 ± 7	3,32 ± 0,18	2,40 ± 0,20
+5-6	37 ± 3

Vrednosti za L-GSH in P-GSH za kontrolno skupino so naslednje:

L-GSH 3,43 ± 0,89 nmol/10⁶ celic

P-GSH 18,1 ± 4,08 μΜ

V pacientih s kroničnim hepatitisom C, ki niso nikoli prejeli antivirusnega zdravljenja (n = 10), pride do resnega padca GSH nivojev v plazmi (0,63 ± 0,07 μΜ) in v PBMC (1,02 ± 0,09 nmol/10⁶ celic) v primerjavi z zdravimi kontrolami (18,1 ± 4,08 μΜ oz. 3,43 ± 0,89 nmol/10⁶ celic, P < 0,01). Dajanje NAC en mesec precej poviša nivoje GSH v PBMC (2,22 ± 0,38 nmol/10⁶ celic, P < 0,05) vendar GSH v plazmah ni znatno modificiran (0,99 ± 0,22 μΜ, n.s.). Poleg tega se tudi nivoji serumske ALT (128 ± 32 IU/L proti 110 ± 29 IU/L po enem mesecu terapije z NAC) znatno ne spremenijo.

V pacientih, ki se ne odzivajo na interferon, pride tudi do precejšnjega znižanja nivojev GSH v PBMC (1,45 ± 0,27 nmol/10⁶ celic) in v plazmi (0,77 ± 0,21 μΜ) v primerjavi s kontrolnimi vrednosti (p < 0,01). V teh pacientih je posledica dajanja NAC skupaj z interferonom, v obdobju 3-4 mesece, precejšen dvig GSH v mononuklearnih celicah (3,32 ± 0,18 nmol/10⁶ celic, p < 0,05) in v plazmi (2,40 ± 0,20 μΜ, p < 0,05).

Iz slike 1 in zgornje tabele je razvidno, da se pri pacientih, ki sodelujejo v študiju (neodzivni na interferon), ALT nivoji niso pomembno spremenili med 4 mesečno IFN terapijo (139 ± 24 proti 124 ± 17 IU/L, n.s.). Vendar je posledica dodatka oralnega NAC takojšen in pomemben padec ALT; celo samo po enem mesecu kombiniranega zdravljenja so ALT vrednosti pomembno padle ( 87 ± 9 IU/L, p < 0,05). Razen tega s kontinuiranim dajanjem IFN in NAC v obdobju 5-6 mesecev proizvedemo nadaljnje pojemanje ALT vrednosti v vseh primerih (37 ± 4 IU/L), pri čemer dosežemo normalne vrednosti v 41 % primerov in skoraj normalne vrednosti (maksimum 56 IU/L v enem primeru) v ostalih primerih. Dodatek NAC k IFN režimu jasno izboljša odziv na IFN pri pacientih, ki smo jih pred tem razvrstili kot neodzivne na IFN terapijo. Kot je razvidno iz slike 4, se to pojemanje ALT vrednosti nadaljuje do najbolj svežih analiz pacientov, 11 mesecev po začetku kombinirane terapije.

Znižanje ALT nivojev s kombinacijo IFN in NAC spremlja skupen učinek na replikacijo virusa. V primeru 9 pacientov, razvrščenih kot neodzivni na IFN, testiramo PBMC na prisotnost tako genomske verige HCV (pozitivna RNA veriga) kot tudi replikativnega intermediata virusa (negativna RNA veriga), pred in po dodatku NAC k terapiji. Kot je razvidno iz slike 2, v primeru, da paciente zdravimo samo z IFN, genomsko verigo lahko detektiramo v 7 primerih (77 %), medtem ko replikativni intermediat detektiramo v 3 pacientih (33 %). Vendar po 4-6 mesecih kombinirane terapije z IFN in NAC pozitivno verigo detektiramo samo v 2 primerih (22 %), negativno HCV-RNA verigo pa ni možno detektirati v nobenem primeru.

Dodatek NAC k IFN režimu spremljajo tudi znižani nivoji HCV-RNA v serumu. Kot je razvidno iz slike 3, je po dodatku NAC k terapiji potrebna povečana koncentracija seruma za HCV detekcijo; torej pred dodatkom NAC lahko HCV-RNA detektiramo v 100 % primerov z uporabo serumske razredčitve 1:10, medtem kot po dodatku NAC k terapiji, pri enaki serumski razredčitvi, virus detektiramo samo v 70 % pacientov.

Za

The Wellcome Foundation Limited:

PATENTNA PISARNA

Claims (30)

1. PATENTNI ZAHTEVKI

   1. Okrepljena kombinacija, označena s tem, da obsega humani interferon in prosti radikalski odstranjevalec ali njegov predhodnik ali induktor.
2. 2. Kombinacija po zahtevku 1, označena s tem, da je humani interferon humani interferon a.
3. 3. Kombinacija po zahtevku 2, označena s tem, da je humani interferon a rekombinanten.
4. 4. Kombinacija po zahtevku 2, označena s tem, da je humani interferon a naraven.
5. 5. Kombinacija po zahtevku 4, označena s tem, da je naravni humani interferon a humani limfoblastoidni interferon.
6. 6. Kombinacija po kateremkoli od zahtevkov 1 do 5, označena s tem, daje prosti radikalski odstranjevalec ali njegov predhodnik ali induktor glutation ali njegov predhodnik ali induktor.
7. 7. Kombinacija po kateremkoli od zahtevkov 1 do 5, označena s tem, da je prosti radikalski odstranjevalec ali njegov predhodnik ali induktor N-acetil cistein.
8. 8. Kombinacija po kateremkoli od zahtevkov 1 do 7, označena s tem, da je uporabna pri zdravljenju stanja, dovzetnega za terapijo z interferonom.
9. 9. Kombinacija po zahtevku 8, označena s tem, da je stanje hepatitis B ali hepatitis C infekcija.
10. 10. Uporaba humanega interferona za izdelavo zdravila za uporabo pri zdravljenju pacienta, ki trpi zaradi stanja, dovzetnega za terapijo s humanim interferonom, po postopku, kjer dajemo tudi prosti radikalski odstranjevalec ali njegov predhodnik ali induktor med zdravljenjem s humanim interferonom.
11. 11. Uporaba prostega radikalskega odstranjevalca in njegovega predhodnika ali induktorja za izdelavo zdravila za zdravljenje pacienta, ki trpi zaradi stanja, dovzetnega za terapijo s humanim interferonom, po postopku, ki vključuje zdravljenje s humanim interferonom in prostim radikalskim odstranjevalcem ali njegovim predhodnikom ali induktorjem.
12. 12. Uporaba po zahtevku 10 ali 11, označena s tem, da je humani interferon humani interferon a.
13. 13. Uporaba po zahtevku 12, označena s tem, da je humani interferon a rekombinanten.
14. 14. Uporaba po zahtevku 12, označena s tem, daje humani interferon a naraven.
15. 15. Uporaba po zahtevku 14, označena s tem, da je naravni humani interferon a humani limfoblastoidni interferon.
16. 16. Uporaba po kateremkoli od zahtevkov 10 do 15, označena s tem, da je prosti radikalski odstranjevalec ali njegov predhodnik ali induktor glutation ali njegov predhodnik ali induktor.
17. 17. Uporaba po kateremkoli od zahtevkov 10 do 15, označena s tem, da je prosti radikalski odstranjevalec ali njegov predhodnik ali induktor N-acetil cistein.
18. 18. Uporaba po kateremkoli od zahtevkov 10 do 17, označena s tem, daje stanje hepatitis B ali hepatitis C infekcija.
19. 19. Uporaba humanega interferona za izdelavo zdravila za uporabo pri zdravljenju pacienta, ki trpi zaradi stanja, dovzetnega za terapijo s humanim interferonom, ki se ne more odzvati na zdravljenje s humanim interferonom, po postopku, kjer dajemo tudi prosti radikalski odstranjevalec ali njegov predhodnik ali induktor med zdravljenjem s humanim interferonom.
20. 20. Uporaba prostega radikalskega odstranjevalca ali njegovega predhodnika ali induktorja za izdelavo zdravila za zdravljenje pacienta, ki trpi zaradi stanja, dovzetnega za terapijo s humanim interferonom, ki se ne more odzvati na zdravljenje s humanim interferonom, po postopku, ki vključuje zdravljenje s humanim interferonom in prostim radikalskim odstranjevalcem ali njegovim predhodnikom ali in19 duktorjem.
21. 21. Uporaba po enem od zahtevkov 19 in 20, označena s tem, da se je pacient pred tem odzval na zdravljenje s humanim interferonom.
22. 22. Uporaba po kateremkoli od zahtevkov 19 do 21, označena s tem, da je humani interferon humani interferon a.
23. 23. Uporaba po zahtevku 22, označena s tem, da je humani interferon a rekombinanten.
24. 24. Uporaba po zahtevku 22, označena s tem, da je humani interferon a naraven.
25. 25. Uporaba po zahtevku 24, označena s tem, daje naravni humani interferon a humani limfoblastoidni interferon.
26. 26. Uporaba po kateremkoli od zahtevkov 19 do 25, označena s tem, da je prosti radikalski odstranjevalec ali njegov predhodnik ali induktor glutation ali njegov predhodnik ali induktor.
27. 27. Uporaba po kateremkoli od zahtevkov 19 do 25, označena s tem, da je prosti radikalski odstranjevalec ali njegov predhodnik ali induktor N-acetil cistein.
28. 28. Uporaba po kateremkoli od zahtevkov 19 do 27, označena s tem, da je stanje hepatitis B ali hepatitis C infekcija.
29. 29. Farmacevtska formulacija, označena s tem, da obsega kombinacijo kot je opisana v kateremkoli od zahtevkov 1 do 7 in farmacevtsko sprejemljiv nosilec.
30. 30. Dvojni zavojček, označen s tem, da obsega združene komponente, potrebne za dajanje, zato da proizvedejo kombinacijo kot je opisana v kateremkoli od zahtevkov 1 do 7.