ITMI960819A1

ITMI960819A1 - Disaccaridi di antracicline antitumorali.

Info

Publication number: ITMI960819A1
Application number: IT96MI000819A
Authority: IT
Inventors: Anna Luisa Colombo; Giovanni Rivola; Lorena Luisa Fedeli; Solari Augusto Inventi; Andrea Pavesi; Marina Ripamonti
Original assignee: Mini Ricerca Scient Tecnolog
Priority date: 1996-04-24
Filing date: 1996-04-24
Publication date: 1997-10-24
Also published as: JP3971801B2; ITMI960819A0; GB2328688B; WO1997040057A1; IT1282379B1; GB2328688A; DE19781703B4; DE19781703T1; JP2000508546A; GB9823306D0; GB2328688A8

Description

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda nuovi disaccaridi di antracicline antitumorali, la loro produzione e le preparazioni farmaceutiche che le contengono. Queste antracicline sono utili quali agenti antitumorali e sono attive contro batteri granipositivi e gram negativi.

I composti oggetto della presente invenzione hanno la formula sotto riportata:

dove R rappresenta:

( I ) COCH3 4'-O-vancosaminil daunomicina (II) -vancosaminil 13-diidro daunomicina,

(III) -vancosaminil doxorubicina.

Il disaccaride della antraciclina (I)/ dove R = COCH3, può essere preparato mediante un processo microbiologico il quale prevede la fermentazione della coltura di Streptomyces sp., individuata presso la nostra banca ceppi con il numero 15105, e depositato il 20.3.96 presso il DSMZ col numero 10632 in condizioni aerobiche in un substrato liquido contenente sorgenti assimilabili di azoto, carbonio e sali minerali.

(I) è ottenuto dalla brodocoltura stessa in accordo con quanto descritto nella presente invenzione.

Il composto con formula (I) dove può essere convertito negli altri composti con formula (II) dove e (III) dove

mediante appropriate reazioni chimiche.

CARATTERISTICHE DEL MICROORGANISMO

Caratteristiche microscopiche

Il micelio vegetativo è formato da ife ramificate di lunghezza variabile e del diametro di 0.5-0.9 micron; il micelio aereo che si origina dal precedente è formato da ife lunghe e flessuose spesso collassate e contorte del diametro di 0,9-1,2 micron.

La sporulazione è molto scarsa, in corte catene terminanti ad uncino. Le spore sono ovali e della dimensione di: 0,8-1,1 x 1,9-2,2 micron. Ad una osservazione al microscopio elettronico a scansione le spore appaiono con una superficie liscia.

Caratteristica macroscopiche,

Le caratteristiche colturali del ceppo 15105 sono riportate nella tabella 1. La crescita è generalmente buona su terreni organici e sintetici. L'osservazione della crescita sui terreni è stata valutata dopo 14 giorni di incubazione a 28°C.

TABELLA 1

Le caratteristiche biochimiche e fisiologiche del ceppo 15105 sono riportate nelle tabelle 2 e 3.

Non è stata osservata crescita a temperatura superiore a 40°C.

Identificazione e classificazione del ceppo 15105

Tutte le caratteristiche mostrate dal ceppo 15105 corrispondono chiaramente a quelle riportate per il genere Streptomyces da Waksman e Henrici.

TABELLA 2

Caratteristiche biochimiche del ceppo 15105

TABELLA 2 (segue.)

= reazione positiva

- = reazione negativa

Il terreno utilizzato per il saggio è stato Yeast nitrogen base (Difco) con aggiunta di K2HPO41%.

TABELLA 3

Caratteristiche biochimiche del ceppo 15105

— reazione positiva

- = reazione negativa

Il terreno utilizzato per la crescita del ceppo è stato ISP3 (Difco). Per la determinazione dell'attività enzimatica è stata utilizzata una sospensione del micelio in acqua.

Fermentazione

La fermentazione può essere condotta in fase liquida agitata ad una temperatura compresa tra i 25‘Ce i 33 "C per tempi variabili tra i 4 e i 7 giorni. Il terreno di coltura può essere costituito da fonti di carbonio, azoto e sali minerali. Le fonti di carbonio possono essere amido, destrina, glucosio, glicerina, mannitolo e maltosio; le fonti di azoto possono essere cornsteep liquor, farina di soia, lievito secco, peptone e caseina. Buoni risultati si ottengono anche usando sali di ammonio come l’ammonio nitrato e l'ammonio solfato. I sali minerali utilizzati per la produzione possono variare in funzione del mezzo di coltura. In un terreno di coltura complesso, contenente diversi tipi di farine o residui di fermentazione, può essere utile aggiungere del calcio carbonato o del fosfato di calcio. La fermentazione può essere condotta in beuta e in fermentatori di diversa capacità.

Metodi analitici

Quando gli estratti dai brodi di fermentazione, i grezzi, le frazioni da colonne cromatografiche ed i campioni provenienti da reazioni chimiche vengono esaminati in cromatografia su strato sottile (TLC lastre 60-F-254 Merck), sviluppate in una miscela di cloroformiomietanolo:acido acetico:acqua 80:20:14:6, i composti (I), (II) e(III) presentano rispettivamente Rf cromatografici di 0,25, 0,15 e 0,12.

Quando campioni ottenuti da una blanda idrolisi acida di (I), (II) e (III) vengono esaminati in TLC usando lo stesso eluente compaiono macchie rosse con Rf cromatografici di 0,5, 0,4 e 0,35 identici a quelli rispettivamente della daunomicina (IV), 13-diidro daunomicina (V) e doxorubicina (VI).

Il residuo acquoso esaminato in TLC mediante sviluppo in una miscela di n-propanolo:acqua:etile acetato:ammoniaca 30% (70:30:10:10) e rivelazione con acido solforico presenta una macchia con Rf 0,55 identico a quella della vancosamina (VII). Quando estratti organici ottenuti da una drastica idrolisi acida di (I), (II) e (III) vengono esaminati in TLC usando come eluente una miscela di cloroformio:acetone 4:1 compaiono macchie rosse con Rf cromatografici di 0,5, 0,11 e 0,15 identici rispetivmente a quelli del daunomicinone (Vili), 13-diidro daunomicinone (IX) ed adriamicinone (X). Nel residuo acquoso esaminato in TLC, come descritto sopra, si evidenzia la presenza di daunosamina (XI) con Rf 0,45 e di vancosamina.

Il contenuto totale di componenti antraciclinici viene determinato spettrofotometricamente a 495 nm utilizzando come riferimento l'estinzione specifica della daunomicina.

Ottenimento di un grezzo da fermentazione

Al termine del processo di fermentazione, il nuovo composto (I) è principalmente contenuto nel brodo filtrato il quale può essere estratto in ambiente alcalino con un solvente immiscibile in acqua, come ad esempio n-butanolo. Dalla fase organica può venire riestratto in acqua acida dalla quale, dopo concentrazione in presenza di alcoli ad esempio n-propanolo, per aggiunta di un solvente poco polare, ad esempio n-esano, si ottiene un precipitato rosso grezzo contenente il composto (I) insieme ad altre antracicline glicosidate.

Processi di purificazione

La purificazione del grezzo di fermentazione, contenente il composto (I) e dei composti (II) e (III) ottenuti dalle successive trasformazioni chimiche di (I), può avvenire mediante l'impiego di colonne cromatografiche a fase inversa, come ad esempio le Lichroprep RP-(8) (Merck). Soluzioni acquose contenenti i prodotti da purificare possono essere cromatografate usando come eluente miscele di acqua e solventi organici come ad esempio acetonitrile acidificate con acidi quale l'acido trifluoro acetico. Le frazioni raccolte dalle colonne, riunite e concentrate possono essere liofilizzate.

Secondo questi procedimenti sono stati ottenuti campioni puri dei nuovi disaccaridi antrachinonici 4'-O-vancosaminili daunomicina (I), 4'-0-vancosaminil 13-diidro daunomicina (II) e 4'-O-vancosamini1 doxorubicina (III) oggetti della presente invenzione.

Proprietà chimico-fisiche di (I). (II). (Ili)

I nuovi composti (I), (II) e (III) ottenuti come liofili rossi in forma di sali trifluoro acetato sono solubili in acqua, diossano ed alcoli, ma insolubili in cloroformio, etere etilico e nesano.

Le proprietà chimico fisiche sono riassunte nelle tabelle 4 e 5.

FORMULA C34H42°12N12 C34H44°12N2 TABELLA 5

*Intercambiabili

Chemical shift sono espressi come valore (ppm) con riferimento a tetrametilsilano.

Delucidazione della struttura

Mediante blanda idrolisi acida di (I), (II) e (III) si ottengono rispettivamente daunomicina (IV), 13-diidro daunomicina (V), doxorubicina (VI) e vancosamina (VII).

Mediante drastica idrolisi acida di (I), (II) e (III) si ottengono gli agliconi rossi rispettivamente daunomicinone (Vili), 13-diidro daunomicinone {IX), adriamicinone {X), daunosamina (XI) e vancosamina (VII).

Sulla base dei prodotti ottenuti dalla degradazione e dei dati spettroscopici siamo arrivati alla conclusione che i composti (I), (II) e (III) sono nuovi disaccaridi delle note antracicline rispettivamente daunomicina, 13-diidro daunomicina e doxorubicina aventi legati in posizione 4* l'amino zucchero vancosamina.

Le strutture chimiche proposte nella presente invenzione sono riportate nello schema 1.

Attività Biologica

a) Attività antibatterica

La minima concentrazione inibente (MIC) della 4'-θvancosaminil daunomicina (I) è stata determinata per alcuni microorganismi utilizzando il metodo delle diluizioni scalari in agar ed è riportata in Tabella 6

TABELLA 6

Attività antibatterica della 4 1 -O-vancosaminil daunomicina (I) .

b) Attività antitumorale

L'attività citotossica della 41—O-vancosaminil daunomicina (I) è stata saggiata in vitro su cellule cresciute LoVo, sensibili o resistenti alla doxorubicina (LoVo/Dxr) ed è mostrata in Tabella 7.

TABELLA 7

Cellule LoVo/Dxr

Saggio della colonia: 4 ore di trattamento

IC50 = concentrazione inibente il 50% della 10 formazione della colonia E.S. {errore standard);

I.R. = indice di resistenza: rapporto tra IC50

LoVo/Dx e IC50 LoVo.

L'attività antileucemica della 4'-0-15 vancosaminil daunomicina (I) è stata saggiata in vivo su leucemia ascitica murine da L1210, come mostrata in Tabella 8.

TABELLA 8

Attività antileucemica della 4'-O-vancosaminil daunomicina (I) su leucemia ascitica murina da L1210.

1 = mg/Kg

2 = Media del tempo di sopravvivenza dei topi trattati/media del tempo di sopravvivenza dei controlli.

3 = Numero di morti per tossicità/numero dei topi trattati.

Il prodotto (I) saggiato in vivo sul topo contro leucemia ascitica murina da L1210 ha mostrato un'attività comparabile con quella della daunorubicina con una più bassa tossicità, come evidenziato in Tabella 8.

I seguenti esempi servono ad illustrare 1'invenzione senza limitarla

ESEMPIO 1

La coltura di Streptomvces ap. 15105 è stata fatta crescere per 12 giorni a 28°C su terreno agarizzato CZY (saccarosio 3%; estratto lievito 0,4%; NaN03 0,3%; K2HP04 0,1%; MgSO4.7H20 0,05%; KC1 0,05%; FeS04.7H20 0,001%; agar 2% H20 deionizzata a 100 mi; pH 6,7; Sterilizzazione a 120 "c per 20 minuti).

Le spore della coltura così ottenuta sono state raccolte e sospese in beuta da 300 mi contenente 30 mi del seguente terreno di coltura: caseina 1%; destrina 2%; cornsteep liquor 1%; <NH4)2S04 0,1%; K2HP04 0,01%; CaC030,5%; H20 deionizzata a 100 mi. Sterilizzazione a 120*C per 20 minuti. Il pH dopo sterilizzazione varia tra 6,8 e 7,0. Le beute inoculate sono state poste ad agitare per 2 giorni a 28°C su un agitatore rotativo a 280 rpm con eccentricità di 7 cm. Un quantitativo pari a 2 mi della coltura sopra descritta è stato inoculato in beuta da 300 mi contenente 30 mi del seguente terreno di coltura: amido 6%; cornsteep liquor 1,8%; estratto lievito 0,1%; NaCl 0,25%; CaC03 0,3%; FeS04.7H20 0,001%; ZnS04.7H20 0,001%; CUS04.5H20 0,001%; H20 deionizzata a 100 mi. Sterilizzazione a 120 "C per 20 minuti. Le beute sono state poste ad incubare per 7 giorni a 28°C su un agitatore rotativo a 280 rpm con eccentricità di 7 cm.

ESEMPIO 2

La brodocoltura (20 litri), ottenuta in accordo con l'Esempio 1, aggiunta di acetonitrile (10 litri) è stata filtrata usando celite. Il filtrato è stato concentrato sotto vuoto (6 litri) ed estratto a pH 8,2 con n-butanolo (2x500 mi). Alla fase organica, contenente il composto (I) con altre antracicline, è stata aggiunta acqua acida per HCl (100 mi pH 2,5) e successivamente etere etilico (2 litri) e n-esano (2 litri). Dopo scuotimento la fase acquosa che si è separata è stata concentrata sotto vuoto con n-propanolo sino a piccolo volume, titolata spettrofotometricamente, aggiunta di 2 equivalenti di HCl metanolico ed un eccesso di nesano sino a provocare la formazione di un precipitato grezzo rosso. Il precipitato è stato raccolto per filtrazione ed essiccato sotto vuoto (mg 600).

Esaminato in TLC conteneva insieme ad altre antracicline glicosidate anche il nuovo composto (I).

ESEMPIO 3

Il precipitato grezzo contenente (I) ottenuto come descritto nell'Esempio 2 è stato sciolto in un piccolo volume di acqua:acetonitrile (9:1) e cromatografato su una colonna Lichroprep RP-8 (310-25 min). L'eluizione è stata condotta con una miscela di acqua:acetonitrile (8:2) corretta a pH 3 con acido trifluoro acetico. Le frazioni raccolte sono state analizzate in TLC, riunite quelle contenenti macchie unitarie e raccolte in una unica frazione la quale è stata concentrata sotto vuoto e liofilizzata.

Sono stati ottenuti 75 mg di un liofilo rosso le cui caratteristiche sono descritte nella Tabella 4 e 5.

Un'aliquota (6 mg) sciolta in diossano (0,5 mi) dopo aggiunta di acido acetico acquoso 0,1N (0,2 mi) è stata scaldata ad 85°C per 1 ora. La miscela di reazione diluita con acqua è stata estratta a pH 8,2 con cloroformio, la fase organica seccata su solfato di sodio è stata concentrata a piccolo volume, titolata ed aggiunta di 1 equivalente di HC1 metanolico. Il precipitato formatosi, raccolto ed essiccato (3 mg), è stato analizzato in TLC ed identificato quale daunomicina (IV) per confronto con un campione autentico. Nella fase acquosa residua era contenuto 11aminozucchero vancosamina (VII) identificato per confronto diretto in TLC con un campione autentico.

Una seconda aliquota (6 mg) è stata sciolta in HCl 0,2 N (2 mi) e scaldata per 1 ora a 100 "C. Il precipitato rosso, raccolto per filtrazione, lavato con acqua, seccato (2 mg) è stato esaminato in TLC ed identificato quale daunomicinone (Vili) per confronto diretto con un campione autentico.

II residuo acquoso esaminato in TLC conteneva due aminozuccheri identificati quali daunosamina (XI) e vancosamina (VII) per confronto diretto con due campioni autentici.

Il prodotto così ottenuto dalla fermentazione è stato identificato quale 4’-0-vaneosamini1 daunomicina (I).

ESEMPIO 4

Un campione di 4*-O-vancosaminil daunomicina (I) pura (8 mg) ottenuto in accordo con l'Esempio 2 è stato sciolto in acqua (0,8 mi), portato a pH 9 con NaHC03 acquoso, aggiunto di NaBH4 (0,6 mg) e tenuto a temperatura ambiente per 5 minuti. Dopo aggiunta di alcune gocce di metanolo e HCl 0,05 N sino a pH 4,5, la soluzione è stata cromatografata su colonna RP-8 come descritto per 1'esempio 3 per ottenere un nuovo prodotto come liofilo rosso le cui caratteristiche sono descritte nella Tabella 4.

Da un'aliquota, sottoposta a blanda idrolisi acida come descritto nell'Esempio 3, sono stati ottenuti ed identificati la 13-diidro daunomicina (V) e la vancosamina (VII) mediante confronto diretto in TLC con campioni autentici.

Da un'aliquota sottoposta a drastica idrolisi acida, come descritto nell'Esempio 3, sono stati identificati il 13-diidro daunomicinone (IX), la daunosamina (XI) e la vancosamina (Vili) mediante confronto in TLC con campioni autentici.

Il nuovo prodotto così ottenuto per trasformazione chimica di (I) è stato identificato quale 4'-O-vancosaminil 13-diidro daunomicina (II).

ESEMPIO 5

Un campione 4'-O-vancosaminil daunomicina (I) (15 mg) è stato sciolto in una miscela di metanolordiossano 1:3 anidri ed aggiunto di etil ortoformato (0,05 mi). Dopo 15 minuti la soluzione è stata raffreddata a 5°C, aggiunta di Br2 (0,15 mi al 5% in CHCI3), HC1 (2,5 M in metanolo 0,02 mi) e tenuta a 4°C per una notte.

Aggiungendo 5 volumi di n-esano è stato ottenuto un precipitato rosso il quale è stato sciolto in acetone (1 mi), HBr acquoso 0#25M {1 mi) e lasciato una notte a 4eC.

Questa soluzione è stata portata a pH 4,3 con NaCOOH 1 M acquoso lasciata in agitazione magnetica a temperatura ambiente per 2 giorni e quindi cromatografata su colonna RP-8, come descritto nell'Esempio 3.

E' stato cosi ottenuto un nuovo prodotto come liofilo rosso (6 mg) le cui caratteristiche sono descritte nella Tabella 4.

Da una aliquota sottoposta a blanda idrolisi acida, come descritto nell’Esempio 3, sono state ottenute ed identificate rispettivamente la doxorubicina e la vancosamina mediante diretto confronto in TLC con campioni autentici.

Da una aliquota sottosposta a drastica idrolisi acida con descritto nell'Esempio 3 sono stati identificati rispettivamente adriamicinone (X), vancosamina (Vili) e daunosamìna (XI) mediante confronto diretto in TLC con campioni autentici.

Il nuovo prodotto cosi ottenuto per trasformazione chimica di (I) è stato identificato quale 4'-0-vancosamini1 adriamicina (III).

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Un composto di formula:

dove R rappresenta
2. Il composto (I) 4'-O-vancosaminil daunorubicina della rivendicazione 1, ed i suoi sali di addizione farmaceuticamente accettabili.
3. Il composto (II) 4'-O-vancosaminil 13-diidro-daunorubicina della rivendicazione 1, ed i suoi sali di addizione farmaceuticamente accettabili.
4. Il composto (III) 4’-O-vancosaminil doxorubicina della rivendicazione 1, ed i suoi di addizione farmaceuticamente accettabili.
5. Un processo fermentativo per produrre l’antibiotico di formula (I) che comprende la fermentazione, in presenza di un ceppo di Streptomyces sp., effettuata in condizioni aerobiche in un mezzo liquido nutritivo contenente una fonte assimilabile di carbonio e azoto.
6. Un processo fermentativo per produrre l'antibiotico di formula (I) (R=-COCH3), che comprende la fermentazione, in presenza di un ceppo di Streptomyces sp. in condizioni aerobiche in un mezzo liquido nutritivo, contenente una fonte assimilabile di carbonio e azoto, ad una temperatura tra 25" e 37°C, per un tempo variabile tra 4 e 7 giorni.
7) Un procedimento in accordo con la rivendicazione 5 o 6, in cui la fermentazione viene effettuata in presenza di sali minerali aggiuntivi.
8) Un procedimento fermentativo per la produzione del composto di formula I (R=-COCH3), in accordo con ognuna delle rivendicazioni precedenti, che include la purificazione di detto antibiotico e/o la preparazione di un suo sale farmaceuticamente accettabile.
9) Una composizione terapeutica contenente uno o più composti secondo le rivendicazioni precedenti, assieme ad un veicolo farmaceuticamente accettabile.