ITMI20100093A1 - Peptidi ciclici che legano il recettore cxcr4 e relativi usi in campo medico e diagnostico - Google Patents

Description

Titolo: “Peptidi ciclici che legano il recettore CXCR4 e relativi usi in campo medico e diagnosticoâ€

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La presente invenzione si riferisce all’individuazione di nuovi peptidi e peptidomimetici che legano il recettore CXCR4, in grado di formare complessi con recettori per le chemochine, in particolare con CXCR4. L'invenzione riguarda inoltre l'uso di tali peptidi per il trattamento, la prevenzione e la diagnosi di malattie in cui siano coinvolti recettori delle chemochine (i.e. neoplasie, metastasi, infezioni da virus HIV-1), nonché per la mobilizzazione di cellule staminali di precursori ematopoietici nel caso dei trapianti autologhi. L'invenzione include, infine, composizioni farmaceutiche e kit diagnostici comprendenti tali peptidi.

Le chemochine sono una famiglia di piccole proteine di 8-10 kDa con attività chemotattica. Esse sono caratterizzate da una vasta gamma di attività biologiche, incluso la regolazione del trafficking leucocitario, la modulazione della proliferazione di cellule ematopoietiche e l'adesione alle molecole di matrice extracellulari.

Recentemente, à ̈ stato identificato un ruolo dell’asse chemochine-recettori per chemochine nelle neoplasie umane. Principalmente il recettore CXCR4 e la relativa chemochina, CXCL12 sono stati descritti in numerose neoplasie.

CXCL12 à ̈ una chemochina di tipo C-X-C che interagisce con un recettore specifico, il CXCR4, appartenente alla famiglia di recettori transmembrana accoppiati a proteine G (GPCR). I GPCR sono caratterizzati da un comune dominio centrale costituito da sette eliche transmembrana, connesse da tre loop intracellulari (i1, i2 ed i3) e da tre loop extracellulari (e1, e2 ed e3). Due residui di cisteina (uno sull'elica 3 e l'altro sul loop e2), che sono conservati nella maggior parte dei GPCR, formano un ponte disolfuro importante per l'impacchettamento e la stabilizzazione del dominio elicoidale. A parte la variabilità di sequenza, i GPCR differiscono nella lunghezza e nella funzione del dominio extracellulare N-terminale, del dominio C-terminale intracellulare e dei loop intracellulari.

Per molto tempo si à ̈ ritenuto che i GPCR fossero specie monomeriche funzionalmente attive e solo recentemente, grazie a numerose evidenze sperimentali e ad approcci combinati, si à ̈ andato affermando il concetto che i GPCR sono biologicamente attivi come dimeri o oligomeri superiori. La capacità dei GPCR ad omo- o eterooligomerizzare à ̈ un requisito necessario per la funzione e chiaramente non à ̈ un processo casuale: la dimerizzazione selettiva definisce la farmacologia del ligando e la risposta biologica.

Una questione molto dibattuta à ̈ come i ligandi di tali recettori alterino la dimerizzazione o l'organizzazione strutturale dei GPCR e se la farmacologia dei ligandi o la funzione degli eterodimeri sia distinta o meno da quella degli omodimeri. Recenti studi hanno dimostrato che la stechiometria dei recettori rispetto alla proteina G à ̈ almeno di 2:1, mentre la modalità con cui ciascun recettore nel dimero (o nell'oligomero) interagisca con le subunità Gα e Gβγ della proteina G eterotrimerica à ̈ a tutt'oggi materia di studio. Un aspetto importante nella funzionalità dei dimeri recettoriali à ̈ stato evidenziato attraverso la modifica di una subunità recettoriale resa costituzionalmente attiva o modificata in modo da legare un agonista o un antagonista non riconosciuto dalla seconda subunità: l'attivazione del secondo recettore, una volta attivato il primo, ha portato ad una perdita del segnale, mentre la sua inibizione ha promosso un incremento del segnale. Quindi l'attività di un recettore omodimerico può essere controllato allostericamente mediante legame differenziale a ciascuna unità recettoriale. Questo risultato à ̈ anche più importante nel caso degli eterodimeri e può condurre ad un'interpretazione della risposta multivariata dei ligandi nei diversi pathway di segnale dei GPCR. Nel caso del CXCR4, à ̈ ben noto che questo recettore possa sia omo- che etero-dimerizzare. Cellule di neoplasia mammaria esprimono elevati livelli di CXCR4 e la specifica chemochina, CXCL12, à ̈ massimamente espressa a livello delle metastasi di neoplasia mammaria. Trattamento con anticorpi neutralizzanti per CXCR4 riducono drammaticamente la metastasi. Anche nel modello di melanoma, carcinoma del colon, carcinoma renale, del colon retto, del polmone, glioblastoma, carcinoma della prostata l'asse CXCR4/CXCL12 ha dimostrato un ruolo centrale nella metastatizzazione. Pertanto i recettori per chemochine e relativi ligandi hanno un ruolo cruciale nel processo di metastatizzazione.

Gli autori della presente invenzione hanno precedentemente dimostrato [1-3] un ruolo prognostico per l’espressione del recettore CXCR4 in associazione all’espressione del VEGF nelle neoplasie del colon retto ed un valore prognostico per l’espressione del CXCR4 nel melanoma primitivo. Numerose evidenze sperimentali suggeriscono che i tumori solidi sono generati e mantenuti da una piccola popolazione di cellule tumorali capaci di proliferare indefinitamente e di dare origine ad una progenie di cellule differenziate. L’espressione di recettori per chemochine, ed in particolare del CXCR4 à ̈ stata descritta diffusamente su cellule staminali neoplastiche.

Il CXCR4 à ̈ stato inoltre identificato come co-recettore per la fusione ed infezione delle cellule T da parte del virus HIV-1. L'ingresso del virus nella cellula ospite à ̈ mediato dall'interazione di alcune glicoproteine dell'involucro virale (gp120 e gp41) con recettori della cellula ospite (CD4 e CCR5 o CXCR4), attraverso una complessa sequenza di eventi molecolari che iniziano con il legame di trimeri della proteina virale gp120 al recettore primario CD4. Tale interazione non à ̈ sufficiente a promuovere l'ingresso del virus nella cellula, ma serve a rendere accessibile sulla proteina gp120 il sito di legame per i recettori per le chemochine mediante induzione di una variazione conformazionale nella glicoproteina. Sebbene differenti sottotipi virali possano legarsi a differenti recettori per le chemochine, CCR5 e CXCR4 rappresentano di gran lunga il bersaglio più diffuso per HIV-1. L'impiego di ligandi del CXCR4 in grado di antagonizzare il legame della glicoproteina virale gp120 ai corecettori rappresenta una nuova frontiera per lo sviluppo di agenti terapeutici anti- AIDS.

Recenti evidenze enfatizzano il ruolo dell’asse CXCR4-CXCL12 nell’homing midollare e quindi nella mobilizzazione di precursori ematopoietici. Nel midollo osseo e nei tessuti linfoidi le cellule tumorali sono in diretto contatto con le cellule stromali che costituiscono il microambiente relativo a diversi stadi della malattia. CXCL12 ha un ampio spettro di effetti in relazione allo sviluppo delle neoplasie, ma il ruolo primario del CXCL12 à ̈ nella mobilizzazione di precursori ematopoietici e nella definizione di una nicchia di cellule staminali neoplastiche in cui l’elevata concentrazione di CXCL12 richiama una sottopopolazione di cellule altamente tumorigeniche e ne promuove sopravvivenza, proliferazione, angiogenesi e diffusione metastatica. La possibilità che l’inibizione dell’asse CXCR4-CXCL12 influenzi la disponibilità di precursori ematopoietici fu evidente attraverso Studi di Fase 1 in volontari sani, prima di iniziare lo Studio di Fase II in pazienti affetti da AIDS, con l’inibitore di CXCR4, AMD3100(1,19-[1,4-fenilenebis(metilene)]-bis-1,4,8,11-azatetradecano) [4].

In tali volontari si evidenziava un rapido incremento delle cellule della serie bianca del sangue con un picco dopo 6 ore dalla somministrazione dell’ AMD3100. Ad una osservazione dettagliata le cellule della serie bianca mobilizzata esprimevano il marcatore CD34 e quindi erano caratterizzate come cellule ematopoietiche [3,4]. Successivamente à ̈ stato dimostrato che la combinazione di AMD3100 in associazione con G-CSF, agente mobilizzante in uso, à ̈ sicura, efficace e superiore al G-CSF da solo per la mobilizzazione di precursori ematopoietici nel trapianto autologo. Sembra inoltre che la popolazione mobilizzata dall’AMD3100 sia differente da quella mobilizzata dal G-CSF.

Calandra et al. hanno dimostrato che la combinazione di AMD3100 e G-CSF mobilizza un numero sufficiente di cellule CD34+ nel linfoma non-Hodgkin, nel mieloma multiplo, e nel linfoma di Hodgkin [5].

Sebbene l’AMD3100, alla luce dei dati appena esposti, risulti un rapido ed efficiente agente mobilizzante, esso ha, tuttavia, rivelato in precedenti studi scarsa biodisponibilità, tossicità epatica, cardiaca e cerebellare [4].

Alla luce di quanto sopra esposto risulta auspicabile l’identificazione di nuove molecole in grado di esplicare un’azione selettiva sui differenti pathway associati all’asse CXCR4-CXCL12 provocando minori effetti collaterali, da impiegare vantaggiosamente nel trattamento, prevenzione e diagnosi di malattie in cui siano coinvolti recettori delle chemochine (i.e. neoplasie, metastasi, virus HIV-1), nonché per la mobilizzazione di cellule staminali di precursori ematopoietici nel caso dei trapianti autologhi.

Gli autori della presente invenzione hanno ora identificato nuovi peptidi ciclici monomerici o dimerici da impiegarsi nella terapia, prevenzione e diagnosi di patologie che sono responsive e sensibili alla modulazione del recettore per le chemochine CXCR4 (i.e. tumori, metastasi, infezioni da HIV), oppure per la mobilizzazione di precursori ematopoietici nell’ambito di trapianti autologhi di midollo osseo.

Infatti, tale recettore à ̈ iperespresso nei luoghi di metastasi di neoplasia mammaria. Anche nel modello di melanoma, carcinoma del colon, carcinoma renale, del colon retto, del polmone, glioblastoma, carcinoma della prostata l'asse CXCR4/CXCL12 ha dimostrato un ruolo centrale nella metastatizzazione.

Inoltre, recenti evidenze enfatizzano il ruolo dell’asse CXCR4-CXCL12 nell’homing midollare e quindi nella mobilizzazione di precursori ematopoietici.

Il CXCR4 Ã ̈ stato inoltre identificato come co-recettore per la fusione ed infezione delle cellule T da parte del virus HIV-1.

Il meccanismo d'azione dei peptidi secondo l'invenzione si suppone regolare l'attività dei recettori CXCR4 mediante competizione con la chemochina endogena CXCL12 per il sito di legame ortosterico, ma non si esclude la possibilità che agiscano da effettori allosterici. Quindi, i peptidi selezionati oggetto dell'invenzione mostrano le attività biologiche e farmacologiche dei composti in grado di legare selettivamente il recettore CXCR4, utili sia come agenti antitumorali, sia come farmaci in grado di facilitare la mobilizzazione di precursori ematopoietici nell’ambito di trapianti autologhi di midollo osseo.

La capacità dei peptidi dell'invenzione di legare il recettore CXCR4, indipendentemente dalla loro attività agonista o antagonista, li rende inoltre validi candidati come marker diagnostici per le patologie neoplastiche.

I peptidi dell'invenzione potrebbero essere potenzialmente utili come agenti profilattici anti AIDS, dal momento che possono potenzialmente competere per il legame al recettore CXCR4 con la glicoproteina virale gp120.

Formano pertanto oggetto della presente invenzione peptidi monomerici ciclici contenenti fino a nove amminoacidi caratterizzati dal fatto di avere un’attività modulatrice sul recettore CXCR4 aventi la seguente formula generale (I):

Nt-(Ns)-Nc-X1-X2-X3-Cc-(Cs)-Ct (I)

|_____tc____|

in cui:

- il gruppo N- terminale Nt del peptide à ̈ scelto tra ammonio libero, acetile (Ac), formile (Fo) e terbutossicarbonile (tBoc);

- il gruppo C terminale Ct del peptide à ̈ scelto tra carbossilato libero, ammide primaria (Nam), N-metilammide (NMe), metilestere (OMe);

- la sequenza N terminale (Ns) facoltativamente presente ha una formula scelta tra B-x-; B-x-x- e B-xx-x-;

- la sequenza C terminale (Cs) facoltativamente presente ha una formula scelta tra -x-B; -x-x-B e -x-xx-B;

dove B rappresenta un residuo amminoacidico basico codificato scelto tra lisina (K) e arginina (R), o non codificato, e dove x rappresenta un qualsiasi residuo amminoacidico codificato o non codificato; in cui dette sequenze (Ns) e (Cs) possono essere presenti con esclusione reciproca o entrambe assenti;

- i residui amminoacidici Nc e Cc, uguali o diversi tra loro, sono scelti dal gruppo che consiste in cisteina (C), acido glutammico (E), β−Alanina ( β−Ala), acido α,β diamminopropionico (Dap), acido α,γ diamminobutirrico (Dab), ornitina (Orn);

- il legame tc che coinvolge i residui amminoacidici Nc e Cc nella ciclizzazione à ̈ scelto dal gruppo che consiste in ponte disolfuro tra catene laterali di cisteina (css), legame ammidico backbone-catena laterale (abs) e viceversa (asb), legame ammidico tra catene laterali (asc), legame peptidico via catena principale (abb), legame estereo backbone-catena laterale (ebs) e viceversa (esb), legame estereo tra catene laterali (esc);

- la sequenza centrale X1-X2-X3Ã ̈ scelta tra Ar1-Ar2-B e B-Ar2-Ar1, in cui B Ã ̈ un residuo amminoacidico basico codificato scelto tra lisina (K) e arginina (R), o non codificato, ed Ar1e Ar2sono residui aromatici codificati scelti tra fenilalanina (F), triptofano (W), tirosina (Y) e istidina (H), o non codificati;

o loro sali farmacologicamente accettabili.

Preferibilmente, un peptide monomerico secondo l'invenzione à ̈ costituito da 5 a circa 9 residui amminoacidici. Più preferibilmente, la regione ciclica del peptide à ̈ composta da non più di 5 residui amminoacidici.

Un sale farmacologicamente accettabile di uno dei peptidi in oggetto può essere facilmente preparato a partire da un peptide (o suo analogo peptidomimetico) mediante metodi convenzionali. Ad esempio, tale sale può essere preparato mediante il trattamento del peptide con una soluzione acquosa dell’idrossido metallico farmacologicamente accettabile desiderato o altra base metallica e quindi lasciando evaporare la soluzione residua fino a portarla a secco, preferibilmente in condizioni di pressione ridotta in atmosfera di azoto. Alternativamente, una soluzione di un peptide può essere miscelata con un alcossido del metallo desiderato, e la soluzione viene evaporata successivamente fino a portarla a secco.

Il termine “sale farmacologicamente accettabile†si riferisce a basi addizionate ad acidi non tossici, contribuenti anioni inorganici, come il cloruro, il bromuro, il fosfato, il solfato, il perclorato, il nitrato, o anioni organici, come l’acetato, l’ossalato, il maleato, il malato, il tartrato, il citrato, il succinato, il malonato, il formiato, il lattato, il ptoluenesolfato, oppure ad acidi addizionati a basi non tossiche, contribuenti cationi che includono, ma non esclusivamente, quelli a base di alcali o metalli alcalino-terrosi, come sodio, litio, potassio, calcio, magnesio e simili, così come ammonio non tossico, ammonio quaternario e ammine cationiche, inclusi, ma non esclusivamente, l’ammonio, la tetrametilammonio, il tetraetilammonio, la metilammina, la dimetilammina, la trimetilammina, la trietilammina, l’etilammina, e simili.

Secondo forme preferite di realizzazione della presente invenzione la sequenza N terminale Ns à ̈: a) assente; b) il dipeptide RA, RP, RG, KA, KP o KG; c) il tripeptide RPA, KPA, RAP o KAP.

Secondo forme preferite di realizzazione della presente invenzione la sequenza C terminale Cs à ̈: a) assente; b) il dipeptide AR, PR, GR, AK, PK o GK; c) il tripeptide APR, APK, PAR o PAK.

Preferibilmente, detta sequenza centrale X1-X2-X3Ã ̈ scelta tra RHW, RFF, WHR, FHR, RHF, FYR, RYF, FFR, WYR, RYW, WFR, RFW.

Secondo forme preferite di realizzazione i peptidi di formula (I) aventi un’attività modulatrice sul recettore CXCR4 possono essere scelti dal gruppo che consiste in:

Ac-C-W-H-R-C-Nam C-F-F-R-C C-W-H-R-C |__css__| |__css__| |__css__|

(SEQ ID NO:1) (SEQ ID NO:2) (SEQ ID NO:3)

R-A-C-R-Y-W-C C-F-F-R-C-Nam C-W-Y-R-C-A-R |__css__| |__css__| |__css__|

(SEQ ID NO:4) (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO:6)

R-A-C-R-F-F-C R-A-C-R-H-W-C βAla-W-H-R-βAla |__css__| |__css__| |____abb____|

(SEQ ID NO:7) (SEQ ID NO:8) (SEQ ID NO:9)

C-W-H-R-C-A-R C-W-W-R-C

|__css__| |__css__|

(SEQ ID NO:10) (SEQ ID NO:11)

Ac-K-G-Dap-F-H-R-E Ac-K-G-Dap-F-H-R-E-Nam |__asc___| |__asc__|

(SEQ ID NO:12) (SEQ ID NO:13)

Ac-C-W-H-R-C Ac-C-F-F-R-C C-W-H-R-C-A-R |__css__| |__css__| |__css__|

(SEQ ID NO:14) (SEQ ID NO:15) (SEQ ID NO:16)

Ac-C-W-Y-R-C C-F-F-R-C-A-R Ac-C-W-Y-R-C-Nam |__css__| |__css__| |__css__| (SEQ ID NO:17) (SEQ ID NO:18) (SEQ ID NO:19) C-W-H-R-C-Nam C-W-Y-R-C-Nam C-R-H-W-C |__css__| |__css__| |__css__| (SEQ ID NO:20) (SEQ ID NO:21) (SEQ ID NO:22)

R-P-A-C-R-F-F-C K-A-P-C-R-F-F-C

|__css__| |__css__|

(SEQ ID NO:23) (SEQ ID NO:24)

I peptidi dell’invenzione comprendono peptidi ciclici sia monomerici che dimerici, le loro combinazioni e i loro sali farmacologicamente accettabili.

Costituiscono oggetto della presente invenzione omodimeri o eterodimeri tra due peptidi di formula (I) come precedentemente definiti, scelti dal gruppo che consiste in:

a) dimeri coda-testa o testa-coda aventi la seguente formula generale (II):

Nt1-Ns1-Nc1-X1,1-X1,2-X1,3-Cc1-Cs1-Linker-Ns2-Nc2-X2,1-X2,2-X2,3-Cc2-|______tc1_____| |______tc2______| Cs2-Ct2

(II)

b) dimeri coda-coda aventi la seguente formula generale (III):

Nt1-Ns1-Nc1-X1,1-X1,2-X1,3-Cc1-Cs1â”

|_______tc1______| Linker (III) Nt2-Ns2-Nc2-X2,1-X2,2-X2,3-Cc2-Cs2â” ̃

|_______tc2______|

c) dimeri testa-testa aventi la seguente formula generale (IV):

┌-Ns1-Nc1-X1,1-X1,2-X1,3-Cc1-Cs1-Ct1

Linker |_______tc1______| (IV) â””-Ns2-Nc2-X2,1-X2,2-X2,3-Cc2-Cs2-Ct2|_______tc2______|

in cui Nt1, Ns1, Nc1, Cc1, Cs1, Ct1, X1,1, X1,2, X1,3sono relativi al primo peptide e hanno lo stesso significato sopra indicato; in cui Nt2, Ns2, Nc2, Cc2, Cs2, Ct2,X2,1, X2,2, X2,3sono relativi al secondo peptide e hanno lo stesso significato sopra indicato;

in cui il legame tra detto primo peptide e detto secondo peptide avviene mediante sostituzione dei gruppi terminali Nt1ed Nt2, Ct1e Ct2, Nt1e Ct2o Ct1ed Nt2con un gruppo linker scelto tra polietilenglicole (PEG), esametilendiammina (N6), PEG600, PEG300-amminomalonil-PEG300. Queste molecole idrosolubili servono a conferire ai peptidi dell'invenzione maggiore biodisponibilità, solubilità e stabilità, oltre a diminuirne l'immunogenicità.

I peptidi dimerici esercitano gli stessi effetti terapeutici dei peptidi monomerici dell'invenzione.

Il termine “peptide†à ̈ usato per indicare una molecola polimerica costituita da un numero non elevato di amminoacidi (inferiore a 100 residui) uniti mediante legame peptidico. Quando un amminoacido à ̈ inserito in una catena peptidica prende il nome di “residuo amminoacidico†. La catena peptidica à ̈ caratterizzata da due estremità, la “testa†e la “coda†, non impegnate in un legame peptidico: la testa à ̈ l'estremità N-terminale che presenta un gruppo ammidico libero, mentre la coda à ̈ l'estremità C-terminale e reca un gruppo carbossilico libero.

Il termine “catena principale†o “backbone†à ̈ usato per indicare la porzione amminoacidica costituita dagli atomi che formano il legame peptidico ovvero l'atomo di carbonio carbonilico, l'atomo di ossigeno, l'atomo di azoto e l'atomo di carbonio in posizione alfa.

Il termine “catena laterale†o “sidechain)†si riferisce alla parte variabile di ciascun amminoacido, in grado di conferire a ciascun residuo caratteristiche chimiche specifiche, in base alle quali essi vengono classificati in: 1) aromatici: fenilanina (F), triptofano (W), tirosina (Y) e istidina (H); 2) carichi postivamente: lisina (K) e arginina (R); 3) carichi negativamente: aspartico (D) e glutammico (E); 4) polari: asparagina (N), glutammina (Q), treonina (T), serina (S) e 5) idrofobici: valina (V), leucina (L), isoleucina (I), alanina (A), metionina (M), cisteina (C), glicina (G), Prolina (P).

Con l'eccezione della glicina, gli amminoacidi sono molecole chirali, caratterizzate dalla presenza di un atomo di carbonio alfa asimmetrico. Essi sono contrassegnati dalle lettere L o D a seconda che i sostituenti dell'atomo di carbonio chirale abbiano disposizione simile a quella della L-gliceraldeide o a quella della D-gliceraldeide.

Il termine amminoacido “codificato†si riferisce ad uno dei venti amminoacidi codificati nel codice genetico per la sintesi proteica, il termine “non codificato†si riferisce agli amminoacidi non codificati nel codice genetico ed ottenuti in natura mediante modifiche posttraduzionali e/o altre via biosintetiche diverse dalla sintesi proteina oppure artificialmente, mediante processi di sintesi chimica.

Secondo forme alternative dei realizzazione della presente invenzione possono essere impiegati derivati dei peptidi monomerici o dimerici di formula (I)-(IV), in cui detti peptidi sono funzionalizzati mediante legame covalente di gruppi fluorescenti, chemiluminescenti, magnetici o radioattivi (i.e. radiomarcatori come<125>I,<32>P o<35>S) a livello della catena principale, delle catene laterali o del gruppo linker. Il gruppo rivelabile può essere anche un gruppo proteico rivelabile, i.e. un enzima saggiabile o un epitopo anticorpale. Analogamente, il gruppo rivelabile può essere un substrato, un cofattore, un inibitore o un ligando di affinità.

L’invenzione ha come oggetto peptidi caratterizzati dal fatto di avere un’attività agonista sul recettore CXCR4, che stimolino il ripopolamento dei tessuti ischemici a livello cardiaco e neuronale [6-12], scelti dal gruppo che consiste in:

Ac-C-W-H-R-C Ac-C-F-F-R-C C-W-H-R-C-A-R |__css__| |__css__| |__css__|

(SEQ ID NO:14) (SEQ ID NO:15) (SEQ ID NO:16)

Ac-C-W-Y-R-C C-F-F-R-C-A-R Ac-C-W-Y-R-C-Nam |__css__| |__css__| |__css__| (SEQ ID NO:17) (SEQ ID NO:18) (SEQ ID NO:19)

C-W-H-R-C-Nam C-W-Y-R-C-Nam

|__css__| |__css__|

(SEQ ID NO:20) (SEQ ID NO:21)

Sebbene i peptidi dell’invenzione siano descritti usando principalmente i termini “peptide†o “peptidi†, un esperto del ramo, al momento della lettura della presente descrizione, comprenderà che questi termini includono anche gli analoghi strutturali e i derivati dei peptidi sopra descritti. Ad esempio, insieme ai peptidi sopra descritti, che possono comprendere gli amminoacidi presenti in natura, sono anche forniti i peptidomimetici dei peptidi secondo la presente invenzione. Gli analoghi peptidici sono comunemente in uso nell’industria farmaceutica come farmaci nonpeptidici con proprietà analoghe a quelle del peptide templato. Questi tipi di composti non-peptidici sono nominati “peptidi mimetici†o “peptidomimetici†e sono sviluppati di solito con l’aiuto del molecular modelling computerizzato [16-18].

I peptidi mimetici che sono strutturalmente simili ai peptidi vantaggiosi da un punto di vista terapeutico o profilattico possono essere usati per produrre un effetto terapeutico o profilattico equivalente. In genere, i peptidomimetici sono strutturalmente simili ad un peptide modello (ovvero, un peptide che ha un’attività biologica o farmacologica), ma hanno uno o più legami peptidici sostituiti facoltativamente da un legame scelto dal gruppo che consiste in: -CH2NH2-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis e trans), -CO CH2-, -CH(OH)CH2-, e -CH2SO-. Tali peptidomimetici possono essere generati mediante i metodi noti nell’arte e descritti ulteriormente nei riferimenti bibliografici [19]-[29] qui citati.

I peptidi mimetici possono avere vantaggi significativi rispetto ai peptidi mimati, inclusi, ad esempio: produzione più economica; maggiore stabilità chimica; proprietà farmacologiche migliorate (emivita, assorbimento, potenza, efficacia); specificità alterata (i.e., un ampio spettro di attività biologiche); ridotta antigenicità.

A causa della loro capacità di legare il recettore per le chemochine CXCR4 ed esercitare un'azione agonista o antagonista sulla funzionalità del recettore, i peptidi di questa invenzione sono vantaggiosamente utilizzati per il trattamento o la prevenzione di un’ampia gamma di malattie e disturbi che rispondono o sono sensibili alla modulazione dell'attività del recettore CXCR4.

Pertanto, costituisce oggetto della presente invenzione l’uso di almeno un peptide monomerico o dimerico di formula (I)-(IV), o loro derivati, o loro miscele, per la preparazione di un medicamento per il trattamento e la prevenzione di tumori o recidive/metastasi in patologie tumorali le cui cellule sovraesprimano il recettore per le chemochine CXCR4.

Preferibilmente, detti tumori sono scelti dal gruppo che consiste in neoplasie della mammella, del colon, dello stomaco, glioblastomi e melanomi [13, 14].

Costituisce ulteriore oggetto della presente l’invenzione l’uso di almeno un peptide monomerico o dimerico di formula (I)-(IV), o loro derivati, o loro miscele, per la preparazione di un medicamento per il trattamento e la prevenzione di infezioni da HIV-1 da sottotipi virali che usino come corecettori i recettori per chemochine della cellula ospite.

L’invenzione ha come oggetto ulteriore l’uso di almeno un peptide monomerico o dimerico di formula (I)-(IV), o loro derivati, o loro miscele, per la preparazione di un medicamento nella terapia dei trapianti di midollo osseo per la mobilizzazione di cellule staminali. La mobilizzazione di precursori ematopoietici à ̈ infatti necessaria nell’ambito di trapianti autologhi di midollo osseo in soggetti che ne hanno necessità.

Il termine “soggetto†à ̈ usato per indicare un animale, come un mammifero, incluso l’uomo. I soggetti animali non umani da trattare includono, ad esempio, pesci, uccelli e mammiferi come vacche, pecore, maiali, cavalli, cani e gatti.

L’invenzione si riferisce ulteriormente all’uso dei peptidi monomerici o dimerici di formula (I)-(IV) come marker tumorali.

E’ possibile effettuare tale diagnosi in vivo mediante somministrazione in un soggetto di una quantità efficace di un peptide dell’invenzione opportunamente marcato.

L’invenzione ha come ulteriore oggetto composizioni farmaceutiche comprendenti almeno uno dei peptidi monomerici o dimerici di formula (I)-(IV), loro derivati, o loro miscele come principio attivo insieme ad uno o più eccipienti o carrier farmacologicamente accettabili.

Il termine “carrier farmacologicamente accettabile†racchiude qualsiasi carrier, tamponi ed eccipienti, farmacologico standard, che comprendono la soluzione salina tampone-fosfato, l’acqua, e le emulsioni (come un’emulsione olio/acqua o acqua/olio), e diversi tipi di agenti umettanti e/o adiuvanti. I carrier farmacologicamente idonei e le loro formulazioni sono descritte in [30]. I carrier farmacologicamente preferiti dipendono dalla via di somministrazione dell’agente attivo che si à ̈ progettata. Tipiche vie di somministrazione sono quella orale, endovenosa, intramuscolare, rettale, sottocutaneo.

L’invenzione fornisce composizioni farmaceutiche in forma di dosaggio unico che comprendono per unità di dosaggio un carrier farmacologicamente accettabile in un range tra 0,01 milligrammi (mg) e circa 1000 mg dei peptidi dell'invenzione o loro sali farmacologicamente accettabili. In un aspetto preferito, l’invenzione fornisce composizioni farmaceutiche in forma di dosaggio unico comprendenti per unità di dosaggio un carrier farmacologicamente accettabile e un range tra circa 1 mg e circa 100 mg dei peptidi dell'invenzione, o loro sali farmacologicamente accettabili. Secondo un altro aspetto, l’invenzione fornisce polimeri peptidici che comprendono almeno due peptidi.

La forma prescelta di queste composizioni farmaceutiche dipende da come si intende somministrarle e dall’applicazione terapeutica. Le composizioni possono includere a secondo della formulazione desiderata), carrier o diluenti, farmacologicamente accettabili non tossici, che sono definiti come veicoli comunemente usati nella formulazione di composizioni farmaceutiche per somministrazioni umane o animali.

I peptidi secondo l’invenzione sono idrosolubili alle basse concentrazioni in cui essi vengono tipicamente utilizzati. Tali peptidi sono preferibilmente usati nella forma dei loro sali acidi o alcalini formati con agenti farmacologicamente accettabili, come l’acido acetico, l’acido citrico, l’acido maleico, o l’acido succinico. I sali solubili privi dei peptidi in oggetto possono anche essere convertiti in sali a bassa solubilità nei fluidi corporei mediante la modifica con un sale farmacologicamente accettabile lievemente idrosolubile (come l’acido tannico o l’acido palmoico), mediante l’inclusione in una formulazione a rilascio controllato del peptide (come attraverso l’accoppiamento covalente ad una proteina carrier più grande o ad un peptide), o mediante l’inclusione in capsule a rilascio controllato e simili. In generale, i sali acidi dei peptidi dell’invenzione sono biologicamente e farmacologicamente equivalenti ai peptidi stessi.

In alcuni casi, potrebbe essere auspicabile stabilizzare i peptidi monometrici o dimerici secondo l’invenzione e i loro analoghi o derivati per aumentare la loro emivita e l’emivita farmacocinetica. La stabilità dell’emivita viene migliorata aggiungendo gli eccipienti come: a) agenti idrofobici (i.e., glicerolo); b) zuccheri (i.e., saccarosio, mannosio, sorbitolo, ramnosio, o xilosio); c) carboidrati complessi (i.e., lattosio); e/o d) agenti batteriostatici. L’emivita farmacocinetica dei peptidi in oggetto può essere modificata mediante l’accoppiamento a peptidi carrier, polipeptidi, e carboidrati usando la derivatizzazione chimica (i.e., accoppiando una catena laterale o residui N- o C-terminali), o alterando per via chimica un amminoacido del peptide in oggetto. L’emivita farmacocinetica e le farmacodinamiche di questi peptidi possono anche essere modificate mediante: a) incapsulamento (i.e., in liposomi); b) controllo del grado di idratazione (i.e., controllando l’entità e il tipo di glicosilazione del peptide); e c) controllo della carica elettrostatica e dell’idrofobicità del peptide.

Infine, l’invenzione contempla kit per la diagnosi di patologie tumorali comprendente uno o più peptidi monomerici o dimerici di formula (I)-(IV) e/o loro derivati.

Per alcune applicazioni in campo diagnostico, potrebbe essere auspicabile fornire i peptidi dell’invenzione come entità marcate, cioà ̈ attaccati in modo covalente o legati ad un gruppo rivelabile, per facilitare l’identificazione, la rivelazione e la quantificazione del peptide in una data circostanza. Questi gruppi rivelabili possono comprendere un gruppo proteico rivelabile, i.e., un enzima saggiabile o un epitopo anticorpale. Alternativamente, il gruppo rivelabile può essere scelto tra una varietà di altri gruppi rivelabili o marcatori, come i radiomarcatori (i.e.,<125>I,<32>P o<35>S) o un gruppo chemiluminescente o fluorescente. Analogamente, il gruppo rivelabile può essere un substrato, un cofattore, un inibitore o un ligando di affinità.

La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati, in cui:

la figura 1 mostra la valutazione del rilascio del calcio in cellule CCFR-CEM in presenza di CXCL12 ed inibitori peptidici del CXCR4; CCFR-CEM (500.000 cellule) risospese in 1 ml di Loading Buffer (PBS 1X, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1% FBS inattivato al calore) a 37°C, ed incubate con 4 ul del tracciante del calcio FLUO3-AM (1 mg/ml; Sigma) e 4 ul di acido pluronico F-127 (1 mg/ml in 2% di DMSO; Invitrogen) al buio per 30' a 37°C in agitazione. L’inibitore specifico del CXCR4 AMD3100 o il peptide testato viene aggiunto alla concentrazione di 10 uM; incubazione al buio (15 minuti a temperatura ambiente) e si procede con l'analisi al citofluorimetro: Ac-css:[C-WHR-C]-Nam riduce il rilascio del Calcio del 40,7%, il css:[C-FFR-C] del 53,3%, il css:[C-FFR-C]-Nam del 59,9% ed il RA-css:[C-RYW-C] del 56%.

la figura 2 mostra la valutazione del legame al recettore CXCR4 in presenza di specifici peptidi inibenti CXCR4 (css:[C-WHR-C], RA-css:[C-RFF-C], RA-css:[C-RHW-C], RA-css:[C-RYW-C]). Le cellule CCRF-CEM sono state pre-incubate con ciascun peptide per 30’ e poi nuovamente incubate in presenza dell’anticorpo anti-CXCR4. Per verificare il numero di molecole di recettore disponibile all’anticorpo anti-CXCR4, à ̈ stato utilizzato un test che permette di quantizzare il numero di anticorpi fluorescenti legati alla cellula comparando attraverso il valore noto di sferette fluorescenti coniugate con ficoeritrina.

la figura 3 mostra i risultati del saggio di migrazione in presenza di CXCL12 e specifici peptidi inibenti CXCR4 secondo l’invenzione (css:[C-WHR-C]; css:[C-WYR-C]-AR ; RA-css:[C-RFF-C]; RA-css:[C-RHW-C]; RA-css:[C-RYW-C]; abb:[β-Ala-WHR-β-Ala]; css:[C-WWR-C]; css:[C-FFR-C]-Nam e css:[C-WHR-C]-AR), utilizzando una linea cellulare umana di melanoma, PES43 precedentemente caratterizzata per espressione del CXCR4 e capacità migratoria in risposta a concentrazioni crescenti di CXCL12. L'indice di migrazione à ̈ stato definito come il rapporto tra la migrazione delle cellule del gruppo sperimentale divisa quella del gruppo di controllo. Il controllo positivo dell’esperimento à ̈ costituito dalla migrazione delle cellule verso siero.

la figura 4 mostra i risultati del saggio di valutazione della induzione di p-ERK mediante Immunoblotting in presenza di CXCL12 e specifiche concentrazioni di peptidi inibenti CXCR4 secondo l’invenzione (css:[C-WHR-C] (10 uM), css:[C-FFR-C] (10 uM), css:[C-FFR-C]-Nam (10 uM), css:[C-WYR-C]-AR (10 uM), RA-css:[C-RFF-C] (10 uM), RA-css:[C-RHW-C] (10 uM), abb:[β-Ala-WHR-β-Ala] (10 uM). Le cellule di melanoma umano, PES43 cresciute su piastre da 100 mm sono state trattate con SDF-1α, per 2-5-7-10 minuti. Attraverso questo esperimento à ̈ stato osservato che SDF-1α à ̈ capace di indurre la fosforilazione di ERK 1, 2 a 2 e 5 minuti. CXCL12 attiva la fosforilazione di ERK e tale fosforilazione à ̈ inibita sia dall'AMD3100 (1 uM), sia dai peptidi css:[C-WHR-C] (10 uM), css:[C-FFR-C] (10 uM), css:[C-FFR-C]-Nam (10 uM), css:[C-WYR-C]-AR (10 uM), RA-css:[C-RFF-C] (10 uM), RA-css:[C-RHW-C] (10 uM), abb:[β-Ala-WHR-β-Ala] (10 uM).

la figura 5 mostra l’analisi microscopica e macroscopica di metastasi polmonari di melanoma effettuata su 25 topi femmina C57/B, tra la sesta e l’ottava settimana di vita e con un peso di circa 18 g. I topi sono stati divisi in 5 gruppi, di 5 topi ciascuno, a seconda del trattamento specifico: GRUPPO A: trattamento con 100 µL PBS; GRUPPO B: trattamento con 1.25 mg/Kg AMD 3100 in 100 µL di PBS; GRUPPO C: trattamento con 2 mg/Kg RA-css:[C-RHW-C] in 100 µL di PBS; GRUPPO D:trattamento con 2 mg/Kg RA-css:[C-RFF-C] in 100 µL di PBS; GRUPPO E: trattamento con 2 mg/Kg css:[C-WHR-C] in 100 µL di PBS.

La presente invenzione viene illustrata ulteriormente attraverso i seguenti esempi. Questi esempi sono meramente illustrativi della presente invenzione e non sono da intendersi come limitativi della presente invenzione.

ESEMPI

Come evidenziato negli Esempi riportati nel seguito, i peptidi oggetto della presente invenzione legano il recettore CXCR4 e mostrano un'attività sia antagonista che agonista sull'attivazione del recettore in diversi saggi biologici in vitro quali:

a) la valutazione citofluorimetrica della liberazione di Ca<2+>in seguito alla stimolazione con SDF-1α;

b) la modulazione della capacità migratoria cellulare in presenza o assenza dello specifico ligando SDF-1α; c) la modulazione dell’attivazione di ERK-1,2.

Come evidenziato in precedenza, i recettori CXCR4 sono iperespressi in diverse patologie tumorali. Una delle risposte funzionali all’attivazione del recettore CXCR4 in relazione alla relativa capacità metastatica à ̈ l’induzione della migrazione. Alcuni dei peptidi dell'invenzione hanno mostrato azione antagonista, rispetto all’induzione di migrazione indotta dal ligando, quasi comparabile all'inibitore meglio caratterizzato, AMD3100.

Lo studio condotto in vivo relativo al saggio di metastasi polmonari di melanoma ha dimostrato un numero significativamente ridotto di metastasi polmonari nei gruppi di topi trattati con i peptidi oggetto dell'invenzione. Pertanto, i peptidi dell'invenzione, opportunamente selezionati, possono essere vantaggiosamente impiegati come agenti antitumorali o per la diagnostica di neoplasie.

Linee cellulari

Per tutti i successivi esempi in vitro sono state utilizzate due linee cellulari: CCFR-CEM e PES 43; la prima à ̈ una linea di leucemia a cellule T CD4+ ad elevata espressione del recettore CXCR4, cresciuta in mezzo di coltura RPMI 1640 arricchito con il 10% di Siero Bovino Fetale (FBS) inattivato al calore e l'1% di L-Glutammina; la seconda à ̈ una linea cellulare derivata da metastasi polmonare di melanoma denominata PES43 ad elevata espressione del recettore CXCR4, cresciuta in Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) supplementato con 10% Siero Bovino Fetale (FBS) inattivato al calore e l'1% di Penicillina-Streptomicina.

Sintesi peptidi

Nella presente invenzione, i peptidi sono stati sintetizzati chimicamente impiegando la procedura in fase solida. Tale tecnica si basa sull’impiego di un supporto solido opportunamente funzionalizzato sul quale ha luogo il completo accrescimento della catena peptidica. La tecnica consiste nel legare l’amminoacido C-terminale di un peptide da sintetizzare ad un polimero insolubile e nel sintetizzare il peptide “step by step†in direzione C → N terminale aggiungendo ad ogni stadio il residuo amminoacidico previsto. Terminata la sintesi in fase solida, il peptide à ̈ rimosso dalla resina mediante un appropriato trattamento.

Il vantaggio più rimarchevole di questa procedura à ̈ che la purificazione può essere effettuata dopo ciascun ciclo di sintesi semplicemente lavando la resina con un solvente opportuno.

Dal punto di vista chimico la formazione di un legame peptidico prevede una reazione di condensazione tra la funzione amminica libera di un amminoacido e la funzione carbossilica libera di un secondo amminoacido. La reazione di formazione di tale legame ammidico prevede l’attivazione del gruppo carbossilico. Nel contempo, per evitare reazioni collaterali che porterebbero a rese basse o nulle, l’amminoacido da legare presenta la funzione α-amminica protetta in maniera “temporanea†. Inoltre, gli eventuali gruppi funzionali presenti sulle catene laterali sono anch’essi protetti per evitare che interferiscano nella reazione di condensazione. I gruppi in catena laterale devono essere stabili nelle condizioni di deprotezione della funzione α-amminica, ma facilmente rimovibili nella procedura di distacco finale del peptide dalla resina.

Dopo aver legato mediante il gruppo COOH il primo amminoacido alla resina, si procede ad ogni ciclo di sintesi effettuando una serie di passaggi che possono essere schematizzati come segue:

1) rimozione del gruppo protettore sull’NH2dell’ultimo residuo aminoacidico inserito nella sequenza peptidica; 2) lavaggio accurato della resina;

3) attivazione del COOH dell’amminoacido che deve reagire;

4) reazione di condensazione;

5) lavaggio accurato della resina.

La strategia di sintesi che viene di solito eseguita à ̈ quella cosiddetta Fmoc, che utilizza, cioà ̈, come gruppo protettore per la funzione α-amminica il gruppo 9-fluorenilmetossicarbonile (Fmoc) rimovibile in modo quantitativo per trattamento con piperidina. Questa strategia prevede l’impiego di gruppi protettori sulla catena laterale degli amminoacidi rimuovibili, invece, in condizioni acide. Per il distacco dalla resina e la deprotezione delle catene laterali si utilizza, infatti, una miscela di acido trifluoroacetico (TFA) e scavengers. Tali reagenti “bloccano†le specie altamente reattive, generalmente carbocationi, che si formano durante la deprotezione delle catene laterali dei residui amminoacidici.

Formule dei peptidi ciclici dell’invenzione

I seguente Schemi 1-4 rappresentano le formule generali dei peptidi monomerici e dimerici secondo l’invenzione e la relativa codifica utilizzata nel testo (vedere Tabelle 2-6 per il significato ed i codici dei vari gruppi).

Schema 1: Monomeri

Nt-Ns-Nc-X1-X2-X3-Cc-Cs-Ct

|_____tc___|

Codifica: Nt-Ns-tc:[Nc-X1X2X3-Cc]-Cs-Ct

Schema 2: Dimeri coda-testa (o testa-coda, attraverso permutazione dei pedici 1 e 2):

Nt1-Ns1-Nc1-X11-X12-X13-Cc1-Cs1-Lnk-Ns2-Nc2-X21-X22-X23-Cc2-|______tc1____| |_____tc2_____|

Cs2-Ct2

Codifica: Lnk:{Nt1-Ns1-tc1:[Nc1-X11X12X13-Cc1]-Cs1-*}{*-Ns2-tc2:[Nc2-X21X22X23-Cc2]-Cs2-Ct2}

Schema 3: Dimeri coda-coda

Nt1-Ns1-Nc1-X11-X12-X13-Cc1-Cs1â” |______tc1_____| Lnk

Nt2-Ns2-Nc2-X21-X22-X23-Cc2-Cs2â” ̃ |______tc2_____|

Codifica: Lnk:{Nt1-Ns1-tc1:[Nc1-X11X12X13-Cc1]-Cs1-*}{Nt2-Ns2-tc2:[Nc2-X21X22X23-Cc2]-Cs2-*}

Schema 4: Dimeri testa-testa

┌Nt1-Ns1-Nc1-X11-X12-X13-Cc1-Cs1

Lnk |______tc1_____|

â””Nt2-Ns2-Nc2-X21-X22-X23-Cc2-Cs2

|______tc2_____|

Codifica: Lnk:{*-Ns1-tc1:[Nc1-X11X12X13-Cc1]-Cs1-Ct1}{*-Ns2-tc2:[Nc2-X21X22X23-Cc2]-Cs2-Ct2}

Le tipologie di tripeptide centrale X1X2X3(oppure X11X12X13o X21-X22-X23) ammissibili per i peptidi di cui agli Schemi 1-4 sono Ar1-Ar2-B e B-Ar2-Ar1.

Ar1e Ar2rappresentano residui amminoacidici aromatici codificati o non (inclusi residui peptidomimetici), B rappresenta residui amminoacidici basici codificati o non (inclusi residui peptidomimetici). Per tutti questi residui nel testo e nelle rivendicazioni sono adoperati i codici ad una lettera IUPAC-IUB [31] per gli amminoacidi codificati, ed apposite sigle, ivi definite per gli altri residui.

La stereochimica dei Cα si intende non esplicitamente specificata in queste formule generali, che includono ogni possibile combinazione di chiralità L o D, mentre laddove nel testo o nelle rivendicazioni si descrivano specifici esempi di peptidi sarà adoperata la convenzione di utilizzare la lettera maiuscola per i codici ad una lettera nei residui codificati o per il primo carattere della sigla dei residui non-codificati nel caso di centri chirali L, e le corrispondenti lettere minuscole per centri chirali D:

Nella seguente Tabella 1 vengono indicati i possibili gruppi N-terminali (Nt) dei peptidi di cui agli Schemi 1-4 (il campo Nt vuoto corrisponde all'omissione del codice corrispondente nella codifica del nome del peptide):

Tabella 1

Nome gruppo Formula chimica Codice Nt gruppo

Nessuno -H<+>

(ammonio libero)

Acetile CH3CO- Ac-Formile HCO- Foter-Butossicarbonile (CH3)3COCO- tBoc-(t-Boc)

La Tabella 2 indica i possibili gruppi C-terminali (Ct) dei peptidi di cui agli Schemi 1-4 (il campo Ct vuoto corrisponde all'omissione del codice corrispondente nella codifica del nome del peptide):

Tabella 2

Nome gruppo Formula chimica Codice Nt gruppo

Nessuno -O-(carbossilato libero)

Ammide primaria -NH2-Nam

N-metilammide -NHCH3-NMe

Metilestere -OCH3-OMe

Sono possibili diverse modalità di ciclizzazione (tc, tc1, tc2) dei peptidi di cui agli Schemi 1-4, coinvolgenti i residui amminoacidici Nc e Cc, i quali saranno indicati dal corrispondente codice IUPAC-IUB ad una lettera [23] per i residui codificati, e da abbreviazioni opportune per i residui non-codificati. Per questi ultimi riportiamo, a puro titolo esemplificativo non esaustivo, alcune abbreviazioni di uso più corrente: β-Ala=β-alanina, Dap=acido α,βdiamminopropionico, Dab=acido α,γ-diamminobutirrico, Orn=ornitina. Per la stereochimica assoluta dei residui Nc e Cc sarà impiegata la stessa convenzione sopra descritta.

La seguente Tabella 3 illustra tali diverse modalità di ciclizzazione.

Tabella 3

Descrizione legame Codice tc

Ponte disolfuro tra catene css

laterali di cisteina

Legame peptidico via catena abb

principale (backbonebackbone)

Legame ammidico backbone- abs

sidechain

Legame ammidico sidechain- asb

backbone

Legame ammidico tra catene asc

laterali (sidechainsidechain)

Legame estereo backbone- ebs

sidechain

Legame estereo sidechain- esb

backbone

Legame estereo tra catene esc

laterali (sidechainsidechain)

La Tabella 4 mostra le possibili sequenze dei peptidi alle estremità N- (Ns) e C-terminale (Cs) del peptide ciclico di cui agli Schemi 1-4. La notazione adoperata, e le considerazioni sulla stereochimica sono le medesime sopra esposte. “x†rappresenta un qualsiasi residuo, e in parentesi tonda sono indicate le estremità a cui si intende possa essere adoperato il peptide:

Tabella 4

Nessun peptide (Ns,Cs)

B-x- (Ns)

B-x-x- (Ns)

B-x-x-x- (Ns)

-x-B (Cs)

-x-x-B (Cs)

-x-x-x-B (Cs)

La Tabella 5 indica i possibili linker covalenti (Lnk) per la dimerizzazione dei peptidi secondo gli Schemi 2-4.

Tabella 5

Nome linker Formula chimica Codice Nt linker

Nessuno 0 (legame diretto)

1,6-diamminoesano o -HN-(CH2)6-NH- N6 Esametilendiammina

Polietilenglicole -O-(C2H4O)n- PEG600 (PEG) 600

PEG 300- -O-(C2H4O)m- 2P300AM amminomalonil-PEG 300 COCH(NH2)CO-O-(C2H4O)n-

Esempi:

Monomero con gruppo N-terminale Acetile, sequenza N-terminale Lys-Gly, chiusura del ciclo tra un residuo Dap e una Glu via legame ammidico catena lateralecatena laterale, tripeptide centrale Phe-His-Arg, sequenza C-terminale nulla e gruppo C-terminale ammide primaria: Ac-KG-asc:[Dap-FHR-E]-Nam (SEQ ID NO:12) Monomero corrispondente al primo esempio, ma con senza gruppo protettore al C-terminale (carbossilato libero): Ac-KG-asc:[Dap-FHR-E] (SEQ ID NO:13)

Dimero formato dallo stesso monomero del secondo esempio, e da un peptide simile al monomero del secondo esempio tranne che per il tripeptide centrale, di sequenza Phe-Tyr-Lys, dimerizzato coda-coda via 1,6-esilendiammina:

N6:{Ac-KG-asc:[Dap-FHR-E]-*}{Ac-KG-asc:[Dap-FYK-E]-*}

Esempio 1: Saggi in vitro: determinazione citofluorimetrica del rilascio di Ca<2+>

La determinazione del rilascio del Calcio intracellulare à ̈ stata eseguita nelle cellule CCFR-CEM. Le cellule (500.000 cellule) vengono lavate con PBS, risospese in 1ml di Loading Buffer (PBS 1X, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1% FBS inattivato al calore) a 37°C, ed incubate con 4ul del tracciante del calcio FLUO3-AM (1 mg/ml; Sigma) e 4ul di Acido Pluronico F-127 (1 mg/ml in 2% di DMSO; Invitrogen) al buio per 30' a 37°C in agitazione. Al fine di rimuovere l'eccesso di FLUO3-AM vengono aggiunti 3 ml di Loading Buffer, a ciò segue una centrifugazione per 5' a 1000-1200 rpm. Il pellet così ottenuto viene risospeso in 1 ml di Loading Buffer. L’inibitore specifico del CXCR4 AMD3100 e/o il peptide testato viene aggiunto alla concentrazione di 10 uM; incubazione al buio (15 minuti a temperatura ambiente) e si procede con l'analisi al citofluorimetro:

• la determinazione della liberazione di calcio in presenza di uno specifico ionoforo (ionomicina 1 mg/ml) in cellule identificate come vitali (mancanza di accumulo dello ioduro di propidio) rappresenta la massima liberazione di Calcio.

• la determinazione della liberazione di calcio in presenza di uno specifico ligando per il recettore CXCR4 (SDF-1α) in cellule identificate come vitali, viene considerata il controllo positivo.

• la determinazione della liberazione di calcio in presenza di uno specifico ligando per il recettore CXCR4 (SDF-1α) e di AMD3100 (10 uM) in cellule identificate come vitali, viene considerata il controllo negativo.

Attraverso la valutazione citofluorimetrica della liberazione di Ca<2+>gli autori hanno dimostrato che alcuni di questi peptidi svolgono un'attività antagonista sull'attivazione del recettore in seguito alla stimolazione con SDF-1α. In particolare i risultati migliori sono stati ottenuti con l'utilizzo dei peptidi Ac-css:[C-WHR-C]-Nam, css:[C-FFR-C], css:[C-FFR-C]-Nam, RA-css:[C-RYW-C]. Come mostrato nella Figura 1, l’aggiunta dei suddetti peptidi ha ridotto il rilascio del Calcio. In particolare, l'Accss:[C-WHR-C]-Nam del 40,7%, il css:[C-FFR-C] del 53,3%, il css:[C-FFR-C]-Nam del 59,9% ed il RA-css:[C-RYW-C] del 56%. Inoltre mediante tale saggio sono stati identificati anche peptidi con una possibile funzione agonista quali ad esempio: Ac-css:[C-WHR-C], Ac-css:[C-FFR-C], Ac-css:[C-WYR-C] e css:[C-FFR-C]-AR che mostrano un aumento dell'attività recettoriale nel rilascio dello ione calcio. Tale aumento à ̈ pari al 104% per il css:[C-FFR-C]-AR, al 106% per l'Ac-css:[C-FFR-C], del 113,7% per l'Ac-css:[C-WYR-C] e del 121% per l'Ac-css:[C-WHR-C].

L'attività dei peptidi à ̈ stata confrontata con quella dell'AMD3100 usato come inibitore della liberazione di Ca<2+>. Pertanto:

I peptidi: Ac-css:[C-WHR-C]-Nam (40%), css:[C-FFR-C] (53,3%), css:[C-FFR-C]-Nam (59,9%) e RA-css:[C-RYW-C](56%), inibiscono il rilascio di Ca<2>+ indotto dall'attivazione del recettore da parte dell'SDF-1α; L'AMD3100 (10 uM) inibisce il rilascio dello ione Ca<2+>indotto da SDF-1α del 70%.

Esempio 2: Saggi in vitro: determinazione quantitativa della fluorescenza

Il legame dei peptidi al recettore CXCR4 à ̈ stato indirettamente saggiato attraverso citofluorimetria a flusso, mediante l’utilizzo di un anticorpo ficoeritrinato anti-CXCR4 (R&D, Inc.).

Per ottenere una misura qualitativa del rapporto di legame tra peptidi ed il CXCR4, le cellule sono state incubate con il peptide per 30’ e poi nuovamente incubate in presenza dell’anticorpo anti-CXCR4. Per verificare il numero di molecole di recettore disponibile all’anticorpo anti-CXCR4, à ̈ stato utilizzato un test che permette di quantizzare il numero di anticorpi fluorescenti legati alla cellula comparando, il valore di fluorescenza ottenuto a quello noto di sferette fluorescenti coniugate con ficoeritrina (PELe cellule CCRF-CEM (500,000 cellule/ml) vengono cresciute in RPMI 1640 1% Glutammina, vengono trattate con AMD3100 o peptide (10 uM) e poste in incubazione a 37°C per 30'. Si effettuano un lavaggio con 2 ml di PBS 1X ed un altro con 2 ml di PBS 0,5% BSA, centrifugando per 5' a 1000-1200 rpm. Si aggiungono al pellet 5 ul di anticorpo monoclonale anti-CXCR4 insieme ad una nuova dose di AMD3100 o peptidi e si incuba per 30'-45' in ghiaccio, al buio. Si effettua un nuovo lavaggio con PBS 0,5% BSA, e si risospendono le cellule in 500 ul di PBS; a ciò segue l'analisi citofluorimetrica. Per la determinazione del legame dei peptidi al CXCR4 à ̈ stato usato come standard un campione a fluorescenza nota (PE Fluorescence quantification Kit, BD Inc.).

I risultati ottenuti sono riportati nella Figura 2, da cui si evince l'affinità di legame dei peptidi css:[C-WHR-C], RA-css:[C-RYW-C], RA-css:[C-RFF-C] e RA-css:[C-RHW-C] per il recettore CXCR4. In particolare, la quantità di fluorescenza normalizzata registrata, con i vari peptidi à ̈: css:[C-WHR-C] 45%; RA-css:[C-RYW-C] 22% ; RA-css:[C-RFF-C] 21% ; RA-css:[C-RHW-C] 17%.

Pertanto l'utilizzo dei peptidi css:[C-WHR-C] (45%), RA-css:[C-RFF-C] (21%), RA-css:[C-RHW-C] (17%) e RA-css:[C-RYW-C] (21%) ha notevolmente ridotto il numero di anticorpi legati per cellula, e quindi comportato una diminuzione della fluorescenza per cellula; ciò dimostra che tali peptidi sono in grado di legare il CXCR4 spiazzando così l’anticorpo anti-CXCR4.

Esempio 3: Saggi in vitro: modulazione della capacità migratoria cellulare in presenza o assenza dello specifico ligando SDF-1α

L’induzione della migrazione à ̈ una delle risposte funzionali all’attivazione del recettore CXCR4 in relazione alla relativa capacità metastatica. La valutazione della attività dei peptidi nell’interazione recettoriale à ̈ stata valutata attraverso il saggio di migrazione. E’stata utilizzata una linea cellulare umana di melanoma, PES43 precedentemente caratterizzate per espressione del CXCR4 e capacità migratoria in risposta a concentrazioni crescenti di SDF-1α.

La migrazione à ̈ stata saggiata in specifiche piastre “transwell†da 24 pozzetti usando cestelli (Corning Inc., Corning, NY) con membrane con pori da 8 µm. Le membrane sono state rivestite con il collagene (collagene umano tipo I/III) e fibronectina (20 µg/ml ciascuno). Le cellule di melanoma umano PES43, sono state seminate nel cestello superiore (2.5x10<5>cellule/well) in mezzo di coltura IMDM contenente 1% BSA (medium di migrazione), e 20 ng/ml SDF-1α sono stati aggiunti nel cestello inferiore. L’esperimento à ̈ corso almeno in triplicato. Dopo 16 ore di incubazione, le cellule nella superficie superiore del filtro sono state rimosse usando un bastoncino ovattato. La migrazione delle cellule verso medium di migrazione serum free à ̈ stata comparata con la migrazione verso 20 ng/ml di SDF-1α. Le cellule sono state contate in 10 campi diversi con ingrandimento 40X. L'indice di migrazione à ̈ stato definito come il rapporto tra la migrazione delle cellule del gruppo sperimentale divisa quella del gruppo di controllo. Il controllo positivo dell’esperimento à ̈ costituito dalla migrazione delle cellule verso siero.

Attraverso il saggio di migrazione à ̈ stata dimostrata l’attività interferente con la migrazione da parte dei seguenti peptidi: css:[C-WHR-C], css:[C-WYR-C]-AR, RA-css:[C-RFF-C], RA-css:[C-RHW-C], RA-css:[C-RYW-C], abb:[β-Ala-WHR-β-Ala], css:[C-WWR-C].

Tali peptidi hanno mostrato azione antagonista rispetto all’induzione di migrazione indotta dal ligando quasi comparabile all'inibitore meglio caratterizzato, AMD3100. L’attività dei peptidi inibenti la migrazione indotta dal ligando à ̈ confrontata all’inibizione mediata da AMD3100. In particolare, le riduzioni della migrazione normalizzate per il controllo sono pari a: css:[C-WHR-C] 80%; css:[C-WYR-C]-AR 40%; RA-css:[C-RFF-C] 20%; RA-css:[C-RHW-C] 75%; RA-css:[C-RYW-C] 20%; abb:[β-Ala-WHR-β-Ala] 45%; css:[C-WWR-C] 37%.

Inoltre, à ̈ stato rilevato che i peptidi css:[C-FFR-C]-Nam e css:[C-WHR-C]-AR determinano un aumento della motilità cellulare in risposta all'SDF-1α, e quindi hanno un’azione additiva all’SDF-1α pari al 190% per css:[C-FFR-C]-Nam e 170% per css:[C-WHR-C]-AR, ovvero pari quasi al doppio di quella del basale non trattato (Figura 3).

Esempio 4: Saggi in vitro: modulazione dell’attivazione di ERK-1,2

L'attivazione del CXCR4 induce la via di trasduzione delle MAPK attraverso fosforilazione di ERK 1,2. Per tale motivo, à ̈ stata valutata la modulazione dell’induzione di P-ERK in relazione al trattamento con SDF-1α (100 ng/ml), peptidi (10 uM) ed AMD3100 (1 uM). Per dimostrare che SDF-1α attiva una cascata di segnale a valle, abbiamo esaminato l'attivazione di ERK1/2 nelle PES43 mediante Immunoblotting con anticorpi che riconoscono la forma fosforilata (e quindi attiva) di queste due chinasi. Le cellule sono state deprivate da siero per 24 ore e quindi stimolate con SDF-1α.

Le cellule di melanoma umano, PES43 cresciute su piastre da 100 mm sono state trattate con SDF-1α, per 2-5-7-10 minuti. Successivamente le cellule sono state staccate meccanicamente, lisate in specifico buffer a cui sono stati aggiunti inibitori di proteasi ed inibitori di fosfatasi (120 mM NaCl, 40 mM Hepes, 5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0.5 mM EDTA, 0.6% Triton, 10% glicerolo, 10mM aprotinina, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF). I lisati cellulari così ottenuti (50 µg di proteine totali) sono stati prima denaturati con Laemmli 4x e poi separati con SDS–PAGE su gel al 10% in presenza di buffer di corsa (Tris Base, Glicina, SDS); successivamente le proteine sono state trasferite su membrana di nitrocellulosa in incubati con anticorpi primari specifici per le seguenti proteine: fosfo-ERK 1/2, ERK totale. In seguito i filtri sono stati lavati con 0.01M T-TBS ed incubati con i relativi anticorpi secondari. La visualizzazione degli immunocomplessi à ̈ stata effettuata utilizzando ECL.

Attraverso questo esperimento abbiamo osservato che l'SDF-1α à ̈ capace di indurre la fosforilazione di ERK 1, 2 a 2 e 5 minuti.

Il ligando SDF-1α attiva la fosforilazione di ERK e tale fosforilazione à ̈ inibita sia dall'AMD3100 (1 uM) che dai peptidi css:[C-WHR-C] (10 uM), css:[C-FFR-C] (10 uM), css:[C-FFR-C]-Nam (10 uM), css:[C-WYR-C]-AR (10uM), RA-css:[C-RFF-C] (10 uM), RA-css:[C-RHW-C] (10uM), abb:[β-Ala-WHR-β-Ala] (10 uM). Inoltre à ̈ stata osservata una discreta capacità agonista in presenza di SDF-1α da parte dei peptidi Ac-css:[C-WHR-C] (10 uM), Ac-css:[C-WYR-C] (10 uM), Ac-css:[C-WYR-C]-Nam (10 uM), css:[C-WHR-C]-Nam (10 uM), css:[C-WYR-C]-Nam (10 uM), css:[C-FFR-C]-AR (10 uM) e css:[C-WHR-C]-AR (10 uM). Al fine di analizzare meglio una possibile azione agonista da parte dei suddetti peptidi à ̈ stata valutata la loro attività in assenza di SDF-1α. Da tale analisi si evidenzia come l’induzione del p-ERK à ̈ pari al 300 % (comparato alla SDF-1α) in seguito al trattamento con i peptidi Ac-css:[C-WYR-C] (10 uM), Ac-css:[C-WYR-C]-Nam (10 uM) e css:[C-WHR-C]-AR (10 uM).

In conclusione dalla valutazione del p-ERK si evince il comportamento da antagonisti dei seguenti peptidi: css:[C-WHR-C]; css:[C-FFR-C]; css:[C-FFR-C]-Nam; css:[C-WYR-C]-AR; RA-css:[C-RFF-C]; RA-css:[C-RHW-C]; abb:[β-Ala-WHR-β-Ala] e da agonisti dei seguenti peptidi: Ac-css:[C-WYR-C], Ac-css:[C-WYR-C]-Nam, css:[C-WHR-C]-AR (vedere Figura 4).

Esempio 5: Studi in vivo: saggio di metastasi polmonari di melanoma

Lo studio in vivo à ̈ stato effettuato su 25 topi femmina C57/B, tra la sesta e l’ottava settimana di vita e con un peso di circa 18 g, acquistati dalla Charles-River Italia (Milano, Italia). I topi sono mantenuti in specifiche condizioni secondo i protocolli approvati dalla Fondazione “G. Pascale†in accordo con le linee guida per la cura e l’uso degli animali, del Ministero della Salute Italiano. Gli animali sono acclimatati per una settimana, prima di iniziare le iniezioni con cellule neoplastiche.

I topi sono stati divisi in 5 gruppi, di 5 topi ciascuno, a seconda del trattamento:

GRUPPO A: trattamento con 100 µL PBS

GRUPPO B: trattamento con 1.25 mg/Kg AMD 3100 in 100 µL di PBS

GRUPPO C: trattamento con 2 mg/Kg RA-css:[C-RHW-C] in 100 µL di PBS.

GRUPPO D:trattamento con 2 mg/Kg RA-css:[C-RFF-C] in 100 µL di PBS.

GRUPPO E: trattamento con 2 mg/Kg css:[C-WHR-C] in 100 µL di PBS.

Cellule B16-CXCR4 (500000 cellule/topo), sono state separate mediante tripsina e lavate due volte in PBS; successivamente le stesse, sono state pre-trattate con GRUPPO A: no trattamento

GRUPPO B: 10 µM AMD3100

GRUPPO C: 10 µM RA-css:[C-RHW-C]

GRUPPO D: 10 µM RA-css:[C-RFF-C]

GRUPPO E: 10 µM css:[C-WHR-C].

Il pre-trattamento à ̈ stato effettuato per 30 minuti a 37°C.

In seguito 5x10<5>B16-CXCR4, risospese in 100 µL di PBS sono state inoculate nella vena caudale. Nella stessa giornata (T0) à ̈ cominciato il trattamento per via sistemica attraverso un’iniezione intraperitoneale giornaliera, per 5 giorni alla settimana, per due settimane.

In particolare:

GRUPPO A: trattamento con 100 µL PBS

GRUPPO B: trattamento con 1.25 mg/Kg AMD 3100 in 100 µL di PBS

GRUPPO C: trattamento con 2 mg/Kg RA-css:[C-RHW-C] in 100 µL di PBS.

GRUPPO D:trattamento con 2 mg/Kg RA-css:[C-RFF-C] in 100 µL di PBS.

GRUPPO E: trattamento con 2 mg/Kg css:[C-WHR-C] in 100 µL di PBS.

Al 21° giorno dall’iniezione, sacrificati gli animali ed espiantati gli organi (polmoni, fegato e milza), due operatori distintamente hanno provveduto all’ispezione degli stessi e all’allestimento dei preparati istologici. Gli unici organi in cui si sono evidenziate metastasi sono stati i polmoni, si à ̈ perciò proseguito con il conteggio delle lesioni metastatiche ivi presenti. L’analisi macroscopica e microscopica ha dimostrato un numero significativamente ridotto di metastasi polmonari nei gruppi di topi trattati con i peptidi RA-css:[C-RFF-C], RA-css:[C-RHW-C], css:[C-WHR-C] (vedere Figura 5).

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Claims (16)

1. RIVENDICAZIONI 1. Peptidi monomerici ciclici contenenti fino a nove amminoacidi caratterizzati dal fatto di avere un’attività modulatrice sul recettore CXCR4 aventi la seguente formula generale (I): Nt-(Ns)-Nc-X1-X2-X3-Cc-(Cs)-Ct (I) |____tc____| in cui: - il gruppo N- terminale Nt del peptide à ̈ scelto tra ammonio libero, acetile (Ac), formile (Fo) e terbutossicarbonile (tBoc); - il gruppo C terminale Ct del peptide à ̈ scelto tra carbossilato libero, ammide primaria (Nam), N-metilammide (NMe), metilestere (OMe); - la sequenza N terminale (Ns) facoltativamente presente ha una formula scelta tra B-x-; B-x-x- e B-xx-x-; - la sequenza C terminale (Cs) facoltativamente presente ha una formula scelta tra -x-B; -x-x-B e -xx-x-B; dove B rappresenta un residuo amminoacidico basico codificato scelto tra lisina (K) e arginina (R), o non codificato, e dove x rappresenta un qualsiasi residuo amminoacidico codificato o non codificato; in cui dette sequenze (Ns) e (Cs) possono essere presenti con esclusione reciproca o entrambe assenti; - i residui amminoacidici Nc e Cc, uguali o diversi tra loro, sono scelti dal gruppo che consiste in cisteina (C), acido glutammico (E), β−Alanina ( β−Ala), acido α,β diamminopropionico (Dap), acido α,γ diamminobutirrico (Dab), ornitina (Orn); - il legame tc che coinvolge i residui amminoacidici Nc e Cc nella ciclizzazione à ̈ scelto dal gruppo che consiste in ponte disolfuro tra catene laterali di cisteina (css), legame ammidico backbone-catena laterale (abs) e viceversa (asb), legame ammidico tra catene laterali (asc), legame peptidico via catena principale (abb), legame estereo backbone-catena laterale (ebs) e viceversa (esb), legame estereo tra catene laterali (esc); - la sequenza centrale X1-X2-X3à ̈ scelta tra Ar1-Ar2-B e B-Ar2-Ar1, in cui B à ̈ un residuo amminoacidico basico codificato scelto tra lisina (K) e arginina (R), o non codificato, ed Ar1e Ar2sono residui aromatici codificati scelti tra fenilalanina (F), triptofano (W), tirosina (Y) e istidina (H), o non codificati; o loro sali farmacologicamente accettabili.
2. 2. Peptidi secondo la rivendicazione 1, in cui la sequenza N terminale Ns à ̈: a) assente; b) un dipeptide scelto tra RA, RP, RG, KA, KP o KG o c) un tripeptide scelto tra RPA, KPA, RAP o KAP.
3. 3. Peptidi secondo la rivendicazione 1, in cui la sequenza C terminale Cs à ̈: a) assente; b) un dipeptide scelto tra AR, PR, GR, AK, PK o GK o c) un tripeptide scelto tra APR, APK, PAR o PAK.
4. 4. Peptidi secondo ognuna delle rivendicazioni 1-3, in cui la sequenza centrale X1-X2-X3Ã ̈ scelta tra RHW, RFF, WHR, FHR, RHF, FYR, RYF, FFR, WYR, RYW, WFR, RFW.
5. 5. Peptidi secondo ognuna delle rivendicazioni 1-4, caratterizzati dal fatto di avere un’attività modulatrice sul recettore CXCR4 scelti dal gruppo che consiste in: Ac-C-W-H-R-C-Nam C-F-F-R-C C-W-H-R-C |__css__| |__css__| |__css__| (SEQ ID NO:1) (SEQ ID NO:2) (SEQ ID NO:3) R-A-C-R-Y-W-C C-F-F-R-C-Nam C-W-Y-R-C-A-R |__css__| |__css__| |__css__| (SEQ ID NO:4) (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO:6) R-A-C-R-F-F-C R-A-C-R-H-W-C βAla-W-H-R-βAla |__css__| |__css__| |____abb____| (SEQ ID NO:7) (SEQ ID NO:8) (SEQ ID NO:9) C-W-H-R-C-A-R C-W-W-R-C |__css__| |__css__| (SEQ ID NO:10) (SEQ ID NO:11) Ac-K-G-Dap-F-H-R-E Ac-K-G-Dap-F-H-R-E-Nam |__asc___| |__asc__| (SEQ ID NO:12) (SEQ ID NO:13) Ac-C-W-H-R-C Ac-C-F-F-R-C C-W-H-R-C-A-R |__css__| |__css__| |__css__| (SEQ ID NO:14) (SEQ ID NO:15) (SEQ ID NO:16) Ac-C-W-Y-R-C C-F-F-R-C-A-R Ac-C-W-Y-R-C-Nam |__css__| |__css__| |__css__| (SEQ ID NO:17) (SEQ ID NO:18) (SEQ ID NO:19) C-W-H-R-C-Nam C-W-Y-R-C-Nam C-R-H-W-C |__css__| |__css__| |__css__| (SEQ ID NO:20) (SEQ ID NO:21) (SEQ ID NO:22) R-P-A-C-R-F-F-C K-A-P-C-R-F-F-C |__css__| |__css__| (SEQ ID NO:23) (SEQ ID NO:24)
6. 6. Omodimeri o eterodimeri tra due peptidi come definiti secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, scelti dal gruppo che consiste in: a) dimeri coda-testa o testa-coda aventi la seguente formula generale (II): Nt1-Ns1-Nc1-X1,1-X1,2-X1,3-Cc1-Cs1-Linker-Ns2-Nc2-X2,1-X2,2-X2,3-Cc2-|______tc1_____| |______tc2_____| Cs2-Ct2 (II) b) dimeri coda-coda aventi la seguente formula generale (III): Nt1-Ns1-Nc1-X1,1-X1,2-X1,3-Cc1-Cs1â” |______tc1______| Linker (III) Nt2-Ns2-Nc2-X2,1-X2,2-X2,3-Cc2-Cs2â” ̃ |_______tc2_____| c) dimeri testa-testa aventi la seguente formula generale (IV): ┌-Ns1-Nc1-X1,1-X1,2-X1,3-Cc1-Cs1-Ct1 Linker |_______tc1_____| (IV) â””-Ns2-Nc2-X2,1-X2,2-X2,3-Cc2-Cs2-Ct2|_______tc2_____| in cui Nt1, Ns1, Nc1, Cc1, Cs1, Ct1, X1,1, X1,2, X1,3sono relativi al primo peptide e hanno lo stesso significato indicato nelle rivendicazioni 1-6; in cui Nt2, Ns2, Nc2, Cc2, Cs2, Ct2,X2,1, X2,2, X2,3sono relativi al secondo peptide e hanno lo stesso significato indicato nelle rivendicazioni 1-5; in cui il legame tra detto primo peptide e detto secondo peptide avviene mediante sostituzione dei gruppi terminali Nt1ed Nt2, Ct1e Ct2, Nt1e Ct2o Ct1ed Nt2con un gruppo linker scelto tra polietilenglicole (PEG), esametilendiammina (N6), PEG600, PEG300-amminomalonil-PEG300.
7. 7. Derivati dei peptidi monomerici o dimerici secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti in cui detti peptidi sono funzionalizzati mediante legame covalente di gruppi fluorescenti, chemiluminescenti, magnetici o radioattivi a livello della catena principale, delle catene laterali o del gruppo linker.
8. 8. Peptidi secondo ognuna delle rivendicazioni 1-4, caratterizzati dal fatto di avere un’attività agonista sul recettore CXCR4, che stimolano il ripopolamento dei tessuti ischemici a livello cardiaco e neuronale, scelti dal gruppo che consiste in: Ac-C-W-H-R-C Ac-C-F-F-R-C C-W-H-R-C-A-R |__css__| |__css__| |__css__| (SEQ ID NO:14) (SEQ ID NO:15) (SEQ ID NO:16) Ac-C-W-Y-R-C C-F-F-R-C-A-R Ac-C-W-Y-R-C-Nam |__css__| |__css__| |__css__| (SEQ ID NO:17) (SEQ ID NO:18) (SEQ ID NO:19) C-W-H-R-C-Nam C-W-Y-R-C-Nam |__css__| |__css__| (SEQ ID NO:20) (SEQ ID NO:21)
9. 9. Uso di almeno un peptide monomerico o dimerico secondo ognuna delle rivendicazioni 1-6, o loro derivati secondo la rivendicazione 7, o loro miscele, per la preparazione di un medicamento per il trattamento e la prevenzione di tumori o recidive/metastasi in patologie tumorali le cui cellule sovraesprimano il recettore per le chemochine CXCR4.
10. 10. Uso secondo la rivendicazione 9, in cui detti tumori sono scelti dal gruppo che consiste in neoplasie della mammella, del colon, dello stomaco, glioblastomi e melanomi.
11. 11. Uso di almeno un peptide monomerico o dimerico secondo ognuna delle rivendicazioni 1-6, o loro derivati secondo la rivendicazione 7 o loro miscele, per la preparazione di un medicamento per il trattamento e la prevenzione di infezioni da HIV-1 da sottotipi virali che usino come corecettori i recettori per chemochine della cellula ospite.
12. 12. Uso di almeno un peptide monomerico o dimerico secondo ognuna delle rivendicazioni 1-6, o loro derivati secondo la rivendicazione 7, o loro miscele, per la preparazione di un medicamento nella terapia dei trapianti di midollo osseo per la mobilizzazione di cellule staminali.
13. 13. Uso dei peptidi monomerici o dimerici secondo ognuna delle rivendicazioni 1-7, come marker tumorali.
14. 14. Uso dei peptidi secondo la rivendicazione 8, per la preparazione di un medicamento per la ripopolazione dei tessuti ischemici a livello cardiaco e neuronale.
15. 15. Composizioni farmaceutiche comprendenti almeno uno dei peptidi monomerici o dimerici come definiti secondo ognuna delle rivendicazioni 1-6, loro derivati come definiti secondo la rivendicazione 7, o loro miscele come principio attivo insieme ad uno o più eccipienti o adiuvanti farmacologicamente accettabili.
16. 16. Kit per la diagnosi di patologie tumorali comprendente uno o più peptidi monomerici o dimerici come definiti secondo ognuna delle rivendicazioni 1-6 e/o loro derivati come definiti secondo la rivendicazione 7.